KR20140000706A - PI3K/mTOR의 억제제로서의 벤즈옥사제핀 및 그의 이용 방법 및 제법 - Google Patents

PI3K/mTOR의 억제제로서의 벤즈옥사제핀 및 그의 이용 방법 및 제법 Download PDF

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엑셀리시스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 PI3K 및 mTOR의 억제제, 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물뿐만 아니라, 이들을 이용하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 억제제는 하기 구조식 I 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염이다:
[구조식 I]
Figure pct00057

식 중, 변수들은 본 명세서에 정의된 바와 같다.

Description

PI3K/mTOR의 억제제로서의 벤즈옥사제핀 및 그의 이용 방법 및 제법{BENZOXAZEPINES AS INHIBITORS OF PI3K/MTOR AND METHODS OF THEIR USE AND MANUFACTURE}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 미국 특허 가출원 제61/417,142호(출원일: 2010년 11월 24일)에 대한 우선권의 이득을 주장하며, 이 기초출원은 참조로 본 명세서에 병합된다.
서열목록
본 출원은 2011년 11월 23일에 작성되어 2011년 11월 23일에 제출된 "10-022_Sequence.txt"(16.2 KB)라는 명칭의 서열목록을 참조로 그의 전문을 포함한다.
발명의 기술분야
본 발명은 단백질 키나제 및 그의 억제제의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 PI3K 및/또는 라파마이신의 포유동물 표적(mammalian target of rapamycin: mTOR) 신호전달 경로의 억제제 및 이들의 이용방법과 제조방법에 관한 것이다.
PI3K 경로는 세포 성장, 증식 및 생존을 조절하며, 인간 종양에서 높은 빈도로 이상조절된다(dysregulated).　 종양 내에서의 PI3K 경로 활성은 PIK3CA 유전자(PI3Ka의 p110 서브유닛을 암호화함)의 우세한 돌연변이와 증폭 또는 지질 포스파타제 PTEN의 하향조절을 비롯한 다수의 기전을 통해 일어난다. PI3K, mTOR의 다운스트림은 그의 두 가지 개별의 신호전달 복합체, 즉, mTORC1 및 mTORC2를 통해서 세포 성장과 증식을 제어한다. 중요한 세포 기능에 대한 PI3K 신호전달의 역할을 보면, PI3K와 mTOR 둘 모두를 표적화하는 억제제는, PIK3CA 또는 Ras에서의 종양 잠복 활성화 변이, PTEN-결핍을 지니거나, 또는 성장 인자 신호전달에서 종양이 상향조절되는 개소를 지니는 환자 모집단에 치료적 혜택을 제공할 수 있었다.
최근의 연구는 포스파티딜이노시톨 3-키나제(PI3K) 신호전달이 암 세포 성장, 생존, 운동성 및 대사에 상당한 효과를 지니는 것을 나타내고 있다. PI3K 경로는, 체세포 돌연변이 및 주된 성분을 암호화하는 유전자의 증폭을 비롯하여, 암 내에서 수개의 상이한 기전에 의해 활성화된다. 또한, PI3K 신호전달은 종양 미세환경에서 비암성 세포를 위하여 통합적인 기능을 제공할 수 있다. 따라서, 각종 암 형태, 특히 제2형 이아소형태 PI3K-알파, PI3K-베타 및 PI3k-감마를 치료하는 수단으로서 PI3K 아이소형태의 억제제를 개발하는데 있어서 지속적인 관심이 있다.
예를 들어, 포스파티딜이노시톨 3-키나제-알파(PI3Kα)인 이중 특이성 단백질 키나제는 85kDa의 규정 서브단위와 110 kDa의 촉매 서브단위로 구성된다. 이 유전자에 의해서 암호화된 단백질은 ATP를 사용하여 PtdIns, PtdIns4P 및 PtdIns(4,5)P2를 인산화하는 촉매 서브단위를 대표한다. PTEN, 즉, 다중 기전을 통해서 세포 성장을 억제하는 종양 억제제는 PIK3CA의 주요 생성물인 PIP3을 탈인산화시킬 수 있다. 이어서, PIP3은 단백질 키나제 B(AKT1, PKB)를 세포막으로 전좌(translocation)시키는데 요구되며, 그러한 세포막에서 업스트림 키나제에 의해서 인산화되어 활성화된다. 세포 사멸에 대한 PTEN의 효과는 PIK3CA/AKT1 경로를 통해서 매개된다.
PI3Kα는 세포골격의 재구성(cytoskeletal reorganization), 아폽토시스(apoptosis), 소포수송(vesicular trafficking), 증식 및 분화과정의 제어와 연루되어 있었다. PIK3CA의 증가된 복제 수 및 발현은, 많은 악성 종양, 예컨대, 난소암(Campbell et al., Cancer Res 2004, 64, 7678-7681; Levine et al., Clin Cancer Res 2005, 11, 2875-2878; Wang et al., Hum Mutat 2005, 25, 322; Lee et al., Gynecol Oncol 2005, 97, 26-34), 자궁경부암, 유방암(Bachman, et al. Cancer Biol Ther 2004, 3, 772-775; Levine, et al., 상기 참조; Li et al., Breast Cancer Res Treat 2006, 96, 91-95; Saal et al., Cancer Res 2005, 65, 2554-2559; Samuels and Velculescu, Cell Cycle 2004, 3, 1221-1224), 결장직장암(Samuels, et al. Science 2004, 304, 554; Velho et al. Eur J Cancer 2005, 41, 1649-1654), 자궁내막암(Oda et al., Cancer Res. 2005, 65, 10669-10673), 위 암종(Byun et al., Int J Cancer 2003, 104, 318-327; Li et al., 상기 참조; Velho et al., 상기 참조; Lee et al., Oncogene 2005, 24, 1477-1480), 간세포 암종(Lee et al., 상기와 동일), 소세포 및 비소세포 폐암(Tang et al., Lung Cancer 2006, 51, 181-191; Massion et al., Am J Respir Crit Care Med 2004, 170, 1088-1094), 갑상선 암종(Wu et al., J Clin Endocrinol Metab 2005, 90, 4688-4693), 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia: AML)(Sujobert et al., Blood 1997, 106, 1063-1066), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia: CML)(Hickey and Cotter J Biol Chem 2006, 281, 2441-2450) 및 교모세포종(Hartmann et al., Acta Neuropathol (Berl) 2005, 109, 639-642; Samuels et al., 상기 참조)과 연관되어 있다..
포유동물 표적인 mTOR은 세포 성장, 증식, 및 생존의 세포외 신호와 세포내 신호 둘 모두를 통합하는 단백질 키나제이다. 세포 표면 수용체로부터의 세포외 미토겐 성장인자 신호전달 및 저산소 스트레스(hypoxic stress), 에너지 및 영양분 상태를 수송하는 세포내 경로는 모두 mTOR에 집중된다. mTOR은 두 가지 개별의 복합체: mTOR 복합체 1(mTORC1) 및 mTOR 복합체 2(mTORC2)로 존재한다. mTORC1은 (그의 기질 p70S6 키나제 및 4E-BP1을 통해서) 전사 및 세포 성장의 주요 매개체이며, 혈청 및 글루코코르티코이드-활성화된 키나제 SGK를 통해서 세포 생존을 촉진시키는 반면, mTORC2는 생존촉진 키나제 AKT(pro-survival kinase AKT)의 활성화를 촉진시킨다. 세포 성장, 증식 및 생존에서의 이의 중추적인 역할을 보면, mTOR 신호전달이 암 및 그 밖의 질환에서 빈번하게 이상조절된다는 것은 놀라운 일이 아닌 듯하다(Bjornsti and Houghton Rev Cancer 2004, 4(5), 335-48; Houghton and Huang Microbiol Immunol 2004, 279, 339-59; Inoki, Corradetti et al. Nat Genet 2005, 37(1), 19-24).
mTOR은 ATM, ATR 및 DNAPK를 포함하는 비전형적인 키나제의 PIKK(PI3K-관련 키나제) 패밀리의 일원이며, 그의 촉매성 도매인은 PI3K의 도매인과 동족성이다. PI3K 신호전달의 이상조절은 종양 세포의 공통 기능이다. 일반적으로, mTOR 억제는 PI3K 신호전달, 예컨대, 이하에 논의된 것들이 관련되는 많은 종양 유형에서 전략으로서 고려될 수 있다.
mTOR의 억제제는 이하의 것들을 포함하는 많은 암을 치료하는데 유용할 수 있다: 유방암(Nagata, Lan et al., Cancer Cell 2004, 6(2), 117-27; Pandolfi N Engl J Med 2004, 351(22), 2337-8; Nahta, Yu et al. Nat Clin Pract Oncol 2006, 3(5), 269-280); 외투막세포 림프종(mantle cell lymphoma: MCL)(Dal Col, Zancai et al. Blood 2008, 111(10), 5142-51); 신장 세포 암종(Thomas, Tran et al. Nat Med 2006, 12(1), 122-7; Atkins, Hidalgo et al. J Clin Oncol 2004, 22(5), 909-18; Motzer, Hudes et al. J Clin Oncol 2007, 25(25), 3958-64); 급성 골수성 백혈병(AML)(Sujobert, Bardet et al.Blood 2005, 106(3), 1063-6; Billottet, Grandage et al. Oncogene 2006, 25(50), 6648-6659; Tamburini, Elie et al. Blood 2007, 110(3), 1025-8); 만성 골수성 백혈병(CML)(Skorski, Bellacosa et al. Embo J 1997, 16(20), 6151-61; Bai, Ouyang et al. Blood 2000, 96(13), 4319-27; Hickey and Cotter Biol Chem 2006, 281(5), 2441-50); 미만성 큰 B세포 림프종(diffuse large B cell lymphoma: DLBCL)(Uddin, Hussain et al. Blood 2006, 108(13), 4178-86); 몇 가지 육종의 서브타입(Hernando, Charytonowicz et al. Nat Med 2007, 13(6), 748-53; Wan and Helman Oncologist 2007, 12(8), 1007-18); 횡문근육종(Cao, Yu et al. Cancer Res 2008, 68(19), 8039-8048; Wan, Shen et al. Neoplasia 2006, 8(5), 394-401); 난소암(Shayesteh, Lu et al. Nat Genet, 1999, 21(1), 99-102; (Lee, Choi et al. Gynecol Oncol 2005, 97(1) 26-34); 자궁내막 종양(Obata, Morland et al. Cancer Res 1998, 58(10), 2095-7; Lu, Wu et al. Clin Cancer Res 2008, 14(9), 2543-50); 비소세포 폐 암종(NSCLC)(Tang, He et al. Lung Cancer 2006, 51(2), 181-91; Marsit, Zheng et al. Hum Pathol 2005, 36(7), 768-76); 소세포, 편형, 대세포 및 샘암종(Massion, Taflan et al. Am J Respir Crit Care Med 2004, 170(10), 1088-94); 일반적인 폐 종양(Kokubo, Gemma et al. Br J Cancer 2005, 92(9), 1711-9; Pao, Wang et al. Pub Library of Science Med 2005, 2(1), e17); 결장직장 종양(Velho, Oliveira et al. Eur J Cancer 2005, 41(11), 1649-54; Foukas, Claret et al. Nature, 2006, 441(7091), 366-370), 특히 현미부수체 불안정성(microsatellite instability)을 나타내는 것들(Goel, Arnold et al. Cancer Res 2004, 64(9), 3014-21; Nassif, Lobo et al. Oncogene 2004, 23(2), 617-28), KRAS-돌연변이 대장 종양(Bos Cancer Res 1989. 49(17), 4682-9; Fearon Ann N Y Acad Sci 1995, 768, 101-10); 위 암종(Byun, Cho et al. Int J Cancer 2003, 104(3), 318-27); 간세포 종양(Lee, Soung et al. Oncogene 2005, 24(8), 1477-80); 간 종양(Hu, Huang et al. Cancer 2003, 97(8), 1929-40; Wan, Jiang et al. Cancer Res Clin Oncol 2003, 129(2), 100-6); 원발성 흑색종 및 이와 관련된 증가된 종양 두께(Guldberg, thor Straten et al. Cancer Res 1997, 57(17), 3660-3; Tsao, Zhang et al. Cancer Res 2000, 60(7), 1800-4; Whiteman, Zhou et al. Int J Cancer 2002, 99(1), 63-7; Goel, Lazar et al. J Invest Dermatol 126(1), 2006, 154-60); 췌장 종양(Asano, Yao et al. Oncogene 2004, 23(53), 8571-80); 전립선 암종(Cairns, Okami et al. Cancer Res 1997, 57(22), 4997-5000; Gray, Stewart et al. Br J Cancer 1998, 78(10), 1296-300; Wang, Parsons et al. Clin Cancer Res 1998, 4(3), 811-5; Whang, Wu et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1998, 95(9), 5246-50; Majumder and Sellers Oncogene 2005, 24(50) 7465-74; Wang, Garcia et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2006, 103(5), 1480-5; (Lu, Ren et al. Int J Oncol 2006, 28(1), 245-51; Mulholland, Dedhar et al. Oncogene 25(3), 2006, 329-37; Xin, Teitell et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1 2006, 03(20), 7789-94; Mikhailova, Wang et al. Adv Exp Med Biol 2008, 617, 397-405; Wang, Mikhailova et al. Oncogene 2008, 27(56), 7106-7117); 특히 역형성 아류형(anaplastic subtype)에서의 갑상선 암종(Garcia-Rostan, Costa et al. Cancer Res 2005, 65(22), 10199-207); 여포상 갑상선 암종(Wu, Mambo et al. J Clin Endocrinol Metab 2005, 90(8), 4688-93); 역형성 대세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma: ALCL); 과오종(hamaratomas), 혈관근육지방종(angiomyelolipomas), TSC-관련 및 산발성 림프관 평활근종증(TSC-associated and sporadic lymphangioleiomyomatosis): 코우덴병(Cowden's disease)(다발성 과오종 증후군)(Bissler, McCormack et al. N Engl J Med 2008, 358(2), 140-151); 경화성 혈관종(Randa M. S. Amin Pathology International 2008, 58(1), 38-44); 포이츠-예거 증후군(Peutz-Jeghers syndrome: PJS); 두경부암(Gupta, McKenna et al. Clin Cancer Res 2002, 8(3), 885-892); 신경섬유종증(Ferner Eur J Hum Genet 2006, 15(2), 131-138; Sabatini Nat Rev Cancer 2006, 6(9), 729-734; Johannessen, Johnson et al. Current Biology 2008, 18(1), 56-62); 황반변성; 황반부종; 골수성 백혈병; 전신 루푸스; 및 자가면역성 림프증식증후군(autoimmune lymphoproliferative syndrome: ALPS).
이하의 설명은 본 발명의 특정의 양상을 단지 요약하고 있는 것이며, 사실상 본 발명을 제한하도록 의도된 것은 아니다. 이들 양상과 그 밖의 양상 및 실시형태들이 이하에 더욱 상세히 기재된다. 본 명세서에서 인용된 모든 참조문헌은 본 명세서에 그들의 전문이 참조로 병합된다. 본 명세서의 명시된 개시내용과 참조로 병합된 참조문헌들 간에 불일치가 있는 경우에, 본 명세서의 명시된 개시내용이 우선한다.
본 발명자들은 생물학적 과정과 질환 상태에서 PI3K 및 mTOR의 중요한 역할을 인지하고, 그에 따라서, 일련 번호 PCT/US2010/036032(출원일: 2010년 5월 25일, 그의 전체 내용은 참조로 본 명세서에 병합됨)에서 입증되는 바와 같이, 이들 단백질 키나제의 억제제가 바람직할 것임을 깨달았다. 따라서, 본 발명은 PI3K 및/또는 mTOR을 억제하고/하거나, 조절하고/하거나, 조정하고, 포유동물에서의 과증식성 질환, 예컨대, 암의 치료에 유용한 화합물을 제공한다. 본 발명은 또한 화합물을 제조하는 방법, 포유동물, 특히 사람에서의 과증식성 질환의 치료에 이러한 화합물을 사용하는 방법, 및 이러한 화합물을 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 제1양상은 하기 화학식 I의 화합물, 또는 그의 단일의 이성질체 또는 이성질체들의 혼합물, 선택적으로 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 I]
Figure pct00001
식 중,
R1은 H, 할로, -OH, (C1-C6)알콕시, NH2, NH(C1-C6)알킬 또는 N((C1-C6)알킬)2이고;
R2는 -NR2aS(O)2-R2b, -S(O)2-NR2aR2c이되, R2a 및 R2c는 각각 독립적으로 H 또는 (C1-C6)알킬이고 R2b는 (C1-C6)알킬 또는 할로(C1-C6)알킬이며;
R3은 H, 할로 또는 (C1-C6)알킬이고;
R4는 H 또는 할로이며;
Q는 N, C-H 또는 C-(C1-C6)알킬, C-CN 또는 C-CF3이고;
R6은 H, (C1-C6)알킬, 할로(C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬렌-NH2, (C1-C6)알킬렌-NH(C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬렌-NH(C1-C6)할로알킬, (C1-C6)알킬렌-N(C1-C6)알킬)2, NH2, NH(C1-C6)알킬, 하이드록시알킬, (C1-C6)알킬렌-O(C1-C6)알킬, NH(C1-C6)알킬렌NH2, NH(C1-C6)알킬렌-사이클로알킬, -NH(C1-C6)알킬렌-헤테로사이클로알킬, N((C1-C6)알킬)2, (C1-C6)알킬렌-NHSO2-(C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬렌-NH(C=O)-(C1-C6)알킬, -(C=O)-NH2, -(C=O)-(C1-C6)알킬, -(C=O)-NH(C1-C6)알킬, -(C=O)-N(C1-C6)알킬))2, -NHSO2-(C1-C6)알킬, -S(O)-(C1-C6)알킬, -SO2-(C1-C6)알킬, -SO2NH2, -SO2NH(C1-C6)알킬, -SO2N((C1-C6)알킬)2, -CN, (C4-C7)헤테로사이클로알킬, (C1-C6)알킬렌-(C3-C7)헤테로사이클로알킬, 나이트로, (C1-C6)알킬렌-CN, NH(C1-C6)알킬렌-NH(C1-C6)알킬, NH(C1-C6)알킬렌-N((C1-C6)알킬)2 또는 (C1-C6)알킬렌-OC(O)-(C1-C6)알킬이되, 여기서, R6 중의 임의의 알킬렌은 독립적으로 할로 또는 하이드록시인 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환되고, 또한 임의의 알킬렌이 -CH2-이면, -CH2-의 수소들 중 하나는 선택적으로 (C1-C3)할로알킬로 대체될 수 있으며;
R7은 H, 할로, -NH2, 나이트로 (C1-C6)알킬, (C1-C6)알콕시이고, R7은 -CF3, 할로(C1-C6)알킬, (C1-C6)알케닐, NH(C1-C6)알킬 또는 N((C1-C6)알킬)2이며;
Y는 N 또는 C-R8이되, 여기서 R8은 H, 할로, (C1-C6)알킬, NH2, NH(C1-C6)알킬, N((C1-C6)알킬)2, (C2-C6)알케닐, (C1-C6)알킬렌-O(C1-C6)알킬, 하이드록시알킬, (C1-C6)알킬렌-CO2(C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬렌-CO2H, 페닐, 할로(C1-C6)알킬, (C3-C7)사이클로알킬, (C1-C6)알킬렌-(C3-C7)사이클로알킬, COH, CO2H, -CO2(C1-C6)알킬, CN, (C1-C6)알킬렌-CN, (C1-C6)알킬렌-C≡C-H, (C1-C6)알킬렌-C≡C-(C1-C6)알킬, -C≡C-H, -C≡C-(C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬렌-페닐이고; 이때 R8 중의 임의의 페닐은 독립적으로 할로 또는 알킬인 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환되거나; 또는
R7과 R8은, 이들이 부착되는 원자들과 함께, 서로 결합되어 N-H, N-(C1-C6)알킬, O, SO 및 SO2로부터 선택된 2개까지의 헤테로원자를 선택적으로 함유하는, 5, 6 또는 7원(membered)의 포화, 부분 불포화 혹은 불포화 고리를 형성할 수 있고, 여기서 R7과 R8에 의해 형성된 고리는 독립적으로 알킬, 알콕시 또는 할로인 1 혹은 2개의 기로 선택적으로 치환되며;
Z는 N 또는 C-R9이되, 여기서 R9는 H, 할로 또는 (C1-C6)알킬이고;
Q 및 Z 중 적어도 하나는 N이다.
제2양상에 있어서, 본 발명은 화학식 1의 및 표 1의 화합물, 또는 그의 단일 입체이성질체 또는 이성질체들의 혼합물, 선택적으로 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 용매화물 및 2) 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 제공한다.
제3양상에 있어서, 본 발명은 화학식 I의 및 표 1의 화합물, 또는 그의 단일 입체이성질체 또는 이성질체들의 혼합물, 선택적으로 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 용매화물; 및 2) 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 제4양상은, mTOR의 생체내 활성을 억제하는 방법이며, 해당 방법은 PI3K/mTOR-억제 유효량의 화학식 I의 또는 표 1의 화합물, 또는 그의 단일 입체이성질체 또는 이성질체들의 혼합물, 선택적으로 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 용매화물, 또는 그의 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
제5양상에 있어서, 본 발명은 질환, 질병, 또는 증후군을 치료하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 치료적 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 단일 입체이성질체 또는 이성질체의 혼합물, 이들의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물, 또는 치료적 유효량의 화학식 I의 혹은 표 1의 화합물 또는 그의 단일 입체이성질체 또는 이성질체들의 혼합물, 선택적으로 그의 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 용매화물과, 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가의 양상은 종양을 가진 대상체를 치료하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 (a) 상기 종양이 PI3K-α 키나제 도메인 내에서 돌연변이를 포함한다면 상기 대상체에게 PI3K-α 선택적 억제제, 이중 PI3K-α/mTOR 선택적 억제제, 또는 PI3K-α 선택적 억제제와 mTOR 선택적 억제제의 조합물을 투여하는 단계; 또는 (b) 상기 종양이 PI3K-α 나선형 도메인 내에서 돌연변이를 포함한다면 상기 대상체에게 PI3K-α 선택적 억제제와 PI3K-β 선택적 억제제의 조합물, 이중 PI3K-α/mTOR 선택적 억제제, 또는 PI3K-β 선택적 억제제를 투여하는 단계를 포함하되, 여기서 PI3K-α 선택적 억제제, 이중 PI3K-α/mTOR 선택적 억제제, 또는 PI3K-α 선택적 억제제와 mTOR 선택적 억제제의 조합물은 화학식 I의 또는 표 1의 화합물이다.
추가의 양상에 있어서, 본 발명은 PI3K 동질효소의 선택적 억제제를 확인하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 (a) PI3K-α 내에 제1돌연변이를 가진 제1세포를 후보 억제제와 접촉시키는 단계; (b) 상기 PI3K-α 내에 야생형 PI3K-α, PTEN 삭제 돌연변이(null mutation) 또는 제2돌연변이를 가진 제2세포를 상기 후보 억제제와 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 제1 및 상기 제2세포 내의 AKT 인산화를 측정하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 제2세포와 비교해서 상기 제1세포에서의 감소된 AKT 인산화는 상기 후보 억제제를 선택적 PI3K-α억제제로서 확인해주고, 여기서 PI3K-α 선택적 억제제, 이중 PI3K-α/mTOR 선택적 억제제, 또는 PI3K-α 선택적 억제제와 mTOR 선택적 억제제의 조합물은 화학식 I의 또는 표 1의 화합물이다.
추가의 양상에 있어서, 본 발명은 PI3K-α를 포함하는 종양을 가진 암환자에 대해서 치료 요법을 결정하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 상기 PI3K-α의 아미노산 1047 및/또는 545에서의 돌연변이의 존재 유무를 결정하는 단계를 포함하되, 여기서 상기 PI3K-α가 위치 1047에서 돌연변이를 지닌다면, 상기 방법은 치료적 유효량의 PI3K-α 선택적 억제제 화합물, 또는 이중 PI3K-α/mTOR 선택적 억제제, 또는 PI3K-α 선택적 억제제와 mTOR 선택적 억제제의 조합물을 상기 암환자에게 투여하는 단계를 포함하거나; 또는 상기 PI3K-α가 위치 545에서 돌연변이를 지닌다면, 상기 방법은 치료적 유효량의 PI3K-α 선택적 억제제와 PI3K-β 선택적 억제제의 조합물, 또는 이중 PI3K-α/mTOR 선택적 억제제, 또는 PI3K-α 선택적 억제제와 mTOR 선택적 억제제의 조합물을 상기 암환자에게 투여하는 단계를 포함하며; 상기 PI3K-α 선택적 억제제, 이중 PI3K-α/mTOR 선택적 억제제, 또는 PI3K-α 선택적 억제제와 mTOR 선택적 억제제의 조합물은 화학식 I의 또는 표 1의 화합물이다.
추가의 양상에 있어서, 진단, 치료 또는 선별(screen)하는데 이용되는 세포는 이하에 기재된 것들: 유방암, 외투세포 림프종, 신장 세포 암종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, NPM/ALK-변형 역형성 대세포 림프종, 미만성 큰 B세포 림프종, 횡문근육종, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 비소세포 폐 암종, 소세포 폐 암종, 샘암종, 결장암, 직장암, 위 암종, 간세포 암종, 흑색종, 췌장암, 전립선 암종, 갑상선 암종, 역형성 대세포 림프종, 혈관종, 교모세포종 또는 두경부암으로부터 유래된 종양 또는 암으로부터 얻어진 암 혹은 종양 세포를 포함하되, 여기서, PI3K-α 선택적 억제제, 이중 PI3K-α/mTOR 선택적 억제제, 또는 PI3K-α 선택적 억제제와 mTOR 선택적 억제제의 조합물은 화학식 I의 또는 표 1의 화합물이다.
약어 및 정의
이하의 약어 및 용어는 본 명세서 전체를 통하여 표시된 의미를 지닌다:
Figure pct00002
Figure pct00003
기호 "-"는 단일 결합을 의미하고, "="은 이중 결합을 의미하며, "≡"은 삼중 결합을 의미하고, "
Figure pct00004
"은 단일 또는 이중 결합을 의미한다. 기호 "
Figure pct00005
"는 해당 기호가 결합되는 이중결합의 말단 상의 어느 위치를 점유하는 바와 같은 이중결합상의 기를 의미하며; 즉, 이중결합의 기하학적 구조 E- 또는 Z-는 모호하다. 기(基)가 그의 부모 화학식(parent formula)으로부터 떨어진 것으로 묘사될 때, 부모 구조식으로부터 상기 기를 분리하기 위하여, 이론적으로 절단된 결합의 단부에서 "
Figure pct00006
"기호가 이용될 것이다.
화학 구조가 묘사되거나 기술될 때, 달리 명시적으로 기술되지 않는 한, 모든 탄소는 4의 원자가(valence)에 부합하도록 수소 치환을 갖는 것으로 가정된다. 예를 들어, 하기 개략도의 왼쪽 구조 내에는 9개의 수소가 암묵적으로 존재한다. 이들 9개의 수소는 오른쪽 구조에 묘사되어 있다. 때때로, 구조 내에서의 특정 원자는 치환체로서 수소 또는 수소들(명확하게 정의된 수소)을 갖는 것으로 화학식, 예를 들어, -CH2CH2-로 기술된다. 당업자라면, 앞서 설명된 기술은 화학 분야에 공통적이므로 다르게는 복잡한 구조의 설명에 간결함과 간단함을 제공하는 것임을 이해할 것이다.
Figure pct00007
"R" 기가, 예를 들어, 하기 화학식:
Figure pct00008
에서와 같은 고리계 상에서 "부유(floating)"하는 것으로 묘사된다면, 달리 규정되지 않는 한, 치환체 "R"은 안정적인 구조가 형성되는 한, 고리 원자들 중에서 하나로부터 묘사된, 암묵된 또는 명확하게 정의된 수소의 치환을 가정함으로써, 상기 고리계의 임의의 원자 상에 존재할 수 있다.
"R" 기가, 예를 들어, 하기 화학식:
Figure pct00009
(여기서, 본 예에서 "y"는 1 이상일 수 있음)에서와 같은, 포화된 탄소를 보유하는 고리계 상에 존재하는 것으로 묘사된 경우에, 각각이 상기 고리 상에서 현재 묘사된, 암묵된, 또는 명확하게 정의된 수소를 대체하는 것으로 가정하면; 달리 정의되지 않는 한, 생성된 구조가 안정하여, 2개의 "R"은 동일한 탄소 상에 존재할 수 있다. 다른 예에서, 동일한 탄소 상에서 2개의 R은, 그 탄소를 포함해서, 고리를 형성할 수 있고, 따라서, 예를 들어, 하기 화학식:
Figure pct00010
에서와 같은, 묘사된 고리를 보유하는 스피로환식 고리 구조를 형성할 수 있다:
본 발명의 화합물과 관련하여 "투여" 및 그의 변형어(예컨대, 화합물을 "투여하는")란 치료를 필요로 하는 동물의 계통 내에 해당 화합물 또는 그의 전구체(prodrug)를 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 화합물 또는 그의 전구체가 하나 이상의 다른 활성제(예, 수술, 방사선, 화학요법 등)와 병용하여 제공될 때, "투여" 및 그의 변형어는 각각 상기 화합물 또는 그의 전구체 및 다른 제제의 동시 및 순차 도입을 포함하는 것으로 이해된다.
"알케닐"이란 2 내지 6개의 탄소원자의 선형의 1가 탄화수소 라디칼 또는 3 내지 6개의 탄소원자의 분지형의 1가 탄화수소 라디칼로서, 적어도 하나의 이중 결합을 함유하는 라디칼, 예를 들어, 에테닐, 프로페닐, 1-뷰트-3-에닐 및 1-펜트-3-에닐 등을 의미한다.
"알콕시"란 -OR 기를 의미하고, 여기서, R은 본 명세서에 기재된 바와 같은 알킬이다. 그 예는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 아이소프로폭시 등을 포함한다.
"알킬"이란 1 내지 6개의 탄소원자의 포화된 선형의 1가 탄화수소 라디칼 또는 3 내지 6개의 탄소원자의 포화된 분지형의 1가 탄화수소 라디칼, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 2-프로필, 뷰틸(모든 이성질체 형태를 포함함), 또는 펜틸(모든 이성질체 형태를 포함함) 등을 의미한다.
"알킬렌"이란 1 내지 6개의 탄소원자의 선형의 포화된 1가 탄화수소 라디칼 또는 3 내지 6개의 탄소원자의 분지형의 포화된 1가 탄화수소 라디칼, 예를 들어, 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 등을 의미한다.
"알키닐"이란 2 내지 6개의 탄소원자의 선형의 1가 탄화수소 라디칼 또는 3 내지 6개의 탄소원자의 분지형의 1가 탄화수소로서 하나 이상의 삼중결합을 함유하는 라디칼, 예를 들어, 에티닐, 프로피닐, 뷰티닐, 펜틴-2-일 등을 의미한다.
"아미노"란 -NH2를 의미한다.
"아릴"이란 6 내지 14원의 1가 단일- 또는 이-탄소환식 고리를 의미하며, 여기서, 단환식 고리는 방향족이며, 이환식 고리 내의 고리들 중 하나 이상이 방향족이다. 달리 언급하지 않는 한, 기의 원자가는, 원자가 규칙이 허용하는 한, 라디칼 내의 어떠한 고리 중의 어떠한 원자에 위치할 수 있다. 대표적인 예는 페닐, 나프틸, 인다일 등을 포함한다.
"아릴알킬"이란 본 명세서에서 정의된 바와 같은 1개 또는 2개의 아릴기로 치환된 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬 라디칼, 예를 들어, 벤질 및 페네틸등을 의미한다.
"사이클로알킬"이란 3 내지 10개의 탄소 고리 원자의 단환식 또는 융합된 이환식의 포화 또는 부분적 불포화(방향족은 아님), 1가 탄화수소 라디칼을 의미한다. 융합된 이환식 탄화수소 라디칼은 스피로 및 브리지된 고리계를 포함한다. 달리 기술되지 않는 한, 기의 원자가는, 원자가 규칙이 허용하는 한, 라디칼 내의 어떠한 고리 중의 어떠한 원자 상에도 위치할 수 있다. 1개 또는 2개의 고리 탄소 원자는 -C(O)-, -C(S)- 또는 -C(=NH)-기로 치환될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 용어 사이클로알킬은 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헥실 또는 사이클로헥스-3-에닐 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
"다이알킬아미노"란, -NRR' 라디칼(여기서 R 및 R'는 본 명세서에 정의된 바와 같은 알킬임), 또는 N-옥사이드 유도체, 또는 그의 보호된 유도체, 예를 들어, 다이메틸아미노, 다이에틸아미노, N,N-메틸프로필아미노 또는 N,N-메틸에틸아미노 등을 의미한다.
"융합된 고리계"란 브리지된 혹은 융합된 고리를 보유하는 다환식 고리계를 의미하며; 즉, 여기서 2개의 고리는 그들의 고리 구조 내에 하나보다 많은 공유된 원자를 지닌다. 이 출원에 있어서, 융합된 고리계는 반드시 모두 방향족 고리계일 필요는 없다. 전형적으로, 필수는 아니지만, 융합된 고리계는, 예를 들어, 나프탈렌 혹은 1,2,3,4-테트라하이드로-나프탈렌과 같이, 인접한 세트의 원자를 공유한다. 본 발명의 융합된 고리계는 그 자체가 융합된 고리계의 단일의 고리 원자를 통해서 이것에 부착된 스피로 고리를 지닐 수 있다. 몇몇 예에서, 당업자가 이해하는 바와 같이, 방향족 계 상의 두 인접한 기는 함께 융합되어 고리 구조를 형성할 수 있다. 웅합된 고리 구조는 헤테로원자를 보유할 수 있고, 또한 하나 이상의 기로 선택적으로 치환될 수 있다.
"할로겐" 또는 "할로"란 불소, 염소, 브롬 및 요오드를 지칭한다.
"할로(C1-C6)알킬" 및 "(C1-C6)할로알킬"이란 하나 이상의 할로겐, 구체적으로는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 할로 원자로 치환된 알킬기, 예를 들어, 트라이플루오로메틸, 2-클로로에틸 및 2,2-다이플루오로에틸 등을 의미한다.
"헤테로아릴"은 고리 원자 중 1개 이상, 특히 1개, 2개, 3개 또는 4개의 고리 헤테로원자가 각각 독립적으로 -O-, -S(O)n-(n은 0, 1, 또는 2), -N=, -NH- 또는 N-옥사이드인 헤테로원자이고, 나머지 고리 원자가 탄소원자인 5 내지 14개의 고리 원자를 갖는 단환식 또는 융합된 이환식 혹은 삼환식 1가 라디칼을 의미하며, 여기서, 단환식 라디칼을 포함하는 고리는 방향족이며, 이환식 라디칼를 포함하는 융합된 고리 중 적어도 하나는 방향족이다. 이환식 라디칼을 포함하는 임의의 비방향족 고리의 1개 또는 2개의 고리 탄소원자는 -C(O)-, -C(S)- 또는 -C(=NH)-기로 치환될 수 있다. 융합된 이환식 라디칼은 브리지된 고리계를 포함한다. 달리 언급하지 않는 한, 원자가는, 원자가 규칙이 허용하는 한, 헤테로아릴기의 임의의 고리의 임의의 원자 상에 위치할 수 있다. 원자가의 지점이 질소 상에 위치한다면, Rx는 존재하지 않는다. 더욱 구체적으로, 헤테로아릴이란 용어는 1,2,4-트라이아졸릴, 1,3,5-트라이아졸릴, 프탈이미딜, 피리디닐, 피롤릴, 이미다졸릴, 티에닐, 퓨라닐, 인돌릴, 2,3-다이하이드로-1H-인돌릴(예를 들어, 2,3-다이하이드로-1H-인돌-2-일 또는 2,3-다이하이드로-1H-인돌-5-일 등을 포함함), 아이소인돌일, 인돌리닐, 아이소인돌리닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조다이옥솔-4-일, 벤조퓨라닐, 신놀리닐, 인돌리지닐, 나프티리딘-3-일, 프탈라진-3-일, 프탈라진-4-일, 프테리디닐, 퓨리닐, 퀴나졸리닐, 5,6,7,8-테트라하이드로퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 테트라조일, 피라졸릴, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 옥사졸릴, 아이소옥사졸릴, 옥사다이아졸릴, 벤즈옥사졸릴, 퀴놀리닐, 5,6,7,8-테트라하이드로퀴놀리닐, 아이소퀴놀리닐, 테트라하이드로아이소퀴놀리닐(예를 들어, 테트라하이드로아이소퀴놀린-4-일 또는 테트라하이드로아이소퀴놀린-6-일 등을 포함함), 피롤로[3,2-c]피리디닐(예를 들어, 피롤로[3,2-c]피리딘-2-일 또는 피롤로[3,2-c]피리딘-7-일 등을 포함함), 벤조피라닐, 2,3-다이하이드로벤조퓨라닐, 벤조[d][1,3]다이옥솔릴, 2,3-다이하이드로벤조[b][1,4]다이옥시닐, 티아졸릴, 아이소티아졸릴, 티아다이아졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조티에닐, 6,7-다이하이드로-5H-사이클로펜타[b]피리디닐, 6,7-다이하이드로-5H-사이클로펜타[c]피리디닐, 6,7-다이하이드로-5H-사이클로펜타[d]피리미디닐, 5,6,7,8-테트라하이드로-5,8-에타노퀴나졸린-4-일 및 6,7,8,9-테트라하이드로피리미도[4,5-b]인돌리진-4-일, 및 이들의 N-옥사이드 및 이들의 보호된 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
"헤테로사이클로알킬"은 고리 원자의 1개 이상, 구체적으로는, 1, 2, 3 또는 4개의 고리 원자가 각각 독립적으로 O, S(O)n(n은 0, 1, 또는 2임), -NH- 또는 -N=이고, 나머지 고리 원자가 탄소인 3 내지 8개의 고리 원자를 갖는 포화 또는 부분적 불포화된(그러나 방향족은 아님) 1가 단환식 기 또는 5 내지 12개의 고리 원자를 갖는 포화 또는 부분적 불포화된(그러나 방향족은 아님) 1가 융합된 혹은 스피로환식 이환식 기를 의미한다. 1개 또는 2개의 고리 탄소원자는 -C(O)-, -C(S)- 또는 -C(=NH)-기에 의해 치환될 수 있다. 융합된 이환식 라디칼은 브리지된 고리계를 포함한다. 달리 언급하지 않는 한, 기의 원자가는, 원자가 규칙이 허용하는 한, 라디칼 내의 임의 고리의 임의 원자 상에 위치할 수 있다. 원자가의 지점이 질소 상에 위치할 때, Ry는 존재하지 않는다. 더욱 구체적으로, 헤테로사이클로알킬이란 용어는 아제티디닐, 피롤리디닐, 2-옥소피롤리디닐, 2,5-다이하이드로-1H-피롤릴, 피페리디닐, 4-피페리도닐, 몰폴리닐, 피페라지닐, 2-옥소피페라지닐, 테트라하이드로피라닐, 2-옥소피페리디닐, 티오몰폴리닐, 티아몰폴리닐, 퍼하이드로아제피닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 다이하이드로피리디닐, 테트라하이드로피리디닐, 옥사졸리닐, 옥사졸리디닐, 아이소옥사졸리디닐, 티아졸리닐, 티아졸리디닐, 퀴누클리디닐, 아이소티아졸리디닐, 옥타하이드로사이클로펜타[c]피롤릴, 옥타하이드로인돌릴, 옥타하이드로아이소인돌릴, 데카하이드로아이소퀴놀릴, 2,6-다이아자스피로[3.3]헵탄-2-일, 테트라하이드로퓨릴 및 테트라하이드로피라닐, 및 이들의 유도체 및 이들의 N-옥사이드 또는 보호된 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
"페닐알킬"이란 1개 또는 2개의 페닐기로 치환된, 본 명세서에서 정의된 바와 같은, 알킬기를 의미한다.
"선택적인" 또는 "선택적으로"란, 차후에 기술되는 현상 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않을 수 있고, 설명이 상기 현상 또는 상황이 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우를 포함한다는 것을 의미한다. 당업자라면, 하나 이상의 선택적인 치환체를 보유하는 것으로 기술된 어떠한 분자에 관하여, 입체적으로 실제적인 및/또는 합성적으로 실현가능한 화합물만이 포함되도록 의미하는 것임을 이해할 것이다. "선택적으로 치환된"은, 달리 기술되지 않는 한, 용어 내에 모든 후속 수식어(modifier)를 지칭한다. 예시적인 선택적 치환체의 목록은 "치환된"의 정의에서 이하에 제시된다.
"옥소"란 이중결합을 통해서 결합되는 산소를 의미한다.
본 명세서에서 기재된 반응의 각각에 대해서 "수율"은 이론적인 수득량의 백분율로서 표현된다.
"대사산물"은 동물이나 인간 체내에서의 대사 또는 생체변환; 예를 들어, 산화, 환원 또는 가수분해 등에 의해 보다 극성인 분자로 또는 컨쥬게이트로의 생체변환에 의해 생성된 화합물 또는 그 염의 분해 또는 최종 생성물을 지칭한다(생체변환의 논의를 위해 문헌[Goodman and Gilman, "The Pharmacological Basis of Therapeutics" 8th Ed., Pergamon Press, Gilman et al. (eds), 1990] 참조). 본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 화합물 또는 그 염의 대사산물은 체내에서 화합물의 생물학적 활성 형태일 수 있다. 하나의 예에서, 전구체는 상기 생물학적 활성 형태인 대사산물이 생체내에서 방출되도록 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 생물학적 활성 대사산물은 뜻밖에 발견된 것으로, 즉, 전구체 설계는 그 자체로 착수되지 않았다. 본 발명의 화합물의 대사산물의 활성에 대한 검정(assay)은 본 발명의 개시내용을 감안하여 당업자에게 알려져 있다.
본 발명의 목적을 위한 "환자"는 인간 및 다른 동물, 특히 포유동물, 및 다른 유기체를 포함한다. 따라서, 상기 방법은 인간 치료 및 수의과 적용의 양쪽 모두에 적용가능하다. 구체적인 실시형태에서, 환자는 포유동물이고, 더욱 구체적인 실시형태에서, 환자는 인간이다.
화합물의 "약제학적으로 허용가능한 염"은 약제학적으로 허용가능하고, 모 화합물의 원하는 약리학적 활성을 가지고 있는 염을 의미한다. 약제학적으로 허용가능한 염은 비독성인 것으로 이해된다. 적당한 약제학적으로 허용가능한 염에 대한 추가 정보는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985(참조로 본 명세서에 병합됨)] 또는 [S. M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," J. Pharm. Sci., 1977;66:1-19(참조로 본 명세서에 병합됨)]에서 찾을 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 산 부가염의 예는 하기 산들에 의해서 형성된 염을 포함한다: 무기 산, 예컨대, 염산, 수소화브롬산, 황산, 질산, 인산 등뿐만 아니라; 유기 산, 예컨대, 아세트산, 트라이플루오로아세트산, 프로피온산, 헥산산, 사이클로펜탄프로피온산,　글라이콜산, 피루브산, 락트산, 옥살산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 3-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 1,2-에탄다이설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄퍼설폰산,　글루코헵톤산, 4,4'-메틸렌비스-(3-하이드록시-2-엔-1-카복실산), 3-페닐프로피온산, 트라이메틸아세트산, 3급 뷰틸아세트산, 라우릴 황산,　글루콘산,　글루탐산, 하이드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산, p-톨루엔설폰산 및 살리실산 등.
약제학적으로 허용가능한 염기 부가 염의 예는 모 화합물에 존재하는 산성 양성자가 금속 이온, 예컨대, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 염 등으로 치환될 때 형성된 것을 포함한다. 구체적인 염은 암모늄, 칼륨, 나트륨, 칼슘 및 마그네슘 염이다. 약제학적으로 허용가능한 유기 비-독성 염기로부터 유도된 염은 1급, 2급 및 3급 아민, 자연 발생적으로 치환된 아민을 포함한 치환된 아민, 환식 아민 및 염기성 이온 교환 수지의 염을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 유기 염기의 예는 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 다이에틸아민, 트라이에틸아민, 트라이프로필아민, 에탄올아민, 2-다이메틸아미노에탄올, 2-다이에틸아미노에탄올, 다이사이클로헥실아민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 하이드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌다이아민,　글루코사민, 메틸글루카민, 테오브로민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 트로메타민, N-메틸글루카민, 폴리아민 수지 등을 포함한다. 예시적인 유기 염기는 아이소프로필아민, 다이에틸아민, 에탄올아민, 트라이메틸아민, 다이사이클로헥실아민, 콜린 및 카페인이다. "플라틴(들)" 및 "플라틴-함유 제제(들)"는, 예를 들어, 시스플라틴, 카보플라틴 및 옥살리플라틴을 포함한다.
"전구체"란 상기 화학식의 모 화합물을, 예를 들어, 혈액 중 가수분해에 의해 얻기 위하여 체내에서 변환되는(전형적으로 신속하게) 화합물을 지칭한다. 통상의 예는 카복실산 모이어티를 보유하는 활성 형태를 지니는 화합물의 에스터 및 아마이드 형태를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용가능한 에스터의 예는, 알킬 에스터(예를 들어 약 1개 내지 약 6개의 탄소를 지님)를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니며, 해당 알킬기는 직쇄 혹은 분지쇄이다. 허용가능한 에스터는 또한 사이클로알킬 에스터 및 아릴알킬 에스터, 예컨대, 벤질을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용가능한 아마이드는 1급 아마이드 및 2급 및 3급 아마이드(예를 들어, 약 1 내지 약 6개의 탄소를 지님)를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 화합물의 아마이드 및 에스터는 통상의 방법에 따라서 제조될 수 있다. 전구체의 전적인 논의는 문헌[T. Higuchi and V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," Vol 14 of the A.C.S. Symposium Series] 및 [Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987]에 제공되어 있으며, 이들 두 문헌은 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참조로 병합된다.
"치료적 유효량"은, 환자에게 투여될 때 질환의 증상을 완화시키는 본 발명의 화합물의 양이다. "치료적 유효량"을 구성하는 본 발명의 화합물의 양은 화합물, 질환 상태 및 그의 중증도, 및 치료될 환자의 연령 등에 따라 달라질 것이다. 치료적 유효량은 당업자의 지식 및 본 명세서와 관련하여 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다.
질환, 장애 또는 증후군의 "예방하는" 또는 "예방"은, 인간에서 질환이 일어나는 것을 억제하는 것, 즉, 질환, 장애 또는 증후군에 노출될 수 있거나 잘 걸릴 수 있지만 아직 질환, 장애 또는 증후군의 증상을 경험하거나 나타내지 않는 동물에서 질환, 장애 또는 증후군의 임상적 증상을 발병하지 않도록 않도록 하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 질환, 장애 또는 증후군의 "치료하는" 또는 "치료"는 (i) 상기 질환, 장애, 또는 증후군을 억제, 즉 그의 발병을 저지하고; (ii) 질환, 장애 또는 증후군을 완화, 즉, 질환, 장애 또는 증후군의 퇴행을 유발시키는 것을 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 국소 전달 대 전신 전달, 연령, 체중, 일반 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 약물 상호작용 및 질환의 중증도에 대한 조정이 필요할 수 있으며, 당업자에 의해서 통상적인 실험으로 확인할 수 있을 것이다.
본 명세서에 개시된 화합물은 또한, 적어도 하나의 원자가 동일한 원자번호를 지니지만 자연에서 통상 발견되는 원자질량과는 다른 원자 질량을 지니는 원자로 대체되어 있는, 모든 약제학적으로 허용가능한 동위원소 변형을 포함한다. 개시된 화합물 내에 내포를 위해 적합한 동위원소의 예는, 제한 없이, 2H 및 3H 등과 같은 수소의 동위원소; 13C 및 14C 등과 같은 탄소의 동위원소; 15N 등과 같은 질소의 동위원소; 17O 및 18O 등과 같은 산소의 동위원소; 31P 및 32P 등과 같은 인의 동위원소; 35S 등과 같은 황의 동위원소; 18F 등과 같은 불소의 동위원소; 및 36Cl 등과 같은 염소의 동위원소를 포함한다. 동위원소 변형(예컨대, 듀테륨 2H)의 사용은, 보다 큰 대사 안정성, 예를 들어, 생체내 반감기의 증가 혹은 투약 요건의 감소로부터 생기는 소정의 치료적 이점을 제공할 수 있다. 부가적으로, 개시된 화합물의 소정의 동위원소 변형은 방사능 동위원소(예컨대, 트리튬 3H, 또는 14C)를 내포할 수 있고, 이는 약물 및/또는 기질 조직 분포 연구에 유용할 수 있다.
본 발명의 실시형태
이하의 단락은 본 발명의 화합물의 많은 실시형태를 제시한다. 각각의 예에서, 실시형태는 열거된 화합물, 및 그의 단일 입체이성질체 또는 입체이성질체들의 혼합물뿐만 아니라 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 모두 포함한다.
화학식 I의 화합물의 일 실시형태에 있어서, R3은 H 또는 할로이다.
다른 실시형태에 있어서, R4는 H이다.
다른 실시형태에 있어서, R6은 NH2, NH(C1-C6)알킬 또는 N((C1-C6)알킬)2이다.
다른 실시형태에 있어서, R7은 H, 할로 또는 (C1-C6)알킬이다.
다른 실시형태에 있어서, Y는 C-R8이다.
화학식 I의 화합물의 다른 실시형태에 있어서,
R1은 H, 할로, -OH, (C1-C6)알콕시, NH2, NH(C1-C6)알킬 또는 N((C1-C6)알킬)2이고;
R2는 -NR2aS(O)2-R2b 또는 -S(O)2-NR2aR2c이며;
R3은 H이고;
R4는 H이며;
R6은 NH2이고;
R7은 H, 할로 또는 (C1-C6)알킬이다.
다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물은 하기 화학식 Ia의 화합물이다:
[화학식 Ia]
Figure pct00011
.
화학식 Ia의 화합물의 일 실시형태에 있어서,
R1은 H, 할로, -OH, (C1-C6)알콕시, NH2, NH(C1-C6)알킬 또는 N((C1-C6)알킬)2이고;
R2는 -NR2aS(O)2-R2b, - S(O)2-NR2aR2c이며;
R3은 H이고;
R6은 NH2이며;
R7은 H, 할로 또는 (C1-C6)알킬이다.
다른 실시형태에 있어서, 화학식 I 또는 화학식 Ia의 화합물 중의
Figure pct00012
는
Figure pct00013
이다.
다른 실시형태에 있어서, 화학식 I 또는 화학식 Ia의 화합물 중의
Figure pct00014
는
Figure pct00015
이다.
다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물은, Z 및 Q가 N이고 Y가 C-R8인 화학식 Ia의 화합물이다.
다른 실시형태에 있어서, 화학식 Ia의 화합물은 하기 화학식 Ib의 화합물이다:
[화학식 Ib]
Figure pct00016
.
다른 실시형태에 있어서, 화학식 Ib의 화합물은 화학식 Ic의 화합물이다:
[화학식 Ic]
Figure pct00017
다른 실시형태에 있어서, 화학식 Ic의 화합물은 화학식 Id의 화합물이다:
[화학식 Id]
Figure pct00018
.
다른 실시형태에 있어서, 화학식 Id의 화합물은 화학식 Ie의 화합물이다:
[화학식 Ie]
Figure pct00019
.
다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물에서,
Figure pct00020
는
Figure pct00021
이고,
Figure pct00022
로부터 선택된다.
다른 실시형태에 있어서,
Figure pct00023
는
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
로부터 선택된다.
다른 실시형태에 있어서,
Figure pct00030
은
Figure pct00031
이되, 여기서 R6a 및 R6b는 각각 독립적으로 H, (C1-C6)알킬 또는 할로(C1-C6)알킬이다.
다른 실시형태에 있어서, 화학식 I, Ia, Ib, Ic, Id 및 Ie의 화합물에서, R1은 H, 할로, (C1-C6)알콕시, NH2, NH(C1-C6)알킬 또는 N((C1-C6)알킬)2이다.
다른 실시형태에 있어서, 화학식 I, Ia, Ib, Ic, Id 및 Ie의 화합물에서, R1은 H, 클로로, 플루오로, 메톡시, 트라이플루오로메톡시, 에톡시, NH2, NH(C1-C6)알킬, 또는 NH(CH3) 또는 N(CH3)2이다.
다른 실시형태에 있어서, 화학식 I, Ia, Ib, Ic, Id 및 Ie의 화합물에서, R1은 H 또는 클로로이다.
다른 실시형태에 있어서, 화학식 I, Ia, Ib, Ic, Id 및 Ie의 화합물에서, R2는 -NR2aS(O)2-R2b이고, 여기서 R2a는 H이고, R2b는 메틸, 트라이플루오로메틸, 에틸, 프로필 또는 뷰틸이다.
다른 실시형태에 있어서, 화학식 I, Ia, Ib, Ic, Id 또는 Ie의 화합물은,
N-(5-{4-[2-아미노-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}-2-클로로피리딘-3-일)메탄설폰아마이드;
N-(5-{4-[2-아미노-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}피리딘-3-일)메탄설폰아마이드;
2-아미노-5-{4-[2-아미노-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}피리딘-3-설폰아마이드;
N-[5-{4-[2-아미노-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}-2-(메틸옥시)피리딘-3-일]메탄설폰아마이드;
N-{5-[4-(2-아미노-6,6-다이메틸-5,6,7,8-테트라하이드로퀴나졸린-4-일)-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일]-2-클로로피리딘-3-일}메탄설폰아마이드;
N-[5-{4-[2-아미노-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}-2-(다이메틸아미노)피리딘-3-일]메탄설폰아마이드;
N-{5-[4-(2-아미노-5-에틸-6-메틸피리미딘-4-일)-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일]-2-클로로피리딘-3-일}메탄설폰아마이드;
N-{5-[4-(2-아미노-5-에테닐-6-메틸피리미딘-4-일)-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일]-2-클로로피리딘-3-일}메탄설폰아마이드;
N-(5-{4-[2-아미노-6-클로로-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}-2-클로로피리딘-3-일)메탄설폰아마이드;
N-(5-{4-[2-아미노-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}-2-클로로피리딘-3-일)메탄설폰아마이드;
N-(5-{4-[2-아미노-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}-2-클로로피리딘-3-일)-1,1,1-트라이플루오로메탄설폰아마이드;
N-{5-[4-(2-아미노-5,6-다이메틸피리미딘-4-일)-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일]-2-클로로피리딘-3-일}메탄설폰아마이드;
N-(2-클로로-5-{4-[6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}피리딘-3-일)메탄설폰아마이드;
N-(5-{4-[2-아미노-6-에틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}-2-클로로피리딘-3-일)메탄설폰아마이드;
N-{5-[4-(2-아미노-5-에테닐피리미딘-4-일)-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일]-2-클로로피리딘-3-일}메탄설폰아마이드;
N-{5-[4-(2-아미노-5-에틸피리미딘-4-일)-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일]-2-클로로피리딘-3-일}메탄설폰아마이드; 또는
N-[2-클로로-5-(4-{2-[(다이메틸아미노)메틸]-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일}-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일)피리딘-3-일]메탄설폰아마이드;
N-(2-클로로-5-{4-[2-{[(2,2-다이플루오로에틸)아미노]메틸}-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}피리딘-3-일)메탄설폰아마이드;
N-[2-클로로-5-(4-{2-[(다이메틸아미노)메틸]-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일}-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일)피리딘-3-일]메탄설폰아마이드;
선택적으로 이들의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 1) 표 1로부터 선택된, 화학식 I의 화합물, Ia, Ib, Ic, Id 및 Ie, 단일 입체이성질체 또는 이성질체들의 혼합물, 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 염 및 2) 그의 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 PI3K/mTOR에 의해 직접 혹은 간접적으로 영향받는 비제어된, 비정상의 및/또는 원치 않는 세포 활성과 연관된 질환, 장애 또는 증후군을 치료하는 방법을 제공하되, 해당 방법은, 치료적 유효량의 화학식 I, Ia, Ib, Ic, Id 및 Ie의 화합물, 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 염 혹은 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 인간에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 질환은 암이다.
이 양상의 일 실시형태에 있어서, 상기 암은 유방암, 외투세포 림프종, 신장 세포 암종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, NPM/ALK-변형 역형성 대세포 림프종, 미만성 큰 B세포 림프종, 횡문근육종, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 비소세포 폐 암종, 소세포 폐 암종, 샘암종, 결장암, 직장암, 위 암종, 간세포 암종, 흑색종, 췌장암, 전립선 암종, 갑상선 암종, 역형성 대세포 림프종, 혈관종, 교모세포종 또는 두경부암이다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 질환, 장애 또는 증후군을 치료하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은, 치료적 유효량의 화학식 I, Ia, Ib, Ic, Id 및 Ie의 화합물, 혹은 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 치료적 유효량의 화학식 I, Ia, Ib, Ic, Id 및 Ie의 화합물, 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 질환은 암이다.
본 양상의 일 실시형태에 있어서, 상기 암은 유방암, 외투세포 림프종, 신장 세포 암종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, NPM/ALK-변형 역형성 대세포 림프종, 미만성 큰 B세포 림프종, 횡문근육종, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 비소세포 폐 암종, 소세포 폐 암종, 샘암종, 결장암, 직장암, 위 암종, 간세포 암종, 흑색종, 췌장암, 전립선 암종, 갑상선 암종, 역형성 대세포 림프종, 혈관종, 교모세포종 또는 두경부암이다.
다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물들인 본 발명의 화합물들은 또한, 본 명세서에 기재된 질환을 비롯한, 생물학적 과정에서 PI3Kα및/또는 mTOR의 생체내 역할을 연구하기 위한 생체내 PI3Kα, PI3Kβ및/또는 mTOR의 억제제로서 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 화합물 혹은 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 생체 내 PI3Kα 및/또는 mTOR을 억제하는 방법을 포함한다.
위에서 제공된 바와 같은 실시형태들 중 어느 하나의 다른 실시형태에 있어서, 상기 암은 유방암, 외투세포 림프종, 신장 세포 암종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, NPM/ALK-변형 역형성 대세포 림프종, 미만성 큰 B세포 림프종, 횡문근육종, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 비소세포 폐 암종, 소세포 폐 암종, 샘암종, 결장암, 직장암, 위 암종, 간세포 암종, 흑색종, 췌장암, 전립선 암종, 갑상선 암종, 역형성 대세포 림프종, 혈관종, 교모세포종 또는 두경부암이다.
다른 실시형태는 PI3K 동질효소의 선택적 억제제를 확인하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은, (a) PI3K-α 내에 제1돌연변이를 가진 제1세포를 후보 억제제와 접촉시키는 단계; (b) 상기 PI3K-α 내에 야생형 PI3K-α, PTEN 삭제 돌연변이(null mutation) 또는 제2돌연변이를 가진 제2세포를 상기 후보 억제제와 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 제1 및 상기 제2세포 내의 AKT 인산화를 측정하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 제2세포와 비교해서 상기 제1세포에서의 감소된 AKT 인산화는 상기 후보 억제제를 선택적 PI3K-α억제제로서 확인해준다. 이것 및 이하에 제공된 다른 실시형태에 있어서, 상기 후보 억제제는 화학식 I의 또는 표 1의 화합물이다.
본 발명의 방법을 이용해서 선별될 수 있는 후보 억제제 화합물의 라이브러리는 다수의 회사로부터 구매되거나 제조될 수 있다. 합성 화합물 라이브러리는, 예를 들어, 콤게넥스(Comgenex)(뉴저지주의 프린스턴시에 소재), 브란돈 어소시에이츠(Brandon Associates)(뉴햄프셔주의 메리맥시에 소재), 마이크로소스(Microsource)(코네티컷주의 뉴 밀퍼드시에 소재) 및 알드리치(위스콘신주의 밀워키시에 소재)로부터 상업적으로 입수가능하다. 후보 억제제 화합물의 라이브러리는 또한 대형 화학사들에 의해 개발되어 있고, 또한 이들로부터 상업적으로 입수가능하다. 추가적으로, 내츄럴 컬렉션(natural collection), 합성적으로 생산된 라이브러리 및 화합물들은 통상의 화학적, 물리적 및 생화학적 수단을 통해서 용이하게 변성된다.
본 명세서에 기재된 선별 방법의 실시에서 이용될 세포는 1차 세포, 2차 세포 또는 무한증식 세포(immortalized cell)(예컨대, 확립된 세포주)일 수 있다. 이들은 당업계에 잘 알려진 기술에 의해 제조될 수 있거나(예를 들어, 세포는 환자 혹은 건강한 공여자로부터의 세침 생검에 의해 얻어질 수 있거나) 또는 면역학적 및 미세생물학적 상업 자원들로부터(예를 들어, 버지나아주의 머내서스시에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection: ATCC)으로부터) 구입할 수 있다. 대안적으로 혹은 추가적으로, 세포는 예를 들어 관심 대상 유전자를 포함하도록 유전공학적으로 조작될 수 있다. 제1세트의 세포들에 있어서, 이들 세포는 PI3K-α 키나제 도메인, 예를 들어, H1047R에서 유전적 돌연변이를 지닌다. 선별 검정에서 이용될 제2세트의 세포들에 있어서, 이들 제2세트의 세포는 상이한 키나제 촉매 서브단위의 유전적 돌연변이(예를 들어, 나선형 도메인, 예를 들어, E545K 내 또는 상이한 조절 단백질, 예를 들어, 인산화효소 및 텐신 상동체(Phosphatase and Tensin Homolog: PTEN) 내의 돌연변이)를 지닌다. 후보 억제제가 상이한 키나제 촉매 단위 내의 유전적돌연변이(예를 들어, 나선형 도메인, 예를 들어, E545K 내, 또는 상이한 조절 단백질 내의 돌연변이)를 지니는 세포와 비교해서, PI3K-α 키나제 도메인 유전적 돌연변이를 지니는 세포 내에서 보다 높은 정도로 인산화(예를 들어 AKT 인산화)를 억제할 경우, 해당 후보 억제제는 PI3K-α 내 활성화 돌연변이를 지니는 암 혹은 종양에 대한 선택적 억제제이다. 역으로, PI3K-α-선택적 화합물은, PTEN 음성, PI3K-α 야생형, 및 PI3K-α-E545K 백그라운드에 비해서, PI3K-α-H1047R 돌연변이를 지니는 종양 세포에서 보다 큰 효능으로 AKT 인산화, PI3K 경로 활성화 및 세포 증식을 억제한다. PTEN 비활성화와 KRAS 활성화는 둘 모두 PI3K-α-선택적 화합물의 성장 억제 효과에 대해 세포를 탈감작화시킨다. 야생형 PI3K-α는 서열번호 1로 예시적으로 제공되고, 서열번호 2의 mRNA에 의해 암호화된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 선별 검정에 이용되는 제1 및 제2세포는 상이한 유전적 백그라운드를 지닌다. 일 실시형태에 있어서, 제1세포군은 PI3K-α 키나제 도메인 내에 유전적 돌연변이를 지닌다. 예시적인 실시형태에 있어서, 제1세포군 내의 유전적 돌연변이는 mRNA의 돌연변이(GenBank 등록 번호 NM 006218, 버전 NM 006218.2 GI: 키나제 도메인 내에 돌연변이를 지니는 전장(full length) PI3K-α를 암호화하는 서열번호 2로서 본 명세서에 개시된 54792081)를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 예시적인 돌연변이는 서열번호 2의 키나제 도메인 내에서 코돈(3296, 3297 및 3298)에 있으며, 여기서 해당 코돈은 서열번호 1에 제공된 PI3K-α의 위치 1047에서 히스티딘 이외의 아미노산을 제공하도록 돌연변이된다. 하나의 예시적인 돌연변이에서, 1047에 있는 히스티딘은 아르기닌으로 돌연변이된다(H1047R). 이 돌연변이는 PI3K/AKT 신호전달 경로에서 특별히 종양원소 돌연변이인 것으로 이미 보고된 바 있다. 제2세포군은 제1 시험 세포군의 돌연변이를 결여한다. 일 실시형태에 있어서, 예시적인 돌연변이는 서열번호 2의 나선형 도메인 내에서 코돈(1790, 1791 및 1792)에 있으며, 여기서 이 코돈은 서열번호 1에 제공된 PI3K-α의 위치 542 또는 545에 있는 글루탐 이외의 아미노산을 제공하도록 돌연변이된다. 하나의 예시적인 돌연변이에서, 545에 있는 글루탐산은 라이신으로 돌연변이된다(예를 들어, E542K 또는 E545K). 이 돌연변이는 또한 PI3K/AKT 신호전달 경로에서 특별히 종양원소 돌연변이인 것으로 이미 보고된 바 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 제2세포군은 PTEN 내에 돌연변이를 지닐 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 제1세포군은, 암 세포주, 예를 들어, PI3K-α의 H1047R het 유전적 돌연변이를 담지하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션((ATCC) 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션, 버지니아주의 머내서스시에 소재)으로부터 상업적으로 입수가능한 유방암 세포주를 포함하는 각종 세포주를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제1세포는 HCT-116, T-47D, MDA-MB-453, SIGOV-3, BT-20 또는 LS H74T 세포주를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제2세포는 MCF-7, PC3 MCI-H460, SK-BR-3, PC-3, MDA-MB-468, SK-BR-3, MDA-MB-231T 또는 A549를 포함할 수 있다. 각 특정 세포주는 구입 시 제공되는 설명서에 따라서 관리될 수 있고 ATCC를 통해 상업적으로 입수가능하다.
몇몇 실시형태에 있어서, 제1세포군과 제2세포군은 또한 돌연변이 PI3K-α 촉매 서브단위, 예를 들어, H1047R het 또는 E545K PI3K-α 촉매 서브단위로 형질전환된 비종양 세포주를 포함할 수 있다. 핵산 및 벡터를 단리된 세포 내로 도입하고 시험관내 형질전환된 숙주세포의 배양과 선택 방법은 당업계에 공지되어 있고, 염화칼슘-매개 형질전환, 형질도입, 컨쥬게이션, 삼친혼성화 짝짓기(triparental mating), DEAE, 덱스트란-매개 형질주입, 감염, 리포좀을 이용한 막 융합, DNA-코팅된 미세투사물(microprojectile)에 의한 고속 충격, 단일 세포 내로의 직접 미세주입 및 전기천공의 이용을 포함한다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 상기 참조; Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 2nd ed., McGraw-Hill Professional, 1995; 및 Neumann et al., EMBO J., 1: 841 (1982)] 참조). 다양한 발현 벡터를 이용해서 일시적으로 혹은 안정적으로 진핵 세포 형질전환하기 위한 방법이 몇 가지 있다. 관심대상 돌연변이된 PI3K-α 촉매 서브단위를 암호화하는 DNA의 서열을 증폭시킴으로써 세포주, 예를 들어 NIH 3T3을 돌연변이시키는 방법. 증폭된 PCR 돌연변이 PI3K-α 작제물은, 바이러스 발현 벡터, 예를 들어, 높은 수준의 10A1 MLV Env를 발현하도록 설계된, pSX2 내로 유인원 바이러스 40 조기 프로모터-네오마이신 포스포트랜스페라제 유전자를 삽입함으로써 제조된 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스(MLV) 긴 말단 반복-구동 발현 벡터인 pSX2neo로 복제(clone)될 수 있다. NIH 3T3 세포의 형질전환은 상이한 CaPO4 공침 수법을 이용한 형질주입에 수행될 수 있다. 컨플루언스(confluence)에 도달한 후, 세포는 덱사메타손 없이 5% FBS를 함유하는 배지 내로 이송될 수 있다. 형태학적으로 변형된 세포는 작은 구멍 피펫(미세 팁을 부여하도록 화염 상에서 인발된 파스퇴르 피펫)을 이용해서 세포층으로부터 변형된 포커스를 잘라내고 해당 피펫에 부착된 고루 벌브를 이용해서 그 포커스를 흡인함으로써 변형된 및 비변형된 Env-플라스미드-형질감염된 세포의 혼합물로부터 분리되고 단리될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 방법은 세포가 후보 억제제의 존재에서 시험되는 것을 필요로 하며, 여기서 상기 후보 억제제는 개별의 예시적인 검정 웰에 첨가하고, 각 웰은 제1 또는 제2세포를 수용한다. 후보 억제제의 양은 다양할 수 있으므로, 억제 활성의 범위는 그 후보 억제제에 대해서 IC50의 결정을 위하여 결정될 수 있다. 이것은 적절한 용매, 예를 들어, DMSO 중에서 이어서 제1 및 제2세포가 인큐베이션 중인 배양 배지 중에서 단계적으로 희석시킴으로써 용이하게 달성될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 후보 억제제의 농도는 약 1pM 내지 약 1mM 농도 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 후보 억제제는 약 0.5nM 내지 약 10μM의 범위의 양으로 첨가된다. 제1 및 제2세포군을 이용한 후보 억제제의 인큐베이션은, 전형적으로 약 30분 내지 약 60시간의 범위로, 다양할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 특히 PI3K-α 매개 활성에 의해, 세포는 성장 인자로 자극된다. 성장 인자의 선택은, 세포주의 요건에 의해 매개되며, 예를 들어, 예시적인 성장 인자는 VEGF, IGF, 인슐린 및 헤레굴린(heregulin)을 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 후보화합물의 억제 활성은 각종 세포 활성을 이용해서 측정될 수 있다. 암 세포주가 이용 중인 경우, PI3K 매개 활성, 예컨대, AKT 인산화(잔기 S473와 T308 둘 모두), AKT 활성화, 세포 증식 및 세포 내 아폽토시스 저항의 억제가 모두 측정될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제1 및 제2세포군에서의 AKT 인산화의 양은 AbCam(매사추세츠주의 캠브리지시에 소재)으로부터 상업적으로 입수가능한 포스포-특이적 항체(예를 들어 AKT1(포스포 S473) 카탈로그 번호 ab8932, AKT1(포스포 T308) 카탈로그 번호 ab66134)를 이용해서 측정될 수 있다. 제1 및 제2세포군 내의 PI3K-α 활성의 억제를 측정하기 위한 기타 방법은 문헌[Donahue, A.C. et al., Measuring phosphorylated Akt and other phosphoinositide 3-kinase-regulated phosphoproteins in primary lymphocytes. Methods Enzymol. 2007(434):131-154 ]에 기재되어 있으며, 이 문헌은 참조로 그의 전문이 본 명세서에 병합된다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 PI3K-α를 포함하는 종양을 지니는 암환자에 대한 치료 요법을 결정하는 방법을 제공하되, 해당 방법은,
PI3K-α의 아미노산 1047 및/또는 545 내의 돌연변이의 존재 유무를 결정하는 단계를 포함하며,
상기 PI3K-α가 위치 1047에서 돌연변이를 지닌다면, 상기 방법은 치료적 유효량의 PI3K-α 선택적 억제제 화합물을 상기 암환자에게 투여하는 단계를 포함하거나; 또는
상기 PI3K-α가 위치 545에서 돌연변이를 지닌다면, 상기 방법은 치료적 유효량의 PI3K-α 선택적 억제제와 PI3K-β 선택적 억제제의 조합물, 이중 PI3K-α/mTOR 선택적 억제제, 또는 PI3K-α 선택적 억제제와 mTOR 선택적 억제제의 조합물을 상기 암환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 PI3K-α를 포함하는 종양을 지니는 암환자에 대한 치료 요법을 결정하는 방법을 제공하되, 해당 방법은,
PI3K-α의 아미노산 1047 및/또는 545 내의 돌연변이의 존재 유무를 결정하는 단계를 포함하며,
상기 PI3K-α가 위치 1047에서 돌연변이를 지닌다면, 상기 방법은 대상체에 대한 치료적 유효량의 PI3K-α 선택적 억제제 화합물, 이중 PI3K-α/mTOR 선택적 억제제, PI3K-α 선택적 억제제와 mTOR 선택적 억제제의 조합물을 상기 암환자에게 투여하는 단계를 포함하거나; 또는
상기 PI3K-α가 위치 545에서 돌연변이를 지닌다면, 상기 방법은 치료적 유효량의 PI3K-α 선택적 억제제와 PI3K-β 선택적 억제제의 조합물, 이중 PI3K-α/mTOR 선택적 억제제, 또는 PI3K-α 선택적 억제제와 mTOR 선택적 억제제의 조합물을 상기 암환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 PI3Kα 선택적 억제제에 의한 치료로부터 더욱 유익할 것 같은 암환자 모집단뿐만 아니라 덜 유익할 것 같은 환자 모집단을 확인하는데 이용될 수 있다.
본 발명은 연장된 시험관내 세포주 증식 및 생체내 약력학 및 효능 연구에 의해 PI3Kα 억제제 민감성 종양 서브타입을 확인하는 유전자 마커 혹은 유전자 발현 표시(gene expression signature)를 더욱 규정하는데 이용될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에서 예시적인 암에 걸린 암환자에 대한 치료 요법을 결정하는 방법은 본 명세서에 기재된 PI3K-α 돌연변이된 백그라운드를 지니는 암에서의 PI3K-α 선택적 억제제의 차동적 활성의 기초 상에서 용이하게 수행될 수 있다. 종양이 키나제 도메인 내에 PI3Kα 돌연변이, 예를 들어, H1047R로 되는 돌연변이를 지니는지의 여부를 판정하기 위하여 종양 세포가 분석되어 있고 또한 검정되어 있는 환자에서, 보다 큰 효능과 처리 개선이 PI3K-α 선택적 억제제를 포함하는 치료를 맞춤화함으로써 달성될 수 있다. PI3Kα키나제 도메인 내에 돌연변이를 지니지 않는 종양을 지니는 환자에 대해서, 치료는, 예를 들어, PI3K-α 선택적 억제제와 PI3K-β 선택적 억제제의 조합물, 이중 PI3K-α/mTOR 선택적 억제제, 또는 PI3K-α 선택적 억제제와 mTOR 선택적 억제제의 조합물의 전달에 역점을 둠으로써, 상이한 치료 요법을 채택하는 것을 필요로 할 수 있다. 위에 표시된 바와 같이, PI3K-α 선택적 억제제, mTOR 선택적 억제제 및 이중 PI3K-α/mTOR 선택적 억제제는 표 1, 그리고 본 명세서의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에 예시되어 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 치료 요법을 결정하기 위한 방법은 대상체의 종양 내에서 PI3K-α의 아미노산 1047 및/또는 545에서의 돌연변이의 존재를 판정하는 단계를 포함한다. 이 단계는, 돌연변이 특이적 항체를 이용해서 핵산 접근법, 단백질 분리 접근법 또는 직접 면역 접근법을 이용하여 각종 방식으로 달성될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 대상체의 종양 내에서 PI3K-α의 아미노산 1047 및/또는 545에서의 돌연변이의 존재는 아미노산의 서열 분석에 대한 임의의 적절한 방법을 이용해서 결정될 수 있다. 적절한 기술의 예는, 웨스턴 블롯 분석, 면역침강, 방사선 면역(radioimmunoassay: RIA) 또는 효소-결합 면역흡수 검정(enzyme-linked immunoabsorbent assay: ELISA)을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, PI3Kα의 아미노산 서열 내의 위치에 대한 기준은 서열번호 1을 참조하여 행해진다. PI3Kα의 뉴클레오타이드 서열 내의 위치에 대한 기준은 서열번호 2를 참조하여 행해진다. 야생형 단백질 서열 내의 특정 아미노산은 단백질 서열 내의 위치에 의해 수반되는 단일 문자 아미노산 표기를 이용해서 기재되며, 예를 들어, E545는 위치 545가 글루탐산인 것을 나타낸다. 특정 위치에서 치환을 나타내기 위하여, 치환된 아미노산은 위치를 수반하고, 예를 들어 E545K는 위치 545에서의 글루탐산이 라이신으로 대체된 것을 나타낸다.
PI3K-α 펩타이드 서열의 서열 내 돌연변이의 존재 유무를 판정하는 것은, 일반적으로 환자의 신체로부터 제거된 종양 시료를 이용하는 시험관내 방법을 이용해서 결정된다.
PI3Kα의 아미노산 서열 또는 그의 일부에서 돌연변이의 존재 유무를 판정하는 것은 임의의 적절한 방법을 이용해서 수행될 수 있다. 예를 들어, PI3Kα의 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 일부가 결정될 수 있고, 뉴클레오타이드 서열 또는 PI3K-α 단백질로부터 추론된 아미노산 서열이 직접 얻어질 수 있다.
PI3K-α의 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 일부는 핵산의 서열 분석을 위하여 임의의 방법을 이용해서 결정될 수 있다. 유전자 내의 서열 돌연변이의 확인 방법은 당업계에 충분히 공지되어 있고, PI3Kα 내의 돌연변이는 임의의 적절한 방법에 의해 확인될 수 있다. 이들 방법은, 다이나믹 대립유전자-특이적 혼성화(dynamic allele-specific hybridization); 분자 비콘의 이용; 예를 들어, DNA 리가제, DNA 폴리메라제 혹은 뉴클레아제를 이용하는 효소 기반 방법; PCR 기반 방법, 전체 게놈 서열결정; 부분 게놈 서열결정; 엑솜 서열결정; 핵산 프로브 혼성화; 및 제한 효소 소화 분석을 포함할하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
직접 DNA 서열 결정 방법은 당업계에 충분히 공지되어 있다(예를 들어: 문헌[Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert E. Kingston, David D. Moore, J. G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl에 의해 편찬된 Current Protocols in Molecular Biology, 및 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Joe Sambrook, David W Russel, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press] 참조). 이들 서열결정 프로토콜은, 예를 들어, 방사성 표지된 뉴클레오타이드, 및 형광 염료로 표지된 뉴클레오타이드의 사용을 포함한다.
예를 들어, Barbi, S. 등은 PI3K-α의 나선형 도메인(엑손 9) 및 키나제 도메인(엑손 20)의 서열에 대한 이하의 프로토콜을 이용하였다. 정상 및 종양 DNA는 파라핀-포매된 조직으로부터 추출되었고, 형광 염료-표지된 프라이머인 이하의 프라이머 쌍을 이용해서 증폭되었다. 프라이머 서열은, 근방의 유사한 서열에 대한 착오 혼성화의 가능성을 회피하기 위하여, DNA의 영역에 대해서 유일하게 선택하기 위하여 채택되는데 필요하다. 통상적으로 이용되는 방법은 프라이머가 결합될 수 있는 모든 가능한 영역이 보여질 수 있는 BLAST 탐색이다. 프라이머 자체뿐만 아니라 뉴클레오타이드 서열은 모두 BLAST 탐색될 수 있다. 유리 NCBI 툴 프라이머-BLAST(free NCBI tool Primer-BLAST)는, 비콘 디자이너(Beacon Designer)(Premier Biosoft International, 캘리노포니아주의 팔로알토시에 소재) 등과 같은 상업적 소프트웨어 제품인, 하나의 용도 내로 프라이머 설계 툴과 BLAST 탐색을 통합한다. 모노뉴클레오타이드 반복은, 루프 형성이 일어나고 착오 혼성화에 기여할 수 있으므로, 회피되어야만 한다. 또한, 컴퓨터 프로그램은 적절한 프라이머의 설계를 원조하기 위하여 용이하게 이용가능하다. 소정의 실시형태에 있어서, 핵산 프로브는 서던(Southern) 혼성화 검정에서 이용하기 위하여 표지된다. 핵산 프로브는 방사성 표지되거나 형광 표지될 수 있거나, 또는 면역적으로 검출가능하며, 특히, 디곡시게닌-표지된다(Roche Diagnostics GmbH, 만하임시에 소재).
몇몇 실시형태에 있어서, 엑손 9 내의 나선형 도메인 돌연변이의 존재를 판정하는 것은 순방향 프라이머와 역방향 프라이머: GGGAAAAATATGACAAAGAAAGC(서열번호 3) 및 CTGAGATCAGCCAAATTCAGTT(서열번호 4)를 각각 이용하는 것을 포함하고, 서열결정 프라이머는 TAGCTAGAGACAATGAATTAAGGGAAA(서열번호 5)를 포함할 수 있다.
엑손 20 내의 키나제 도메인에서의 돌연변이를 판정하기 위하여, 예시적인 세트의 프라이머는 순방향 및 역방향 프라이머 CTCAATGATGCTTGGCTCTG(서열번호 6) 및 TGGAATCCAGAGTGAGCTTTC(서열번호 7) 각각을 포함할 수 있고, 서열결정 프라이머는 TTGATGACATTGCATACATTCG(서열번호 8)를 포함할 수 있다. 증폭 산물은 이어서 서열결정될 수 있다(Barbi, S. et al. J. Experimental and Clinical Cancer Research 2010, 29:32). 서열은 이어서 비교되어, 야생형 PI3K-α 서열과 종양 PI3K-α의 서열 간의 차이를 결정한다. 이 검정은 또한 종양 DNA를 단지 증폭시켜 해당 종양 내의 PI3K-α 서열을 서열번호 1의 서열과 비교함으로써 수행될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명은 고도로 엄격한 조건 하에서 PI3K-α의 키나제 도메인, 또는 나선형 영역에 혼성화될 수 있는 서열 2로부터 전부 혹은 일부의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 PI3K-α 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 특이적 돌연변이를 지니는 PI3K-α를 전부 혹은 부분적으로 암호화하는 핵산 서열에 대해 상보적인 서열을 포함할 수 있다. "상보적인" 및 "상보성"이란 용어는 염기-짝짓기 규칙에 의해 관련된 폴리뉴클레오타이드(즉, 뉴클레오타이드의 서열)를 지칭한다. 예를 들어, 상기 서열에 대해서 "A-G-T"는 서열 "T-C-A"에 대해서 상보적이다. 상보성은 "부분적"일 수 있는데, 여기서, 핵산 염기들의 단지 몇몇만이 염기 짝짓기 규칙에 따라서 정합된다. 또는, 핵산 간에 "완전한" 혹은 "전체" 상보성이 있을 수 있다. 핵산 가닥들 간의 상보성의 정도는 핵산 가닥들 간의 혼성화의 효율과 강도에 상당한 영향을 지닌다. 이것은 증폭 반응뿐만 아니라 핵산 간 결합에 의존하는 검출 방법에서 특히 중요하다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명은 고도로 엄격한 조건 하에서 키나제 도메인 oPI3K-α 또는 나선형 영역에 혼성화 가능한 서열번호 2로부터 폴리뉴클레오타이드 서열을 전부 혹은 일부 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 방법은 서열번호 1의 위치 1047, 542 또는 545에서 아미노산의 돌연변이가 있는지의 여부를 판정하기 위한 검정에 있어서 대상체의 종양으로부터 단리된 RNA를 이용하는 것을 포함하며, 상기 검정은 (a) 상기 RNA 시료를 등가의 cDNA로 역전사시키는 단계; (b) PI3K-α 유전자의 미리 결정된 영역에 관한 핵산 프로브의 쌍을 이용해서 cDNA의 미리 결정된 영역을 증폭시키는 단계; (c) 상기 증폭된 cDNA 영역의 폴리뉴클레오타이드 서열을 얻기 위하여 상기 증폭된 cDNA 영역을 서열결정하는 단계; 및 (d) 상기 증폭된 cDNA 영역이 서열번호 1의 위치 1047, 542 또는 545에서 아미노산을 암호화하는 코돈에서 유전자 돌연변이를 포함하는지의 여부를 판정하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 방법은, 1쌍의 핵산 프라이머, 즉, 서열번호 1의 아미노산 1047 또는 542 또는 545에서 아미노산을 암호화하는 DNA 코돈의 상류에 있는 cDNA에 대해 엄격하게 혼성화가능한 제1핵산 프라이머와 서열번호 1의 아미노산 1047 또는 542 또는 545에서 아미노산을 암호화하는 DNA 코돈의 하류에 있는 cDNA에 대해 엄격하게 혼성화가능한 제2핵산 프라이머를 이용해서 cDNA를 증폭시킴으로써 cDNA의 미리 결정된 영역을 증폭하는 것을 이용할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 PI3K-α 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 특이적 돌연변이를 지니는 PI3K-α를 전부 혹은 일부 암호화하는 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. "상보적인" 및 "상보성"이란 용어는 염기-짝짓기 규칙에 의해 관련된 폴리뉴클레오타이드(즉, 뉴클레오타이드의 서열)를 지칭한다. 예를 들어, 상기 서열에 대해서 "A-G-T"는, 서열 "T-C-A"에 대해서 상보적이다. 상보성은 "전부 혹은 부분적"일 수 있는데, 여기서, 핵산 염기들의 단지 몇몇만이 염기 짝짓기 규칙에 따라서 정합된다. 또는, 핵산 간에 "완전한" 혹은 "전체" 상보성이 있을 수 있다. 핵산 가닥들 간의 상보성의 정도는 핵산 가닥들 간의 혼성화의 효율과 강도에 상당한 영향을 지닌다. 이것은 증폭 반응뿐만 아니라 핵산 간 결합에 의존하는 검출 방법에서 특히 중요하다.
핵산 혼성화와 관련하여 이용된 경우 "고도로 엄격한 조건"은 약 500개의 뉴클레오타이드 길이의 프로브가 이용될 경우 5×SSPE(43.8 g/ℓ NaCl, 6.9 g/ℓ NaH2PO4.H2O 및 1.85 g/ℓ EDTA, pH가 NaOH로 7.4로 조정됨), 0.5% SDS, 5×덴하르트 시약(Denhardt's reagent) 및 100 ㎍/㎖ 변성된 연어 정자 DNA로 이루어진 용액 중에서 42℃에서 결합 혹은 혼성화에 이어서 42℃에서 0.1×SSPE, 1.0% SDS를 포함하는 용액 중에서의 세척과 등가인 조건을 포함한다.
핵산과 관련하여 이용되는 경우의 "상동성"이란 용어는 상보성의 정도를 지칭한다. 전부 혹은 일부 상동성 또는 완전한 상동성(즉, 동일성(identity))이 있을 수 있다. "서열 동일성"이란 2개 이상의 핵산 혹은 단백질 간의 관련성의 척도를 지칭하며, 전체 비교 길이를 기준으로 백분율로서 부여된다. 동일성 계산은 그들 각각의 보다 큰 서열에서 동일한 상대 위치에서 그리고 동일한 이들 뉴클레오타이드 혹은 아미노산 잔기를 고려한다. 동일성의 계산은 "GAP"(Genetics Computer Group, 위스콘신주의 매디슨시에 소재) 및 "ALIGN"(DNAStar, 위스콘신주의 매디슨시에 소재) 등과 같은 컴퓨터 프로그램 내에 포함된 알고리즘에 의해 수행될 수 있다. 일부 상보적인 서열은 "실질적으로 상동성"이라는 기능적 용어를 이용해서 지칭되는, 표적 핵산에 대한 혼성화로부터 완전히 상보적인 서열을 적어도 부분적으로 억제(또는 상기 서열과 경쟁)하는 것이다. 표적 서열에 대해 완전히 상보적인 서열의 혼성화의 억제는 낮은 엄격한 조건 하에 혼성화 검정(서던 혹은 노던 블롯(Southern or Northern blot), 용액 혼성화 등)을 이용해서 조사될 수 있다. 실질적으로 상동성인 서열 혹은 프로브는 낮은 엄격한 조건 하에 표적에 완전히 상동성인 서열의 결합(즉, 혼성화)과 경쟁하고 억제할 것이다. 이것은, 낮은 엄격한 조건이 비특이적 결합이 허용되도록 한다는 것은 아니다; 낮은 엄격한 조건은 두 서열의 서로에 대한 결합이 특이적(즉, 선택적) 상호작용이라는 것을 필요로 한다. 비특이적 결합의 부재는 심지어 상보성의 부분적인 정도(즉, 약 30% 미만의 동일성)를 결여하는 제2표적의 사용에 의해 시험될 수 있고; 비특이적 결합의 부재 시, 프로브는 제2의 비상보적인 표적에 상보적이 아닐 것이다.
바람직한 실시형태에 있어서, 혼성화 조건은 핵산 결합 복합체의 용융 온도(Tm)에 의거하고 규정된 "엄격함"을 부여한다. "혼성화"란 용어는 상보적인 핵산들의 짝짓기를 지칭한다. 혼성화 및 혼성화의 강도(즉, 핵산들 간의 연결 정도)는 핵산들 간의 상보적인 정도, 내포된 조건의 엄격함, 형성된 혼성화물의 Tm 및 핵산 내의 G:C비와 같은 인자에 의해 영향받는다. 그의 구조 내에 상보적인 핵산의 짝짓기를 포함하는 단일 분자는 "자체-혼성화"된다고 지칭된다.
"Tm"이란 용어는 핵산의 "용융 온도"를 지칭한다. 용융 온도는 이중 가닥 핵산 분자의 모집단이 단일 가닥으로 절반 해리되는 온도이다. 핵산의 Tm을 계산하는 등식은 당업계에 잘 알려져 있다. 표준 기준에 의해 표시된 바와 같이, Tm값의 단순한 추정치는, 핵산이 1M NaCl의 수성 용액에 있을 때, 등식: Tm =81.5+0.41(% G+C)에 의해 계산될 수 있다. "엄격"이란 용어는 온도, 이온 강도 및 다른 화합물, 예컨대, 유기 용매의 존재 조건을 지칭하며, 이러한 조건 하에서 핵산 혼성화가 수행된다. "고도로 엄격"한 조건에 의해, 핵산 염기 짝짓기는 높은 빈도의 상보적인 염기 서열을 지니는 핵산 단편들 간에서만 일어날 것이다.
또한, PI3Kα에서의 서열 돌연변이는, 특히 상보적인 염기 짝짓기를 포함하는 임의의 이러한 방법에서, 단일-뉴클레오타이드 변형의 검출을 허용하는 임의의 서열-특이적 핵산 검출 방법을 이용해서 결정될 수 있다. 예를 들어, PI3K-α가 E545 돌연변이를 포함하는지를 판정하기 위하여, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1790, 1791 또는 1792(아미노산 서열 내의 위치 545와 대응하는 코돈)를 포함하는 PI3K-α 펩타이드 또는 그의 일부의 서열은, 위치 1790에서 뉴클레오타이드가 G인 경우에만 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 PI3Kα의 증폭을 허용하는 폴리메라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)에 이용된다. 반응 생성물이 형성되지 않으면, 위치 545에서의 아미노산이 돌연변이된다. 다른 예에서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는, 위치 3297에서 뉴클레오타이드가 A(뉴클레오타이드 3296, 3297 및 3298을 포함하는 코돈이 아미노산 서열 내의 위치 1047에 상당함)인 경우 증폭을 허용하도록 증폭을 허용하도록 설계된다. 이들 프라미어를 이용해서 어떠한 반응 생성물도 형성되지 않는다면, 위치 545에서의 아미노산이 돌연변이된다. PCR을 수행하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(문헌[Current Protocols in Molecular Biology, edited by Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert E. Kingston, David D. Moore, J. G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl; 및 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Joe Sambrook, David W Russel, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press] 참조).
다이나믹 대립 유전자-특이적 혼성화(dynamic allele-specific hybridization: DASH) 유전자형분석(genotyping)은 불일치된 염기 쌍의 불안정성에 기인하는 DNA 중의 용융 온도의 차를 이용한다. 이 기술은 자동화에 상당히 적합하다. 제1단계에서, DNA 세그먼트는 바이오틴화된 프라이머와의 PCR 반응을 통해서 증폭되어 비드에 부착된다. 제2단계에서, 증폭된 산물은 스트렙타비딘 칼럼에 부착되고 NaOH로 세척되어 비바이오틴화된 가닥을 제거한다. 서열-특이적 올리고뉴클레오타이드는 이어서 이중 가닥 DNA에 결합될 때 형광을 발하는 분자의 존재 시 부가된다. 이어서 강도는 Tm이 결정될 수 있을 때까지 온도가 증가함에 따라서 측정된다. 단일의 뉴클레오타이드 변화는 예상된 Tm보다 낮게 될 것이다(Howell W., Jobs M., Gyllensten U., Brookes A. (1999) Dynamic allele-specific hybridization. A new method for scoring single nucleotide polymorphisms. Nat Biotechnol. 17(1):87-8). DASH 유전자형분석은 Tm의 정량화가능한 변화를 측정하고 있기 때문에, SNP가 아니라 모든 유형의 돌연변이를 측정 가능하다. DASH의 다른 유익은 표지가 없는 프로브와 그의 간단한 설계및 성능 조건과 작용하는 그의 능력을 포함한다.
분자 비콘은 또한 DNA 서열 내 돌연변이를 검출하는데 이용될 수 있다. 분자 비콘은 특이적으로 공학적으로 조작된 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용한다. 올리고뉴클레오타이드는, 일단부에 상보적인 영역이 있고 그 사이에 프로브 서열이 위치되도록 설계된다. 이 설계는 헤어핀, 또는 스템-루프(stem-loop), 그의 자연적인 단리된 상태의 구조를 취할 수 있게 한다. 프로브의 일단부에 형광단이 부착되고, 타단부에 형광 소광제(fluorescence quencher)가 부착된다. 프로브의 스템-루프 구조 때문에, 형광단은 상기 소광제에 근접하게 있고, 따라서 분자가 어떠한 형광이라도 발광하는 것을 방지한다. 분자는 또한 단지 프로브 서열이 검정에 이용될 게놈 DNA에 대해 상보적이 되도록 공학적으로 조작된다(Abravaya K., Huff J., Marshall R., Merchant B., Mullen C., Schneider G., and Robinson J. (2003) Molecular beacons as diagnostic tools: technology and applications. Clin Chem Lab Med. 41:468-474). 분자 비콘의 프로브 서열이 검정 동안 그의 표적 게놈 DNA와 조우한다면, 이것은 어닐링되고 혼성화될 것이다. 프로브 서열의 길이 때문에, 프로브의 헤어핀 세그먼트는 보다 길고 더욱 안정적인 프로브-표적 하이브리드 형성을 위하여 번성될 것이다. 이 입체형태적 변화는 형광단 및 소광제가 헤어핀 연합으로 인해 그들의 밀접한 인접함이 없도록 허용하므로, 분자가 형광을 발할 수 있다. 한편, 프로브 서열이 하나의 비상보적인 뉴클레오타이드와 같은 작은 정도로 표적 서열과 조우한다면, 분자 비콘은 그의 천연 헤어핀 상태에서 우선적으로 머물 것이고, 형광단이 소광된 채로 있으므로 형광은 관찰되지 않을 것이다. 이들 분자 비콘의 고유한 설계는 주어진 위치에서 SNP를 식별하기 위하여 간단한 진단적 검정을 허용한다. 분자 비콘이 야생형 대립 유전자와 정합하고 다른 것이 대립 유전자의 돌연변이체와 정합하도록 설계되면, 이들 둘은 개별적인 유전자형을 확인하는데 이용될 수 있다. 단지 제1프로브의 형광단 파장이 검정 동안 검출된다면, 개체가 야생형과 상동성이다. 단지 제2프로브의 파장이 검출된다면, 개체는 돌연변이체 대립 유전자와 상동성이다. 마지막으로, 두 파장이 검출된다면, 양쪽 분자 비콘이 그들의 성분에 혼성화되어야만 하므로, 개체가 양쪽 대립유전자 모두를 포함하고 이질성이어야 한다.
효소 기반 핵산 방법이 또한 적절하며, PI3K-α 뉴클레오타이드 서열 내 돌연변이를 판정하기 위하여 고려된다. 예를 들어, 제한 단편 길이 다형성(Restriction fragment length polymorphism: RFLP)(이하에 더욱 상세히 논의됨)이 단일의 뉴클레오타이드 차이를 검출하기 위하여 이용될 수 있다. SNP-RFLP는 많은 상이한 제한 엔도뉴클레아제 및 독특하고 특이적인 제한 부위에 대한 그들의 높은 친화도를 이용한다. 게놈 시료에 대한 소화를 수행하고 겔 검정을 통해 단편 길이를 결정함으로써, 효소가 예상된 제한 부위를 절단했는지의 여부를 확인하는 것이 가능하다. 게놈 시료의 절단의 실패는 예상되는 단편보다 크게 확인되어 뉴클레아제 활성으로부터 보호가 부여된 제한 부위의 지점에서 돌연변이가 있다는 것을 의미한다.
"기능적으로 등가인 코돈"이란 용어는, 본 명세서에서는, 아르기닌에 대해서 6개의 코돈과 같이, 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈을 지칭하는데 이용된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 방법은 아미노산 1047을 암호화하는 코돈의 서열을 결정하기 위하여 적어도 하나의 핵산 프로브 또는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 방법은 아미노산 545를 암호화하는 코돈의 서열을 결정하기 위하여 적어도 하나의 핵산 프로브 또는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 PCR 프라이머, 바람직하게는 PCR 프라이머들의 세트인데, 이는 아미노산 1047을 암호화하는 코돈이 히스티딘을 암호화하는 경우에만 PI3Kα 핵산 서열 단편의 증폭을 허용한다. 다른 방법에서, PCR 프라이머 또는 PCR 프라이머들의 세트는 아미노산 545를 암호화하는 코돈이 글루탐산을 암호화하는 경우에만 핵산 서열 단편의 증폭을 허용한다. 적절한 PCR 프라이머의 결정은 당업계에서 일상적이다(Current Protocols in Molecular Biology, edited by Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert E. Kingston, David D. Moore, J. G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl; Looseleaf: 0-471-650338-X; CD-ROM: 0-471 -30661-4). 또한, 적절한 프라이머의 설계를 원조하기 위하여 컴퓨터 프로그램이 용이하게 이용가능하다. 소정의 실시형태에 있어서, 핵산 프로브는 서던 혼성화 검정에 이용하기 위하여 표지된다. 핵산 프로브는 방사성 표지되거나, 형광 표지되거나 또는 면역 검출가능하고, 특히 디곡시게닌-표지화된다(Roche Diagnostics GmbH, 만하임시에 소재).
미국 특허 공개 제20010016323호는 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 형광 공명 에너지 전이를 이용해서 점 돌연변이를 검출하는 방법을 개시한다. 프로브와 표적 DNA 가닥 간의 염기 불일치를 초래하는 점 돌연변이는 프로브와 표적이 완벽하게 일치한다면 복합체의 용융 온도를 프로브와 표적에 대한 용융 온도보다 낮게 한다.
단일의 점 돌연변이를 검출하는 다른 적절한 방법은, 예를 들어, 어레이 형태로 올리고뉴클레오타이드 프로브의 사용을 내포하는 미국 특허 공개 제2002010665호에 개시된 것을 포함한다. 이러한 어레이는 서열번호 3 내지 8 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 미국 특허 공개 제20020177157호 공보는 점 돌연변이를 검출하는 추가의 방법을 개시한다.
PI3K-α 키나제 도메인의 돌연변이, 예를 들어, 본 발명의 대상인 H1047R을 초래한 점 돌연변이를 수반하는 폴리뉴클레오타이드는 많은 이용가능한 기술 중 하나 이상을 이용해서 확인될 수 있다. 그러나, 검출은 본 명세서에 기재된 기술로 제한되는 것은 아니고, 본 발명의 방법과 조성물은 단지 예시 목적으로 제공되는 이들 방법으로 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오타이드와 올리고뉴클레오타이드 프로브는 또한 본 명세서에 개시되어 있고 본 발명의 범위 내이며, 이들 프로브는 이하에 기재된 기술들 중 하나 이상에 적합하다. 이들은 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오타이드 혼성화(ASO)를 포함하며, 이는, 일 실시형태에 있어서, 기지의 돌연변이의 대립유전자에 대응하는 1쌍의 올리고뉴클레오타이드와의 혼성화가 돌연변이를 검출하는 데 이용되는 진단적 돌연변이 검출 방법이다. 다른 적절한 방법은 변성 고성능 액체 크로마토그래피(denaturing high performance liquid chromatography: DHPLC)이며, 이는 불일치된 뉴클레오타이드들 간의 헤테로듀플렉스 형성의 검출에 의거해서 돌연변이와 다형성을 확인하도록 설계된 액체 크로마토그래피 방법이다. 특정 조건 하에서, 헤테로듀플렉스는 감소된 용융 온도 때문에 호모듀플렉스보다 조기에 칼럼으로부터 용리된다. 분석은 이어서 개별 시료에 대해 수행될 수 있다.
돌연변이 혹은 야생형 서열을 보유하는 DNA의 증폭된 영역은 DHPLC에 의해 분석될 수 있다. DHPLC의 이용은 미국 특허 제5,795,976호 및 제6,453,244호에 기재되어 있고, 이들 두 문헌은 참조로 본 명세서에 병합된다. 적절한 방법이 트랜스게노믹 웨이브(등록상표) 시스템(Transgenomic WAVE® System)을 이용해서 트랜스게노믹사(Transgenomic, Inc.)(네브라스카주의 오마하시에 소재)에 의해 제공된다.
ASO에 대해서, PI3K-α 돌연변이(H1047R 및/또는 E545K)를 포함하는 게놈 DNA 또는 cDNA의 영역은 PCR에 의해 증폭되고 듀플리케이팅 막 상으로 이전된다. 이것은 도트/슬롯 블로팅, 수동 스폿팅 또는 소화 및 서던 블로팅에 의해 수행될 수 있다. 상기 막은 미리 혼성화되고 나서, 돌연변이체 혹은 야생형 서열에 대해서 방사선표지되거나 또는 데옥시게닌(DIG) 표지된 올리고뉴클레오타이드와 혼성화된다. DIG 표지에 대해서, 검출은 화학발광법 혹은 비색법을 이용해서 수행된다. 이어서 막은 ASO가 비특이적 서열로부터 세척될 때까지 엄격성을 증가시키면서 세척된다. 방사선사진 노출 후, 산물은 각 올리고뉴클레오타이드에 대한 혼성화 수준에 대해서 점수 매겨진다. 최적으로는, 정확한 엄격함을 확인하기 위하여 각 필터 상에 정상 및 돌연변이 서열에 대한 대조군이 포함되며, 음성 PCR 대조군은 PCR 내의 오염을 체크하기 위하여 이용된다.
ASO 프로브의 크기는 당업계의 기술적 파라미터를 제외하고는 제한되지 않는다. 일반적으로, 너무 짧은 프로브는 위치에 대해 고유하지 않을 것이고, 너무 긴 프로브는 감도의 소실을 초래할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 길이가 15 내지 21개의 뉴클레오타이드이고, 해당 올리고뉴클레오타이드의 중심을 향하여 불일치하게 된다.
본 발명의 돌연변이를 검출하기 위하여 ASO 혼성화가 수행되는 시료 DNA의 영역은 바람직하게는 순방향 프라이머를 이용한 PCR에 의해 증폭된다. 엑손 9에 대해서, 순방향 프라이머와 역방향 프라이머는 각각 GGGAAAAATATGACAAAGAAAGC(서열번호 3) 및 CTGAGATCAGCCAAATTCAGTT(서열번호 4)였고, 서열결정 프라이머는 TAGCTAGAGACAATGAATTAAGGGAAA(서열번호 5)였으며, 엑손 20에 대해서, 순방향 및 역방향 프라이머는 각각 CTCAATGATGCTTGGCTCTG(서열번호 6) 및 TGGAATCCAGAGTGAGCTTTC(서열번호 7)였다. 이 경우, PCR 혹은 견줄만한 방법에 의한 증폭은 필수는 아니고 선택적으로 수행될 수 있다.
선택적으로, 위에 기재된 증폭된 영역들(서열번호 3 내지 8의 프라이머를 이용해서 생성된 306개의 뉴클레오타이드 영역 또는 이들 영역의 어느 하나의 보다 짧은 부분을 포함함) 중 하나 혹은 하나보다 많은 것은, 돌연변이를 검출하기 위하여 서열결정에 의해 분석될 수 있다. 서열결정은 당업계에서 일상적인 바와 같이 수행될 수 있다. 돌연변이의 존재를 확인하기 위하여, 서열결정될 영역의 선택에 대한 유일한 제한은, 서열결정을 위하여 선택된 영역이 돌연변이의 대상인 뉴클레오타이드를 포함해야만 한다는 점이다. 서열결정을 위하여 선택된 영역의 크기는 당업계에 공지된 바와 같은 기술적인 파라미터를 제외하고 제한되지 않으며, 본 명세서에 개시된 프라이머들인 서열번호 3과 4 및 6과 7을 이용해서 선택된 증폭된 영역들 간의 DNA 또는 RNA의 일부 혹은 전부 혹은 모두를 포함하는 보다 긴 영역이 서열결정될 수 있다.
상기 개시된 방법의 변화는 또한 돌연변이를 검출하는데 적합하다. 예를 들어, ASO의 변화에 있어서, ASO는 말단의 데옥시리보뉴클레오티딜 트랜스페라제를 지니는 단독중합체 테일을 부여하고, 나일론 막 상에 스폿팅되며, UV 조사에 의해 공유 결합된다. 표적 DNA는 바이오틴화된 프라이머로 증폭되고 고정된 올리고뉴클레오타이드를 보유하는 막에 하이브리드화되고 나서, 검출이 행해진다. 이 역 도트 블롯 기술의 일례는 이노제네틱스사(Innogenetics)(벨기에)로부터의 INNO-LIPA 키트이다.
돌연변이된 유전자와 유전자 산물, 즉, E545K 및 H1047R에서 돌연변이를 지니는 서열번호 1의 확인과 서열결정에 의해, 이 유전자 산물보다 높은 프로브 및 항체가 정상 혹은 돌연변이된 유전자 혹은 유전자 산물의 존재를 선별하고 검출하기 위하여 각종 혼성화 및 면역학적 검정에 이용될 수 있다.
이질성 세포계 내의 돌연변이된 유전자의 발현은 구조 기능 관계를 입증하기 위하여 이용될 수 있다. 세포를 형질주입시키기 위하여 플라스미드 발현 벡터 내로 DNA 서열을 결찰시키는 것은 각종 세포 생화학 파라미터에 대한 돌연변이의 영향을 시험하기 위하여 유용한 방법이다. 전체 정상 혹은 돌연변이 인간 혹은 마우스 서열 혹은 그의 일부를 보유하는 플라스미드 발현 벡터는, 조절 기능에 결정적인 단백질의 부분을 확인하는 시험관내 돌연변이유발 실험에 이용될 수 있다.
DNA 서열은 유전자 및 그의 산물의 발현을 이해하고, 또한 기능성 분석을 위하여, 항체 생산을 위하여 그리고 환자 치료를 위하여 다량의 단백질의 생산을 달성하기 위한 연구에서 조작될 수 있다. 서열의 변화는 상대적인 양, 조직-특이성 및 기능적 특성의 관점에서 발현 패턴을 변화시킬 수 있거나 혹은 변화시키지 않을 수도 있다.
변이체(예컨대, 돌연변이 또는 다형성) 핵산 서열의 분석을 위하여 다수의 방법이 이용가능하다. 다형체 혹은 돌연변이를 검출하기 위한 검정은 수개의 카테고리로 분류되며, 이 카테고리는, 직접 서열결정 검정, 단편 다형성 검정, 혼성화 검정 및 컴퓨터 기반 데이터 분석을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 이들 검정의 다수의 변형을 수행하기 위한 프로토콜 및 상업적으로 이용가능한 키트 혹은 서비스는 상업적으로 이용가능하며 당업자에게 공지되어 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 검정은 조합하여 혹은 조합된 부분으로 수행된다(예컨대, 수개의 검정으로부터 상이한 시약 혹은 기술이 조합되어 하나의 검정을 가져온다). 이하의 예시적인 검정은 관심 대상 PI3K-α 돌연변이의 돌연변이를 포함하는 핵산 분자를 선별하고 확인하는데 이용될 수 있다.
단편 길이 다형성 검정
본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 변종 서열은 단편 길이 다형성 검정을 이용해서 검출된다. 단편 길이 다형성 검정에 있어서, 일련의 위치에서 DNA를 분할하는 것에 기초한 고유한 DNA 밴드 패턴은 효소(예컨대, 제한 효소 혹은 CLEAVASE I[Third Wave Technologies, 위스콘신주의 매디슨시에 소재] 효소)를 이용해서 생성된다. SNP 또는 돌연변이를 포함하는 시료로부터의 DNA 단편은 야생형과는 상이한 밴드 패턴을 지닐 것이다.
PCR 검정
본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 변종 서열은 PCR-기반 검정을 이용해서 검출된다. 몇몇 실시형태에 있어서, PCR 검정은 PI3Kα의 변이체 혹은 야생형 대립유전자에만(예컨대, 돌연변이 또는 다수의 돌연변이의 영역에) 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 핵산 프라이머의 이용을 포함한다. 이들 두 세트의 프라이머는 DNA의 시료를 증폭하는데 이용된다. 단지 돌연변이 프라이머가 PCR 산물로 되면, 대상체의 종양 혹은 암은 PI3K-α 돌연변이 대립유전자 내에 체세포 돌연변이를 발현한다. PCR 증폭 조건은 이용된 특정 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 선별 중인 DNA 혹은 RNA의 품질과 유형, 그리고 당업자에게 공지된 적절한 시약 및/또는 PCR 사이클링 조건을 이용해서 제어될 수 있는 기타 잘 알려진 변수에 맞춤화된다.
RFLP 검정
본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 변종 서열은 제한 단편 길이 다형성 검정(RFLP)을 이용해서 검출된다. 관심 대상 영역은 우선 PCR을 이용해서 단리된다. PCR 산물은 이어서 주어진 다형성을 위하여 고유한 길이 단편을 부여하기 위하여 공지된 제한 효소로 분할된다. 제한-효소 소화된 PCR 산물은 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분리되고 브롬화에티듐 염색에 의해 가시화된다. 단편의 길이는 분자량 마커 및 야생형 및 돌연변이 대조군으로부터 생성된 단편과 비교된다.
직접 서열결정 검정
본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 변종 서열은 직접 서열결정 기술을 이용해서 검출된다. 이들 검정에 있어서, DNA 시료는 우선 임의의 적절한 방법을 이용해서 대상체로부터 단리된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 관심 대상 영역은 적절한 벡터로 복제되고, 숙주 세포(예컨대, 박테리아) 내에서의 성장에 의해 증폭된다. 다른 실시형태에 있어서, 관심 대상 영역의 DNA는 PCR을 이용해서 증폭된다.
증폭 후, 관심 대상 영역(예컨대, 관심 대상 SNP 또는 돌연변이를 포함하는 영역)의 DNA는, 예컨대, 방사성 마커 뉴클레오타이드를 이용하는 수동 서열결정 또는 자동 서열결정을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 임의의 적절한 방법을 이용해서 서열결정된다. 서열결정의 결과는 임의의 적절한 방법을 이용해서 표시된다. 서열은 조사되고, 주어진 SNP 또는 돌연변이의 존재 유무가 결정된다.
CFLP 검정
다른 실시형태에 있어서, 변종 서열은 CLEAVASE 단편 길이 다형성 검정(CLEAVASE fragment length polymorphism assay)(CFLP; Third Wave Technologies, 위스콘신주의 매디슨시에 소재; 예컨대, 미국 특허 제 5,843,654; 5,843,669; 5,719,208; 및 제5,888,780호 참조; 이들 각각은 참조로 본 명세서에 병합됨)을 이용해서 검출된다. 이 검정은, DNA의 단일 가닥들이 자체로 접힐 때, 이들이 DNA 분자의 정확한 서열에 대해서 고도로 개별적인 고차 구조를 취한다고 하는 관찰에 의거하고 있다. 이들 2차 구조는 단일 가닥 영역이 이중 가닥 DNA 헤어핀과 나란하도록 DNA의 부분적 듀플렉스 영역을 내포한다. CLEAVASE I 효소는 이들 단일 가닥 영역과 이중 가닥 영역 간의 접합을 인식하여 절단하는 구조-특이적 내열성 뉴클레아제이다. 관심 대상 영역은 우선 예를 들어 PCR을 이용해서 단리된다. 이어서, DNA 가닥은 가열에 의해 분리된다. 다음에, 반응물이 냉각되어 가닥내 2차 구조의 형성을 허용한다. PCR 산물은 이어서 CLEAVASE I 효소로 처리되어 주어진 SNP 또는 돌연변이에 고유한 일련의 단편을 생성한다. CLEAVASE 효소 처리된 PCR 산물은 분리되어, (예컨대, 아가로스 겔 전기영동에 의해) 검출되고, (예컨대, 브롬화에티듐 염색에 의해) 가시화된다. 단편의 길이는 분자량 마커, 그리고 야생형 및 돌연변이 대조군으로부터 생성된 단편과 비교된다.
혼성화 검정
본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 변종 서열은 혼성화 검정 시 혼성화 분석에 의해 검출된다. 혼성화 검정에 있어서, 주어진 돌연변이의 존재 유무는 시료로부터 상보적인 DNA 분자(예컨대, 본 명세서에 예시된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프로브들)에 혼성화되는 DNA의 능력에 기초하여 결정된다. 혼성화 및 검출을 위한 각종 기술을 이용하는 각종 혼성화 검정이 이용가능하다. 본 발명의 방법을 실시하기 위한 관련된 유용한 혼성화 검정이 이하에 제공된다.
혼성화의 직접 검출
몇몇 실시형태에 있어서, 관심 대상 서열에 프로브의 혼성화(예컨대, SNP 또는 돌연변이)는 결합된 프로브(예컨대, 노던 혹은 서던 검정; 예컨대, 문헌[Ausabel et al. (eds.) (1991) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY] 참조)를 가시화함으로써 직접 검출된다. 이들 검정에서, 게놈 DNA(서던) 또는 RNA(노던)가 대상체로부터 단리된다. DNA 혹은 RNA는 이어서 일련의 제한 효소로 절단되어 검정 중인 마커의 어느 것의 부근이 아니라 게놈에서 드물게 절단된다. 그 후, DNA 또는 RNA는 (예컨대, 아가로스 겔 상에서) 분리되고, 막으로 이송된다. 검출 중인 SNP 혹은 돌연변이에 대해서 특이적인 (예컨대, 라디오뉴클레오타이드를 혼입시킴으로써) 표지된 프로브 혹은 프로브들은 소정 조건, 또는 낮은, 중간 혹은 고도의 엄격한 조건 하에서 막을 접촉시키도록 허용한다. 미결합된 프로브는 제거되고, 결합의 존재는 표지된 프로브를 가시화시킴으로써 검출된다.
"DNA 칩" 검정을 이용하는 혼성화의 검출
본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 변종 서열은 DNA 칩 혼성화 검정을 이용해서 검출된다. 이 검정에 있어서, 일련의 올리고뉴클레오타이드 프로브는 고체 지지체에 고정된다. 올리고뉴클레오타이드 프로브는 주어진 SNP 또는 돌연변이에 대해서 고유하도록 설계된다. 관심 대상 DNA 시료는 DNA "칩"과 접촉되어 혼성화가 검출된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 예시적인 상업적으로 입수가능한 DNA 칩 어레이는 GENECHIP(등록상표)(미국 캘리포니아주의 산타클라라시에 소재한 아피매트릭스(Affymetrix)사로부터 상업적으로 입수가능함; 예컨대, 미국 특허 제6,045,996호; 제5,925,525호; 및 제5,858,659호를 참조할 수 있으며; 이들 문헌의 각각은 참조로 본 명세서에 병합됨) 어레이를 포함할 수 있다. GENECHIP(등록상표) 기술은 "칩"에 고정된 올리고뉴클레오타이드 프로브의 소형 고밀도 어레이를 이용한다. 프로브 어레이는 아피매트릭스사의 광 지향적 화학 합성 과정에 의해 제조되며, 이 과정은 고상 화학 합성을 반도체 산업에서 이용되는 포토리소그라피 제작 수법과 조합한 것이다. 일련의 포토리소그라피를 이용해서 칩 노광 부위를 규정하도록 마스킹하고 나서, 특정 화학 합성 단계들을 행하는데, 이 과정은 올리고뉴클레오타이드의 고밀도 어레이를 구축하며, 각 프로브는 어레이 내의 미리 규정된 위치에 있게 된다. 다수의 프로브 어레이는 다형 유리 웨이퍼 상에 동시에 합성된다. 이어서 웨이퍼는 다이싱되고, 개별 프로브 어레이가 사출 성형된 플라스틱 카트리지에 포장되어, 이들을 환경으로부터 보호하여 혼성화에 대한 챔버로서 제공한다.
분석될 핵산은 단리되고, PCR에 의해 분석되며, 형광 리포터군으로 표지된다. 표지된 DNA는 이어서 플루이딕스 스테이션(fluidics station)을 이용해서 어레이에서 인큐베이팅된다. 이어서, 어레이는 스캐너 내로 삽입되며, 여기서 혼성화의 패턴이 검출된다. 혼성화 데이터는, 프로브 어레이에 결합되는, 표적 내에 미리 혼입된 형광 리포터 군으로부터 방출된 광으로서 수집된다. 표적과 완전히 일치하는 프로브는 일반적으로 일치하지 않는 것들보다 강력한 신호를 발생한다. 어레이 상의 각각의 프로브의 서열과 위치는 알려져 있으므로, 상보성에 의해, 프로브 어레이에 적용된 표적 핵산의 동일성이 결정될 수 있다.
혼성화의 효소 검출
본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 혼성화는 특이적 구조의 효소 절단에 의해 검출된다(INVADER 검정, 써드 웨이브 테크놀로지(Third Wave Technologies)사; 예컨대, 미국 특허 제5,846,717호, 제6,090,543호; 제6,001,567호; 제5,985,557호; 및 제5,994,069호 참조; 이들 문헌의 각각은 참조로 본 명세서에 병합됨). INVADER 검정은 오버랩핑 올리고뉴클레오타이드 프로브의 혼성화에 의해 형성된 복합체를 절단하는 구조-특이적 효소를 이용함으로써 특이적 DNA 및 RNA 서열을 검출한다. 프로브들 중 하나의 과량 및 상승된 온도는 다수의 프로브가 온도 사이클링 없이 존재하는 각 표적 서열에 대해서 절단될 수 있게 한다. 이어서, 이들 절단된 프로브는 제2표지된 프로브를 직접 절단한다. 2차 프로브 올리고뉴클레오타이드는 내부 염료에 의해 소광되는 플루오레신으로 표지된 5'-말단일 수 있다. 절단 시, 탈소광된 플루오레신 표지된 산물은 표준 형광 플레이트 리더를 이용해서 검출될 수 있다. INVADER 검정은 미증폭 게놈 DNA 내의 특이적 돌연변이를 검출한다. 단리된 DNA 시료는 야생형 PI3K-α 서열 또는 본 발명의 돌연변이에 대해서 특이적인 제1프로브와 접촉되어 혼성화를 허용한다. 이어서, 플루오레신 표지를 포함하고 제1프로브에 특이적인 2차 프로브는 혼성화되고, 효소가 첨가된다. 결합은 형광 플레이트 리더를 이용해서 기지의 양성 및 음성 대조군에 대해서 시험 시료의 신호를 비교함으로써 검출된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 결합된 프로브의 혼성화는 타크만(TaqMan) 검정(PE 바이오시스템즈(PE Biosystems)사, 캘리포니아주의 포스터시티에 소재; 예컨대, 미국 특허 제 5,962,233호 및 제5,538,848호 참조, 이들 문헌의 각각은 참조로 본 명세서에 병합됨)을 이용해서 검출된다. 이 검정은 PCR 반응 동안 수행된다. 타크만 검정은 AMPLITAQ GOLD DNA 폴리메라제의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 이용한다. 주어진 대립유전자 혹은 돌연변이를 위하여 특이적인 프로브는 PCR 반응에 포함된다. 프로브는 5'-리포터 염료(예컨대, 형광 염료) 및 3'-소광제 염료(quencher dye)를 지니는 올리고뉴클레오타이드로 구성된다. PCR 동안, 프로브가 그의 표적에 결합되면, AMPLITAQ GOLD 폴리메라제의 5'-3' 핵산분해 활성은 리포터 염료와 소광제 염료 사이에서 프로브를 절단한다. 소광제 염료로부터 리포터 염료의 분리는 형광의 증가를 초래한다. 신호는 PCR의 각 사이클에서 축적되어, 형광계로 모니터링될 수 있다.
본 발명에 따르면, 전술한 진단적 선별을 위하여 필요한 시약을 포함하는 진단적 키트가 또한 제공된다. 예를 들어, 돌연변이체 PI3K-α 및 견줄만한 야생형 PI3K-α-관련 뉴클레오타이드 서열의 검출 및/또는 증폭을 위하여 존재하는 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 PCR 프라이머를 포함하는 키트가 제공될 수 있다. 재차, 이러한 프로브는 특이적 혼성화의 조기 검출을 위하여 표지화될 수 있다. 전술한 각종 진단적 실시형태에 적합한 바와 같이, 이러한 키트 내의 올리고뉴클레오타이드 프로브는 기질에 고정될 수 있고, 적절한 대조군이 제공될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오타이드 프로브의 예는 서열번호 3과 4 및 6과 7 중 적어도 하나를 포함하거나 또는 이것으로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
PI3Kα의 아미노산 서열 내의 돌연변이의 존재 유무의 결정은 아미노산의 서열 분석을 위한 임의의 방법을 이용해서 결정될 수 있다. 비제한적인 예는 대상체의 종양에서의 PI3Kα의 웨스턴 블롯 분석 혹은 ELISA 검정, 또는 직접 단백질 서열 결정을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 특히 유용한 항체는 야생형 PI3K-α 대 돌연변이 PI3Kα에 대한 선택성을 지니며, 예를 들어, 검정에 유용한 항체는 야생형 PI3K-α에 결합되거나, 또는 일부의 야생형 PI3Kα는 관심 대상 아미노산에서 돌연변이를 지니는 PI3Kα에에 결합되지 않는다. 특히 유용한 항체는 위치 1047에서 히스티딘을 지니는 야생형 PI3Kα를 결합하지만, 히스티딘 이외의 아미노산, 예컨대, 아르기닌을 지니는 돌연변이 PI3Kα를 결합하지 않으며, 즉, 항체는 위치 1047에서 히스티딘을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 마찬가지로, 위치 545에서 글루탐산을 지니는 야생형 PI3Kα를 결합하지만, 위치 545에서 글루탐산 이외의 아미노산, 예컨대, 그 위치에서 라이신을 지니는 돌연변이 PI3Kα를 결합하지 않는 항체가 특히 유용하다.
본 발명의 다른 실시형태는 PI3Kα의 변이된 형태에 결합하는 것에 비해서 야생형 PI3Kα 단백질에 대해서 선택적으로 결합하는 적어도 하나의 항체를 이용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 대안적으로, 항체는 야생형 PI3Kα 단백질에 결합하는 것에 비해서 PI3Kα의 변이된 형태에 대해서 선택적으로 결합하고, 야생형 PI3Kα와 PI3Kα-H1047R 간에 또는 야생형 PI3Kα와 PI3Kα-E545K 간에 구별될 수 있다. 비교적 소량(1㎎ 미만)으로 복합체 혼합물로부터 표적 단백질의 적절한 양을 단리시키는 방법은 통상적으로 당업자에게 공지되어 있다. 하나의 예시적인 실시형태에 있어서, 대상체의 종양 또는 암으로부터 종양 세포 또는 복수의 종양 세포는 프로테아제 억제제의 존재 하에 통상적으로 입수가능한 용해 시약을 이용해서 용해된다. 용해물은 맑아져서, 상청액은 전기영동되며, 돌연변이 특이적 항체를 이용한 웨스턴 블롯이 실시되거나, 또는 대안적으로 변이된 PI3Kα-H1047R 또는 PI3Kα-E545K는 선택적으로 면역침강되고 추가로 포획 항체로부터 해리되어 웨스턴 블롯이 실시되거나 직접 단백질 서열결정된다.
"항체"는, 인식되어, 면역글로불린 분자의 가변 영역 내에 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해서, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질 등과 같은, 표적에 특이적으로 결합하는 임의의 면역글로불린 분자를 포함한다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 이 용어는 가장 광범위한 의미로 이용되고, 항체가 목적으로 하는 생물학적 활성을 발휘하는 한 다클론성 항체, 온전한 단클론성 항체, 항체 단편(Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편 등), 단쇄 Fv(scFv) 돌연변이체, 다특이적 항체, 예컨대, 적어도 2개의 온전한 항체로부터 생성된 이특이적(bispecific) 항체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 기타 변형된 면역글로불린 분자를 망라한다. 항체는, 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로서 지칭되는 그들의 중쇄 불변 도메인의 동일성에 기초하여, 5가지 주된 부류의 면역글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 또는 그의 하위부류(아이소형)(예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)의 어느 것일 수 있다. 면역글로불린의 다른 부류는 상이하고 잘 알려진 서브단위 구조 및 3차원 입체형태를 지닌다. 항체는 네이키드(naked)될 수 있거나, 또는 톡신, 방사능동위원소 등과 같은 다른 분자에 컨쥬게이트될 수 있다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부를 지칭할 수 있다. 항체 단편의 예는, 선형 항체; 단쇄 항체 분자; Fc 또는 Fc' 펩타이드, Fab 및 Fab 단편 및 항체 단편으로부터의 다특이적 항체를 포함할 수 있지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
"키메라 항체"란 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 2개 이상의 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 목적으로 하는 특이성, 친화도 및 능력을 지니는 포유동물(예컨대, 마우스, 래트, 토끼 등)의 하나의 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역에 대응하는 한편 불변 영역은 그 종에서 면역 반응을 유도하는 것을 회피하기 위하여 다른 것(통상적으로 인간)으로부터 유래된 항체의 서열과 상동성이다.
비인간(non-human)(예컨대, 토끼) 항체의 "인간화된" 형태는, 비인간 면역글로불린으로부터 유래된, 최소 서열을 포함하거나 서열을 포함하지 않는 키메라 항체를 포함한다. 대부분, 인간화된 항체는 인간 면역글로불린(수용자 항체)이며, 여기서 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기는 비인간 종(공여자 항체), 예컨대, 마우스, 래트, 토끼 혹은 목적으로 하는 특이성, 친화도 및 능력을 지니는 비안간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체되어 있다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 대응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화된 항체는 수용자 항체 혹은 공여자 항체 내에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 대부분, 인간화된 항체는 적어도 하나, 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 수 있고, 이때 초가변 루프의 전부 혹은 실질적으로 전부는 비인간 면역글로불린의 것들에 대응하며, FR 잔기의 전부 혹은 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 인간화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글루불린의 것을 포함할 수 있다. 인간화된 항체를 발생하는데 이용되는 방법은 면역학 및 분자 생물학의 분야에서 잘 알려져 있다.
"하이브리드 항체"는 면역글로불린 분자를 포함할 수 있는데, 여기에서, 상이한 항원 결정인자 영역을 지니는 항체로부터의 중쇄와 경쇄의 쌍은 함께 조립되므로 2개의 상이한 에피토프 혹은 2개의 상이한 항원은 얻어지는 사량체에 의해 인식되고 결합될 수 있다.
"에피토프" 또는 "항원 결정인자"란 용어는 본 명세서에서 호환가능하게 이용되며, 특정 항체에 의해 인식되고 특이적으로 결합될 수 있는 항원의 그 부분을 지칭한다. 항원이 폴리펩타이드인 경우, 에피토프는 단백질의 3차 접힘에 의해 나란히 배치된 비인접 아미노산 및 인접 아미노산의 양쪽 모두로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 단백질 변성 동안 전형적으로 유지되는 반면, 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프는 단백질 변성 시 전형적으로 소실된다. 에피토프는 고유한 공간적 입체형태 내에 전형적으로 적어도 3 내지 5개, 더욱 통상적으로 적어도 5개 혹은 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다.
에피토프를 향하여 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적 결합"을 보이는 것은 대안적인 물질에 의한 것보다 에피토프와 더욱 빈번하게 및/또는 더욱 신속하게 및/또는 더욱 많은 지속기간에 및/또는 더 큰 친화도로 반응하거나 결합하는 것을 의미한다.
항체의 제조
다클론성 항체
다클론성 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 보조제의 다수의 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주입에 의해 동물에서 상승된다. 바람직하게는, 항원은 동물의 림프절 내로 직접 주입될 수 있다(문헌[Kilpatrick et al., Hybridoma, 16:381-389, 1997] 참조). 개선된 항체 반응은, 이작용성 혹은 유도체화 제제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 설포숙신이미드 에스터(시스테인 잔기를 통한 컨주게이션), N-하이드록시숙신이미드(라이신 잔기를 통해서), 글루타르알데하이드, 숙신 무수물 혹은 기타 당업계에 공지된 제제를 이용해서 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예컨대, 키홀 림펫 헤모사이아닌(keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 콩 트립신 억제제에 관련 항원을 컨쥬게이션함으로써 얻어질 수 있다.
동물은, 예컨대, 100㎍의 단백질 또는 컨쥬게이트(마우스용)를 프로이트의 완전 보조제 3 부피와 배합하고 다수 부위에 피부내로 해당 용액을 주입함으로써 항원, 면역원성 컨쥬게이트 혹은 유도체에 대해서 면역화된다. 1개월 후, 동물을 다수 부위에 피하 주입에 의해 프로이트의 완전 보조제 내 원래의 양의 1/5 내지 1/10의 양의 펩타이드 혹은 컨쥬게이트로 추가주입한다. 7 내지 14일 추가주입 후, 동물을 채혈하고, 혈청은 항체 역가에 대해서 검정하였다. 동물을 역가가 안정상태로 될 때까지 추가주입한다. 바람직하게는, 동물은 상이한 가교 시약을 통해 컨쥬게이트된 동일한 항원의 컨쥬게이트로 추가주입한다. 컨쥬게이트는 또한 단백질 용융물로서 재조합 세포 배양액 중에서 만들어질 수 있다. 또한, 명반(alum) 등과 같은 응집제가 면역 반응을 증대시키는데 적절하게 이용된다.
단클론성 항체
단클론성 항체는 문헌[Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음에 기재된 하이브리도마 방법을 이용해서 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에 있어서, 마우스 혹은 기타 적절한 숙주 동물, 예컨대, 래트, 햄스터 혹은 짧은 꼬리 원숭이는 면역화를 위해 이용되는 단백질에 특이적으로 결합하게 될 항체를 생산하거나 생산가능한 림프구를 유도하도록 면역화된다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수도 있다. 림프구는 이어서 적절한 융합제, 예컨대, 폴리에틸렌 글라이콜을 이용해서 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 하이브리도마 세포는 이와 같이 해서 미융합된 부모의 골수종 세포의 성장 혹은 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 바람직하게는 함유하는 적절한 배지에 파종되어 성장된다. 예를 들어, 부모의 골수종 세포가 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스페라제(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase: HGPRT 또는 HPRT)를 결여한다면, 하이브리도마용의 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT 배지)을 포함할 것이고, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
바람직한 골수종 세포는 선택된 항체-생산 세포에 의해 효율적으로 융해되고 안정한 높은 수준의 항체의 생산을 뒷받침하며 배지에 대해 민감한 것들이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 또한 인간 단클론성 항체의 생산에 대해서 기술된 바 있다(Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). 예시적인 쥣과 골수종 세포주는 미국 캘리포니아주의 샌디에고시에 소재한 살크 연구소 세포 분배센서(Salk Institute Cell Distribution Center)로부터 입수가능한 MOP-21 및 M. C.-11 마우스 종양, 및 미국 매릴랜드주의 록빌시에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포로부터 유래된 것들을 포함한다. 하이브리도마 세포가 성장 중에 있는 배양 배지는 항원에 대항하는 단클론성 항체의 생산을 위하여 검정된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단클론성 항체의 결합 특이성은 면역침강에 의해, 또는 방사면역검정(radioimmunoassay: RIA) 또는 효소-결합 면역흡수 검정(ELISA) 등과 같은 시험관내 검정에 의해 결정된다. 단클론성 항체의 결합 친화도는, 예를 들어, 바이아코어(BIAcore) 혹은 스캐차드(Scatchard) 분석(Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980))에 의해 결정될 수 있다.
하이브리도마 세포가 목적으로 하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생산하는 것이 확인된 후, 클론은 제한 희석 절차에 의해 서브클론화되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 이 목적을 위한 적절한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEMO 또는 RPMI 1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내에서 성장될 수 있다. 서브클론에 의해 분비된 단클론성 항체는, 단백질 A-세파로스, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기 영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피 등과 같은 종래의 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지, 복수 유체 혹은 혈청으로부터 적절하게 분리된다.
항체의 재조합 생산
관심 대상 면역글로불린의 아미노산 서열은 직접 단백질 서열결정에 의해 결정될 수 있고, 적절한 암호화 뉴클레오타이드 서열은 범용 코돈 테이블에 따라서 설계될 수 있다.
대안적으로, 단클론성 항체를 암호화하는 DNA는, (예컨대, 단클론성 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전제에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용함으로써) 종래의 절차를 이용해서 하이브리도마 세포로부터 단리되고 서열결정될 수 있다. 서열 결정은 일반적으로 관심 대상 유전자 혹은 cDNA의 적어도 일부의 단리를 필요로 할 것이다. 통상적으로 이것은 단클론성 항체를 암호화하는 DNA 또는 mRNA를 복제하는 것을 필요로 한다. 복제는 표준 기술(예컨대, 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press] 참조, 이 문헌은 참조로 본 명세서에 병합됨)을 이용해서 수행된다. 예를 들어, cDNA 라이브러리는 폴리A+ mRNA, 바람직하게는 막-결합 mRNA의 역전사 및 인간 면역글로불린 폴리펩타이드 유전자 서열에 특이적인 프로브를 이용해서 선별된 라이브러리에 의해 구축될 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 폴리메라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)은 관심 대상 면역글로불린 유전자 세그먼트(예컨대, 경쇄 가변 세그먼트)를 암호화하는 cDNAs(또는 전장 cDNA의 일부)를 증폭시키는데 이용된다. 증폭된 서열은 적절한 벡터, 예컨대, 발현 벡터, 꼬마유전자 벡터 혹은 파지 디스플레이 벡터 내로 용이하게 복제될 수 있다. 이용되는 복제하는 특정 방법은, 관심대상 면역글로불린 폴리펩타이드의 소정 부분의 서열을 결정하는 것이 가능한 한, 임계적이지 않다는 것이 이해될 것이다.
복제 및 서열결정을 위해 이용되는 RNA를 위한 하나의 공급원은 유전자이식 마우스로부터 B 세포를 얻고 이 B 세포를 불멸의 세포에 융합시킴으로써 생산된 하이브리도마이다. 하이브리도마들을 이용하는 이점은, 이들이 용이하게 선별될 수 있고, 또한 하이브리도마가 선택된 관심 대상 인간 단클론성 항체를 생성한다는 점이다. 대안적으로, RNA는 면역화된 동물의 B 세포(또는 전체 비장)로부터 단리될 수 있다. 하이브리도마 이외의 공급원이 이용된다면, 특정 결합 특성을 지니는 면역글로불린 혹은 면역글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 선별하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 선별을 위한 하나의 방법은 파지 디스플레이 기술의 이용이다. 파지 디스플레이는, 예컨대, Dower 등의 WO 91/17271, McCafferty 등의 WO 92/01047, 및 문헌[Caton and Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6450-6454 (1990)]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 참조로 본 명세서에 병합된다. 파지 디스플레이 기술을 이용하는 일 실시형태에 있어서, 면역화된 유전자이식 마우스로부터의 cDNA(예컨대, 전체 비장 cDNA)가 단리되고, PCR이 면역글로불린 폴리펩타이드의 일부분, 예컨대, CDR 영역을 암호화하는 cDNA 서열을 증폭하는데 이용되고, 증폭된 서열은 파지 벡터 내에 삽입된다. 관심 대상 펩타이드, 예컨대, 목적으로 하는 결합 특성을 지니는 가변 영역 펩타이드를 암호화하는 cDNA는, 패닝(panning) 등과 같은 표준 기술에 의해 확인된다. 증폭된 혹은 복제된 핵산의 서열이 이어서 결정된다. 전형적으로 면역글로불린 폴리펩타이드의 전체 가변 영역을 암호화하는 서열이 결정되지만, 때로는 가변 영역의 일부, 예를 들어, CDR-암호화 부분만이 서열결정될 필요가 있다. 전형적으로 서열결정된 부분은 적어도 30개의 염기 길이일 것이고, 더욱 종종 가변 영역의 길이의 적어도 약 1/3 내지 약 절반을 암호화하는 염기가 서열결정될 것이다. 서열결정은 cDNA 라이브러리로부터 단리된 클론 상에, 또는 PCR이 이용될 경우, 증폭된 서열을 서브복제한 후 혹은 증폭된 세그먼트의 직접 PCR 서열결정에 의해 수행될 수 있다. 서열결정은 표준 기술을 이용해서 수행된다(예컨대, 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, and Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467] 참조, 이 문헌은 참조로 그의 전문이 본 명세서에 병합된다). 복제된 핵산의 서열을 인간 면역글로불린 유전자 및 cDNA의 공개된 서열과 비교함으로써, 당업자라면 서열결정된 영역, (i) 하이브리도마 면역글로불린 폴리펩타이드(중쇄의 아이소형을 포함함)의 생식세포 세그먼트 이용 및 (ii) N-영역 부가 및 체세포 돌연변이의 과정으로부터 얻어지는 서열을 포함하는, 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열에 따라서, 용이하게 결정할 수 있다. 면역글로불린 유전자 서열 정보의 하나의 공급원은, 매릴랜드주의 베데스다시에 소재한 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 산하 미국 국립 의학 도서관(National Library of Medicine)의 미국 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)이다.
일단 단리되면, DNA는 발현 제어 서열에 조작가능하게 연결되거나 발현 벡터 내에 배치될 수 있고, 이것은 이어서 대장균(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포, 또는 다르게는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포 등과 같은 숙주 세포 내로 형질주입되어, 재조합 숙주 세포 내의 단클론성 항체의 합성을 유도한다.
발현 제어 서열은 특히 숙주 유기체 내의 조작가능하게 연결된 암호화 서열의 발현을 위해 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 예를 들어, 원핵생물에 적합한 제어 서열은 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열(operator sequence) 및 리보좀-결합 부위을 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 조작가능하게 연결된다. 예를 들어, 전서열(presequence) 혹은 분비 리더용의 DNA는, 폴리펩타이드의 분비에 관여하는 전구단백질로서 발현된다면 폴리펩타이드용의 DNA에 조작가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는, 서열의 전사에 영향을 미친다면 암호화 서열에 조작가능하게 연결되거나; 또는 리보좀-결합 부위는 해독을 용이하게 하도록 위치된다면 암호화 서열에 조작가능하게 연결된다. 일반적으로, 조작가능하게 연결된(operably linked)이란 연결 중인 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우에 연속적이며 판독 단계(reading phase)에 있는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 연속적이지 않아야 한다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성될 수 있다. 이러한 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오타이드 연결기(adaptor) 혹은 링커는 관례에 따라서 이용될 수 있다.
세포, 세포주 및 세포 배양액은 종종 호환가능하게 이용되며, 이러한 모든 호칭은 자손을 포함한다. 형질전환주 및 형질전환된 세포는, 다수의 전이와 관계없이 주된 대상 세포 및 이로부터 유래된 배양액을 포함한다. 또한, 모든 자손은, 유도적 혹은 우발적 돌연변이로 인해, DNA 내용물 내에서 정확하게 동일하지 않을 수도 있음을 이해해야 한다. 원래 형질전환된 세포에 대해서 선별된 것과 동일한 기능 혹은 생물학적 활성을 지니는 돌연변이 자손이 포함된다.
숙주 세포, 벡터 및 핵산을 포함하는 숙주 세포, 및 항체의 생산을 위한 재조합 기술에 의해 인식되는 대조 서열에 선택적으로 조작가능하게 연결된 특이적 항체를 암호화하는 단리된 단리된 핵산이 또한 제공되며, 상기 재조합 기술은 핵산이 발현되도록 숙주 세포를 배양하고, 선택적으로 숙주 세포 배양액 혹은 배양 배지로부터 항체를 회수하는 것을 포함할 수 있다.
각종 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 벡터 성분은 이하의 것들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 신호 서열(예를 들어, 항체의 분비를 유도할 수 있는 것), 복제의 기원, 하나 이상의 선택적 마커 유전자(예를 들어, 항생제 혹은 기타 약물 내성, 보체 영양요구성 결핍(complement auxotrophic deficiency)을 부여하거나 또는 배지에서 이용가능하지 않은 중대한 영양분을 공급할 수 있는 것), 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열, 이들은 모두 당업계에 공지되어 있다.
적절한 숙주 세포는 원핵생물, 효모, 또는 고급 진핵생물 세포를 포함한다. 적절한 원핵생물은 진정 세균, 예컨대. 그램 음성 혹은 그램 양상 유기체, 예를 들어, 장내세균과(Enterobacteriaceae), 예를 들어, 에셰리키아(Escherichia), 예컨대, 대장균, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예컨대, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예컨대, 세라티아 마세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella)뿐만 아니라, 바실루스, 예컨대, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 및 바실러스 리케니포미스(B. licheniformis), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 원핵 생물에 부가해서, 진핵 미생물, 예컨대, 곰팡이(filamentous fungi) 혹은 효모 등이 항체-암호화 벡터를 위한 적절한 복제 혹은 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상의 빵 효모가 보다 저급의 원핵생물 숙주 미생물 중에서 가장 통상적으로 이용된다. 그러나, 많은 기타 속, 종 및 균주, 예컨대, 피키아(Pichia), 예컨대 피키아 파스토리스(P. pastoris), 쉬조사카로마이에스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 야로위아(Yarrowia); 칸디다(Candida); 트라이코더마 레에시아(Trichoderma reesia); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 쉬와니오마이세스(Schwanniomyces), 예컨대, 쉬와니오마이세스 오시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 곰팡이, 예컨대, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼질러스 숙주(Aspergillus host), 예컨대, 아스퍼질러스 니둘란스(A. nidulans) 및 아스퍼질러스 나이거(A. niger)가 통상적으로 이용가능하다.
글라이코실화된 항체의 발현을 위한 적절한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 세포 및 곤충 세포를 포함한다. 예컨대, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(캐터필러), 아에데스 아에기프티(Aedes aegypti)(모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus)(모기), 노랑 초파리(Drosophila melanogaster)(초파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori) 등과 같은 숙주로부터의 다수의 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 대응하는 허용가능한 곤충 숙주 세포가 확인되어 있다. 이러한 세포의 형질주입을 위한 다양한 바이러스 균주, 예컨대, 오토그라프 캘리포니카(Autographa californica) NPV의 L-I 변이체 및 봄빅스 모리(Bombyx mori) NPV의 Bm-5 균주 등이 공개적으로 이용가능하다.
그러나, 관심은 척추동물 세포에서 더 커졌고, 배양액(조직 배양액) 내 척추동물 세포의 전파는 일상적으로 되었다. 이용가능한 포유동물 숙주 세포주의 예는, CHOKI 세포(ATCC CCL61) 및 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(DXB-11, DG-44; Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980))를 포함하는 중국 햄스터 난소 세포; SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(현탁 배양액 중에서 성장을 위하여 서브클로닝된 293 또는 293 세포, [Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)]; 베이비 햄스터 신장 세포(baby hamster kidney cell)(BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이(African green monkey) 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(WI38, ATCC CCL 75); 인간 악성간암 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); MRC 5 세포 및 FS4 세포이다.
숙주 세포는 각종 배지에서 배양될 수 있다. Ham's F10(Sigma), 최소 필수 배지(MEM)(Sigma), RPMI-1640(Sigma) 및 둘베코의 변성 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM)(Sigma) 등과 같은 상업적으로 입수가능한 배지가 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 첨가 시, 문헌[Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), 미국 특허 제 4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO90103430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 등록 제30,985호]에 기재된 배지 중 어느 것이라도 숙주 세포의 배양 배지로서 이용될 수 있다. 이들 배지 중 어느 것이라도 필요에 따라서 호르몬 및/또는 기타 성장 인자(예컨대, 인슐린, 트랜스페린, 혹은 상피 성장 인자 등), 염(예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염 등), 완충제(예컨대, HEPES 등), 뉴클레오타이드(예컨대, 아데노신 및 티미딘 등), 항생제(예컨대, 겐타마이신(Gentamycin)(상표명) 약물 등), 미량 원소(통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 혹은 등가의 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 기타 필요한 보충물의 어느 것이라도 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대, 온도, pH 등은 발현을 위하여 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 이용되던 것들이며, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
항체 조성물은, 예를 들어, 친화도 리간드로서 관심 대상 항원 또는 단백질 A 또는 단백질 G를 이용해서, 수산화인회석 크로마토그래피, 양이온 혹은 음이온 교환 크로마토그래피, 또는 바람직하게는 친화도 크로마토그래피를 이용해서 정제될 수 있다. 단백질 A는 인간 .감마.1, .감마.2, 또는 .감마.4 중쇄에 기초하는 항체를 정제하는데 이용될 수 있다(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 아이소형에 대해서 그리고 인간 .감마.3에 대해서 권장된다(Guss et al., 20 EMBO J. 5: 15671575 (1986)). 친화도 리간드가 부착된 매트릭스는 자주 아가로스이지만, 다른 매트릭스가 이용가능하다. 제어된 기공 유리 또는 폴리(스타이렌다이비닐)벤젠 등과 같은 기계적으로 안정적인 매트릭스는 아가로스로 달성될 수 있는 것보다 보다 빠른 유량과 보다 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함할 경우, Bakerbond ABX(상표명) 수지(J. T. Baker, 25 뉴저지주의 필립스버그시에 소재)가 정제를 위해 이용가능하다. 에탄올 침강, 역상 HPLC, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침강 등과 같은 단백질 정제를 위한 기타 방법이 또한 회수될 특이적 결합제 혹은 항체에 따라서 가능하다.
"에피토프" 또는 "항원 결정인자"란 용어는 본 명세서에서 호환가능하게 이용되며, 특히 항체에 의해 인식되고 특이적으로 결합될 수 있는 항원의 그 부분을 지칭한다. 항원이 폴리펩타이드인 경우, 에피토프는 인접한 아미노산 및 단백질의 3차 접힘에 의해 나란히 놓인 비인접한 아미노산의 양쪽 모두로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성 시 유지되는 한편, 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성 시 소실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간적 입체 형태 내에 적어도 3 내지 5개, 더욱 통상적으로, 적어도 5 또는 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다.
에피토프를 향하여 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적인 결합"을 보이는 것은 대안적인 물질에 의한 것보다 에피토프와 더욱 빈번하게 및/또는 더욱 신속하게 및/또는 더욱 많은 지속기간에 및/또는 더 큰 친화도로 반응하거나 결합하는 것을 의미한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 대상체의 종양이 야생형 PI3K-α 대 돌연변이 PI3K-α, 예를 들어, PI3K-α E545K 또는 PI3K-α H1047R를 지니는지를 판정하기 위하여 상기 기재된 검정 및 방법의 임의의 하나 이상을 이용해서 일단 해당 종양이 분석되었다면, 치료 요법이 대상체를 위하여 준비될 수 있다. 대상체의 종양이 위치 1047에 돌연변이를 지니는 PI3K-α(예를 들어, H1047R)를 지닌다면, 상기 치료 요법은 치료적 유효량의 PI3K-α 선택적 억제제 화합물, 또는 이중 PI3K-α/mTOR 선택적 억제제, 또는 PI3K-α 선택적 억제제 또는 mTOR 선택적 억제제의 조합물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 대상체의 종양이 위치 545에 돌연변이를 지니는 PI3K-α(예를 들어, E545K)를 지닌다면, 상기 치료 요법은 치료적 유효량의 PI3K-α 선택적 억제제와 PI3K-β 선택적 억제제의 조합물, 이중 PI3K-α/mTOR 선택적 억제제, 또는 PI3K-α 선택적 억제제와 mTOR 선택적 억제제의 조합물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 방법을 수행하는데 유용한 재료를 포함하는 키트를 제공한다. 본 명세서에 기재된 진단/선별 절차는 진단 실험실, 실험적 실험실 또는 의사에 의해 수행될 수 있다. 본 발명은 이들 상이한 세팅에 이용될 수 있는 키트를 제공한다.
본 발명의 방법에 따라서 대상체의 종양 혹은 암에서의 PI3K-α 돌연변이를 확인하는데 필요로 되는 기본적인 재료 및 시약은 키트 내에 함께 조립될 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, 키트는 본 명세서에 개시된 대상체의 종양으로부터 얻어진 핵산 혹은 단백질 내의 돌연변이를 구체적으로 검출하는 적어도 하나의 PI3K-α 아미노산 서열 결정 시약 및 본 발명의 하나 이상의 방법에 따라서 키트를 이용하는 설명서를 포함한다. 각 키트는 반드시 절차 특이성을 부여하는 시약을 포함한다. 이와 같이 해서, PI3K-α H1047R 또는 E545K 돌연변이를 지니는 mRNA를 검출하기 위하여, 상기 시약은, 예를 들어, cDNA 혹은 올리고뉴클레오타이드 등과 같은 mRNA에 상보적인 핵산 프로브를 포함할 것이다. 핵산 프로브는 기질 표면(예컨대, 마이크로어레이) 상에 고정될 수 있거나 고정되지 않을 수 있다. 적어도 하나의 PI3K-α 돌연변이 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드 산물을 검출하기 위하여, 시약은 돌연변이된 PI3K-α 또는 야생형 PI3K-α에 특이적으로 결합되는 항체를 포함할 것이다.
절차에 따라서, 키트는 추출 완충제 및/또는 시약, 증폭 완충제 및/또는 시약, 혼성화 완충제 및/또는 시약, 면역검출 완충제 및/또는 시약, 표지화 완충제 및/또는 시약, 및 검출 수단 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 상기 절차의 상이한 단계들을 수행하기 위하여 이들 완충제 및 시약을 이용하는 프로토콜이 또한 키트에 포함될 수 있다.
시약은 고체(예컨대, 동결건조됨) 혹은 액체 형태로 공급될 수 있다. 본 발명의 키트는 선택적으로 각 개별적인 완충제 및/또는 시약에 대해서 시료 및/또는 시약을 혼합하기 위한 하나 이상의 저장용기(예컨대, 바이알, 앰플, 시험관, ELISA 플레이트, 배양 플레이트, 플라스크 혹은 병)를 포함할 수 있다. 각 성분은 일반적으로 농축된 형태로 제공되거나 각각의 용기 내에 등분된 것처럼 되어 있는 것이 적합할 것이다. 개시된 방법을 위하여 소정의 단계들을 행하는데 적합한 기타 용기가 또한 제공될 수 있다. 키트의 개별적인 용기는 바람직하게는 상업적 판매를 위한 폐쇄 구획 내에 유지된다.
소정의 실시형태에 있어서, 본 발명의 키트는 대조 시료를 더 포함한다. 예를 들어, 키트는, 예를 들어, 대조군으로서 이용될 야생형 PI3K-α, PI3K-α H1047R mRNA 또는 PI3K-α E545K mRNA 등과 같은 각종 생리학적 상태의 조직으로부터 유래된 총 mRNA의 시료를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 키트는 비교 주형으로서 이용하기 위하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 전립선 질환 발현 프로파일 맵을 포함한다. 바람직하게는, 상기 발현 프로파일 맵은 컴퓨터-판독가능한 매체에 저장된 디지털 정보이다.
본 발명의 하나 이상의 방법에 따른 키트를 이용하는 설명서는 전립선 조직 시료를 처리하고/하거나 시험을 수행하는 지시, 결과를 해석하는 지시뿐만 아니라 제조사, 약제 혹은 생물학적 제품의 사용 혹은 판매에 관한 정부 기관(예컨대, FDA)에 의해 규정된 형태의 지침을 포함할 수 있다.
대표적인 화합물
본 발명의 화합물의 구조 및 명칭은 표 1에 표시되어 있다. 표의 각 입력은 표시된 바와 같은 화합물뿐만 아니라 그의 단일의 입체이성질체 혹은 입체이성질체들의 혼합물, 그리고 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 화합물은 국제 순수 응용화학 연합(International Union of Pure and Applied Chemistry: IUPAC), 국제 생화학 분자생물학 연합(International Union of Biochemistry and Molecular Biology: IUBMB) 및 화학 초록 서비스(Chemical Abstracts Service: CAS)에 의해 합의된 명명법의 체계적인 적용에 따라 명명되었다. 구체적으로, 표 1의 명칭은 공개된 ACD/Labs 네이밍 소프트웨어 8.00, 제품 버전 8.08 또는 이후 버전을 사용하여 생성하였다.
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일반적 투여
일 양상에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 PI3K/mTOR의 억제제 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 소정의 다른 실시형태에서, 투여는 경구 경로에 의한다. 본 발명의 화합물들, 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염의 투여는 순수 형태로 또는 적합한 약제학적 조성물로 모든 허용되는 투여 방법을 통해 또는 유사한 유용성을 제공하기 위한 시약으로 실시될 수 있다. 이와 같이, 투여는, 예를 들어, 고체, 반-고체, 동결건조된 분말, 또는 액제 복용 형태, 예컨대, 정제, 좌제, 환제, 연질 탄성 및 경질 젤라틴 캡슐제, 산제, 용액제, 현탁제, 또는 에어로졸제 등의 형태로, 특히 정확한 복용량의 단순한 투여에 적합한 단위 복용 형태로, 예컨대, 경구, 비강내, 비경구(정맥내, 근육내 또는 피하), 국소, 경피, 질내, 방광내, 낭내(intracisternally), 또는 직장으로 투여될 수 있다.
본 조성물은 통상의 약제학적 담체 또는 부형제 및 활성성분으로서 본 발명의 화합물을 포함할 수 있고, 추가적으로 담체 및 보조제 등을 포함할 수 있다.
보조제는 보존제, 습윤제, 현탁제, 감미제, 조미제, 향료, 에멀전화제 및 분배제(dispensing agent)를 포함한다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항생제 및 항곰팡이제, 예를 들어, 파라벤류, 클로로뷰탄올, 페놀, 솔브산 등에 의해 담보될 수 있다. 이것은 또한 당, 염화나트륨 등과 같은 등장화제를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사가능한 약제학적 형태의 지속적 투여는 흡수지연제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 달성될 수 있다.
필요한 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 항산화제 등, 예컨대, 시트르산, 솔비탄 모노라우레이트, 트라이에탄올아민 올레에이트, 뷰틸화 하이드록시톨루엔 등과 같은 소량의 보조 성분을 또한 함유할 수 있다.
제제의 선택은 약물 투여 방법(예컨대, 경구 투여, 정제, 환제 또는 캡슐제의 형태로의 제제) 및 약물 물질의 생물학적 이용성 등과 같은 다양한 인자에 의존한다. 최근에는, 표면적을 증가시킴으로써, 즉, 입자 크기를 감소시킴으로써 생물학적 이용성이 증가될 수 있다는 원리에 기초하여 나쁜 생물학적 이용성을 나타내는 약물에 대한 약제학적 제제가 특히 개발 중이다. 예를 들어, 미국특허 제4,107,288호는 활성물질이 거대분자의 가교결합된 매트릭스에 지지되는 10 내지 1,000㎚의 크기 범위인 입자를 포함하는 약제학적 제제를 기술한다. 미국특허 제5,145,684호는 표면 개질제의 존재 하에 약물 물질을 나노입자(평균 입자 크기가 400㎚)로 분쇄한 후 액체 매질에 분산되어 현저하게 높은 생물학적 이용성을 나타내는 약제학적 제제를 얻은 약제학적 제제의 생산을 기술한다.
비경구적 주사에 적합한 조성물은 생리학적으로 허용가능한 멸균 수성 또는 비수성 용액류, 분산제류, 현탁액류 또는 에멀전류 및 멸균 주사가능한 용액류 또는 분산액류 내에 재구성을 위한 멸균 분말류를 포함할 수 있다. 적합한 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예는 물, 에탄올, 폴리올(프로필렌 글라이콜, 폴리에틸렌 글라이콜, 글라이세롤 등), 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일(예컨대, 올리브 오일) 및 주사가능한 유기 에스터, 예컨대, 에틸 올레에이트를 포함한다. 적합한 유동성이, 예컨대, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 목적으로 하는 입자크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
투여의 하나의 특정 경로는, 치료될 질환 상태의 중증도에 따라서 조정될 수 있는 통상의 1일 용량 범위를 사용하는, 경구 경로이다.
경구 투여를 위한 고체 투약 형태는 캡슐, 정제, 환제, 산제 및 과립제를 포함한다. 이러한 고체 투약 형태에서, 활성 화합물은 적어도 하나의 불활성의 통상의 부형제(또는 담체), 예컨대, 시트르산나트륨 또는 인산이칼슘 또는 (a) 충전제 또는 증량제, 예컨대, 전분, 락토즈, 수크로즈, 글루코스, 만니톨 및 규산, (b) 결합제, 예컨대, 셀룰로스 유도체, 전분, 알리그네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수크로즈 및 아카시아검, (c) 습윤제, 예컨대, 글라이세롤, (d) 붕해제, 예컨대, 아가-아가(agar-agar), 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 크로스카멜로스 나트륨, 복합 실리케이트 및 탄산나트륨, (e) 용액 지연제, 예컨대, 파라핀, (f) 흡수 촉진제, 예컨대, 4급 암모늄 화합물, (g) 습윤제, 예컨대, 세틸 알코올, 및 글라이세롤 모노스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트 등, (h) 흡수제, 예컨대, 카올린 및 벤토나이트, 및 (i) 활택제, 예컨대, 탤크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글라이콜, 소듐 라우릴 설페이트, 또는 그의 혼합물과 혼합된다. 캡슐, 정제 및 환제의 경우에, 투약 형태는 또한 완충제를 포함할 수 있다.
전술한 고체 투약 형태는 코팅 및 쉘(shell), 예컨대, 장용 코팅 및 당업계에 충분히 공지된 기타의 것들로 제조될 수 있다. 이들은 진정제(pacifying agent)를 포함할 수 있고, 지연화 방법으로 장관의 특정 부분에 활성 화합물 또는 화합물들을 방출하는 이러한 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 내장형 조성물의 예는 폴리머 물질 및 왁스이다. 활성 화합물은 또한 적합하다면, 하나 이상의 상기 부형제와 함께 마이크로캡슐 형태일 수 있다.
경구투여를 위한 액체 투약 형태는 약제학적으로 허용가능한 에멀전, 용액, 현탁액, 시럽 및 에릭시르제를 포함한다. 이러한 투약 형태는, 예컨대, 본 발명의 화합물(들), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 및 담체 예컨대, 물, 식염수, 수성 텍스트로스, 글라이세롤, 에탄올 등 내의 임의의 약제학적 보조제; 가용화제 및 유화제, 예컨대, 에틸 알코올, 아이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글라이콜, 1,3-뷰틸렌글라이콜, 다이메틸포름아마이드; 오일, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배아 오일, 올리브 오일, 캐스터 오일 및 참깨 오일, 글라이세롤, 테트라하이드로푸루푸릴 알코올, 폴리에틸렌글라이콜 및 솔비탄의 지방산 에스터; 또는 이들 성분의 혼합물로 용해, 분산 등 시킴으로써 용액 또는 현탁액으로 제조할 수 있다.
현탁액은, 활성 화합물에 부가해서, 현탁제, 예를 들어, 에톡실화 아이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 솔비톨 및 솔비탄 에스터, 미세결정성 셀룰로스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트래거캔트 또는 이들 물질의 혼합물 등을 포함할 수 있다.
직장 투여를 위한 조성물은, 예를 들어, 본 발명의 화합물을 예컨대, 적합한 비-자극성 부형제 또는 담체, 예를 들어, 평상 시 온도에서는 고체이지만 인체에서는 액제이고 따라서 적합한 체강에서 용융되고 여기서 활성 성분을 유리시키는, 코코아 버터, 폴리에틸렌글라이콜 또는 좌제용 왁스와 혼합하여 제조될 수 있다.
본 발명의 화합물의 국소 투여를 위한 투약 형태는 연고, 파우더, 스프레이 및 흡입제를 포함한다. 활성 성분은 멸균 조건 하에서 생리학적으로 허용가능한 담체 및 필요에 따라 임의의 보존제, 버퍼제 또는 추진제를 포함할 수 있다. 안과용 제제, 안연고, 산제 및 용액은 또한 본 발명의 범위 내인 것으로 상정된다.
압축 가스는 에어로졸 형태 내에 본 발명의 화합물을 확산시키는데 사용될 수 있다. 이 목적에 적합한 불활성 가스는 질소, 이산화탄소 등이다.
일반적으로, 의도된 투여 모드에 따라서, 약제학적으로 허용가능한 조성물은 약 1중량% 내지 약 99중량%의 본 발명의 화합물(들) 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 99중량% 내지 1중량%의 적합한 약제학적 부형제를 포함할 수 있다. 일례에서, 본 조성물은 약 5중량% 및 약 75중량%의 본 발명의 화합물(들), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염과 잔량의 적합한 약제학적 부형제를 포함한다.
이러한 투약 형태를 제조하는 실제 방법은 알려져 있거나, 또는 당업자에게 명백할 것이다; 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990)] 참조. 투여될 조성물은, 어떠한 경우에도, 본 발명에 교시에 따라서 질환-상태를 치료하기 위해, 치료적 유효량의 본 발명의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함할 것이다.
본 발명의 화합물, 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 사용된 특정 화합물의 활성, 대사안정성 및 화합물의 작용기간, 연령, 체중, 일반적 건강, 성, 식이, 투여 방법 및 시간, 배출속도, 약물 조합, 특정 질환-상태 및 치료를 받는 객체를 포함하는 다양한 인자에 크게 의존하는 치료적 유효량으로 투여된다. 본 발명의 화합물은 1일당 약 0.1 내지 약 1,000㎎의 범위의 용량 수준에서 환자에 투여될 수 있다. 약 70킬로그램의 체중을 갖는 일반 환자에 대해서는, 1일당 체중의 킬로그램당 약 0.01 내지 약 100㎎의 범위의 용량을 예로 들 수 있다. 그러나, 사용되는 특정 용량은 달라질 수 있다. 예를 들어, 용량은 환자의 필요, 치료되는 질환의 중증도 및 사용되는 화합물의 약리학적 활성를 포함하는 다수의 인자에 의존할 수 있다. 특정 환자를 위한 최적 용량의 결정은 당업자에게 잘 알려져 있다.
만일 고정된 용량으로서 제형화되면, 이러한 조합 제품은 전술한 용량 범위 내의 본 발명의 화합물 및 승인된 용량 범위 내의 다른 약제학적 활성제(들)을 사용할 수 있다. 조합 제형이 부적합할 때, 본 발명의 화합물은 대안적으로 공지의 약제학적으로 허용가능한 제제(들)로 순차적으로 사용할 수 있다.
일반적 합성
본 발명의 화합물은 하기 기술한 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 화합물을 제조하는데 사용되는 출발물질 및 시약들은 알드리치 화학사(Aldrich Chemical Co.)(위스콘신주의 밀워키시에 소재), 또는 바켐(Bachem)(캘리포니아주의 토랜스시에 소재)과 같은 상업적인 공급자로부터 이용가능하거나, 또는 하기 참고문헌에 제시된 이하의 절차에 따라 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다: Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, Volumes 1-17 (John Wiley and Sons, 1991); Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, Volumes 1-5 and Supplementals (Elsevier Science Publishers, 1989); Organic Reactions, Volumes 1-40 (John Wiley and Sons, 1991), March's Advanced Organic Chemistry, (John Wiley and Sons, 4th Edition) 및 Larock's Comprehensive Organic Transformations (VCH Publishers Inc., 1989). 이들 예는 본 발명의 화합물이 합성될 수 있는 몇몇 방법을 단지 예시한 것일 뿐, 이들 예에 대한 다양한 변화가 행해질 수 있고, 이 개시내용을 참조하는 당업자에게 제안될 것이다. 반응의 출발물질 및 중간생성물은, 요망된다면, 여과, 증류, 결정화, 크로마토그래피 등을 포함하는(단, 이들로 제한되는 것은 아님) 통상의 방법을 사용하여 단리 및 정제될 수 있다. 이러한 물질은 물리적 상수 및 스펙트럼 데이터를 포함하는 통상의 수단을 사용하여 특성규명될 수 있다.
상반되게 특정되지 않는 한, 본 명세서에서 기재된 반응은 대기압 및 약 -78℃ 내지 약 150℃, 보다 구체적으로는 약 0℃ 내지 약 125℃의 범위, 보다 구체적으로는 약 상온(주위 온도), 예컨대, 약 20℃에서 일어난다. 달리 기술되어 있지 않은 한(예컨대, 수소화의 경우에서처럼), 모든 반응은 질소 분위기 하에서 수행된다.
전구체가 당업자에게 알려진 기술에 의해 제조될 수 있다. 이들 기술은 일반적으로 주어진 화합물의 적합한 작용기를 변경한다. 이들 변경된 작용기는 경로 조작 또는 생체내에서 원래의 작용기로 돌아간다. 본 발명의 화합물의 아마이드 및 에스터가 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다. 전구체의 충분한 논의는 문헌[T. Higuchi and V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," Vol 14 of the A.C.S. Symposium Series, and in Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987]에서 제공되며, 이는 모든 목적을 위하여 참조로 본 명세서에 병합된다.
본 발명의 화합물, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염은 이들의 구조내에 비대칭 탄소원자 또는 4차 질소원자를 가질 수 있다. 본 명세서에 기재된 합성을 통해 제조될 수 있는 본 발명의 화합물은 단일 입체이성질체, 라세미체 및 거울상이성질체의 혼합물 및 부분입체이성질체로서 존재할 수 있다. 화합물은 또한 기하 이성질체로서 존재할 수 있다. 모든 이러한 단일 입체이성질체, 라세미체 및 이들의 혼합물, 기하 이성질체는 본 발명의 범위 내인 것으로 의도된다.
본 발명의 몇몇 화합물은 활성 케톤 -C(O)CF3를 포함할 수 있고, 일부 또는 전부가 -C(OH2)CF3 형태로서 존재할 수 있다. 화합물이 -C(O)CF3 또는 -C(OH2)CF3 형태로서 그려지는지의 여부와 무관하게, 이들 양쪽 모두는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 비록 각각의 화합물이 -C(O)CF3 형태로서 그려질 수 있지만, 당업자라면 화합물이 일부 또는 전부로서 -C(OH2)CF3 형태로 존재할 수 있고, 두 가지 형태의 비가 화합물 및 이들의 존재 조건에 따라서 변경될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 몇몇 화합물은 호변이성체로서 존재할 수 있다. 예를 들어, 케톤 또는 알데하이드가 존재할 경우, 분자는 에놀 형태로 존재할 수 있다; 아마이드가 존재할 경우, 분자는 이미드산으로서 존재할 수 있고; 엔아민이 존재할 경우, 분자는 이민으로 존재할 수 있다. 이러한 모든 호변이성질체는 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 N-옥사이드 유도체 및 보호된 유도체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 화합물이 산화가능한 질소원자를 포함한다면, 질소원자는 당업계에 충분히 공지된 방법에 의해 N-옥사이드로 전환될 수 있다. 본 발명의 화합물이 하이드록시, 카복시, 티올 또는 질소원자(들)를 포함하는 다른 기를 포함한다면, 이들 기는 적합한 "보호하는 기" 또는 "보호기"로 보호될 수 있다. 적합한 보호기의 포괄적인 리스트는 문헌[T.W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Inc. 1991]에서 찾을 수 있고, 이 문헌의 개시내용은 참조로 그의 전문이 본 명세서에 병합된다. 본 발명의 화합물의 보호된 유도체는 당업계에 충분히 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
입체이성질체의 라세미 혼합물 또는 비-라세미 혼합물로부터 단일의 입체이성질체의 제조 및/또는 분리 및 단리하기 위한 방법은 당업계에 충분히 공지되어 있다. 예를 들어, 광학적으로 활성인 (R)- 및 (S)- 이성질체는 키랄 신톤(chiral synthon) 또는 키랄 시약을 사용하여 제조할 수 있거나, 통상의 기술을 사용하여 분해될 수 있다. 거울상이성질체(R- 및 S-이성질체)는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어, 분리될 수 있는 부분입체이성질체성 염 또는 복합체의 형성에 의해, 예를 들어, 결정화에 의해, 분리될 수 있는 부분입체이성질체성 유도체의 형성에 의해, 예를 들어, 하나의 거울상이성질체를 거울상이성질체-특이적 시약을 사용한 결정화, 선택적 반응에 의해, 예를 들어, 효소적 산화 또는 환원에 이은 변성 및 비변성된 거울상이성질체의 분리에 의해; 또는 예를 들어 실리카와 같은 키랄 지지체 상에 결합 키랄 리간드 또는 키랄 용매의 존재와 같은 키랄 환경에서 가스-액체 또는 액체 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다. 목적으로 하는 거울상이성질체는 전술한 분리 기술의 하나에 의해 다른 키랄체로 변경될 수 있고, 목적으로 하는 거울상이성질체 형태를 제조하기 위해 추가의 단계가 필요할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 대안적으로, 특정 거울상이성질체는 광학 활성 시약, 기질, 촉매 또는 용매를 사용하는 비대칭성 합성에 의해 합성될 수 있거나, 비대칭성 변형에 의해 거울상이성질체를 다른 거울상이성질체로 전환함으로써 합성될 수 있다. 특정 거울상이성질체가 풍부한 거울상이성질체들의 혼합물에 대해, 주된 성분 거울상이성질체를 재결정화에 의해 (수율에서 수반되는 손실과 함께) 더욱 풍부하게 할 수 있다.
또, 본 발명의 화합물은 물, 에탄올 등과 같은 약제학적으로 허용가능한 용매와 용매화된 형태뿐만 아니라 비용매화된 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 용매화된 형태는 본 발명의 목적을 위하여 비용매화된 형태와 등가인 것으로 간주된다.
본 발명의 화합물의 제조를 위한 화학은 당업자에게 공지되어 있다. 사실상, 본 발명의 화합물을 제조하는 하나 이상의 공정이 있을 수 있다. 이하의 실시예는 예시적인 것이므로 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 본 명세서에 인용된 모든 문헌은 참조로 그들의 전문이 본 명세서에 병합된다.
합성예
N-(5-브로모-2-클로로피리딘-3-일)메탄설폰아마이드
Figure pct00035
다이클로로메탄(25㎖) 중 5-브로모-2-클로로피리딘-3-아민(1.0g, 4.8 m㏖) 및 다이아이소프로필에틸아민(1.85㎖, 10.6 m㏖)의 용액을 0℃로 냉각시키고 나서, 메탄설포닐 클로라이드(750㎕, 9.6 m㏖)를 서서히 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반하고 나서, 실온까지 가온시켰다. 2시간 동안 교반 후, 물을 첨가하고 나서, 이상성 혼합물(biphasic mixture)을 분별하였다. 유기상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과 후, 진공 중 농축시켰다. 잔류물을 이어서 다이옥산(10㎖) 및 물(10㎖) 중에 용해시켰다. 탄산칼륨(2.76g, 20 m㏖)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 이어서, 이 혼합물에 물을 첨가하고, 계속해서 수성 시트르산(10%)으로 산성화시켰다. 수성 혼합물을 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 유기 추출물을 합해서 황산마그네슘 상에서 건조시키고 나서, 여과 후, 진공 중 농축시켰다. 잔류물을 플래시 크로마토그래피(구배, 100% 헥산류 내지 에틸 아세테이트 중 50% 헥산류)에 의해 정제시켜 N-(5-브로모-2-클로로피리딘-3-일)메탄설폰아마이드(520㎎, 1.82 m㏖, 수율 38%)를 옅은 분홍색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 8.27 (d, 1H), 8.14 (d, 1H), 6.83 (br s, 1H), 3.11 (s, 3H); C6H6BrClN2O2S에 대한 MS (EI): 285, 287, 289 (Br, Cl 동위원소 패턴, MH+).
4-클로로-5-아이소프로필-6-메틸피리미딘-2-아민
Figure pct00036
단계 1:
메탄올(100㎖) 중의 에틸 2-아이소프로필아세토아세테이트(22.0g, 0.18 ㏖) 및 구아니딘 하이드로클로라이드(18.0g, 0.19 ㏖)의 용액에 나트륨 메톡사이드(0.38 mol, 86.4㎖, 25% 메탄올 용액)를 0℃에서 적가 깔때기를 통해서 30분에 거쳐서 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온으로 방치하고 나서 50℃까지 18시간 동안 가열하였다. 이 혼합물을 농축시키고 에틸 아세테이트(20㎖)로 희석시키고, 6N 수성 염산으로 pH 6 내지 7로 조정하였다. 얻어진 고체를 여과시키고 물로 세척하였다. 여과액을 농축시키고, 여과를 반복하여 제2수확량의 고체를 얻었다. 고체를 합하여 진공 하 건조시켜 2-아미노-5-아이소프로필-6-메틸피리미딘-4(1H)-온을 담황색 고체로서 수득하였다(16.8g, 56%); 1H NMR (400 ㎒, DMSO-d6): δ 10.5 (s, 1H), 6.17 (s, 2H), 2.85 (m, 1H), 2.03 (s, 3H), 1.15 (d, 6H); C8H13N3O에 대한 MS (EI): 168.2 (MH+).
단계 2:
오염화인(50㎖) 중 2-아미노-5-아이소프로필-6-메틸피리미딘-4(1H)-온 (4.93g, 29.5 m㏖)의 용액에 18시간 환류시켰다. 이 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트와 물이라면(각각 10㎖) 혼합물로 분별하였다. 이 이상성 혼합물을 수상 pH가 6 내지 7이 될 때까지 고체 중탄산나트륨 첨가에 의해 반응중지시켰다(quenched). 수층을 에틸 아세테이트(3×100㎖)로 추출하고, 유기 용액을 합하여 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과 후 농축시켜 4-클로로-5-아이소프로필-6-메틸피리미딘-2-아민을 담갈색 고체로서(4.92g, 90%) 수득하였다; 1H NMR (400 ㎒, DMSO-d6): δ 6.71 (s, 2H), 3.26 (m, 1H), 3.25 (s, 3H), 1.21 (d, 6H); C8H12ClN3에 대한 MS (EI): 186.1 (MH+).
1,1-다이메틸에틸 7-브로모-2,3-다이하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-4(5 H )-카복실레이트
Figure pct00037
단계 1:
시판의 5-브로모-2-하이드록시벤즈알데하이드(4.0g, 10 m㏖) 및 2-아미노에탄올을 THF/MeOH(100㎖, 10:1)에 배합하고 수소화붕소 나트륨(0.76g, 2.0 m㏖)을 교반하면서 첨가하였다. 얻어진 반응혼합물을 40℃에서 4시간 동안 교반하고, 회전 증발기 상에서 농축시킨 후, EtOAc(50㎖) 및 포화 NaHCO3(30㎖)로 희석시켰다. 이 현탁액에 다이-tert-뷰틸 다이카보네이트(2.83g, 13 m㏖)를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 유기층을 물로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고 나서, 여과 후, 회전 증발기 상에서 농축시켰다. 얻어진 조질의 반응 생성물에 이어서 헥산을 첨가하여, 백색 고체가 형성되었다. 이 슬러리를 여과시켜 tert-뷰틸-5-브로모-2-하이드록시벤질(2-하이드록시에틸)카바메이트(6.8g, 98%)를 백색 고체로서 수득하였다. C14H20BrNO4에 대한 MS (EI), 확인치 346 (MH+).
단계 2:
tert-뷰틸-5-브로모-2-하이드록시벤질(2-하이드록시에틸)카바메이트(3.46g, 10 m㏖) 및 트라이페닐포스핀(3.96g, 15 m㏖)을 DCM(100㎖)에 배합하고, 다이아이소프로필 아조다이카복실레이트(3.03g, 15 m㏖)를 첨가하였다. 얻어진 반응혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 물로 세척하고, 건조시키고 나서, 여과 후, 회전 증발기 상에서 농축시켰다. 얻어진 조질의 생성물을 8:2 헥산/에틸 아세테이트로 용리시키는 실리카겔 크로마토그래피를 통해서 정제시켜 목적으로 하는 생성물(1.74g, 53%)을 백색 고체로서 수득하였다. C14H18BrNO3에 대한 MS (EI), 확인치 328 (MH+).
(4-{[(1,1-다이메틸에틸)옥시]카보닐}-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일)보론산
Figure pct00038
단계 1:
THF(300㎖) 중 1,1-다이메틸에틸 7-브로모-2,3-다이하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-4(5H)-카복실레이트(30.0g, 91.4 m㏖) 및 트라이아이소프로필 보레이트(22.4g, 119 m㏖)의 용액을 -78℃까지 냉각시키고, 헥산류(47.6㎖, 119 m㏖) 중 n-뷰틸리튬의 2.5M 용액을 이 온도에서 40분에 걸쳐서 적가하였다. 이 반응 혼합물을 추가로 30분 동안 -78℃에서 교반하고 나서, 2N 염산(80㎖)의 적가에 의해 반응중지시키고, 실온까지 가온시켰다. 에틸 아세테이트(100㎖)와 물(100㎖)을 첨가하고, 유기층을 분액시키고, 수층을 에틸 아세테이트(100㎖)로 추출하였다. 유기층을 합하여 물로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조 후, 농축시켰다. 이 잔류물에 헥산(200㎖)을 첨가하고, 얻어진 혼합물을 하룻밤 교반하였다. 석출물을 여과시키고, 헥산으로 수회 세척하고, 건조시켜 (4-{[(1,1-다이메틸에틸)옥시]카보닐}-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일)보론산(23.4g, 87%)을 무색 고체로서 수득하였다. C14H20BNO5에 대한 MS (EI): 294 (MH+).
실시예 1
N-(5-{4-[2-아미노-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}-2-클로로피리딘-3-일)메탄설폰아마이드
Figure pct00039
단계 1:
다이옥산(1.5㎖) 및 물(375㎕) 중 (4-{[(1,1-다이메틸에틸)옥시]카보닐}-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일)보론산(300㎎, 1.02 m㏖), N-(5-브로모-2-클로로-3-피리디닐)-메탄설폰아마이드(292㎎, 1.02 m㏖), 탄산칼륨(282㎎, 2.04 m㏖), 1,1'-비스(다이페닐포스피노)페로센-팔라듐(II)다이클로라이드 다이클로로메탄 복합체(42㎎, 0.051 m㏖)의 혼합물에 질소 가스를 2분 동안 살포하였다. 이어서, 이 혼합물을 마이크로파 반응기 속에서 110℃에서 15분 동안 가열하였다. 언어진 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고 나서, 셀라이트를 통해서 여과시켰다. 여과액을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과 후, 진공 중 농축시켰다. 잔류물을 실리카겔 플래시 크로마토그래피(헥산류:에틸 아세테이트 1:1)에 의해 정제시켜 1,1-다이메틸에틸 7-{6-클로로-5-[(메틸설포닐)아미노]피리딘-3-일}-2,3-다이하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-4(5H)-카복실레이트(400㎎, 0.88 m㏖, 수율 86%)를 황색 발포체로서 수득하였다. 1H NMR (400 ㎒, DMSO-d6) δ 9.85 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 8.04 (d, 1H), 7.74-7.40 (m, 2H), 7.22-6.96 (m, 1H), 4.63-4.42 (m, 2H), 4.22-3.92 (m, 2H), 3.88-3.51 (m, 2H), 3.16 (s, 3H), 1.40-1.25 (m, 9H); C20H24ClN3O5S에 대한 MS (EI): 454 (MH+).
단계 2:
메탄올(5㎖) 중 1,1-다이메틸에틸 7-{6-클로로-5-[(메틸설포닐)아미노]피리딘-3-일}-2,3-다이하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-4(5H)-카복실레이트(400㎎, 0.88 m㏖)의 용액에 다이옥산(4M, 2.2㎖, 8.8 m㏖) 중 염화수소를 첨가하고, 얻어진 용액을 60℃까지 25분 동안 가열하였다. 실온까지 냉각 후, 휘발성 물질을 진공 중 제거하여, N-[2-클로로-5-(2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일)-3-피리디닐]-메탄설폰아마이드 다이하이드로클로라이드염을 정량적 수율로 수득하였다. 1H NMR (400 ㎒, DMSO-d6) δ 9.92 (s, 1H), 9.52 (br s, 2H), 8.59 (d, 1H), 8.07 (d, 1H), 7.91 (d, 1H), 7.75 (dd, 1H), 7.23 (d, 1H), 4.48-4.35 (m, 2H), 4.26 (s, 2H), 3.55-3.46 (m, 2H), 3.18 (s, 3H). C15H16ClN3O3S에 대한 (EI): 354 (MH+).
단계 3:
NMP(500㎕) 중 N-[2-클로로-5-(2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일)-3-피리디닐]-메탄설폰아마이드 다이하이드로클로라이드염(100㎎, 0.23 m㏖), 4-클로로-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-2-아민(44㎎, 0.23 m㏖) 및 다이아이소프로필에틸아민(160㎕, 0.92 m㏖)의 용액을 120℃까지 3.5시간 동안 가열하고 나서, 실온까지 냉각시켰다. 이어서, 물을 첨가하고, 얻어진 수성 혼합물을 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 유기 추출물을 합해서 10% 염화리튬 용액으로 세척하고, 황산나트염화리튬상에서 건조시키고 나서, 여과 후, 진공 중 농축시켰다. 잔류물을 분취용 HPLC에 의해 정제시켜 N-(5-{4-[2-아미노-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}-2-클로로피리딘-3-일)메탄설폰아마이드(29.7㎎, 0.059 m㏖, 수율 26%)를 담황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 ㎒, DMSO-d6) δ 9.96 (br s, 1H), 8.50 (s, 1H), 8.02 (d, 1H), 7.62-7.56 (m, 2H), 7.12 (d, 1H), 6.09 (s, 2H), 4.32 (s, 2H), 4.30-4.23 (m, 2H), 3.60-3.52 (m, 2H), 3.19-3.09 (m, 4H), 2.30 (s, 3H), 1.24 (d, 6H); C23H27ClN6O3S에 대한 MS (EI): 503 (MH+).
실시예 2
2-아미노-5-{4-[2-아미노-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}피리딘-3-설폰아마이드
Figure pct00040
단계 1:
다이옥산(1.8㎖) 및 물(450㎕) 중 (4-{[(1,1-다이메틸에틸)옥시]카보닐}-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일)보론산(293㎎, 1.0 m㏖), 2-아미노-5-브로모-3-피리딘설폰아마이드(252㎎, 1.0 m㏖), 탄산칼륨(276㎎, 2.0 m㏖), 1,1'-비스(다이페닐포스피노)페로센-팔라듐(II)다이클로라이드 다이클로로메탄 복합체(41㎎, 0.05 m㏖)의 혼합물을 마이크로파 반응기 속에서 110℃에서 45분 동안 가열하였다. 이어서, 이 혼합물을 물로 희석시키고, 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 유기 추출물을 합하여, 황산나트륨 상에서 건조시키고 나서 여과 후, 진공 중 농축시켰다. 잔류물을 실리카겔 플래시 크로마토그래피(구배 100% 헥산류 내지 70% 에틸 아세테이트:30% 헥산류)에 의해 정제시켜 1,1-다이메틸에틸 7-[6-아미노-5-(아미노설포닐)피리딘-3-일]-2,3-다이하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-4(5H)-카복실레이트(270㎎, 0.64 m㏖, 수율 64%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 ㎒, CDCl3) δ 8.48-8.37 (m, 1H), 8.26-8.17 (m, 1H), 7.49-7.28 (m, 2H), 7.14-7.01 (m, 1H), 5.79-5.63 (m, 2H), 5.57-5.23 (m, 2H), 4.49 (d, 2H), 4.11-4.03 (m, 2H), 3.88-3.74 (m, 2H), 1.49-1.32 (m, 9H); C19H24N4O5S에 대한 MS (EI): 421 (MH+).
단계 2:
메탄올(3.5㎖) 중 1,1-다이메틸에틸 7-[6-아미노-5-(아미노설포닐)피리딘-3-일]-2,3-다이하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-4(5H)-카복실레이트(270㎎, 0.64 m㏖)의 용액에 다이옥산(4M, 1.6㎖, 6.4 m㏖) 중 염화수소를 첨가하고, 얻어진 용액을 60℃에서 1시간 동안 가열하였다. 실온까지 냉각 후, 휘발성 물질을 진공 중 제거하여, 2-아미노-5-(2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일)피리딘-3-설폰아마이드 다이하이드로클로라이드염을 정량적 수율로 수득하였다. 1H NMR (400 ㎒, DMSO-d6) δ 9.31 (br s, 2H), 8.51 (d, 1H), 8.13 (d, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.60 (dd, 1H), 7.56 (s, 2H), 7.17 (d, 1H), 6.71 (br s, 2H), 4.44-4.35 (m, 2H), 4.27-4.18 (m, 2H), 3.50 (s, 2H); C14H16N4O3S에 대한 MS (EI): 321 (MH+).
단계 3:
NMP(3㎖) 중 2-아미노-5-(2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일)피리딘-3-설폰아마이드 다이하이드로클로라이드염(252㎎, 0.64 m㏖), 4-클로로-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-2-아민(119㎎, 0.64 m㏖) 및 다이아이소프로필에틸아민(557㎕, 3.2 m㏖)의 용액을 120℃에서 16시간 동안 가열하고 나서, 실온까지 냉각시켰다. 이어서 물을 첨가하고, 얻어진 수성 혼합물을 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 유기 추출물을 합해서 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과 후, 진공 중 농축시켰다. 잔류물을 분취용 역상 HPLC에 의해 정제시켜, 2-아미노-5-{4-[2-아미노-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}피리딘-3-설폰아마이드(55.9㎎, 0.119 m㏖, 수율 19%)를 담황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 ㎒, DMSO-d6) δ 8.46 (d, 1H), 8.07 (d, 1H), 7.52 (s, 2H), 7.48-7.39 (m, 2H), 7.07 (d, 1H), 6.62 (br s, 2H), 6.01 (s, 2H), 4.29-4.19 (m, 4H), 3.56-3.47 (m, 2H), 3.24-3.10 (m, 1H), 2.29 (s, 3H), 1.24 (d, 6H); C22H27N7O3S에 대한 MS (EI): 470 (MH+).
단계 1 및/또는 3에서 대안적인 출발 시약을 이용해서 실시예 1의 절차를 수행하여, 본 발명의 이하의 화합물들을 제조하였다:
N-(5-{4-[2-아미노-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}피리딘-3-일)메탄설폰아마이드
Figure pct00041
1H NMR (400 ㎒, DMSO-d6) δ 8.57 (d, 1H), 8.36 (d, 1H), 7.77 (t, 1H), 7.58-7.49 (m, 2H), 7.12 (d, 1H), 6.01 (s, 2H), 4.33-4.20 (m, 4H), 3.58-3.50 (m, 2H), 3.24-3.12 (m, 1H), 3.10 (s, 3H), 2.29 (s, 3H), 1.25 (d, 6H); C23H28N6O3S에 대한 MS (EI): 469 (MH+).
N-[5-{4-[2-아미노-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}-2-(메틸옥시)피리딘-3-일]메탄설폰아마이드
Figure pct00042
1H NMR (400 ㎒, DMSO-d6) δ 9.33 (s, 1H), 8.24 (d, 1H), 7.83 (d, 1H), 7.54-7.43 (m, 2H), 7.09 (d, 1H), 6.01 (s, 2H), 4.29-4.17 (m, 4H), 3.95 (s, 3H), 3.58-3.49 (m, 2H), 3.25-3.13 (m, 1H), 3.07 (s, 3H), 2.30 (s, 3H), 1.25 (d, 6H); C24H30N6O4S 에 대한 MS (EI): 499 (MH+).
N-{5-[4-(2-아미노-6,6-다이메틸-5,6,7,8-테트라하이드로퀴나졸린-4-일)-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일]-2-클로로피리딘-3-일}메탄설폰아마이드
Figure pct00043
1H NMR (400 ㎒, DMSO-d6) δ 10.07 (br s, 1H), 8.45 (s, 1H), 7.99 (d, 1H), 7.67 (d, 1H), 7.54 (dd, 1H), 7.08 (d, 1H), 5.99 (br s, 2H), 4.57 (s, 2H), 4.34-4.24 (m, 2H), 3.83-3.67 (m, 2H), 3.09 (s, 3H), 2.54-2.46 (m, 2H), 2.29 (s, 2H), 1.51 (t, 2H), 0.83 (d, 6H); C25H29ClN6O3S에 대한 MS (EI): 529 (MH+).
N-(2-클로로-5-{4-[2-{[(2,2-다이플루오로에틸)아미노]메틸}-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}피리딘-3-일)메탄설폰아마이드
Figure pct00044
1H NMR (400 ㎒, CD3OD) δ8.45 (d, 1H), 8.16 (d, 1H), 7.59 (d, 1H), 7.51 (dd, 1H), 7.07 (d, 1H), 5.83 (tt, 1H), 4.63 (s, 2H), 4.36 (t, 2H), 3.85 (t, 2H), 3.74 (s, 2H), 3.35 (m, 1H), 3.09 (s, 3H), 2.83 (td, 2H), 2.53 (s, 3H), 1.39 (d, 6H); C26H31ClF2N6O3S에 대한 MS (ES): 581 (MH+).
N-[2-클로로-5-(4-{2-[(다이메틸아미노)메틸]-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일}-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일)피리딘-3-일]메탄설폰아마이드
1H NMR (400 ㎒, CD3OD) δ 8.50 (d, 1H), 8.19 (d, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.55 (dd, 1H), 7.07 (d, 1H), 4.96 (s, 2H), 4.48 (t, 2H), 4.40 (s, 2H), 4.04 (t, 2H), 3.27 (m, 1H), 3.12 (s, 3H), 2.87 (s, 6H), 2.62 (s, 3H), 1.43 (d, 6H); C26H33ClN6O3S에 대한 MS (ES): 545 (MH+).
생물학적 실시예
본 발명의 화합물은 PI3K-알파, mTOR 또는 이들 양쪽 모두에 대해 활성을 지닌다. 본 발명의 화합물은 생물학적 실시예 1 및 3에 기재된 검정을 이용해서 테스트되었고, 또한 PI3K-알파, mTOR 또는 이들 양쪽 모두의 억제제인 것으로 판정되었다.
화합물들에 의한 PI3K, mTORc1, 및 mTORc2 활성 및 이들의 억제를 측정하기 위한 적절한 시험관내 검정은 당업계에 공지되어 있다. 생물학적 실시예인 실시예 1, 2 및 3은 PI3K 및 mTOR 활성을 측정하기 위한 시험관내 검정을 기재한다. 암의 치료에서 시험관내 효능의 측정을 위한 세포-기반 검정은 당업계에 공지되어 있다. 생물학적 실시예인, 실시예 5 및 6은 시험관내 세포 활성을 측정하기 위한 검정을 기재한다. 암에 대한 적절한 생체내 모델은 당업자에게 공지되어 있다. 생물학적 실시예 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13은 전립선암종, 교모세포종, 폐 암종 및 흑색종에 대한 생체내 모델을 기재한다. 본 명세서에 개시된 실시예뿐만 아니라 당업계에 개시된 것에 따라서, 당업자라면 본 발명의 화합물의 PI3K-억제 및/또는 mTOR-억제 활성을 판정할 수 있다.
이와 같이 해서, 화학식 I의 화합물은, 질환, 특히, PI3K-알파, mTOR, 또는 이들 양쪽 모두에 대한 활성이 질환의 병리학 및/또는 징후학에 기여하는 암을 치료하는데 유용하다. 예를 들어, PI3K-알파, mTOR, 또는 이들 양쪽 모두에 대한 활성이 병리학 및/또는 징후학에 기여하는 암은 유방암, 외투세포 림프종, 신장 세포 암종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, NPM/ALK-변형 역형성 대세포 림프종, 미만성 큰 B세포 림프종, 횡문근육종, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 비소세포 폐 암종, 소세포 폐 암종, 샘암종, 결장암, 직장암, 위 암종, 간세포 암종, 흑색종, 췌장암, 전립선 암종, 갑상선 암종, 역형성 대세포 림프종, 혈관종, 교모세포종 또는 두경부암을 포함한다.
생물학적 실시예 1
mTOR/GbL/랩터(mTORC1) ELISA 검정
mTORC1 효소 활성의 측정은 4E-BP1 단백질의 인산화에 따라 ELISA 검정 포맷에서 수행하였다. 모든 실험은 384-웰 포맷에서 수행하였다. 일반적으로, 시험 화합물의 변화되는 농도를 함유한 0.5㎕ DMSO를 15㎕ 효소 용액에 혼합시켰다. 키나제 반응은 15㎕의 기질-함유 용액의 첨가에 의해 개시되었다. 검정 조건은 아래와 같다; 0.2nM mTORC1, 20mM Hepes, pH 7.2 중 10μM ATP 및 50 nM NHis-표지된 4E-BP1, 1mM DTT, 50mM NaCl, 10mM MnCl2, 0.02 mg/㎖ BSA, 0.01% CHAPS, 50mM β-글라이세로포스페이트. 주위 온도에서 120분간 인큐베이션 후, 20㎕의 반응 부피를 Ni-킬레이트-코팅된 384-웰 플레이트로 이동시켰다. 4E-BP1 단백질의 결합 단계가 60분간 진행된 후, 50㎕의 트리스-버퍼 식염수 용액(Tris-buffered saline solution; TBS)으로 각각 4회 세척하였다. 5% BSA-TBST(TBS 중 0.2% Tween-20) 중 항-포스포-4E-BP1 래빗-IgG(20㎕, 1:5000)를 첨가하고 추가로 60분간 인큐베이션하였다. 2차 HRP-표지된 항-IgG로의 인큐베이션은 일차 항체(50㎕의 4회 세척)를 세척해낸 후 유사하게 수행하였다. TBST로 최종 세척 단계 후, 20㎕의 수퍼시그널 엘리사 펨토(SuperSignal ELISA Femto)(Pierce Biotechnology)를 첨가하고 엔비전 플레이트 리더(EnVision plate reader)를 사용하여 발광을 측정하였다.
이 검정을 이용하면, 본 발명의 화합물은, 바람직하게는 약 0.0001nM 내지 2500nM(IC50)의 mTOR-억제 활성을 지닌다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물은 약 0.001nM 내지 500nM의 mTOR-억제 활성을 지닌다. 또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물은 약 0.001nM 내지 250nM의 mTOR-억제 활성을 지닌다. 또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물은 약 0.001nM 내지 100nM의 mTOR-억제 활성을 지닌다. 또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물은 약 0.1nM 내지 75nM의 mTOR-억제 활성을 지닌다.
이 검정을 이용하면, 표 1의 화합물 1 내지 5, 그리고 18 및 19는 100nM 미만의 mTOR-억제 활성을 지녔다.
생물학적 실시예 2
면역-복합체 mTORC2 키나제(mTORC2 IP 키나제) 검정
HeLa(ATCC) 세포를 현탁 배양액에서 성장시키고 40mM HEPES pH 7.5, 120mM NaCl, 1mM EDTA, 10mM 피로인산나트륨, 10mM β-글라이세로포스페이트, 10mM NaF, 10mM NaN3, 1개 정제의 프로테아제 저해제(완전-미니(Complete-Mini), EDTA-무함유, 로셰(Roche)), 0.3% 콜라미도프로필다이메틸암모니오프로판설포네이트(CHAPS), 1mM AEBSF, 0.5mM 벤즈아미딘 HCl, 20 ㎍/㎖ 헤파린, 및 1.5mM Na3VO4를 함유한 빙냉된 용해 버퍼에서 용해시켰다. mTORC2 복합체는 항-RICTOR 항체로 2시간 동안 면역침강시켰다. 면역 복합체를 단백질 A 세파로스(GE 헬스케어(GE Healthcare)사 제품, 17-5280-01) 상에 고정시키고, 세척 버퍼(40mM HEPES pH 7.5, 120mM NaCl, 10mM β-글라이세로포스페이트, 0.3% CHAPS, 1mM AEBSF, 20 ㎍/㎖ 헤파린, 1.5mM Na3VO4, 및 완전-미니, EDTA-무함유)로 순차적으로 3회 세척하고, 키나제 버퍼(40mM HEPES, pH 7.5, 120mM NaCl, 0.3% CHAPS, 20 ㎍/㎖ 헤파린, 4mM MgCl2, 4mM MnCl2, 10% 글리세롤 및 10mM DTT)에 재현탁시켰다. 면역 복합체(1×107 세포들과 등가)는 37℃에서 시험 화합물 또는 0.6% DMSO로 5분간 예비-인큐베이션시킨 후, 키나제 버퍼, 50μM ATP, 및 0.75 ㎍ 전장 탈인산화된 AKT1을 함유하는 33㎕의 최종 부피(5㎕ 베드 볼륨 포함)에서 8분간 키나제 반응을 수행시켰다. 키나제 반응은 20% β-머캅토에탄올을 함유하는 11㎕ 4×SDS 샘플 버퍼의 첨가에 의해 종결시키고 10% 트리스 글라이신 겔(Tris Glycine gel)에 용해시켰다. 겔을 4℃에서 20시간 동안 50V에서 PVDF 막 상에 이동시켰다. 상기 막을 TBST 중 5% 무지 우유에서 1시간 동안 블로킹시키고, 3% BSA/TBST 중 래빗 항-pAKT(S473)(셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)사 제품, 4060)의 1/1000 희석액으로 4℃에서 하룻밤 인큐베이션시켰다. 상기 막을 TBST 중에서 3회 세척하고 5% 무지 우유/TBST 중 2차 염소 항-래빗 HRP 항체(셀 시그널링 테크놀로지사 제품, 2125)의 1/10000 희석액으로 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 신호는 아머샴(Amersham) ECL 플러스를 사용하여 검출되었다. 스캔된 데이터는 이미지퀀트(ImageQuant) 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 시험 화합물에 대한 IC50은 XLfit4 소프트웨어를 사용하여 DMSO 처리된 샘플에 관하여 결정하였다.
생물학적 실시예 3
pS6(S240/244) ELISA 검정
10% FBS(셀그로(Cellgro)사 제품), 1% NEAA(셀그로사 제품) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(셀그로사 제품)을 함유하는 DMEM(셀그로사 제품) 중에서 96-웰 플레이트(코닝(Corning)사 제품, 3904)에 각 웰당 24000 세포수로 MCF-7 세포(ATCC)를 파종하였다. 세포들을 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션시키고, 성장 배지를 혈청-무함유 DMEM 또는 0.4% BSA 함유 배지로 교환하였다. 0.3% DMSO(비히클) 중 시험 화합물의 순차적인 희석액을 세포에 첨가하고 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포들을 고정시키기 위해, 배지를 제거하고, TBS(20mM 트리스(Tris), 500mM NaCl) 중 4% 포름알데하이드(시그마 알드리치사 제품, F8775)를 실온에서 30분간 100㎕/웰로 각 웰에 첨가하였다. 세포들을, 0.1% 트리톤(Triton) X-100(시그마사 제품, 카탈로그 번호 T9284)을 함유하는 200㎕ TBS로 4회 세척하였다. 플레이트를 100㎕ 오딧세이 블로킹 버퍼(Odyssey blocking buffer)(리-코르 바이오사이언시스(Li-Cor Biosciences)사 제품, 927-40000)로 실온에서 1시간 동안 블로킹시켰다. 항-pS6(S240/244) 항체(셀 시그널링 테크놀로지사 제품, 2215) 및 항-총-S6 항체(R&D 시스템즈(systems)사 제품, MAB5436)를 오딧세이 블록킹 버퍼에서 1:400으로 희석하고, 둘 모두의 항체를 함유하는 50㎕의 항체 용액을 하나의 플레이트에 첨가하여 pS6 및 총 S6을 검출하였다. 4℃에서 하룻밤 인큐베이션시킨 후, 플레이트를, 0.1% Tween20을 함유하는 TBS(Bio-Rad, 카탈로그 번호 170-6351)(TBST) 200㎕로 4회 세척하였다. 염소 항-래빗 및 염소 항-마우스 2차 항체(리-코르 바이오사이언시스사 제품, 카탈로그 번호 926-32221 및 926-32210)를 IRDye와 컨쥬게이트시킨 후 0.1% Tween20을 함유하는 오딧세이 블록킹 버퍼에서 1:400으로 희석하였다. 둘 모두의 항체를 함유한 50㎕의 항체 용액을 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 200㎕ TBST로 3회 세척하고 200㎕ TBS로 2회 세척하였다. 형광은 오딧세이 플레이트 리더 상에서 판독하였다. IC50값을 웰에서 처리된 화합물에 대한 pS6 대 총 S6 신호의 비율에 근거하여 결정하였으며, DMSO-처리된 대조군 웰에 대해 정규화시켰다.
일 실시형태에 있어서, MCF-7 세포에서 본 검정에 시험된 본 발명의 화합물은 약 1.5μM 이하의 억제 활성을 지닌다. 다른 실시형태에 있어서, MCF-7 세포에서 본 검정에 시험된 본 발명의 화합물은 약 1.0μM 이하의 억제 활성을 지닌다. 다른 실시형태에 있어서, MCF-7 세포에서 본 검정에 시험된 본 발명의 화합물은 약 0.5μM 이하의 억제 활성을 지닌다. 일 실시형태에 있어서, MCF-7 세포에서 본 검정에 시험된 본 발명의 화합물은 약 0.25μM 이하의 억제 활성을 지닌다. 일 실시형태에 있어서, MCF-7 세포에서 본 검정에 시험된 본 발명의 화합물은 약 0.2μM 이하의 억제 활성을 지닌다. 일 실시형태에 있어서, MCF-7 세포에서 본 검정에 시험된 본 발명의 화합물은 약 0.1μM 이하의 억제 활성을 지닌다.
생물학적 실시예 4
PI3K 생화학적 검정
PI3Kα 활성은 루시페라아제-루시페린-커플링된 화학 발광을 사용하여 키나제 반응 후에 소비된 ATP의 퍼센트로서 측정하였다. 반응을 384-웰 백색, 미디움 바인딩 마이크로타이터 플레이트(medium binding microtiter plate)(그라이너(Greiner)사 제품)에서 수행하였다. 키나제 반응은 버퍼 용액 중 20㎕ 부피에서 시험 화합물, ATP, 기질(PIP2) 및 키나제를 배합함으로써 개시되었다. 표준 PI3K알파 검정 버퍼는 50mM 트리스(Tris), pH 7.5, 1mM EGTA, 10mM MgCl2, 1mM DTT 및 0.03% CHAPS로 구성되었다. 효소, ATP 및 기질에 대한 표준 검정 농도는 각각 3nM, 1μM 및 10μM이었다. 반응 혼합물을 대략 2시간 동안 주위 온도에서 인큐베이션시켰다. 키나제 반응 후, 루시페라아제-루시페린 믹스(프로메가-키나제-글로(Promega Kinase-Glo)사 제품)의 10㎕ 분량을 첨가하고, 화학 발광 신호를 빅터2(Victor2) 또는 엔비전(퍼킨 엘머(Perkin Elmer)사 제품)을 사용하여 측정하였다. 총 ATP 소비는 40 내지 60%로 제한되었고 대조군 화합물의 IC50값은 문헌 표준과 양호하게 상관성을 보였다. PI3Kα를 PI3Kβ, PI3Kγ 또는 PI3Kδ로 치환하여, PI3K의 다른 아이소형태에 대한 화합물의 억제 활성을 측정하였다. PI3Kβ 및 PI3Kδ 검정에 대해서, 효소 농도는 각각 10nM 및 4nM이었다. PI3Kγ 검정에 대해서, 효소 농도는 40nM이었고, 인큐베이션 시간은 1시간이었으며, 검정 버퍼 중 MgCl2의 농도는 5mM이었다.
이 검정을 이용하면, 본 발명의 화합물은, 바람직하게는 0.0001nM 내지 2500nM(IC50)의 PI3Kα-억제 활성을 지닌다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물은 약 0.001nM 내지 500nM의 PI3Kα-억제 활성을 지닌다. 또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물은 약 0.001nM 내지 250nM의 PI3Kα-억제 활성을 지닌다. 또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물은 약 0.001nM 내지 100nM의 PI3Kα-억제 활성을 지닌다. 또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물은 약 0.1nM 내지 75nM의 mTOR-억제 활성을 지닌다.
이 검정을 이용하면, 표 1의 화합물 1 내지 5, 그리고 18 및 19는 100nM 미만의 PI3Kα-억제 활성을 지녔다.
실시형태 1: 일 실시형태에서, 본 발명은 약 0.5μM 이하의 PI3K-알파-억제 활성을 지니고 mTOR에 비활성이거나(2.0μM 이상의 농도에서 시험했을 때), 또는 mTOR에 비해 PI3K-알파에 대해서 약 5배 이상, 약 7배 이상 또는 약 10배 이상만큼 선택적인 본 발명의 화합물을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 약 0.35μM 이하의 PI3K-알파-억제 활성을 지니고 mTOR에 비활성이거나(2.0μM 이상의 농도에서 시험했을 때), 또는 mTOR에 비해 PI3K-알파에 대해서 약 5배 이상, 약 7배 이상, 또는 약 10배 이상만큼 선택적인 본 발명의 화합물을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 약 0.25μM 이하의 PI3K-알파-억제 활성을 지니고 mTOR에 비활성이거나(2.0μM 이상의 농도에서 시험했을 때) 또는 mTOR에 비해 PI3K-알파에 대해서 약 5배 이상, 약 7배 이상 또는 약 10배 이상만큼 선택적인 본 발명의 화합물을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 약 0.1μM 이하의 PI3K-알파-억제 활성을 지니고 mTOR에 비활성이거나(2.0μM 이상의 농도에서 시험했을 때) 또는 mTOR에 비해 PI3K-알파에 대해서 약 5배 이상, 약 7배 이상 또는 약 10배 이상만큼 선택적인 본 발명의 화합물을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 약 0.05μM 이하의 PI3K-알파-억제 활성을 지니고 mTOR에 비해 PI3K-알파에 대해서 약 5배 이상, 약 7배 이상 또는 약 10배 이상만큼 선택적인 본 발명의 화합물을 포함한다.
실시형태 2: 일 실시형태에서, 본 발명은 약 2.0μM 이하의 PI3K-알파-억제 활성과 약 2.0μM 이하의 mTOR-억제 활성을 지니는 본 발명의 화합물을 포함하고, 다른 것에 비해 표적들 중의 하나에 대한 선택성이 3배를 초과하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 약 1.0μM 이하의 PI3K-알파-억제 활성과 약 1.0μM 이하의 mTOR-억제 활성을 지니는 본 발명의 화합물을 포함하고, 다른 것에 비해 표적들 중의 하나에 대한 선택성이 3배를 초과하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 약 0.5μM 이하의 PI3K-알파-억제 활성과 약 0.5μM 이하의 mTOR-억제 활성을 지니는 본 발명의 화합물을 포함하고, 다른 것에 비해 표적들 중의 하나에 대한 선택성이 3배를 초과하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 약 0.3μM 이하의 PI3K-알파-억제 활성과 약 0.3μM 이하의 mTOR-억제 활성을 지니는 본 발명의 화합물을 포함하고, 다른 것에 비해 표적들 중의 하나에 대한 선택성이 3배를 초과하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 약 0.2μM 이하의 PI3K-알파-억제 활성과 약 0.2μM 이하의 mTOR-억제 활성을 지니는 본 발명의 화합물을 포함하고, 다른 것에 비해 표적들 중의 하나에 대한 선택성이 2배를 초과하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 약 0.15μM 이하의 PI3K-알파-억제 활성과 약 0.15μM 이하의 mTOR-억제 활성을 지니는 본 발명의 화합물을 포함하고, 다른 것에 비해 표적들 중의 하나에 대한 선택성이 2배를 초과하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 약 0.1μM 이하의 PI3K-알파-억제 활성과 약 0.1μM 이하의 mTOR-억제 활성을 지니는 본 발명의 화합물을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 약 0.05μM 이하의 PI3K-알파-억제 활성과 약 0.05μM 이하의 mTOR-억제 활성을 지니는 본 발명의 화합물을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 약 0.02μM 이하의 PI3K-알파-억제 활성과 약 0.02μM 이하의 mTOR-억제 활성을 지니는 본 발명의 화합물을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 약 0.01μM 이하의 PI3K-알파-억제 활성과 약 0.01μM 이하의 mTOR-억제 활성을 지니는 본 발명의 화합물을 포함한다.
생물학적 실시예 5-11
약동력학적 이종이식 종양 모델
5 내지 8주령 및 약 20 내지 25g의 체중을 갖는 암컷 및 수컷 무흉선 누드 마우스(NCr)를 아래 모델에서 사용하였다. 연구 개시 이전에, 동물을 최소 48시간 동안 적응시켰다. 이 연구 동안, 동물에는 임의량의 음식 및 물을 공급하였으며, 70 내지 75℉, 60% 상대 습도의 조건인 방에 두었다. 12시간 명(light) 및 12시간 암(dark) 사이클이 자동 타이머로 유지되었다. 모든 동물은 화합물 유도 또는 종양 관련 사망에 대해 매일 검사되었다.
MCF-7 유방 샘암종 모델
가습된 5% CO2 대기 중 37℃에서 MCF7 인간 유방 샘암종 세포를 10% 소태아 혈청(셀그로사 제품), 페니실린-스트렙토마이신 및 비필수 아미노산이 보충된 DMEM(셀그로사 제품) 중에서 시험관 내 배양하였다. 0일째에, 세포를 트립신 처리에 의해 수확하고, 50% 성장 인자 감소된 마트리겔(matrigel)(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)사 제품)과 함께 50% 냉 행크스 발란스 염 용액(cold Hank's balanced salt solution)으로 제조된 100㎕의 용액 중 5×106 세포를 암컷 누드 마우스의 뒷 옆구리로 피하 주입하였다. 각 마우스에는 식별 및 데이터 추척을 위해 트랜스폰더(transponder)를 이식하였고, 동물들은 임상 징후 및 생존을 매일 모니터링하였다.
종양은 암컷 무흉선 누드 마우스에 자리를 잡고 평균 종양 무게가 100 내지 200㎎에 이르도록 하였다. 본 발명의 화합물은 물(1:1 몰 비율의 1N HCL과 함께) 중 용액/미세 현탁액으로서 하루에 1회(qd) 또는 하루에 2회(bid)씩 10, 25, 50 및 100 ㎎/㎏에서 14일간 경구 투여하였다. 14 내지 19일의 투여 기간 동안, 종양 무게를 주 2회 측정하고 체중은 매일 기록하였다.
콜로(Colo)-205 결장 모델
가습된 5% CO2 대기 중 37℃에서 콜로-205 인간 결장 암종 세포를 10% 소태아 혈청(하이클론(Hyclone)사 제품), 페니실린-스트렙토마이신 및 비필수 아미노산이 보충된 DMEM(미디아테크(Mediatech)사 제품) 중에서 시험관 내 배양하였다. 0일째에, 세포를 트립신 처리에 의해 수확하고, 0.1㎖ 빙냉된 행크스 발란스 염 용액 중 3×106 세포(패시지 10 내지 15, >95% 생존도)를 5 내지 8주령의 암컷 무흉선 누드 마우스의 뒷 옆구리로 피부내 주입하였다. 각 마우스에는 식별을 위해 트랜스폰더를 이식하였고, 동물들은 임상 징후 및 생존을 매일 모니터링하였다.
종양은 암컷 무흉선 누드 마우스에 자리를 잡고 평균 종양 무게가 100 내지 200㎎에 이르도록 하였다. 본 발명의 화합물은 물(1:1 몰 비율의 1N HCL과 함께) 중 용액/미세 현탁액으로서 하루에 1회(qd) 또는 하루에 2회(bid)씩 10, 25, 50 및 100 ㎎/㎏에서 14일간 경구 투여하였다. 14 일간의 투여 기간 동안, 종양 무게를 주 2회 검출하고 체중은 매일 기록하였다.
PC-3 전립선 샘암종 모델
가습된 5% CO2 대기 중 37℃에서 PC-3 인간 전립선 샘암종 세포를 20% 소태아 혈청(하이클론사 제품), 페니실린-스트렙토마이신 및 비필수 아미노산이 보충된 DMEM(미디아테크사 제품) 중에서 시험관 내 배양하였다. 0일째에, 세포를 트립신처리에 의해 수확하고, 0.1㎖ 빙냉된 행크스 발란스 염 용액 중 3×106 세포(패시지 10 내지 14, >95% 생존도)를 5 내지 8주령의 수컷 누드 마우스의 뒷 옆구리로 피하 주입하였다. 각 마우스에는 식별을 위해 트랜스폰더를 이식하였고, 동물들은 임상 징후 및 생존을 매일 모니터링하였다.
종양은 수컷 무흉선 누드 마우스에 자리를 잡고 평균 종양 무게가 100 내지 200㎎에 이르도록 하였다. 본 발명의 화합물은 물 (1:1 몰 비율의 1 N HCL과 함께) 중 용액/미세 현탁액으로서 하루에 1회(qd) 또는 하루에 2회(bid)씩 10, 25, 50 및 100 ㎎/㎏에서 19일간 경구 투여하였다. 14 내지 19일의 투여 기간 동안, 종양 무게를 주 2회 검출하고 체중은 매일 기록하였다.
U-87 MG 인간 교모세포종 모델
가습된 5% CO2 대기 중 37℃에서 U-87 MG 인간 교모세포종 세포를 10% 소태아 혈청(하이클론사 제품), 페니실린-스트렙토마이신 및 비필수 아미노산이 보충된 DMEM(미디아테크사 제품) 중에서 시험관 내 배양하였다. 0일째에, 세포를 트립신 처리에 의해 수확하고, 0.1㎖ 빙냉된 행크스 발란스 염 용액 중 2×106 세포(패시지 5, 96% 생존도)를 5 내지 8주령의 암컷 누드 마우스의 뒷 옆구리로 피부내 주입하였다. 각 마우스에는 식별을 위해 트랜스폰더를 이식하였고, 동물들은 임상 징후 및 생존을 매일 모니터링하였다. 체중은 매일 기록하였다.
A549 인간 폐 암종 모델
가습된 5% CO2 대기 중 37℃에서 A549 인간 폐 암종 세포를 10% 소태아 혈청(하이클론사 제품), 페니실린-스트렙토마이신 및 비필수 아미노산이 보충된 DMEM(미디아테크사 제품) 중에서 시험관 내 배양하였다. 0일째에, 세포를 트립신 처리에 의해 수확하고, 0.1㎖ 빙냉된 행크스 발란스 염 용액 중 10×106세포(패시지 12, 99% 생존도)를 5 내지 8주령의 암컷 누드 마우스의 뒷 옆구리로 피부내 주입하였다. 각 마우스에는 식별을 위해 트랜스폰더를 이식하였고, 동물들은 임상 징후 및 생존을 매일 모니터링하였다. 체중은 매일 기록하였다.
A2058 인간 흑색종 모델
가습된 5% CO2 대기 중 37℃에서 A2058 인간 흑색종 세포를 10% 소태아 혈청(하이클론사 제품), 페니실린-스트렙토마이신 및 비필수 아미노산이 보충된 DMEM(미디아테크사 제품) 중에서 시험관 내 배양하였다. 0일째에, 세포를 트립신 처리에 의해 수확하고, 0.1㎖ 빙냉된 행크스 발란스 염 용액 중 3×106 세포(패시지 3, 95% 생존도)를 5 내지 8주령의 암컷 무흉선 누드 마우스의 뒷 옆구리로 피부내 주입하였다. 각 마우스에는 식별을 위해 트랜스폰더를 이식하였고, 동물들은 임상 징후 및 생존을 매일 모니터링하였다. 체중은 매일 기록하였다.
WM-266-4 인간 흑색종 모델
가습된 5% CO2 대기 중 37℃에서 WM-266-4 인간 흑색종 세포를 10% 소태아 혈청(하이클론사 제품), 페니실린-스트렙토마이신 및 비필수 아미노산이 보충된 DMEM(미디아테크사 제품) 중에서 시험관 내 배양하였다. 0일째에, 세포를 트립신처리에 의해 수확하고, 0.1㎖ 빙냉된 행크스 발란스 염 용액 중 3×106 세포(패시지 5, 99% 생존도)를 5 내지 8주령의 암컷 무흉선 누드 마우스의 뒷 옆구리로 피부내 주입하였다. 각 마우스에는 식별을 위해 트랜스폰더를 이식하였고, 동물들은 임상 징후 및 생존을 매일 모니터링하였다. 체중은 매일 기록하였다.
상기 모델에서 종양 무게(tumor weight: TW)는 아래의 식을 사용하여, 캘리퍼로 수직의 직경을 측정하여 결정하였다:
종양 무게(㎎) = [종양 부피 = 길이(㎜) × 폭2(㎟)]/2
이들 데이터가 기록되었으며, 종양 무게 대 주입 후 날짜 선 그래프에 표시되어, 종양 성장 속도의 표지로서 도표로 나타내었다. 종양 성장의 억제 퍼센트(TGI)는 아래 식으로 결정된다:
Figure pct00045
여기서 X0 = 날짜에서 모든 군에 대한 종양의 평균 TW
Xf = 날짜 f에서 처리된 군의 TW
Yf = 날짜 f에서 비히클 대조군의 TW
만약 종양이 이들의 시작 크기 아래로 퇴행한다면, 퍼센트 종양 퇴행성은 아래 식으로 결정된다:
Figure pct00046
각 실험군에 대한 평균 ± SEM 값을 얻도록 종양 크기는 각 종양에 대해 독립적으로 계산하였다. 통계적 유의도는 2-테일드 스튜던트의 t-테스트(P<0.05로서 정의된 유의도)를 사용하여 결정하였다.
전술한 발명은, 명확성 및 이해를 목적으로 해서 예시 및 실시예에 의해서 상세히 기재되었다. 본 발명은 다양한 구체적인 실시형태 및 기술을 참고로 하여 기재되었다. 그러나, 본 발명의 사상 및 범위 내에서 수많은 변화 및 변형이 있을 수 있음을 이해할 필요가 있다. 첨부된 특허청구범위의 범주 내에서 변화 및 변형이 실시될 수 있음이 당업자에게는 명백할 것이다. 따라서, 전술한 기재는 예시를 의도한 것일 뿐 제한하기 위한 것이 아님을 이해할 필요가 있다. 그러므로, 본 발명의 범위는 상기 기재를 참고로 결정되지 않으며, 대신에 아래 첨부된 특허청구범위를 참고로 하여 이러한 특허청구범위에 부여된 동등한 전체 범위에 따라 결정되어야 한다. 본 출원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공개문헌은, 마치 각 개개의 특허, 특허 출원 또는 공개문헌이 독립적으로 나타내는 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위하여 이들 전체가 참조로서 본 명세서에 병합된다.
SEQUENCE LISTING <110> Exelixis, Inc. <120> Benzoxazepines as Inhibotors of PI3K/mTOR and Methods of Their Use and Manufacture <130> 224990/10-022C-PC/318773 <150> 61/417,142 <151> 2010-11-24 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1068 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Human phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit alpha polypeptide (PIK3CA) encoded by mRNA polynucleotide sequence ID: NCBI Accession Reference No: NM_006218; GI:54792081 (3724 nucleotides) <400> 1 Met Pro Pro Arg Pro Ser Ser Gly Glu Leu Trp Gly Ile His Leu Met 1 5 10 15 Pro Pro Arg Ile Leu Val Glu Cys Leu Leu Pro Asn Gly Met Ile Val 20 25 30 Thr Leu Glu Cys Leu Arg Glu Ala Thr Leu Ile Thr Ile Lys His Glu 35 40 45 Leu Phe Lys Glu Ala Arg Lys Tyr Pro Leu His Gln Leu Leu Gln Asp 50 55 60 Glu Ser Ser Tyr Ile Phe Val Ser Val Thr Gln Glu Ala Glu Arg Glu 65 70 75 80 Glu Phe Phe Asp Glu Thr Arg Arg Leu Cys Asp Leu Arg Leu Phe Gln 85 90 95 Pro Phe Leu Lys Val Ile Glu Pro Val Gly Asn Arg Glu Glu Lys Ile 100 105 110 Leu Asn Arg Glu Ile Gly Phe Ala Ile Gly Met Pro Val Cys Glu Phe 115 120 125 Asp Met Val Lys Asp Pro Glu Val Gln Asp Phe Arg Arg Asn Ile Leu 130 135 140 Asn Val Cys Lys Glu Ala Val Asp Leu Arg Asp Leu Asn Ser Pro His 145 150 155 160 Ser Arg Ala Met Tyr Val Tyr Pro Pro Asn Val Glu Ser Ser Pro Glu 165 170 175 Leu Pro Lys His Ile Tyr Asn Lys Leu Asp Lys Gly Gln Ile Ile Val 180 185 190 Val Ile Trp Val Ile Val Ser Pro Asn Asn Asp Lys Gln Lys Tyr Thr 195 200 205 Leu Lys Ile Asn His Asp Cys Val Pro Glu Gln Val Ile Ala Glu Ala 210 215 220 Ile Arg Lys Lys Thr Arg Ser Met Leu Leu Ser Ser Glu Gln Leu Lys 225 230 235 240 Leu Cys Val Leu Glu Tyr Gln Gly Lys Tyr Ile Leu Lys Val Cys Gly 245 250 255 Cys Asp Glu Tyr Phe Leu Glu Lys Tyr Pro Leu Ser Gln Tyr Lys Tyr 260 265 270 Ile Arg Ser Cys Ile Met Leu Gly Arg Met Pro Asn Leu Met Leu Met 275 280 285 Ala Lys Glu Ser Leu Tyr Ser Gln Leu Pro Met Asp Cys Phe Thr Met 290 295 300 Pro Ser Tyr Ser Arg Arg Ile Ser Thr Ala Thr Pro Tyr Met Asn Gly 305 310 315 320 Glu Thr Ser Thr Lys Ser Leu Trp Val Ile Asn Ser Ala Leu Arg Ile 325 330 335 Lys Ile Leu Cys Ala Thr Tyr Val Asn Val Asn Ile Arg Asp Ile Asp 340 345 350 Lys Ile Tyr Val Arg Thr Gly Ile Tyr His Gly Gly Glu Pro Leu Cys 355 360 365 Asp Asn Val Asn Thr Gln Arg Val Pro Cys Ser Asn Pro Arg Trp Asn 370 375 380 Glu Trp Leu Asn Tyr Asp Ile Tyr Ile Pro Asp Leu Pro Arg Ala Ala 385 390 395 400 Arg Leu Cys Leu Ser Ile Cys Ser Val Lys Gly Arg Lys Gly Ala Lys 405 410 415 Glu Glu His Cys Pro Leu Ala Trp Gly Asn Ile Asn Leu Phe Asp Tyr 420 425 430 Thr Asp Thr Leu Val Ser Gly Lys Met Ala Leu Asn Leu Trp Pro Val 435 440 445 Pro His Gly Leu Glu Asp Leu Leu Asn Pro Ile Gly Val Thr Gly Ser 450 455 460 Asn Pro Asn Lys Glu Thr Pro Cys Leu Glu Leu Glu Phe Asp Trp Phe 465 470 475 480 Ser Ser Val Val Lys Phe Pro Asp Met Ser Val Ile Glu Glu His Ala 485 490 495 Asn Trp Ser Val Ser Arg Glu Ala Gly Phe Ser Tyr Ser His Ala Gly 500 505 510 Leu Ser Asn Arg Leu Ala Arg Asp Asn Glu Leu Arg Glu Asn Asp Lys 515 520 525 Glu Gln Leu Lys Ala Ile Ser Thr Arg Asp Pro Leu Ser Glu Ile Thr 530 535 540 Glu Gln Glu Lys Asp Phe Leu Trp Ser His Arg His Tyr Cys Val Thr 545 550 555 560 Ile Pro Glu Ile Leu Pro Lys Leu Leu Leu Ser Val Lys Trp Asn Ser 565 570 575 Arg Asp Glu Val Ala Gln Met Tyr Cys Leu Val Lys Asp Trp Pro Pro 580 585 590 Ile Lys Pro Glu Gln Ala Met Glu Leu Leu Asp Cys Asn Tyr Pro Asp 595 600 605 Pro Met Val Arg Gly Phe Ala Val Arg Cys Leu Glu Lys Tyr Leu Thr 610 615 620 Asp Asp Lys Leu Ser Gln Tyr Leu Ile Gln Leu Val Gln Val Leu Lys 625 630 635 640 Tyr Glu Gln Tyr Leu Asp Asn Leu Leu Val Arg Phe Leu Leu Lys Lys 645 650 655 Ala Leu Thr Asn Gln Arg Ile Gly His Phe Phe Phe Trp His Leu Lys 660 665 670 Ser Glu Met His Asn Lys Thr Val Ser Gln Arg Phe Gly Leu Leu Leu 675 680 685 Glu Ser Tyr Cys Arg Ala Cys Gly Met Tyr Leu Lys His Leu Asn Arg 690 695 700 Gln Val Glu Ala Met Glu Lys Leu Ile Asn Leu Thr Asp Ile Leu Lys 705 710 715 720 Gln Glu Lys Lys Asp Glu Thr Gln Lys Val Gln Met Lys Phe Leu Val 725 730 735 Glu Gln Met Arg Arg Pro Asp Phe Met Asp Ala Leu Gln Gly Phe Leu 740 745 750 Ser Pro Leu Asn Pro Ala His Gln Leu Gly Asn Leu Arg Leu Glu Glu 755 760 765 Cys Arg Ile Met Ser Ser Ala Lys Arg Pro Leu Trp Leu Asn Trp Glu 770 775 780 Asn Pro Asp Ile Met Ser Glu Leu Leu Phe Gln Asn Asn Glu Ile Ile 785 790 795 800 Phe Lys Asn Gly Asp Asp Leu Arg Gln Asp Met Leu Thr Leu Gln Ile 805 810 815 Ile Arg Ile Met Glu Asn Ile Trp Gln Asn Gln Gly Leu Asp Leu Arg 820 825 830 Met Leu Pro Tyr Gly Cys Leu Ser Ile Gly Asp Cys Val Gly Leu Ile 835 840 845 Glu Val Val Arg Asn Ser His Thr Ile Met Gln Ile Gln Cys Lys Gly 850 855 860 Gly Leu Lys Gly Ala Leu Gln Phe Asn Ser His Thr Leu His Gln Trp 865 870 875 880 Leu Lys Asp Lys Asn Lys Gly Glu Ile Tyr Asp Ala Ala Ile Asp Leu 885 890 895 Phe Thr Arg Ser Cys Ala Gly Tyr Cys Val Ala Thr Phe Ile Leu Gly 900 905 910 Ile Gly Asp Arg His Asn Ser Asn Ile Met Val Lys Asp Asp Gly Gln 915 920 925 Leu Phe His Ile Asp Phe Gly His Phe Leu Asp His Lys Lys Lys Lys 930 935 940 Phe Gly Tyr Lys Arg Glu Arg Val Pro Phe Val Leu Thr Gln Asp Phe 945 950 955 960 Leu Ile Val Ile Ser Lys Gly Ala Gln Glu Cys Thr Lys Thr Arg Glu 965 970 975 Phe Glu Arg Phe Gln Glu Met Cys Tyr Lys Ala Tyr Leu Ala Ile Arg 980 985 990 Gln His Ala Asn Leu Phe Ile Asn Leu Phe Ser Met Met Leu Gly Ser 995 1000 1005 Gly Met Pro Glu Leu Gln Ser Phe Asp Asp Ile Ala Tyr Ile Arg 1010 1015 1020 Lys Thr Leu Ala Leu Asp Lys Thr Glu Gln Glu Ala Leu Glu Tyr 1025 1030 1035 Phe Met Lys Gln Met Asn Asp Ala His His Gly Gly Trp Thr Thr 1040 1045 1050 Lys Met Asp Trp Ile Phe His Thr Ile Lys Gln His Ala Leu Asn 1055 1060 1065 <210> 2 <211> 3724 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Human phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit alpha mRNA polynucleotide sequence ID: NCBI Accession Reference No: NM_006218; GI:54792081 (3724 nucleotides) <400> 2 tctccctcgg cgccgccgcc gccgcccgcg gggctgggac ccgatgcggt tagagccgcg 60 gagcctggaa gagccccgag cgtttctgct ttgggacaac catacatcta attccttaaa 120 gtagttttat atgtaaaact tgcaaagaat cagaacaatg cctccacgac catcatcagg 180 tgaactgtgg ggcatccact tgatgccccc aagaatccta gtagaatgtt tactaccaaa 240 tggaatgata gtgactttag aatgcctccg tgaggctaca ttaataacca taaagcatga 300 actatttaaa gaagcaagaa aataccccct ccatcaactt cttcaagatg aatcttctta 360 cattttcgta agtgttactc aagaagcaga aagggaagaa ttttttgatg aaacaagacg 420 actttgtgac cttcggcttt ttcaaccctt tttaaaagta attgaaccag taggcaaccg 480 tgaagaaaag atcctcaatc gagaaattgg ttttgctatc ggcatgccag tgtgtgaatt 540 tgatatggtt aaagatccag aagtacagga cttccgaaga aatattctga acgtttgtaa 600 agaagctgtg gatcttaggg acctcaattc acctcatagt agagcaatgt atgtctatcc 660 tccaaatgta gaatcttcac cagaattgcc aaagcacata tataataaat tagataaagg 720 gcaaataata gtggtgatct gggtaatagt ttctccaaat aatgacaagc agaagtatac 780 tctgaaaatc aaccatgact gtgtaccaga acaagtaatt gctgaagcaa tcaggaaaaa 840 aactcgaagt atgttgctat cctctgaaca actaaaactc tgtgttttag aatatcaggg 900 caagtatatt ttaaaagtgt gtggatgtga tgaatacttc ctagaaaaat atcctctgag 960 tcagtataag tatataagaa gctgtataat gcttgggagg atgcccaatt tgatgttgat 1020 ggctaaagaa agcctttatt ctcaactgcc aatggactgt tttacaatgc catcttattc 1080 cagacgcatt tccacagcta caccatatat gaatggagaa acatctacaa aatccctttg 1140 ggttataaat agtgcactca gaataaaaat tctttgtgca acctacgtga atgtaaatat 1200 tcgagacatt gataagatct atgttcgaac aggtatctac catggaggag aacccttatg 1260 tgacaatgtg aacactcaaa gagtaccttg ttccaatccc aggtggaatg aatggctgaa 1320 ttatgatata tacattcctg atcttcctcg tgctgctcga ctttgccttt ccatttgctc 1380 tgttaaaggc cgaaagggtg ctaaagagga acactgtcca ttggcatggg gaaatataaa 1440 cttgtttgat tacacagaca ctctagtatc tggaaaaatg gctttgaatc tttggccagt 1500 acctcatgga ttagaagatt tgctgaaccc tattggtgtt actggatcaa atccaaataa 1560 agaaactcca tgcttagagt tggagtttga ctggttcagc agtgtggtaa agttcccaga 1620 tatgtcagtg attgaagagc atgccaattg gtctgtatcc cgagaagcag gatttagcta 1680 ttcccacgca ggactgagta acagactagc tagagacaat gaattaaggg aaaatgacaa 1740 agaacagctc aaagcaattt ctacacgaga tcctctctct gaaatcactg agcaggagaa 1800 agattttcta tggagtcaca gacactattg tgtaactatc cccgaaattc tacccaaatt 1860 gcttctgtct gttaaatgga attctagaga tgaagtagcc cagatgtatt gcttggtaaa 1920 agattggcct ccaatcaaac ctgaacaggc tatggaactt ctggactgta attacccaga 1980 tcctatggtt cgaggttttg ctgttcggtg cttggaaaaa tatttaacag atgacaaact 2040 ttctcagtat ttaattcagc tagtacaggt cctaaaatat gaacaatatt tggataactt 2100 gcttgtgaga tttttactga agaaagcatt gactaatcaa aggattgggc actttttctt 2160 ttggcattta aaatctgaga tgcacaataa aacagttagc cagaggtttg gcctgctttt 2220 ggagtcctat tgtcgtgcat gtgggatgta tttgaagcac ctgaataggc aagtcgaggc 2280 aatggaaaag ctcattaact taactgacat tctcaaacag gagaagaagg atgaaacaca 2340 aaaggtacag atgaagtttt tagttgagca aatgaggcga ccagatttca tggatgctct 2400 acagggcttt ctgtctcctc taaaccctgc tcatcaacta ggaaacctca ggcttgaaga 2460 gtgtcgaatt atgtcctctg caaaaaggcc actgtggttg aattgggaga acccagacat 2520 catgtcagag ttactgtttc agaacaatga gatcatcttt aaaaatgggg atgatttacg 2580 gcaagatatg ctaacacttc aaattattcg tattatggaa aatatctggc aaaatcaagg 2640 tcttgatctt cgaatgttac cttatggttg tctgtcaatc ggtgactgtg tgggacttat 2700 tgaggtggtg cgaaattctc acactattat gcaaattcag tgcaaaggcg gcttgaaagg 2760 tgcactgcag ttcaacagcc acacactaca tcagtggctc aaagacaaga acaaaggaga 2820 aatatatgat gcagccattg acctgtttac acgttcatgt gctggatact gtgtagctac 2880 cttcattttg ggaattggag atcgtcacaa tagtaacatc atggtgaaag acgatggaca 2940 actgtttcat atagattttg gacacttttt ggatcacaag aagaaaaaat ttggttataa 3000 acgagaacgt gtgccatttg ttttgacaca ggatttctta atagtgatta gtaaaggagc 3060 ccaagaatgc acaaagacaa gagaatttga gaggtttcag gagatgtgtt acaaggctta 3120 tctagctatt cgacagcatg ccaatctctt cataaatctt ttctcaatga tgcttggctc 3180 tggaatgcca gaactacaat cttttgatga cattgcatac attcgaaaga ccctagcctt 3240 agataaaact gagcaagagg ctttggagta tttcatgaaa caaatgaatg atgcacatca 3300 tggtggctgg acaacaaaaa tggattggat cttccacaca attaaacagc atgcattgaa 3360 ctgaaaagat aactgagaaa atgaaagctc actctggatt ccacactgca ctgttaataa 3420 ctctcagcag gcaaagaccg attgcatagg aattgcacaa tccatgaaca gcattagaat 3480 ttacagcaag aacagaaata aaatactata taatttaaat aatgtaaacg caaacagggt 3540 ttgatagcac ttaaactagt tcatttcaaa attaagcttt agaataatgc gcaatttcat 3600 gttatgcctt aagtccaaaa aggtaaactt tgaagattgt ttgtatcttt ttttaaaaaa 3660 caaaacaaaa caaaaatccc caaaatatat agaaatgatg gagaaggaaa aaaaaaaaaa 3720 aaaa 3724 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human exon 9 forward primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> human exon 9 forward primer <400> 3 gggaaaaata tgacaaagaa agc 23 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human exon 9 reverse primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> human exon 9 reverse primer <400> 4 ctgagatcag ccaaattcag tt 22 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human exon 9 sequencing primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(27) <223> human exon 9 sequencing primer <400> 5 tagctagaga caatgaatta agggaaa 27 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human exon 20 forward primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> human exon 20 forward primer <400> 6 ctcaatgatg cttggctctg 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human exon 20 reverse primers <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> human exon 20 reverse primers <400> 7 tggaatccag agtgagcttt c 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human exon 20 sequencing primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> human exon 20 sequencing primer <400> 8 ttgatgacat tgcatacatt cg 22

Claims (17)

  1. 하기 화학식 I의 화합물, 또는 그의 단일의 이성질체 또는 이성질체들의 혼합물, 선택적으로 그의 약제학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 I]
    Figure pct00047

    식 중,
    R1은 H, 할로, -OH, (C1-C6)알콕시, NH2, NH(C1-C6)알킬 또는 N((C1-C6)알킬)2이고;
    R2는 -NR2aS(O)2-R2b, -S(O)2-NR2aR2c이되, R2a 및 R2c는 각각 독립적으로 H 또는 (C1-C6)알킬이고, R2b는 (C1-C6)알킬 또는 할로(C1-C6)알킬이며;
    R3은 H, 할로 또는 (C1-C6)알킬이고;
    R4는 H 또는 할로이며;
    Q는 N, C-H 또는 C-(C1-C6)알킬, C-CN 또는 C-CF3이고;
    R6은 H, (C1-C6)알킬, 할로(C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬렌-NH2, (C1-C6)알킬렌-NH(C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬렌-NH(C1-C6)할로알킬, (C1-C6)알킬렌-N(C1-C6)알킬)2, NH2, NH(C1-C6)알킬, 하이드록시알킬, (C1-C6)알킬렌-O(C1-C6)알킬, NH(C1-C6)알킬렌NH2, NH(C1-C6)알킬렌-사이클로알킬, -NH(C1-C6)알킬렌-헤테로사이클로알킬, N((C1-C6)알킬)2, (C1-C6)알킬렌-NHSO2-(C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬렌-NH(C=O)-(C1-C6)알킬, -(C=O)-NH2, -(C=O)-(C1-C6)알킬, -(C=O)-NH(C1-C6)알킬, -(C=O)-N(C1-C6)알킬))2, -NHSO2-(C1-C6)알킬, -S(O)-(C1-C6)알킬, -SO2-(C1-C6)알킬, -SO2NH2, -SO2NH(C1-C6)알킬, -SO2N((C1-C6)알킬)2, -CN, (C4-C7)헤테로사이클로알킬, (C1-C6)알킬렌-(C3-C7)헤테로사이클로알킬, 나이트로, (C1-C6)알킬렌-CN, NH(C1-C6)알킬렌-NH(C1-C6)알킬, NH(C1-C6)알킬렌-N((C1-C6)알킬)2 또는 (C1-C6)알킬렌-OC(O)-(C1-C6)알킬이되, R6 중의 임의의 알킬렌은 독립적으로 할로 또는 하이드록시인 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환되고, 또한 임의의 알킬렌이 -CH2-이면, -CH2-의 수소들 중 하나는 선택적으로 (C1-C3)할로알킬로 대체될 수 있으며;
    R7은 H, 할로, -NH2, 나이트로 (C1-C6)알킬, (C1-C6)알콕시이고, R7은 -CF3, 할로(C1-C6)알킬, (C1-C6)알케닐, NH(C1-C6)알킬 또는 N((C1-C6)알킬)2이고;
    Y는 N 또는 C-R8이되, R8은 H, 할로, (C1-C6)알킬, NH2, NH(C1-C6)알킬, N((C1-C6)알킬)2, (C2-C6)알케닐, (C1-C6)알킬렌-O(C1-C6)알킬, 하이드록시알킬, (C1-C6)알킬렌-CO2(C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬렌-CO2H, 페닐, 할로(C1-C6)알킬, (C3-C7)사이클로알킬, (C1-C6)알킬렌-(C3-C7)사이클로알킬, COH, CO2H, -CO2(C1-C6)알킬, CN, (C1-C6)알킬렌-CN, (C1-C6)알킬렌-C≡C-H, (C1-C6)알킬렌-C≡C-(C1-C6)알킬, -C≡C-H, -C≡C-(C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬렌-페닐이고; R8 중의 임의의 페닐은 독립적으로 할로 또는 알킬인 1, 2 또는 3개의 기로 선택적으로 치환되거나; 또는
    R7과 R8은, 이들이 부착되는 원자들과 함께, 서로 결합되어 N-H, N-(C1-C6)알킬, O, SO 및 SO2로부터 선택된 2개까지의 헤테로원자를 선택적으로 함유하는, 5, 6 또는 7원(membered)의 포화, 부분 불포화 혹은 불포화 고리를 형성할 수 있되, R7과 R8에 의해 형성된 고리는 독립적으로 알킬, 알콕시 또는 할로인 1 혹은 2개의 기로 선택적으로 치환되며;
    Z는 N 또는 C-R9이되, R9는 H, 할로 또는 (C1-C6)알킬이고;
    Q 및 Z 중 적어도 하나는 N이다.
  2. 제1항에 있어서, R3은 H 또는 할로인 것인 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R4는 H인 것인 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R6은 NH2, NH(C1-C6)알킬 또는 N((C1-C6)알킬)2인 것인 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R7은 H, 할로 또는 (C1-C6)알킬인 것인 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Y는 C-R8인 것인 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화학식 Ia의 화합물인 것인 화합물:
    [화학식 Ia]
    Figure pct00048
    .
  8. 제7항에 있어서,
    R1은 H, 할로, -OH, (C1-C6)알콕시, NH2, NH(C1-C6)알킬 또는 N((C1-C6)알킬)2이고;
    R2는 -NR2aS(O)2-R2b, - S(O)2-NR2aR2c이며;
    R3은 H이고;
    R6은 NH2이며;
    R7은 H, 할로 또는 (C1-C6)알킬인 것인 화합물.
  9. 제8항에 있어서,
    Figure pct00049
    는
    Figure pct00050
    인 것인 화합물.
  10. 제8항에 있어서,
    Figure pct00051
    는
    Figure pct00052

    Figure pct00053

    Figure pct00054

    Figure pct00055

    Figure pct00056

    로부터 선택된 것인 화합물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 H, 할로, (C1-C6)알콕시, NH2, NH(C1-C6)알킬 또는 N((C1-C6)알킬)2인 것인 화합물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 -NHS(O)2-(C1-C6)알킬 또는 -S(O)2-NH2인 것인 화합물.
  13. N-(5-{4-[2-아미노-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}-2-클로로피리딘-3-일)메탄설폰아마이드;
    N-(5-{4-[2-아미노-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}피리딘-3-일)메탄설폰아마이드;
    2-아미노-5-{4-[2-아미노-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}피리딘-3-설폰아마이드;
    N-[5-{4-[2-아미노-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}-2-(메틸옥시)피리딘-3-일]메탄설폰아마이드;
    N-{5-[4-(2-아미노-6,6-다이메틸-5,6,7,8-테트라하이드로퀴나졸린-4-일)-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일]-2-클로로피리딘-3-일}메탄설폰아마이드;
    N-[5-{4-[2-아미노-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}-2-(다이메틸아미노)피리딘-3-일]메탄설폰아마이드;
    N-{5-[4-(2-아미노-5-에틸-6-메틸피리미딘-4-일)-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일]-2-클로로피리딘-3-일}메탄설폰아마이드;
    N-{5-[4-(2-아미노-5-에테닐-6-메틸피리미딘-4-일)-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일]-2-클로로피리딘-3-일}메탄설폰아마이드;
    N-(5-{4-[2-아미노-6-클로로-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}-2-클로로피리딘-3-일)메탄설폰아마이드;
    N-(5-{4-[2-아미노-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}-2-클로로피리딘-3-일)메탄설폰아마이드;
    N-(5-{4-[2-아미노-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}-2-클로로피리딘-3-일)-1,1,1-트라이플루오로메탄설폰아마이드;
    N-{5-[4-(2-아미노-5,6-다이메틸피리미딘-4-일)-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일]-2-클로로피리딘-3-일}메탄설폰아마이드;
    N-(2-클로로-5-{4-[6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}피리딘-3-일)메탄설폰아마이드;
    N-(5-{4-[2-아미노-6-에틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}-2-클로로피리딘-3-일)메탄설폰아마이드;
    N-{5-[4-(2-아미노-5-에테닐피리미딘-4-일)-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일]-2-클로로피리딘-3-일}메탄설폰아마이드;
    N-{5-[4-(2-아미노-5-에틸피리미딘-4-일)-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일]-2-클로로피리딘-3-일}메탄설폰아마이드;
    N-[2-클로로-5-(4-{2-[(다이메틸아미노)메틸]-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일}-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일)피리딘-3-일]메탄설폰아마이드;
    N-(2-클로로-5-{4-[2-{[(2,2-다이플루오로에틸)아미노]메틸}-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일]-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일}피리딘-3-일)메탄설폰아마이드;
    N-[2-클로로-5-(4-{2-[(다이메틸아미노)메틸]-6-메틸-5-(1-메틸에틸)피리미딘-4-일}-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-7-일)피리딘-3-일]메탄설폰아마이드;
    선택적으로 그의 약제학적으로 허용가능한 염인 화합물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
  15. 질환, 장애 또는 증후군을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 치료적 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 화합물 혹은 선택적으로 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 환자에게 투여하는 단계, 또는 치료적 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 화합물 혹은 선택적으로 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을, 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 질환은 암인 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 암은 유방암, 외투세포 림프종, 신장 세포 암종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, NPM/ALK-변형 역형성 대세포 림프종, 미만성 큰 B세포 림프종, 횡문근육종, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 비소세포 폐 암종, 소세포 폐 암종, 샘암종, 결장암, 직장암, 위 암종, 간세포 암종, 흑색종, 췌장암, 전립선 암종, 갑상선 암종, 역형성 대세포 림프종, 혈관종, 교모세포종 또는 두경부암인 것인 방법.
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