JP2013544827A - ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲの阻害剤としてのベンゾオキサゼピン類ならびにそれらの使用法および製造法 - Google Patents

ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲの阻害剤としてのベンゾオキサゼピン類ならびにそれらの使用法および製造法 Download PDF

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Abstract

本発明は、構造式Ｉ（式中、変数は、本明細書で定義したとおりである）およびその薬学的に許容される塩である、ＰＩ３ＫおよびｍＴＯＲの阻害剤、その薬学的に許容される塩または溶媒和物、ならびにそれらの使用法を対象とする。
【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年１１月２４日に出願された米国仮出願第６１／４１７，１４２号への優先権の利益を主張するものであり、この仮出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願には、２０１１年１１月２３日に作成され、２０１１年１１月２３日に共に出願された「１０−０２２＿配列表（１０−０２２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ.ｔｘｔ）」（１６．２ＫＢ）と題する配列表のその全体が参照により組み込まれる。
本発明は、タンパク質キナーゼおよびその阻害剤の分野に関する。特に、本発明は、ＰＩ３Ｋおよび／または哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）シグナル伝達経路の阻害剤、ならびにそれらの使用法および調製法に関する。
ＰＩ３Ｋ経路は、細胞の成長、増殖および生存を調節するが、ヒト腫瘍においては高頻度に調節不全になる。腫瘍におけるＰＩ３Ｋ経路活性化は、（ＰＩ３Ｋａのｐ１１０サブユニットをコードする）ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の一般的な変異および増幅、または脂質ホスファターゼＰＴＥＮの下方制御を含む多重機構によって生じる。ＰＩ３Ｋの下流のｍＴＯＲは、その２つの別々のシグナル伝達複合体：ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２を介して細胞の成長および増殖を調節する。重要な意味を持つ細胞機能におけるＰＩ３Ｋシグナル伝達の役割を考慮すると、ＰＩ３ＫとｍＴＯＲの両方を標的にする阻害剤は、ＰＩＫ３ＣＡもしくはＲａｓに活性化変異またはＰＴＥＮ欠失を持つ腫瘍、あるいは、成長因子シグナル伝達において上方制御される腫瘍を患う患者集団に治療的有用性を提供することができる。
ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）シグナル伝達は、癌細胞の成長、生存、運動性、および代謝に著しく影響を与えることを最近の研究が示している。ＰＩ３Ｋ経路は、主要構成成分をコードする遺伝子の体細胞変異および増幅を含む、癌におけるいくつかの異なる機構によって活性化される。さらに、ＰＩ３Ｋシグナル伝達は、腫瘍の微小環境における非癌性細胞の複合的機能に役立ち得る。その結果として、癌の様々な形態を治療するための手段として、ＰＩ３Ｋアイソフォーム、特に、クラスＩＩアイソフォームのＰＩ３Ｋ−α、ＰＩ３Ｋ−β、およびＰＩ３Ｋ−γの阻害剤開発に絶え間ない関心がある。
例えば、二重特異性プロテインキナーゼであるホスファチジルイノシトール３−キナーゼ−α（ＰＩ３Ｋα）は、８５ｋＤａの調節サブユニットおよび１１０ｋＤａの触媒サブユニットで構成されている。この遺伝子がコードするタンパク質は、ＡＴＰを使用してＰｔｄＩｎｓ、ＰｔｄＩｎｓ４ＰおよびＰｔｄＩｎｓ（４、５）Ｐ２をリン酸化する触媒サブユニットを有する。多重機構を介して細胞成長を阻害する腫瘍抑制因子であるＰＴＥＮは、ＰＩＫ３ＣＡの主要産物であるＰＩＰ３を脱リン酸化することができる。順に、ＰＩＰ３は、プロテインキナーゼＢ（ＡＫＴ１、ＰＫＢ）の細胞膜への転位に必要であり、その際、ＰＩＰ３は、上流のキナーゼによってリン酸化および活性化される。ＰＴＥＮの細胞死に対する効果は、ＰＩＫ３ＣＡ／ＡＫＴ１経路を介して媒介される。
ＰＩ３Ｋαは、細胞骨格再構築、アポトーシス、小胞輸送、増殖および分化のプロセスの制御に関与している。ＰＩＫ３ＣＡのコピー数および発現の増加は、卵巣癌（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ.,Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４,６４,７６７８−７６８１；Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ.,Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５,１１,２８７５−２８７８；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ.,Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ ２００５,２５,３２２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ.,Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２００５,９７,２６−３４）、子宮頸癌、乳癌（Ｂａｃｈｍａｎ,ｅｔ ａｌ.Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ２００４,３,７７２−７７５；Ｌｅｖｉｎｅ,ｅｔ ａｌ.,上記参照；Ｌｉ ｅｔ ａｌ.,Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ ２００６,９６,９１−９５；Ｓａａｌ ｅｔ ａｌ.,Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５,６５,２５５４−２５５９；Ｓａｍｕｅｌｓ ａｎｄ Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ,Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ２００４,３,１２２１−１２２４）、結腸直腸癌（Ｓａｍｕｅｌｓ,ｅｔ ａｌ.Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４,３０４,５５４；Ｖｅｌｈｏ ｅｔ ａl.Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００５,４１,１６４９−１６５４）、子宮内膜癌（Ｏｄａ ｅｔ ａｌ.Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.２００５,６５,１０６６９−１０６７３）、胃癌（Ｂｙｕｎ ｅｔ ａｌ.,Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００３,１０４,３１８−３２７；Ｌｉ ｅｔ ａｌ.,上記参照；Ｖｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ.,上記参照；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ.,Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００５,２４,１４７７−１４８０）、肝細胞癌（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ.,上記参照）、小細胞肺癌および非小細胞肺癌（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ.,Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ２００６,５１,１８１−１９１；Ｍａｓｓｉｏｎ ｅｔ ａｌ.,Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ２００４,１７０,１０８８−１０９４）、甲状腺癌（Ｗｕ ｅｔ ａｌ.,Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２００５,９０,４６８８−４６９３）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（Ｓｕｊｏｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ.,Ｂｌｏｏｄ １９９７,１０６,１０６３−１０６６）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｈｉｃｋｅｙ ａｎｄ Ｃｏｔｔｅｒ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００６,２８１,２４４１−２４５０）、および神経膠芽腫（Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ.Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ（Ｂｅｒｌ）２００５,１０９,６３９−６４２；Ｓａｍｕｅｌｓ ｅｔ ａｌ.,上記）などの多くの悪性腫瘍に関連する。
哺乳類標的のｍＴＯＲは、細胞の成長、増殖、および生存の細胞外シグナルならびに細胞内シグナルの両方を統合するプロテインキナーゼである。低酸素ストレス、エネルギー状態および栄養状態を伝える細胞表面受容体からの細胞外分裂促進成長因子（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）シグナル伝達経路ならびに細胞内経路は全て、ｍＴＯＲに集中する。ｍＴＯＲは、２つの別々の複合体：ｍＴＯＲ複合体１（ｍＴＯＲＣ１）およびｍＴＯＲ複合体２（ｍＴＯＲＣ２)で存在する。ｍＴＯＲＣ１は、転写および細胞の成長の（その基質であるｐ７０Ｓ６キナーゼおよび４Ｅ−ＢＰ１を介した）主要メディエーターであり、血清およびグルココルチコイドによって活性化されるキナーゼＳＧＫによる細胞の生存を促進するが、ｍＴＯＲＣ２は、生存促進キナーゼＡＫＴの活性化を促進する。細胞の成長、増殖および生存におけるその中心的役割を考慮すると、ｍＴＯＲシグナル伝達が、癌および他の疾患において調節不全になる場合が多いことはおそらく驚くべきことではない（Ｂｊｏｒｎｓｔｉ ａｎｄ Ｈｏｕｇｈｔｏｎ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２００４，４（５），３３５−４８；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４，２７９，３３９−５９；Ｉｎｏｋｉ，Ｃｏｒｒａｄｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２００５，３７（１），１９−２４）。
ｍＴＯＲは、ＡＴＭ、ＡＴＲ、およびＤＮＡＰＫを含む異型キナーゼのＰＩＫＫ（ＰＩ３Ｋ関連キナーゼ）ファミリーのメンバーであり、その触媒ドメインは、ＰＩ３Ｋのドメインと相同である。ＰＩ３Ｋシグナル伝達の調節不全は、腫瘍細胞の共通機能である。一般に、ｍＴＯＲ阻害は、ＰＩ３Ｋシグナル伝達が以下で論じられるものなどに関係している多くの腫瘍型における戦略と見なされ得る。
ｍＴＯＲの阻害剤は、以下のものを含む多くの癌を治療するのに有用であり得る：乳癌（Ｎａｇａｔａ,Ｌａｎ ｅｔ ａｌ.,Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２００４,６（２）,１１７−２７；Ｐａｎｄｏｌｆｉ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４,３５１（２２）,２３３７−８；Ｎａｈｔａ,Ｙｕ ｅｔ ａｌ.Ｎａｔ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ Ｏｎｃｏｌ ２００６,３（５）,２６９−２８０）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）（Ｄａｌ Ｃｏｌ，Ｚａｎｃａｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２００８，１１１（１０），５１４２−５１）、腎細胞癌（Ｔｈｏｍａｓ，Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００６，１２（１），１２２−７；Ａｔｋｉｎｓ，Ｈｉｄａｌｇｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００４，２２（５），９０９−１８；Ｍｏｔｚｅｒ，Ｈｕｄｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００７，２５（２５），３９５８−６４）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（Ｓｕｊｏｂｅｒｔ，Ｂａｒｄｅｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２００５，１０６（３），１０６３−６；Ｂｉｌｌｏｔｔｅｔ，Ｇｒａｎｄａｇｅ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００６，２５（５０），６６４８−６６５９；Ｔａｍｂｕｒｉｎｉ，Ｅｌｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２００７，１１０（３），１０２５−８）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｓｋｏｒｓｋｉ，Ｂｅｌｌａｃｏｓａ ｅｔ ａｌ．Ｅｍｂｏ Ｊ １９９７，１６（２０），６１５１−６１；Ｂａｉ，Ｏｕｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０００，９６（１３），４３１９−２７；Ｈｉｃｋｅｙ ａｎｄ Ｃｏｔｔｅｒ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００６，２８１（５），２４４１−５０）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）（Ｕｄｄｉｎ，Ｈｕｓｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２００６，１０８（１３），４１７８−８６）、肉腫のいくつかのサブタイプ（Ｈｅｒｎａｎｄｏ，Ｃｈａｒｙｔｏｎｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００７，１３（６），７４８−５３；Ｗａｎ ａｎｄ Ｈｅｌｍａｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ ２００７，１２（８），１００７−１８）、横紋筋肉腫（Ｃａｏ，Ｙｕ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００８，６８（１９），８０３９−８０４８；Ｗａｎ，Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ２００６，８（５），３９４−４０１）、卵巣癌（Ｓｈａｙｅｓｔｅｈ，Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，１９９９，２１（１），９９−１０２；（Ｌｅｅ，Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２００５，９７（１）２６−３４）、子宮内膜腫瘍（Ｏｂａｔａ，Ｍｏｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９８，５８（１０），２０９５−７；Ｌｕ，Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００８，１４（９），２５４３−５０）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（Ｔａｎｇ，Ｈｅ ｅｔ ａｌ．Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ２００６，５１（２），１８１−９１；Ｍａｒｓｉｔ，Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ ２００５，３６（７），７６８−７６）、小細胞、扁平上皮、大細胞および腺癌（Ｍａｓｓｉｏｎ，Ｔａｆｌａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ２００４，１７０（１０），１０８８−９４）、一般的な肺腫瘍（Ｋｏｋｕｂｏ，Ｇｅｍｍａ ｅｔ ａｌ．Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００５，９２（９），１７１１−９；Ｐａｏ，Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｕｂ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｄ ２００５，２（１），ｅ１７）、大腸腫瘍（Ｖｅｌｈｏ，Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００５，４１（１１），１６４９−５４；Ｆｏｕｋａｓ，Ｃｌａｒｅｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２００６，４４１（７０９１），３６６−３７０）、特に、マイクロサテライト不安定性を示すもの（Ｇｏｅｌ，Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４，６４（９），３０１４−２１；Ｎａｓｓｉｆ，Ｌｏｂｏ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００４，２３（２），６１７−２８）、ＫＲＡＳ変異の大腸腫瘍（Ｂｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９８９．４９（１７），４６８２−９、Ｆｅａｒｏｎ Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９９５，７６８，１０１−１０）、胃癌（Ｂｙｕｎ，Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００３，１０４（３），３１８−２７）、肝細胞癌（Ｌｅｅ，Ｓｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００５，２４（８），１４７７−８０）、肝腫瘍（Ｈｕ，Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ２００３，９７（８），１９２９−４０；Ｗａｎ，Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００３，１２９（２），１００−６）、原発性黒色腫およびそれに関連した腫瘍の厚さの増加（Ｇｕｌｄｂｅｒｇ，ｔｈｏｒ Ｓｔｒａｔｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９７，５７（１７），３６６０−３；Ｔｓａｏ，Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０００，６０（７），１８００−４；Ｗｈｉｔｅｍａｎ，Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ２００２，９９（１），６３−７；Ｇｏｅｌ，Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １２６（１），２００６，１５４−６０）、膵臓腫瘍（Ａｓａｎｏ，Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００４，２３（５３），８５７１−８０）、前立腺癌（Ｃａｉｒｎｓ，Ｏｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９７，５７（２２），４９９７−５０００；Ｇｒａｙ，Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９８，７８（１０），１２９６−３００；Ｗａｎｇ，Ｐａｒｓｏｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９８，４（３），８１１−５；Ｗｈａｎｇ，Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９９８，９５（９），５２４６−５０；Ｍａｊｕｍｄｅｒ ａｎｄ Ｓｅｌｌｅｒｓ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００５，２４（５０）７４６５−７４；Ｗａｎｇ，Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２００６，１０３（５），１４８０−５；（Ｌｕ，Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ ２００６，２８（１），２４５−５１；Ｍｕｌｈｏｌｌａｎｄ，Ｄｅｄｈａｒ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２５（３），２００６，３２９−３７；Ｘｉｎ，Ｔｅｉｔｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １２００６，０３（２０），７７８９−９４；Ｍｉｋｈａｉｌｏｖａ，Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ ２００８，６１７，３９７−４０５；Ｗａｎｇ，Ｍｉｋｈａｉｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００８，２７（５６），７１０６−７１１７）、特に、未分化のサブタイプの甲状腺癌、（Ｇａｒｃｉａ−Ｒｏｓｔａｎ，Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５，６５（２２），１０１９９−２０７）、濾胞性甲状腺癌（Ｗｕ，Ｍａｍｂｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２００５，９０（８），４６８８−９３）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、過誤腫、血管骨髄脂肪腫、ＴＳＣ関連および散発性リンパ管平滑筋腫症：カウデン病（多発性過誤腫症候群）（Ｂｉｓｓｌｅｒ，ＭｃＣｏｒｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００８，３５８（２），１４０−１５１）、硬化性血管腫（Ｒａｎｄａ Ｍ．Ｓ．Ａｍｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２００８，５８（１），３８−４４）、ポイツ・ジェガース症候群（ＰＪＳ）、頭頸部癌（Ｇｕｐｔａ，ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００２，８（３），８８５−８９２）、神経線維腫症（Ｆｅｒｎｅｒ Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ２００６，１５（２），１３１−１３８；Ｓａｂａｔｉｎｉ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２００６，６（９），７２９−７３４；Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００８，１８（１），５６−６２）、黄斑変性症、黄斑浮腫、骨髄性白血病、全身性エリテマトーデス、および自己免疫リンパ球増殖性症候群（ＡＬＰＳ）。
以下は、本発明の特定の態様を単に要約するものであり、本質的に限定することを意図するものではない。これらの態様および他の態様ならびに実施形態を、以下でさらに十分に説明する。本明細書に引用される全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書の明確な開示と参照により組み込まれる参考文献との間に矛盾がある場合は、本明細書の明確な開示が優先するものとする。
２０１０年５月２５日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３６０３２（この全内容は参照により本明細書に組み込まれる）で証明されているように、出願者らは、生物学的プロセスおよび疾患状態におけるＰＩ３ＫおよびｍＴＯＲの重要な役割を認識し、そのために、これらのプロテインキナーゼの阻害剤が望ましいことに気付いた。したがって、本発明は、ＰＩ３Ｋおよび／またはｍＴＯＲを阻害し、制御し、かつ／または調節し、哺乳類における癌などの過剰増殖性疾患の治療に有用である化合物を提供する。本発明は、本化合物の作製法、哺乳類、特にヒトの過剰増殖性疾患の治療におけるかかる化合物の使用法、ならびにかかる化合物を含む医薬組成物に対する使用法も提供する。
本発明の第１の態様は、式Ｉ
の化合物、またはその単一異性体もしくは異性体の混合物、任意にその薬学的許容される塩を提供し、式中、
Ｒ１は、Ｈ、ハロ、−ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、またはＮ（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２であり、
Ｒ２は、−ＮＲ２ａＳ（Ｏ）２−Ｒ２ｂ、−Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ２ａＲ２ｃであり、Ｒ２ａおよびＲ２ｃは、それぞれ独立して、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、Ｒ２ｂは、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたはハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、
Ｒ３は、Ｈ、ハロ、または（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、
Ｒ４は、Ｈ、またはハロであり、
Ｑは、Ｎ、Ｃ−Ｈ、またはＣ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｃ−ＣＮ、またはＣ−ＣＦ３であり、
Ｒ６は、Ｈ、(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ハロ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ＮＨ２、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)ハロアルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−Ｎ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル)２、ＮＨ２、ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ヒドロキシアルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−Ｏ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキレンＮＨ２、ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−シクロアルキル、−ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ヘテロシクロアルキル、Ｎ((Ｃ１−Ｃ６)アルキル)２、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ＮＨＳＯ２−(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ＮＨ(Ｃ＝Ｏ)−(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ２、−(Ｃ＝Ｏ)−(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、−(Ｃ＝Ｏ)−Ｎ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル))２、−ＮＨＳＯ２−(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、−Ｓ(Ｏ)−(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、−ＳＯ２−(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、−ＳＯ２Ｎ((Ｃ１−Ｃ６)アルキル)２、−ＣＮ、(Ｃ４−Ｃ７)ヘテロシクロアルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−(Ｃ３−Ｃ７)ヘテロシクロアルキル、ニトロ、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ＣＮ、ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−Ｎ((Ｃ１−Ｃ６)アルキル)２、または(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ＯＣ(Ｏ)−(Ｃ１−Ｃ６)アルキルであり、Ｒ６の任意のアルキレンは、独立して、ハロもしくはヒロドキシである１個、２個または３個の基で任意に置換され、その際、任意のアルキレンが−ＣＨ２−である場合、−ＣＨ２−の水素のうちの１つは、任意に、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルで置き換えることができ、
Ｒ７は、Ｈ、ハロ、−ＮＨ２、ニトロ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルコキシであり、Ｒ７は、−ＣＦ３、ハロ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルケニル、ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、またはＮ((Ｃ１−Ｃ６)アルキル)２であり、
Ｙは、ＮまたはＣ−Ｒ８であり、式中、Ｒ８は、Ｈ、ハロ、(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ＮＨ２、ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、Ｎ((Ｃ１−Ｃ６)アルキル)２、(Ｃ２−Ｃ６)アルケニル、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−Ｏ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ヒドロキシアルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ＣＯ２(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ＣＯ２Ｈ、フェニル、ハロ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキル、ＣＯＨ、ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ＣＮ、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ＣＮ、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−Ｃ≡Ｃ−Ｈ、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−Ｃ≡Ｃ−(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、−Ｃ≡Ｃ−Ｈ、−Ｃ≡Ｃ−(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−フェニルであり、Ｒ８の任意のフェニルは、独立して、ハロもしくはアルキルである１個、２個、または３個の基で任意に置換されるか、または、
Ｒ７およびＲ８は、それらが結合している原子と共に互いに結合して、任意に、Ｎ−Ｈ、Ｎ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｏ、ＳＯ、およびＳＯ２から選択される最高で２個のヘテロ原子を含む５員、６員、もしくは７員の飽和環、５員、６員、もしくは７員の部分的に不飽和環、または５員、６員、もしくは７員の不飽和環を形成することができ、Ｒ７およびＲ８によって形成された環は、独立して、アルキル、アルコキシ、またはハロである１個もしくは２個の基で任意に置換され、
Ｚは、ＮまたはＣ−Ｒ９であり、式中、Ｒ９は、Ｈ、ハロ、または(Ｃ１−Ｃ６)アルキルであり、
ＱおよびＺの少なくとも１つは、Ｎである。
第２の態様において、本発明は、式Ｉおよび表１の化合物、またはその単一立体異性体もしくは異性体の混合物、任意に、その薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、ならびに２）薬学的に許容される担体、賦形剤、もしくは希釈剤を提供する。
第３の態様において、本発明は、式Ｉおよび表１の化合物、またはその単一立体異性体もしくは異性体の混合物、任意に、その薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、ならびに２）薬学的に許容される担体、賦形剤、もしくは希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
第４の態様において、本発明は、ｍＴＯＲのインビボ活性を阻害する方法であって、有効なＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害量の式Ｉもしくは表１の化合物、またはその単一立体異性体もしくは異性体の混合物、任意にその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、またはその医薬組成物を患者に投与することを含む方法である。
第５の態様において、本発明は、疾患、障害、または症候群を治療する方法であって、治療有効量の式Ｉの化合物またはその単一立体異性体もしくは異性体の混合物、任意に、その薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、または治療有効量の式Ｉもしくは表１の化合物、その単一立体異性体もしくは異性体の混合物、任意に、その薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、および薬学的に許容される担体、賦形剤、もしくは希釈剤を含む医薬組成物を患者に投与することを含む方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、腫瘍を患う対象を治療する方法であって、（ａ）前記腫瘍が、ＰＩ３Ｋ−αキナーゼドメインに変異を含む場合、ＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤、デュアルＰＩ３Ｋ−α／ｍＴＯＲ選択的阻害剤、もしくはＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤とｍＴＯＲ選択的阻害剤の組み合わせを前記対象に投与することを含むか、または（ｂ）前記腫瘍が、ＰＩ３Ｋ−αヘリックスドメインに変異を含む場合、ＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤とＰＩ３Ｋ−β選択的阻害剤の組み合わせ、デュアルＰＩ３Ｋ−α／ｍＴＯＲ選択的阻害剤、もしくはＰＩ３Ｋ−β選択的阻害剤を前記対象に投与することを含み、その際、ＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤、デュアルＰＩ３Ｋ−α／ｍＴＯＲ選択的阻害剤、もしくはＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤とｍＴＯＲ選択的阻害剤の組み合わせが、式Ｉもしくは表１の化合物である方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、ＰＩ３Ｋアイソザイムの選択的阻害剤を同定する方法であって、（ａ）ＰＩ３Ｋ−α中に第１の変異を有する第１の細胞を候補阻害剤と接触させること、（ｂ）野生型ＰＩ３Ｋ−α、ＰＴＥＮヌル変異、または前記ＰＩ３Ｋ−α中に第２の変異を有する第２の細胞を候補阻害剤と接触させること、（ｃ）前記第１の細胞および前記第２の細胞内のＡＫＴリン酸化を測定することを含み、その際、前記第２の細胞と比較した時に、前記第１の細胞内のＡＫＴリン酸化が減少すると、前記候補阻害剤は選択的ＰＩ３Ｋ−α阻害剤として同定され、その際、ＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤、デュアルＰＩ３Ｋ−α／ｍＴＯＲ選択的阻害剤、もしくはＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤とｍＴＯＲ選択的阻害剤の組み合わせが、式Ｉまたは表１の化合物である方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、ＰＩ３Ｋ−αを含む腫瘍を患う癌患者のための治療計画を決定する方法であって、前記ＰＩ３Ｋ−αのアミノ酸１０４７および／またはアミノ酸５４５における変異の有無を判定することを含む方法を提供し、その際、前記ＰＩ３Ｋ−αが１０４７位に変異を有する場合、前記方法は、治療有効量のＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤化合物、デュアルＰＩ３Ｋ−α／ｍＴＯＲ選択的阻害剤、もしくはＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤とｍＴＯＲ選択的阻害剤の組み合わせを前記癌患者に投与することを含むか、または前記ＰＩ３Ｋ−αが５４５位に変異を有する場合、前記方法は、治療有効量のＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤とＰＩ３Ｋ−β選択的阻害剤の組み合わせ、デュアルＰＩ３Ｋ−α／ｍＴＯＲ選択的阻害剤、もしくはＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤とｍＴＯＲ選択的阻害剤の組み合わせを前記癌患者に投与することを含み、その際、ＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤、デュアルＰＩ３Ｋ−α／ｍＴＯＲ選択的阻害剤、もしくはＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤とｍＴＯＲ選択的阻害剤の組み合わせは、式Ｉまたは表１の化合物である。
さらなる態様において、診断、治療またはスクリーニングに用いられる細胞には、乳癌、マントル細胞リンパ腫、腎細胞癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ＮＰＭ／ＡＬＫ形質転換未分化大細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、横紋筋肉腫、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腺癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、肝細胞癌、黒色腫、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、未分化大細胞リンパ腫、血管腫、グリア芽腫、または頭頸部癌に由来する腫瘍もしくは癌から得られる癌細胞または腫瘍細胞が含まれ、その際、ＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤、デュアルＰＩ３Ｋ−α／ｍＴＯＲ選択的阻害剤、もしくはＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤とｍＴＯＲ選択的阻害剤の組み合わせは、式Ｉまたは表１の化合物である。
略語および定義
以下の略語および用語は、全体を通して示される意味を有する。
記号「−」は単結合を意味し、「＝」は二重結合を意味し、「≡」は三重結合を意味し、
は単結合または二重結合を意味する。記号
は、この記号が結合している二重結合の末端のどちらの位置も占める二重結合上の基を表し、すなわち、二重結合の幾何異性体のＥまたはＺは不明瞭である。基がその親式から離れていることが示される場合、記号
は、その基をその親構造式から分離するために理論的に切断される結合の末端において使用される。
化学構造が図示または記載される場合、特に明記されない限り、全ての炭素は、４の原子価に従うために水素置換を有すると想定される。例えば、以下の図式の左側の構造には、９個の水素が含まれる。これらの９個の水素を、右側の構造に図示する。構造中の特定の原子は、置換として１つまたは複数の水素（明確に定義された水素）、例えば、−ＣＨ２ＣＨ２−を有するように文字式で記載されることもある。前述の説明的手法は、そうでなければ複雑な構造の説明に対して簡潔さおよび単純さを提供するために、化学技術分野において一般的であることは当業者なら理解する。
基「Ｒ」が、例えば、式：
にあるように、環系において「浮いている」ように図示される場合、特に定義しない限り、安定した構造が形成される限り、環原子のうちの１個からの図示された、暗示された、または明確に定義された水素の置換を仮定すると、置換基「Ｒ」は、この環系のいずれの原子上にも存在し得る。
基「Ｒ」が、例えば、式：
にあるように、飽和炭素を含む環系に存在するように図示される場合、この例において、それぞれが、環上の現在図示されているか、暗示されているか、または明確に定義されている水素を置換すると仮定すると、「ｙ」は２個以上であり得、特に定義されない限り、得られた構造が安定している場合、２個の「Ｒ」は、同一の炭素上に存在し得る。別の例において、同じ炭素上の２個のＲは、その炭素を含み、環を形成するので、例えば、式：
にあるように、図示された環でスピロ環構造を作ることができる。
本発明の化合物に関連した「投与」およびその変形（例えば、化合物を「投与する」）は、治療を必要としている動物のシステムに本化合物または本化合物のプロドラッグを導入することを意味する。本発明の化合物またはそのプロドラッグが、１つまたは複数の他の活性剤（例えば、外科手術、放射線療法、および化学療法など）と組み合わせて提供される場合、「投与」およびその変形は、それぞれ、本化合物と他の薬剤または本化合物のプロドラッグと他の薬剤の同時導入ならびに逐次導入を含むと理解される。
「アルケニル」は、ラジカルが少なくとも１つの二重結合を含む２〜６個の炭素原子の直鎖一価炭化水素ラジカルまたは３〜６個の炭素原子の分枝鎖一価炭化水素ラジカルを意味し、例えば、エテニル、プロペニル、１−ブタ−３−エニル、および１−ペンタ−３−エニルなどである。
「アルコキシ」は、Ｒが本明細書で定義されるアルキル基である−ＯＲ基を意味する。例として、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、およびイソプロポキシなどが挙げられる。
「アルキル」は、１〜６個の炭素原子の直鎖飽和一価炭化水素ラジカルまたは３〜６個の炭素原子の分枝鎖飽和一価炭化水素ラジカルを意味し、例えば、メチル、エチル、プロピル、２−プロピル、ブチル（全ての異性体を含む）、またはペンチル（全ての異性体を含む）などである。
「アルキレン」は、１〜６個の炭素原子の直鎖飽和一価炭化水素ジラジカルまたは３〜６個の炭素原子の分枝鎖飽和一価炭化水素ラジカルを意味し、例えば、メチレン、エチレン、およびプロピレンなどである。
「アルキニル」は、ラジカルが少なくとも１つの三重結合を含む２〜６個の炭素原子の直鎖一価炭化水素ラジカルまたは３〜６個の炭素原子の分枝鎖一価炭化水素ラジカルを意味し、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、およびペンチン−２−イルなどである。
「アミノ」は、−ＮＨ２を意味する。
「アリール」は、一価の６員〜１４員の単環式炭素環または二環式炭素環を意味し、単環式環は芳香族であり、二環式環の中の環の少なくとも１つは芳香族である。特に記載しない限り、この基の原子価は、原子価則が許す、ラジカル内の全ての環の全ての原子上に位置し得る。代表的な例として、フェニル、ナフチル、およびインダニルなどが挙げられる。
「アリールアルキル」は、本明細書で定義される１個または２個のアリール基で置換されている、本明細書で定義されるアルキルラジカルを意味し、例えば、ベンジルおよびフェネチルなどである。
「シクロアルキル」は、３〜１０個の炭素環原子の単環式飽和もしくは単環式部分的不飽和（しかし芳香族ではない）の一価炭化水素ラジカル、または縮合二環式飽和もしくは縮合二環式部分的不飽和（しかし芳香族ではない）の一価炭化水素ラジカルを意味する。縮合二環式炭化水素ラジカルには、スピロ環系および架橋環系が含まれる。特に記載しない限り、この基の原子価は、原子価則が許す、ラジカル内の全ての環の全ての原子上に位置し得る。１個または２個の環炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基、−Ｃ（Ｓ）−基、または−Ｃ（＝ＮＨ）−基で置換してもよい。より具体的には、シクロアルキルという用語には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキシル、またはシクロヘキサ−３−エニルなどが含まれるが、これらに限定されない。
「ジアルキルアミノ」は、ＲおよびＲ’が本明細書で定義されるアルキル、またはそのＮ−オキシド誘導体もしくはその保護された誘導体である−ＮＲＲ’ラジカルを意味し、例えば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、Ｎ，Ｎ−メチルプロピルアミノ、またはＮ，Ｎ−メチルエチルアミノなどである。
「縮合環系」は、架橋環または縮合環を含む多環式環系を意味し、すなわち、２個の環が、それらの環構造中に２個以上の共有原子を有する。本出願において、縮合環系は、必ずしも全てが芳香族環系とは限らない。一般的に、必ずしもそうである必要はないが、縮合環系は隣接した一組の原子を共有し、例えば、ナフタレンまたは１，２，３，４−テトラヒドロ−ナフタレンである。本発明の縮合環系は、それ自体、縮合環系の単一環原子を介してそれに結合しているスピロ環を有してもよい。いくつかの例において、当業者が理解するとおり、芳香族系の２個の隣接基は、共に縮合して、環構造を形成することができる。この縮合環構造は、ヘテロ原子を含んでもよく、１個または複数の基で任意に置換されてもよい。
「ハロゲン」または「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を表す。
「ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル」および「（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキル」は、１個または複数のハロゲン、具体的には、１個、２個、３個、４個、５個または６個のハロ原子で置換されているアルキル基を意味し、例えば、トリフルオロメチル、２−クロロエチル、および２，２−ジフルオロエチルなどである。
「ヘテロアリール」は、それぞれのヘテロ原子が、独立して、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｎ−（ｎは、０、１、または２である）、−Ｎ＝、−ＮＨ−、またはＮ−オキシドである１個または複数の、具体的には、１個、２個、３個、または４個の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子が炭素である５〜１４個の環原子の単環式一価ラジカル、縮合二環式一価ラジカル、または三環式一価ラジカルを意味し、単環式ラジカルを含む環は芳香族であり、二環式ラジカルを含む縮合環の少なくとも１つは芳香族である。二環式ラジカルを含む全ての非芳香族環の１個または２個の環炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基、−Ｃ（Ｓ）−基、または−Ｃ（＝ＮＨ）−基によって置換されてもよい。縮合二環式ラジカルには、架橋環系が含まれる。特に記載しない限り、原子価は、原子価則が許す、ヘテロアリール基の全ての環の全ての原子上に位置し得る。原子価点が窒素に位置する場合、ＲＸは存在しない。より具体的には、ヘテロアリールという用語には、１，２，４−トリアゾリル、１，３，５−トリアゾリル、フタルイミジル、ピリジニル、ピロリル、イミダゾリル、チエニル、フラニル、インドリル、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドリル（例えば、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−２−イルまたは２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−イルなどを含む）、イソインドリル、インドリニル、イソインドリニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾジオキソール−４−イル、ベンゾフラニル、シンノリニル、インドリジニル、ナフチリジン−３−イル、フタラジン−３−イル、フタラジン−４−イル、プテリジニル、プリニル、キナゾリニル、５，６，７，８−テトラヒドロキナゾリニル、キノキサリニル、テトラゾイル、ピラゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、ベンゾオキサゾリル、キノリニル、５，６，７，８−テトラヒドロキノリニル、イソキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル（例えば、テトラヒドロイソキノリン−４−イルまたはテトラヒドロイソキノリン−６−イルなどを含む）、ピロロ［３，２−ｃ］ピリジニル（例えば、ピロロ［３，２−ｃ］ピリジン−２−イルまたはピロロ［３，２−ｃ］ピリジン−７−イルなどを含む）、ベンゾピラニル、２，３−ジヒドロベンゾフラニル、ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソリル、２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシニル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチエニル、６，７−ジヒドロ−５Ｈ−シクロペンタ［ｂ］ピリジニル、６，７−ジヒドロ−５Ｈ−シクロペンタ［ｃ］ピリジニル、６，７−ジヒドロ−５Ｈ−シクロペンタ［ｄ］ピリミジニル、５，６，７，８−テトラヒドロ−５，８−エタノキナゾリン（ｅｔｈａｎｏｑｕｉｎａｚｏｌｉｎ）−４−イル、および６，７，８，９−テトラヒドロピリミド［４，５−ｂ］インドリジン−４−イル、ならびにそのＮ−オキシドおよびその保護された誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
「ヘテロシクロアルキル」は、３〜８個の環原子の飽和一価単環式基もしくは部分的不飽和（しかし芳香族ではない）一価単環式基、または５〜１２個の環原子の飽和一価縮合二環式基もしくは飽和スピロ環二環式基（ｓｐｉｒｏｃｙｃｌｉｃ ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｇｒｏｕｐ）または部分的不飽和の（しかし芳香族ではない）一価縮合二環式基もしくはスピロ環二環式基を意味し、１個または複数、具体的には、１個、２個、３個、または４個の環ヘテロ原子において、それぞれのヘテロ原子は、独立して、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｎ（ｎは０、１、または２である）、−ＮＨ−、または−Ｎ＝であり、残りの環原子が炭素である。１個または２個の環炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基、−Ｃ（Ｓ）−基、または−Ｃ（＝ＮＨ）−基によって置換されてもよい。縮合二環式ラジカルには、架橋環系が含まれる。特に記載しない限り、この基の原子価は、原子価則が許す、ラジカル内の全ての環の全ての原子上に位置し得る。原子価点が窒素原子に位置する場合、Ｒｙは存在しない。より具体的には、ヘテロシクロアルキルという用語には、アゼチジニル、ピロリジニル、２−オキソピロリジニル、２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロリル、ピペリジニル、４−ピペリドニル、モルホリニル、ピペラジニル、２−オキソピペラジニル、テトラヒドロピラニル、２−オキソピペリジニル、チオモルホリニル、チアモルホリニル、ペルヒドロアゼピニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ジヒドロピリジニル、テトラヒドロピリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、キヌクリジニル、イソチアゾリジニル、オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロリル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、デカヒドロイソキノリル、２，６−ジアザスピロ［３，３］ヘプタン−２−イル、テトラヒドロフリル、およびテトラヒドロピラニル、ならびにそれらの誘導体およびそのＮ−オキシドまたはその保護された誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
「フェニルアルキル」は、本明細書で定義され、１個または２個のフェニル基で置換されているアルキル基を意味する。
「任意の」または「任意に」は、その後に記載される事象または状況が生じてもまたは生じなくてもよく、この記載には、前記事象または状況が生じる場合およびそれが生じない場合が含まれることを意味する。当業者なら、１個または複数の任意の置換基を含むと記載される全ての分子に関して、立体的に実用的であり、かつ／または合成的に実現可能な化合物のみが含まれることを意味すると理解するであろう。「任意に置換される」とは、特に記載されない限り、用語内の全てのそれに続く修飾語句を表す。例示的な任意の置換の一覧を、以下の「置換」の定義の中で示す。
「オキソ」は、二重結合を介して結合している酸素を意味する。
本明細書に記載の反応のそれぞれの「収率」は、理論的収量の百分率として表す。
「代謝」は、動物またはヒトの体内の代謝もしくは生体内変換、例えば、酸化、還元、もしくは加水分解などによるより極性の分子への生体内変換、または共役分子への生体内変換によって産生される化合物またはその塩の分解産物もしくは最終産物を表す（生体内変換の議論については、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ,“Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”８.ｓｕｐ.ｔｈ Ｅｄ.,Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ,Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ.（ｅｄｓ）,１９９０を参照されたい）。本明細書で使用するように、本発明の化合物またはその塩の代謝産物は、体内において生物活性のある化合物の形態であり得る。一例において、プロドラッグは、生物活性形態の代謝産物がインビボで放出されるように使用されてもよい。別の例において、生物活性代謝産物は思いがけなく発見され、すなわち、プロドラッグの設計自体が行われなかった。本開示を考慮すると、本発明の化合物の代謝産物活性についてのアッセイは、当業者に周知である。
本発明の目的のための「患者」には、ヒトおよび他の動物、特に、哺乳類、ならびに他の生物が含まれる。したがって、本方法は、ヒトの治療および獣医学的用途の両方に適用できる。具体的な実施形態において、患者は哺乳類であり、より具体的な実施形態においては、患者はヒトである。
化合物の「薬学的に許容される塩」は、薬学的に許容され、かつ親化合物の所望の薬理学的活性を保有する塩を意味する。薬学的に許容される塩は、非毒性であると理解される。適切な薬学的に許容される塩のさらなる情報は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ,第１７版.,Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ,イーストン,ペンシルベニア州,１９８５、またはＳ.Ｍ.Ｂｅｒｇｅ,ｅｔ ａｌ.,“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ,”Ｊ.Ｐｈａｒｍ.Ｓｃｉ.,１９７７；６６：１−１９（共に、参照により本明細書に組み込まれる）で見つけることができる。
薬学的に許容される酸付加塩の例として、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、およびリン酸などの無機酸、ならびに酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１、２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、グルコヘプトン酸、４，４’−メチレンビス（３−ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、第３級ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、およびサリチル酸などの有機酸で形成された塩が挙げられる。
薬学的に許容される塩基付加塩の例として、親化合物中に存在する酸性プロトンがナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩、およびアルミニウム塩などの金属イオンによって置き換えられた時に形成される塩が挙げられる。具体的な塩は、アンモニウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩である。薬学的に許容される有機非毒性塩基から誘導される塩には、第１級アミン、第２級アミンおよび第３級アミンの塩、天然に生じる置換アミンを含む置換アミン、環式アミンおよび塩基性イオン交換樹脂が含まれるが、これらに限定されない。有機塩基の例として、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミン、およびポリアミン樹脂などが挙げられる。例示的な有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン、およびカフェインである。「白金（複数可）」および「白金含有剤（複数可）」には、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチンが含まれる。
「プロドラッグ」は、例えば、血液中の加水分解によりインビボで（一般的に迅速に）変換され、上記の式ｅの親化合物を産生する化合物を表す。一般的な例として、カルボン酸部分を有している活性型を有する化合物のエステル形態およびアミド形態が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の化合物の薬学的に許容されるエステルの例として、アルキル基が直鎖または分枝鎖である（例えば、約１〜約６個の間の炭素を有する）アルキルエステルが挙げられるが、これらに限定されない。許容されるエステルには、ベンジルなどのシクロアルキルエステルおよびアリールアルキルエステルも含まれるが、これらに限定されない。本発明の化合物の薬学的に許容されるアミドの例として、第１級アミド、ならびに（例えば、約１〜約６個の間の炭素を有する）第２級アルキルアミドおよび第３級アルキルアミドが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の化合物のアミドおよびエステルは、従来の方法に従って調製することができる。プロドラッグの徹底的な議論は、Ｔ.Ｈｉｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｖ.Ｓｔｅｌｌａ,“Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ,”Ｖｏｌ １４ ｏｆ ｔｈｅ Ａ.Ｃ.Ｓ.Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ、およびＢｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ,Ｅｄｗａｒｄ Ｂ.Ｒｏｃｈｅ編,Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ,１９８７においてなされており、これらの両方は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
「治療有効量」は、患者に投与した時に、疾患の症状を寛解させる本発明の化合物の量である。「治療有効量」を構成する本発明の化合物の量は、化合物、疾患状態およびその重症度、ならびに治療される患者の年齢などに依存して変化する。治療有効量は、当業者が、かれらの知識および本開示を考慮して日常的に決定することができる。
疾患、障害、もしくは症候群の「防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」または「防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」には、疾患がヒトに生じるのを阻止すること、すなわち、疾患、障害、もしくは症候群にさらされるかまたは罹りやすいが、疾患、障害、もしくは症候群の症状をまだ経験していないかまたはその症状を呈していない動物において、疾患、障害、もしくは症候群の臨床症状を発症させないことが含まれる。
本明細書で使用する疾患、障害、もしくは症候群の「治療（Ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」には、（ｉ）疾患、障害、もしくは症候群を抑制すること、すなわち、その発症を阻むこと、（ｉｉ）疾患、障害、もしくは症候群を和らげること、すなわち、疾患、障害、もしくは症候群の軽減をもたらすことが含まれる。当技術分野で知られているとおり、全身輸送対局所輸送、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食生活、投与時間、薬物間相互作用、および病状の重症度についての調整が必要であり得、当業者による日常的な実験で確かめることができる。
本明細書に開示される化合物には、同じ原子番号を有するが、通常、自然界に見られる原子質量とは異なる原子質量を有する原子によって、少なくとも１個の原子が置き換えられている全ての薬学的に許容される同位体バリエーションも含まれる。開示される化合物に含めるのに適する同位体の例として、２Ｈおよび３Ｈなどの水素の同位体、１３Ｃおよび１４Ｃなどの炭素の同位体、１５Ｎなどの窒素の同位体、１７Ｏおよび１８Ｏなどの酸素の同位体、３１Ｐおよび３２Ｐなどのリンの同位体、ｓｕｐ.３５Ｓなどの硫黄の同位体、１８Ｆなどのフッ素の同位体、３６Ｃｌなどの塩素の同位体が挙げられるが、これらに限定されない。同位体バリエーション（例えば、重水素、２Ｈ）の使用は、より大きな代謝安定性から生じるある種の治療的利点、例えば、インビボ半減期の増加または必要投与量の減少をもたらし得る。さらに、開示される化合物のある種の同位体バリエーションは、放射性同位体（例えば、トリチウム、３Ｈ、または１４Ｃ）を取り込むことができ、これは、薬物および／または基質の組織分布研究に有用であり得る。
発明の実施形態
以下の段落は、本発明の化合物の多くの実施形態を示す。それぞれの場合において、実施形態には、引用される化合物、およびその単一立体異性体またはその立体異性体の混合物の両方、ならびにその薬学的に許容される塩が含まれる。
式Ｉの化合物の一実施形態において、Ｒ３は、Ｈまたはハロである。
別の実施形態において、Ｒ４はＨである。
別の実施形態において、Ｒ６は、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、またはＮ（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２である。
別の実施形態において、Ｒ７は、Ｈ、ハロ、または（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである。
別の実施形態において、ＹはＣ−Ｒ８である。
式Ｉの化合物の別の実施形態において、
Ｒ１は、Ｈ、ハロ、−ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、またはＮ（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２であり、
Ｒ２は、−ＮＲ２ａＳ（Ｏ）２−Ｒ２ｂまたは−Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ２ａＲ２ｃであり、
Ｒ３は、Ｈであり、
Ｒ４は、Ｈであり、
Ｒ６は、ＮＨ２であり、
Ｒ７は、Ｈ、ハロ、または（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである。
別の実施形態において、式Ｉの化合物は、式Ｉａ
の化合物である。
式Ｉａの化合物の一実施形態において、
Ｒ１は、Ｈ、ハロ、−ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、またはＮ（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２であり、
Ｒ２は、−ＮＲ２ａＳ（Ｏ）２−Ｒ２ｂ、−Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ２ａＲ２ｃであり、
Ｒ３は、Ｈであり、
Ｒ６は、ＮＨ２であり、
Ｒ７は、Ｈ、ハロ、または（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである。
別の実施形態において、式Ｉまたは式Ｉａの化合物中の
は、
である。
別の実施形態において、式Ｉまたは式Ｉａの化合物中の
は、
である。
別の実施形態において、式Ｉの化合物は、ＺおよびＱがＮであり、ＹがＣ−Ｒ８である式Ｉａの化合物である。
別の実施形態において、式Ｉａの化合物は、式Ｉｂ
の化合物である。
別の実施形態において、式Ｉｂの化合物は、式Ｉｃ
の化合物である。
別の実施形態において、式Ｉｃの化合物は、式Ｉｄ
の化合物である。
別の実施形態において、式Ｉｄの化合物は、式Ｉｅ
の化合物である。
別の実施形態において、式Ｉの化合物中の
は、
であり、
から選択される。
別の実施形態において、
は、
から選択される。
別の実施形態において、
は、
であり、式中、Ｒ６ａおよびＲ６ｂは、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、またはハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである。
別の実施形態において、式Ｉ、式Ｉａ、式Ｉｂ、式Ｉｃ、式Ｉｄ、および式Ｉｅの化合物中のＲ１は、Ｈ、ハロ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、またはＮ（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２である。
別の実施形態において、式Ｉ、式Ｉａ、式Ｉｂ、式Ｉｃ、式Ｉｄ、および式Ｉｅの化合物中のＲ１は、Ｈ、クロロ、フルオロ、メトキシ、トリフルオロメトキシ、エトキシ、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＮＨ（ＣＨ３）、またはＮ（ＣＨ３）２である。
別の実施形態において、式Ｉ、式Ｉａ、式Ｉｂ、式Ｉｃ、式Ｉｄ、および式Ｉｅの化合物中のＲ１は、Ｈまたはクロロである。
別の実施形態において、式Ｉ、式Ｉａ、式Ｉｂ、式Ｉｃ、式Ｉｄ、および式Ｉｅの化合物中のＲ２は、−ＮＲ２ａＳ（Ｏ）２−Ｒ２ｂであり、式中、Ｒ２ａはＨであり、Ｒ２ｂは、メチル、トリフルオロメチル、エチル、プロピル、またはブチルである。
別の実施形態において、式Ｉ、式Ｉａ、式Ｉｂ、式Ｉｃ、式Ｉｄ、または式Ｉｅの化合物は、
Ｎ−（５−｛４−［２−アミノ−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝−２−クロロピリジン−３−イル）メタンスルホンアミド；
Ｎ−（５−｛４−［２−アミノ−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝ピリジン−３−イル）メタンスルホンアミド；
２−アミノ−５−｛４−［２−アミノ−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝ピリジン−３−スルホンアミド；
Ｎ−［５−｛４−［２−アミノ−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝−２−（メチルオキシ）ピリジン−３−イル］メタンスルホンアミド；
Ｎ−｛５−［４−（２−アミノ−６,６−ジメチル−５,６,７,８−テトラヒドロキナゾリン−４−イル）−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル］−２−クロロピリジン−３−イル｝メタンスルホンアミド；
Ｎ−［５−｛４−［２−アミノ−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝−２−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル］メタンスルホンアミド；
Ｎ−｛５−［４−（２−アミノ−５−エチル−６−メチルピリミジン−４−イル）−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル］−２−クロロピリジン−３−イル｝メタンスルホンアミド；
Ｎ−｛５−［４−（２−アミノ−５−エテニル−６−メチルピリミジン−４−イル）−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル］−２−クロロピリジン−３−イル｝メタンスルホンアミド；
Ｎ−（５−｛４−［２−アミノ−６−クロロ−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝−２−クロロピリジン−３−イル）メタンスルホンアミド；
Ｎ−（５−｛４−［２−アミノ−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２，３，４，５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝−２−クロロピリジン−３−イル）メタンスルホンアミド；
Ｎ−（５−｛４−［２−アミノ−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝−２−クロロピリジン−３−イル）−１,１,１−トリフルオロメタンスルホンアミド；
Ｎ−｛５−［４−（２−アミノ−５,６−ジメチルピリミジン−４−イル）−２,３,４，５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル］−２−クロロピリジン−３−イル｝メタンスルホンアミド；
Ｎ−（２−クロロ−５−｛４−［６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝ピリジン−３−イル）メタンスルホンアミド；
Ｎ−（５−｛４−［２−アミノ−６−エチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝−２−クロロピリジン−３−イル）メタンスルホンアミド；
Ｎ−｛５−［４−（２−アミノ−５−エテニルピリミジン−４−イル）−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル］−２−クロロピリジン−３−イル｝メタンスルホンアミド；
Ｎ−｛５−［４−（２−アミノ−５−エチルピリミジン−４−イル）−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル］−２−クロロピリジン−３−イル｝メタンスルホンアミド；または
Ｎ−［２−クロロ−５−（４−｛２−［（ジメチルアミノ）メチル］−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル｝−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル）ピリジン−３−イル］メタンスルホンアミド；
Ｎ−（２−クロロ−５−｛４−［２−｛［（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］メチル｝−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３，４，５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝ピリジン−３−イル）メタンスルホンアミド；
Ｎ−［２−クロロ−５−（４−｛２−［（ジメチルアミノ）メチル］−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル｝−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル）ピリジン−３−イル］メタンスルホンアミド；
任意に、その薬学的に許容される塩である。
別の態様において、本発明は、１）式Ｉ、Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、およびＩｅの化合物を、表１から選択されるその単一立体異性体または異性体の混合物、任意に、その薬学的に許容される塩、ならびに２）その薬学的に許容される担体、賦形剤、および／または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、直接的にまたは間接的にＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲによってもたらされる、制御されていない、異常な、かつ／または望まれない細胞活性と関連する疾患、障害、または症候群を治療する方法であって、治療有効量の式Ｉ、Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、およびＩｅの化合物、任意に、その薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物を、それを必要としているヒトに投与することを含む方法を提供する。別の実施形態において、この疾患は癌である。
この態様の実施形態において、この癌は、乳癌、マントル細胞リンパ腫、腎細胞癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ＮＰＭ／ＡＬＫを形質転換した未分化大細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、横紋筋肉腫、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腺癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、肝細胞癌、黒色腫、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、未分化大細胞リンパ腫、血管腫、グリア芽腫、または頭頸部癌である。
別の態様において、本発明は、疾患、障害、または症候群を治療する方法であって、治療有効量の式Ｉ、Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、およびＩｅの化合物、任意に、その薬学的に許容される塩、または治療有効量の式Ｉ、Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、およびＩｅの化合物ならびに薬学的に許容される担体、賦形剤、もしくは希釈剤を含む医薬組成物を患者に投与することを含む方法を対象とする。別の実施形態において、この疾患は癌である。
この態様の実施形態において、この癌は、乳癌、マントル細胞リンパ腫、腎細胞癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ＮＰＭ／ＡＬＫを形質転換した未分化大細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、横紋筋肉腫、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腺癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、肝細胞癌、黒色腫、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、未分化大細胞リンパ腫、血管腫、グリア芽腫、または頭頸部癌である。
別の実施形態において、式Ｉの化合物である本発明の化合物は、本明細書に記載の疾患を含む生物過程におけるＰＩ３Ｋαおよび／またはｍＴＯＲのインビボでの役割を調べるための、インビボのＰＩ３Ｋα、ＰＩ３Ｋβおよび／またはｍＴＯＲの阻害剤としても有用である。したがって、本発明は、本発明の化合物もしくは組成物を哺乳類に投与することを含む、ＰＩ３Ｋαおよび／またはｍＴＯＲをインビボで阻害する方法も含む。
上記に提供した実施形態のいずれかのうちの別の実施形態において、この癌は、乳癌、マントル細胞リンパ腫、腎細胞癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ＮＰＭ／ＡＬＫを形質転換した未分化大細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、横紋筋肉腫、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腺癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、肝細胞癌、黒色腫、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、未分化大細胞リンパ腫、血管腫、グリア芽腫、または頭頸部癌である。
別の実施形態は、ＰＩ３Ｋアイソザイムの選択的阻害剤を同定する方法であって、（ａ）ＰＩ３Ｋ−α中に第１の変異を有する第１の細胞を候補阻害剤と接触させること、（ｂ）野生型ＰＩ３Ｋ−α、ＰＴＥＮヌル変異、または前記ＰＩ３Ｋ−α中に第２の変異を有する第２の細胞を候補阻害剤と接触させること、（ｃ）前記第１の細胞および前記第２の細胞内のＡＫＴリン酸化を測定することを含み、その際、前記第２の細胞と比較した時に、前記第１の細胞内のＡＫＴリン酸化が減少すると、前記候補阻害剤は選択的ＰＩ３Ｋ−α阻害剤として同定される方法を対象とする。以下に提供されるこのおよび他の実施形態において、この候補阻害剤は、式Ｉおよび表Ｉの化合物である。
本発明の方法を用いてスクリーニングすることができる候補阻害剤化合物のライブラリーは、調製するか、またはいくつかの会社から購入してもよい。合成化合物ライブラリーは、例えば、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ社（プリンストン、ニュージャージー州）、Ｂｒａｎｄｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社（メリマク、ニューハンプシャー州）、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ社（ニューミルフォード、コネティカット州）、およびＡｌｄｒｉｃｈ社（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）から市販されている。候補阻害剤化合物のライブラリーは、大きな化学薬品会社でも開発されており、そこから市販されている。さらに、天然のコレクション、合成的に製造されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的手段、物理学的手段、および生化学的手段を介して容易に改良される。
本明細書に記載のスクリーニング法の実践において用いられる細胞は、初代細胞、二次細胞、または不死化細胞（例えば、樹立細胞株）であってよい。それらは、当技術分野で公知の技術によって調製する（例えば、細胞を、患者もしくは健康なドナーからの細針生検によって得てもよい）か、または免疫学的および微生物学的な商業資源（例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、マナッサス、バージニア州）から購入してもよい。あるいはまたはさらに、細胞を、例えば、興味のある遺伝子を含むように遺伝子操作してもよい。細胞の第１のセットにおいて、これらの細胞は、ＰＩ３Ｋ−αキナーゼドメイン内に遺伝子変異、例えば、Ｈ１０４７Ｒを有する。スクリーニングアッセイにおいて用いられる細胞の第２のセットにおいて、細胞の第２のセットは、異なるキナーゼ触媒サブユニットにおける遺伝子変異（例えば、ヘリックスドメインにおける変異、例えば、Ｅ５４５Ｋ、または別の調節タンパク質、例えば、ホスファターゼ・テンシン・ホモログ（ＰＴＥＮ）における変異）を有する。候補阻害剤が、別のキナーゼ触媒サブユニットに遺伝子変異（例えば、ヘリックスドメインにおける変異、例えば、Ｅ５４５Ｋ、または別の調節タンパク質における変異）を有する細胞と比較した時に、ＰＩ３Ｋ−αキナーゼドメイン遺伝子変異を有する細胞において、より高い程度でリン酸化（例えば、ＡＫＴリン酸化）を阻害する場合、この候補阻害剤は、ＰＩ３Ｋ−αに活性化変異を持つ癌または腫瘍に対して選択的な阻害剤である。逆に、ＰＩ３Ｋ−α選択的化合物は、ＰＴＥＮ陰性、ＰＩ３Ｋ−α野生型、およびＰＩ３Ｋ−α−Ｅ５４５Ｋのバックグラウンドと比較して、ＰＩ３Ｋ−α−Ｈ１０４７Ｒ変異を持つ腫瘍細胞において、より高い効力でＡＫＴリン酸化、ＰＩ３Ｋ経路活性化、および細胞増殖を阻害する。ＰＴＥＮ不活性化およびＫＲＡＳ活性化の両方は、ＰＩ３Ｋ−α選択的化合物の成長阻害効果に対して細胞を鈍化させる。野生型のＰＩ３Ｋ−αは、配列番号１に説明のために提供され、配列番号２のｍＲＮＡによってコードされる。
いくつかの実施形態において、スクリーニングアッセイに用いられる第１の細胞および第２の細胞は、異なる遺伝的背景を有する。一実施形態において、第１の細胞群は、ＰＩ３Ｋ−αキナーゼドメインに遺伝子変異を有する。例示的な実施形態において、第１の細胞群の遺伝子変異は、本明細書において配列番号２として開示され、キナーゼドメインに変異を有する全長ＰＩ３Ｋ−αをコードするｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ００６２１８、バージョンＮＭ ００６２１８．２ ＧＩ:５４７９２０８１）に変異を含む。一実施形態において、例示的な変異は、配列番号２のキナーゼドメインのコドン（３２９６、３２９７および３２９８）にあり、このコドンを変異させて、配列番号１に提供されるＰＩ３Ｋ−αの１０４７位に、ヒスチジン以外のアミノ酸を提供する。１つの例示的な変異において、１０４７位のヒスチジンをアルギニンに変異させる（Ｈ１０４７Ｒ）。この変異は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路において特に発癌性の変異であると以前に報告された。第２の細胞群は、第１の試験細胞群の変異を欠く。一実施形態において、例示的な変異は、配列番号２のヘリックスドメインのコドン（１７９０、１７９１および１７９２）にあり、このコドンを変異させて、配列番号１に提供されるＰＩ３Ｋ−αの５４２位または５４５位に、グルタミン酸以外のアミノ酸を提供する。１つの例示的な変異において、５４５位のグルタミン酸をリジンに変異させる（例えば、Ｅ５４２ＫまたはＥ５４５Ｋ）。この変異も、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路において特に発癌性の変異であると以前に報告された。
いくつかの実施形態において、第２の細胞群は、ＰＴＥＮに変異を持つことができる。
いくつかの実施形態において、第１の細胞群には、癌細胞株、例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（（ＡＴＣＣ）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナッサス、バージニア州）から入手することができ、ＰＩ３Ｋ−αのＨ１０４７Ｒ ｈｅｔ遺伝子変異をもつ乳癌細胞株を含む様々な細胞株が含まれ得る。いくつかの実施形態において、第１の細胞には、ＨＣＴ−１１６、Ｔ−４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＳＩＧＯＶ−３、ＢＴ−２０またはＬＳ Ｈ７４Ｔの細胞株が含まれ得る。いくつかの実施形態において、第２の細胞には、ＭＣＦ−７、ＰＣ３ ＭＣＩ−Ｈ４６０、ＳＫ−ＢＲ−３、ＰＣ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｔ、またはＡ５４９が含まれ得る。それぞれの特定の細胞株は、購入の際に提供され、かつＡＴＣＣを通して一般に入手可能な取扱説明書に従って維持することができる。
いくつかの実施形態において、第１の細胞群および第２の細胞群には、変異体ＰＩ３Ｋ−α触媒サブユニット、例えば、Ｈ１０４７Ｒ ｈｅｔまたはＥ５４５Ｋ ＰＩ３Ｋ−α触媒サブユニットで形質転換した非腫瘍細胞株も含まれ得る。核酸およびベクターを単離細胞に導入する方法、形質転換宿主細胞をインビトロで培養し、選択する方法は、当技術分野で公知であり、これには、塩化カルシウムに媒介される形質転換、形質導入、接合、三親接合、ＤＥＡＥ、デキストランに媒介されるトランスフェクション、感染、リポソームによる膜融合、ＤＮＡコーティング微粒子銃による高速照射、単一細胞への直接的マイクロインジェクション、およびエレクトロポレーションが含まれる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ.,上記参照；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ.,Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ,第２版.,ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ,１９９５；およびＮｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ.,ＥＭＢＯ Ｊ.,１:８４１（１９８２）参照）。様々な発現ベクターを用いて、一過的に、または安定的に真核細胞を形質転換するための方法はいくつかある。興味のある、変異させたＰＩ３Ｋ−α触媒サブユニットをコードするＤＮＡの配列を増幅することによって、細胞株、例えば、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞を変異させる方法がある。増幅させたＰＣＲ変異体ＰＩ３Ｋ−αコンストラクトを、ウイルスの発現ベクター、例えば、高レベルの１０Ａ１ ＭＬＶ Ｅｎｖを発現するように設計され、サルウイルス４０初期プロモーター−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子をｐＳＸ２に挿入することによって作製されたｐＳＸ２ｎｅｏ、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）末端反復配列促進性発現ベクター（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ−ｄｒｉｖｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）にクローニングすることができる。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞の形質転換は、別のＣａＰＯ４共沈法でトランスフェクションすることによって行うことができる。コンフルエンスに達した後、これらの細胞を、デキサメタゾンを含まず、５％ＦＢＳを含む培地に移すことができる。形態的形質転換細胞を、形質転換されたＥｎｖ−プラスミド−トランスフェクト細胞および形質転換されていないＥｎｖ−プラスミド−トランスフェクト細胞の混合物から、小口径のピペット（細いチップを得るために、炎上で引き延ばしたパスツールピペット）を用いて細胞層から形質転換フォーカスを切除し、ピペットに取り付けたゴム球を用いてそのフォーカスを吸引することにより分離し、単離することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法には、細胞が、候補阻害剤の存在下で試験されることが要求され、その際、この候補阻害剤は、各ウェルが第１の細胞または第２の細胞のいずれかを含む、別々の典型的なアッセイウェルに添加される。候補阻害剤の量は変更することができ、その候補阻害剤のＩＣ５０の測定のために、様々な範囲の阻害活性を測定することができる。これは、化合物を適切な溶媒、例えば、ＤＭＳＯに段階希釈し、次いで、第１の細胞および第２の細胞がインキュベートされている培地に段階希釈することによって容易に達成することができる。いくつかの実施形態において、候補阻害剤の濃度は、約１ｐＭ〜約１ｍＭの濃度の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、候補阻害剤を、約０．５ｎＭ〜約１０μＭの範囲の量で添加する。候補阻害剤と、第１の細胞群および第２の細胞群のインキュベーションは、一般に、約３０分〜約６０時間の範囲で変えることができる。
いくつかの実施形態において、特に、ＰＩ３Ｋ−α媒介性活性を有する細胞を、成長因子で刺激する。成長因子の選択は、細胞株の要求によって媒介され、例えば、例示的な成長因子には、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、インスリンおよびヘレグリンが含まれ得る。
いくつかの実施形態において、候補化合物の阻害活性は、様々な細胞活性を用いて測定することができる。癌細胞株を用いる場合、細胞内のＰＩ３Ｋ媒介性活性、例えば、ＡＫＴリン酸化（Ｓ４７３残基およびＴ３０８残基の両方）、ＡＫＴ活性化、細胞増殖、およびアポトーシス抵抗性の阻害は、全て測定することができる。いくつかの実施形態において、第１の細胞群および第２の細胞群におけるＡＫＴリン酸化の量は、ＡｂＣａｍ社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州から市販されているリン酸化部位特異的抗体（例えば、ＡＫＴ１（ｐｈｏｓｐｈｏ Ｓ４７３、カタログ番号ａｂ８９３２、ＡＫＴ１（ｐｈｏｓｐｈｏ Ｔ３０８）カタログ番号ａｂ６６１３４）を用いて測定することができる。第１の細胞群および第２の細胞群におけるＰＩ３Ｋ−α活性の阻害を測定するための他の方法については、Ｄｏｎａｈｕｅ,Ａ.Ｃ.ｅｔ ａｌ.,Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ Ａｋｔ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ.Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ.２００７（４３４）:１３１−１５４に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
別の実施形態において、本発明は、ＰＩ３Ｋ−αを含む腫瘍を有する癌患者のための治療計画を決定する方法であって、ＰＩ３Ｋ−αのアミノ酸１０４７および／または５４５における変異の有無を判定することを含む方法を提供し、その際、ＰＩ３Ｋ−αが１０４７位に変異を有する場合、この方法は、治療有効量のＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤化合物をこの癌患者に投与することを含むか、またはＰＩ３Ｋ−αが５４５位に変異を有する場合、この方法は、治療有効量のＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤とＰＩ３Ｋ−β選択的阻害剤の組み合わせ、デュアルＰＩ３Ｋ−α／ｍＴＯＲ選択的阻害剤、もしくはＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤とｍＴＯＲ選択的阻害剤の組み合わせをこの癌患者に投与することを含む。
別の実施形態において、本発明は、ＰＩ３Ｋ−αを含む腫瘍を有する癌患者のための治療計画を決定する方法であって、ＰＩ３Ｋ−αのアミノ酸１０４７および／または５４５における変異の有無を判定することを含む方法を提供し、その際、ＰＩ３Ｋ−αが１０４７位に変異を有する場合、この方法は、治療有効量のＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤化合物、デュアルＰＩ３Ｋ−α／ｍＴＯＲ選択的阻害剤、ＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤とｍＴＯＲ選択的阻害剤の組み合わせをこの癌患者に投与することを含むか、またはＰＩ３Ｋ−αが５４５位に変異を有する場合、この方法は、治療有効量のＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤とＰＩ３Ｋ−β選択的阻害剤の組み合わせ、デュアルＰＩ３Ｋ−α／ｍＴＯＲ選択的阻害剤、もしくはＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤とｍＴＯＲ選択的阻害剤の組み合わせをこの癌患者に投与することを含む。
本発明の方法を用いて、ＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤での治療から恩恵を受ける可能性の高い癌患者集団、ならびに恩恵を受ける可能性の低い患者集団を特定することができる。
本発明を用いて、広範なインビトロ細胞株プロファイリングならびにインビボの薬理学的研究および有効性研究によって、ＰＩ３Ｋα阻害剤感受性腫瘍サブタイプを特定する遺伝子マーカーまたは遺伝子発現サインをさらに定義することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に例示した癌を有する癌患者のために治療計画を決定する方法は、本明細書に記載のＰＩ３Ｋ−α変異バックグラウンドを有する癌においてＰＩ３Ｋα選択的阻害剤の活性の差異に基づいて容易に行うことができる。腫瘍がキナーゼドメインにＰＩ３Ｋα変異、例えば、Ｈ１０４７Ｒをもたらす変異を持つか否かを判定するために、腫瘍細胞を分析し、アッセイする患者において、ＰＩ３Ｋα選択的阻害剤を含む治療を調整することによって、より高い有効性および治療の改善が達成できる。ＰＩ３Ｋ−αキナーゼドメインに変異を持たない腫瘍を有する患者にとって、例えば、ＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤とＰＩ３Ｋ−β選択的阻害剤の組み合わせ、デュアルＰＩ３Ｋ−α／ｍＴＯＲ選択的阻害剤、またはＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤とｍＴＯＲ選択的阻害剤の組み合わせの送達に焦点を置くことによって、この治療は、別の治療計画の採用を必要とし得る。上記に示したとおり、ＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤、ｍＴＯＲ選択的阻害剤およびデュアルＰＩ３Ｋ−α／ｍＴＯＲ選択的阻害剤を、表１、および本明細書の発明を実施するための形態に例示する。
いくつかの実施形態において、治療計画を決定する方法は、対象の腫瘍におけるＰＩ３Ｋ−αのアミノ酸１０４７および／または５４５の変異の存在を決定することを含む。このステップは、核酸法、タンパク質分離法または変異特異的抗体を用いる直接的な免疫学的手法を用いて、様々な方法で達成することができる。いくつかの実施形態において、対象の腫瘍におけるＰＩ３Ｋαのアミノ酸１０４７および／または５４５の変異の存在は、アミノ酸の配列解析のための任意の適切な方法を用いて決定することができる。適切な技術の例として、ウエスタンブロット解析、免疫沈降法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ））が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明において、ＰＩ３Ｋαのアミノ酸配列内の位置への言及は、配列番号１を参照して行う。ＰＩ３Ｋαのヌクレオチド配列内の位置への言及は、配列番号２を参照して行う。野生型タンパク質配列の特異的アミノ酸を、１文字のアミノ酸記号表示、続いて、タンパク質配列の位置を用いて記載し、例えば、Ｅ５４５は、５４５位がグルタミン酸であることを示す。特定の位置における置換を表すために、置換されたアミノ酸が、その位置の後に続き、例えば、Ｅ５４５Ｋは、５４５位のグルタミン酸がリジンで置き換えられていることを示す。
ＰＩ３Ｋ−αペプチド配列の配列内の変異の有無の判定は、一般的に、患者の体内から除去した腫瘍試料を用いるインビトロ法を用いて決定される。
ＰＩ３Ｋ−αまたはその一部のアミノ酸配列における変異の有無の判定は、任意の適切な方法を用いて行うことができる。例えば、ＰＩ３Ｋ−αまたはその一部のヌクレオチド配列を決定し、そのヌクレオチド配列からアミノ酸配列を推定するか、またはＰＩ３Ｋ−αタンパク質を、直接調べることができる。
ＰＩ３Ｋ−αまたはその一部のヌクレオチド配列は、核酸の配列解析のための任意の方法を用いて決定してもよい。遺伝子内の配列変異の同定法は、当技術分野で公知であり、ＰＩ３Ｋ−αの変異は、任意の適切な方法によって同定することができる。これらの方法には、ダイナミック・アレル−スペシフィック・ハイブリダイゼーション法（ｄｙｎａｍｉｃ ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、モレキュラー・ビーコンの使用、例えば、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡヌクレアーゼを用いる酵素ベースの方法、ＰＣＲベースの方法、全ゲノムシーケンシング、部分的なゲノムシーケンシング、エキソームシーケンシング、核酸プローブハイブリダイゼーション、および制限酵素消化分析法が含まれるが、これらに限定されない。
ＤＮＡのダイレクトシーケンシング法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ,Ｆｒｅｄ Ｍ.Ａｕｓｕｂｅｌ,Ｒｏｇｅｒ Ｂｒｅｎｔ,Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ.Ｋｉｎｇｓｔｏｎ,Ｄａｖｉｄ Ｄ.Ｍｏｏｒｅ,Ｊ.Ｇ.Ｓｅｉｄｍａｎ,Ｊｏｈｎ Ａ.Ｓｍｉｔｈ,Ｋｅｖｉｎ Ｓｔｒｕｈｌ編、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ:Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ,Ｊｏｅ Ｓａｍｂｒｏｏｋ,Ｄａｖｉｄ Ｗ Ｒｕｓｓｅｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ参照）。これらのシーケンシングプロトコールには、例えば、放射活性物質で標識したヌクレオチド、および蛍光色素で標識したヌクレオチドの使用が含まれる。
例えば、Ｂａｒｂｉ,Ｓ.らは、以下のプロトコールを用いて、ＰＩ３Ｋ−αのヘリックスドメイン（エクソン９）およびキナーゼドメイン（エクソン２０）のシーケンスを行った。正常なＤＮＡおよび腫瘍のＤＮＡを、パラフィン包埋組織から抽出し、蛍光色素で標識したプライマー（以下のプライマーセット）を用いて増幅した。プライマー配列は、ＤＮＡ領域をユニークに選択し、隣接する類似の配列へのミスハイブリダイゼーションの可能性を回避するように選ぶ必要がある。一般的に用いられる方法はＢＬＡＳＴ検索であり、これによって、プライマーが結合する可能性のある全ての領域を調べることができる。ヌクレオチド配列およびプライマーの両方を、それ自体ＢＬＡＳＴ検索することができる。無料のＮＣＢＩツールのＰｒｉｍｅｒ−ＢＬＡＳＴは、プライマー設計ツールおよびＢＬＡＳＴ検索を１つのアプリケーションに統合したものであり、Ｂｅａｃｏｎ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、パロアルト、カリフォルニア州）などの市販のソフトウェア製品がそうである。ループ形成が生じ、ミスハイブリダイゼーションの一因となり得るので、モノヌクレオチドリピートは避けるべきである。さらに、適切なプライマーの設計に役立つコンピュータープログラムは、容易に利用できる。特定の実施形態において、核酸プローブを、サザンハイブリダイゼーションアッセイで使用するために標識する。核酸プローブは、放射活性標識、蛍光標識してもよく、または免疫学的に検出可能であり、特に、ジゴキシゲニンで標識される（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ社、マンハイム）。
いくつかの実施形態において、エクソン９におけるヘリックスドメイン変異の存在の判定には、フォワードプライマーおよびリバースプライマー、それぞれ、ＧＧＧＡＡＡＡＡＴＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＣ（配列番号３）およびＣＴＧＡＧＡＴＣＡＧＣＣＡＡＡＴＴＣＡＧＴＴ（配列番号４）の使用が含まれ得、シーケンシングプライアーには、ＴＡＧＣＴＡＧＡＧＡＣＡＡＴＧＡＡＴＴＡＡＧＧＧＡＡＡ（配列番号５）が含まれ得る。
エクソン２０のキナーゼドメインにおける変異の判定のための例示的なプライマーセットには、フォワードプライマーおよびリバースプライマー、それぞれ、ＣＴＣＡＡＴＧＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＣＴＧ（配列番号６）およびＴＧＧＡＡＴＣＣＡＧＡＧＴＧＡＧＣＴＴＴＣ（配列番号７）が含まれ得、シーケンシングプライアーには、ＴＴＧＡＴＧＡＣＡＴＴＧＣＡＴＡＣＡＴＴＣＧ（配列番号８）が含まれ得る。次いで、増幅産物のシーケンスを行うことができる（Ｂａｒｂｉ,Ｓ.ｅｔ ａｌ.Ｊ.Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１０,２９：３２）。次いで、これらの配列を比較し、野生型のＰＩ３Ｋ−α配列と腫瘍のＰＩ３Ｋ−α配列との間の違いを判定する。このアッセイは、腫瘍のＤＮＡを増幅させ、腫瘍のＰＩ３Ｋ−α配列を配列番号１の配列と比較するだけで行うこともできる。
いくつかの実施形態において、本発明は、高ストリンジェンシー条件下で、ＰＩ３Ｋ−αのヘリックス領域、またはキナーゼドメインにハイブリダイズすることができる配列番号２由来のポリヌクレオチド配列を全部または部分的に含むポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態において、これらのポリヌクレオチド配列には、ＰＩ３Ｋ−αもしくは本明細書に記載の特異的変異を有するＰＩ３Ｋ−αを全部または部分的にコードする核酸配列と相補的な配列を含み得る。「相補的」および「相補性」という用語は、塩基対律によって関係づけられるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を表す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と相補的である。相補性は「部分的」であってもよく、その際、核酸の塩基のいくつかのみが塩基対律にしたがってマッチする。あるいは、核酸間で「完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）」相補性すなわち「完全（ｔｏｔａｌ）」相補性であってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に著しい影響を与える。このことは、増幅反応、および核酸間の結合に依存する検出法に特に重要である。
いくつかの実施形態において、本発明は、高ストリンジェンシー条件下で、ＰＩ３Ｋ−αのヘリックス領域、またはキナーゼドメインにハイブリダイズすることができる配列番号２由来のポリヌクレオチド配列を全部または部分的に含むポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、配列番号１の１０４７位、５４２位、または５４５位のアミノ酸に変異があるのか否かを判定するためのアッセイにおいて、対象の腫瘍由来の単離したＲＮＡの使用を含む。このアッセイには、さらに、（ａ）前記ＲＮＡ試料を相当するｃＤＮＡに逆転写すること、（ｂ）ＰＩ３Ｋ−α遺伝子の予定領域を対象とする核酸プローブの対を用いて、ｃＤＮＡの予定領域を増幅すること、（ｃ）前記増幅ｃＤＮＡ領域のシーケンスを行い、前記増幅ｃＤＮＡ領域のポリヌクレオチド配列を得ること、かつ（ｄ）前記増幅ｃＤＮＡ領域が、配列番号１の１０４７位、５４２位、または５４５位のアミノ酸をコードするコドンに遺伝子変異を含むか否かを判定することが含まれる。
いくつかの実施形態において、本方法を用いて、核酸プライマーの対、配列番号１のアミノ酸１０４７、５４２、または５４５のいずれかのアミノ酸をコードするＤＮＡコドンの上流のｃＤＮＡにストリンジェントにハイブリダイズすることができる第１のプライマー、配列番号１のアミノ酸１０４７、５４２、または５４５のいずれかのアミノ酸をコードするＤＮＡコドンの下流のｃＤＮＡにストリンジェントにハイブリダイズする働きをする第２の核酸プライマーを用いてｃＤＮＡを増幅することによって、ｃＤＮＡの予定領域を増幅することができる。
いくつかの実施形態において、これらのポリヌクレオチドは、ＰＩ３Ｋ−αもしくは本明細書に記載の特異的変異を有するＰＩ３Ｋ−αを全部または部分的にコードする核酸配列と相補的な配列を含み得る。「相補的」および「相補性」という用語は、塩基対律によって関係づけられるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を表す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と相補的である。相補性は「部分的」であってもよく、その際、核酸の塩基のいくつかのみが塩基対律にしたがってマッチする。あるいは、核酸間で「完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）」相補性すなわち「完全（ｔｏｔａｌ）」相補性であってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に著しい影響を与える。このことは、増幅反応、および核酸間の結合に依存する検出法に特に重要である。
核酸ハイブリダイゼーションに関連して使用される「ストリンジェンシーの高い条件」には、約５００ヌクレオチド長のプローブを使用する場合に、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４.Ｈ２Ｏおよび１.８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）試薬および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中で、４２℃にて結合またはハイブリダイゼーションし、その後、０．１×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液で４２℃にて洗浄するのに相当する条件が含まれる。
核酸に関連して使用される「ホモロジー」という用語は、相補性の程度を表す。部分的ホモロジーまたは完全ホモロジー（すなわち、同一性）があってよい。「配列同一性」は、２つ以上の核酸またはタンパク質間の関連性の尺度を表し、比較する全長に対する割合として与えられる。同一性の計算は、同一であり、かつそれらのそれぞれのより長い配列中の同じ相対位置にあるそれらのヌクレオチド残基またはアミノ酸残基を考慮に入れる。同一性の計算は、「ＧＡＰ」（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、マディソン、ウィスコンシン州）および「ＡＬＩＧＮ」（ＤＮＡＳｔａｒ、マディソン、ウィスコンシン州）などのコンピュータープログラム内に含まれるアルゴリズムによって行ってもよい。部分的に相補的な配列は、完全に相補的な配列が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する（または競合する）配列であり、「実質的に相同」という機能的な用語を用いて表される。完全に相補的な配列の標的配列へのハイブリダイゼーションの阻害は、ストリンジェンシーの低い条件下で、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロットまたはノーザンブロット、および溶液ハイブリダイゼーションなど）を用いて調べてもよい。実質的に相同な配列またはプローブは、ストリンジェンシーの低い条件下で、標的に対して完全に相同である配列と競合し、そのような配列の結合を阻害する。ストリンジェンシーの低い条件が、非特異的な結合を許すと言っているわけではなく、ストリンジェンシーの低い条件は、２つの配列の互いへの結合が特異的（すなわち、選択的）相互作用であることを必要とする。非特異的結合が存在しないことは、部分的なある程度の相補性（例えば、約３０％未満の同一性）さえ欠いている第２の標的を使用することによって試験してもよく、非特異的結合の非存在下では、プローブは、第２の非相補的な標的にハイブリダイズしない。
好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体の融点（Ｔｍ）に基づいており、明確な「ストリンジェンシー」を与える。「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的な核酸の対合を表す。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比などの要因によって影響を与えられる。その構造内に相補的な核酸の対合を含む単一分子は、「自己ハイブリダイズする」と言われる。
「Ｔｍ」という用語は、核酸の「融点」を表す。融点は、２本鎖の核酸分子の集団が半分解離して、１本鎖になっている温度である。核酸のＴｍを計算する式は、当技術分野で公知である。標準的な参照試料によって示されるとおり、Ｔｍ値の単純な概算は、核酸が、１ＭのＮａＣlの水溶液中に存在する時、式：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）によって計算してもよい。「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションが行われる温度、イオン強度、および有機溶媒などの他の化合物の存在の条件を表す。「ストリンジェンシーの高い」条件では、核酸塩基対合は、高頻度の相補的な塩基配列を有する核酸断片間でのみ生じる。
さらに、ＰＩ３Ｋαの配列変異は、単一ヌクレオチド変化の検出を可能にする任意の配列特異的な核酸検出法を用いて判定することができ、特に、任意のかかる方法には、相補的な塩基対合が関与する。例えば、ＰＩ３ＫαがＥ５４５変異を含むか否かを判定するために、配列番号２のヌクレオチド１７９０、１７９１および１７９２（アミノ酸配列内の５４５位に相当するコドン）を含むＰＩ３Ｋαペプチド配列またはその一部の配列は、１７９０位のヌクレオチドがＧである場合にのみ、オリゴヌクレオチドプライマーが、ＰＩ３Ｋαの増幅を可能にするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用される。反応産物が形成されない場合、５４５位のアミノ酸が変異する。別の実施例において、オリゴヌクレオチドプライマーを、３２９７位のヌクレオチドがＡである場合に、増幅を可能にするように設計する（ヌクレオチド３２９６、３２９７および３２９８を含むコドンは、アミノ酸配列の１０４７位に相当する）。それらのプライマーを用いて反応産物が形成されない場合、５４５位のアミノ酸が変異する。ＰＣＲを行う方法は、当技術分野において公知である（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ,Ｆｒｅｄ Ｍ.Ａｕｓｕｂｅｌ,Ｒｏｇｅｒ Ｂｒｅｎｔ,Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ.Ｋｉｎｇｓｔｏｎ,Ｄａｖｉｄ Ｄ.Ｍｏｏｒｅ,Ｊ.Ｇ.Ｓｅｉｄｍａｎ,Ｊｏｈｎ Ａ.Ｓｍｉｔｈ,Ｋｅｖｉｎ Ｓｔｒｕｈｌ.編および；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ,Ｊｏｅ Ｓａｍｂｒｏｏｋ,Ｄａｖｉｄ Ｗ Ｒｕｓｓｅｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ参照）。
ダイナミック・アレル−スペシフィック・ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）ジェノタイピングは、ミスマッチ塩基対の不安定性に起因するＤＮＡにおける融点の違いをうまく利用する。この技術は、自動化に十分に向いている。第１のステップにおいて、ＤＮＡ部分を増幅させ、ＰＣＲ反応を介して、ビオチン化プライマーを用いてビーズに結合させる。第２のステップにおいて、増幅産物をストレプトアビジンカラムに結合させ、ＮａＯＨで洗浄し、非ビオチン化鎖を除去する。次いで、２本鎖ＤＮＡに結合した時に蛍光を発する分子の存在下で、配列特異的オリゴヌクレオチドを添加する。次いで、Ｔｍを決定することができるまで、温度を増加させた時の強度を測定する。１本鎖ヌクレオチド変化は、期待されるＴｍよりも低いＴｍをもたらす（Ｈｏｗｅｌｌ Ｗ.,Ｊｏｂｓ Ｍ.,Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ Ｕ.,Ｂｒｏｏｋｅｓ Ａ.（１９９９）Ｄｙｎａｍｉｃ ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ.Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ.Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.１７（１）:８７−８）。ＤＡＳＨジェノタイピングは、Ｔｍの定量化できる変化を測定しているので、ＳＮＰだけでなく全てのタイプの変異を測定することができる。ＤＡＳＨの他の利点には、非標識プローブと共に機能する能力ならびにその単純な設計および性能状態が含まれる。
モレキュラービーコンを用いて、ＤＮＡ配列の変異を検出することもできる。モレキュラービーコンは、特別に遺伝子工学処理された１本鎖オリゴヌクレオチドプローブを利用する。このオリゴヌクレオチドは、それぞれの末端に相補的な領域があり、その間にプローブ配列が位置するように設計されている。この設計は、このプローブが、その自然の分離状態においてヘアピン構造またはステムループ構造を取るのを可能にする。フルオロフォアがこのプローブの一端に結合し、蛍光消光剤が他端に結合している。このプローブのステムループ構造により、フルオロフォアは消光剤の近傍にあるので、この分子は蛍光を発するのを妨げられている。プローブ配列のみが、アッセイで用いられるゲノムＤＮＡに相補的であるように、この分子も遺伝子工学処理される（Ａｂｒａｖａｙａ Ｋ.,Ｈｕｆｆ Ｊ.,Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｒ.,Ｍｅｒｃｈａｎｔ Ｂ.,Ｍｕｌｌｅｎ Ｃ.,Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｇ.,およびＲｏｂｉｎｓｏｎ Ｊ.（２００３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ ａｓ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｏｏｌｓ:ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ.Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ.４１:４６８−４７４）。このモレキュラービーコンのプローブ配列が、アッセイ中にその標的ゲノムＤＮＡに出合うと、それはアニールし、ハイブリダイズする。プローブ配列の長さにより、このプローブのヘアピン部分は、より長く、より安定したプローブ−標的ハイブリッドの形成を好んで変性する。この立体構造変化は、フルオロフォアおよび消光剤が、ヘアピン会合（ｈａｉｒｐｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）によるそれらの密接な近接（状態）から遊離することを可能にし、この分子が蛍光を発するのを可能にする。他方では、このプローブ配列が、１個程度の非相補的ヌクレオチドを有する標的配列に出合うと、このモレキュラービーコンは、優先的にその自然のヘアピン状態に留まり、フルオロフォアは消光状態のままであるので、蛍光は観察されない。これらの分子ビーコムの特有の設計により、特定の位置のＳＮＰを同定するための単純な診断アッセイが可能になる。１個のモレキュラービーコンを、野生型アレルにマッチするように設計し、別のモレキュラービーコンを、アレルの変異体にマッチするように設計する場合、この２つのビーコムを用いて、個体のジェノタイプを同定することができる。アッセイ中に、第１のプローブのフルオロフォア波長のみが検出される場合、その個体は野生型のホモ接合体である。第２のプローブ波長のみが検出される場合、その個体は、変異体アレルのホモ接合体である。最後に、両方の波長が検出される場合、両方の分子ビーコムがそれらの補体にハイブリダイズしていなければならず、したがって、その個体は両方のアレルを含み、ヘテロ接合体でなければならない。
酵素ベースの核酸法も、ＰＩ３Ｋ−αヌクレオチド配列の変異を判定するのに適し、企図される。例えば、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）（以下で詳細に論じる）を用いて、単一ヌクレオチド差異を検出することができる。ＳＮＰ−ＲＦＬＰは、多くの異なる制限酵素およびユニークで、特異的な制限酵素部位に対するそれらの高い親和性を利用する。ゲノム試料の消化を行い、ゲルアッセイを経て断片長を決定することにより、酵素が予想される制限酵素部位を切断したか否かを確認することができる。ゲノム試料を切断しなかった場合、予想される断片よりも識別可能なほど長い断片が得られ、このことは、制限酵素部位の場所で変異があり、その断片がヌクレアーゼ活性から保護されていることを意味する。
本明細書で使用する「機能的に同等のコドン」という用語は、アルギニンに対する６個のコドンなどの、同じアミノ酸をコードするコドンを表す。
本発明の一実施形態において、この方法は、１０４７番目のアミノ酸をコードするコドンの配列を決定するための少なくとも１つの核酸プローブまたはオリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態において、この方法は、５４５番目のアミノ酸をコードするコドンの配列を決定するための少なくとも１つの核酸プローブまたはオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、１０４７番目のアミノ酸をコードするコドンがヒスチジンをコードする場合にのみ、ＰＩ３Ｋα核酸配列断片の増幅を可能にするＰＣＲプライマー、好ましくは、ＰＣＲプライマーのセットである。別の方法において、このＰＣＲプライマーまたはＰＣＲプライマーのセットは、５４５番目のアミノ酸をコードするコドンがグルタミン酸をコードする場合にのみ、核酸配列断片の増幅を可能にする。適切なＰＣＲプライマーの決定は、当技術分野で決められた方法である（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ,Ｆｒｅｄ Ｍ.Ａｕｓｕｂｅｌ,Ｒｏｇｅｒ Ｂｒｅｎｔ,Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ.Ｋｉｎｇｓｔｏｎ,Ｄａｖｉｄ Ｄ.Ｍｏｏｒｅ,Ｊ.Ｇ.Ｓｅｉｄｍａｎ,Ｊｏｈｎ Ａ.Ｓｍｉｔｈ,Ｋｅｖｉｎ Ｓｔｒｕｈｌ編；Ｌｏｏｓｅｌｅａｆ:０−４７１−６５０３３８−Ｘ；ＣＤ−ＲＯＭ:０−４７１−３０６６１−４）。さらに、適切なプライマーの設計に役立つコンピュータープログラムは、容易に入手できる。特定の実施形態において、核酸プローブを、サザンハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用するために標識する。核酸プローブは、放射活性標識、蛍光標識してもよく、または免疫学的に検出可能であり、特に、ジゴキシゲニンで標識される（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ社、マンハイム）。
米国特許公開第２００１００１６３２３号は、蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブおよび蛍光共鳴エネルギー移動を用いて点変異を検出する方法を開示している。プローブと標的ＤＮＡ鎖の間の塩基ミスマッチをもたらす点変異は、プローブおよび標的が完全にマッチした場合に、複合体の融点を、プローブおよび標的の融点よりも低くさせる。
単一点変異を検出するのに適する他の方法には、例えば、アレイフォーマットにオリゴヌクレオチドプローブを使用する米国特許公開第２００２０１０６６５号に開示されているものが含まれる。かかるアレイには、配列番号３〜８のうちの１つまたは複数が含まれ得る。米国特許公開第２００２０１７７１５７号は、点変異を検出するためのさらなる方法を開示している。
ＰＩ３Ｋ−αキナーゼドメインの変異につながる点変異を保有するポリヌクレオチド、例えば、本発明の対象であるＨ１０４７Ｒは、いくつかの利用可能な技術のうちの１つまたは複数を用いて同定することができる。しかし、検出は本明細書に記載の技術に限定されず、本発明の方法および組成物はこれらの方法に限定されるものでもなく、これらは単に説明の目的のために提供される。ポリヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプローブも本明細書に開示され、本発明の範囲内に含まれ、これらのプローブは、下記の技術のうちの１つまたは複数に適する。これらには、一実施形態において、診断用変異検出法であるアレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＡＳＯ）が含まれ、これは、既知の変異のアレルに対応するオリゴヌクレオチドのペアとのハイブリダイゼーションを用いて、変異を検出する。別の適切な方法は変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）であり、これは、ミスマッチヌクレオチド間のヘテロ２本鎖形成の検出に基づく変異および多型を同定するように考案された液体クロマトグラフィー法である。特定の条件下、ヘテロ２本鎖は、融点の低下により、ホモ２本鎖よりも早くカラムから溶出する。次いで、個々の試料において解析を行うことができる。
変異配列または野生型配列を含むＤＮＡの増幅領域は、ＤＨＰＬＣによって解析することができる。ＤＨＰＬＣの使用は、米国特許第５，７９５，９７６号および同第６，４５３，２４４号に記載されており、これらは共に、参照により本明細書に組み込まれる。適切な方法は、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ ＷＡＶＥ（商標）システムを用いるＴｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ社（オハマ、ネブラスカ州）によって提供される方法である。
ＡＳＯについては、ＰＩ３Ｋ−α変異（Ｈ１０４７Ｒおよび／またはＥ５４５Ｋ）を含むゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの領域をＰＣＲによって増幅し、２枚の膜上に移す。これは、ドット／スロットブロッティング、手によるスポッティング、または消化およびサザンブロッティングによって行うことができる。これらの膜をプレハイブリダイズさせ、次いで、変異体配列もしくは野生型配列のいずれか一方に放射標識オリゴヌクレオチドまたはジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。ＤＩＧ標識については、検出は、化学発光法または比色法を用いて行う。次いで、ＡＳＯが非特異的配列から洗い流されるまで、ストリンジェンシーを増加させて、これらの膜を洗浄する。自動Ｘ線撮影後、それぞれのオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションのレベルについて、生成物をスコア化する。好ましくは、正確なストリンジェンシーを確かめるために、それぞれのフィルター上に正常配列および変異体配列のための対照を含め、ＰＣＲの陰性対照を用いて、ＰＣＲにおける混入をチェックする。
ＡＳＯプローブのサイズは、当技術分野の技術パラメータを除いて制限されない。一般に、短すぎるプローブは位置に対してユニークにはならず、長すぎるプローブは、感受性の喪失をもたらす。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、１５〜２１個のヌクレオチド長であり、オリゴヌクレオチドの中心に向かってミスマッチを有する。
ＡＳＯハイブリダイゼーションを行って、本発明の変異を検出する試料ＤＮＡの領域は、好ましくは、フォワードプライマーを用いてＰＣＲによって増幅する。エクソン９については、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれＧＧＧＡＡＡＡＡＴＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＣ（配列番号３）およびＣＴＧＡＧＡＴＣＡＧＣＣＡＡＡＴＴＣＡＧＴＴ（配列番号４）であり、シーケンシングプライマーは、ＴＡＧＣＴＡＧＡＧＡＣＡＡＴＧＡＡＴＴＡＡＧＧＧＡＡＡ（配列番号５）であり、エクソン２０については、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれＣＴＣＡＡＴＧＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＣＴＧ（配列番号６）およびＴＧＧＡＡＴＣＣＡＧＡＧＴＧＡＧＣＴＴＴＣ（配列番号７）であった。この場合、ＰＣＲによる増幅または比較できる方法は必須ではないが、任意に行うことができる。
任意に、上記に記載の（配列番号３〜８のプライマーを用いて生成された３０６ヌクレオチド領域、またはこれらの領域のいずれかのより短い部分を含む）増幅領域のうちの１つまたは２つ以上は、変異を検出するためにシーケンシングによって解析することができる。シーケンシングは、当技術分野で定められたとおりに行うことができる。変異の存在を同定するために、シーケンスされる領域の選択における唯一の制限は、シーケンシング用に選択される領域が、変異の対象であるヌクレオチドを含まねばならないことである。シーケンシング用に選択される領域のサイズは、当技術分野で公知の技術パラメータを除いて制限されず、より長い領域は、本明細書に開示される配列番号３と配列番号４のプライマーおよび配列番号６と配列番号７のプライマーを用いて、選択される増幅領域間のＤＮＡまたはＲＮＡの一部もしくは全部を含む。
上記に開示される方法のバリエーションも、変異の検出に適する。例えば、ＡＳＯのバリエーションにおいて、ＡＳＯは、ターミナル・デオキシリボヌクレオチジル・トランスフェラーゼを有するホモポリマー末端が与えられ、これをナイロン膜上にスポットし、ＵＶ照射により共有結合させる。標的ＤＮＡを、ビオチン化プライマーを用いて増幅し、固定化オリゴヌクレオチドを含む膜にハイブリダイズさせ、その後、検出する。このリバースドットブロット技術の例として、Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ社（ベルギー）のＩＮＮＯ−ＬＩＰＡキットが挙げられる。
変異遺伝子および遺伝子産物、すなわち、Ｅ５４５ＫおよびＨ１０４７Ｒにおける変異を有する配列番号１の同定およびシーケンシングと共に、遺伝子産物に対するプローブおよび抗体を、様々なハイブリダイゼーションおよび免疫アッセイにおいて使用し、正常遺伝子もしくは変異遺伝子または遺伝子産物のいずれかの存在をスクリーニングし、検出することができる。
異種細胞系における変異遺伝子の発現を用いて、構造機能関係を示すことができる。細胞にトランスフェクトするために、このＤＮＡ配列をプラスミド発現ベクターにライゲーションすることは、様々な細胞生化学パラメータの変異の影響を試験するのに有用な方法である。全く正常なヒトもしくはマウスの配列、変異体のヒトもしくはマウスの配列、全く正常なヒトもしくはマウスの配列の一部、または変異体のヒトもしくはマウスの配列の一部のいずれかを含むプラスミド発現ベクターは、制御機能に欠かせないタンパク質の部分を同定するインビトロ変異誘発実験において使用することができる。
遺伝子およびその産物の発現を理解するための実験でＤＮＡ配列を操作し、機能解析、抗体産生、および患者の治療のための大量のタンパク質の産生を達成することができる。配列の変化により、相対量、組織特異性および機能特性に関して、発現パターンが変わっても、変わらなくてもよい。
いくつかの方法が、バリアント（例えば、変異体または多型の）核酸配列の解析に利用できる。多型または変異の検出のためのアッセイは、ダイレクトシーケンシングアッセイ、断片多型アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、およびコンピューターベースのデータ解析を含むが、これらに限定されないいくつかのカテゴリーに分類される。これらのアッセイの複数のバリエーションを行うためのプロトコールおよび市販のキットまたはサービスは、商業的に利用可能であり、当業者に周知である。いくつかの実施形態において、アッセイを組み合わせて、すなわち混合した部分で行う（例えば、いくつかのアッセイ由来の異なる試薬または技術を組み合わせて、１つのアッセイを生み出す）。以下の例示的なアッセイを用いて、興味のあるＰＩ３Ｋ−α変異を含む核酸分子をスクリーニングし、同定してもよい。
断片長多型アッセイ
本発明のいくつかの実施形態において、バリアント配列を、断片長多型アッセイを用いて検出する。断片長多型アッセイにおいて、一連の位置でＤＮＡを切断することに基づく、特有のＤＮＡバンドパターンを、酵素（例えば、制限酵素またはＣＬＥＡＶＡＳＥ Ｉ（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、マディソン、ウィスコンシン州）酵素）を用いて作成する。ＳＮＰまたは変異を含む試料由来のＤＮＡ断片は、野生型とは異なるバンドパターンを有する。
ＰＣＲアッセイ
本発明のいくつかの実施形態において、バリアント配列を、ＰＣＲベースのアッセイを用いて検出する。いくつかの実施形態において、このＰＣＲアッセイは、ＰＩ３Ｋαのバリアントアレル（例えば、変異もしくは複数の変異の領域）または野生型アレルにのみハイブリダイズするオリゴヌクレオチド核酸プライマーの使用を含む。両方のプライマーセットを用いて、ＤＮＡ試料を増幅する。変異体プライマーのみがＰＣＲ産物をもたらす場合、対象の腫瘍または癌は、ＰＩ３Ｋ−α変異アレルに体細胞変異を発現する。ＰＣＲ増幅条件を、用いる特異的なオリゴヌクレオチドプライマーもしくはオリゴヌクレオチドプローブ、スクリーニングされているＤＮＡもしくはＲＮＡの質および種類、ならびに当業者に周知の適切な試薬および／またはＰＣＲサイクリング条件を用いて制御することができる他の周知の変数に合わせる。
ＲＦＬＰアッセイ
本発明のいくつかの実施形態において、バリアント配列を、制限断片長多型アッセイ（ＲＦＬＰ）を用いて検出する。最初に、興味のある領域を、ＰＣＲを用いて単離する。次いで、このＰＣＲ産物を、特定の多型に関して特有の長さの断片が得られると知られる制限酵素で切断する。制限酵素消化ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動によって分離し、エチジウムブロマイド染色によって視覚化する。断片の長さを、分子量マーカーならびに野生型対照および変異体対照から作られる断片と比較する。
ダイレクトシーケンシングアッセイ
本発明のいくつかの実施形態において、バリアント配列を、ダイレクトシーケンシング技術を用いて検出する。これらのアッセイにおいて、最初に、ＤＮＡ試料を任意の適切な方法を用いて対象から単離する。いくつかの実施形態において、興味のある領域を適切なベクターにクローニングし、宿主細胞（例えば、細菌）内での増殖により増幅する。他の実施形態において、興味のある領域内のＤＮＡを、ＰＣＲを用いて増幅する。
増幅後、興味のある領域内のＤＮＡ（例えば、興味のあるＳＮＰまたは変異を含む領域）を、放射性マーカーヌクレオチドを用いる手動のシーケンシング法、または自動化されたシーケンシング法を含むがこれらに限定されない任意の適切な方法を用いてシーケンスする。シーケンシングの結果を、任意の適切な方法を用いて表示する。配列を調べ、特定のＳＮＰまたは変異の有無を判定する。
ＣＦＬＰアッセイ
他の実施形態において、バリアント配列を、ＣＬＥＡＶＡＳＥ断片長多型アッセイ（ＣＦＬＰ;Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、マディソン、ウィスコンシン州；例えば、米国特許第５，８４３，６５４号、同第５，８４３，６６９号、同第５，７１９，２０８号、および同第５，８８８，７８０号を参照されたい。これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）を用いて検出する。このアッセイは、一本鎖のＤＮＡがそれ自体の上で折り重なる場合に、それらは、そのＤＮＡ分子の正確な配列に対して個体差の大きい高次構造をとるという観察に基づく。これらの２次構造は、１本鎖領域が２本鎖ＤＮＡヘアピンと並置するような部分的に２本鎖のＤＮＡ領域を含む。ＣＬＥＡＶＡＳＥ Ｉ酵素は、１本鎖領域と２本鎖領域との間の接合部を認識し、切断する構造特異的な、熱安定性のヌクレアーゼである。最初に、興味のある領域を、例えば、ＰＣＲを用いて単離する。次いで、ＤＮＡ鎖を加熱により分離する。次に、反応物を冷却し、鎖内の２次構造の形成を可能にする。次いで、ＰＣＲ産物をＣＬＥＡＶＡＳＥ Ｉ酵素で処理し、特定のＳＮＰまたは変異に特有の一連の断片を作る。ＣＬＥＡＶＡＳＥ酵素によって処理したＰＣＲ産物を分離し、（例えば、アガロースゲル電気泳動によって）検出し、（例えば、エチジウムブロマイド染色によって）視覚化する。断片の長さを、分子量マーカーならびに野生型対照および変異体対照から作られる断片と比較する。
ハイブリダイゼーションアッセイ
本発明のいくつかの実施形態において、バリアント配列を、ハイブリダイゼーションアッセイにおけるハイブリダイゼーション分析によって検出する。ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、特定の変異の有無を、試料由来のＤＮＡが相補的なＤＮＡ分子（例えば、本明細書で説明した１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブ）にハイブリダイズする能力に基づいて判定する。ハイブリダイゼーションおよび検出のための様々な技術を用いる様々なハイブリダイゼーションアッセイが利用可能である。本発明の方法を実行するのに関連し、有用なハイブリダイゼーションアッセイを以下に提供する。
ハイブリダイゼーションの直接検出
いくつかの実施形態において、興味のある配列（例えば、ＳＮＰまたは変異）へのプローブのハイブリダイゼーションを、結合したプローブを視覚化することによって直接検出する（例えば、ノーザンアッセイまたはサザンアッセイ；例えば、Ａｕｓａｂｅｌ ｅｔ ａｌ.（編）（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ,Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ,ＮＹ参照）。これらのアッセイにおいて、ゲノムＤＮＡ（サザン）またはＲＮＡ（ノーザン）を、対象から単離する。次いで、このＤＮＡまたはＲＮＡを、アッセイされるマーカーのいずれかの近くではなく、まれにゲノム内を切断する一連の制限酵素で切断する。次いで、このＤＮＡまたはＲＮＡを（例えば、アガロースゲル上で）分離し、膜に移す。検出されるＳＮＰまたは変異に特異的な１つまたは複数の（例えば、放射性ヌクレオチドを取り込むことによって）標識したプローブを、ストリンジェンシーの低い条件下、中程度のストリンジェンシー条件下、もしくはストリンジェンシーの高い条件下で、膜に接触させる。非結合プローブを除去し、結合の存在を、標識プローブを視覚化することによって検出する。
「ＤＮＡチップ」アッセイを用いるハイブリダイゼーションの検出
本発明のいくつかの実施形態において、バリアント配列を、ＤＮＡチップハイブリダイゼーションアッセイを用いて検出する。このアッセイにおいて、一連のオリゴヌクレオチドプローブを、固体支持体に固定する。このオリゴヌクレオチドプローブは、特定のＳＮＰまたは変異に対して特有であるように設計する。興味のあるＤＮＡ試料を、このＤＮＡ「チップ」と接触させ、ハイブリダイゼーションを検出する。
いくつかの実施形態において、例示的で、市販されているＤＮＡチップアッセイには、ＧＥＮＥＣＨＩＰ（商標）（アフィメトリクス社、サンタクララ、カリフォルニア州、米国から市販されている）アッセイが含まれ得る（例えば、米国特許第６，０４５，９９６号、同第５，９２５，５２５号、および同第５，８５８，６５９号を参照されたく、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。ＧＥＮＥＣＨＩＰ（商標）技術は、「チップ」に固定されたオリゴヌクレオチドプローブの、小型化された高密度アレイを用いる。プローブアレイは、固相化学合成と半導体産業で用いられるフォトリソグラフィー製作技術（ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃ ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）とを組み合わせた、アフィメトリクス社の光指向（ｌｉｇｈｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）化学合成プロセスによって製造される。チップの露光部位を画定するために一連のフォトリソグラフィーマスクを用い、続いて、特有の化学合成ステップを用いるプロセスは、アレイの中の所定の位置にそれぞれのプローブを有するオリゴヌクレオチドの高密度アレイを構築する。多数のプローブアレイを、大きなガラスウエハー上で同時に合成する。次いで、これらのウエハーをダイスカットし、個々のプローブアレイを射出成形プラスチックカートリッジにパッケージする。これは、プローブアレイを環境から保護し、ハイブリダイゼーションのチャンバーとしての機能を果たす。
分析する核酸を単離し、ＰＣＲによって増幅し、蛍光レポーター群で標識する。次いで、この標識ＤＮＡを、ｆｌｕｉｄｉｃｓ ｓｔａｔｉｏｎを用いてアレイと共にインキュベートする。次いで、このアレイをスキャナーに挿入し、ハイブリダイゼーションパターンを検出する。ハイブリダイゼーションデータを、プローブアレイに結合した標的にすでに取り込まれた蛍光レポーター群から放たれる光として収集する。標的に完全にマッチするプローブは、一般に、ミスマッチを有するものよりも強いシグナルを生む。アレイ上のそれぞれのプローブの配列および位置は分かっているので、相補性により、プローブアレイに結合した標的核酸の強度を決定することができる。
ハイブリダイゼーションの酵素検出法
本発明のいくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションを、特定の構造の酵素的切断により検出することができる（ＩＮＶＡＤＥＲアレイ、Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、例えば、米国特許第５，８４６，７１７号、同第６，０９０，５４３号、同第６，００１，５６７号、同第５，９８５，５５７号、および同第５，９９４，０６９号を参照されたく、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。ＩＮＶＡＤＥＲアレイは、重なっているオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによって形成される複合体を切断するために、構造特異的酵素を用いることによって特異的なＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列を検出する。温度サイクルなしに、上昇した温度および過剰量のプローブのうちの１つにより、存在するそれぞれの標的配列に対して多数のプローブを切断することが可能になる。次いで、これらの切断されたプローブは、第２の標識プローブの切断を指示する。第２のプローブオリゴヌクレオチドは、内部色素によって消光されるフルオレセインで５’末端標識をすることができる。切断の際、脱消光されたフルオレセイン標識生成物を、標準的な蛍光プレートリーダーを用いて検出してもよい。ＩＮＶＡＤＥＲアッセイは、非増幅ゲノムＤＮＡの特異的変異を検出する。単離したＤＮＡ試料を、本発明の変異または野生型ＰＩ３Ｋ−α配列のいずれか一方に対して特異的な第１のプローブと接触させ、ハイブリダイズさせる。次いで、第１のプローブに対して特異的であり、かつフルオレセイン標識を含む第２のプローブをハイブリダイズさせ、酵素を添加する。結合を、蛍光プレートリーダーを用い、試験試料のシグナルと既知の陽性対照および陰性対照を比較することによって検出する。
いくつかの実施形態において、結合プローブのハイブリダイゼーションを、ＴａｑＭａｎアッセイ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、カリフォルニア州；例えば、米国特許第５，９６２，２３３号および同第５，５３８，８４８号を参照されたく、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。このアッセイは、ＰＣＲ反応中に行われる。ＴａｑＭａｎアッセイは、ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤ ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を利用する。所定のアレルまたは変異に特異的なプローブを、ＰＣＲ反応に含める。このプローブは、５’−レポーター色素（例えば、蛍光色素）および３’−消光剤色素を有するオリゴヌクレオチドからなる。ＰＣＲ中、プローブがその標的に結合すると、ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤポリメラーゼの５’−３’核酸分解活性が、レポーター色素と消光剤色素との間のプローブを切断する。レポーター色素を消光剤色素から分離すると、蛍光の増加がもたらされる。シグナルは、ＰＣＲのそれぞれのサイクルで蓄積し、蛍光光度計を用いて測定することができる。
本発明によると、上記の診断スクリーニングに必要な試薬を含む診断用キットも提供する。例えば、変異体ＰＩ３Ｋ−α関連ヌクレオチド配列および比較できる野生型ＰＩ３Ｋ−α関連ヌクレオチド配列の検出および／または増幅のために存在するオリゴヌクレオチドプローブまたはＰＣＲプライマーを含むキットを提供してもよい。再び、かかるプローブを、特異的ハイブリダイゼーションのより容易な検出のために標識してもよい。上記の様々な診断の実施形態にふさわしいように、かかるキットのオリゴヌクレオチドプローブを基質に固定化してもよく、適切な対照を提供してもよい。かかるオリゴヌクレオチドプローブの例として、配列番号３と４および配列番号６と７のうちの少なくとも１つを含む、またはそれらからなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＰＩ３Ｋαのアミノ酸配列における変異の有無の判定は、アミノ酸の配列解析のための任意の方法を用いて判定することができる。限定されない例として、対象の腫瘍のＰＩ３Ｋαのウエスタンブロット解析もしくはＥＬＩＳＡアッセイ、またはタンパクのダイレクトシーケンシング法が挙げられる。いくつかの実施形態において、特に有用な抗体は、野生型ＰＩ３Ｋ−α対変異体ＰＩ３Ｋ−αの選択性を有し、例えば、このアッセイに有用な抗体は、野生型ＰＩ３Ｋ−α、または野生型ＰＩ３Ｋαの一部には結合するが、興味のあるアミノ酸に変異を有するＰＩ３Ｋαには結合しない。特に有用な抗体は、１０４７位にヒスチジンを有する野生型ＰＩ３Ｋαには結合するが、アルギニンなどのヒスチジン以外のアミノ酸を有する変異体ＰＩ３Ｋαには結合しない抗体を含み、言い換えると、この抗体は、１０４７位にヒスチジンを含むエピトープに特異的に結合する。同様に、５４５位にグルタミン酸を有する野生型ＰＩ３Ｋαには結合するが、５４５位にリジンなどのグルタミン酸以外のアミノ酸を有する変異体ＰＩ３Ｋαには結合しない抗体が、特に有用である。
本発明の別の実施形態において、ＰＩ３Ｋαの変異型への結合と比較して、野生型ＰＩ３Ｋαタンパク質に選択的に結合する少なくとも１つの抗体の使用を含む方法を提供する。逆に、この抗体は、野生型ＰＩ３Ｋαタンパク質への結合と比較して、ＰＩ３Ｋαの変異型に選択的に結合し、野生型ＰＩ３ＫαとＰＩ３Ｋα−Ｈ１０４７Ｒとを区別するか、または野生型ＰＩ３ＫαとＰＩ３Ｋα−Ｅ５４５Ｋとを区別することができる。適切な量の標的タンパク質を比較的少量（１ｍｇ未満）の複合体混合物から単離する方法は、一般に、当業者に周知である。１つの例示的な実施形態において、対象の腫瘍または癌から１つまたは複数の腫瘍細胞を、プロテアーゼ阻害剤の存在下で、市販の溶解試薬を用いて溶解する。溶解物を除去し、上清を電気泳動し、変異特異的抗体を用いてウエスタンブロットを行うか、またはもう１つの方法として、変異ＰＩ３Ｋα−Ｈ１０４７ＲもしくはＰＩ３Ｋα−Ｅ５４５Ｋを選択的に免疫沈降させ、さらに、捕獲抗体から解離させ、ウエスタンブロットまたはタンパク質のダイレクトシーケンスを行う。
「抗体」には、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介して、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、脂質などの標的を認識し、特異的に結合する任意の免疫グロブリン分子が含まれる。本明細書で使用するとおり、この用語は、最も広い意味で使用され、抗体が所望の生物活性を示す限り、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、（Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびＦｖ断片などの）抗体断片、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）変異体、少なくとも２種類のインタクトな抗体から作製された二重特異性抗体などの多特異性抗体、抗体部分を含む融合タンパク質、ならびに抗原認識部位を含む任意の他の改変された免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、５つの主要クラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、またはそれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のいずれかであり得、これは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる免疫グロブリンの重鎖定常ドメインのアイデンティティーに基づいている。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる、周知のサブユニット構造および３次元配置を有する。抗体はネイキッドであるか、または毒素および放射性同位体などの他の分子に結合させることができる。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部を表し得る。抗体断片の例として、直鎖抗体、１本鎖抗体分子、ＦｃペプチドもしくはＦｃ’ペプチド、ＦａｂおよびＦａｂ断片、抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２種類以上に由来する抗体を表す。一般的に、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、所望の特異性、親和性、および能力を有する哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）のうちの１種類に由来する抗体の可変領域に相当するが、定常領域は、その種の免疫反応を引き起こすのを避けるために、別の種（一般に、ヒト）に由来する抗体の配列に相同性がある。
非ヒト（例えば、ウサギ）抗体の「ヒト化」型には、非ヒト免疫グロブリン由来の最小の配列を含むか、または全く含まないキメラ抗体が含まれる。大部分は、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変流域の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）または非ヒト霊長類の超可変領域の残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によって、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含み得る。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般的に２つの可変ドメインの実質的に全てを含み得、超可変ループの全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲ残基の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ残基である。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、一般的にヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含み得る。ヒト化抗体を作製するために用いられる方法は、免疫学および分子生物学の分野で公知である。
「ハイブリッド抗体」には、異なる抗原決定領域を有する抗体由来の重鎖および軽鎖の対を構築し、その結果、生じるテトラマーが、２つの異なるエピトープまたは２つの異なる抗原を認識し、結合することができる免疫グロブリン分子が含まれ得る。
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、本明細書で互換的に使用され、特定の抗体が認識し、特異的に結合することできる抗原の部分を表す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、隣接するアミノ酸およびタンパク質の３次元フォールディングにより並置される非隣接アミノ酸の両方から形成され得る。隣接アミノ酸から形成されるエピトープは、一般に、タンパク質変性時に保持されるが、３次元フォールディングにより形成されるエピトープは、一般に、タンパク質変性時に失われる。エピトープは、特有の空間構造内に、一般的に、少なくとも３〜５個、より一般的には、少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を含む。
エピトープに「特異的に結合する」または「特異的結合」を示すとは、抗体が、代替物質よりもエピトープとより高頻度に、かつ／またはより迅速に、かつ／またはより長い持続時間、かつ／またはより高い親和性で反応するか、または結合するということを意味する。
抗体の調製
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原およびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）注射または腹腔内（ｉｐ）注射により動物内で産生される。もう１つの方法として、抗原を、動物のリンパ節に直接注射してもよい（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ.,Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ,１６：３８１−３８９,１９９７参照）。改良された抗体反応を、免疫される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤に、二官能性薬剤または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）（システイン残基を介して結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸または当技術分野で公知の他の薬剤に、関連する抗原を結合させることによって得てもよい。
例えば、（マウスでは）このタンパク質または複合体１００μｇを、完全フロイントアジュバント３容積と組み合わせ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、動物を、抗原、免疫原性の複合体または誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、これらの動物に、複数部位における皮下注射によって、完全フロイントアジュバント中最初の量の１／５〜１／１０のペプチドまたは複合体を追加免疫する。追加免疫注射後７〜１４日目に、これらの動物から採血し、抗体力価について血清をアッセイする。力価がプラトーに達するまで、動物に追加免疫する。好ましくは、この動物に、同じ抗原であるが、異なる架橋試薬を介して結合させた複合体を追加免疫する。複合体は、タンパク質融合物として組換え細胞培養で作製することもできる。また、ミョウバンなどの凝集剤を、免疫反応を高めるように適切に用いる。
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体を、最初に、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ.,Ｎａｔｕｒｅ,２５６：４９５（１９７５）に記載されたハイブリドーマ法を用いるか、または組換えＤＮＡ法により作製することができる。ハイブリドーマ法においては、マウス、またはラット、ハムスターもしくはマカクザルなどの他の適切な宿主動物を免疫化し、免疫化に用いられるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生することができるリンパ球を誘発させる。もう１つの方法として、リンパ球をインビトロで免疫化してもよい。次いで、リンパ球を、ハイブリドーマ細胞を形成するために、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させる（Ｇｏｄｉｎｇ,Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ,ｐｐ.５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ,１９８６））。このように調製したハイブリドーマ細胞を、好ましくは、融合していない親骨髄腫細胞の成長もしくは生存を阻害する１つまたは複数の物質を含む適切な培地に播種し、成長させる。例えば、この親骨髄腫細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマ用の培地は、一般的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻止する。
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択される抗体産生細胞によって安定した高レベルの抗体産生を支援し、培地に感受性のある細胞である。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒトの骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトのヘテロ骨髄腫細胞株についても記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.,１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ.,Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ,ｐｐ.５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ,Ｉｎｃ.,Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ,１９８７））。例示的なマウス骨髄腫細胞株には、ソーク研究所細胞配布センター（Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ）、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国から入手可能なＭＯＰ−２１マウス腫瘍およびＭ.Ｃ.−１１マウス腫瘍、およびアメリカ培養細胞系統保存機関、ロックビル、メリーランド州、米国から入手可能なＳＰ−２細胞またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞由来のものが含まれる。ハイブリドーマ細胞が成長している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降、または放射免疫測定法（ＲＩＡ）もしくは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって判定する。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅまたはスキャッチャード解析（Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ.,Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.,１０７：２２０（１９８０））によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、および／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を特定した後、これらのクローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法によって成長させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ,Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ,ｐｐ.５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ,１９８６））。この目的に適する培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭＯ培地またはＲＰＭＩ １６４０培地が含まれる。さらに、これらのハイブリドーマ細胞を、動物の腹水腫瘍としてインビボで成長させることができる。サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体を、プロテインＡ−セファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって培地、腹水、または血清から適切に分離する。
組換え抗体産生
興味のある免疫グロブリンのアミノ酸配列を、タンパク質のダイレクトシーケンシングによって決定することができ、適切なコードヌクレオチド配列を、一般的なコドン表に従って設計することができる。
もう１つの方法として、従来の手順を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、ハイブリドーマ細胞からモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを単離し、シーケンスすることができる。配列決定は、一般に、興味のある遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部の単離を必要とする。一般に、これは、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡのクローニングを必要とする。クローニングを、標準的な技術を用いて行う（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ.（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ,Ｖｏｌｓ １−３,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、ポリＡ＋ｍＲＮＡ、好ましくは、膜結合ｍＲＮＡの逆転写により構築することができ、このライブラリーは、ヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に特異的なプローブを用いてスクリーニングすることができる。好ましい実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、興味のある免疫グロブリン遺伝子部分（例えば、軽鎖可変部分）をコードするｃＤＮＡ（または全長ｃＤＮＡの部分）を増幅する。増幅した配列を、任意の適切なベクター、例えば、発現ベクター、ミニ遺伝子ベクター、またはファージディスプレイベクターに容易にクローニングすることができる。興味のある免疫グロブリンポリペプチドの一部の配列を決定することが可能である限り、使用する特定のクローニング法が重大な意味をもつわけではないことを理解されたい。
クローニングおよびシーケンシングに用いられるＲＮＡの１つの供給源は、トランスジェニックマウスからＢ細胞を取得し、このＢ細胞を不死化細胞に融合することによって産生されるハイブリドーマである。ハイブリドーマを用いる利点は、容易にスクリーニングすることができ、かつ興味のあるヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することができることである。もう１つの方法として、ＲＮＡは、免疫動物のＢ細胞（または全脾臓）から単離することができる。ハイブリドーマ以外の供給源を用いる場合、特異的結合特性を有する免疫グロブリンまたは免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列をスクリーニングすることが望ましいこともある。かかるスクリーニングの１つの方法は、ファージディスプレイ法の使用である。ファージディスプレイは、例えば、ＤｏｗｅｒらのＷＯ９１／１７２７１、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらのＷＯ９２／０１０４７、およびＣａｔｏｎ ａｎｄ Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ,８７：６４５０−６４５４（１９９０）に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。ファージディスプレイ法を用いる一実施形態において、免疫化したトランスジェニックマウスのｃＤＮＡ（例えば、全脾臓ｃＤＮＡ）を単離し、ＰＣＲを用いて、免疫グロブリンポリペプチドの一部、例えば、ＣＤＲ領域をコードするｃＤＮＡ配列を増幅し、この増幅配列をファージベクターに挿入する。興味のあるペプチドをコードするｃＤＮＡ、例えば、所望の結合特性を有する可変領域ペプチドを、パニングなどの標準的な技術によって同定する。次いで、増幅またはクローニングされた核酸の配列を決定する。一般的に、免疫グロブリンポリペプチドの全可変領域をコードする配列が決定されるが、可変領域の一部、例えば、ＣＤＲをコードする部分のみをシーケンスする必要があることもある。一般的に、シーケンスされる部分は、少なくとも３０塩基長であり、可変領域の長さの少なくとも約１／３または少なくとも約１／２をコードする塩基がシーケンスされる場合が多い。シーケンシングは、ｃＤＮＡライブラリーから単離したクローンで行うか、またはＰＣＲを用いる場合、サブクローニング後に、増幅配列もしくは増幅部分の直接ＰＣＲシーケンシングによって行うことができる。シーケンシングを、標準的な技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ.（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ:Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ,Ｖｏｌｓ １−３,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、およびＳａｎｇｅｒ,Ｆ.ｅｔ ａｌ.（１９７７）Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ７４:５４６３−５４６７を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる）を用いて行う。クローニングした核酸の配列をヒト免疫グロブリン遺伝子およびｃＤＮＡの公表配列と比較することによって、技術者は、シーケンスされる領域に依存して、（ｉ）ハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチド（重鎖のアイソタイプを含む）の生殖細胞系列部分の使用、ならびに（ｉｉ）Ｎ−領域付加および体細胞変異のプロセスから生じる配列を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列を容易に決定することができる。免疫グロブリン遺伝子配列情報の１つの供給源は、（米国）国立衛生研究所（ベセスダ、メリーランド州）の国立医学図書館のバイオテクノロジー情報センターである。
単離した時点で、このＤＮＡを発現制御配列に作動可能に連結するか、または発現ベクター内に置くことができ、次いで、これを、そうでなければ、免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトし、これらの組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成を指示する。
発現制御配列は、特定の宿主生物における作動可能に連結されるコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に適する制御配列には、例えば、プロモーター、任意に、オペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、作動可能に連結される。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現させる場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結される。プロモーターまたはエンハンサーが配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結される。または、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置付けられる場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、作動可能に連結するとは、連結されるＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合には、隣接し、かつリーディング相（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、隣接している必要はない。都合の良い制限酵素部位でライゲーションすることによって、連結を行うことができる。かかる部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを、慣例に従って用いることができる。
細胞、細胞株、および細胞培養は、互換的に用いられる場合が多く、全てのかかる命名には子孫が含まれる。形質転換体および形質転換細胞には、トランスファーの数を問わず、形質転換体および形質転換細胞に由来する主要な対象細胞および培養物が含まれる。全子孫は、意図的な変異または偶発的な変異により、ＤＮＡ含有量が正確に同一ではない可能性があることも理解されるべきである。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされる場合と同じ機能または生物活性を有する変異体子孫が含まれる。
特異的抗体をコードし、任意に、宿主細胞に認識される制御配列に作動可能に連結された単離核酸、この核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに、この核酸が発現できるように宿主細胞を培養すること、任意に、宿主細胞培養物または培地から抗体を回収することを含み得る抗体産生の組換え技術も提供する。
様々なベクターが当技術分野で知られている。ベクター構成要素には、以下のもののうちの１つまたは複数が含まれ得る：（例えば、抗体の分泌を指示することができる）シグナル配列、複製開始点、（例えば、抗生物質耐性または他の薬剤耐性を与えるか、栄養要求性欠損を補完するか、または培地中で利用できない重要な栄養分を供給することができる）１つまたは複数の選択マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。これらの全ては、当技術分野で公知である。
適切な宿主細胞には、原核生物、酵母、またはより高等の真核生物の細胞が含まれる。適切な原核生物には、グラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば、大腸菌属、例えば、大腸菌などの腸内細菌科、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えば、ネズミチフス菌、セラチア属、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、赤痢菌、ならびに枯草菌およびＢ.ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなどのバチルス属、シュードモナス属、ストレプトマイセス属などの真正細菌が含まれる。原核生物に加えて、糸状菌または酵母菌などの真核微生物が、抗体をコードするベクターに適するクローニング宿主または発現宿主である。出芽酵母、または一般のパン酵母が、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に用いられている。しかし、ピキア属、例えば、Ｐ.ｐａｓｔｏｒｉｓ、分裂酵母；クリベロミセス属、ヤロウイア属；カンジダ属；トリコデルマ・リーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；スクワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などのスクワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）；ならびに例えば、アカパンカビ属、ペニシリウム属、トリポクラジウム属ならびに偽巣性コウジ菌およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス属の宿主などの糸状菌などの多数の他の属、種、および株が一般に利用可能である。
グリコシル化抗体の発現に適する宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例として、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および変異体、ならびにヨトウガ（イモムシ）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）、およびカイコなどの宿主由来の対応する許容的な昆虫宿主細胞が知られている。かかる細胞のトランスフェクションのための様々なウイルス株、例えば、キンウワバ科ＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコＮＰＶのＢｍ−５菌株が公的に入手可能である。
しかし、脊椎動物細胞に最も関心があり、培養液（組織培養液）における脊椎動物細胞の増殖が通例となっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例として、ＣＨＯＫＩ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）およびチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＤＸＢ−１１,ＤＧ−４４；Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ７７:４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣細胞；ＳＶ４０（ＣＯＳ−７,ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎細胞（懸濁培養で増殖させるためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、［Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ.３６：５９（１９７７）］）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ,ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４,Ｍａｔｈｅｒ,Ｂｉｏｌ.Ｒｅｐｒｏｄ.２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６,ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ,ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ,ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ,ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（ＷＩ３８,ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２,ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２,ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ.,Ａｎｎａｌｓ Ｎ.Ｙ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.３８３:４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ ５細胞およびＦＳ４細胞が挙げられる。
これらの宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ社）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ社）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ社）などの市販の培地が、これらの宿主細胞の培養に適する。さらに、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ.,Ｍｅｔｈ.Ｅｎｚ.５８：４４（１９７９）,Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ.,Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.１０２：２５５（１９８０）,米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；または同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０１０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国特許第３０，９８５号に記載の培地のいずれかを、これらの宿主細胞の培地として用いることができる。これらの培地のいずれにも、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮細胞増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム塩、マグネシウム塩、およびリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン．ＴＭ薬など）、（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）微量元素、およびグルコースまたは等価エネルギー供給源（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｅｎｅｒｇｙ ｓｏｕｒｃｅ）を補充することができる。任意の他の必要な栄養補助剤も、当業者に周知の適切な濃度で含めることができる。温度、およびｐＨなどの培地条件は、発現用に選択される宿主細胞と共に以前に用いられた条件であり、技術者に明らかである。
抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーもしくは陰イオン交換クロマトグラフィー、または好ましくは、アフィニティーリガンドとして興味のある抗原、プロテインＡもしくはプロテインＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができる。プロテインＡを用いて、ヒトガンマ１重鎖、ヒトガンマ２重鎖、またはヒトガンマ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.Ｍｅｔｈ.６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは、全てのマウスのアイソタイプおよびヒトガンマ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ.,２０ ＥＭＢＯ Ｊ.５：１５６７１５７５（１９８６））。アフィニティーリガンドが結合しているマトリクスは、アガロースである場合が最も多いが、他のマトリクスも利用できる。制御細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）またはポリ（スチレンジビニルベンゼン）などの機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成することができるものよりも速い流速および短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ.ＴＭ樹脂（Ｊ.Ｔ.Ｂａｋｅｒ,Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ,２５ ＮＪ.）は精製に有用である。エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、クロマト分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿法などの他のタンパク質精製技術も、特異的結合剤または回収される抗体に依存して、利用可能である。
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、本明細書で互換的に使用され、特定の抗体が認識し、特異的に結合することができる抗原の部分を表す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、隣接するアミノ酸およびタンパク質の３次元フォールディングにより並置される非隣接アミノ酸の両方から形成され得る。隣接アミノ酸から形成されるエピトープは、一般に、タンパク質変性時に保持されるが、３次元フォールディングにより形成されるエピトープは、一般に、タンパク質変性時に失われる。エピトープは、特有の空間構造内に、一般的に、少なくとも３〜５個、より一般的には、少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を含む。
エピトープに「特異的に結合する」または「特異的結合」を示すとは、抗体が、代替物質よりもエピトープとより高頻度に、かつ／またはより迅速に、かつ／またはより長い持続時間、かつ／またはより高い親和性で反応するか、または結合するということを意味する。
いくつかの実施形態において、上記に記載のアッセイおよび方法のうちの任意の１つまたは複数を用いて、腫瘍が、野生型ＰＩ３Ｋ−α対変異体ＰＩ３Ｋ−α、例えば、ＰＩ３Ｋ−α Ｅ５４５ＫまたはＰＩ３Ｋ−α Ｈ１０４７Ｒを持つか否かを決定するために、一度、対象の腫瘍が分析されると、その対象のために治療計画を準備することができる。その対象の腫瘍が１０４７位に変異を有するＰＩ３Ｋ−α（例えば、Ｈ１０４７Ｒ）を持つ場合、治療計画は、治療有効量のＰＩ３Ｋ−α選択的阻害化合物、もしくはデュアルＰＩ３Ｋ−α／ｍＴＯＲ選択的阻害剤、またはＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤とｍＴＯＲ選択的阻害剤の組み合わせをその対象に投与することを含む。対象の腫瘍が５４５位に変異を有するＰＩ３Ｋ−α（例えば、Ｅ５４５Ｋ）を持つ場合、治療計画は、治療有効量のＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤とＰＩ３Ｋ−β選択的阻害剤の組み合わせ、デュアルＰＩ３Ｋ−α／ｍＴＯＲ選択的阻害剤、またはＰＩ３Ｋ−α選択的阻害剤とｍＴＯＲ選択的阻害剤の組み合わせをその対象に投与することを含む。
別の実施形態において、本発明は、本発明の方法を実行するのに有用な材料を含むキットを提供する。本明細書に記載の診断／スクリーニング手順を、診断研究所、実験研究所、または開業医が行ってもよい。本発明は、これらの異なる設定で用いることができるキットを提供する。
本発明の方法に従って、対象の腫瘍または癌におけるＰＩ３Ｋ−α変異を同定するために必要な基本材料および試薬を、キットにまとめてもよい。特定の実施形態において、このキットは、本明細書に開示する対象の腫瘍から得られる核酸またはタンパク質における変異を特異的に検出する少なくとも１つのＰＩ３Ｋ−αアミノ酸配列決定試薬、および本発明の１つまたは複数の方法に従ってキットを使用するための取扱説明書を含む。各キットは、必ず、この手順に特異性を与える試薬を含む。したがって、ＰＩ３Ｋ−α Ｈ１０４７Ｒ変異またはＥ５４５Ｋ変異を持つｍＲＮＡを検出するために、この試薬は、例えば、ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドなどの、ｍＲＮＡに相補的な核酸プローブを含む。核酸プローブは、基質表面（例えば、マイクロアレイ）上に固定してもまたは固定しなくてもよい。少なくとも１つのＰＩ３Ｋ−α変異遺伝子がコードするポリペプチド産物を検出するために、この試薬は、変異ＰＩ３Ｋ−αまたは野生型ＰＩ３Ｋ−αに特異的に結合する抗体を含む。
手順に依存して、このキットは、さらに、抽出用緩衝液および／または試薬、増幅用緩衝液および／または試薬、ハイブリダイゼーション用緩衝液および／または試薬、免疫検出用緩衝液および／または試薬、標識用緩衝液および／または試薬、ならびに検出手段のうちの１つまたは複数を含んでもよい。この手順の異なるステップを実行するために、これらの緩衝液および試薬を使用するためのプロトコールも、このキットに含めてもよい。
試薬を、固体（例えば、凍結乾燥された）形態または液体形態で供給してもよい。本発明のキットは、任意に、それぞれ個々の緩衝液および／または試薬用の試料および／または試薬を混合するための１つまたは複数の容器（例えば、バイアル、アンプル、試験管、ＥＬＩＳＡプレート、培養プレート、フラスコもしくは瓶）を含んでもよい。それぞれの成分は、一般に、そのそれぞれの容器に分注されるか、または濃縮形態で提供されるのに適する。開示される方法のいくつかのステップを行うのに適する他の容器も提供してもよい。キットのそれぞれの容器は、好ましくは、委託販売用に密封して維持される。
特定の実施形態において、本発明のキットは、さらに対照試料を含む。例えば、キットは、対照として使用される、例えば、野生型ＰＩ３Ｋ−αのｍＲＮＡ、ＰＩ３Ｋ−α Ｈ１０４７ＲのｍＲＮＡまたはＰＩ３Ｋ−α Ｅ５４５ＫのｍＲＮＡなどの様々な生理状態の組織由来の全ｍＲＮＡの試料を含んでもよい。他の実施形態において、本発明は、比較の鋳型として使用するための、本明細書に記載の、少なくとも１つの前立腺疾患発現プロファイルマップを含む。好ましくは、この発現プロファイルは、コンピューターが読める媒体で保存されるデジタル情報である。
本発明の１つまたは複数の方法に従ってキットを使用するための取扱説明書は、前立腺組織試料を処理し、かつ／または試験を実行するための取扱説明書、結果を解釈するための取扱説明書、ならびに医薬品もしくはバイオ製品の製造、使用もしくは販売を規制する政府機関（例えば、ＦＤＡ）によって規定された形式の注意事項を含んでもよい。
代表的な化合物
本発明の化合物の構造および名前を表１に示す。表中のそれぞれの記入は、示される化合物、およびその単一立体異性体もしくは異性体の混合物、ならびにその薬学的に許容される塩を含むと意図される。本発明の化合物を、国際純正および応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）、国際生化学分子生物学連合（ＩＵＢＭＢ）、および化学情報検索サービス機関（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ （ＣＡＳ））によって承認された命名法の系統的適用に従って名付ける。具体的には、表１の名前は、ＡＣＤ／Ｌａｂｓネーミングソフトウェア８．００リリース、製品バージョン８．０８もしくはそれ以降を用いて作った。
一般的な投与
一態様において、本発明は、本発明に係るＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲの阻害剤および薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。いくつかの他の具体的な実施形態において、投与は、経口経路による。純粋な形態にあるか、または適切な医薬組成物中にある本発明の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩の投与は、一般的に認められた投与形式のいずれかまたは同様のユーティリティに役立つ薬剤により実行することができる。したがって、投与は、例えば、錠剤、座薬、丸薬、軟カプセル剤および硬ゼラチンカプセル、散剤、液剤、懸濁剤、もしくはエアロゾルなどの、固体、半固体、凍結乾燥粉末の形態か、または液体投薬形態、具体的に言うと、正確な投薬量の単回投与に適する単位剤形で、例えば、経口投与、経鼻投与、非経口（静脈、筋肉内、または皮下）投与、局所投与、経皮投与、膣内投与、膀胱内投与、大槽内投与、または直腸投与することができる。
組成物は、従来の医薬担体または賦形剤ならびに活性薬剤として本発明の化合物を含み、さらに、担体およびアジュバントなどを含んでもよい。
アジュバントには、保存剤、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、乳剤、および予製剤が含まれる。微生物作用の防止は、様々な抗菌性薬および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、およびソルビン酸などによって確実にすることができる。等張剤、例えば、糖類、および塩化ナトリウムなどを含むことも好ましい場合がある。注射可能な医薬品形態の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。
必要に応じて、本発明の医薬組成物は、例えば、クエン酸、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、ブチルヒドロキシトルエンなどの湿潤剤または乳剤、ｐＨ緩衝剤、および抗酸化剤などの最小量の補助物質も含んでもよい。
製剤の選択は、薬物投与（例えば、経口投与用、錠剤、丸剤またはカプセルの形態の製剤）および薬物原料の生物学的利用率などの様々な要因に依存する。表面積の増加、すなわち、粒径の減少によって生物学的利用率を増加させることができるという原則に基づき、特に、低い生物学的利用率を示す薬物の医薬製剤が近年開発された。例えば、米国特許第４，１０７，２８８号は、活性材料が架橋された巨大分子のマトリクスに担持され、粒径が１０〜１，０００ｎｍの範囲である医薬製剤について記載している。米国特許第５，１４５，６８４号は、薬物物質が表面改質剤の存在下でナノ粒子（平均粒径４００ｎｍ）に粉砕され、次いで、非常に高い生物学的利用率を示す医薬製剤を得るために液体培地に分散させた医薬製剤の生成について記載している。
注射剤に適する組成物は、生理的に許容される、無菌の水性溶液もしくは非水性溶液、分散剤、懸濁剤または乳剤、および無菌の注射可能な溶液もしくは分散剤で再構成するための無菌の散剤を含んでもよい。適切な水性および非水性の担体、希釈剤、溶剤またはビヒクルの例として、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびグリセロールなど）、それらの適切な混合物、（オリーブ油などの）植物油およびオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用すること、分散剤の場合には必要な粒径を維持すること、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。
１つの具体的な投与経路は、治療される疾患状態の重症度に従って調節することができる便利な１日投与計画を用いる経口投与である。
経口投与の固体剤形には、カプセル、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤が含まれる。かかる固体剤形において、活性化合物を、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムなどの少なくとも１つの不活性の普通の賦形剤（もしくは担体）または（ａ）充填剤もしくは増量剤、例えば、デンプン、乳糖、ショ糖、グルコール、マンニトール、およびケイ酸、（ｂ）結合剤、例えば、セルロース誘導体、デンプン、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖、およびアカシアゴム、（ｃ）湿潤剤、例えば、グリセロール、（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、クロスカルメロースナトリウム、ケイ酸塩複合体、および炭酸ナトリウム；（ｅ）遅延剤溶液、例えば、パラフィン；（ｆ）吸収促進剤、例えば、第４級アンモニウム化合物；（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコール、およびグリセロールモノステアレート、ステアリン酸マグネシウムなど；（ｈ）吸着剤、例えば、カオリンおよびベントナイト；ならびに（ｉ）潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体のポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、またはそれらの混合物と混合する。カプセル、錠剤、および丸剤の場合は、剤形は、緩衝剤も含んでもよい。
上記に記載の固体剤形は、腸溶コーティングおよび当技術分野で公知の他のものなどのコーティング剤およびシェルを用いて調製することができる。固体剤形は、鎮静剤（ｐａｃｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を含んでもよく、それらが遅延式で腸管の特定の部分に１つまたは複数の活性化合物を放出するような組成物でもあり得る。用いることができる包埋組成物の例として、重合物質およびワックスが挙げられる。活性化合物は、適切な場合、上述の賦形剤のうちの１つまたは複数を有するマイクロカプセル化形態でもあり得る。
経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容される乳剤、溶剤、懸濁剤、シロップ剤、およびエリキシル剤が含まれる。かかる剤形は、例えば、分散剤、本発明の化合物（複数可）、またはその薬学的に許容される塩、および任意の医薬アジュバントを、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、およびエタノールなどの担体；可溶化剤および乳剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジル安息香酸、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド；油類、特に、綿実油、ラッカセイ油、トモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル；またはこれらの物質の混合物などに溶解し、それによって溶液または懸濁液を形成することにより調製する。
この活性化合物に加えて、懸濁剤は、懸濁化剤、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｍｅｔａｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）、ベントナイト、寒天およびトラガカント、またはこれらの物質の混合物などを含んでもよい。
直腸投与用の組成物は、例えば、本発明の化合物と、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコールまたは座薬ワックスなどの適切な非刺激性の賦形剤または担体とを混合することによって調製することができる座薬であり、これは、常温で固体であるが、体温では液体であり、それ故に、適切な体腔中では融解し、そこで有効成分を放出する。
本発明の化合物の局所投与用の剤形には、軟膏剤、散剤、噴霧剤、および吸入剤が含まれる。この有効成分を、必要であれば、無菌条件下で、生理的に許容される担体および任意の防腐剤、緩衝剤、または噴霧剤と混合する。点眼用の製剤、眼軟膏剤、散剤、および溶剤も、本発明の範囲内にあると企図される。
圧縮ガスを用いて、エアロゾル形態に本発明の化合物を分散させてもよい。この目的に適する不活性ガスは、窒素、二酸化炭素などである。
一般に、目的の投与法に依存して、この薬学的に許容される組成物は、本発明の化合物（複数可）またはその薬学的に許容される塩を約１重量％〜約９９重量％、かつ適切な医薬品賦形剤を１重量％〜９９重量％含む。一例において、この組成物中の本発明の化合物（複数可）またはその薬学的に許容される塩は、約５重量％から約７５重量％の間であり、その残りは、適切な医薬品賦形剤である。
かかる剤形を調製するための実際の方法は、当業者に周知であるかまたは明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ,第１８版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、イーストン、ペンシルベニア州、１９９０）を参照されたい。投与される組成物は、いずれにしても、本発明の教示に従って疾患状態を治療するために、治療有効量の本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の化合物またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物は、使用される特定の化合物の活性、化合物の代謝安定性および作用時間、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食習慣、投与法および投与時間、排泄率、合剤、特定の疾患状態の重症度、および治療を受けているホストを含む様々な要因に依存して変化する治療有効量で投与する。本発明の化合物は、１日あたり約０．１〜約１，０００ｍｇの範囲の投与レベルで患者に投与することができる。約７０ｋｇの体重の健常なヒト成人については、１日あたり、体重１ｋｇあたり約０．０１〜約１００ｍｇの範囲の投与量が一例である。しかし、用いられる特定の投与量は変化し得る。例えば、投与量は、患者、治療される病状の重症度、および使用される化合物の薬理活性の要件を含む多くの要因に依存し得る。特定の患者に最適な投与量の決定は、当業者に周知である。
固定用量として製剤化する場合、かかる併用製品は、上記の投与量範囲内の本発明の化合物およびその承認された投与量範囲内の他の薬学的活性剤（複数可）を使用する。もう１つの方法として、本発明の化合物は、複合製剤が不適切である場合、薬学的に許容される薬剤（複数可）と共に、連続して用いてもよい。
一般的合成法
本発明の化合物を、以下に記載の合成手順によって作製することができる。これらの化合物を調製するのに用いる出発原料および試薬は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ.（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）、またはＢａｃｈｅｍ（トランス、カリフォルニア州）などの商業的供給業者から入手できるか、またはＦｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１〜１７巻（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ,１９９１）；Ｒｏｄｄ’ｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、１〜５巻および補足（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ,１９８９）；Ｏｒｇａｎｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、１〜４０巻（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ,１９９１）、Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、第４版）ならびにＬａｒｏｃｋ’ｓ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ.,１９８９）などの参考文献に記載の手順に従って、当業者に周知の方法によって調製する。これらの実施例は、本発明の化合物を合成することができるいくつかの方法のうちの単なる説明であり、これらの実施例への様々な変更は行うことができ、この開示を引用している当業者に提案される。この反応の出発原料および中間体は、必要に応じて、濾過、蒸留、結晶化、およびクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない従来の技術を用いて、単離および精製してもよい。かかる原料を、物理定数およびスペクトルデータを含む従来の手段を用いて特徴づけてもよい。
逆の意味を指定しない限り、本明細書に記載の反応は、大気圧および約−７８℃〜約１５０℃、より具体的には、約０℃〜約１２５℃の温度範囲にわたって、より具体的には、約室温（または周囲温度）、例えば、約２０℃で起こる。（水素化の場合のように）特に記載されない限り、全反応は、窒素雰囲気下で行われる。
プロドラッグは、当業者に周知の技術によって調製することができる。これらの技術は、一般に、所定の化合物の適切な官能基を修飾する。これらの修飾された官能基は、日常的な操作によってまたはインビボで最初の官能基を再生する。本発明の化合物のアミドおよびエステルは、従来の方法に従って調製してもよい。プロドラッグの徹底的な議論は、Ｔ.Ｈｉｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｖ.Ｓｔｅｌｌａ,“Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ,”ｔｈｅ Ａ.Ｃ.Ｓ.シンポジウムシリーズの１４巻、およびＢｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、Ｅｄｗａｒｄ Ｂ.Ｒｏｃｈｅ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９８７に提供されており、これらの両方は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩は、それらの構造中に非対称性炭素原子または４級化窒素原子を有していてもよい。本明細書に記載の合成を経て調製され得る本発明の化合物は、単一立体異性体、ラセミ体として、ならびにエナンチオマーおよびジアステレオマーの混合物として存在してもよい。これらの化合物は、幾何異性体としても存在し得る。全てのかかる単一立体異性体、ラセミ体およびそれらの混合物、ならびに幾何異性体は、本発明の範囲内にあると意図される。
本発明の化合物のいくつかは、活性ケトン−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３を含んでもよく、一部または全体において、−Ｃ（ＯＨ２）ＣＦ３型として存在してもよい。本化合物が−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３または−Ｃ（ＯＨ２）ＣＦ３型として描かれるか否かにかかわらず、両者は本発明の範囲内に含まれる。個々の化合物は、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３型として描かれてもよいが、当業者なら、本化合物が、一部または全体において、−Ｃ（ＯＨ２）ＣＦ３型として存在してもよいこと、かつこれらの２つの型の比率は、本化合物およびそれが存在する条件に依存して変化し得ることを理解するであろう。
本発明の化合物のいくつかは、互変異性体として存在してもよい。例えば、ケトンまたはアルデヒドが存在する場合は、この分子はエノール型で存在し得、アミドが存在する場合は、この分子は、イミド酸として存在し得、エナミンが存在する場合は、この分子は、イミンとして存在し得る。全てのかかる互変異性体は、本発明の範囲内である。
本発明には、本発明の化合物のＮ−オキシド誘導体および保護された誘導体も含まれる。例えば、本発明の化合物が、酸化できる窒素原子を含む場合、この窒素原子は当技術分野で公知の方法によってＮ−オキシドに変換することができる。本発明の化合物が、ヒドロキシ、カルボキシ、チオールなどの基または窒素原子（複数可）を含む任意の基を含む場合、これらの基は、適切な「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）」または「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐ）」で保護することができる。適切な保護基の総覧は、Ｔ.Ｗ.Ｇｒｅｅｎｅ,Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ,Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ,Ｉｎｃ.１９９１で見つけることができ、この開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明の化合物の保護誘導体は、当技術分野で公知の方法によって調製することができる。
立体異性体のラセミ混合物または非ラセミ混合物からの単一立体異性体の調製法ならびに／または分離法および単離法は、当技術分野で公知である。例えば、光学活性（Ｒ）−異性体および（Ｓ）−異性体は、キラルシントンまたはキラル試薬を用いて調製するか、または従来の技術を用いて分割してもよい。エナンチオマー（Ｒ−異性体およびＳ−異性体）は、当業者に周知の方法、例えば、結晶化によって分離できるジアステレオマーの塩もしくは複合体の形成；例えば、結晶化、エナンチオマー特異的試薬を用いる１つのエナンチオマーの選択反応、例えば、酵素的酸化または酵素的還元、その後の、修飾されたエナンチオマーおよび修飾されていないエナンチオマーの分離によって分離できるジアステレオマー誘導体の形成によって；またはキラル環境、例えば、結合したキラルリガンドを有するシリカなどのキラル支持体上もしくはキラル溶媒の存在下でのガス−液体クロマトグラフィーまたは液体クロマトグラフィーによって分割してもよい。所望のエナンチオマーが、上記の分離手順のうちの１つによって別の化学物質に変換される場合、所望のエナンチオマー型を遊離するさらなるステップが必要とされ得ることが理解される。もう１つの方法として、特異的エナンチオマーを、光学活性のある試薬、基質、触媒もしくは溶剤を用いる不斉合成か、または不斉変換による１つのエナンチオマーの他のエナンチオマーへの変換によって合成してもよい。特定のエナンチオマーに濃縮されたエナンチオマーの混合物については、主成分のエナンチオマーが、再結晶によってさらに濃縮され得る（収率の減少が同時に起こる）。
さらに、本発明の化合物は、水、およびエタノールなどの薬学的に許容される溶媒で非溶媒和形態ならびに溶媒和形態で存在することができる。一般に、溶媒和形態は、本発明の目的で、非溶媒和形態と同等であると考えられる。
本発明の化合物の調製の化学は、当業者に周知である。実際、本発明の化合物を調製するために、２つ以上のプロセスがあり得る。以下の実施例は、説明のためのものであり、本発明を限定するものではない。本明細書で引用する全ての参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。
合成の実施例
Ｎ−（５−ブロモ−２−クロロピリジン−３−イル）メタンスルホンアミド
ジクロロメタン（２５ｍＬ）中５−ブロモ−２−クロロピリジン−３−アミン（１．０ｇ、４．８ミリモル）およびジイソプロピルエチルアミン（１．８５ｍＬ、１０．６ミリモル）の溶液を０℃まで冷却し、次いで、塩化メタンスルホニル（７５０μＬ、９．６ミリモル）をゆっくり加えた。この反応混合物を、０℃で１５分間撹拌し、次いで室温まで温めた。２時間撹拌した後、水を加え、次いで、２相混合物に分けた。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空濃縮した。次いで、残留物をジオキサン（１０ｍＬ）および水（１０ｍＬ）に溶解した。炭酸カリウム（２．７６ｇ、２０ミリモル）を加え、反応混合物を室温で１５時間撹拌した。次いで、水をこの混合物に加え、その後、これを水性クエン酸（１０％）で酸性にした。この水性混合物を酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（勾配、酢酸エチル中１００％ヘキサンから５０％ヘキサン）で精製し、紅梅色固体としてＮ−（５−ブロモ−２−クロロピリジン−３−イル）メタンスルホンアミド（５２０ｍｇ、１．８２ミリモル、３８％収率）を得た。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ３）δ８．２７（ｄ,１Ｈ）,８．１４（ｄ,１Ｈ）,６．８３（ｂｒ ｓ,１Ｈ）,３．１１（ｓ,３Ｈ）；Ｃ６Ｈ６ＢｒＣｌＮ２Ｏ２ＳのＭＳ（ＥＩ）：２８５,２８７,２８９（Ｂｒ、Ｃｌ同位体パターン、ＭＨ＋）。
４−クロロ−５−イソプロピル−６−メチルピリミジン−２−アミン
ステップ１：
メタノール（１００ｍＬ）中エチル−２−イソプロピルアセトアセテート（２２．０ｇ,０．１８モル）および塩酸グアニジン（１８．０ｇ,０．１９モル）の溶液に、３０分かけて、滴下漏斗によりナトリウムメトキシド（０．３８モル、８６．４ｍＬ,２５％メタノール溶液）を０℃で加えた。この反応混合物を室温まで放置し、次いで、１８時間、５０℃まで加熱した。混合物を濃縮し、酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、６Ｎの水性塩酸でｐＨを６〜７に調整した。得られた固体を濾過し、水で洗浄した。濾液を濃縮し、濾過を繰り返し、固体の第２の収穫物を得た。合わせた固体を真空乾燥させ、淡黄色固体として２−アミノ−５−イソプロピル−６−メチルピリミジン−４（１Ｈ）−オン（１６．８ｇ,５６％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＤＭＳＯ−ｄ６）:δ１０.５（ｓ,１Ｈ）,６．１７（ｓ,２Ｈ）,２．８５（ｍ,１Ｈ）,２．０３（ｓ,３Ｈ）,１．１５（ｄ,６Ｈ）；Ｃ８Ｈ１３Ｎ３ＯのＭＳ（ＥＩ）：１６８．２（ＭＨ＋）。
ステップ２：
オキシ塩化リン（５０ｍＬ）中２−アミノ−５−イソプロピル−６−メチルピリミジン−４（１Ｈ）−オン（４．９３ｇ,２９．５ミリモル）の溶液を１８時間還流した。この反応混合物を濃縮し、酢酸エチルおよび水（それぞれ１０ｍＬ）の混合液で残留物を分けた。水相のｐＨが６〜７になるまで、２相混合物を固体の炭酸ナトリウムの添加により急冷した。水層を酢酸エチル（１００ｍＬで３回）で抽出し、合わせた有機溶液を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して、濃縮し、薄茶色固体として４−クロロ−５−イソプロピル−６−メチルピリミジン−２−アミンを得た（４．９２ｇ、９０％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ６．７１（ｓ,２Ｈ）,３．２６（ｍ,１Ｈ）,３．２５（ｓ,３Ｈ）,１．２１（ｄ,６Ｈ）;Ｃ８Ｈ１２ＣｌＮ３のＭＳ（ＥＩ）:１８６．１（ＭＨ＋）。
１，１−ジメチルエチル−７−ブロモ−２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾオキサゼピン−４（５Ｈ）−カルボキシレート
ステップ１：
市販の５−ブロモ−２−ヒドロキシベンズアルデヒド（４．０ｇ、１０ミリモル）および２−アミノエタノールを、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ（１００ｍＬ、１０：１）中で混合し、水素化ホウ素ナトリウム（０．７６ｇ、２．０ミリモル）を撹拌しながら加えた。得られた反応混合物を４０℃で４時間撹拌し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、次いで、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３（３０ｍＬ）で希釈した。この懸濁液に、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（２．８３ｇ、１３ミリモル）を加えた。この混合物を室温で一晩撹拌した。有機層を水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。その後、ヘキサンを粗反応生成物に加え、これは、白色固体の形成をもたらした。このスラリーを濾過し、白色個体としてｔｅｒｔ−ブチル−５−ブロモ−２−ヒドロキシベンジル（２−ヒドロキシエチル）カルバメート（６．８ｇ、９８％）を得た。Ｃ１４Ｈ２０ＢｒＮＯ４のＭＳ（ＥＩ）は３４６（ＭＨ＋）であった。
ステップ２：
ｔｅｒｔ−ブチル−５−ブロモ−２−ヒドロキシベンジル（２−ヒドロキシエチル）カルバメート（３．４６ｇ、１０ミリモル）およびトリフェニルホスフィン（３．９６ｇ、１５ミリモル）をＤＣＭ（１００ｍＬ）中で混合し、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（３．０３ｇ、１５ミリモル）を加えた。得られた反応混合物を室温で１２時間撹拌した。この反応混合物を水で洗浄し、乾燥させ、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、８：２のヘキサン／酢酸エチルで溶出し、白色固体として所望の生成物を得た（１．７４ｇ、５３％）。Ｃ１４Ｈ１８ＢｒＮＯ３のＭＳ（ＥＩ）は、３２８（ＭＨ＋）であった。
（４−｛[（１，１−ジメチルエチル）オキシ]カルボニル｝−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾオキサゼピン−７−イル）ボロン酸
ステップ１：
ＴＨＦ（３００ｍＬ）中１，１−ジメチルエチル−７−ブロモ−２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾオキサゼピン−４（５Ｈ）−カルボキシレート（３０．０ｇ、９１．４ミリモル）およびトリイソプロピルボレート（２２．４ｇ、１１９ミリモル）の溶液を−７８℃まで冷却し、この温度でヘキサン中２．５Ｍのｎ−ブチルリチウム溶液（４７．６ｍＬ、１１９ミリモル）を４０分かけて滴加した。この反応混合物を−７８℃でさらに３０分間撹拌し、次いで、２Ｎの塩酸（８０ｍｌ）を滴加することによって急冷し、室温まで温めた。酢酸エチル（１００ｍＬ）および水（１００ｍＬ）を加え、有機層を分離し、水層を酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。ヘキサン（２００ｍＬ）をこの残留物に加え、混合物を一晩撹拌した。沈殿を濾過し、ヘキサンで数回洗浄し、乾燥させ、無色の固体として（４−｛[（１，１−ジメチルエチル）オキシ]カルボニル｝−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾオキサゼピン−７−イル）ボロン酸（２３．４ｇ、８７％）を得た。Ｃ１４Ｈ２０ＢＮＯ５のＭＳ（ＥＩ）：２９４（ＭＨ＋）。
実施例１
Ｎ−（５−｛４−［２−アミノ−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝−２−クロロピリジン−３−イル）メタンスルホンアミド
ステップ１：
ジオキサン（１．５ｍＬ）および水（３７５μＬ）中（４−｛[（１，１−ジメチルエチル）オキシ]カルボニル｝−２，３，４，５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾオキサゼピン−７−イル）ボロン酸（３００ｍｇ、１．０２ミリモル）、Ｎ−（５−ブロモ−２−クロロ−３−ピリジニル）メタンスルホンアミド（２９２ｍｇ、１．０２ミリモル）、炭酸カリウム（２８２ｍｇ、２．０４ミリモル）、１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン−パラジウム（ＩＩ）ジクロライドジクロロメタン錯体（４２ｍｇ、０．０５１ミリモル）の混合物に、窒素ガスを２分間散布した。次いで、この混合物を、１１０℃で１５分間、マイクロ波反応器中で加熱した。得られた混合物を酢酸エチルで希釈し、次いで、セライトに通して濾過した。濾液を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空濃縮した。残留物を、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル１：１）により精製し、黄色の泡として１，１−ジメチルエチル−７−｛６−クロロ−５−[（メチルスルホニル）アミノ]ピリジン−３−イル｝−２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾオキサゼピン−４（５Ｈ）−カルボキシレート（４００ｍｇ、０．８８ミリモル、８６％収率）を得た。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．８５（ｓ,１Ｈ）,８．５５（ｓ,１Ｈ）,８．０４（ｄ,１Ｈ）,７．７４−７．４０（ｍ,２Ｈ）,７．２２−６．９６（ｍ,１Ｈ）,４．６３−４．４２（ｍ,２Ｈ）,４．２２−３．９２（ｍ,２Ｈ）,３.８８−３．５１（ｍ,２Ｈ）,３．１６（ｓ,３Ｈ）,１．４０−１．２５（ｍ,９Ｈ）；Ｃ２０Ｈ２４ＣｌＮ３Ｏ５ＳのＭＳ（ＥＩ）:４５４（ＭＨ＋）。
ステップ２：
メタノール（５ｍＬ）中１，１−ジメチルエチル−７−｛６−クロロ−５−［（メチルスルホニル）アミノ］ピリジン−３−イル｝−２,３−ジヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−４（５Ｈ）−カルボキシレート（４００ｍｇ、０．８８ミリモル）の溶液に、ジオキサン中塩化水素（４Ｍ、２．２ｍＬ、８．８ミリモル）を加え、得られた溶液を、２５分間６０℃まで加熱した。室温まで冷却した後、揮発性材料を真空除去して、定量的収率のＮ−［２−クロロ−５−（２，３，４，５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル）−３−ピリジニル］−メタンスルホンアミドジヒドロクロライド塩を得た。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．９２（ｓ,１Ｈ）,９．５２（ｂｒ ｓ,２Ｈ）,８．５９（ｄ,１Ｈ）,８．０７（ｄ,１Ｈ）,７．９１（ｄ,１Ｈ）,７．７５（ｄｄ,１Ｈ）,７．２３（ｄ,１Ｈ）,４．４８−４．３５（ｍ,２Ｈ）,４.２６（ｓ,２Ｈ）,３．５５−３．４６（ｍ,２Ｈ）,３．１８（ｓ,３Ｈ）。Ｃ１５Ｈ１６ＣｌＮ３Ｏ３Ｓの（ＥＩ）：３５４（ＭＨ＋）。
ステップ３：
ＮＭＰ（５００μＬ）中Ｎ−［２−クロロ−５−（２，３，４，５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル）−３−ピリジニル］−メタンスルホンアミドジヒドロクロライド塩（１００ｍｇ、０．２３ミリモル）、４−クロロ−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−２−アミン（４４ｍｇ、０．２３ミリモル）、およびジイソプロピルエチルアミン（１６０μＬ、０．９２ミリモル）の溶液を３．５時間１２０℃まで加熱し、次いで、室温まで冷却した。次いで、水を加え、得られた水性混合物を酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機抽出物を１０％塩化リチウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して、真空濃縮した。残留物を、分取ＨＰＬＣにより精製し、淡黄色固体としてＮ−（５−｛４−［２−アミノ−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝−２−クロロピリジン−３−イル）メタンスルホンアミド（２９．７ｍｇ、０．０５９ミリモル、２６％収率）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．９６（ｂｒ ｓ,１Ｈ）,８．５０（ｓ,１Ｈ）,８．０２（ｄ,１Ｈ）,７．６２−７．５６（ｍ,２Ｈ）,７．１２（ｄ,１Ｈ）,６．０９（ｓ,２Ｈ）,４．３２（ｓ,２Ｈ）,４．３０−４．２３（ｍ,２Ｈ）,３．６０−３．５２（ｍ,２Ｈ）,３．１９−３．０９（ｍ,４Ｈ）,２．３０（ｓ,３Ｈ）,１．２４（ｄ,６Ｈ）；Ｃ２３Ｈ２７ＣｌＮ６Ｏ３ＳのＭＳ（ＥＩ）：５０３（ＭＨ＋）。
実施例２
２−アミノ−５−｛４−［２−アミノ−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝ピリジン−３−スルホンアミド
ステップ１：
ジオキサン（１．８ｍＬ）および水（４５０μＬ）中（４−｛［（１，１−ジメチルエチル）オキシ］カルボニル｝−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル）ボロン酸（２９３ｍｇ、１．０ミリモル）、２−アミノ−５−ブロモ−３−ピリジンスルホンアミド（２５２ｍｇ、１．０ミリモル）、炭酸カリウム（２７６ｍｇ、２．０ミリモル）、１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン−パラジウム（ＩＩ）ジクロライドジクロロメタン錯体（４１ｍｇ、０．０５ミリモル）の混合物を、マイクロ波反応器中で、４５分間１１０℃で加熱した。次いで、この混合物を水で希釈し、酢酸エチルで３回抽出した。有機抽出物を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して、真空濃縮した。残留物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（勾配１００％ヘキサンから７０％酢酸エチル：３０％ヘキサン）により精製し、黄色固体として１，１−ジメチルエチル−７−［６−アミノ−５−（アミノスルホニル）ピリジン−３−イル］−２,３−ジヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−４（５Ｈ）−カルボキシレート（２７０ｍｇ、０．６４ミリモル、６４％収率）を得た。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ３）δ８．４８−８．３７（ｍ,１Ｈ）,８．２６−８．１７（ｍ,１Ｈ）,７．４９−７．２８（ｍ,２Ｈ）,７．１４−７．０１（ｍ,１Ｈ）,５．７９−５．６３（ｍ,２Ｈ）,５．５７−５．２３（ｍ,２Ｈ）,４．４９（ｄ,２Ｈ）,４．１１−４．０３（ｍ,２Ｈ）,３．８８−３．７４（ｍ,２Ｈ）,１．４９−１．３２（ｍ,９Ｈ）；Ｃ１９Ｈ２４Ｎ４Ｏ５ＳのＭＳ（ＥＩ）：４２１（ＭＨ＋）。
ステップ２：
メタノール（３．５ｍＬ）中１，１−ジメチルエチル−７−［６−アミノ−５−（アミノスルホニル）ピリジン−３−イル］−２,３−ジヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−４（５Ｈ）−カルボキシレート（２７０ｍｇ、０．６４ミリモル）の溶液に、ジオキサン中の塩酸（４Ｍ、１．６ｍＬ、６．４ミリモル）を加え、得られた溶液を１時間６０℃まで加熱した。室温まで冷却した後、揮発性材料を真空除去し、定量的収率の２−アミノ−５−（２，３，４，５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル）ピリジン−３−スルホンアミドジヒドロクロライド塩を得た。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．３１（ｂｒ ｓ,２Ｈ）,８．５１（ｄ,１Ｈ）,８．１３（ｄ,１Ｈ）,７．７４（ｓ,１Ｈ）,７．６０（ｄｄ,１Ｈ）,７．５６（ｓ,２Ｈ）,７．１７（ｄ,１Ｈ）,６．７１（ｂｒ ｓ,２Ｈ）,４.４４−４．３５（ｍ,２Ｈ）,４．２７−４．１８（ｍ,２Ｈ）,３．５０（ｓ,２Ｈ）；Ｃ１４Ｈ１６Ｎ４Ｏ３ＳのＭＳ（ＥＩ）：３２１（ＭＨ＋）。
ステップ３：
ＮＭＰ（３ｍＬ）中２−アミノ−５−（２，３，４，５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル）ピリジン−３−スルホンアミドジヒドロクロライド塩（２５２ｍｇ、０．６４ミリモル）、４−クロロ−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−２−アミン（１１９ｍｇ、０．６４ミリモル）、およびジイソプロピルエチルアミン（５５７μＬ、３．２ミリモル）の溶液を１６時間１２０℃まで加熱し、次いで、室温まで冷却した。次いで、水を加え、得られた水性混合物を酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空濃縮した。残留物を分取逆相ＨＰＬＣにより精製し、淡黄色固体として２−アミノ−５−｛４−［２−アミノ−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝ピリジン−３−スルホンアミド（５５．９ｍｇ、０．１１９ミリモル、１９％収率）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．４６（ｄ,１Ｈ）,８．０７（ｄ,１Ｈ）,７．５２（ｓ,２Ｈ）,７．４８−７．３９（ｍ,２Ｈ）,７．０７（ｄ,１Ｈ）,６．６２（ｂｒ ｓ,２Ｈ）,６．０１（ｓ,２Ｈ）,４．２９−４．１９（ｍ,４Ｈ）,３．５６−３．４７（ｍ,２Ｈ）,３．２４−３．１０（ｍ,１Ｈ）,２．２９（ｓ,３Ｈ）,１．２４（ｄ,６Ｈ）；Ｃ２２Ｈ２７Ｎ７Ｏ３ＳのＭＳ（ＥＩ）：４７０（ＭＨ＋）。
ステップ１および／またはステップ３で別の出発試薬を用いて、実施例１の手順に従い、以下の本発明の化合物を調製した：
Ｎ−（５−｛４−［２−アミノ−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝ピリジン−３−イル）メタンスルホンアミド
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．５７（ｄ,１Ｈ）,８．３６（ｄ,１Ｈ）,７．７７（ｔ,１Ｈ）,７．５８−７．４９（ｍ,２Ｈ）,７．１２（ｄ,１Ｈ）,６．０１（ｓ,２Ｈ）,４．３３−４．２０（ｍ,４Ｈ）,３．５８−３．５０（ｍ,２Ｈ）,３．２４−３．１２（ｍ,１Ｈ）,３．１０（ｓ,３Ｈ）,２．２９（ｓ,３Ｈ）,１．２５（ｄ,６Ｈ）；Ｃ２３Ｈ２８Ｎ６Ｏ３ＳのＭＳ（ＥＩ）：４６９（ＭＨ+)。
Ｎ−［５−｛４−［２−アミノ−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝−２−（メチルオキシ）ピリジン−３−イル］メタンスルホンアミド
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．３３（ｓ,１Ｈ）,８．２４（ｄ,１Ｈ）,７．８３（ｄ,１Ｈ）,７．５４−７．４３（ｍ,２Ｈ）,７．０９（ｄ,１Ｈ）,６．０１（ｓ,２Ｈ）,４．２９−４．１７（ｍ,４Ｈ）,３．９５（ｓ,３Ｈ）,３.５８−３．４９（ｍ,２Ｈ）,３．２５−３．１３（ｍ,１Ｈ）,３．０７（ｓ,３Ｈ）,２．３０（ｓ,３Ｈ）,１．２５（ｄ,６Ｈ）；Ｃ２４Ｈ３０Ｎ６Ｏ４ＳのＭＳ（ＥＩ）：４９９（ＭＨ＋）。
Ｎ−｛５−［４−（２−アミノ−６,６−ジメチル−５,６,７,８−テトラヒドロキナゾリン−４−イル）−２,３,４,５−テトラヒドロ−１，４−ベンゾオキサゼピン−７−イル］−２−クロロピリジン−３−イル｝メタンスルホンアミド
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１０．０７（ｂｒ ｓ,１Ｈ）,８．４５（ｓ,１Ｈ）,７．９９（ｄ,１Ｈ）,７．６７（ｄ,１Ｈ）,７．５４（ｄｄ,１Ｈ）,７．０８（ｄ,１Ｈ）,５．９９（ｂｒ ｓ,２Ｈ）,４．５７（ｓ,２Ｈ）,４.３４−４．２４（ｍ,２Ｈ）,３．８３−３．６７（ｍ,２Ｈ）,３．０９（ｓ,３Ｈ）,２．５４−２．４６（ｍ,２Ｈ）,２．２９（ｓ,２Ｈ）,１．５１（ｔ,２Ｈ）,０.８３（ｄ,６Ｈ）；Ｃ２５Ｈ２９ＣｌＮ６Ｏ３ＳのＭＳ（ＥＩ）：５２９（ＭＨ＋）。
Ｎ−（２−クロロ−５−｛４−［２−｛［（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］メチル｝−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３，４，５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝ピリジン−３−イル）メタンスルホンアミド
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤ３ＯＤ）δ８．４５（ｄ,１Ｈ）,８．１６（ｄ,１Ｈ）,７．５９（ｄ,１Ｈ）,７．５１（ｄｄ,１Ｈ）,７．０７（ｄ,１Ｈ）,５.８３（ｔｔ,１Ｈ）,４．６３（ｓ,２Ｈ）,４．３６（ｔ,２Ｈ）,３．８５（ｔ,２Ｈ）,３．７４（ｓ,２Ｈ）,３．３５（ｍ,１Ｈ）,３．０９（ｓ,３Ｈ）,２.８３（ｔｄ,２Ｈ）,２．５３（ｓ,３Ｈ）,１．３９（ｄ,６Ｈ）；Ｃ２６Ｈ３１ＣｌＦ２Ｎ６Ｏ３ＳのＭＳ（ＥＳ）：５８１（ＭＨ＋）。
Ｎ−［２−クロロ−５−（４−｛２−［（ジメチルアミノ）メチル］−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル｝−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル）ピリジン−３−イル］メタンスルホンアミド
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤ３ＯＤδ８．５０（ｄ,１Ｈ）,８．１９（ｄ,１Ｈ),７．７０（ｓ,１Ｈ）,７．５５（ｄｄ,１Ｈ）,７．０７（ｄ,１Ｈ）,４．９６（ｓ,２Ｈ）,４．４８（ｔ,２Ｈ）,４．４０（ｓ,２Ｈ）,４．０４（ｔ,２Ｈ）,３．２７（ｍ,１Ｈ）,３．１２（ｓ,３Ｈ）,２．８７（ｓ,６Ｈ）,２．６２（ｓ,３Ｈ）,１．４３（ｄ,６Ｈ）；Ｃ２６Ｈ３３ＣｌＮ６Ｏ３ＳのＭＳ（ＥＳ）：５４５（ＭＨ＋）。
生物学的実施例
本発明の化合物は、ＰＩ３Ｋ−α、ｍＴＯＲまたはその両方に対して活性を有する。本発明の化合物を、生物学的実施例１および生物学的実施例３に記載のアッセイを用いて試験し、これらは、ＰＩ３Ｋ−α、ｍＴＯＲまたはその両方の阻害剤であると決定した。
ＰＩ３Ｋ、ｍＴＯＲｃ１、およびｍＴＯＲｃ２の活性および化合物によるその阻害を測定するのに適するインビトロアッセイは、当技術分野で公知である。生物学的実施例の実施例１、実施例２および実施例３では、ＰＩ３Ｋ活性およびｍＴＯＲ活性を測定するインビトロアッセイについて説明する。癌治療におけるインビトロの有効性を測定するための細胞ベースのアッセイは、当技術分野で公知である。生物学的実施例の実施例５および実施例６では、インビトロ細胞活性を測定するアッセイについて説明する。癌に適するインビボモデルは、当業者に周知である。生物学的な実施例７、実施例８、実施例９、実施例１０、実施例１１、実施例１２、および実施例１３では、前立腺腺癌、グリア芽腫、肺癌、および黒色腫のインビボモデルについて説明する。本明細書に開示する実施例および当技術分野で開示される実施例に従って、当業者は、本発明の化合物のＰＩ３Ｋ−阻害活性および／またはｍＴＯＲ−阻害活性を決定することができる。
したがって、式Ｉの化合物は、疾患、特に、癌を治療するのに有用であり、その際、ＰＩ３Ｋ−α、ｍＴＯＲ、またはその両方に対する活性は、疾患の病理学および／または症候学に寄与する。例えば、ＰＩ３Ｋ−α、ｍＴＯＲ、またはその両方に対する活性が、その病理学および／または症候学に寄与する癌には、乳癌、マントル細胞リンパ腫、腎細胞癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ＮＰＭ／ＡＬＫ形質転換未分化大細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、横紋筋肉腫、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腺癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、肝細胞癌、黒色腫、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、未分化大細胞リンパ腫、血管腫、グリア芽腫、または頭頸部癌が含まれる。
生物学的実施例１
ｍＴＯＲ／ＧｂＬ／Ｒａｐｔｏｒ（ｍＴＯＲＣ１）ＥＬＩＳＡアッセイ
ｍＴＯＲＣ１酵素活性の測定を、４Ｅ−ＢＰ１タンパク質のリン酸化の後に、ＥＬＩＳＡアッセイ形式で行った。全ての実験を３８４ウェル形式で行った。一般に、ＤＭＳＯ０．５μＬを含む様々な濃度の試験化合物を、酵素溶液１５μＬと混合した。キナーゼ反応を、基質含有溶液１５μＬの添加により開始した。アッセイ条件は、以下のとおりであった：２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．２、１ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、０．０２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．０１％のＣＨＡＰＳ、５０ｍＭのβ−グリセロリン酸中０．２ｎＭのｍＴＯＲＣ１、１０μＭのＡＴＰおよび５０ｎＭのＮＨｉｓタグ付き４Ｅ−ＢＰ１。周囲温度で１２０分間のインキュベーションの後、反応体積２０μＬを、Ｎｉキレートコーティング３８４ウェルプレートに移した。４Ｅ−ＢＰ１タンパク質の結合ステップを６０分間継続し、その後、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水溶液（ＴＢＳ）５０μＬでそれぞれ４回洗浄した。５％ＢＳＡ−ＴＢＳＴ（ＴＢＳ中０．２％のＴｗｅｅｎ−２０）中の抗−リン−４Ｅ−ＢＰ１ウサギ−ＩｇＧ（２０μＬ、１：５０００）を添加し、さらに６０分間インキュベートした。２次ＨＲＰ−タグ付き抗−ＩｇＧでのインキュベーションは、１次抗体を洗い流した後に同様に行った（５０μＬで４回洗浄）。ＴＢＳＴでの最終洗浄ステップの後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｆｅｍｔｏ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）２０μＬを加え、発光を、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーを用いて測定した。
このアッセイにより、本発明の化合物は、好ましくは、約０．０００１ｎＭから２５００ｎＭの間のｍＴＯＲ−阻害活性（ＩＣ５０）を有する。別の実施形態において、本発明の化合物は、約０．００１ｎＭから５００ｎＭの間のｍＴＯＲ−阻害活性を有する。別の実施形態において、本発明の化合物は、約０．００１ｎＭから２５０ｎＭの間のｍＴＯＲ−阻害活性を有する。別の実施形態において、本発明の化合物は、０．００１ｎＭおよび１００ｎＭのｍＴＯＲ−阻害活性を有する。別の実施形態において、本発明の化合物は、０．１ｎＭおよび７５ｎＭのｍＴＯＲ−阻害活性を有する。
このアッセイにより、表１の化合物１〜５および化合物１８ならびに化合物１９は、１００ｎＭ未満のｍＴＯＲ−阻害活性を有していた。
生物学的実施例２
免疫複合体ｍＴＯＲＣ２キナーゼ（ｍＴＯＲＣ２ ＩＰ−キナーゼ）アッセイ
ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ）細胞を、懸濁培養で増殖させ、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１２０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭのβ−グリセロリン酸塩、１０ｍＭのＮａＦ、１０ｍＭのＮａＮ３、プロテアーゼ阻害剤１錠（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ−Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡフリー、Ｒｏｃｈｅ社）、０．３％のコラミドプロピルジメチルアンモニオプロパンスルホネート（ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳ）、１ｍＭのＡＥＢＳＦ、０．５ｍＭのベンズアミジンＨＣｌ、２０μｇ／ｍＬのヘパリン、および１．５ｍＭのＮａ３ＶＯ４を含む氷冷溶解緩衝液に溶解する。ｍＴＯＲＣ２錯体を、２時間、抗ＲＩＣＴＯＲ抗体で免疫沈降する。免疫複合体をプロテインＡセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、１７−５２８０−０１）で固定化し、洗浄緩衝液（４０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１２０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのβ−グリセロリン酸塩、０．３％のＣＨＡＰＳ、１ｍＭのＡＥＢＳＦ、２０μｇ／ｍＬのヘパリン、１．５ｍＭのＮａ３ＶＯ４、およびＣｏｍｐｌｅｔｅ−Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡフリー）で連続３回洗浄し、キナーゼ緩衝液（４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１２０ｍＭのＮａＣｌ、０．３％のＣＨＡＰＳ、２０μｇ／ｍＬのヘパリン、４ｍＭのＭｇＣｌ２、４ｍＭのＭｎＣｌ２、１０％グリセロール、および１０ｍＭのＤＴＴ）に再懸濁する。（１×１０７細胞に等しい）これらの免疫複合体を、５分間３７℃で試験化合物または０．６％ＤＭＳＯとプレインキュベートし、次いで、キナーゼ緩衝液、ＡＴＰ５０μＭ、および全長の脱リン酸化ＡＫＴ１を０．７５μｇ含む最終容積３３μＬ（総容積５μＬを含む）で８分間キナーゼ反応を行う。キナーゼ反応を、２０％β−メルカプトエタノールを含む４×ＳＤＳ試料緩衝液１１μＬの添加により終了し、１０％トリスグリシンゲルで分離した。このゲルを、５０Ｖ、２０時間、４℃でＰＶＤＦ膜に移す。これらの膜を、ＴＢＳＴ中脂肪を含まない５％ミルクで1時間ブロッキングし、３％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中１／１０００希釈したウサギ抗ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、４０６０）と４℃で一晩インキュベートする。これらの膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、脂肪を含まない５％ミルク／ＴＢＳＴ中１／１００００希釈した２次ヤギ抗ウサギＨＲＰ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、２１２５）と１時間インキュベートする。シグナルを、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ−プラスを用いて検出する。スキャンデータを、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて解析する。試験化合物のＩＣ５０を、ＸＬｆｉｔ４ソフトウェアを用いて、ＤＭＳＯ処理試料と比較して決定する。
生物学的実施例３
ｐＳ６（Ｓ２４０／２４４）ＥＬＩＳＡアッセイ
ＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣ）を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、３９０４）に、１０％ＦＢＳ（Ｃｅｌｌｇｒｏ社）、１％ＮＥＡＡ（Ｃｅｌｌｇｒｏ社）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｃｅｌｌｇｒｏ社）を含むＤＭＥＭ（Ｃｅｌｌｇｒｏ社）中、１ウェルあたり２４０００細胞で播種した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートし、増殖培地を、血清を含まないＤＭＥＭまたは０．４％ＢＳＡを含む培地と交換した。０．３％ＤＭＳＯ（ビヒクル）で段階希釈した試験化合物をこれらの細胞に加え、３時間インキュベートした。これらの細胞を固定し、培地を除去し、ＴＢＳ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ）中４％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｆ８７７５）を１ウェルあたり１００μＬで、それぞれのウェルに室温で３０分間加えた。細胞を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｔ９２８４）を含むＴＢＳ２００μＬで４回洗浄した。プレートを、室温で１時間、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、９２７−４００００）１００μＬでブロッキングした。抗ｐＳ６（Ｓ２４０／２４４）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、２２１５）および抗−全Ｓ６抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＭＡＢ５４３６）を、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液で１：４００に希釈し、両方の抗体を含む抗体溶液５０μＬを１つのプレートに加え、ｐＳ６および全Ｓ６を検出した。４℃で一晩インキュベーションした後、プレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、カタログ番号１７０−６３５１）（ＴＢＳＴ）を含むＴＢＳ２００μＬで４回洗浄した。ＩＲＤｙｅに結合させたヤギ抗ウサギ２次抗体およびヤギ抗マウス２次抗体（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログ番号９２６−３２２２１および９２６−３２２１０）を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液で１：４００に希釈した。両方の抗体を含む抗体溶液５０μＬを、それぞれのウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを、ＴＢＳＴ２００μＬで３回洗浄し、ＴＢＳ２００μＬで２回洗浄した。蛍光を、Ｏｄｙｓｓｅｙプレートリーダーで読み取った。ＩＣ５０値を、化合物で処理したウェルについて、ｐＳ６の全Ｓ６に対するシグナル比に基づき測定し、ＤＭＳＯで処理した対照ウェルで基準化した。
一実施形態において、ＭＣＦ−７細胞においてこのアッセイで試験した本発明の化合物は、１．５μＭ以下の阻害活性を有する。別の実施形態において、ＭＣＦ−７細胞においてこのアッセイで試験した本発明の化合物は、１．０μＭ以下の阻害活性を有する。別の実施形態において、ＭＣＦ−７細胞においてこのアッセイで試験した本発明の化合物は、０．５μＭ以下の阻害活性を有する。一実施形態において、ＭＣＦ−７細胞においてこのアッセイで試験した本発明の化合物は、０．２５μＭ以下の阻害活性を有する。一実施形態において、ＭＣＦ−７細胞においてこのアッセイで試験した本発明の化合物は、０．２μＭ以下の阻害活性を有する。一実施形態において、ＭＣＦ−７細胞においてこのアッセイで試験した本発明の化合物は、０．１μＭ以下の阻害活性を有する。
生物学的実施例４
ＰＩ３Ｋ生化学アッセイ
ＰＩ３Ｋα活性を、ルシフェラーゼ−ルシフェリン共役化学発光（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を用いて、キナーゼ反応後に消費したＡＴＰの割合として測定した。反応を、３８４ウェル白色の培地結合マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社）中で行った。キナーゼ反応を、緩衝溶液２０μＬ容積中で試験化合物、ＡＴＰ、基質（ＰＩＰ２）、およびキナーゼを混合することによって開始した。標準的なＰＩ３Ｋαアッセイ緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴおよび０．０３％のＣＨＡＰＳで構成されていた。酵素、ＡＴＰ、および基質についての標準アッセイ濃度は、それぞれ３ｎｍ、１μＭおよび１０μＭであった。反応混合物を約２時間、周囲温度でインキュベートした。キナーゼ反応後に、ルシフェラーゼ−ルシフェリン混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｋｉｎａｓｅ−Ｇｌｏ）の１０μＬアリコートを加え、化学発光シグナルを、Ｖｉｃｔｏｒ２またはＥｎＶｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いて測定した。ＡＴＰ総消費量は４０〜６０％に制限され、対照化合物のＩＣ５０値は、参考文献の値とよく相関する。ＰＩ３ＫαをＰＩ３Ｋβ、ＰＩ３Ｋγ、またはＰＩ３Ｋδと置換することにより、ＰＩ３Ｋの他の異性体に対する本化合物の阻害活性を測定した。ＰＩ３ＫβアッセイおよびＰＩ３Ｋδアッセイについては、酵素濃度は、それぞれ１０ｎＭおよび４ｎＭであった。ＰＩ３Ｋγアッセイについては、酵素濃度は、４０ｎＭであり、インキュベーション時間は１時間で、アッセイ緩衝液のＭｇＣｌ２濃度は５ｍＭであった。
このアッセイにより、本発明の化合物は、好ましくは、約０．０００１ｎＭから２５００ｎＭの間のＰＩ３Ｋα−阻害活性（ＩＣ５０）を有する。
別の実施形態において、本発明の化合物は、約０．００１ｎＭから５００ｎＭの間のＰＩ３Ｋα−阻害活性を有する。別の実施形態において、本発明の化合物は、約０．００１ｎＭから２５０ｎＭの間のＰＩ３Ｋα−阻害活性を有する。別の実施形態において、本発明の化合物は、０．００１ｎＭおよび１００ｎＭのＰＩ３Ｋα−阻害活性を有する。別の実施形態において、本発明の化合物は、０．１ｎＭおよび７５ｎＭのｍＴＯＲ−阻害活性を有する。
このアッセイにより、表１の化合物１〜５および化合物１８ならびに化合物１９は、１００ｎＭ未満のＰＩ３Ｋα−阻害活性を有していた。
実施形態１：一実施形態において、本発明は、約０．５μＭ以下のＰＩ３Ｋα−阻害活性を有する本発明の化合物を含み、（２．０μＭ以上の濃度で試験した場合は）ｍＴＯＲに対して不活性であるか、またはｍＴＯＲを上回ってＰＩ３Ｋαに対して約５倍以上、約７倍以上、もしくは約１０倍以上選択的である。別の実施形態において、本発明は、約０．３５μＭ以下のＰＩ３Ｋα−阻害活性を有する本発明の化合物を含み、（２．０μＭ以上の濃度で試験した場合は）ｍＴＯＲに対して不活性であるか、またはｍＴＯＲを上回ってＰＩ３Ｋαに対して約５倍以上、約７倍以上、もしくは約１０倍以上選択的である。別の実施形態において、本発明は、約０．２５μＭ以下のＰＩ３Ｋα−阻害活性を有する本発明の化合物を含み、（２．０μＭ以上の濃度で試験した場合は）ｍＴＯＲに対して不活性であるか、またはｍＴＯＲを上回ってＰＩ３Ｋαに対して約５倍以上、約７倍以上、もしくは約１０倍以上選択的である。別の実施形態において、本発明の化合物は、約０．１μＭ以下のＰＩ３Ｋα−阻害活性を有し、（２．０μＭ以上の濃度で試験した場合は）ｍＴＯＲに対して不活性であるか、またはｍＴＯＲを上回ってＰＩ３Ｋαに対して約５倍以上、約７倍以上、もしくは約１０倍以上選択的である。別の実施形態において、本発明は、約０．０５μＭ以下のＰＩ３Ｋα−阻害活性を有する本発明の化合物を含み、ｍＴＯＲを上回ってＰＩ３Ｋαに対して約５倍以上、約７倍以上、もしくは約１０倍以上選択的である。
実施形態２：一実施形態において、本発明は、約２．０μＭ以下のＰＩ３Ｋα−阻害活性および約２．０μＭ以下のｍＴＯＲ−阻害活性を有する本発明の化合物を含み、標的のうちの１つの他方に対する選択性は、３倍を超えない。別の実施形態において、本発明は、約１．０μＭ以下のＰＩ３Ｋα−阻害活性および約１．０μＭ以下のｍＴＯＲ−阻害活性を有する本発明の化合物を含み、標的のうちの１つの他方に対する選択性は、３倍を超えない。別の実施形態において、本発明は、約０．５μＭ以下のＰＩ３Ｋα−阻害活性および約０．５μＭ以下のｍＴＯＲ−阻害活性を有する本発明の化合物を含み、標的のうちの１つの他方に対する選択性は、３倍を超えない。別の実施形態において、本発明は、約０．３μＭ以下のＰＩ３Ｋα−阻害活性および約０．３μＭ以下のｍＴＯＲ−阻害活性を有する本発明の化合物を含み、標的のうちの１つの他方に対する選択性は、３倍を超えない。別の実施形態において、本発明は、約０．２μＭ以下のＰＩ３Ｋα−阻害活性および約０．２μＭ以下のｍＴＯＲ−阻害活性を有する本発明の化合物を含み、標的のうちの１つの他方に対する選択性は、２倍を超えない。別の実施形態において、本発明は、約０．１５μＭ以下のＰＩ３Ｋα−阻害活性および約０．１５μＭ以下のｍＴＯＲ−阻害活性を有する本発明の化合物を含み、標的のうちの１つの他方に対する選択性は、２倍を超えない。別の実施形態において、本発明は、約０．１μＭ以下のＰＩ３Ｋα−阻害活性および約０．１μＭ以下のｍＴＯＲ−阻害活性を有する本発明の化合物を含む。別の実施形態において、本発明は、約０．０５μＭ以下のＰＩ３Ｋα−阻害活性および約０．０５μＭ以下のｍＴＯＲ−阻害活性を有する本発明の化合物を含む。別の実施形態において、本発明は、約０．０２μＭ以下のＰＩ３Ｋα−阻害活性および約０．０２μＭ以下のｍＴＯＲ−阻害活性を有する本発明の化合物を含む。別の実施形態において、本発明は、約０．０１μＭ以下のＰＩ３Ｋα−阻害活性および約０．０１μＭ以下のｍＴＯＲ−阻害活性を有する本発明の化合物を含む。
生物学的実施例５〜１１
薬力学的異種移植腫瘍モデル
５〜８週齢で、体重が約２０〜２５ｇの雌雄の胸腺欠損ヌードマウス（ＮＣｒ）を、以下のモデルにおいて使用する。試験開始前に、これらの動物を、最低４８時間順化させた。これらの試験中、動物に、適宜、食物と水を与え、室温７０〜７５°Ｆおよび相対湿度６０％に設定した部屋に収容する。自動タイマーを用いて、１２時間ずつの明暗サイクルを維持する。化合物による死または腫瘍に関連する死について、全ての動物を毎日調べる。
ＭＣＦ−７乳腺癌モデル
ＭＣＦ７ヒト乳腺癌細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｃｅｌｌｇｒｏ社）、ペニシリン−ストレプトマイシンおよび非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ（Ｃｅｌｌｇｒｏ社）中で、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中でインビトロ培養する。０日目に、細胞をトリプシン処理により収集し、５０％成長因子低減マトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）と共に５０％氷冷ハンクス平衡塩類溶液で作られた溶液１００μＬ中の５×１０６細胞を、雌ヌードマウスの後側腹部（ｈｉｎｄｆｌａｎｋ）に皮下移植する。個体識別とデータ追跡のために、それぞれのマウスにトランスポンダーを埋め込み、これらの動物を、臨床症状および生存について毎日監視する。
腫瘍の平均重量が１００〜２００ｍｇに達した時に、雌胸腺欠損ヌードマウス中で腫瘍が確立され、これを病期分類する。本発明の化合物を、（１：１モル比の１Ｎ ＨＣｌを含む）水中の溶液／微細懸濁液として、１日１回（ｑｄ）または１日２回（ｂｉｄ）、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇで１４日間経口投与する。１４〜１９日の投与期間中、週に２回、腫瘍の重量を測定し、体重を毎日記録する。
Ｃｏｌｏ−２０５結腸モデル
Ｃｏｌｏ−２０５ヒト結腸直腸癌細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、ペニシリン−ストレプトマイシンおよび非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社）中で、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中でインビトロ培養する。０日目に、細胞をトリプシン処理により収集し、氷冷ハンクス平衡塩類溶液０．１ｍＬ中の３×１０６個の細胞（継代１０〜１５回、生存率＞９５％）を、５〜８週齢の雌胸腺欠損ヌードマウスの後側腹部に皮内移植する。個体識別用のそれぞれのマウスにトランスポンダーを埋め込み、これらの動物を臨床症状および生存について毎日監視する。
腫瘍の平均重量が１００〜２００ｍｇに達した時に、雌胸腺欠損ヌードマウス中で腫瘍が確立され、これを病期分類する。本発明の化合物を、（１：１モル比の１Ｎ ＨＣｌを含む）水中の溶液／微細懸濁液として、１日１回（ｑｄ）または１日２回（ｂｉｄ）、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇで１４日間経口投与する。１４日の投与期間中、週に２回、腫瘍の重量を測定し、体重を毎日記録する。
ＰＣ−３前立腺癌モデル
ＰＣ−３ヒト前立腺癌細胞を、２０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、ペニシリン−ストレプトマイシンおよび非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社）中で、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中でインビトロ培養する。０日目に、細胞をトリプシン処理により収集し、氷冷ハンクス平衡塩類溶液０．１ｍＬ中の３×１０６個の細胞（継代１０〜１４回、生存率＞９５％）を、５〜８週齢の雄ヌードマウスの後側腹部に皮下移植する。個体識別用のそれぞれのマウスにトランスポンダーを埋め込み、これらの動物を臨床症状および生存について毎日監視する。
腫瘍の平均重量が１００〜２００ｍｇに達した時に、雄胸腺欠損ヌードマウス中で腫瘍が確立され、これを病期分類する。本発明の化合物を、（１：１モル比の１Ｎ ＨＣｌを含む）水中の溶液／微細懸濁液として、１日１回（ｑｄ）または１日２回（ｂｉｄ）、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇで１９日間経口投与する。１４〜１９日の投与期間中、週に２回、腫瘍の重量を測定し、体重を毎日記録する。
Ｕ−８７ＭＧヒトグリア芽腫モデル
Ｕ−８７ＭＧヒトグリア芽腫細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、ペニシリン−ストレプトマイシンおよび非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社）中で、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中でインビトロ培養する。０日目に、細胞をトリプシン処理により収集し、氷冷ハンクス平衡塩類溶液０．１ｍＬ中の２×１０６個の細胞（継代５回、生存率９６％）を、５〜８週齢の雌ヌードマウスの後側腹部に皮内移植する。個体識別用のそれぞれのマウスにトランスポンダーを埋め込み、これらの動物を臨床症状および生存について毎日監視する。体重を毎日記録する。
Ａ５４９ヒト肺癌モデル
Ａ５４９ヒト肺癌細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、ペニシリン−ストレプトマイシンおよび非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社）中で、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中でインビトロ培養する。０日目に、細胞をトリプシン処理により収集し、氷冷ハンクス平衡塩類溶液０．１ｍＬ中の１０×１０６個の細胞（継代１２回、生存率９９％）を、５〜８週齢の雌ヌードマウスの後側腹部に皮内移植する。個体識別用のそれぞれのマウスにトランスポンダーを埋め込み、これらの動物を臨床症状および生存について毎日監視する。体重を毎日記録する。
Ａ２０５８ヒト黒色腫モデル
Ａ２０５８ヒト黒色腫細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、ペニシリン−ストレプトマイシンおよび非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社）中で、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中でインビトロ培養する。０日目に、細胞をトリプシン処理により収集し、氷冷ハンクス平衡塩類溶液０．１ｍＬ中の３×１０６個の細胞（継代３回、生存率９５％）を、５〜８週齢の雌胸腺欠損ヌードマウスの後側腹部に皮内移植する。個体識別用のそれぞれのマウスにトランスポンダーを埋め込み、これらの動物を臨床症状および生存について毎日監視する。体重を毎日記録する。
ＷＭ−２６６−４ヒト黒色腫モデル
ＷＭ−２６６−４ヒト黒色腫細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、ペニシリン−ストレプトマイシンおよび非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社）中で、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中でインビトロ培養する。０日目に、細胞をトリプシン処理により収集し、氷冷ハンクス平衡塩類溶液０．１ｍＬ中の３×１０６個の細胞（継代５回、生存率９９％）を、５〜８週齢の雌胸腺欠損ヌードマウスの後側腹部に皮内移植する。個体識別用のそれぞれのマウスにトランスポンダーを埋め込み、これらの動物を臨床症状および生存について毎日監視する。体重を毎日記録する。
上記のモデルの腫瘍重量（ＴＷ）を、以下の式を用いて、ノギスで直角に交わる直径を測定することにより決定する：
［数１］
腫瘍重量（ｍｇ）＝[腫瘍体積＝長さ（ｍｍ）×幅２（ｍｍ２）]／２
これらのデータを記録し、腫瘍重量対移植後の日数の線グラフにプロットし、腫瘍増殖速度の表示としてグラフを使って示した。腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ）を以下の式を用いて決定する：
式中、Ｘ０＝０日目の全腫瘍の平均ＴＷ
Ｘｆ＝ｆ日目の治療群のＴＷ
Ｙｆ＝ｆ日目のビヒクル対照群のＴＷ
腫瘍が開始時点のサイズよりも退縮した場合は、以下の式により、腫瘍退縮率を決定する：
腫瘍サイズは各腫瘍について個別に計算し、各試験群について平均±ＳＥＭ値を得る。統計上の有意性は、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を用いて決定する（Ｐ＜０．０５の場合に有意と定義する）。
上述の発明を、明確さと理解を目的として、図および実施例を通して少し詳しく説明した。種々の特定の実施形態および技術を参照し、本発明を記載した。しかし、本発明の趣旨および範囲内にとどまりつつ、多数の変更および修正を加えることが可能であると理解すべきである。添付した特許請求の範囲の範囲内で変更および修正が行われ得ることは、当業者には明らかであろう。したがって、上記の説明は、例示を意図したものであり、限定するものではないことが理解されるべきである。したがって、本発明の範囲は、上記の説明を参照して決定されるべきではなく、その代わりに、以下の添付の特許請求の範囲、およびかかる特許請求の範囲と同等と認められるものの全範囲を参照して決定されるべきである。本出願で引用されるすべての特許、特許出願および公表文献は、それぞれの特許、特許出願または公表文献が個別に示されるのと同程度に、全ての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (17)

  1. 式Ｉの化合物、またはその単一異性体もしくは異性体の混合物、任意にその薬学的許容される塩：
    （式中、
    Ｒ１は、Ｈ、ハロ、−ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、またはＮ（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２であり、
    Ｒ２は、−ＮＲ２ａＳ（Ｏ）２−Ｒ２ｂ、−Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ２ａＲ２ｃであり、Ｒ２ａおよびＲ２ｃは、それぞれ独立して、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、Ｒ２ｂは、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたはハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、
    Ｒ３は、Ｈ、ハロ、または（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、
    Ｒ４は、Ｈ、またはハロであり、
    Ｑは、Ｎ、Ｃ−Ｈ、またはＣ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｃ−ＣＮ、またはＣ−ＣＦ３であり、
    Ｒ６は、Ｈ、(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ハロ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ＮＨ２、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)ハロアルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−Ｎ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル)２、ＮＨ２、ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ヒドロキシアルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−Ｏ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキレンＮＨ２、ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−シクロアルキル、−ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ヘテロシクロアルキル、Ｎ((Ｃ１−Ｃ６)アルキル)２、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ＮＨＳＯ２−(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ＮＨ(Ｃ＝Ｏ)−(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ２、−(Ｃ＝Ｏ)−(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、−(Ｃ＝Ｏ)−Ｎ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル))２、−ＮＨＳＯ２−(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、−Ｓ(Ｏ)−(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、−ＳＯ２−(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、−ＳＯ２Ｎ((Ｃ１−Ｃ６)アルキル)２、−ＣＮ、(Ｃ４−Ｃ７)ヘテロシクロアルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−(Ｃ３−Ｃ７)ヘテロシクロアルキル、ニトロ、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ＣＮ、ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−Ｎ((Ｃ１−Ｃ６)アルキル)２、または(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ＯＣ(Ｏ)−(Ｃ１−Ｃ６)アルキルであり、Ｒ６の任意のアルキレンは、独立して、ハロもしくはヒロドキシである１個、２個または３個の基で任意に置換され、その際、任意のアルキレンが−ＣＨ２−である場合、−ＣＨ２−の水素のうちの１つは、任意に、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルで置き換えることができ、
    Ｒ７は、Ｈ、ハロ、−ＮＨ２、ニトロ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルコキシであり、Ｒ７は、−ＣＦ３、ハロ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルケニル、ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、またはＮ((Ｃ１−Ｃ６)アルキル)２であり、
    Ｙは、ＮまたはＣ−Ｒ８であり、式中、Ｒ８は、Ｈ、ハロ、(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ＮＨ２、ＮＨ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、Ｎ((Ｃ１−Ｃ６)アルキル)２、(Ｃ２−Ｃ６)アルケニル、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−Ｏ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ヒドロキシアルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ＣＯ２(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ＣＯ２Ｈ、フェニル、ハロ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキル、ＣＯＨ、ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ＣＮ、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−ＣＮ、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−Ｃ≡Ｃ−Ｈ、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−Ｃ≡Ｃ−(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、−Ｃ≡Ｃ−Ｈ、−Ｃ≡Ｃ−(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレン−フェニルであり、Ｒ８の任意のフェニルは、独立して、ハロもしくはアルキルである１個、２個、または３個の基で任意に置換されるか、または、
    Ｒ７およびＲ８は、それらが結合している原子と共に互いに結合して、任意に、Ｎ−Ｈ、Ｎ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、Ｏ、ＳＯ、およびＳＯ２から選択される最高で２個のヘテロ原子を含む５員、６員、もしくは７員の飽和環、５員、６員、もしくは７員の部分的に不飽和環、または５員、６員、もしくは７員の不飽和環を形成することができ、Ｒ７およびＲ８によって形成された環は、独立して、アルキル、アルコキシ、またはハロである１個もしくは２個の基で任意に置換され、
    Ｚは、ＮまたはＣ−Ｒ９であり、式中、Ｒ９は、Ｈ、ハロ、または(Ｃ１−Ｃ６)アルキルであり、
    ＱおよびＺの少なくとも１つは、Ｎである。）
  2. Ｒ３がＨまたはハロである、請求項１に記載の化合物。
  3. Ｒ４がＨである、請求項１〜２に記載の化合物。
  4. Ｒ６が、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、またはＮ（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２である、請求項１〜３に記載の化合物。
  5. Ｒ７が、Ｈ、ハロ、または（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである、請求項１〜４に記載の化合物。
  6. ＹがＣ−Ｒ８である、請求項１〜５に記載の化合物。
  7. 式Ｉａの化合物である、請求項１〜６に記載の化合物。
  8. 式中、
    Ｒ１は、Ｈ、ハロ、−ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、またはＮ（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２であり、
    Ｒ２は、−ＮＲ２ａＳ（Ｏ）２−Ｒ２ｂ、−Ｓ（Ｏ）２−ＮＲ２ａＲ２ｃであり、
    Ｒ３は、Ｈであり、
    Ｒ６は、ＮＨ２であり、
    Ｒ７は、Ｈ、ハロ、または（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである、請求項７に記載の化合物。
  9. 式中、
    が、
    である、請求項８に記載の化合物。
  10. 式中、
    が、
    から選択される、請求項８に記載の化合物。
  11. Ｒ１が、Ｈ、ハロ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、またはＮ（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２である、請求項１〜１０に記載の化合物。
  12. Ｒ２が、−ＮＨＳ（Ｏ）２−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたは−Ｓ（Ｏ）２−ＮＨ２である、請求項１〜１１に記載の化合物。
  13. Ｎ−（５−｛４−［２−アミノ−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝−２−クロロピリジン−３−イル）メタンスルホンアミド；
    Ｎ−（５−｛４−［２−アミノ−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝ピリジン−３−イル）メタンスルホンアミド；
    ２−アミノ−５−｛４−［２−アミノ−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝ピリジン−３−スルホンアミド；
    Ｎ−［５−｛４−［２−アミノ−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝−２−（メチルオキシ）ピリジン−３−イル］メタンスルホンアミド；
    Ｎ−｛５−［４−（２−アミノ−６,６−ジメチル−５,６,７,８−テトラヒドロキナゾリン−４−イル）−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル］−２−クロロピリジン−３−イル｝メタンスルホンアミド；
    Ｎ−［５−｛４−［２−アミノ−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝−２−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル］メタンスルホンアミド；
    Ｎ−｛５−［４−（２−アミノ−５−エチル−６−メチルピリミジン−４−イル）−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル］−２−クロロピリジン−３−イル｝メタンスルホンアミド；
    Ｎ−｛５−［４−（２−アミノ−５−エテニル−６−メチルピリミジン−４−イル）−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル］−２−クロロピリジン−３−イル｝メタンスルホンアミド；
    Ｎ−（５−｛４−［２−アミノ−６−クロロ−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝−２−クロロピリジン−３−イル）メタンスルホンアミド；
    Ｎ−（５−｛４−［２−アミノ−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２，３，４，５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝−２−クロロピリジン−３−イル）メタンスルホンアミド；
    Ｎ−（５−｛４−［２−アミノ−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝−２−クロロピリジン−３−イル）−１,１,１−トリフルオロメタンスルホンアミド；
    Ｎ−｛５−［４−（２−アミノ−５,６−ジメチルピリミジン−４−イル）−２,３,４，５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル］−２−クロロピリジン−３−イル｝メタンスルホンアミド；
    Ｎ−（２−クロロ−５−｛４−［６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝ピリジン−３−イル）メタンスルホンアミド；
    Ｎ−（５−｛４−［２−アミノ−６−エチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝−２−クロロピリジン−３−イル）メタンスルホンアミド；
    Ｎ−｛５−［４−（２−アミノ−５−エテニルピリミジン−４−イル）−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル］−２−クロロピリジン−３−イル｝メタンスルホンアミド；
    Ｎ−｛５−［４−（２−アミノ−５−エチルピリミジン−４−イル）−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル］−２−クロロピリジン−３−イル｝メタンスルホンアミド；
    Ｎ−［２−クロロ−５−（４−｛２−［（ジメチルアミノ）メチル］−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル｝−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル）ピリジン−３−イル］メタンスルホンアミド；
    Ｎ−（２−クロロ−５−｛４−［２−｛［（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］メチル｝−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル］−２,３，４，５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル｝ピリジン−３−イル）メタンスルホンアミド；
    Ｎ−［２−クロロ−５−（４−｛２−［（ジメチルアミノ）メチル］−６−メチル−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−イル｝−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,４−ベンゾオキサゼピン−７−イル）ピリジン−３−イル］メタンスルホンアミド
    である化合物、任意に、その薬学的に許容される塩。
  14. 請求項１〜１３の化合物、任意に、その薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物。
  15. 疾患、障害、または症候群を治療する方法であって、治療有効量の請求項１〜１３の化合物、任意に、その薬学的に許容される塩を患者に投与するか、または治療有効量の請求項１〜１３の化合物、任意に、その薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物を患者に投与することを含む方法。
  16. 前記疾患が癌である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記癌が、乳癌、マントル細胞リンパ腫、腎細胞癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ＮＰＭ／ＡＬＫ形質転換未分化大細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、横紋筋肉腫、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腺癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、肝細胞癌、黒色腫、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、未分化大細胞リンパ腫、血管腫、グリア芽腫、または頭頸部癌である、請求項１６に記載の方法。
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