KR20130128693A

KR20130128693A - 벤조티아졸 유도체 및 암 치료를 위한 그의 용도

Info

Publication number: KR20130128693A
Application number: KR1020120052599A
Authority: KR
Inventors: 홍성희; 홍인석; 한은종; 이기호
Original assignee: 한국원자력의학원
Priority date: 2012-05-17
Filing date: 2012-05-17
Publication date: 2013-11-27
Also published as: KR101385603B1

Abstract

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물, 약학적으로 허용 가능한 그의 염, 또는 그의 용매화물, 그리고 이를 포함하는 암 치료용 약학 조성물 및 암에 대한 방사선 치료 민감제용 약학 조성물을 제공한다:
[화학식 I]

상기 화학식 I에서,
-R¹은 C₁-C₃ 알콕시, =O, 또는 -OH 이고,
-R²는 질소 및 산소에서 선택된 1-2개의 헤테로 원자를 함유하는 5 내지 6 원의 헤테로아릴로서, 헤테로아릴의 탄소는 C₁-C₃알킬, C₁-C₃알콕시, 또는 히드록시로 선택적으로 치환된다.

Description

벤조티아졸 유도체 및 암 치료를 위한 그의 용도{Benzothiazole derivatives and a use thereof for the treatment of cancer}

본 발명은 암 치료에 효과적인 신규한 벤조티아졸 유도체 화합물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 신규한 벤조티아졸 유도체 화합물, 암 치료를 위한 그 화합물의 용도, 및 암에 대한 방사선 치료를 민감제로서 사용하기 위한 그 화합물의 용도에 관한 것이다.

최근 암 발생률은 산업의 급격한 발달, 지구 생태계 및 식생활의 변화 등으로 과거에 비해 급격히 증가하고 있으나, 아직도 암의 발생기전이 불명확하여 난치성 질병으로 알려져 있다. 현재 사용되고 있는 항암제들은 효소 제제나 백신 등의 생물학적 제제, 순수 합성 의약품, 및 천연물 유래의 의약품 등으로 크게 구분할 수 있는데, 항암제는 암의 종류에 따라 약리작용이 다양하고, 독성에 의한 부작용이 다양하게 나타나기 때문에 암 치료시 문제점이 되고 있다. 또한, 항암제는 암세포의 성장을 효과적으로 억제하기도 하지만, 때로는 정상 세포에 대해서 독성을 나타내기도 한다. 따라서, 많은 학자들은 보다 효과적이면서 정상세포에 대한 독성을 최대화할 수 있는 항암제의 개발을 위해 노력해오고 있다.

폐암은 위암에 이어 두 번째로 많은 부분을 차지하고 있으며, 예후가 불량하여 전체 암 사망률 중에서 폐암으로 인한 사망률은 2000 년부터 1 위를 차지하고 있다. 폐암은 조직학적으로 소세포 폐암과 비소세포 폐암으로 구분되며 소세포성 폐암의 경우 화학적 치료와 방사선 치료가 권장되고 비소세포폐암은 근치적 절제술이 최선의 방법으로 알려져 있다. 폐암은 종양의 국소적인 제어가 어렵고 진단 당시 영상검사로는 발견하기 어려운 미세전이 암세포가 존재한다. 따라서, 폐에 국한된 방사선 요법 시행 후 원격 장기에서의 재발을 초래하는 경우가 있어 방사선 단독요법으로는 5 년 생존률이 10% 미만으로 좋지 않다. 따라서, 이러한 원격 장기에서의 재발을 막기 위해 다양한 방법으로 항암 화학요법이 방사선 치료와 병용되고 있고, 이러한 병용 치료가 방사선 단독 치료보다 우수함이 밝혀지고 있다.

PPARs(peroxisome proliferator activated receptors)는 스테로이드/갑산성 호르몬/레티로이드 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 핵수용체로, 여러 종류의 리간드에 의해 활성이 조절되는 전사인자이다. 또한, 당과 지질대사를 조절하는 핵심인자이며, 여러 조직에서 세포분열, 분화, 그리고 세포사를 조절한다고 알려져 왔다. PPAR의 활성화는 각종 항암활성이 있는 것으로 알려져 있다.

트로글리타존(troglitazone, TGZ), 시글리타존(ciglitazon), 로시글리타존(rosiglitazone) 또는 피오글리타존(pioglitazone)을 포함한 티아졸리딘디온(thiazolidinediones) 당뇨병치료제는 합성 PPARγ 아고니스트이고 TGZ는 또한 사람의 대장(비특허문헌 1), 유방(비특허문헌 2), 간, 폐, 신장 그리고 전립선암 등 다양한 암에 대해 세포독성효과를 가지고 있는 것으로 보고되었다.

PPAR β/δ 활성은 폐암을 약화시킬 수 있다고 제안된 바 있으며, 고친화성(high-affinity) 합성 PPAR β/δ의 리간드, L165041은 사람 폐암의 세포증식을 억제하고(비특허문헌 3), PPAR β/δ유전자 발현을 제거한 형질전환 마우스(transgenic mouse)에서 폐암을 악화시키는 것으로 밝혀졌다(비특허문헌 4).

예후가 나쁜 폐암환자들에서 PPAR γ의 발현이 감소했고(비특허문헌 8), 내인성 아고니스트와 합성 아고니스트에 의한 PPAR γ의 활성은 폐암세포의 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다(비특허문헌 5). 비소세포폐암에 PPAR γ 활성물질을 처리하면 아포토시스와 분화를 유도한다고 보고 되었다(비특허문헌 6). 또한, 시글리타존이 누드 마우스에서 A-549로부터 유도된 종양을 억제한다고 보고되었다(비특허문헌 7). 당뇨병을 치료하기 위하여 PPAR γ 아고니스트인 티아졸리딘디온을 투여한 환자는 폐암발달 확률이 현저히 낮았고(비특허문헌 8), 또한 PPAR-γ 리간드에 의한 반응이 폐암으로부터 신체를 보호하는 역할을 한다고 제안되었다(비특허문헌 9, 10).

PPAR-γ 리간드는 PPAR-γ에 의존적인 경로 이외에도 PPAR-γ 와는 독립적인 경로를 통해 항암 작용한다는 보고가 있으며. 실제로 PPAR-γ 리간드는 독립적인 경로와 폐암과의 관련성이 확인되었다(비특허문헌 11).

1. Sarraf P, Mueller E, Jones D, King FJ, DeAngelo DJ, Partridge JB, Holden SA et al., Differentiation and reversal of malignant changes in colon cancer through PPARgamma. Nat Med. 1998 Sep;4(9):1046-52. 2. Elstner E, Mㆌller C, Koshizuka K, Williamson EA, et al.,Ligands for peroxisome proliferator-activated receptorgamma and retinoic acid receptor inhibit growth and induce apoptosis of human breast cancer cells in vitro and in BNX mice.Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Jul 21;95(15):8806-11. 3. Fukumoto K, Yano Y, Virgona N, Hagiwara H, et al., Peroxisome proliferator-activated receptor delta as a molecular target to regulate lung cancer cell growth. FEBS Lett. 2005 Jul 4;579(17):3829-36. 4. Mㆌller-Brㆌsselbach S, Ebrahimsade S, Jㅴkel J, Eckhardt J, Rapp UR, Peters JM et al., Growth of transgenic RAF-induced lung adenomas is increased in mice with a disrupted PPARbeta/delta gene.Int J Oncol. 2007 Sep;31(3):607-11. 5. Tsubouchi Y, Sano H, Kawahito Y, Mukai S, Yamada R, Kohno M, Inoue K et al., Inhibition of human lung cancer cell growth by the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists through induction of apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 2000 Apr 13;270(2):400-5. 6. Chang TH, Szabo E. Induction of differentiation and apoptosis by ligands of peroxisome proliferator-activated receptor gamma in non-small cell lung cancer. Cancer Res. 2000 Feb 15;60(4):1129-38. 7. Zhang W, Zhang H, Xing L., Influence of ciglitazone on A549 cells growth in vitro and in vivo and mechanism. J Huazhong Univ Sci Technol Med Sci. 2006;26(1):36-39. 8. Govindarajan R, Ratnasinghe L, Simmons DL, Siegel ER, Midathada MV, Kim L, Kim PJ et al., Thiazolidinediones and the risk of lung, prostate, and colon cancer in patients with diabetes. J Clin Oncol. 2007 Apr 20;25(12):1476-81. 9. Girnun GD, Chen L, Silvaggi J, Drapkin R, Chirieac LR, Padera RF, Upadhyay R et al., Regression of drug-resistant lung cancer by the combination of rosiglitazone and carboplatin. Clin Cancer Res. 2008 Oct 15;14(20):6478-86. 10. Roman J., Peroxisome proliferator-activated receptor gamma and lung cancer biology: implications for therapy. J Investig Med. 2008 Feb;56(2):528-33. 11. Jun-Jie Wang, Oi-Tong Mak. Induction of apoptosis by 15d-PGJ2 via ROS formation: An alternative pathway without PPARγactivation in non-small cell lung carcinoma A549 cells. Prostagladins & other Lipid Mediators 2011;94;104-111.

이에 본 발명자들은 PPAR-γ 리간드로서 작용할 수 있으면서 항암 활성 및 방사선 민감제로서 작용할 수 있는 새로운 화합물을 개발하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 PPAR-γ 리간드로서 작용하며, 항암 활성 및 방사선 민감제 활성이 있는 신규 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신규 화합물을 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규 화합물을 포함하는 암에 대한 방사선 치료 민감제용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 하기 화학식 I의 화합물, 약학적으로 허용 가능한 그의 염, 또는 그의 용매화물을 제공한다:

[화학식 I]

상기 화학식 I에서,

-R¹은 C₁-C₃알콕시, =O, 또는 -OH 이고,

-R²는 질소 및 산소에서 선택된 1-2개의 헤테로 원자를 함유하는 5 내지 6 원의 헤테로아릴로서, 헤테로아릴의 탄소는 C₁-C₃알킬, C₁-C₃알콕시, 또는 히드록시로 선택적으로 치환된다.

본 발명의 다른 일 측면은 상기 화학식 I의 화합물, 약학적으로 허용 가능한 그의 염, 또는 그의 용매화물을 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 화학식 I의 화합물, 약학적으로 허용 가능한 그의 염, 또는 그의 용매화물을 포함하는 암에 대한 방사선 치료 민감제용 약학 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.

본 발명자들은 PPAR-γ 리간드이면서 항암활성이 있는 새로운 화합물의 개발을 위해 연구한 결과, 새로운 벤조티아졸 유도체 화합물을 개발하게 되었다.

따라서, 본 발명은 일 측면에 있어서, 하기 화학식 I의 화합물, 약학적으로 허용 가능한 그의 염, 또는 그의 용매화물을 제공한다:

[화학식 I]

상기 화학식 I에서,

-R¹은 C₁-C₃알콕시, =O, 또는 -OH 이고,

상기 화학식 I의 화합물은 구체적으로는

4-메톡시-시클로헥산카르복실산 [2-(4,6-디메틸-2H-1,2-옥사진-5-일)술파닐-벤조티아졸-6-일]-아미드;

4-옥소-시클로헥산카르복실산 [2-(4,6-디메틸-2H-1,2-옥사진-5-일)술파닐-벤조티아졸-6-일]-아미드; 및

4-히드록시-시클로헥산카르복실산 [2-(4,6-디메틸-2H-1,2-옥사진-5-일)술파닐-벤조티아졸-6-일]-아미드로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

상기 약제학적으로 허용 가능한 염은 상기 화학식 I의 화합물이 유리산과 함께 염을 형성하는 산부가염으로서 존재할 수 있다. 상기 화학식 I의 화합물은 당해 기술분야에 공지된 통상의 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 산부가염을 형성할 수 있다. 상기 유리산으로는 유기산 또는 무기산을 사용할 수 있고, 상기 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 또는 인산 등을 사용할 수 있고, 상기 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartariac acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적으로 허용 가능한 염은 상기 화학식 I의 화합물의 무기염으로서 존재할 수 있다. 상기 화학식 I의 화합물은 당해 기술분야에 공지된 통상의 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 무기염을 형성할 수 있다. 상기 무기염에는 알루미늄, 암모늄, 칼슘, 구리, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 칼륨, 나트륨, 또는 아연과의 염이 있으나 이에 한정되지 않으며, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 또는 소듐염이 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 상기 화학식 I의 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물을 포함한 용매화물을 모두 포함할 수 있다.

상기 화학식 I의 화합물은 일 구현예에 따르면 하기 반응식 I와 같은 방법에 의해 합성될 수 있다.

[반응식 I]

상기 반응식에서 화학식 V의 R³ 및 R⁴는 각각 독립적으로 수소, C₁-C₃알킬, C₁-C₃알콕시, 또는 히드록시이다. 상기 반응식에서 R⁵는 C₁-C₃알킬이다.

상기 반응식에 따른 제조방법을 하기 실시예 1 내지 5에 상세하게 기재하였다. 하기 실시예에서는 화학식 V의 R³ 및 R⁴, 그리고 R⁵가 특정 작용기를 가질 경우에 한정하여 기재하였지만, 유기화학분야에서 통상의 지식을 가진 자는 상기 반응식 I 및 하기 실시예의 제조방법에 기초하여 R³ 및 R⁴, 그리고 R⁵ 의 작용기를 변경함으로써 상기 화학식 I의 화합물을 제조할 수 있음이 자명하다. 본 명세서에서는 화학식 I의 제조방법을 일 구현예를 들어 설명하였지만, 유기화학분야에서 통상의 지식을 가진 자는 출발물질, 반응경로, 반응조건 들을 적절히 변경함으로써 본 명세서에 기재된 방법과 다른 방법으로도 화학식 I의 화합물을 제조할 수 있다.

상기 화학식 I의 화합물은 Oil-Red-O 염색법을 통하여 PPAR γ 리간드인 것으로 확인되었으며(실시예 6), 인체 대장암세포, 유방암 세포, 비소폐암세포, 및 백혈암 세포를 포함한 다양한 암세포들에서 세포성장 억제 작용을 갖는 것으로 나타났으며, 특히 비소폐암 세포주에서 가장 민감한 세포성장 억제 작용을 나타내었으며 암세포가 아닌 다른 폐세포에 대한 암세포의 선택적인 세포성장 억제 및 살해 작용을 나타내었다(실시예 7). 또한, 상기 화학식 I의 화합물의 처리 시, 암세포의 부착력이 상실되고, 염색질 응축에 의한 아포토틱 바디가 증가되고, 세포외로 방출된 LDH의 양의 증가하는 것으로 나타나, 암세포의 사멸이 아폽토시스에 의한 것으로 나타났다(실시예 8). 또한, 상기 화학식 I의 화합물을 방사선과 함께 처리 시 투여량 증가율의 수치가 1 이상이면서 2 이하인 것으로 나타나(실시예 9), 암치료에 대한 방사선 민감제로서도 효과가 있는 것으로 확인되었다.

따라서, 본 발명은 다른 측면에 있어서, 화학식 I의 화합물, 약학적으로 허용 가능한 그의 염, 또는 그의 용매화물을 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다:

[화학식 I]

상기 화학식 I에서,

-R¹은 C₁-C₃알콕시, =O, 또는 -OH 이고,

본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물, 약학적으로 허용 가능한 그의 염, 또는 그의 용매화물을 포함하는 암 치료에 대한 방사선 민감제용 약학 조성물을 제공한다.

상기 암은 구체적으로는 방광암, 위암, 대장암, 식도암, 췌장암, 폐암, 비소세포성폐암, 결장암, 골암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 직장암, 항문부근암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 결장암, 뇌암, 백혈암, 전립선암, 식도암, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 또는 뇌하수체 선종 등을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는 상기 암은 폐암, 유방암, 대장암 또는 백혈암이고, 더욱 구체적으로는 상기 암은 비소세포폐암이다.

상기 약학 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 제형은 경구투여제제, 주사제, 좌제, 경피투여제제, 및 경비투여제제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 임의의 제형으로 제제화되어 투여될 수도 있으나, 바람직하게는 경구 투여용 제제 및 주사제로 제제화될 수 있다.

상기 각각의 제형으로 제제화 시, 각각의 제형의 제조에 필요한 약제학적으로 허용 가능한 담체를 부가하여 제조할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 약학적 활성 성분을 제외한 임의의 구성 성분을 지칭하기 위해 사용된다. "약제학적으로 허용가능한"은 조성물 중에 존재하는 다른 구성 성분들과 상호작용하여 (예를 들면, 담체들 상호 간 또는 약학적 활성 성분과 담체 간의 상호작용) 약제학적으로 바람직하지 않은 변화를 야기하지 않는 성질을 의미한다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체의 선택은 특정한 투여 제형의 특성, 투여 방식, 용해도 및 안정성에 대한 상기 담체의 효과와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다.

일 구체예에서, 경구 투여용 약학 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용가능한 담체는 희석제, 결합제, 활택제(또는 윤활제), 붕해제, 안정화제, 용해보조제, 감미제, 착색제, 착향제로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

희석제(diluent)는 조성물의 부피를 증량하여 제형에 따른 적절한 크기로 만들기 위해 첨가되는 임의의 부형제를 지칭한다. 상기 희석제는, 전분 (예를 들면, 감자전분, 옥수수전분, 밀전분, 전젤라틴화 전분), 미세결정성 셀룰로오스 (예를 들면, 저수화 미결정셀룰로오스), 유당 (예를 들면, 유당 일수화물, 무수유당, 분무유당), 포도당, 소르비톨, 만니톨, 수크로오스, 알기네이트, 알칼리토금속류염, 클레이, 폴리에틸렌글리콜 및 디칼슘포스페이트, 무수인산수소칼슘, 이산화규소 등을 단독으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 부형제는 상기 약학 조성물 총량에 대해 5 중량% 내지 50 중량% 범위로 사용될 수 있으며, 정제화 및 품질 유지를 위해 예를 들면, 조성물 총량에 대해 10 중량% 내지 35 중량%로 사용될 수 있다.

결합제(binder)는 분말상의 물질에 점착성을 부여하여 압착을 용이하게 하고 유동성을 개선하기 위해 사용되는 물질을 지칭한다. 상기 결합제는 전분, 미세결정성 셀룰로오스, 고분산성 실리카, 만니톨, 락토스, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스 유도체 (예를 들면, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스), 천연검, 합성검, 포비돈, 코포비돈 및 젤라틴로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 결합제는 상기 약학 조성물 총량에 대해 2 중량% 내지 15 중량%로 사용될 수 있으며, 정제화 및 품질 유지를 위해 예를 들면, 1 중량% 내지 3 중량%로 사용될 수 있다.

붕해제(disintegant)는 생체 투여 후 고체 제형의 붕괴 또는 붕해를 용이하게 하기 위해 첨가되는 물질을 지칭한다. 상기 붕해제는 나트륨전분글리콜레이트, 옥수수전분, 감자전분 또는 전젤라틴화전분와 같은 전분 또는 변성전분, 벤토나이트, 몬모릴로나이트, 비검(veegum) 과 같은 클레이(clay), 미세결정성셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 또는 카르복시메틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스, 알긴산나트륨 또는 알긴산과 같은 알긴류, 크로스카르멜로스(croscarmellose) 나트륨과 같은 가교 셀룰로오스, 구아검, 잔탄검과 같은 검, 가교 폴리비닐피롤리돈(crospovidone)과 같은 가교 중합체, 중탄산나트륨, 시트르산과 같은 비등성 제제를 단독 또는 혼합 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 붕해제를 약학 조성물 총량에 대해 2 중량% 내지 15 중량% 내외로 사용할 수 있으며, 예를 들면, 정제화 및 품질 유지를 위해 4 중량% 내지 10 중량%로 사용될 수 있다.

활택제(glidant) 또는 윤활제(lubricant)는 압착 설비에 대한 분말의 부착을 방지하고 과립의 유동을 개선시키는 기능을 수행하는 물질을 지칭한다. 상기 활택제는 경질 무수 규산, 탈크, 스테아린산, 스테아린산의 금속염(마그네슘염 또는 칼슘염 등), 라우릴설페이트나트륨, 수소화식물성오일, 나트륨벤조에이트, 푸마르산스테아릴나트륨, 글리세릴비헤네이트, 글리세릴모노스테아레이트 또는 폴리에틸렌글리콜을 단독 또는 혼합 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 활택제는 약학 조성물 총량에 대해 0.1 중량% 내지 5 중량%로 사용될 수 있으며, 예를 들면, 정제화 및 품질 유지를 위해 1 중량% 내지 3 중량%로 사용될 수 있다.

흡착제(adsorbant)는 함수이산화규소, 경질무수규산, 콜로이달실리콘디옥사이드(상품명 : Aerosil, 데구사), 메타규산알루민산마그네슘, 미결정셀룰로오스, 유당 또는 가교 폴리비닐피롤리돈을 단독 또는 혼합 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

안정화제(stabilizer)는 부틸히드록시아니솔, 부틸히드록시톨루엔, 카로틴, 레티놀, 아스코르빈산, 토코페롤, 토코페롤폴리에틸렌글리콜 숙신산 또는 프로필갈레이트와 같은 항산화제, 사이클로덱스트린, 카르복시에틸 사이클로덱스트린, 히드록시프로필 사이클로덱스트린, 술포부틸에테르 또는 사이클로덱스트린와 같은 당류의 환상화합물, 인산, 젖산, 초산, 구연산, 주석산, 숙신산, 말레인산, 푸마르산, 글리콜산, 프로피온산, 글루콘산 또는 글루쿠론산과 같은 유기산 중 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

선택적으로, 미각을 돋구어 기호성을 증진시키기 위한 공지의 첨가제가 포함될 수 있다. 예를 들면, 수크랄로오스, 수크로오스, 프럭토오스, 에리스리톨, 아세설팜 칼륨, 당 알코올, 벌꿀, 소르비톨 또는 아스파르탐과 같은 감미제를 첨가하여, 쓴맛을 보다 효과적으로 은폐시키고 제제의 안정성 및 품질을 유지할 수 있다. 또한, 구연산, 구연산 나트륨과 같은 산미제, 매실향, 레몬향, 파인애플향, 허브향 등의 천연향료, 천연과즙, 클로로필린, 플라보노이드 등의 천연색소가 사용될 수 있다.

상기 경구 투여용 약학 조성물은 경구 투여를 위한 고형 제제, 반고형 제제 또는 액상 제제일 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제는 예를 들면, 정제, 환제, 경질 또는 연질 캡슐제, 산제, 세립, 과립, 용액 또는 현탁액 재구성용 분말, 로젠지, 웨이퍼, 구강필름 (oral strip) 드라제(dragee) 및 츄잉검(chewable gum) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 경구 투여를 위한 액상 제제는 액제, 현탁제, 에멀젼, 시럽제, 엘릭서제, 주정제, 방향수제, 레모네이드제, 엑스제, 침전제, 틴크제 및 약유제를 포함한다. 반고형 제제는 에어로졸, 크림, 겔(gel) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

상기 본 발명에 따른 약학 조성물은 주사제로서 제제화될 수 있으며, 주사제로 제제화될 경우 혈액과 등장인 무독성 완충용액을 희석제로서 포함할 수 있으며, 예를 들어 pH 7.4의 인산완충용액 등이 있다. 상기 약제학적 조성물은 완충용액 이외에 기타 다른 희석제 또는 첨가제를 포함할 수 있다.

상기 언급된 제제에 사용되는 담체와 제제의 제조방법은 당해 기술분야에 널리 알려져 바에 따라 선택하고 제조할 수 있으며, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Science 최신판에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.

상기 본 발명에 따른 암 치료용 약학 조성물의 투여량 및 투여시기는 투여대상의 나이, 성별, 상태, 체중, 투여경로, 투여 횟수, 약의 형태에 따라서 달라진다. 일일 투여량은 약 1-1000 mg/kg이고, 바람직하게는 0.01 mg/kg 내지 100mg/kg 이다. 상기 투여량은 암의 종류, 암의 진행 정도, 투여 경로, 성별, 나이, 체중 등에 따라 적절히 증감될 수 있다.

상기 본 발명에 따른 방사선 민감제용 약학 조성물은 암에 대한 방사선 치료 증진 효과를 얻기 위하여, 유효성분으로서 성인을 기준으로 1 일 총 투여량이 화합물로서 1－1000 mg/kg이 되도록 임의로 수회 나누어서 투여할 수 있다. 상기 투여량은 암의 종류, 암의 진행 정도, 투여 경로, 성별, 나이, 체중, 건강상태 등에 따라 적절히 증감될 수 있다.

본 발명에 따른 암 치료용 약학 조성물 및 방사선 민감제용 약학 조성물은 본 발명에 따른 화학식 I의 화합물을 전체 조성물 총 중량에 대해 약 0.0001 ~ 10 중량%, 바람직하게는 0.001 ~ 1 중량%의 양으로 함유할 수 있다.

앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 신규 화합물은 PPAR-γ 리간드이면서, 각종 암에 대한 항암 활성을 가질 뿐만 아니라 암세포에 대해 선택적인 세포 독성을 가지므로 부작용을 최소화할 수 있는 항암제로서 작용할 수 있다. 또한, 암에 대한 방사선 치료에 있어서 방사선 치료 민감제로서 작용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 화합물 및 대조 화합물을 3T3-L1 세포에 10 μM 처리하여 약 2일(48시간) 동안 지방세포로의 분화를 유도한 다음 Oil-Red-O 염색법으로 분화유도 정도를 확인한 결과를 촬영한 사진이다.
도 2a는 본 발명의 일 구현예에 따른 화합물(PB 01)을 다양한 암세포주에 가하고 배양한 다음 WST-1 방법으로 세포 생존율을 산정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2b는 본 발명의 일 구현예에 따른 화합물(PB 11)을 다양한 암세포주에 가하고 배양한 다음 WST-1 방법으로 세포 생존율을 산정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 본 발명의 일 구현예에 따른 화합물(PB01 및 PB 11)을 A549 또는 H460 세포주에 가하고 배양한 다음 트립판블루 염색한 다음 현미경 관찰에 의해 얻어진 세포 생존율을 시험 화합물의 농도 및 시간의 변화에 따라 나타낸 그래프이다.
도 3b는 본 발명의 일 구현예에 따른 화합물 PB01, PB11, 또는 PB12를 H460 세포주에 가하고 배양한 다음 트립판블루 염색한 다음 현미경 관찰에 의해 얻어진 세포 생존율을 시험 화합물의 농도 및 시간의 변화에 따라 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 화합물(PB01 또는 PB11) 50uM을 H460 세포주에 가하고 48시간 배양한 다음 도립 현미경을 이용하여 200 배의 배율로 관찰한 결과를 촬영한 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 화합물(PB01 또는 PB11) 50uM을 H460 세포주에 가하고 48시간 배양한 다음, 세포를 Hoechst 염색 후 형광현미경을 이용하여 400 배의 배율로 암세포의 핵 형태 변화를 관찰한 결과를 촬영한 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 화합물(PB01 또는 PB11) 50uM을 A549 또는 H460 세포주에 가하고 48시간 배양한 다음, 세포를 Hoechst 염색 후 형광현미경을 이용하여 400 배의 배율로 암세포의 핵 형태 변화를 관찰하여, 핵의 응축 정도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 화합물(PB01 또는 PB11) 50 uM을 A549 또는 H460 세포주에 가하고 0 내지 48시간 배양하면서 배양배지로 방출된 LDH 양을 검출한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 A549와 H460를 PB01 또는 PB11로 48 시간 동안 50 μM 농도로 처리하여 배양한 다음 프로피듐 요오다이드로 염색 후 유세포 측정 방법에 의해 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9a는 A549와 H460를 PB01 또는 PB11로 40 시간 동안 50 μM 농도로 처리하여 배양한 다음 Annexin V Flous Staining kit를 사용하여 30 분간 어두운 곳에서 염색한 세포를 FACScan^TM(Becton Dicknson)을 사용하여 유세포 측정 방법에 의해 측정 후, 아폽토시스 비율을 산정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9b는 H460 세포주를 PB01, PB11, 또는 PB12로 40 시간 동안 처리하여 배양한 다음 Annexin V Flous Staining kit를 사용하여 30 분간 어두운 곳에서 염색한 세포를 FACScan^TM(Becton Dicknson)을 사용하여 유세포 측정 방법에 의해 측정 후, 아폽토시스 비율을 산정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 H460 세포에 PB01 또는 PB11을 48 시간 동안 50 μM 농도로 처리하여 배양한 세포로부터 추출한 단백질을 SDS-PAGE를 실시하여 분리한 다음 웨스텃블랏팅한 결과를 촬영한 사진이다.
도 11은 플레이트에 배양된 H460 세포를 시글리타존(10μM), PB01(10μM), 또는 PB11(5μM,10μM)로 처리하여 배양한 다음 γ선을 조사하고 14 일 동안 배양 후, 콜로니 형성 비율을 계산한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 플레이트에 배양된 H460 세포를 시글리타존(10μM), PB01(10μM), 또는 PB11(5μM,10μM)로 처리하여 배양한 다음 γ선을 조사하고 14 일 동안 배양 후, 콜로니 형성 비율에 기초하여 PB01 또는 PB11의 방사선 민감제로서의 효능을 나타낸 도표이다.
도 13는 플레이트에 배양된 H460 세포를 시글리타존(10μM), PB01(10μM), 또는 PB11(5μM,10μM)로 처리하여 배양한 다음 γ선을 조사하고 14 일 동안 배양 후, 콜로니 형성을 육안으로 관찰하여 촬영한 사진이다.
[도면의 부호에 대한 설명]
conc: 대조군
cig: 시글리타존

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1 : 화학식 Ⅲ의 제조

에틸-4-시클로헥사논 카르복실레이트(5.0 g, 29.0 mmol)의 메탄올 용액에 수산화나트륨 수용액(2.5g, 43.5 mmol)을 부가하였다. 그 반응 혼합물을 실온에서 교반하여 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 용매를 진공 하에서 제거하고, 조생성물을 물에 용해시키고, 1N 염산으로 pH를 3-4로 조정하였다. 그런 다음, 에틸아세테이트로 추출하고, Na₂SO₄를 이용하여 건조하고, 농축시켰다. 얻어진 조생성물을 실리카겔을 이용한 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 상기 화학식 Ⅲ의 화합물 4-시클로헥사논 카르복실산 (3.5 g, 85%)을 백색의 고체로서 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ10.50 (1H, s), 2.62-2.72 (1H, m), 2.30-2.10 (4H, m), 2.01-1.86 (4H, m); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ 210.8, 180.0, 44.5, 40.4(2C), 25.9(2C).

실시예 2 : 화학식 Ⅵ의 제조

6-아미노-2-머캅토 벤조티아졸(Ⅳ)(1.0 g, 5.49 mmol), 4-(클로로메틸)-3,5-디메틸이속사졸(V)(0.749 ml, 6.04 mmol) 및 K₂CO₃(1.8 g, 13.72 mmol)를 아세톤 중에서 8 시간 환류하였다. 반응이 완료된 후, 용매를 회전증발로 제거한 다음, 물에 용해하였다. 그런 다음, 에틸아세테이트로 추출하고, 탄산수소나트륨으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조한 다음, 농축시켰다. 얻어진 조생성물을 실리카겔을 이용한 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 상기 화학식 Ⅵ의 화합물(1.07 g, 67%)을 백색의 고체로서 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 7.62 (1H, d, J=8.8 Hz), 6.93 (1H, d, J=2.0 Hz), 6.74 (1H, dd, J=2.4, 8.4 Hz), 4.21 (2H, s), 3.87 (2H, s), 2.34 (3H, s), 2.27 (3H, s); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ 164.2, 159.9, 158.9, 146.6, 143.5, 135.9, 122.6, 119.4, 114.1, 105.4, 100.5, 19.4, 11.0, 6.3.

실시예 3 : 화학식 Ia의 화합물 (PB11)의 제조

4-시클로헥사논 카르복실산(Ⅲ)(3.12 g, 21.9 mmol), HBTU(9.169 g, 24.1 mmol) 및 DIEA(7.65 mL, 43.8 mmol)을 DMF 중의 화학식 Ⅵ의 아민 화합물(6.4 g, 21.9 mmol) 용액에 부가하였다. 그 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. DMF를 진공 하에서 제거하였고, 잔사를 에틸아세테이트 중에 희석하고, 탄산나트륨, 함수로 순서대로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 다음, 여과하였다. 용매를 진공 하에서 제거하였다. 얻어진 조생성물을 실리카겔을 이용한 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 상기 화학식 Ia의 화합물인 4-옥소-시클로헥산카르복실산 [2-(4,6-디메틸-2H-1,2-옥사진-5-일)술파닐-벤조티아졸-6-일]-아미드(7.0 g, 77%)을 백색의 고체로서 수득하였다.

¹H NMR (DMSO, 400 MHz): δ 10.23 (1H, s), 8.41 (1H, d, J=2.0 Hz), 7.80 (1H, d, J=8.8 Hz), 7.55 (1H, dd, J=2.0, 9.2 Hz), 4.38 (2H, s), 2.87-2.79 (1H, m), 2.49-2.10 (6H, m), 2.41 (3H, s), 2.24 (3H, s), 1.90 (2H, q, J=13.2 Hz); ¹³C NMR (DMSO, 100 MHz) δ 210.8, 173.0, 164.2, 159.9, 158.9, 149.1, 136.5, 135.3, 122.0, 119.4, 110.7, 100.5, 42.6, 40.0(2C), 26.8(2C), 19.4, 11.0, 6.3.

실시예 4 : 화학식 Ib(PB12)의 제조

상기 실시예 3에서 얻어진 케톤 유도체(Ia)(0.7 g, 1.68 mmol)의 에탄올 용액에 NaBH₄(0.76 g, 2.02 mmol)을 부가하였다. 그 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용매를 진공 하에서 제거하고, 얻어진 조생성물을 물에 용해시키고, 1N 염산으로 pH를 6-7로 조정하였다. 그런 다음, 에틸아세테이트로 추출하고, Na₂SO₄를 이용하여 건조하고, 농축시켰다. 얻어진 조생성물을 실리카겔을 이용한 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 상기 화학식 Ib의 화합물인 4-히드록시-시클로헥산카르복실산 [2-(4,6-디메틸-2H-1,2-옥사진-5-일)술파닐-벤조티아졸-6-일]-아미드(0.3 g, 43%)을 백색의 고체로서 수득하였다.

¹H NMR(CD₃OD, 400 MHz): δ 8.25 (1H, d, J=2.0 Hz), 7.73 (1H, d, J=9.2 Hz), 7.47 (1H, dd, J=2.4, 8.8 Hz), 4.32 (2H, s), 3.96-3.94 (1H, m), 2.43-2.41 (1H, m), 2.39 (3H, s), 2.27 (3H, s), 2.06 (2H, q, J=12.8 Hz), 1.87-1.83 (2H, m), 1.66-1.56 (4H, m); ¹³C NMR(CD₃OD, 100 MHz) δ 173.0, 164.2, 159.9, 158.9, 149.1, 136.5, 135.3, 122.0, 119.4, 110.7, 100.5, 72.3, 43.5, 33.3(2C), 23.1(2C), 19.4, 11.0, 6.3.

실시예 5 : 화학식 Ic 해당 화합물(PB01)의 제조

상기 실시예 4에서 얻어진 히드록시 유도체(Ib)(0.2 g, 0.48 mmol)의 THF 용액에 NaH(0.021 g, 0.528 mmol) 및 메틸 요오다이드(0.029 ml, 0.48 mmol)를 부가하였다. 그 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 용매를 회전증발로 제거하고 물에 용해하였다. 그런 다음, 에틸아세테이트로 추출하고, 탄산수소나트륨으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조한 다음, 농축시켰다. 얻어진 조생성물을 실리카겔을 이용한 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 상기 R⁵가 메틸에 해당하는 화학식 Ic의 화합물인 4-메톡시-시클로헥산카르복실산[2-(4,6-디메틸-2H-1,2-옥사진-5-일)술파닐-벤조티아졸-6-일]-아미드(0.080 g, 40%)을 백색의 고체로서 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃, 400 MHz): δ 7.88 (1H, d, J=8.4 Hz), 7.58 (1H, d, J=2.4 Hz), 7.24 (1H, dd, J=2.4, 8.8 Hz), 4.36 (2H, s), 3.56-3.54 (1H, m), 3.26 (3H, s), 2.48 (3H, s), 2.34 (3H, s), 2.11-2.08 (1H, m), 1.92-1.53 (6H, m), 0.96 (2H, q, J=13.2 Hz); ¹³C NMR(CDCl₃, 100 MHz) δ 173.0, 164.2, 159.9, 158.9, 149.1, 136.5, 135.3, 122.0, 119.4, 110.7, 100.5, 84.1, 57.1, 43.5, 30.8(2C), 23.4(2C), 19.4, 11.0, 6.3.

실시예 6 : PPAR-γ 리간드 검증 실험

상기 실시예 3에서 제조된 화합물(PB11) 및 실시예 5에서 제조된 화합물(PB01)이 PPAR-γ 리간드의 활성을 갖고 있는지를 지방세포 분화 유도 능력을 통해 검증하였다. 3T3-L1 세포(American Type Culture Collection, Manassas, VA)에 시험 화합물을 10 μM 처리하여 지방세포로의 분화를 유도하였다. 아무것도 처리하지 않은 그룹과 같은 농도의 시글리타존을 처리한 그룹을 비교군으로 사용하였다. 또한, PPAR-γ 리간드 안타고니스트로 알려진 GW9662(Cayman, Ann Arbor, MI)를 처리한 그룹을 대조군으로 사용하였다. 48시간 동안 분화유도한 다음 Oil-Red-O 염색법으로 분화유도 정도를 확인하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 화합물 및 대조 화합물을 3T3-L1 세포에 10 μM 처리하여 48시간 동안 지방세포로의 분화를 유도한 다음 Oil-Red-O 염색법으로 분화유도 정도를 확인한 결과를 촬영한 사진이다.

Oil-Red-O 염색법 결과 실시예 5의 화합물(PB01)은 PPAR-γ 리간드의 특성인 지방세포 분화를 유도하는데 있어서 탁월함을 확인할 수 있었다. 실시예 3의 화합물(PB11) 또한 지방세포 분화 유도에 있어서 매우 높은 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물은 PPAR-γ 리간드인 것으로 확인되었다.

실시예 7 : 암세포 생장 억제 효능 측정

PPAR-γ 리간드로 검증된 화합물 PB01과 PB11의 암세포 생장 억제 효능을 측정하였다. 다양한 암세포, 즉 인체 비소폐암 세포주(A549, H460), 유방암 세포주(MCF-7, T-470), 대장암 세포주(LoVo, SW480), 백혈암 세포주(HL-60, K562) (American Type Culture Collection;Manassas, VA) 들의 생장 억제 효능을 WST-1 방법을 통해서 측정하였다. 각각의 세포들을 96 웰 플레이트에 5 x 10³ /웰 씩 분주하고 200 ul의 배양액에 PB01과 PB11을 각기 다른 농도와 시간으로 배양하였다. 24시간, 48시간, 및 72시간 동안 배양시간 후, 각 웰마다 10 ul의 WST-1 용액을 첨가하고 37℃에서 1 시간 배양시킨 후 450 nm에서 측정하여, 세포생존율을 산정하여 그래프로 나타내었다. 그 결과를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.

도 2a는 본 발명의 일 구현예에 따른 화합물(PB 01)을 다양한 암세포주에 가하고 배양한 다음 WST-1 방법으로 세포 생존율을 산정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 2b는 본 발명의 일 구현예에 따른 화합물(PB 11)을 다양한 암세포주에 가하고 배양한 다음 WST-1 방법으로 세포 생존율을 산정한 결과를 나타낸 그래프이다.

각각의 세포주에서 PB01과 PB11 화학물질들의 50 μM 농도에서 생장 억제 효능이 탁월함을 확인할 수 있었다. 암세포 생장 억제 효능의 민감도는 세포주마다 조금씩 차이를 보였으나, 인체 비소폐암 세포주(A549, H460)에서 가장 민감한 효능을 나타내었다. 또한, 암세포주가 아닌 MRC-5와 MRC-9 폐세포에 대한 PB01과 PB11의 세포성장 억제 효과는 보이지 않았다. 이 두 세포에서는 세포성장 억제 효능이 비교적 거의 일어나지 않는 것을 통하여 PB01과 PB11은 암세포 주에만 선택적으로 세포성장 억제효능을 가지는 것으로 사료된다.

실시예 8 : 비소폐암 세포주의 사멸효능 측정 시험

상기 화합물 PB01과 PB11에 의한 비소폐암세포 증식억제 현상이 아폽토시스(apoptosis) 유발과 연관성이 있는지 조사하기로 하였다. 트립판블루 어세이(Trypan blue assay)에 의한 세포성장 억제를 조사하였고, 도립 현미경을 이용한 세포 형태를 관찰 하였다. 또한, Hoeschst 33342 염색에 의해 세포핵의 형태를 관찰하였으며, 아폽토시스 유발 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 flow cytometry로 분석하였다(FACS).

실험결과, A549와 H460 세포에서 PB01과 PB11의 IC₅₀은 50 μM 농도, 48 시간이었다. PB01과 PB11 두 물질 모두 폐암세포의 사멸 효능을 가지고 있었으며, 세포 사멸효능 메커니즘으로 아폽토시스를 유도한다는 사실을 알 수 있었다.

1) PB01과 PB11의 비소폐암세포 사멸 효과 측정

A549와 H460 세포주를 96웰 플레이트에 각각 5 x 10³/웰씩 분주하고 200 ul의 배양액에 PB01과 PB11을 10 내지 50 uM의 농도로 가하고 배양하였다. 8 내지 72 시간 배양 후, 세포를 회수하여 2,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 세포만 남긴 다음 다시 PBS(phosphate-buffered saline)를 1 ml씩 첨가하여 잘 섞은 세포부유액과 0.5% 트립판블루(Gibco BRL)를 동량으로 섞은 후 1 분간 처리하였고, 위상차 현미경을 이용하여 살아있는 세포 수를 계수하였다. 측정은 각각 세 번을 하였으며, 그에 대한 평균값과 표준오차를 Microsoft Excel 프로그램으로 구하였다. 그리하여 얻어진 화합물 농도 및 시간의 변화에 따른 세포 생존율을 그래프로 나타내었다. 또한, PB01 50 μM, PB11 50 μM, 또는 PB12 150 μM을 이용하여 동일한방식으로 실험한 뒤, 화합물 농도 및 시간의 변화에 따른 세포 생존율을 그래프로 나타내었다.

도 3a는 본 발명의 일 구현예에 따른 화합물(PB01 및 PB 11)을 A549 또는 H460 세포주에 가하고 배양한 다음 트립판블루 염색한 다음 현미경 관찰에 의해 얻어진 세포 생존율을 시험 화합물의 농도 및 시간의 변화에 따라 나타낸 그래프이다.

도 3b는 본 발명의 일 구현예에 따른 화합물 PB01, PB11, 또는 PB12를 H460 세포주에 가하고 배양한 다음 트립판블루 염색한 다음 현미경 관찰에 의해 얻어진 세포 생존율을 시험 화합물의 농도 및 시간의 변화에 따라 나타낸 그래프이다.

도 3a 및 3b의 결과에 따르면, 농도와 시간의 변화에 따라 암세포 사멸효과가 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 특히 50 μM PB01과 PB11를 처리한 그룹에서 암세포 사멸 효과가 탁월함을 알 수 있었다.

또한, 50 μM PB01, PB11을 처리한 후, 48 시간째에 H460 세포 형태변화를 도립현미경을 이용하여 200 배의 배율로 관찰하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 따르면, 본 발명의 일 구현예에 따른 화합물로 처리한 결과 암세포의 밀도가 감소하면서 부착력을 상실하고 배지 위로 부유되는 경향성이 증가함을 알 수 있었다. 따라서, 이러한 형태적 변화 정도가 증식억제와 부합되는 결과라고 할 수 있다.

2) PB01과 PB11에 의한 비소폐암세포의 핵산의 응축 및 분절 관찰

세포사가 유발되었을 경우 특이적으로 나타나는 핵의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 PB01과 PB11이 처리된 세포를 모은 다음 상층액을 제거하고 37% 포름알데하이드 용액과 PBS(phosphate buffered saline) 완충용액을 1:9의 비율로 섞어 만든 고정 용액을 500 μl 첨가하여 충분히 섞은 후, 상온에서 10분 동안 고정하였다. 고정된 세포를 2,000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 고정용액을 제거하고 PBS 완충용액으로 부유시킨 후, 슬라이드 글라스 위에 떨어뜨리고 1,000 rpm에서 5분간 사이토스핀하여 세포를 슬라이드 글라스에 부착하였다. 세포가 부착된 슬라이드 글라스에 2μg/ml Hoechst 33342(Sigma, St. Louis, MO, USA)용액을 처리하여 상온에서 20분간 염색하였다. 염색이 끝난 후, 염색약을 충분하게 세척하고 형광현미경(ECLIPSE E600; Nikon, Tokyo, Japan)을 이용하여 400 배의 배율로 암세포의 핵 형태 변화를 관찰하였다. 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.

도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 화합물(PB01 또는 PB11) 50uM을 H460 세포주에 가하고 48시간 배양한 다음, 세포를 Hoechst 염색 후 형광현미경을 이용하여 400 배의 배율로 암세포의 핵 형태 변화를 관찰한 결과를 촬영한 사진이다.

도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 화합물(PB01 또는 PB11) 50uM을 A549 또는 H460 세포주에 가하고 48시간 배양한 다음, 세포를 Hoechst 염색 후 형광현미경을 이용하여 400 배의 배율로 암세포의 핵 형태 변화를 관찰하여, 핵산의 응축 및 분절 정도를 나타낸 그래프이다.

도 5 및 6에 따르면, 정상 배지에서 자란 암세포의 경우에는 핵의 형태가 뚜렷하게 정상으로 염색이 되었으나, PB01 또는 PB11로 처리된 암세포의 경우 아폽토시스가 일어난 세포에서 전형적으로 관찰되는 핵산의 응축에 의한 아포토틱 바디가 증가되었다. 이상의 결과에서, PB01과 PB11에 의한 비소폐암세포에서의 증식억제 및 형태변화가 아폽토시스와 연관이 있음을 알 수 있었다.

3) PB01 또는 PB11에 의한 비소폐암세포에서 방출하는 LDH의 측정

상기 PB01 또는 PB11를 처리한 후, 각각의 배양 8, 24, 48시간 배양 상등액 만을 회수하였다. LDH 활성은 Cytotoxicity Detection Kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)를 이용하여 세포의 사이토졸로부터 배양배지로 방출된 LDH 양을 검출함으로써 측정할 수 있다. PB01과 PB11가 유도한 LDH 방출량은 세포외로 방출된 LDH 양과 세포내에 남아있는 LDH 양을 더한 전체 LDH 양에 대한 세포외로 방출된 LDH 양의 백분율을 통해 산출하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 화합물(PB01 또는 PB11) 50 uM을 A549 또는 H460 세포주에 가하고 0 내지 48시간 배양하면서 배양배지로 방출된 LDH 양을 검출한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 7의 결과에 따르면, PB01 또는 PB11를 처리한 그룹에서는 처리하지 않은 그룹에 비해 세포외로 방출된 LDH 양이 처리한 시간에 따라 증가함을 알 수 있었다. 따라서 PB01과 PB11를 처리한 그룹에서의 세포사멸 기작이 아폽토시스 기전일 것으로 사료된다.

실시예 9 : 비소폐암세포 사멸 반응 메커니즘 규명

1) sub-G1기 세포수의 변화에 미치는 PB01과 PB11의 영향 측정

A549와 H460를 PB01 또는 PB11을 48 시간 동안 50 μM 농도로 처리하여 배양하였다. 그런 다음, A549와 H460 세포를 회수하여, 1 X PBS (PH 7.4)로 부유시킨 뒤 차가운 70% 에탄올로 -20℃에서 고정하였다. 다시 1 X PBS로 2번 수세한 후, 프로피듐 요오다이드(Propidium iodide) 10 μg/mL (PI; 0.5%, Tween-20; 0.1% RNase 100 μg/ml 포함)로 상온에서 30 분간 염색하였다. 염색된 세포를 FACScan^TM(Becton Dicknson)을 사용하여 유세포 측정 방법에 의해 측정하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8은 A549와 H460를 PB01 또는 PB11로 48 시간 동안 50 μM 농도로 처리하여 배양한 다음 프로피듐 요오다이드로 염색 후 유세포 측정 방법에 의해 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 8에 따르면, PB01과 PB11 50 μM 농도로 처리한 경우 sub G1의 세포수가 급격히 증가하는 것을 알 수 있었다. sub G1기의 세포수가 증가하는 것을 통하여 세포가 아폽토시스를 통하여 세포사멸이 이루어지고 있는 것을 제시할 수 있다.

2) PB01과 PB11를 처리한 비소폐암 세포에서 세포사멸 세포수 측정

세포를 6-웰 플레이트에 5 X 10⁵ cells/well의 밀도로 분주한 후 위와 동일한 방법으로 PB01과 PB11을 처리하여 40 시간 동안 배양하였다. 세포단층을 PBS로 헹구고 트립신-EDTA를 처리하여 세포를 분리하여 수집한 후, Annexin V Flous Staining kit(Roche Applied Science, Penzberg, Germany)를 사용하여 30분간 어두운 곳에서 염색하였다. 염색된 세포를 FACScan^TM(Becton Dicknson)을 사용하여 유세포 측정 방법에 의해 사멸된 세포수를 측정하고 아폽토시스 비율을 산정하였다. 또한, PB01 50 μM, PB11 50 μM, 또는 PB12 150 μM을 이용하여 동일한방식으로 실험한 뒤, 화합물 농도 및 시간의 변화에 따른 세포 생존율을 그래프로 나타내었다.

그 결과를 도 9a 및 도 9b에 나타내었다.

도 9a는 A549와 H460를 PB01 또는 PB11로 40 시간 동안 50 μM 농도로 처리하여 배양한 다음 Annexin V Flous Staining kit를 사용하여 30 분간 어두운 곳에서 염색한 세포를 FACScan^TM(Becton Dicknson)을 사용하여 유세포 측정 방법에 의해 측정 후, 아폽토시스 비율을 산정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 9b는 H460 세포주를 PB01, PB11, 또는 PB12로 40 시간 동안 처리하여 배양한 다음 Annexin V Flous Staining kit를 사용하여 30 분간 어두운 곳에서 염색한 세포를 FACScan^TM(Becton Dicknson)을 사용하여 유세포 측정 방법에 의해 측정 후, 아폽토시스 비율을 산정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 9a 및 도 9b에 따르면, 본 발명에 따른 화합물이 아폽토시스 유발에 의해 비소폐암 세포를 사멸하는 것임을 알 수 있다.

3) 비소폐암 세포에서의 세포사멸 관련 단백질 측정

상기 A549와 H460를 PB01 또는 PB11을 48 시간 동안 50 μM 농도로 처리하여 배양한 세포를 lysis buffer (1% Triton X-100, 1mM EGTA, 1mM EDTA, 10mM Tris-HCl, pH 7.4)에 넣어 세포를 용해한 후 얼음에서 30 분 둔 후 원심분리하여 단백질을 추출하였고, 10 ~ 15% 겔(gel)로 SDS-PAGE를 실시하였다. 분리된 단백질은 10 V에서 2 시간 동안 전기적 방법으로 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮긴 후, 멤브레인을 blocking buffer (1 X TBS, 0.1% Tween-20, 5% skim milk)에 넣고 상온에서 1 시간 반응시킨 후 각각의 일차 항체를 처리하여 4℃에서 밤새도록 반응시키고 HRP 결합을 가진 anti-goat, anti-rabbit과 anti-mouse 2차 항체를 사용해 다시 1 시간 동안 반응시킨 뒤 ECL-plus(Amersham Biosciences) 시스템을 이용하여 발색시키고 필름에 감광시켰다. 그 결과를 촬영한 사진을 도 10에 나타내었다.

도 10은 H460 cell에 PB01 또는 PB11을 48 시간 동안 50 μM 농도로 처리하여 배양한 세포로부터 추출한 단백질을 SDS-PAGE를 실시하여 분리한 다음 웨스텃블랏팅한 결과를 촬영한 사진이다.

앞의 실험들을 통하여 세포사멸 기작이 아폽토시스를 통해서 이루어진다는 사실을 알 수 있었으므로, 세포사멸 과정 중 세포 내의 아폽토시스 관련 단백질의 변화와 아폽토시스의 반응 기작을 정확히 밝혀내고자 상기 웨스턴블랏팅을 실시한 것이다. 아폽토시스의 대표적인 세포내 단백질들의 변화를 측정한 결과, 도 10에 따르면 아폽토시스 개시단백질인 caspase-8의 활성을 확인할 수 있었다. 또한 그 다음 단계인 Bid, caspase-9, caspase-3, 그리고 PARP 단백질의 활성이 유도되고 있는 것을 알 수 있었다. 따라서 이러한 단백질들의 활성 기작을 통해 아폽토시스가 유발되는 것으로 확인되었다.

실험예 10: 방사선 민감성 측정

H460 세포를 60 mm 세포배양 플래이트에 500개씩 부유시킨 다음, 24시간 동안 배양하였다. 세포가 바닥에 잘 붙어 안정된 것을 확인한 후, 시글리타존(10μM), PB01(10μM), 또는 PB11(5μM,10μM)을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 24 시간 후에, 2, 4, 그리고 6 Gy 세기로 γ-조사(3.2 Gy/min, Gammacell 3000; Atomic Energy of Canada, Ltd., Mississauga, ON, Canada)을 조사하였다. 14 일 동안 배양한 후, 메탄올에 1%로 만든 크리스탈 바이올렛 염색약으로 염색하여 직경이 0.5 mm이상인 콜로니만 계수하였다. 계수된 콜로니수를 이용하여 하기 식에 따라 콜로니 형성 비율을 계산한 결과를 도 11에 그래프로 나타내었다.

SF ( surviving fraction )= number of colonies formed / number of cells seeded X plating efficiency of the control group

도 12는 방사선 조사와 함께 처리된 PB01 또는 PB11의 방사선 민감제로서의 효능을 콜로니 형성 계수를 통해 얻은 결과를 기초로 나타낸 도표이다. 투여량 증가율의 수치가 1 이상이면서 2 이하일 경우에 민감제로서의 효능이 있다고 제시할 수 있다. 따라서, 4Gy의 방사선 조사와 함께 PB01(10μM), PB11(5μM)로 처리할 경우 매우 높은 방사선 민감제로서의 효능을 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었다.

도 13은 콜로니 형성을 육안으로 관찰하여 촬영한 사진이다.

Claims

하기 화학식 I의 화합물, 약학적으로 허용 가능한 그의 염, 또는 그의 용매화물:
[화학식 I]

상기 화학식 I에서,
-R¹은 C₁-C₃알콕시, =O, 또는 -OH 이고,
-R²는 질소 및 산소에서 선택된 1-2개의 헤테로 원자를 함유하는 5 내지 6 원의 헤테로아릴로서, 헤테로아릴의 탄소는 C₁-C₃알킬, C₁-C₃알콕시, 또는 히드록시로 선택적으로 치환된다.
제1항에 있어서, 상기 -R¹은 메톡시인 화합물, 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염 또는 용매화물.
제1항에 있어서, 상기 -R²는 2H-1,2-옥사진-5-일, 6H-1,2-옥사진-5-일, 2H-1,3-옥사진-5-일, 4H-1,3-옥사진-5-일, 이속사졸-4-일, 또는 옥사졸-4-일인 화합물, 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염 또는 용매화물.
제1항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물은 하기 화합물로 구성된 군에서 선택된 화합물, 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염 또는 용매화물:
4-메톡시-시클로헥산카르복실산 [2-(4,6-디메틸-2H-1,2-옥사진-5-일)술파닐-벤조티아졸-6-일]-아미드;
4-옥소-시클로헥산카르복실산 [2-(4,6-디메틸-2H-1,2-옥사진-5-일)술파닐-벤조티아졸-6-일]-아미드; 및
4-히드록시-시클로헥산카르복실산 [2-(4,6-디메틸-2H-1,2-옥사진-5-일)술파닐-벤조티아졸-6-일]-아미드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염 또는 용매화물을 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
제5항에 있어서, 상기 암은 폐암, 유방암, 대장암, 또는 백혈암인 약학 조성물.
제6항에 있어서, 상기 폐암은 비소세포폐암인 암 치료용 약학 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염 또는 용매화물을 포함하는 암에 대한 방사선 치료 민감제용 약학 조성물.
제8항에 있어서, 상기 암은 폐암, 유방암, 대장암, 또는 백혈암인 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 폐암은 비소세포폐암인 약학 조성물.