KR20130124110A - 항균 활성 및 항암 활성이 강화된 리소좀의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항균 활성 및 항암 활성을 갖는 리소좀 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 리소좀을 유효성분으로 포함하는 항균조성물 및 상기 제조방법에 의해 제조된 리소좀을 유효성분으로 포함하는 항암조성물에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 상기 항균 활성 및 항암 활성을 갖는 리소좀 제조방법은 아미노말단 펩티드 가수분해효소 유전자 및 조절유전자를 진핵생물에 도입하여 돌연변이를 제조하는 단계; 상기 아미노말단 펩티드 가수분해효소 및 조절유전자가 도입된 돌연변이를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 돌연변이로부터 리소좀을 수득하는 단계를 포함하는 리소좀 제조방법에 의하면, 상기 리소좀은 기존 리소좀에 비하여 항균 활성 및 항암 활성이 현저히 개선되는 것으로 확인되었다.

Description

항균 활성 및 항암 활성이 강화된 리소좀의 제조방법{A METHOD OF PREPARING LYSOSOME HAVING ANTIBACTERIAL ACTIVITY AND ANTI-CANCER ACTIVITY}

본 발명은 항균 활성 및 항암 활성이 강화된 리소좀 제조방법에 관한 것이다.

항생제란 통상적으로 항미생물제를 총칭하는 것으로, 특히 세균에 대한 항균작용을 하는 물질, 상세하게는 세균이 세포벽이나 단백질 등을 합성하는 시스템을 저해시킴으로써 뛰어난 항균작용을 하는 물질 또는 이러한 물질로부터 제조된 것을 의미한다. 항생제의 성분은 주로 곰팡이로부터 추출된 것이 주를 이루었으며, 오늘날 세균 감염에 의한 질병 등을 치료하기 위해 많이 사용되고 있다.

상기 항생제의 남용과 합성 농약의 남용으로 인해 항생제 내성 균주의 출현과 저항성 병해충의 증가, 과다 항생제 사용이나 과다 농약 사용에 의한 농축산물에의 항생제 또는 농약의 잔류 문제, 환경오염으로 인한 생태계의 파괴 등으로 인해 국제적으로 항생제 및 화학적인 합성 농약의 사용을 줄이려는 추세를 보이고 있다.

한편, 화학적으로 합성된 합성 농약에 대한 대체제로 생물농약, 구체적으로 미생물 농약이 제시되고 있다. 그러나, 다양한 살균제 및 살충제가 출시되고 있음에도, 소재 자체가 살아 있는 미생물이라는 이유로 시장에서 커다란 호응을 얻지는 못하고 있다.

그러므로, 기존 화학적으로 합성되는 농약 및 항생제를 대체할 대체제에 대한 요구가 증가함에 따라, 이에 대한 기술개발이 미진한 현재의 문제점을 해결하기 위한 연구개발의 필요성이 증대되고 있다.

특히, 농업경쟁력 및 농가 소득 보장 등 농업인들의 기술적 애로를 해결하기 위하여, 저렴하고 대량생산이 가능하면서도 효과가 우수한 천연물 유래 항균제 또는 합성 농약 및 항생제를 대체할 수 있는 천연물 유래 제품의 개발이 요구되고 있다.

또한, 암은 제어되지 않는 세포성장으로 특징 지어지며, 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양(tumor)이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 정상조직 또는 기관으로 침윤하여 파괴하고 새로운 성장장소를 만들 수 있어 개체의 생명을 빼앗아 갈 수 있는 질환군을 총칭한다.

이러한 암은 인류가 해결해야 할 난치병 중의 하나로, 전 세계적으로 이를 치유하기 위한 개발에 막대한 자본이 투자되고 있고, 의학 기술 또한 혁신적으로 발전하고 있음에도, 암의 발생 및 암에 의한 사망은 계속 증가추세에 있다. 세계 보건 기구의 최근 통계 자료에 의하면 전 세계적으로 연간 약 1천만 명 이상의 새로운 암환자가 발생하는 것으로 알려져 있으며, 우리나라에서도 암은 가장 높은 사망원인으로 연간 약 십만 명 이상이 진단되고, 약 6만 명 이상이 암에 의해 사망하고 있다.

암의 발생요인으로는 여러 가지가 있으며, 유전인자 또는 면역학적 요인 등의 내적 요인과 화학물질, 방사선 또는 바이러스 등의 외적 요인으로 구분되기도 한다. 특히, 최근 암 환자의 증가와 관련하여, 현대 사회에서 암이 발생되는 원인은 유전적 요인보다 환경적 요인이 더 큰 비중을 차지하고 있는 것으로 알려져 있고, 특히 식생활에서 오는 발암률은 환경적 요인의 36%로서 매우 높은 것으로 알려져 있다. 따라서, 현대 사회에서의 생활환경이 근원적으로 변화되지 않는 이상 이러한 암의 발병률 및 암에 의한 사망자 수의 증가추세는 계속해서 유지될 것으로 보인다.

항암제와 관련하여, 기존 화학요법에 사용되던 화학물질의 경우 강한 세포독성으로 인하여 많은 부작용이 유발되므로, 종래 천연물 유래 항암제를 개발하려는 연구가 이루어지고 있다. 이러한 천연물 유래 항암제로 대표적인 것은 주목나무에서 분리한 택솔(Taxol; 파클리탁셀)이 있으나, 암세포 사멸뿐만 아니라 신체 내 다른 정상세포에도 작용하기 때문에 다른 질환을 유발할 수 있는 문제점을 안고 있으며, 물에 대한 용해도가 낮아서 독성 및 부작용이 심각한 것으로 보고되어 있다.

KR 10-0853717B KR 10-2010-0130842A KR 10-2012-0011697A

상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 항균 활성 및 항암 활성이 강화된 리소좀 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 항균 활성 및 항암 활성을 갖는 리소좀을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항균 활성 및 항암 활성을 갖는 리소좀 제조방법을 제공한다.

상기 항균 활성 및 항암 활성을 갖는 리소좀 제조방법은 아미노말단 펩티드 가수분해효소 유전자 및 조절유전자를 진핵생물에 도입하여 돌연변이를 제조하는 단계; 상기 아미노말단 펩티드 가수분해효소 및 조절유전자가 도입된 돌연변이를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 돌연변이로부터 리소좀을 수득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 아미노말단 펩티드 가수분해효소 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.

상기 조절유전자는 유전자 GAL 프로모터(GAL Promoter), lac 프로모터(lac Promoter), tac 프로모터(tac Promoter), trc 프로모터(trc Promoter), 아라비노스 프로모터(Arabinose Promoter) 및 trp 프로모터(trp Promoter)로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 GAL 1, GAL 3 또는 GAL 10일 수 있다.

상기 진핵생물은 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.) 미생물일 수 있고, 바람직하게는 사카로마이세스 세르비지에(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다.

상기 돌연변이를 제조하는 단계는 상기 아미노말단 펩티드 가수분해효소 유전자 및 상기 조절유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 과정 및 상기 벡터를 진핵생물에 도입하는 과정을 포함하는 방법으로 수행하는 것일 수 있다.

상기 아미노말단 펩티드 가수분해효소 및 조절유전자가 도입된 돌연변이를 배양하는 단계는 상기 돌연변이를 갈락토스(galactose)가 포함된 배지에서 배양하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 배양하는 단계는 27℃ 내지 29℃, 바람직하게는 28℃에서 수행할 수 있다.

상기 배양된 돌연변이로부터 리소좀을 수득하는 단계는 상기 돌연변이에 대해 세포분획하는 방법으로 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 리소좀 제조방법에 의해 제조된 리소좀을 유효성분으로 포함하는 항균조성물을 제공한다.

상기 항균조성물은 대장균(E. coli), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 잔토모나스 오리제(Xanthomonas oryzae), 스트렙토마이세스 알부스(Streptomyces albus), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 및 데니오코커스 라디오필러스(Deinococcus radiophilus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 대한 항균 활성을 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 항균조성물을 유효성분으로 포함하는 동물 사료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 리소좀 제조방법에 의해 제조된 리소좀을 유효성분으로 포함하는 항암조성물을 제공한다.

본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 명세서에서 특별히 다르게 정의되지 않은 이상, 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지며, 일 예로, 싱글레톤 등의 미생물학 및 세포 생물학 사전(2nd ed.(1994)); 과학과 기술의 캠브리지 사전; R. 리거 등의 유전학 용어 사전(5TH ed.), 헤일, 말햄 및 하퍼 콜린스의 생물학 사전(1991)에 기재된 용어를 이해한다.

본 명세서에서 돌연변이는 야생형 생물 또는 야생형 세포에 외래형 유전자를 도입시킨 형질전환체를 의미한다.

본 명세서에서 조절유전자는 유전자 발현을 조절할 수 있는 DNA 또는 RNA를 의미하고, 발현 조절 서열 또는 조절 서열(regulatory sequence)일 수 있다. 상기 조절유전자는 상기 조절유전자에 작동가능하게 연결된 뉴클레오타이드 서열의 발현(전사 및/또는 번역)을 조절하는 폴리뉴클레오타이드 내 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 상기 작동가능하게 연결된(operably linked)이란 의미는 다른 부분(예를 들어 서열의 전사)의 활성을 야기하는 한 부분(예를 들어 전사를 조절하는 능력)의 활성에 있어서 두 부분 사이의 상호 간에 기능적 관계(functional relationship), 예를 들면 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있도록 연결 관계에 있는 코딩 서열과 조합된 조절 서열 또는 그러한 조합을 의미한다.

상기 조절유전자는 프로모터 서열(예를 들어, 유도 가능한 또는 구성 요소인), 인핸서(engancer), 사일랜서(silencer), 전사종결자(transcription terminator), 시작 코돈(즉, ATG), 샤인 달가노(Shine-Dalgarno) 서열, TATA-박스(TATA-box), 전사 인자의 부착 부위, 폴리아데닐화 부위(polyadenylation site), 인트론을 위한 스프라이싱 신호 또는 종결 코돈일 수 있으며, 바람직하게는 유전자 발현을 유도할 수 있는 염기서열, 일 예로 프로모터 서열일 수 있다.

본 명세서에서 프로모터는 RNA 폴리머라제(RNA polymerase)가 전사를 개시하기 위해 결합하는 DNA 또는 RNA의 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 상기 프로모터는 유도성이거나 구성성일 수 있다.

본 명세서에서 벡터는 그에 연결된 또 다른 폴리뉴클레오타이드를 수송할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 즉, 핵산 분자를 의미한다. 상기 벡터는 자발적 복제를 수행할 수 있거나, 숙주 DNA로 통합될 수 있다. 상기 벡터는 일 예로 외래 폴리뉴클레오타이드의 삽입을 위한 제한 효소 인식 부위를 포함하고, 하나 이상의 선택 마커(selectable marker)를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 발현 벡터는 발현되는 뉴클레오타이드 서열에 가동적으로 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 의미한다. 상기 발현 벡터는 일 예로, 코스미드(cosmids), 플라스미드 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 바이러스 등일 수 있다.

본 명세서에서 재조합 폴리뉴클레오타이드는 자연적으로 함께하지 않은 서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 증폭되거나 조립된 재조합 폴리뉴클레오타이드는 적합한 벡터에 포함될 수 있고, 벡터는 적합한 호스트 세포를 변형시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 호스트 세포는 재조합 호스트 세포일 수 있다.

본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 항균은 항세균 및 항진균을 포함하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 유효한 양이란 대상의 건강 상태, 병리학 및 질병 또는 진단 목적에 따라 의도한 결과를 만들기에 충분한 용량을 의미한다. 의도한 결과는 용량을 받는 사람에 있어서 객관적 또는 주관적 개선을 포함할 수 있다.

또한, 치료약학적으로 유효한 용량은 건강상 의도된 이익의 결과를 만들기에 유효한 제제의 양을 의미한다.

본 명세서에서 약학적 조성물이란 인간 및 포유 동물을 포함하는 대상 동물에서 약학적으로 사용되기 적합한 조성물을 의미한다. 상기 약학적 조성물은 치료학적인 리소좀을 약물학적으로 유효한 양으로 포함하고, 또한 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 첨가제를 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 배양물이란 특정 미생물을 배양배지 또는 배양액에서 배양한 것을 의미하며, 상기 배양물은 상기 특정 미생물을 포함하는 배양물 또는 상기 미생물을 제균한 제균 배양물을 포함하는 것일 수 있다. 상기 배양물 또는 배양물의 농축물은 그 제형이 한정되지 아니하고, 일 예로 상기 제형은 액체 또는 고체일 수 있다.

본 명세서에서 배지는 특정 미생물을 배양하기 위하여, 배양대상 즉, 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다.

본 발명의 발명자들은 천연소재 유래의 항균 물질 및 항암 물질에 대해 연구하던 중, 종래 항균 활성이 인정된 리소좀과 관련하여, 리소좀 내에 존재하는 아미노말단 펩티드 가수분해효소 유전자를 과발현시키는 경우, 항균 활성 및 항암 활성이 개선될 수 있다는 것을 확인하였고, 추가로 상기 아미노말단 펩티드 가수분해효소 유전자의 도입 후 발현 유도와 관련하여 GAL 프로모터에 의해 과발현을 유도하면서 28℃에서 배양하는 경우, 과발현된 아미노말단 펩티드 가수분해효소가 봉입체(inclusion body)를 생성하지 않고 리소좀 내로 잘 도입(targeting)될 수 있다는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 항균 활성 및 항암 활성을 갖는 리소좀 제조방법에 관한 것으로 상기 제조방법에 의해 제조된 리소좀은 통상의 리소좀에 비하여 항균 활성 및 항암 활성이 개선될 수 있다.

상기 리소좀(lysosome)은 진핵세포 내에 가수 분해 효소를 많이 지니고 있어서, 세포 내 성분의 대사에 관계하는 것 외에 특히 식세포작용으로 외계 이물질의 세포내 소화에 중요한 역할을 수행하는 세포소기관을 의미한다.

상기 리소좀은 세포 내 소기관인 미토콘드리아와 다르게 한 겹의 막구조로 싸여 있으며, 이 내부는 가수분해효소 일 예로, 아미노말단 펩티드 가수분해효소는(aminopeptidase)와 같은 단백질 분해효소(protease), 산성 탈인산가수분해효소, 리보핵산 가수분해효소, β-글루클로리타아제 또는 아릴설퍼타아제 등이 포함되어 있다.

상기 항균 활성 및 항암 활성을 갖는 리소좀 제조방법은 아미노말단 펩티드 가수분해효소 유전자 및 조절유전자를 진핵생물에 도입하여 돌연변이를 제조하는 단계; 상기 아미노말단 펩티드 가수분해효소 및 조절유전자가 도입된 돌연변이를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 돌연변이로부터 리소좀을 수득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 돌연변이를 제조하는 단계는 상기 아미노말단 펩티드 가수분해효소 유전자 및 상기 조절유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 과정 및 상기 벡터를 진핵생물에 도입하는 과정을 포함하는 방법으로 수행하는 것일 수 있다.

상기 아미노말단 펩티드 가수분해효소는(aminopeptidase)는 단백질 분해효소(protease)의 하나로, 엑소펩티다아제에 속하며 폴리펩티드 사슬의 N말단(아미노말단) 측에서 순서대로 하나씩 아미노산을 유리시킨 효소군이며, EC 3.4.11군이다.

상기 아미노말단 펩티드 가수분해효소는 아미노말단 펩티드 가수분해효소 Y(aminopeptidase Y)일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 아미노말단 펩티드 가수분해효소일 수 있다. 상기 아미노말단 펩티드 가수분해효소 Y(aminopeptidase Y, APY)는 산화적 스트레스에 의해 증가하는 리소좀 내에 효소 중에 하나이다.

상기 아미노말단 펩티드 가수분해효소 유전자는 상기 아미노말단 펩티드 가수분해효소 Y를 암호화하는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.

상기 조절유전자는 유전자 발현을 조절, 구체적으로 유전자 발현을 유도할 수 있는 염기서열을 의미하며, GAL 프로모터(GAL Promoter), lac 프로모터(lac Promoter), tac 프로모터(tac Promoter), trc 프로모터(trc Promoter), 아라비노스 프로모터(Arabinose Promoter) 및 trp 프로모터(trp Promoter)로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 GAL 프로모터(GAL Promoter)일 수 있다. 상기 GAL 프로모터는 갈락토스(galactose)에 의해 발현이 유도되는 유도성 프로모터일 수 있고, 일 예로, GAL 1, GAL 3 또는 GAL 10 등일 수 있다. 상기 GAL 1은 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 진핵생물은 크게는 효모 등의 균류와 유즐동물이나 측생동물 등을 포함하는 후편모생물(Opisthokonta) 및 아메바조아(Amoebozoa)를 포함하는 단편모생물과 다세포 동물 및 식물을 포함한 쌍편모생물을 모두 포함하는 개념으로, 구체적으로 진핵 미생물 또는 진핵 동물세포일 수 있고, 바람직하게는 진핵 미생물일 수 있다. 상기 진핵 미생물은 효모, 바람직하게는 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.) 미생물, 더욱 바람직하게는 사카로마이세스 세르비지에(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다. 또한, 상기 진행 동물세포는 Hela Cell(HC 18802) 등일 수 있다.

상기 돌연변이를 제조하는 단계는 상기 아미노말단 펩티드 가수분해효소 유전자 및 상기 조절유전자를 진핵생물에 도입하는 방법으로 수행할 수 있으며, 구체적으로 아미노말단 펩티드 가수분해효소 유전자 및 상기 조절유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 과정 및 상기 벡터를 진핵생물에 도입하는 과정을 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 벡터는 상기 아미노말단 펩티드 가수분해효소 유전자 및/또는 상기 조절유전자의 삽입을 위한 제한 효소 인식 부위를 포함하고, 하나 이상의 선택 마커(selectable marker)를 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 단백질의 발현이 가능한 발현벡터일 수 있다.

상기 벡터를 진핵생물에 도입하는 과정은 통상의 형질전환(translation) 또는 형질감염(transfection)에 사용되는 방법에 의할 수 있고, 상세하게 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 외래 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 다양한 기법일 수 있으며, 상기 방법은 상기 도입되는 벡터 및 진핵생물의 종류에 의해 의존적으로 선택될 수 있다. 일 예로, 상기 방법은 인산칼슘 또는 염화칼슘 공-침전(co-precipitation), DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 리포좀 매개 형질감염(lipofection), 화학천공(chemoporation) 또는 전기천공(electroporation)법으로 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 아미노말단 펩티드 가수분해효소 및 조절유전자가 도입된 돌연변이를 배양하는 단계는 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 통상의 방법에 따라 배양된다. 일 예로, 상기 돌연변이는 통상의 배지, 구체적으로 탄소원, 효모 추출물과 같은 유기 질소원 또는 암모늄 설페이트와 같은 염의 형태인 질소원 및 철, 망간 또는 마그네슘과 같은 미량 원소(trace element) 및 필요에 따란 비타민을 포함하는 배지에서 배양될 수 있다. 상기 배지는 바람직하게는 갈락토스(galactose)가 포함된 배지일 수 있다.

따라서, 상기 돌연변이를 배양하는 단계는 상기 갈락토스(galactose)가 포함된 배지에서 배양하는 방법으로 수행할 수 있다.

또한, 상기 돌연변이를 배양하는 단계는 27℃ 내지 29℃, 바람직하게는 28℃에서 수행할 수 있다.

상기 배양된 돌연변이로부터 리소좀을 수득하는 단계는 상기 돌연변이에 대해 세포분획하는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 리소좀은 세포 분해물 또는 세포 마쇄액을 원심분리하는 방법으로 수행하는 세포 원심분획법에 의할 경우, 미토콘드리아와 마이크로솜의 중간으로 분획된다.

따라서, 상기 배양된 돌연변이로부터 리소좀을 수득하는 단계는 원심분획법으로 수행할 수 있고, 구체적으로 균질화하는 단계 및 원심분리하는 단계를 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 진핵세포를 균질화하는 단계 및 상기 균질화시킨 진핵세포를 원심분리하는 단계를 포함하는 방법으로 수행할 수 있고, 더욱 상세하게는, 상기 진핵세포를 균질화하는 단계; 상기 균질화시킨 진핵세포를 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 하층액을 수득하는 단계 및 상기 하층액을 원심분리한 후, 상층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.

일 예로, 상기 리소좀을 수득하는 방법은 원심분획법일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 진핵세포를 균질화하는 단계; 상기 균질화시킨 진핵세포를 18,000 x g 내지 22,000 x g의 조건으로 20분 내지 40분간 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 하층액을 수득하는 단계 및 상기 하층액을 450 x g 내지 550 x g의 조건으로 3분 내지 7분간 원심분리한 후, 상층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법일 수 있다.

상기 균질화하는 단계는 균질기 또는 호모게나이저를 이용하는 방법으로 수행할 수 있고, 상기 균질기 또는 호모게나이저 외에 시료인 세포를 마쇄할 수 있는 분쇄기 또는 마쇄할 수 있는 방법이라면 그 종류가 제한되지 아니한다. 상기 각 단계에서의 원심분리는 3℃ 내지 5℃에서 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 리소좀 제조방법에 의해 제조된 리소좀을 유효성분으로 포함하는 항균조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 항균조성물이란 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항균제, 살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미일 수 있으며, 바람직하게는 그람 양성균 및 그람 음성균의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질을 의미한다.

본 발명의 항균조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 상기 리소좀 제조방법에 의해 제조된 리소좀을 0.001 내지 99.99중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있으며, 상기 항균조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 유효성분의 함량을 적절히 조절할 수 있다.

상기 항균조성물은 병원성 미생물 및 병원성 진균에 대한 항균 활성을 갖는 항균조성물일 수 있고, 구체적으로는 병원성 미생물의 경우 그람 양성균 또는 그람 음성균일 수 있다.

상기 항균조성물은 대장균(E. coli), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 코리네박테리움 속 균주 (Corynebacterium. sp), 잔토모나스 속 균주 (Xanthomonas. sp), 스트렙토마이세스 속 균주(Streptomyces. sp), 시겔라 속 균주(Shigella. sp) 및 데니오코커스 속 균주(Deinococcus. sp)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 대한 항균 활성을 갖는 것일 수 있고, 바람직하게는 대장균(E. coli), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 잔토모나스 오리제(Xanthomonas oryzae), 스트렙토마이세스 알부스(Streptomyces albus), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 및 데니오코커스 라디오필러스(Deinococcus radiophilus) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 대한 항균 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 항균조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용되어 항균 활성을 나타낼 수 있다.

상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하며, 소화나 배설 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하고, 구체적으로는 극피동물, 갑각류, 연체동물, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류일 수 있다.

본 발명의 항균조성물은 상기 리소좀 제조방법에 의해 제조된 리소좀 외에 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류를 포함할 수 있다.

상기 당질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일 예로 벌꿀, 덱스트린, 수크로오스, 팔라티노스, 포도당, 과당, 물엿, 당알콜(sugar alcohol), 소르비톨, 크실리톨, 말티톨일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 단백질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 카제인(casein), 유청 단백질(whey protein) 등의 우유 유래 단백질, 대두 단백질, 이들 단백질의 트립신, 펩신 등의 동물 유래 효소 및 뉴트라아제(neutrase), 알칼라아제(alkilase)에 의한 가수분해물일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 지질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일 예로, 제1가 포화지방산, 다가 불포화지방산을 포함하는 해바라기유, 채종유(rapeseed oil), 올리브유, 홍화유(safflower oil), 옥수수유, 대두유, 팜유(palm oil), 야자유 등의 각종 식물 유래 유지, 중쇄 지방산(middle-chain fatty acid), EPA, DHA, 대두유래 인지질, 우유 유래 인지질일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 비타민류는 특별한 제한은 없으며, 상기 미네랄류는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 인산칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨, 유산칼슘, 글루콘산칼슘, 판토텐산칼슘, 카제인칼슘, 염화마그네슘, 황산제1철, 탄산수소나트륨일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류 중 어느 것에 대해서도, 조성물의 항균성이 유지되는 한 상기 구체예에 한정되지 않고 다른 성분을 포함할 수 있으며, 각각의 함량은 항균성이 유지되는 한 제한되지 아니하고, 바람직하게는 전체 조성물 대비 0.1 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.5 내지 10 중량%일 수 있다.

본 발명의 상기 항균조성물은 항균 활성이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있으며, 구체적으로는 병원성 미생물 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물, 동물 사료용 조성물, 동물 사료용 첨가물, 식품, 식품 첨가제, 음료, 화장료 조성물, 화장품 첨가물 또는 세정제의 용도로 사용될 수 있다.

추가적으로, 본 발명은 상기 리소좀 제조방법에 의해 제조된 리소좀을 유효성분으로 포함하는 친환경 항균제일 수 있다. 상기 친환경 항균제는 도 5에서 확인된 바와 같이, 일반 진핵생물에서 분리한 리소좀보다 다양한 미생물 및 진균에 대해 더 우수한 항균활성이 인정되고, 친환경적이므로 인체 및 농축산물에 무해한 물질로서 안심하고 사용할 수 있는 유리한 효과가 있다.

상기 친환경 항균제는 미생물 농약을 대체한 가축 산업 및 농업 산업에 적용할 수 있고, 일례로서 가축 산업에는 가축 사료 첨가제나 가축의 항생제 대신 사용할 수 있으며, 농업 산업에는 미생물 농약대신 친환경 농약제로 사용가능할 수 있다. 또한, 일반 생활에 쓰이는 항균제 대신 대체 항균제로 사용 가능할 수 있다. 일 예로, 항균 스프레이로 개발하여 공기 중의 세균이나 자동차 시트, 옷 등에 스프레이하는 형식으로 사용될 수 있다.

이러한 측면에서, 본 발명은 상기 항균조성물을 유효성분으로 포함하는 동물 사료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항균조성물을 포함하는 동물 사료용 조성물을 제공한다.

상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하며, 소화나 배설 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하고, 구체적으로는 극피동물, 갑각류, 연체동물, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류일 수 있으며, 일 예로 꿩 또는 닭 등의 가금류를 포함하는 조류 또는 돼지, 소, 염소 등의 포유류일 수 있다.

상기 동물 사료용 조성물은 상기 항균조성물을 유효성분으로 포함하는 항균조성물에 곡물, 식물성 단백질 사료, 동물성 단백질 사료, 당분 또는 유제품을 추가로 포함할 수 있다. 상기 곡물은 구체적으로는 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀일 수 있고, 상기 식물성 단백질 사료는 구체적으로는 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것일 수 있으며, 상기 동물성 단백질 사료는 구체적으로는 혈분, 육분, 골분 및 생선분일 수 있고, 상기 당분 또는 유제품은 구체적으로는 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분일 수 있다.

상기 동물 사료용 조성물은 추가로 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성창 촉진제 또는 질병 예방제와 같은 성분을 함께 사용할 수 있다.

본 발명의 동물 사료용 조성물에 포함되는 항균조성물은 사료의 사용목적 및 사용조건에 따라 달라질 수 있으며, 일 예로 최종 생산된 사료 1kg을 기준으로 상기 항균조성물이 0.1g 내지 100g 포함될 수 있다.

또한, 상기 사료용 조성물은 성분들의 분쇄정도에 따라 경점성의 조립 또는 과립 물질로 제조될 수 있으며, 상기 조성물은 메시(mesh)로 공급되거나 추가 가공 및 포장을 위해 원하는 분리된 형상으로 형성시킬 수 있으며, 저장을 위해 펠렛화, 팽창화 또는 압출 공정을 거칠 수 있으며, 저장의 용이성을 위해 바람직하게는 과잉의 물을 건조 제거될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 리소좀 제조방법에 의해 제조된 리소좀을 유효성분으로 포함하는 항암조성물을 제공한다.

상기 항암 조성물의 유효성분인 상기 리소좀 제조방법에 의해 제조된 리소좀은 통상의 리소좀에 비해 항암 활성이 우수할 뿐만 아니라, 천연 물질 유래이므로 부작용 등이 문제되지 아니하고, 안전성도 우수하므로, 상기 항암 조성물은 암의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물 또는 암의 개선 또는 예방을 위한 식품 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 항암 조성물 또는 상기 리소좀 제조방법에 의해 제조된 리소좀을 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물은 유효성분으로 상기 항암 조성물 또는 상기 등골나물 추출물을 단독으로 포함할 수 있으며, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 암은 악성 종양(malignant tumor)이라고도 하며, 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자라난 덩어리로 주위 조직에 침윤하면서 빠르게 성장하고 신체 각 부위에 확산 되거나 전이되어 생명을 위협하게 되는 질환을 의미하고, 상기 암은 암종(carcinoma)과 육종(sarcoma)을 포함하며, 일예로 유방암, 위암, 간암, 폐암, 대장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 뇌척수종양, 두경부암, 흉선종, 식도암, 췌장암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병 및 다발성 골수종 등일 수 있다.

상기 암 치료 또는 예방용 조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용될 수 있다. 상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하고, 소화기관, 배설기관 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하며, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간일 수 있다.

상기 항암 조성물 또는 상기 리소좀 제조방법에 의해 제조된 리소좀은 상기 암 치료 또는 예방용 조성물 내에 단독으로 사용될 수 있으며, 그 외 약리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 항암 조성물 또는 상기 리소좀 제조방법에 의해 제조된 리소좀을 포함하는 조성물이 약제로 사용되거나, 의약 또는 약학적 용도로 사용되는 경우, 상기 항암 조성물 또는 상기 리소좀 제조방법에 의해 제조된 리소좀은 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합하거나 희석제로 희석하여 사용될 수 있다.

이 경우 상기 조성물 내 상기 항암 조성물 또는 상기 리소좀 제조방법에 의해 제조된 리소좀의 함량은 0.001 중량 % 내지 99.9 중량 %, 0.1 중량% 내지 99 중량% 또는 1 중량% 내지 20 중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 조성물의 사용태양 및 사용방법에 따라 상기 항암 조성물 또는 상기 리소좀 제조방법에 의해 제조된 리소좀의 함량은 약학적으로 유효한 양 또는 바람직한 양으로 적절히 조절하여 사용될 수 있다.

상기 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀 및 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다.

또한, 상기 암 치료 또는 예방용 조성물은 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, pH 조절제, 영양제, 비타민, 전해질, 알긴산 및 그의 염, 펙트산 및 그의 염, 보호성 콜로라이드, 글리세린, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분들은 상기 항암 조성물 또는 상기 등골나물 추출물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 공지의 항암제로 사용되는 물질을 더욱 포함할 수 있다.

상기 암 치료 또는 예방용 조성물이 약제로 사용하는 경우 투여방법은 경구 또는 비경구 모두 가능하며, 일 예로는 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.

또한, 상기 암 치료 또는 예방용 조성물의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으며, 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

일반적으로는, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제(TABLETS), 알약, 연질 또는 경질 캅셀제(CAPSULES), 환제(PILLS), 산제(POWDERS) 및 과립제(GRANULES) 등이 포함되고, 이러한 제제는 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제(SUSTESIONS), 내용액제, 유제(EMULSIONS) 및 시럽제(SYRUPS) 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 형태는 크림(CREAM), 로션제(LOTIONS), 연고제(ONITMENTS), 경고제(PLASTERS), 액제(LIQUIDS AND SOULTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 유동엑스제(FRUIDEXTRACTS), 엘릭서(ELIXIR), 침제(INFUSIONS), 향낭(SACHET), 패취제(PATCH) 또는 주사제(INJECTIONS) 등의 형태일 수 있다.

더 나아가, 본 발명의 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 제형화될 수 있다.

상기 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 환자의 중증도, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 병용되는 약물을 고려하여 결정할 수 있으며, 일 예로 1일 유효성분을 기준으로 하였을 때 0.1 mg/kg(체중) 내지 500 mg/kg(체중), 0.1 mg/kg(체중) 내지 400 mg/kg(체중) 또는 1 mg/kg(체중) 내지 300 mg/kg(체중)으로 투여할 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 리소좀은 배양이 용이하고, 대량 배양에 과도한 설비투자나 비용이 요구되지 않는 효모를 이용한 것으로, 본 발명의 방법에 의해 제조된 효모의 리소좀의 경우 항균 활성 및 항암 활성이 우수하므로, 세포 내부에 존재하는 작은 소기관인 리소좀을 이용하는 것으로 생물체 자체를 사용하지 않는 것이어서, 소비자들의 반감도 발생하지 아니하여, 친환경적 신생물 소재로 그 의미가 우수한 것으로 평가된다.

따라서, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 리소좀은 우수한 항균 활성으로 인해 항균조성물 및 친환경 농약 소재, 사료 첨가제, 의약품 소재 및 식품 보존제 소재 등으로 다양하게 사용될 수 있고, 항암 효과도 우수하므로, 항암용 조성물, 구체적으로 의약품 소재 또는 건강기능성식품 소재로도 이용될 수 있어, 의약 및 식품 등 다양한 산업분야에 이용될 수 있으므로 그 산업적 이용가치가 매우 클 것으로 평가된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 리소좀 내의 효소인 아미노말단 펩티드 가수분해효소 유전자(APY gene)을 포함하는 단백질 발현벡터의 개략적인 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 리소좀 내의 효소인 아미노말단 펩티드 가수분해효소 유전자(APY gene)을 포함하는 발현벡터(pYES2::APY::GFP)를 제조하는 과정을 나타낸 개략적 순서도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 아미노말단 펩티드 가수분해효소 유전자(APY gene)을 포함하는 발현벡터(pYES2::APY::GFP)를 도입한 형질전환체인 돌연변이(MBTL-JH-1)에서 아미노말단 펩티드 가수분해효소의 발현 정도 및 아미노말단 펩티드 가수분해효소의 리소좀 도입 여부(targeting)를 확인한 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현벡터(pYES2)를 도입한 형질전환체인 돌연변이(MBTL-1) 및 아미노말단 펩티드 가수분해효소 유전자(APY gene)을 포함하는 발현벡터(pYES2::APY::GFP)를 도입한 형질전환체인 돌연변이(MBTL-JH-1)에서 아미노말단 펩티드 가수분해효소의 발현 정도 및 아미노말단 펩티드 가수분해효소의 리소좀 도입 여부(targeting)를 확인한 사진으로, APY::GFP는 형광여부를 통하여 아미노말단 펩티드 가수분해효소의 발현여부를 확인한 것이고, Lyso-Tracker는 리소좀에 대한 마커를 이용하여 리소좀 위치를 확인한 것이며, Merged는 상기 APY::GFP와 Lyso-Tracker의 촬영 결과를 겹친 사진을 나타내며, 각 기재된 수치는 배양 온도를 나타내고, Galactose induction은 갈락토스가 포함된 배지를 통하여 과발현을 유도한 경우를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현벡터(pYES2)를 도입한 형질전환체인 돌연변이(MBTL-1), 아미노말단 펩티드 가수분해효소 유전자(APY gene)을 포함하는 발현벡터(pYES2::APY::GFP)를 도입한 형질전환체인 돌연변이(MBTL-JH-1) 및 상기 발현벡터(pYES2::APY::GFP)를 도입한 형질전환체인 돌연변이(MBTL-JH-1)를 갈락토스가 포함된 배지에서 배양시킨 경우(MBTL-JH-1-Galactose induction)의 수득한 리소좀의 세균에 대한 항균 활성을 8종의 세균 및 진균에 대한 항균활성으로 나타낸 그래프로, 상기 그래프의 세로축은 해당 세균의 사멸정도(Cell Mortality(%))를 의미한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 발현벡터(pYES2)를 도입한 형질전환체인 돌연변이(MBTL-1), 아미노말단 펩티드 가수분해효소 유전자(APY gene)을 포함하는 발현벡터(pYES2::APY::GFP)를 도입한 형질전환체인 돌연변이(MBTL-JH-1) 및 상기 발현벡터(pYES2::APY::GFP)를 도입한 형질전환체인 돌연변이(MBTL-JH-1)를 갈락토스가 포함된 배지에서 배양시킨 경우(MBTL-JH-1-Galactose induction)의 수득한 리소좀의 세균에 대한 항암 활성을 나타낸 그래프로, 상기 그래프의 세로축은 해당 진핵세포의 생존율(Cell Viability(%))를 의미한다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예1 > Saccharomyces cerevisiae 에 APY 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작

본 실시예에서는 아미노말단 펩티드 가수분해효소 Y(aminopeptidase Y)의 수득을 위하여 진핵미생물인 S. cerevisiae s2805를 한국생명공학연구원으로부터 분양받아 사용하였고, 형질전환을 위한 재조합 벡터 제조용 단백질 발현벡터는 pYES2(Invitogen, USA) 벡터를 이용하였다.

상기 S. cerevisiae의 유전체 데이터로부터 APY gene의 DNA 서열을 NCBI의 genebank(www.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 확보하였고(서열번호 2), 상기 APY gene을 증폭시키기 위한 프라이머로 하기 서열번호 5 및 하기 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머(primer) 쌍을 선택하여 이용하였다.

또한, 상기 APY gene의 삽입 여부 등을 확인하기 위한 표지로 GFP gene을 확보하기 위하여, pEGFP-C1 (BD Bioscience Clontech, USA) 벡터를 주형으로 이용하고, 상기 GFP gene을 증폭시키기 위한 프라이머인 하기 서열번호 7 및 하기 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머(primer) 쌍을 선택하여 이용하였다. 상기 각 유전자 증폭을 위한 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.

	프라이머 서열(5'-3')	제한효소
APY-F	GCC GGT ACC ATG CAC TTT TCT TTG AAG C	KpnI
APY-R	TGT GCG GCC GCA ATA ATC AAG AAG TCG G	NotI
GFP-F	ATT TCT AGA CTT GTA CAG CTC GTC CAT G	NotI
GFP-R	ATA GCG GCC GCG TGA AGG GCG AGG A	XbaI

상기 표 1에 기재된 프라이머를 이용한 아미노말단 펩티드 가수분해효소 Y(aminopeptidase Y, APY)의 유전자 및 GFP gene의 확보는 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

우선, APY의 유전자를 증폭하기 위하여, S. cerevisiae s2805를 배양한 후, 상기 S. cerevisiae s2805로부터 게놈 DNA(genome DNA)를 GeneAll-genomic DNA isolation kit(㈜진올바이오테크놀러지, 대한민국)를 이용하여 상기 키트의 사용방법에 따라 추출하였다. 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 상기 표 1의 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머(primer) 쌍을 사용하여 PCR (Polymerase chain reaction)을 수행하여, 서열번호 1의 유전자 서열을 갖는 APY gene 유전자의 단편을 증폭하였다.

상기 PCR 증폭은 94℃에서 5분간 Pre-denaturation을 한 후, 94℃에서 30초간 Denaturation하고, 55℃에서 30초간 Anealing하며, 72℃에서 1분간 Extension하는 단계를 총 28회(cycle) 반복하고, 72℃에서 7분간 Denaturation하는 방법으로 수행하였다. 상기 증폭과정에 의하여 제한효소 부위(Kpn I 및 Not I)를 갖는 APY gene 유전자 서열이 증폭되었다.

또한, 상기 pGFP-C1 벡터를 제한효소 Not I 및 Xba I로 처리한 결과물을 주형으로 하여 상기 표 1의 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머(primer) 쌍을 사용하여 PCR (Polymerase chain reaction)을 수행하여, 서열번호 4의 유전자 서열을 갖는 GFP gene 유전자의 단편을 증폭하였다.

상기 PCR 증폭은 94℃에서 5분간 Pre-denaturation을 한 후, 94℃에서 30초간 Denaturation하고, 65℃에서 30초간 Anealing하며, 72℃에서 1분간 Extension하는 단계를 총 28회(cycle)회 반복하고, 72℃에서 7분간 Denaturation하는 방법으로 수행하였다. 상기 증폭과정에 의하여 제한효소 부위(Kpn I 및 Not I)를 갖는 GFP gene 유전자 단편이 증폭되었다.

상기 증폭된 APY gene 유전자 단편 및 GFP gene 유전자 단편은 실험에 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.

상기 각각의 PCR증폭 산물을 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동한 결과, APY gene에 해당하는 증폭산물은 1.67 kb의 단편을 갖는 유전자임이 확인되었고, GFP gene에 해당하는 증폭산물은 798 bp의 단편을 갖는 유전자임이 확인되었다.

상기 전기영동을 통하여 확인된 유전자들은 모두 GeneAll PCR DNA purification kit(㈜진올바이오테크놀러지, 대한민국)로 정제한 후 사용하였다.

< 실시예 2> 제조합 벡터 ( pYES2 :: APY :: GFP )의 제조

상기 실시예 1에서 수득한 서열번호 1의 염기서열을 갖는 APY gene 유래 증폭산물 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 GFP gene 유래 증폭산물을 이용하여, 도 2에 기재된 방법에 따라 도 1에 기재된 재조합 벡터를 제조하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1에서 수득한 서열번호 1의 염기서열을 갖는 APY gene 유래 증폭산물은 KpnI과 NotI으로 처리한 후, 제한효소 처리된 APY gene을 KpnI과 NotI으로 동일하게 처리한 상기 발현벡터인 pYES2(Invitogen, USA)에 도입시키고, 이를 pYES2::APY로 명명하였다. 추가로, 상기 실시예 1에서 수득한 서열번호 4의 염기서열을 갖는 GFP gene 유래 증폭산물은 NotI과 XbaI으로 처리한 후, 제한효소 처리된 GFP gene을 NotI과 XbaI으로 동일하게 처리한 상기 재조합 벡터인 pYES2::APY에 도입시켜 pYES2::APY::GFP를 제조하고, 최종적으로 이를 pYES2::APY로 명명하였다.

상기 제조된 재조합 벡터인 pYES2::APY::GFP를 S. cereviaie s2805에 전기천공법(Electroporation)으로 형질전환을 수행하고, SD 고체평판배지에서 얻은 콜로니를 새로운 배지에 옮겨 단일콜로니를 얻어, 최종적으로 형질전환된 돌연변이를 제조하였다.

상기 형질전환된 돌연변이의 게놈 DNA를 상기 실시예 1의 방법으로 추출한 후, 솔젠타사(solgent Co.)에 의뢰하여, DNA 시퀀싱(Sequancing) 방법으로 pYES2::APY::GFP에 삽입된 유전자를 확인하여, DNA 염기서열(서열번호 9)이 확인되었고, APY gene과 GFP gene이 도입된 것임을 최종적으로 확인하였으며, 상기 pYES2::APY::GFP가 도입된 형질전환된 돌연변이를 MBTL-JH-1이라 명명하였다. 이와 함께, 대조구로 사용될 APY gene이 도입되지 않은 발현벡터인 pYES2만이 도입된 형질전환된 돌연변이는 MBTL- 1이라 명명하였다.

< 실시예 3> 재조합 효모에서 APY 단백질의 과발현 및 봉입체 생성 억제

상기 실시예 2에서 제조한 재조합 형질전환된 돌연변이인 MBTL-JH-1와 대조군인 MBTL- 1을 SD 액체 배지(6.7 g/L Yeast nitrogen base, 5 g/L amino acid 및 20 g/L glucose) 15 mL에 접종하여, 30 ℃ 및 160 rpm 조건과 595nm 조건에서 OD₅₉₅값이 3.0이 될 때까지 진탕배양 하였다. 상기 배양 후, 원심분리를 통해 배양액을 제거하고 균주만 수득한 후, 상기 균주에 SG 액체 배지 6.7 g/L Yeast nitrogen base, 5 g/L amino acid 및 20 g/L galactose) 15 mL을 첨가하고, 상기 배양액의 OD₅₉₅값이 0.4가 되도록 조절된 배양액 6.67 mL을 SG 액체 배지 50 mL에 넣어 30℃ 및 160 rpm의 조건에서 10시간 동안 배양하여, APY의 과발현을 유도하였다.

상기 반응 결과에 대해 유도된 반응시킨 세포에 리소좀에만 특이적으로 반응하는 LysoTracker(LysoTracker DND 99, Invitrogen, USA)를 처리하여 APY의 발현정도와 리소좀 내로 잘 도입(targeting)되었는지를 형광현미경으로 관찰한 결과 단백질이 과발현되는 것을 확인하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 APY의 과발현을 유도에 의해 MBTL-JH-1에서 APY의 발현은 확인되었으나, 리소좀을 확인한 결과 및 상기 APY 발현여부(도 3의 왼쪽 사진)와 리소좀 확인사진(도 3의 가운데 사진)을 결합한 사진(도 3의 오른쪽 사진)에서는 일부 APY가 리소좀 내에서 확인되지 아니하여, 과발현된 APY의 경우 봉입체(inclusion body)가 생성되어 리소좀 내로 targeting되지 못한 것으로 확인되었다.

따라서, 리소좀의 항균 활성 등을 증가하기 위하여, 과발현된 APY가 리소좀 내로 targeting될 수 있도록, 배양 온도 조건을 달리하면서 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

상기 도 4에 나타낸 바와 같이, APY gene이 도입되지 않은 발현벡터인 pYES2만이 도입된 형질전환된 돌연변이는 MBTL- 1의 경우 APY가 과발현되지 아니한 것이 확인되었다(도 4의 왼쪽 윗사진, MBTL- 1). 또한, 20 ℃에서 배양한 경우, 상기 pYES2::APY::GFP가 도입된 형질전환된 돌연변이인 MBTL-JH-1의 경우에도 APY가 제대로 발현되지 아니한 것으로 확인되었다(도 4의 오른쪽 윗사진, MBTL-JH-1-20℃). 한편, 25℃에서 배양한 경우에는 APY는 과발현되었으나, 생성되어 리소좀 내로 targeting되지 못하고, 봉입체(inclusion body)가 생성된 APY가 확인되었고(도 4의 왼쪽 중간사진, MBTL-JH-1-25℃), 30℃에서 배양한 경우에도 APY는 과발현되었으나, 생성되어 리소좀 내로 targeting되지 못하고, 봉입체(inclusion body)가 생성된 APY가 확인되었다(도 4의 왼쪽 아래사진, MBTL-JH-1-30℃). 한편, 28 ℃에서 배양한 경우에는 APY가 과발현되고, 봉입체(inclusion body)도 생성되지 않아, 리소좀 내로 잘 targeting된 것으로 확인되어, 최적 배양온도로 28℃를 선택하였다(도 4의 오른쪽 중간사진, MBTL-JH-1-28℃). 또한, 동일한 30℃에서 배양한 경우에도 갈락토스를 첨가시킨 경우(Galactose induction), APY가 과발현되나, 봉입체(inclusion body)는 생성되지 않아, 리소좀 내로 targeting된 것으로 확인되는 것으로 확인되었다(도 4의 오른쪽 아래사진, MBTL-JH-1-30℃(Galactose induction)). 다만, 상기 경우에도 갈락토스를 첨가시킨 배지(Galactose induction)를 이용하여 30℃에서 배양한 경우에도 갈락토스를 첨가하지 않은 배지를 이용하여 28℃에서 배양한 경우에 비하여 리소좀 내 targeting 정도가 낮은 것으로 확인되어, 상기 결과로부터 최적 배양온도로 28℃를 선택하였다(도 4의 오른쪽 윗사진, MBTL-JH-1-28℃).

< 실시예 4> 재조합 효모에서 추출한 리소좀의 항균활성 비교

상기 pYES2::APY::GFP가 도입된 형질전환된 돌연변이를 MBTL-JH-1를 갈락토스가 포함된 배지(SG 배지)에서 상기 실시예 3에서 최적 배양조건으로 확인된 28 ℃의 조건으로 배양(galactose induction)한 후, 리소좀을 추출하였다. 대조군으로 APY gene이 도입되지 않은 발현벡터인 pYES2만이 도입된 형질전환된 돌연변이 MBTL- 1을 배양한 것과, 상기 MBTL-JH-1를 갈락토스가 포함되지 않은 배지(SD 배지)에서 배양한 것을 사용하였다.

상기 리소좀에 대해 호모게나이저(UL TRA-TUR RAX T25, Jarke&Kunkel)를 이용하여 9,500 rpm의 조건에서 2분간 균질화한 후, 상기 균질화시킨 돌연변이를 원심분리 튜브(eppendorf tube)에 넣고, 20,000×g 및 4℃의 조건에서 30분간 원심분리를 수행하였다. 상기 원심분리 후, 상층액을 제거하고 하층액을 수득하였다. 상기 수득된 하층액을 다시 500×g 및 4℃의 조건에서 5분간 원심분리한 후, 상층액만을 분리하여, 리소좀을 수득하였다.

상기 리소좀의 항균활성은 0.1M phosphate buffer에 상기 수득한 각각의 리소좀을 부피비를 기준으로 5%(v/v)가 되게 만들고, 각각의 세균 배양액과 상기 5% 리소좀 희석액을 부피비를 기준으로 1 : 9(v/v, 리소좀 희석액 : 세균배양액)의 비율로 혼합되도록 첨가하고 혼합한 후, 상기 혼합액 100 ㎕를 아가 고체배지에 도말하여, 30℃에서 24시간 배양하였다.

상기 배양한 고체배지에 생긴 콜로니(colony) 수를 세어 대조군 리소좀을 첨가하지 않은 세균만 도말한 대조군과 비교하여, cell mortality를 %로 나타내었다. 상기 비교한 결과는 도 5에 나타내었다.

상기 항균 활성을 측정하기 위한 위해 세균 및 진균으로는 E. coil(KCTC1041), Shigella flexneri(KCTC2517), Deinococcus radiophilus(ATCC 27603), Xanthomonas oryzae(KACC 10859), Staphylococcus aureus, Corynebacterium glutamicum(ATCC13032), Streptomyces albus(KCTC1136) 및 Saccharomyces cerevisiae(KCTC7947)를 사용하였다.

상기 도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 APY가 과발현되는 조건(MBTL-JH-1-galactose induction)에서는 APY가 발현되지 않거나(MBTL-1) 과발현되지 않은 경우(MBTL-JH-1)에 비하여, 수득한 효모 돌연변이체의 리소좀의 항균 활성이 현저하게 향상되는 것으로 확인되었다.

< 실시예 5> 재조합 효모에서 추출한 리소좀의 항암활성 비교

상기 실시예 4에서 제조된 상기 MBTL-JH-1를 갈락토스가 포함된 배지에서 배양(galactose induction)한 실험군과 상기 MBTL- 1 및 상기 MBTL-JH-1를 갈락토스가 포함되지 않은 배지에서 배양한 리소좀에 대해서 항암활성을 측정하였다.

상기 항암 활성을 측정하기 위한 암세포 및 정상세포로는 HeLa cell line(KCTC HC18802), 계명대학교 의과대학에서 분양받은 HaCaT cells, Melanocytes(KCLB 10053.1)와 정상세포인 BAECs를 사용하였다.

상기 항암활성은 상기 실시예 4에서 제조된 리소좀 희석액 즉, 0.1M phosphate buffer에 상기 수득한 각각의 리소좀을 부피비를 기준으로 5%(v/v)가 되게 만들고, 각각의 세균 배양액과 상기 5% 리소좀 희석액을 첨가하면서, 상기 각각의 세포에 대한 MTT assay를 수행하는 방법으로 측정하였다. 상기 측정한 결과는 도 6에 나타내었다.

상기 도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 APY가 과발현되는 조건에서는 APY가 발현되지 않거나 과발현되지 않은 경우에 비하여, 수득한 효모 돌연변이체의 리소좀이 암세포들을 현저하게 죽이는 반면, 정상 세포에는 아무런 영향을 미치지 아니하여, 상기 항암활성이 증가된 리소좀은 안전할 뿐만 아니라 항암활성이 현저하게 우수한 것으로 확인되었다.

<110> Industrial Cooperation Foundation Chonbuk National University <120> A METHOD OF PREPARING LYSOSOME HAVING ANTIBACTERIAL ACTIVITY AND ANTI-CANCER ACTIVITY <130> DP20110614 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1614 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APY gene <400> 1 atgcactttt ctttgaagca attggctgtc gctgcgtttt acgctaccaa tttaggctct 60 gcctatgtca ttcctcaatt cttccaggaa gcctttcaac aagaagagcc aattgagaat 120 tatcttccgc aattaaacga cgatgatagc tctgccgttg ctgccaacat tccgaagcca 180 catattcctt acttcatgaa accacatgta gaaagtgaaa aattgcaaga taaaatcaaa 240 gttgacgatt tgaatgctac tgcttgggac ctctaccgtt tagctaacta ttctactcct 300 gactacggtc accctacccg tgtgatcggg tccaagggtc ataacaagac tatggaatac 360 atattgaatg ttttcgatga catgcaggac tactatgatg tttctttgca agagttcgaa 420 gctttatccg gtaagatcat ctctttcaac ctctctgacg ccgaaaccgg taaaagcttt 480 gctaacacta cagctttcgc actttctcca cctgtggacg ggttcgtagg taagctagtc 540 gaaattccta acttgggatg tgaagagaag gattacgcct ctgtagtccc accaagacac 600 aacgaaaagc 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taccaacacc aagttgattg ctcactctgt ggccacctat 1500 gctgactctt tcgagggttt cccaaaaaga gaaacccaaa agcacaaaga ggtggacata 1560 ttgaatgctc aacaaccaca atttaagtac agggccgact tcttgattat ttaa 1614 <210> 2 <211> 537 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> APY <400> 2 Met His Phe Ser Leu Lys Gln Leu Ala Val Ala Ala Phe Tyr Ala Thr 1 5 10 15 Asn Leu Gly Ser Ala Tyr Val Ile Pro Gln Phe Phe Gln Glu Ala Phe 20 25 30 Gln Gln Glu Glu Pro Ile Glu Asn Tyr Leu Pro Gln Leu Asn Asp Asp 35 40 45 Asp Ser Ser Ala Val Ala Ala Asn Ile Pro Lys Pro His Ile Pro Tyr 50 55 60 Phe Met Lys Pro His Val Glu Ser Glu Lys Leu Gln Asp Lys Ile Lys 65 70 75 80 Val Asp Asp Leu Asn Ala Thr Ala Trp Asp Leu Tyr Arg Leu Ala Asn 85 90 95 Tyr Ser Thr Pro Asp Tyr Gly His Pro Thr Arg Val Ile Gly Ser Lys 100 105 110 Gly His Asn Lys Thr Met Glu Tyr Ile Leu Asn Val Phe Asp Asp Met 115 120 125 Gln Asp Tyr Tyr Asp Val Ser Leu Gln Glu Phe Glu Ala Leu Ser Gly 130 135 140 Lys Ile Ile Ser Phe Asn Leu Ser Asp Ala Glu Thr Gly Lys Ser Phe 145 150 155 160 Ala Asn Thr Thr Ala Phe Ala Leu Ser Pro Pro Val Asp Gly Phe Val 165 170 175 Gly Lys Leu Val Glu Ile Pro Asn Leu Gly Cys Glu Glu Lys Asp Tyr 180 185 190 Ala Ser Val Val Pro Pro Arg His Asn Glu Lys Gln Ile Ala Leu Ile 195 200 205 Glu Arg Gly Lys Cys Pro Phe Gly Asp Lys Ser Asn Leu Ala Gly Lys 210 215 220 Phe Gly Phe Thr Ala Val Val Ile Tyr Asp Asn Glu Pro Lys Ser Lys 225 230 235 240 Glu Gly Leu His Gly Thr Leu Gly Glu Pro Thr Lys His Thr Val Ala 245 250 255 Thr Val Gly Val Pro Tyr Lys Val Gly Lys Lys Leu Ile Ala Asn Ile 260 265 270 Ala Leu Asn Ile Asp Tyr Ser Leu Tyr Phe Ala Met Asp Ser Tyr Val 275 280 285 Glu Phe Ile Lys Thr Gln Asn Ile Ile Ala Asp Thr Lys His Gly Asp 290 295 300 Pro Asp Asn Ile Val Ala Leu Gly Ala His Ser Asp Ser Val Glu Glu 305 310 315 320 Gly Pro Gly Ile Asn Asp Asp Gly Ser Gly Thr Ile Ser Leu Leu Asn 325 330 335 Val Ala Lys Gln Leu Thr His Phe Lys Ile Asn Asn Lys Val Arg Phe 340 345 350 Ala Trp Trp Ala Ala Glu Glu Glu Gly Leu Leu Gly Ser Asn Phe Tyr 355 360 365 Ala Tyr Asn Leu Thr Lys Glu Glu Asn Ser Lys Ile Arg Val Phe Met 370 375 380 Asp Tyr Asp Met Met Ala Ser Pro Asn Tyr Glu Tyr Glu Ile Tyr Asp 385 390 395 400 Ala Asn Asn Lys Glu Asn Pro Lys Gly Ser Glu Glu Leu Lys Asn Leu 405 410 415 Tyr Val Asp Tyr Tyr Lys Ala His His Leu Asn Tyr Thr Leu Val Pro 420 425 430 Phe Asp Gly Arg Ser Asp Tyr Val Gly Phe Ile Asn Asn Gly Ile Pro 435 440 445 Ala Gly Gly Ile Ala Thr Gly Ala Glu Lys Asn Asn Val Asn Asn Gly 450 455 460 Lys Val Leu Asp Arg Cys Tyr His Gln Leu Cys Asp Asp Val Ser Asn 465 470 475 480 Leu Ser Trp Asp Ala Phe Ile Thr Asn Thr Lys Leu Ile Ala His Ser 485 490 495 Val Ala Thr Tyr Ala Asp Ser Phe Glu Gly Phe Pro Lys Arg Glu Thr 500 505 510 Gln Lys His Lys Glu Val Asp Ile Leu Asn Ala Gln Gln Pro Gln Phe 515 520 525 Lys Tyr Arg Ala Asp Phe Leu Ile Ile 530 535 <210> 3 <211> 451 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAL1 promoter_pYES2 <400> 3 acggattaga agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt 60 cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga 120 acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac 180 ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga 240 ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat 300 taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc 360 ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac 420 ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac c 451 <210> 4 <211> 714 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP <400> 4 gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60 gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120 aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180 gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240 cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300 aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360 aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct 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ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 1800 cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 1860 cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 1920 cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga 1980 cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 2040 cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 2100 caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 2160 gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 2220 gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac 2280 ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 2340 cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaag 2386

Claims (11)

1. 아미노말단 펩티드 가수분해효소 유전자 및 조절유전자를 진핵생물에 도입하여 돌연변이를 제조하는 단계; 상기 아미노말단 펩티드 가수분해효소 및 조절유전자가 도입된 돌연변이를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 돌연변이로부터 리소좀을 수득하는 단계
   를 포함하는 항균 활성 및 항암 활성을 갖는 리소좀 제조방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 돌연변이를 제조하는 단계는 상기 아미노말단 펩티드 가수분해효소 유전자 및 상기 조절유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 과정 및 상기 벡터를 진핵생물에 도입하는 과정을 포함하는 방법으로 수행하는 것인
   항균 활성 및 항암 활성을 갖는 리소좀 제조방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 아미노말단 펩티드 가수분해효소 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드이고, 상기 조절유전자는 유전자 GAL 프로모터(GAL Promoter), lac 프로모터(lac Promoter), tac 프로모터(tac Promoter), trc 프로모터(trc Promoter), 아라비노스 프로모터(Arabinose Promoter) 및 trp 프로모터(trp Promoter)로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나인
   항균 활성 및 항암 활성을 갖는 리소좀 제조방법.
4. 제3항에 있어서,
   상기 아미노말단 펩티드 가수분해효소 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드이고, 상기 조절유전자는 GAL 1, GAL 3 또는 GAL 10인
   항균 활성 및 항암 활성을 갖는 리소좀 제조방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 진핵생물은 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.) 미생물인
   항균 활성 및 항암 활성을 갖는 리소좀 제조방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 아미노말단 펩티드 가수분해효소 및 조절유전자가 도입된 돌연변이를 배양하는 단계는 상기 돌연변이를 갈락토스(galactose)가 포함된 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는
   항균 활성 및 항암 활성을 갖는 리소좀 제조방법.
7. 제6항에 있어서,
   상기 아미노말단 펩티드 가수분해효소 및 조절유전자가 도입된 돌연변이를 배양하는 단계는 27℃ 내지 29℃의 온도조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는
   항균 활성 및 항암 활성을 갖는 리소좀 제조방법.
8. 제1항의 제조방법에 의해 제조된 리소좀을 유효성분으로 포함하는 항균조성물.
9. 제8항에 있어서,
   상기 항균조성물은 대장균(E. coli), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 잔토모나스 오리제(Xanthomonas oryzae), 스트렙토마이세스 알부스(Streptomyces albus), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 및 데니오코커스 라디오필러스(Deinococcus radiophilus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 대한 항균 활성을 갖는 것인 항균조성물.
10. 제9항의 항균조성물을 유효성분으로 포함하는 동물 사료용 조성물.
11. 제1항의 제조방법에 의해 제조된 리소좀을 유효성분으로 포함하는 항암조성물.

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