KR101621352B1 - 표적적 항균 활성이 강화된 리포좀, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 항균 제품 - Google Patents

Abstract

본 발명은 표적적 항균 활성이 강화된 리포좀에 관한 것으로, 보다 상세하게는 HSP70을 포함하는 항균 활성이 강화된 리포좀, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 항균 조성물을 제공한다. 본발명의 HSP70를 포함하는 리포좀은 선택적으로 타겟팅이 가능하고 강화된 항균 활성 가지며, 사람에게 무해하게 사용 가능하기 때문에 항균 조성물로 사용될 수 있어 효과적이다.

Description

표적적 항균 활성이 강화된 리포좀, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 항균 제품{Antimicrobial targeting liposome having antibacterial activity, Preparing method there of and Antimicrobial products containing there}

본 발명은 표적적 항균 활성이 강화된 리포좀, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항균제품에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 HSP70 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물, 리포좀 타입 항균 조성물 제조방법, 이의 제조방법으로 제조된 리포좀 및 리포좀을 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다.

전세계적으로 유용한 물질의 생산을 대량화를 위해 유전자 재조합된 미생물 사용이 20세기부터 급속도로로 연구·개발되어 왔다. 이러한 기술 개발은 기존의 화학물질의 합성과 같이 위험하고 유해한 연구가 아닌, 미생물내에서 생산되는 물질을 유전자 재조합을 통해서 대량으로 생산하고자 하는 방법이다. 이러한 타겟과 관련된 관여 물질을 알아내기 위해 메커니즘적인 부분의 해결이 된다면, 또는 물질이 존재 유무만 파악이 된다면 미생물 내에서 발현하는 것은 쉬운 일이다. 그리하여 현재 항균, 항암 관련하여 많은 연구 및 약물들이 개발되고 있다. 또한 이러한 개발을 통해 제조된 약물들의 사용에 있어서 안정성 및 적합성에 맞도록 개발되고 있다. 예를 들면 안정성이 떨어지는 부분에 있어서는 흡착, 나노물질을 이용한 고정화 기술, 제제로서 사용 가능한 약물형태 개발 등이 그 예이다. 하지만 이러한 기술 개발에도 한계가 있기 마련이다. 즉 다른 물질과 흡착이나 고정화 또는 나노물질의 이용에 있어서 안전성이 아직까지 확보되지 않았고 제제로서의 개발에 있어서는 인체내에서 타겟으로 하는 부분에 직접적으로 운반이 쉽지 않은 단점을 가지고 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 선택적으로 타겟으로 하는 부위에 운반되도록 많은 연구가 진행되고 있다.

한편, 본 발명자들은 리소좀을 유효성분으로 포함하는 항균제에 대한 연구를 통하여, 대한민국 특허출원 제10-2007-0079191호(리소좀을 포함하는 친환경 항균제 및 그 제조방법), 대한민국 특허출원 제10-2010-0130842호(진핵 생물에서 분리한 리소좀의 항균 활성을 증대시키는 방법 및 이를 이용하여 얻어진 친환경 항균제) 및 대한민국 특허출원 제10-2013-10124110호(항균 활성 및 항암 활성이 강화된 리소좀의 제조방법)를 개시한 바 있다. 그러나, 상기 특허출원은 표적적 항균 효과를 갖지 못하며, 항균 효과가 원하는 정도로 강력하지 못하였다.

이에, 본 발명자들은 HSP70 단백질이 도입된 리포좀에서 표적적인 항균 활성을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 HSP70(Heat Shock Protein 70) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, HSP70(Heat Shock Protein 70) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 리포좀 타입 항균 조성물 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, HSP70 단백질을 포함하는 표적적 항균 활성을 갖는 리포좀을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 리포좀을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 HSP70(Heat Shock Protein 70) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 HSP70 유전자는 서열번호 1로 이루어지는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 재조합 벡터는 발현을 확인하기 위한 형광 단백질 유전자를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은 또한, HSP70(Heat Shock Protein 70) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 재조합 미생물은 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.) 미생물인 것일 수 있다.

본 발명은 또한, (a) HSP70(Heat Shock Protein 70) 유전자를 미생물에 형질전환하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 형질전환한 미생물을 배양하는 단계; (c) 상기 (b)단계에서 배양한 미생물로부터 생산된 HSP70 단백질을 수득하는 단계; 및 (d) 상기 (c)단계에서 수득된 HSP70 단백질을 리포좀 막에 개질시키는 단계;를 포함하는 리포좀 타입 항균 조성물 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 HSP70(heat shock protein 70) 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 형광단백질은 적색형광단백질(red fluorescent protein; RFP), 증강된 적색 형광 단백질(enhanced red fluorescent protein;ERFP), 녹색형광단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질(EGFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 시안 형광 단백질(CFP), 증강된 시안 형광 단백질(ECFP), 황색형광단백질(YFP), 및 증강된 황색 형광 단백질(EYFP)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것 일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계는 (ⅰ) HSP 70 유전자 및 형광단백질 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 벡터를 미생물에 도입하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (d) 단계는 (ⅰ) 지질과 콜레스테롤 및 리소좀 막 단백질을 섞은 후 유기용매에 녹이는 단계; (ⅱ) 유기용매를 제거하는 단계; (ⅲ) 라이소소멀 효소를 혼합하는 단계; 및 (ⅳ) 작은 크기의 리포좀을 형성하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 미생물은 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.) 미생물인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 항균은 항세균 또는 항진균인 것일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 제조방법으로 제조된, HSP70 단백질을 포함하는 표적적 항균 활성이 강화된 리포좀을 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 리포좀을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 항균 조성물은 약학 조성물, 건강기능식품, 화장료 조성물, 동물 사료 조성물, 식품 첨가물, 화장품 첨가물, 동물 사료용 첨가물, 세정제 및 청결제로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다.

따라서 본 발명은 표적적 항균 활성이 강화된 리포좀에 관한 것으로, 보다 상세하게는 HSP70을 포함하는 항균 활성이 강화된 리포좀, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 항균 조성물을 제공한다. 본발명의 HSP70를 포함하는 리포좀은 선택적으로 타겟팅이 가능하고 강화된 항균 활성 가지며, 사람에게 무해하게 사용 가능하기 때문에 항균 조성물로 사용될 수 있어 효과적이다.

도 1은 항균관련 리소좀 막 단백질 확인을 위해 산화적 스트레스와 관련된 물질 처리 후 프로테옴(Proteome)을 분석한 것이다.
도 2는 소프트웨어 프로그램인 프로제네시스(progenesis) PG200을 이용하여 로딩된 스팟(spot)들을 분석한 후, 3가지 서로 다른 스팟을 확인한 것이다.
도 3은 HSP 70을 포함하는 유전자 재조합 효모를 제조하기 위한 pYES2 벡터를 나타낸 모식도이다.
도 4는 pYES2 벡터에 녹색형광단백질을 삽입한 후 뉴클레오타이드를 비교한 것이다.
도 5는 pYES2 벡터에 HSP 70을 삽입한 후 아미노산을 확인한 것이다.
도 6은 HSP 70과 녹색형광단백질이 유전자 재조합된 효모균을 공초점 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 7은 HSP 70을 포함하는 리소좀과 일반 효모균내 리소좀의 항균력을 확인한 그래프이다.
도 8은 HSP 70을 포함하는 리소좀 효소와 일반 효모균내 존재하는 리소좀 효소의 항균력을 확인한 그래프이다.
도 9는 HSP 70을 포함하는 리소좀의 막단백질과, 일반 효모균내 존재하는 리소좀의 막단백질의 항균력을 확인한 그래프이다.
도 10은 표면이 개질된 리포좀을 제조하기 위한 방법을 나타낸 순서도이다.
도 11은 HSP 70이 과발현된 리소좀 막 단백질을 이용하여 표면을 개질시킨 리포좀을 나타낸 모식도이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 강한 항균력을 가지면서 인체에는 무해한 항균 조성물이 요구되었으며, 본 발명자들은 HSP70 단백질이 도입된 리포좀에서 강화된 항균 활성을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 선택적으로 타겟팅이 가능하고 강화된 항균 활성 가지며, 사람에게 무해하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 “HSP70 (Heat Shock Protein 70)”은 분자량 70000을 나타내는 열충격에 의해 합성이 유도되는 단백질을 의미하는 것으로 HSP은 샤페론으로서 완성한 입체구조를 취하지 않은 단백질에 결합하여 그들의 분자간 회합형성을 방지함과 동시에 재생을 촉진하는 기능을 갖고 있다. 이 때문에 HSP이 대량으로 축적하고 있는 세포는 고온에 대해서는 저항성을 나타낸다.

본 발명의 “리소좀”은 인지질 2중층으로 둘러싸여 있으며 최적 pH가 산성인 약 70종류의 가수분해효소가 함유되어 있는 것을 의미한다. 리소좀은 세포 내외 생체 고분자의 분해에 관여하는 진핵세포에 보편적으로 존재한다. 효모에서는 액포에 해당되는 이 소기관에는 식작용에 유래하는 헤테로리소좀과 자식작용(autophage)에 유래하는 오토리소좀이 존재하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 “리포좀”은 지질소포(인공막)를 지칭한다. 인지질을 염류 수용액 중에서 현탁시키면 다중층 리포좀이 생기고 이것을 초음파 처리하면 2분자막으로 된 소포가 얻어진다. 리포좀 중에 여러 가지 물질을 봉입하거나 또는 생체막처럼 막 내에서 막단백질을 재구성시키거나 하여 각종 작용을 재현할 수 있으므로 마이크로 캡슐로 하여 의료품의 투여법으로 개발되고 있다.

본 발명의 “재조합 폴리뉴클레오타이드”는 자연적으로 함께하지 않은 서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 증폭되거나 조립된 재조합 폴리뉴클레오타이드는 적합한 벡터에 포함될 수 있고, 벡터는 적합한 호스트 세포를 변형시키기 위해 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 명세서에서 특별히 다르게 정의되지 않은 이상, 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지며, 일 예로, 싱글레톤 등의 미생물학 및 세포 생물학 사전(2nd ed.(1994)); 과학과 기술의 캠브리지 사전; R. 리거 등의 유전학 용어 사전(5TH ed.), 헤일, 말햄 및 하퍼 콜린스의 생물학 사전(1991)에 기재된 용어를 이해한다.

본 발명은 HSP70(Heat Shock Protein 70) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 바람직하게 상기 HSP70 단백질은 서열번호 1로 표시되는 것일 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 HSP70 유전자를 발현벡터에 삽입한 것일 수 있다. 발현벡터는 HSP70 유전자를 발현할 수 있으면, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 플라스미드 DNA, 파지 DNA 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등) 이 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다. 본 발명의 일실시예에서는 pYES2.0를 발현벡터로 사용하였다.

본 발명의 재조합 벡터는 제1도에 기재된 개열지도를 갖는 것일 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 도 1에 표시된 바와 같이, pYES2.0 발현벡터에 HSP70과 GFP가 작동가능하게 연결된 것일 수 있다.

또한, 상기 재조합 벡터는 발현을 확인하기 위한 형광 단백질 유전자를 추가적으로 포함할 수 있으며, 발현을 확인할 수 있는 형광 단백질이면 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 적색형광단백질(red fluorescent protein; RFP), 증강된 적색 형광 단백질(enhanced red fluorescent protein;ERFP), 녹색형광단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질(EGFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 시안 형광 단백질(CFP), 증강된 시안 형광 단백질(ECFP), 황색형광단백질(YFP), 또는 증강된 황색 형광 단백질(EYFP) 등이 있다. 본원 발명에서 바람직하게 형광 단백질은 녹색형광단백질(GFP)일 수 있다.

본 발명은 HSP70을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다. 상기 HSP70 유전자는 바람직하게는 서열번호 1로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 상기 재조합 벡터는 추가적으로 형광 단백질을 포함하는 것일 수 있다.

상기 벡터를 진핵생물에 도입하는 과정은 통상의 형질전환(translation) 또는 형질감염(transfection)에 사용되는 방법에 의할 수 있고, 상세하게 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 외래 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 다양한 기법일 수 있으며, 상기 방법은 상기 도입되는 벡터 및 진핵생물의 종류에 의해 의존적으로 선택될 수 있다. 일 예로, 상기 방법은 인산칼슘 또는 염화칼슘 공-침전(co-precipitation), DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 리포좀 매개 형질감염(lipofection), 화학천공(chemoporation) 또는 전기천공 (electroporation)법으로 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 재조합 미생물은 HSP70 단백질을 발현할 수 있는 미생물이면 이에 한정하지 않으나, 바람직하게는 진핵 미생물일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 효모, 바람직하게는 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.) 미생물, 더욱 바람직하게는 사카로마이세스 세르비제(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 카로마이세스 세레비제(saccharomyces cerevisiae) s2085에 재조합 벡터를 형질전환하였다.

본 발명은 (a) HSP70(Heat Shock Protein 70) 유전자를 미생물에 형질전환하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 형질전환한 미생물을 배양하는 단계; (c) 상기 (b)단계에서 배양한 미생물로부터 생산된 HSP70 단백질을 수득하는 단계; 및 (d) 상기 (c)단계에서 수득된 HSP70 단백질을 리포좀 막에 개질시키는 단계;를 포함하는 리포좀 타입 항균 조성물 제조 방법을 제공한다.

상기 HSP70(heat shock protein 70) 유전자는 분자량 70000을 나타내는 열충격에 의해 합성이 유도되는 단백질이면 무엇이든 가능하며, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.

상기 형광단백질은 HSP70 유전자가 잘 삽입되었는지 확인이 가능한 형광 단백질이면 모두 사용될 수 있으나, 바람직하게는 적색형광단백질(red fluorescent protein; RFP), 증강된 적색 형광 단백질(enhanced red fluorescent protein;ERFP), 녹색형광단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질(EGFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 시안 형광 단백질(CFP), 증강된 시안 형광 단백질(ECFP), 황색형광단백질(YFP), 및 증강된 황색 형광 단백질(EYFP)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것 일 수 있다. 더욱 바람직하게는 녹색형광단백질(GFP)일 수 있다.

상기 (a) 단계는 (ⅰ) HSP70 유전자 및 형광단백질 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 벡터를 미생물에 도입하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 돌연변이를 제조하는 단계는 상기 HSP70유전자 및 상기 형광단백질 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 과정 및 상기 벡터를 진핵생물에 도입하는 과정을 포함하는 방법으로 수행하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 “재조합 미생물”은 야생형 미생물에 외래형 유전자를 도입시킨 형질전환체를 의미한다.

본 명세서에서 “조절유전자”는 유전자 발현을 조절할 수 있는 DNA 또는 RNA를 의미하고, 발현 조절 서열 또는 조절 서열(regulatory sequence)일 수 있다. 상기 조절유전자는 상기 조절유전자에 작동가능하게 연결된 뉴클레오타이드 서열의 발현(전사 및/또는 번역)을 조절하는 폴리뉴클레오타이드 내 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

상기 “작동가능하게 연결된(operably linked)”이란 의미는 다른 부분(예를 들어 서열의 전사)의 활성을 야기하는 한 부분(예를 들어 전사를 조절하는 능력)의 활성에 있어서 두 부분 사이의 상호 간에 기능적 관계(functional relationship), 예를 들면 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있도록 연결 관계에 있는 코딩 서열과 조합된 조절 서열 또는 그러한 조합을 의미한다.

본 명세서에서 “벡터”는 그에 연결된 또 다른 폴리뉴클레오타이드를 수송할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 즉, 핵산 분자를 의미한다. 상기 벡터는 자발적 복제를 수행할 수 있거나, 숙주 DNA로 통합될 수 있다. 상기 벡터는 일 예로 외래 폴리뉴클레오타이드의 삽입을 위한 제한 효소 인식 부위를 포함하고, 하나 이상의 선택 마커(selectable marker)를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 “발현 벡터”는 발현되는 뉴클레오타이드 서열에 가동적으로 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 의미한다. 상기 발현 벡터는 일 예로, 코스미드(cosmids), 플라스미드 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 바이러스 등일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 pYES2 벡터를 발현벡터로 사용하여 도 3에 나타난 모식도와 같이 형질전환을 실시하였다.

상기 벡터를 미생물에 도입하는 과정은 통상의 형질전환(translation) 또는 형질감염(transfection)에 사용되는 방법에 의할 수 있고, 상세하게 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 외래 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 다양한 기법일 수 있으며, 상기 방법은 상기 도입되는 벡터 및 진핵생물의 종류에 의해 의존적으로 선택될 수 있다. 일 예로, 상기 방법은 인산칼슘 또는 염화칼슘 공-침전(co-precipitation), DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 리포좀 매개 형질감염(lipofection), 화학천공(chemoporation) 또는 전기천공 (electroporation)법으로 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 재조합 미생물을 배양하는 (b) 단계는 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 통상의 방법에 따라 배양된다. 일 예로, 상기 돌연변이는 통상의 배지, 구체적으로 탄소원, 효모 추출물과 같은 유기 질소원 또는 암모늄 설페이트와 같은 염의 형태인 질소원 및 철, 망간 또는 마그네슘과 같은 미량 원소(trace element) 및 필요에 따란 비타민을 포함하는 배지에서 배양될 수 있다.

상기 배양된 재조합 미생물로부터 리소좀을 수득하는 (c) 단계는 상기 돌연변이에 대해 세포 분획하는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 리소좀(lysosome)은 진핵세포 내에 가수 분해 효소를 많이 지니고 있어서, 세포 내 성분의 대사에 관계하는 것 외에 특히 식세포작용으로 외계 이물질의 세포내 소화에 중요한 역할을 수행하는 세포소기관을 의미한다.

상기 리소좀은 세포 내 소기관인 미토콘드리아와 다르게 한 겹의 막구조로 싸여 있으며, 이 내부는 가수분해효소 일 예로, 아미노말단 펩티드 가수분해효소는(aminopeptidase)와 같은 단백질 분해효소(protease), 산성 탈인산가수분해효소, 리보핵산 가수분해효소, β-글루클로리타아제 또는 아릴설퍼타아제 등이 포함되어 있다.

상기 리소좀은 세포 분해물 또는 세포 마쇄액을 원심분리하는 방법으로 수행하는 세포 원심분획법에 의할 경우, 미토콘드리아와 마이크로솜의 중간으로 분획된다.

상기 배양된 돌연변이로부터 리소좀을 수득하는 단계는 원심분획법으로 수행할 수 있고, 구체적으로 균질화하는 단계 및 원심분리하는 단계를 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.

일 예로, 상기 리소좀을 수득하는 방법은 원심분획법일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 진핵세포를 균질화하는 단계; 상기 균질화시킨 진핵세포를 18,000 x g 내지 22,000 x g의 조건으로 20분 내지 40분간 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 하층액을 수득하는 단계 및 상기 하층액을 450 x g 내지 550 x g의 조건으로 3분 내지 7분간 원심분리한 후, 상층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법일 수 있다.

상기 균질화하는 단계는 균질기 또는 호모게나이저를 이용하는 방법으로 수행할 수 있고, 상기 균질기 또는 호모게나이저 외에 시료인 세포를 마쇄할 수 있는 분쇄기 또는 마쇄할 수 있는 방법이라면 그 종류가 제한되지 아니한다. 상기 각 단계에서의 원심분리는 3℃ 내지 5℃에서 수행할 수 있다.

상기 리소좀 막단백질을 리포좀에 개질시키는 (d) 단계는 (ⅰ) 지질과 콜레스테롤 및 리소좀 막 단백질을 섞은 후 유기용매에 녹이는 단계; (ⅱ) 유기용매를 제거하는 단계; (ⅲ) 라이소소멀 효소를 혼합하는 단계; 및 (ⅳ) 작은 크기의 리포좀을 형성하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 바람직하게 상기 유기용매는 클로로포름일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 HSP70 유전자와 형광단백질을 도입하는 진핵생물은 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.) 미생물인 것일 수 있다.

상기 미생물은 구체적으로 진핵 미생물일 수 있다. 상기 진핵 미생물은 효모, 바람직하게는 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.) 미생물, 더욱 바람직하게는 사카로마이세스 세르비제(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다. 더더욱 바람직하게는 사카로마이세스 세르비제(Saccharomyces cerevisiae) s2085일 수 있다.

본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 항균은 항세균 및 항진균을 포함하는 것을 의미한다.

바람직하게 본원 발명의 항균은 대장균에 대한 항균일 수 있으며, HSP70은 대장균이 특이적으로 결합한다. 따라서, HSP70을 외막단백질로 포함하는 리포좀은 대장균에 표적적으로 항균 활성을 나타낼 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 제조방법으로 제조된, HSP70 단백질을 포함하는 표적적 항균 활성이 강화된 리포좀을 포함한다. HSP70 단백질을 포함하는 항균 활성이 강화된 리포좀은 도 11과 같이 나타낼 수 있다.

리소좀 타입의 항균 조성물의 경우, 표적적인 항균활성을 나타나도록 하기 어렵다. 하지만, 리소자임을 포함하는 리포좀의 막 표면을 개질(본원 발명에서는 HSP70을 막 단백질에 삽입하는 과정)하면, 특정 균에 대하여 표적적으로 타겟팅할 수 있다. 따라서, 인체 내에 해로운 균만 선택적, 표적적으로 사멸시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 리포좀을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 항균조성물이란 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항균제, 살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미일 수 있으며, 바람직하게는 그람 양성균 및 그람 음성균의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질을 의미한다.

상기 항균조성물은 병원성 미생물 및 병원성 진균에 대한 항균 활성을 갖는 항균조성물일 수 있고, 구체적으로는 병원성 미생물의 경우 그람 양성균 또는 그람 음성균일 수 있다.

상기 항균조성물은 대장균(E. coli), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 코리네박테리움 속 균주(Corynebacterium. sp), 잔토모나스 속 균주 (Xanthomonas . sp), 스트렙토마이세스 속 균주(Streptomyces. sp), 시겔라 속 균주(Shigella . sp) 및 데니오코커스 속 균주(Deinococcus . sp)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 대한 항균 활성을 갖는 것일 수 있고, 바람직하게는 대장균(E. coli), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 잔토모나스 오리제(Xanthomonas oryzae), 스트렙토마이세스 알부스(Streptomyces albus), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 및 데니오코커스 라디오필러스(Deinococcus radiophilus) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 대한 항균 활성을 갖는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는 대장균(E. coli)에 대한 항균 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 항균조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 리포좀 제조방법에 의해 제조된 리포좀을 0.001 내지 99.99중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있으며, 상기 항균조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 유효성분의 함량을 적절히 조절할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 항균제의 항균력은 하기 도 9에서 확인할 수 있듯이, 일반 진핵생물에서 분리한 리소좀 막단백질보다 HSP70이 포함된 리소좀 막단백질이 대장균에 대한 항균활성이 향상된 것을 확인하였다. 즉, HSP70이 대장균에 특이적으로 결합하여, 대장균을 표적적으로 사멸시킬 수 있음을 의미한다.

또한, 본 발명의 항균제는 미생물 농약을 대체한 가축 산업 및 농업 산업에 적용할 수 있는데, 일례로서 가축 산업에는 가축 사료 첨가제나 가축의 항생제 대신 사용할 수 있으며, 농업 산업에는 미생물 농약대신 친환경 농약제로 사용가능하다. 또한 일반 생활에 쓰이는 항균제 대신 대체 항균제로 사용 가능하다. 즉, 항균 스프레이로 개발하여 공기 중의 세균이나 자동차 시트, 옷 등에 스프레이할 수 있는 제품으로 사용하는 것 또한 가능하다.

본 발명의 항균조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용되어 항균 활성을 나타낼 수 있다. 상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하며, 소화나 배설 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하고, 구체적으로는 극피동물, 갑각류, 연체동물, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류일 수 있다.

본 발명의 항균조성물은 상기 리포좀 제조방법에 의해 제조된 리포좀 외에 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류를 포함할 수 있다.

상기 당질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일 예로 벌꿀, 덱스트린, 수크로오스, 팔라티노스, 포도당, 과당, 물엿, 당알콜(sugar alcohol), 소르비톨, 크실리톨, 말티톨일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 단백질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 카제인(casein), 유청 단백질(whey protein) 등의 우유 유래 단백질, 대두 단백질, 이들 단백질의 트립신, 펩신 등의 동물 유래 효소 및 뉴트라아제(neutrase), 알칼라아제(alkilase)에 의한 가수분해물일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 지질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일 예로, 제1가 포화지방산, 다가 불포화지방산을 포함하는 해바라기유, 채종유(rapeseed oil), 올리브유, 홍화유(safflower oil), 옥수수유, 대두유, 팜유(palm oil), 야자유 등의 각종 식물 유래 유지, 중쇄 지방산(middle-chain fatty acid), EPA, DHA, 대두유래 인지질, 우유 유래 인지질일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 비타민류는 특별한 제한은 없으며, 상기 미네랄류는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 인산칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨, 유산칼슘, 글루콘산칼슘, 판토텐산칼슘, 카제인칼슘, 염화마그네슘, 황산제1철, 탄산수소나트륨일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류 중 어느 것에 대해서도, 조성물의 항균성이 유지되는 한 상기 구체예에 한정되지 않고 다른 성분을 포함할 수 있으며, 각각의 함량은 항균성이 유지되는 한 제한되지 아니하고, 바람직하게는 전체 조성물 대비 0.1 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.5 내지 10 중량%일 수 있다.

본 발명의 상기 항균 조성물은 항균 활성이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있으며, 구체적으로는 병원성 미생물 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 건강기능식품, 화장료 조성물, 동물 사료 조성물, 식품 첨가물, 화장품 첨가물, 동물 사료용 첨가물, 세정제 및 청결제로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 항균 조성물 병원성 미생물 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 항균 조성물은 단독으로 사용될 수 있으며, 그 외 약리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함 할 수 있다.

상기 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀 및 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다.

본 발명은 상기 항균조성물을 포함하는 동물 사료용 조성물을 제공한다. 상기 동물 사료용 조성물은 상기 항균조성물을 유효성분으로 포함하는 항균조성물에 곡물, 식물성 단백질 사료, 동물성 단백질 사료, 당분 또는 유제품을 추가로 포함할 수 있다. 상기 곡물은 구체적으로는 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀일 수 있고, 상기 식물성 단백질 사료는 구체적으로는 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것일 수 있으며, 상기 동물성 단백질 사료는 구체적으로는 혈분, 육분, 골분 및 생선분일 수 있고, 상기 당분 또는 유제품은 구체적으로는 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분일 수 있다. 상기 동물 사료용 조성물은 추가로 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성창 촉진제 또는 질병 예방제와 같은 성분을 함께 사용할 수 있다.

본 발명의 동물 사료용 조성물에 포함되는 항균조성물은 사료의 사용목적 및 사용조건에 따라 달라질 수 있으며, 일 예로 최종 생산된 사료 1kg을 기준으로 상기 항균조성물이 0.1g 내지 100g 포함될 수 있다.

또한, 상기 사료용 조성물은 성분들의 분쇄정도에 따라 경점성의 조립 또는 과립 물질로 제조될 수 있으며, 상기 조성물은 메시(mesh)로 공급되거나 추가 가공 및 포장을 위해 원하는 분리된 형상으로 형성시킬 수 있으며, 저장을 위해 펠렛화, 팽창화 또는 압출 공정을 거칠 수 있으며, 저장의 용이성을 위해 바람직하게는 과잉의 물을 건조 제거될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

항균 활성 관련한 리소좀 막 단백질 분석

본 실시예1에서는 진핵생물인 사카로마이세스 세레비제(saccharomyces cerevisiae) 내 리소좀 막 단백질의 항균 활성 관련한 타겟팅 능력을 확인하기 위해 리소좀의 활성을 촉진시키는 물질인 과산화수소를 처리하여 키운 효모균으로부터 추출된 리소좀과 활성을 안정화시키는 염화암모늄을 20mM 과 50mM을 각각 처리한 후 성장시켰다. 그 뒤 리소좀 추출 후 막 단백질만을 분리한 다음 2차 전기영동 분석을 진행하였다(도 1 참조). 그 후 소프트웨어 프로그램인 progenesis PG200을 이용하여 로딩 된 스팟(spot)들을 분석하였고 그 결과 3가지의 서로 다른 스팟을 확인할 수 있었다. 그 상기 스팟분석을 통해 확인된 3가지 스팟은 HSP 70(heat shock protien 70, 이하 HSP 70)과 리보뉴클레오타이드 리덕테이즈(ribonucleotide reductase), 아데닐레이트 카이네이즈(adenylate kinase) 인 것으로 맵핑(mapping)을 통해 확인하였으며, 더욱 더 정확한 확인을 위해 말디-토프(maldi-tof) 분석을 의뢰하여 확인을 하였다(도 2 참조).

이를 이용하여 유전자 재조합된 효모를 재조하여 다시 리소좀을 분리 후 막단백질을 분리하여 리포좀의 표면을 개질하는데 이용하여 항균활성을 확인하고자 한다.

사카로마이세스 세레비제 균에 HSP 70과 녹색형광단백질(GFP)를 포함하는 유전자 재조합된 벡터 제작

본 실시예2에서는 진핵미생물인 사카로마이세스 세레비제(saccharomyces cerevisiae) s2085를 사용하였으며, pYES2(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 운반체 벡터로 사용하여 유전자 재조합을 진행하였다. 사카로마이세스 세레비제 균으로부터 유전체 데이터를 확인하였고, 유전체인 HSP 70의 DNA 서열(서열번호 1)을 NCBI의 genebank (www.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 확보하였다. pEGFP-C1 (BD Bioscience Clontech, USA) 벡터로부터 GFP 유전자(서열번호 2)를 확보하여 아래의 서열번호 3 내지 6에 해당하는 뉴클레오타이드 프라이머를 제작하였다. 제작한 프라이머를 이용하여 사카로마이세스 세레비제 균으로부터 제노믹 DNA를 추출하고, 이를 주형으로 하여 먼저 HSP 70관련 프라이머를 이용하여 PCR (polymerase chain reaction)을 진행하여 HSP 70 유전자을 증폭시켰다(표 1 참조). 또한, pEGP-C1을 주형으로 하여 GFP 관련 프라이머를 이용하여 PCR (polymerase chain reaction)을 진행하여 GFP 유전자를 증폭시켰다(표 1 참조).

유전자 동정을 위한 프라이머 서열

Gene	프라이머 서열	제한효소	서열번호
HSP70-F	5`- ccc GGA TCC atg tca aaa gct gtc ggt -3`	BamH	3
HSP70-R	5`- ggg CTC GAG tta atc aac ttc ttc aac -3`	XhoI	4
GFP-F	5`- tct CTC GAG atg gtg agc aag ggc gag gag -3`	XhoI	5
GFP-R	5`- gaa TCT AGA ctt gta cag ctc gtc cat 3`	XBaI	6

제조합 벡터 (pYES2::HSP70::GFP)의 제조

본 실시예3에서는 효모의 단백질 발현벡터인 pYES2 (invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 기본 벡터로 사용하여 HSP70 발현용 벡터인 pYES2::HSP70:GFP를 제작하고자 하였으며, 제작과정은 다음과 같다.

상기 실시예2에서 증폭한 GFP 유전자 DNA 절편을 XBaI과 XhoI으로 절단하여 동일한 제한 부위를 절단한 pYES2 벡터에 삽입하였다. 여기에 타겟 유전자인 HSP70을 XhoI과 BamHI로 절단한 후 동일한 제한부위에 삽입하여 최종적으로 pYES2::HSP70::GFP로 명명하였다(도 3 참조). 본 실시예에서 제조한 벡터 pYES2::HSP70::GFP를 효모인 사카로마이세스 세레비제 s2805에 전기천공법 (Electrophoration)으로 형질전환하였고, SD 고체평판배지에서 얻은 콜로니를 새로운 배지에 옮겨 단일콜로니를 얻었다. 콜로니를 얻은 후 DNA 확인을 위해 염기서열 확인을 통해 pYES2::HSP70::GFP에 삽입 된 HSP70과 GFP gene의 DNA 염기서열을 정확히 확인하였다. (도 4 및 5 참조)

재조합 효모에서 추출한 HSP70의 과발현 확인

본 실시예4에서는 상기 실시예 3에서 제조한 재조합 효모균을 SD 배지 (6.7g/L Yeast nitrogen base, 5 g/L amino acid 및 20 g/L glucose) 15ml에 접종하여 30 ℃, 160 rpm으로 OD 값이 3.0이 될 때까지 진탕 배양하였다. 얻어진 배양액에서 미생물만 남기고 제거한 다음 SG 액체 배지 (6.7g/L Yeast nitrogen base, 5 g/L amino acid 및 20 g/L galactose) 15ml을 넣어주었다. 이렇게 얻어진 배양액 6.67 ml(OD값이 0.4가 되도록 계산)을 SG 액체 배지 50 ml에 넣어 30 ℃, 160 rpm으로 약 3시간 단위로 측정해본 결과, 8시간과 12시간 동안 키웠을 경우에 단백질 과발현을 확인할 수 있었다. 도 6의 이미지는 HSP70의 발현을 확인하기 위해 효모균내 리소좀만 특이적으로 반응하는 붉은색의 LysoTracker를 처리하여 효모내 리소좀을 확인하였고, 병합(merged) 된 것으로 원하는 타겟 유전자가 잘 삽입된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 발현을 공초점현미경 (confocal microscope)으로 확인하였다. 붉은색으로 나타나는 Lyso-tracker의 경우, 배양된 효모균(배양액 포함)하여 약 만분의 일정도 희석된 염색약을 첨가하여 약 10분에서 20분동안 30 ℃에서 배양한 후 반응된 배양액을 다시 원심분리하여 상층액을 제거하고 펠렛을 수거한 후 멸균된 증류수에 희석하여 슬라이드 글라스에 효모를 놓고 공초점 이미지를 확인하였다(도 6 참조).

재조합 효모로부터 추출한 리소좀과 리소좀 내 효소의 항균 활성 확인

본 실시예5에서는 재조합된 효모균으로부터 추출된 리소좀의 막 단백질에 대한 타겟팅 능력을 확인하기 위해 먼저 리소좀에 대한 항균활성의 변화를 확인하고자 하였다. 리소좀의 항균활성의 변화를 확인하기 위해 벡터만 삽입된 재조합 효모균과 HSP 70이 삽입된 효모로부터 리소좀을 추출하여 항균활성을 확인하였다.

첫번째로는 리소좀의 막단백질만 따로 추출하여 항균 활성을 테스트 하였는데, 확인 결과 HSP 70이 삽입된 재조합된 효모균으로부터 추출된 리소좀에서 항균활성이 일반 효모균으로부터 추출된 리소좀보다 높음을 확인할 수 있었다(도 7 참조).

두번째로는 리소좀 내부의 효소만 따로 추출하여 항균 활성을 테스트 하였다. 확인 결과 일반 효모균과 재조합된 효모균으로부터 분리된 리소좀 효소의 항균 활성은 유의한 차이를 보이지 않았다(도 8 참조).

결과적으로, 리소좀 내부의 효소는 큰 차이가 없으나, 리소좀 막 단백질, 막 단백질 중에서도 특히 HSP 70 단백질이 타겟팅 효과 및 항균 활성을 가진다는 것을 확인하였다.

재조합된 효모로부터 추출된 리소좀 막단백질을 포함하는 리포좀의 항균 활성 확인

본 실시예6에서는 재조합된 리소좀 막 단백질의 타겟팅 능력을 확인하기 위한 실험을 진행하였다. HSP 70으로 재조합된 효모로부터 리소좀을 분리하여, 리포좀 내부에는 라이소소멀 효소를 넣고, 리포좀 막에는 분리한 HSP70 막단백질을 개질하였다. 대조군으로는 mock 벡터만 삽입된 효모로부터 리소좀을 분리하여, 리포좀 내부에는 라이소소멀 효소를 넣고, 리포좀 막에는 분리한 일반 리소좀 막단백질을 개질하였다.

리포좀의 표면을 리소좀 막 단백질로 개질하는 방법은 도 10에 나타난 바와 같이, 지질과 콜레스테롤를 8:2의 비율로 혼합하고, 재조합된 리소좀 막 단백질을 혼합한 후 클로로포름에 녹였다. 그 후 감압 농축기를 이용하여 유기용매를 제거하면서 얇은 필름을 제조하였고. 그 후 유기용매를 완벽하게 제거하기 위하여 10분동안 오븐에 두고 리소좀 효소를 섞은 후 1분간 혼합(vortexing)하였다. 그런 다음 보다 작은 크기의 리포좀 형성을 위하여 초음파균질기를 사용하였다. 개질한 리포좀의 보관은 원심분리를 실시하여 0.1M pH 6 PBS 버퍼에 보관하였다(도 10 및 11 참조).

상기 방법으로 개질한 HSP 70 막단백질을 포함하는 리포좀과 일반 리포좀의 항균활성을 확인한 결과, HSP 70 막단백질을 포함하는 리포좀에서 항균 활성이 높게 측정되었다. HSP70이 대장균에 특이적으로 결합하여, 라이소소멀 효소가 대장균에 높은 항균 활성을 나타낸 것이다. 즉, HSP70 단백질의 대장균 표적 효과 및 증강된 항균 활성을 확인하였다(도 9 참조).

[제조예 1]

피부 세안제의 제조

HSP70 막단백질을 포함하는 리포좀 0.5중량%

글리세린 6g

모노알킬포스페이트 2.0g

수산화나트륨수용액 0.5g

미리스틴산 1.5g, 향료 미량이 포함된 세안제 베이스12g

상기 성분을 호모 믹서(homo mixer)에서 교반한 후 60℃에서 3분간 가열한 다음 탈기하고 37℃로 냉각하여 세안제 조성물을 제조한다.

[제조예 2]

비누의 제조

HSP70 막단백질을 포함하는 리포좀 0.5중량%

비누 베이스 99.5중량%(수분 포함)

상기 성분을 혼합기로 잘 혼합한 후 비누 제조기에서 압출, 절단 및 형타하여 고형 비누 조성물을 제조한다.

[제조예 3]

주방용 세정제의 제조

HSP70 막단백질을 포함하는 리포좀 0.5중량%

알킬에테르술폰산염(alkylethersulfonate) 20중량%

알킬폴리글루코시드(alkylpolyglucoside) 4중량%

라우릴디메틸아민옥사이드(lauryldimethylamine oxide) 4중량%

코카미도 프로필베타인(Cocamidopropyl Betaine) 7중량%

에톡시화라우릴알콜 5중량%

EDTA 0.3중량%

색소 소량

향 0.5중량%

정제수 적량

상기의 성분을 혼합하여 세정제를 제조한다.

본 발명은 표적적 항균 활성이 강화된 리포좀에 관한 것으로, 보다 상세하게는 HSP70을 포함하는 항균 활성이 강화된 리포좀, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 항균 조성물을 제공한다. 본 발명의 HSP70를 포함하는 리포좀은 선택적으로 타겟팅이 가능하고 강화된 항균 활성 가지며, 사람에게 무해하게 사용 가능하다. 항균력을 바탕으로 하는 제품에는 모두 적용가능하고, 손 세정제, 항균제 등에 사용 가능하며, 살충제나 제초제에 있어서도 사용 가능하기 때문에 산업상 이용 가능성이 높다.

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Antimicrobial targeting liposome having antibacterial activity, Preparing method there of and Antimicrobial products containing there <130> 1042425 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1929 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP70 <400> 1 atgtcaaaag ctgtcggtat tgatttaggt acaacatact cgtgtgttgc tcactttgct 60 aatgatcgtg tggacattat tgccaacgat caaggtaaca gaaccactcc atcttttgtc 120 gctttcactg acactgaaag attgattggt gatgctgcta agaatcaagc tgctatgaat 180 ccttcgaata ccgttttcga cgctaagcgt ttgatcggta gaaacttcaa cgacccagaa 240 gtgcaggctg acatgaagca cttcccattc aagttgatcg atgttgacgg taagccacaa 300 attcaagttg aatttaaggg tgaaaccaag aactttaccc cagaacaaat ctcctccatg 360 gtcttgggta agatgaagga aactgccgaa tcttacttgg gtgccaaggt caatgacgct 420 gtcgtcactg tcccagctta cttcaacgat tctcaaagac aagctaccaa ggatgctggt 480 accattgctg gtttgaatgt cttgcgtatt attaacgaac ctaccgccgc tgccattgct 540 tacggtttgg acaagaaggg taaggaagaa 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ctttcgatgt cgactctaac 1440 ggtattttga atgtttccgc cgtcgaaaag ggtactggta agtctaacaa gatcactatt 1500 accaacgaca agggtagatt gtccaaggaa gatatcgaaa agatggttgc tgaagccgaa 1560 aaattcaagg aagaagatga aaaggaatct caaagaattg cttccaagaa ccaattggaa 1620 tccattgctt actctttgaa gaacaccatt tctgaagctg gtgacaaatt ggaacaagct 1680 gacaaggaca ccgtcaccaa gaaggctgaa gagactattt cttggttaga cagcaacacc 1740 actgccagca aggaagaatt cgatgacaag ttgaaggagt tgcaagacat tgccaaccca 1800 atcatgtcta agttgtacca agctggtggt gctccaggtg gcgctgcagg tggtgctcca 1860 ggcggtttcc caggtggtgc tcctccagct ccagaggctg aaggtccaac cgttgaagaa 1920 gttgattaa 1929 <210> 2 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP <400> 2 tctctcgaga tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc 60 gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat 120 gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc 180 tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac 240 cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc 300 accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc 360 gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc 420 ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag 480 cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg 540 cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc 600 gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat 660 cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg 720 tacaagtcta gattc 735 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP70 forward primer <400> 3 cccggatcca tgtcaaaagc tgtcggt 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP70 reverse primer <400> 4 gggctcgagt taatcaactt cttcaac 27 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP forward primer <400> 5 tctctcgaga tggtgagcaa gggcgaggag 30 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP reverse primer <400> 6 gaatctagac ttgtacagct cgtccat 27 <210> 7 <211> 642 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heat shock protein 70 amino acid <400> 7 Met Ser Lys Ala Val Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Ser Cys Val 1 5 10 15 Ala His Phe Ala Asn Asp Arg Val Asp Ile Ile Ala Asn Asp Gln Gly 20 25 30 Asn Arg Thr Thr Pro Ser Phe Val Ala Phe Thr Asp Thr Glu Arg Leu 35 40 45 Ile Gly Asp Ala Ala Lys Asn Gln Ala Ala Met Asn Pro Ser Asn Thr 50 55 60 Val Phe Asp Ala Lys Arg Leu Ile Gly Arg Asn Phe Asn Asp Pro Glu 65 70 75 80 Val Gln Ala Asp Met Lys His Phe Pro Phe Lys Leu Ile Asp Val Asp 85 90 95 Gly Lys Pro Gln Ile Gln Val Glu Phe Lys Gly Glu Thr Lys Asn Phe 100 105 110 Thr Pro Glu Gln Ile Ser Ser Met Val Leu Gly Lys Met Lys Glu Thr 115 120 125 Ala Glu Ser Tyr Leu Gly Ala Lys Val Asn Asp Ala Val Val Thr Val 130 135 140 Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ser Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly 145 150 155 160 Thr Ile Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala 165 170 175 Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Lys Gly Lys Glu Glu His Val 180 185 190 Leu Ile Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Leu Leu Ser 195 200 205 Ile Glu Asp Gly Ile Phe Glu Val Lys Ala Thr Ala Gly Asp Thr His 210 215 220 Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Asn Arg Leu Val Asn His Phe Ile Gln 225 230 235 240 Glu Phe Lys Arg Lys Asn Lys Lys Asp Leu Ser Thr Asn Gln Arg Ala 245 250 255 Leu Arg Arg Leu Arg Thr Ala Cys Glu Arg Ala Lys Arg Thr Leu Ser 260 265 270 Ser Ser Ala Gln Thr Ser Val Glu Ile Asp Ser Leu Phe Glu Gly Ile 275 280 285 Asp Phe Tyr Thr Ser Ile Thr Arg Ala Arg Phe Glu Glu Leu Cys Ala 290 295 300 Asp Leu Phe Arg Ser Thr Leu Asp Pro Val Glu Lys Val Leu Arg Asp 305 310 315 320 Ala Lys Leu Asp Lys Ser Gln Val Asp Glu Ile Val Leu Val Gly Gly 325 330 335 Ser Thr Arg Ile Pro Lys Val Gln Lys Leu Val Thr Asp Tyr Phe Asn 340 345 350 Gly Lys Glu Pro Asn Arg Ser Ile Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr 355 360 365 Gly Ala Ala Val Gln Ala Ala Ile Leu Thr Gly Asp Glu Ser Ser Lys 370 375 380 Thr Gln Asp Leu Leu Leu Leu Asp Val Ala Pro Leu Ser Leu Gly Ile 385 390 395 400 Glu Thr Ala Gly Gly Val Met Thr Lys Leu Ile Pro Arg Asn Ser Thr 405 410 415 Ile Pro Thr Lys Lys Ser Glu Ile Phe Ser Thr Tyr Ala Asp Asn Gln 420 425 430 Pro Gly Val Leu Ile Gln Val Phe Glu Gly Glu Arg Ala Lys Thr Lys 435 440 445 Asp Asn Asn Leu Leu Gly Lys Phe Glu Leu Ser Gly Ile Pro Pro Ala 450 455 460 Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Val Asp Ser Asn 465 470 475 480 Gly Ile Leu Asn Val Ser Ala Val Glu Lys Gly Thr Gly Lys Ser Asn 485 490 495 Lys Ile Thr Ile Thr Asn Asp Lys Gly Arg Leu Ser Lys Glu Asp Ile 500 505 510 Glu Lys Met Val Ala Glu Ala Glu Lys Phe Lys Glu Glu Asp Glu Lys 515 520 525 Glu Ser Gln Arg Ile Ala Ser Lys Asn Gln Leu Glu Ser Ile Ala Tyr 530 535 540 Ser Leu Lys Asn Thr Ile Ser Glu Ala Gly Asp Lys Leu Glu Gln Ala 545 550 555 560 Asp Lys Asp Thr Val Thr Lys Lys Ala Glu Glu Thr Ile Ser Trp Leu 565 570 575 Asp Ser Asn Thr Thr Ala Ser Lys Glu Glu Phe Asp Asp Lys Leu Lys 580 585 590 Glu Leu Gln Asp Ile Ala Asn Pro Ile Met Ser Lys Leu Tyr Gln Ala 595 600 605 Gly Gly Ala Pro Gly Gly Ala Ala Gly Gly Ala Pro Gly Gly Phe Pro 610 615 620 Gly Gly Ala Pro Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Pro Thr Val Glu Glu 625 630 635 640 Val Asp <210> 8 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP amino acid <400> 8 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser 225 230 235 240

Claims (10)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. (a) 서열번호 1로 이루어지는 HSP70(Heat Shock Protein 70) 유전자를 미생물에 형질전환하는 단계;
   (b) 상기 (a)단계에서 형질전환한 미생물을 배양하는 단계;
   (c) 상기 (b)단계에서 배양한 미생물로부터 생산된 HSP70 단백질을 수득하는 단계; 및
   (d) 상기 (c)단계에서 수득된 HSP70 단백질을 리포좀 막에 개질시키고, 리포좀 막 내에 라이소소멀 효소를 주입하는 단계;를 포함하며,
   상기 (d) 단계는 (ⅰ) 지질과 콜레스테롤이 중량비 8 : 1 내지 8 : 3로 혼합된 혼합물, HSP70 단백질, 및 리소좀 막 단백질을 혼합한 후 클로로포름에 녹이는 단계; (ⅱ) 클로로포름을 제거하는 단계; (ⅲ) 라이소소멀 효소를 혼합하는 단계; 및 (ⅳ) 리포좀을 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 리포좀 타입 대장균 억제용 조성물 제조 방법.
   
7. 삭제
8. 제6항의 제조방법에 의해 제조된, HSP70 단백질을 포함하는 대장균 억제 활성을 갖는 리포좀.
   
9. 삭제
10. 제6항의 제조방법에 의해 제조된 리포좀을 유효성분으로 포함하는 대장균 억제용 조성물.

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