KR20130115993A - 10-프로파길-10-데아자아미노프테린을 이용하여 메토트렉세이트-내성 장애를 치료하는 방법 - Google Patents

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기스베르투스 제이. 프롱크
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알로스 쎄러퓨틱스, 아이엔씨.
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Abstract

본 발명은 유효량의 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체의 메토트렉세이트-내성 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

10-프로파길-10-데아자아미노프테린을 이용하여 메토트렉세이트-내성 장애를 치료하는 방법{METHODS FOR TREATING METHOTREXATE-RESISTANT DISORDERS WITH 10-PROPARGYL-10-DEAZAAMINOPTERIN}
메토트렉세이트(methotrexate)(또한, "MTX")는 많은 종류의 암을 치료하기 위한 조합 화학요법의 일부로 사용된다. 이는 급성 림프모구성 백혈병을 포함하는 많은 신생물 장애의 치료제이다. 메토트렉세이트는 또한 중증근무력증, 다발근육염, 피부근염, 봉입체 근염, 강직척추염, 크론병, 건선, 농포 건선, 건선 관절염, 류마티스 관절염, 베게너 육아종증, 및 피부경화증을 포함하는 일부 자가면역 질병에 대한 치료제로 사용된다.
10-프로파길-10-데아자아미노프테린("10-프로파길-10-dAM", "프랄라트렉세이트", "라세미 PDX", "(2S)-2-[[4-[(1RS)-1-[(2,4-다이아미노프테리딘-6-일)메틸]부트-3-이닐]벤조일]아미노]펜탄이산", "(2RS)-2-[[4-[(1RS)-1-[(2,4-다이아미노프테리딘-6-일)메틸]부트-3-이닐]벤조일]아미노]펜탄이산" 및 "PDX"를 포함함)은 시험되고, 암의 치료에서 유용한 것으로 밝혀진 화합물이다. 10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 재발성 및 난치성 말초 T-세포 림프종에 대한 치료제로서 미국 식품의약국(FDA)에 의해 승인되었다. 10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 또한 림프종, 폐암, 방광암 및 유방암에서 사용하기 위해 연구되고 있다.
10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 본래 문헌[DeGraw et al., "Synthesis and Antitumor Activity of 10-Propargyl-10-deazaaminopterin," J. Med. Chem. 36: 2228-2231 (1993)]에 개시되었으며, 효소 다이하이드로폴레이트 환원효소("DHFR")의 억제제 및 뮤린 L1210 림프구성 백혈병 세포주에서의 성장의 억제제로 작용하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 뮤린 E0771 유방 종양 모델을 이용한 상기 화합물의 항종양 특성에 대해 일부 결과가 제시되었다.
미국 특허 번호 6,028,071호 및 PCT 공개공보 제WO 1998/02163호는 고도로 정제된 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 조성물이 이종이식 모델에서 시험되는 경우에 인간 종양에 대한 효능을 갖는 것을 개시한다. 10-프로파길-10-데아자아미노프테린을 이용한 이후의 연구는 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 자체 및 다른 치료제와의 조합물이 유용한 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 문헌[Sirotnak et al., Clinical Cancer Research Vol. 6, 3705-3712 (2000)]은 10-프로파길-10-데아자아미노프테린과 cMOAT/MRP-유사 형질막 ATPase의 억제제인 프로베네시드(probenecid)의 공동 투여가 인간 고형 종양에 대한 10-프로파길-10-데아자아미노프테린의 효능을 크게 향상시킨 것을 보고한다. 10-프로파길-10-데아자아미노프테린, 및 10-프로파길-10-데아자아미노프테린과 백금 기반 화학치료제의 조합물은 중피종에 대해 효과적인 것으로 밝혀졌다(Khokar, et al., Clin. Cancer Res. 7: 3199-3205 (2001)). 림프종의 치료를 위한 젬시타빈(Gem)과의 공동 투여가 WO/2005/117892호에 개시되었다. 10-프로파길-10-데아자아미노프테린과 탁솔의 조합물이 미국 특허 제6,323,205호에서 효과적인 것으로 개시되어 있다. 10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 또한 T-세포 림프종의 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌다. 이에 대해서는 미국 특허 제7,622,470호를 참조할 수 있다. PCT 공개공보 제WO 2005/117892호에 개시된 다른 연구에서 샘플에 의해 발현된 환원 폴레이트 담체-1 단백질(RFC-1)의 양을 결정함으로써 10-프로파길-10-데아자아미노프테린을 이용한 치료에 대한 림프종의 민감성을 평가하는 방법이 제시되었으며, 여기서 보다 높은 수준의 발현된 RFC-1은 10-프로파길-10-데아자아미노프테린에 대한 보다 큰 민감성을 나타낸다.
10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 항폴린산제(antifolate)/항대사물질로 공지되어 있다. 폴레이트 경로는 세포 성장 및 증식에서 중요한 역할을 한다(Appling, 1991; Odin et al, 2003). 폴산(폴레이트)는 환원 폴레이트 담체 1(RFC-1)을 통해 세포로 진입하고, 폴릴폴리글루타메이트 신세타제(folylpolyglutamate synthetase, FPGS)에 의해 폴리글루타메이션(polyglutamation)되고, 다이하이드로폴레이트로 환원되고, 이는 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)에 의해 추가로 테트라하이드로폴레이트(THF)로 전환된다. 상기 경로와 관련된 다양한 효소 및 전달체(transporter)가 중요한 부류의 세포독성 작용제인 항폴린산제에 대한 표적이다. 메토트렉세이트는 상기 부류의 첫번째 작용제 중 하나였고, 소아 급성 림프모구성 백혈병의 치료에서 첫번째로 사용되었다(Farber et al, 1948). 상기 이래로, 메토트렉세이트는 혈액암 및 고형암에서 널리 사용되어 왔고, 온당히 폴레이트 경로의 다양한 양태를 연구하기 위해 새로운 세대의 항폴린산제가 고안되어왔다(예를 들어, 결장직장암에서의 랄티트렉세드(raltitrexed)(Cocconi et al, 1998), 및 악성 중피종(Vogelzang et al, 2003) 및 비소세포폐암종(NSCLC)(Hanna et al, 2004)에서의 페메트렉세드(pemetrexed)). 대부분의 종양 세포에서, RFC-1은 폴레이트 유사체의 내재화를 매개한다. 세포 내로 진입한 후, 상기 유사체는 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)에 결합하여 퓨린 및 티미딘 생합성에 필요한 세포내 환원 폴레이트 푸울(pool)을 고갈시키거나, DHFR로의 결합 전에 폴리글루타메이트로 대사될 것이다. 폴리글루타메이션은 폴릴-폴리글루타메이트 신세타제(FPGS)에 의해 촉매된다. 폴릴-폴리글루타메이트 히드롤라제(FPGH, 감마-글루타밀 히드롤라제[GGH]로도 공지됨)는 상기 세포내 폴리글루타메이션된 항폴린산제의 분해 및 이에 따른 이후의 청소를 매개한다. 티미딜레이트 신타제(Thymidylate synthase, TS) 및 글리신아미드 리보뉴클레오타이드 포밀 트랜스퍼라제(glycinamide ribonucleotide formyl transferase, GARFT)가 또한 "순환(recycling)" 효소로서 폴레이트 대사와 관련된다(따라서, DNA 합성에 이용가능한 뉴클레오타이드의 풀에 직접적으로 영향을 미친다).
메토트렉세이트는 항폴린산제이다. 세포주의 시험을 기초로 하여, 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 및 메토트렉세이트는 유사한 패턴의 세포독성을 갖는 것으로 생각되며, 10-프로파길-10-데아자아미노프테린이 종종 메토트렉세이트보다 3 내지 19배 더 효능이 있다.
메토트렉세이트 내성은 보통 DHFR 유전자의 돌연변이 또는 증폭의 결과로서 발생한다. 세포가 상기 폴레이트 길항제의 효과에 대해 면역을 획득할 수 있는 3개의 공지된 방식이 존재한다. 세포 내의 메토트렉세이트의 농도는 약물을 세포 내외로 이동시키는 전달 시스템에서의 변화에 의해 감소될 수 있다. 예를 들어, 메토트렉세이트가 세포에 의해 흡수되는 것을 매개하는 전달체의 수의 감소가 존재하는 경우, 세포에 의해 흡수되는 메토트렉세이트가 세포 내에서 덜 발견될 것이다. 또한, 세포 내의 약물의 농도는 폴리글루타메이션 및 대사의 변경된 속도에 의해 조절될 수 있다. 약물이 보다 천천히 폴리글루타메이션화되거나 더욱 신속히 대사되는 경우, 약물은 세포로부터 보다 용이하게 제거되고, 세포 내에서의 약물의 농도 및 활성이 감소될 수 있다. DHFR 유전자의 증폭은 존재하는 DHFR의 양을 증가시킬 수 있고, 이는 메토트렉세이트 처리에 대한 감소된 반응과 관련되는 것으로 밝혀졌다. 메토트렉세이트는 이의 활성을 방지하기 위해 DHFR에 결합해야 한다. 유전적 변화가 메토트렉세이트 결합을 감소시키는 방식으로 DHFR의 결합 영역을 변경시키는 경우, DHFR은 폴레이트를 지속적으로 활성화시킬 수 있고, 치료의 효과가 감소될 것이다. 상기 결과 모두는 메토트렉세이트에 대한 증가된 내성과 관련이 있다. 메토트렉세이트에 대한 내성은 신속히 획득될 것이고, 치료 실패를 야기시킬 수 있다.
따라서, 획득된 메토트렉세이트 내성을 극복하는 방법이 이용될 것이다.
일 구체예에서, 본 발명은 개체의 메토트렉세이트-내성 장애를 치료하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 유효량의 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 유효량의 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 메토트렉세이트-내성 신생물을 필요로 하는 개체를 치료하는 방법을 포함한다.
일부 구체예에서, 장애는 암이다. 다른 구체예에서, 장애는 염증성 장애이다. 일 구체예에서, 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화된다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 경구 투여용으로 제형화된다.
도 1은 10-프로파길-10-데아자아미노프테린을 제조하는데 유용한 합성 반응식을 도시한 도면;
도 2(즉, 도 2a 내지 도 2d)는 시험된 15개의 암세포주에 대한 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 및 다른 폴레이트 억제제의 민감성을 도시한 도면;
도 3(즉, 도 3a 내지 도 3e)은 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 또는 메토트렉세이트로 처리된 경우, 나이브(naive), 10-프로파길-10-데아자아미노프테린-적합화(DU-PDX)된, 그리고 메토트렉세이트-적합화(DU-MTX)된, DU-145 세포에 대한 IC50을 도시한 도면;
도 4(즉, 도 4a 내지 도 4e)는 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 또는 메토트렉세이트로 처리된 경우, 나이브, 10-프로파길-10-데아자아미노프테린-적합화(HEP-PDX)된, 그리고 메토트렉세이트-적합화(HEP-MTX)된, HEP2 세포에 대한 IC50을 도시한 도면;
도 5(즉, 도 5a 및 도 5b)는 10-프로파길-10-데아자아미노프테린-내성 세포주에서의 폴레이트 유전자의 상대적 mRNA 발현을 도시한 도면;
도 6은 DU145 및 HEP2 민감성 및 DU-PDX, DU-MTX, HEP-PDX 및 HEP-MTX 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 및 메토트렉세이트-내성 세포주에서의 DHFR 단백질의 웨스턴 블롯을 도시한 도면;
도 7(즉, 도 7a 및 도 7b)은 DU145 및 HEP2 민감성 및 DU-PDX, DU-MTX, HEP-PDX 및 HEP-MTX 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 및 메토트렉세이트-내성 세포주에서의 DHFR에 대한 mRNA 발현을 도시한 도면.
암 환자에서 요법을 이용하는 것의 지속된 문제 중 하나는 요법에 대한 반응에서의 개별적 차이 및 화학요법에 대한 내성을 발생시키는 종양 내에서의 유전적 변화이다. 화학요법은 종종 신속하게 분열하는 세포로 표적화된 약물의 투여를 포함한다. 항폴린산제를 포함하는 많은 화학요법 약물은 세포 분열 전에 DNA 복제를 방해한다. 화학요법제에서 많은 진전이 있어왔으나, 암 세포, 특히 진행된 암의 유전적 불안정성은 약물 내성 암의 높은 발생률을 발생시킨다.
본 발명에서, 메토트렉세이트 및 10-프로파길-10-데아자아미노프테린에 대한 획득 내성을 갖는 세포주가 DU145(전립선) 및 HEP2(두경부)암세포주로부터 개발되었다. 모(parental) 세포보다 10-프로파길-10-데아자아미노프테린에 대해 200배 더 내성인 경우, 10-프로파길-10-데아자아미노프테린에 대해 획득 내성을 갖는 DU-PDX 및 HEP-PDX 세포는 메토트렉세이트에 대해 교차-내성을 나타내었고, DU-MTX 및 HEP-MTX 세포는 여전히 10-프로파길-10-데아자아미노프테린에 대한 유의한 민감성을 나타내었다.
10-프로파길-10-데아자아미노프테린 및 메토트렉세이트에 대한 획득 내성의 다양한 메커니즘이 관찰되었다. 10-프로파길-10-데아자아미노프테린에 대한 획득 내성은 DU-PDX 및 HEP-PDX 둘 모두의 세포주에서의 RFC1 mRNA 발현의 유의한 감소와 관련되었고, 또한, MDR1 mRNA 발현의 약간의 증가가 또한 관찰되었다. 본 발명은 또한 10-프로파길-10-데아자아미노프테린-내성 세포에서의 FPGS mRNA 발현의 약간의 감소를 나타내며, 이는 10-프로파길-10-데아자아미노프테린에 대한 내성에서의 폴리글루타메이션(polyglutamation)의 역할을 암시한다. 30년 전에 수행된 연구로 획득 메토트렉세이트 내성의 빈번한 메커니즘은 DHFR 유전자 증폭 및 결과로서 발생하는 효소 과발현임을 발견하였다(Assaraf 2007; Chen et al, 1995에서 개관됨). 그러므로, 메토트렉세이트의 점진적으로 증가하는 농도에서 배양된 종양 세포주의 선택 후, 획득 항폴린산제 내성은 종종 DHFR 유전자 증폭으로 인한 것이다. 또한, 본 발명에서, 메토트렉세이트에 대한 획득 내성을 갖는 세포주 HEP-MTX는 이의 모 대응물(counterpart)에 비해 DHFR 단백질 발현에서 극적인 증가를 나타내었고, 이는 상기 모델에서 DHFR 유전자 증폭이 가능함을 암시한다. 이러한 단백질 증가는 10-프로파길-10-데아자아미노프테린-내성 세포주에서는 관찰되지 않았다. 이러한 발견은 상기 세포주에서의 메토트렉세이트 및 10-프로파길-10-데아자아미노프테린에 대한 내성의 다양한 분자 메커니즘을 암시한다.
암은 치료제와의 접촉의 부재하에서의 암의 성장에 비해 치료제와의 접촉의 결과로서 암의 성장 속도가 억제되는 경우에 치료제에 대해 "반응성"이거나 치료에 대해 "우수한 반응"이 존재한다. 암의 성장은 다양한 방식, 예를 들어, 종양의 크기 또는 종양 유형이 측정될 수 있기에 적절한 종양 마커의 발현으로 측정될 수 있다. 이러한 기준은 측정되는 반응의 유형 및 또한 치료제에 대한 종양의 민감성의 또 다른 중요한 척도인 질병 진행에 대한 시간의 특성규명을 규정한다. 10-프로파길-10-데아자아미노프테린에 반응하는 특성은 가변적이고, 다양한 암은 다양한 조건 하에서 제공된 치료제에 대한 "반응성"의 다양한 수준을 나타낸다. 또한 추가로, 반응성의 척도는 환자의 삶의 질, 전이의 정도 등을 포함하는 종양의 성장 크기를 넘어서는 추가 기준을 이용하여 평가될 수 있다. 또한, 임상 예후 마커 및 변수가 적용가능한 상황에서 평가될 수 있다.
암은 치료제와의 접촉의 부재하에서의 암의 성장과 비교시 치료제와의 접촉의 결과로서 암의 성장 속도가 억제되지 않거나 매우 적은 정도로 억제되는 경우에 10-프로파길-10-데아자아미노프테린과 같은 치료제에 대해 "비-반응성"이거나 "불량한 반응"을 갖거나, 치료에 대해 불량한 반응이 존재한다. 상기 언급된 바와 같이, 암의 성장은 다양한 방식, 예를 들어, 종양의 크기 또는 종양 유형이 측정될 수 있기에 적절한 종양 마커의 발현으로 측정될 수 있다. 치료제에 반응하지 않는 특성은 매우 가변적이고, 다양한 암은 다양한 조건 하에서 제공된 치료제에 대한 "비-반응성"의 다양한 수준을 나타낸다. 또한 추가로, 비-반응성의 척도는 환자의 삶의 질, 전이의 정도 등을 포함하는 종양의 성장 크기를 넘어서는 추가 기준을 이용하여 평가될 수 있다. 또한, 임상 예후 마커 및 변수가 적용가능한 상황에서 평가될 수 있다. 이러한 반응하지 않거나 불량하게 반응하는 암은 비 반응성일 수 있거나, 최초에는 반응성이지만 획득 내성을 가질 수 있다. 내성 또는 비 반응성은 다른 더욱 민감한 암 또는 종양 세포주, 또는 동일 유형의 암 또는 종양 세포주에 대해 측정될 수 있다. 이러한 유형의 암은 또한 특정 화학치료제에 대한 "내성" 암으로 언급될 수 있고, 예를 들어, 메토트렉세이트-내성 암은 본래 메토트렉세이트에 대해 내성일 수 있거나, 메토트렉세이트 또는 또 다른 화학치료제를 이용한 경과 또는 경과들 동안 메토트렉세이트에 대해 획득 내성을 가질 수 있다. 내성은 폴레이트 경로 단백질 및 폴레이트 유입 경로 중 하나에서의 단백질 내의 돌연변이 또는 돌연변이들로 인한 것이거나, 메토트렉세이트에 대한 반응과 관련된 임의의 다른 단백질에 의한 것일 수 있다.
따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 유효량의 10-프로파길-10-데아자아미노프테린, 및 이의 약제학적으로 허용되는 염을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 메토트렉세이트-내성 장애를 치료하는 방법을 포함한다.
이전에 종양에 대해 독성이었던 약물의 효과에 대한 내성을 획득하는 종양의 능력은 내성을 발생시킬 수 있다. 이러한 획득된 내성은 염색체 붕괴로부터 발생할 수 있다. 감소된 투과성은 내인성 내성의 통상적인 형태이다. 약물의 변경 또는 비활성화는 아마 약물 내성의 가장 통상적인 메커니즘일 것이다. 약물 내성은 또한 약물이 작용하는 표적 부위에서의 변화로부터 발생할 수 있다. 장애, 예를 들어, 암이 메토트렉세이트에 대해 획득 내성을 갖는 상황은 주치의 또는 당 분야에서 기술을 갖는 사람의 평가에 의해 결정될 수 있고, 이는 치료시 장애의 회귀 또는 정체 후, 특정 치료 기간 후의 장애의 진행을 포함한다. 암을 포함하는 많은 장애에서 많은 장애가 치료에 대해 획득 내성을 나타내는 것이 관찰되었다.
따라서, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 메토트렉세이트를 이용한 치료 동안 메토트렉세이트에 대해 획득 내성을 갖는 폴레이트 경로 의존 질병 또는 악성종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.
"치료"는 추가 종양 성장을 예방하거나 억제할 뿐만 아니라, 종양의 수축을 야기시키고, 보다 긴 생존 시간을 제공하는 요법의 사용을 의미할 수 있다. 치료는 또한 종양의 전이의 예방을 포함한다. 종양은 암 또는 종양의 적어도 하나의 증상(반응성/비-반응성, 진행 시간, 또는 당 분야에 공지되거나 본원에 기재된 지표에 의해 결정됨)이 경감되거나, 종결되거나, 둔화되거나, 최소화되거나, 예방되는 경우에 "억제"되거나 "치료"된다. 본원에 추가로 기재된 바와 같은 치료 요법(예를 들어, 10-프로파길-10-데아자아미노프테린)을 이용한 치료에 따른 신체적 또는 다른 임의의 증상의 임의의 개선은 본 발명의 범위 내이다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 용어 "치료", "치료하는" 및 "치료하다"는 증상을 경감시키거나, 일시적 또는 영구적 원리로 암 또는 염증성 장애의 야기를 배제시키거나, 장애의 증상 및/또는 진행의 징조를 둔화시키거나, 질병을 예방(즉, 예방적으로 치료함)하는 것을 의미한다. 예방적 치료를 받는 피검체는 일반적으로, 예를 들어, 유전적 소인, 식이, 장애를 유발시키는 작용제에 대한 노출, 병원성 작용제에 대한 노출 등으로 인해 암 또는 염증성 질환의 위험이 있는 포유동물이다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 조성물은 "고도로 정제된" 10-프로파길-10-데아자아미노프테린, 및 10-프로파길-10-데아자아미노프테린의 부분입체 이성질체를 포함하는 10-프로파길-10-데아자아미노프테린을 포함할 수 있다. 명세서 및 이의 청구항에서 사용되는 바와 같이, "고도로 정제된" 조성물은 10-프로파길-10-데아자아미노프테린의 항종양 활성을 방해할 수 있는 다른 폴산 유도체, 특히 10-데아자아미노프테린을 실질적으로 함유하지 않는 10-프로파길-10-데아자아미노프테린을 함유한다. 본 발명의 범위 내의 조성물은 10-프로파길-10-데아자아미노프테린을 치료 용도를 위한 적합한 투여 단위 형태로 제형화시키기 위한 담체 또는 부형제뿐만 아니라 비-폴레이트 치료제를 함유할 수 있다.
10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 탄소 10(C10) 및 탄소 19(C19) 위치에 비대칭 중심을 함유한다. 일 구체예에서, 10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 C10 키랄 중심에 R-형태 및 S-형태의 약 1:1 라세미 혼합물을 포함하며, C19 키랄 중심에 98.0% 이상의 S-부분입체 이성질체를 포함한다. 10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 C10 부분입체 이성질체 PDX-10a [S-형태] 화학명: (2S)-2-[[4-[(1S)-1-[(2,4-다이아미노프테리딘-6-일)메틸]부트-3-이닐]벤조일]아미노]펜탄이산, 및 PDX-10b [R-형태] 화학명: (2S)-2-[[4-[(1R)-1-[(2,4-다이아미노프테리딘-6-일)메틸]부트-3-이닐]벤조일]아미노]펜탄이산을 포함한다.
10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 10-프로파길-10-데아자아미노프테린을 제조하는 것에 관한 것인 데그로우 등(DeGraw et al.)의 미국 특허 제5,354,751호의 실시예 7에 개시된 방법을 이용하여 합성될 수 있고, 상기 특허는 전체내용이 본원에 참조로서 포함된다. 10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 또한 본원에 참조로서 포함되는 미국 특허 제6,028,071호, 특히 실시예 1에 제시된 방법에 의해 합성될 수 있다.
10-프로파길-10-데아자아미노프테린의 부분입체 이성질체를 생성시키기 위해, 10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 본원 및 다른 곳에 교시된 바와 같이 합성될 수 있고, 최종 생성물 또는 이전의 중간 생성물이 이후에 C10 부분입체 이성질체를 분리시키기 위한 시작 물질로 사용될 수 있다. 대안적으로, 실질적으로 순수한 PDX-10a 및/또는 PDX-10b가 다수의 시작 물질 중 임의의 물질로부터 직접적으로 생성되는 키랄 합성이 이용될 수 있다. 당 분야에 공지된 거울상 이성질체 또는 부분입체 이성질체를 분리시키는 키랄 컬럼이 최종 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 또는 이전의 중간체의 부분입체 이성질체를 분리시키는데 사용될 수 있다. 부분입체 이성질체를 분리시키기에 적합한 키랄 컬럼은 이동상으로서 에탄올을 이용하는 Daicel Chemical Industries Ltd(Japan)로부터 이용가능한 키랄 컬럼 CHIRALPAK AD를 포함한다.
일부 구체예에서, 폴레이트 경로 의존 질병 또는 장애는 암이다. 다른 구체예에서, 폴레이트 경로 의존 질병 또는 장애는 염증성 장애이다. 일부 구체예에서, 암 또는 염증성 장애는 적어도 어느 정도는 처음에 메토트렉세이트에 민감하고, 이후에 메토트렉세이트에 대해 획득 내성이 된 장애이다. 폴레이트 경로 질병 또는 장애가 내인성이거나 획득이건 간에 메토트렉세이트에 대해 내성을 갖는지의 여부를 결정하는 방법은 당업자에 의해 결정될 수 있고, 이는 환자로부터 종양 세포와 같은 관련 세포를 배양하거나 획득하고, 메토트렉세이트에 대한 내성 및/또는 민감성과 관련된 다양한 폴레이트 경로 효소의 발현의 수준을 결정하는 것과 같은 방법을 포함할 수 있다. 또 다른 상기 방법은 고유하거나 획득이건 간에 내성을 나타내는 메토트렉세이트 치료에 대한 환자 반응을 결정하고/하거나 모니터함으로써 이루어진다. 관련 세포는 메토트렉세이트에 대한 내성을 나타내는 마커의 상대 발현을 결정하기 위해 유전형 검정되거나 표현형 검정될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 유전형 검정은 환자로부터 종양 체외이식편을 수득하고, 체외이식편의 일부를 배양하고, 체외이식편으로부터 관련 종양의 단층을 성장시키고, 단층을 약물 후보자에 노출시키고, 종양 세포 표현형을 변경시키는 약물 후보자의 능력을 평가하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 유전형 분석은 임의의 공지된 방법에 의해 달성된다. 바람직한 방법은 환자로부터 수득된 세포의 유전형 또는 이의 일부를 평가되는 치료제 후보자와 일반적으로 또는 특이적으로 관련된 약물 내성과 관련된 것으로 공지된 유전형을 비교하는 것을 포함한다. 예를 들어, 치료제 후보자에 내성을 부여하는 것으로 공지되거나 치료제 후보자에 내성을 부여하는 것으로 여겨지는 다형태 변이체의 환자 세포에서의 존재는 상기 세포에 대한 잠재적인 치료제에 대해 후보자를 배제시키는 방식으로 스크리닝된다. 환자 세포의 유전적 특성규명은 하기 기재되는 바와 같이 당 분야에 공지된 방법(예를 들어, 서열분석, 다형태)에 의해 결정된다. 약물 내성시의 환자의 유전형의 영향은 내성과 관련된 공지된 돌연변이 또는 다형태가 목록화된 유전 데이터베이스 또는 라이브러리를 참조로 하여 결정될 수 있다.
임의의 메커니즘으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 메토트렉세이트에 대한 내성 또는 획득 내성과 관련된 세포에서의 돌연변이의 예는 민감한 세포 또는 내성을 획득하기 전의 세포에 비한 DHFR mRNA 및/또는 단백질 발현에서의 증가를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구체예에서, 암 또는 염증성 장애는 메토트렉세이트에 대해 획득 내성을 갖는다. 치료하기 위한 암은, 예를 들어, 전립선암, 유방암, 흑색종, 폐암, 및 T-세포 림프종을 포함한다. T-세포 림프종에 대해, 본 발명의 부분입체 이성질체를 이용한 치료에 적용되는 다양한 질환이 존재하며, 이들은 (a) 흉선으로부터의 원시 림프양 전구체에서 악성종양이 발생하는 림프모구성 림프종; (b) 성숙 또는 말초 T 세포 신생물, 예를 들어, T 세포 전림프구성 백혈병, T-세포 과립 림프구성 백혈병, 침습성 NK-세포 백혈병, 피부 T 세포 림프종(균상식육종/세자리 증후군), 역형성 큰세포 림프종, T-세포 유형, 장병증형 T 세포 림프종, 성인 T-세포 백혈병/림프종, 예를 들어, HTLV-1과 관련된 성인 T-세포 백혈병/림프종, 및 혈관면역모세포 T 세포 림프종, 및 피하 지방층염 T 세포 림프종; 및 (c) 처음에 림프절 곁피질과 관련되며, 진정한 소포 패턴으로 성장하지 않는 말초 T 세포 림프종을 포함한다. 치료하기 위한 다른 암은 혈액암, 두경부암, 위장관의 암, 난소암, 및 골육종을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "염증성 장애"는 염증에 의해 야기되거나 증상이 염증을 포함하는 임의의 장애를 의미한다. 예를 들어, 염증에 의해 야기되는 염증성 장애는 패혈 쇼크일 수 있고, 증상이 염증을 포함하는 염증성 장애는 류마티스 관절염일 수 있다. 본 발명의 염증성 장애는 심혈관 질병, 류마티스 관절염, 다발경화증, 크론병, 염증성 장질병, 전신홍반루푸스, 다발근육염, 패혈 쇼크, 이식편 대 숙주병, 천식, 비염, 건선, 및 습진을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일 구체예에서, 치료하기 위한 염증성 장애는 류마티스 관절염 및 소아 류마티스 관절염을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "환자" 또는 "포유동물"은 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원 또는 반려 동물, 예를 들어, 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 의미한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 통상적으로 당 분야에 공지된 바와 같은 치료되는 환자에 가장 효과적인 치료(효능 및 안전성 둘 모두의 견지)를 제공하는 투여 요법으로 환자에 투여될 것이다. 본 발명의 치료 방법을 수행하는데 있어서, 본 발명에 따른 메토트렉세이트-내성 장애 및/또는 10-프로파길-10-데아자아미노프테린-민감성 암에서 사용하기 위한 10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 치료되는 암의 유형, 및, 예를 들어, 공개된 임상 연구의 결과를 기초로 한 처방 의사의 임상적 판단에 따라 당 분야에 공지된 임의의 효과적인 방식, 예를 들어, 경구, 국소, 정맥내, 복막내, 근내, 관절내, 피하, 비내, 안구내, 질내, 직장내, 두개내, 또는 피내 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 메토트렉세이트-내성 장애 및/또는 10-프로파길-10-데아자아미노프테린-민감성 암에서 사용하기 위한 10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 약제학적 제조물의 일부로 제형화될 수 있다. 특정 투여 형태는 투여 방법에 좌우될 것이며, 이는 정제, 캡슐, 경구용 액체, 및 경구, 정맥내, 근내, 두개내 또는 복막내 투여 등을 위한 주사용 용액을 포함할 수 있다. 투여량은 ㎎/㎡로 표현될 수 있다. 대안적으로, 투여량은 당업자에게 허용되는 임의의 방식에 의해 ㎎/㎏(체중)으로 표현될 수 있다. ㎎/㎏(체중)의 동등한 투여량을 수득하기 위한 한 방법은 평균적인 인간에 대해 1 ㎎/㎡와 대략 동등한 변환 인자 0.025 ㎎/㎏을 적용시키는 것을 포함한다. 이러한 계산에 따르면, 150 ㎎/㎡의 투여량은 약 3.75 ㎎/㎏와 대략 동등하다.
메토트렉세이트-내성 장애 및/또는 10-프로파길-10-데아자아미노프테린-민감성 암의 치료를 위한 종양학에 대한 적절한 투여는 하기 투여 요법을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 투여는 I.V.이다. 예를 들어, 약 10 내지 120 ㎎/㎡(체표면적)/일 (약 0.25 내지 3 ㎎/㎏(체중)/일)의 투여량이 적절하다. 3주 동안 매주 1회 30 ㎎/㎡(약 0.75 ㎎/㎏) 후, 1주일의 휴지 후, 6주 동안 매주 1회 30 ㎎/㎡(약 0.75 ㎎/㎏) 후, 1주일의 휴지, 또는 6주 동안 매주 1회 점진적으로 증가하는 용량의 10-프로파길-10-데아자아미노프테린의 투여가 또한 적합하다. 환자 내약력 및 악성종양의 유형을 기초로 하여 보다 적은 용량이 적절하게 사용될 수 있다. 덜 빈번한 투여가 이용되는 경우에 보다 높은 용량이 이용될 수 있다. 따라서, 일반적인 의미로, 다양한 투여 스케줄, 예를 들어, 격주 투여의 약 100 내지 275 ㎎/㎡(약 2.5 내지 약 6.87 ㎎/㎏), 및 매주 1회 투여의 약 10 내지 150 ㎎/㎡(약 0.25 내지 약 3.75 ㎎/㎏), 또는 더욱 특이적으로 약 10 내지 60 ㎎/㎡로 10 내지 275 ㎎/㎡(약 0.25 내지 약 6.9 ㎎/㎏)의 투여량이 적합하게 사용된다.
미국 특허 제6,323,205호에 기재된 것과 유사한 프로토콜을 이용한 적합한 투여량의 결정은 당 분야의 기술 범위 내이다. 일 구체예에서, 본 발명에 따른 메토트렉세이트-내성 장애 및/또는 10-프로파길-10-데아자아미노프테린-민감성 암에서 사용하기 위한 10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 용량 당 약 10 내지 약 275 ㎎/㎡(약 0.25 내지 약 6.87 ㎎/㎏)의 양으로 투여될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 매주 약 10 ㎎/㎡(0.25 ㎎/㎏) 또는 약 30 ㎎/㎡(0.75 ㎎/㎏)의 용량; 용량 당 약 10 내지 약 150 ㎎/㎡(약 0.25 내지 약 3.75 ㎎/㎏)의 양; 격주로 약 100 내지 약 275 ㎎/㎡(약 2.5 내지 약 6.9 ㎎/㎏)의 투여량의 본 발명에 따른 메토트렉세이트-내성 장애 및/또는 10-프로파길-10-데아자아미노프테린-민감성 암에서 사용하기 위한 10-프로파길-10-데아자아미노프테린의 투여를 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명에 따른 메토트렉세이트-내성 장애 및/또는 10-프로파길-10-데아자아미노프테린-민감성 암에서 사용하기 위한 10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 약 0.25 ㎎/㎏ 내지 약 4 ㎎/㎏의 양; 약 0.75 ㎎/㎏ 내지 약 3 ㎎/㎏의 양; 약 1.0 ㎎/㎏ 내지 약 2.5 ㎎/㎏의 양; 약 0.25 ㎎/㎏ 또는 약 0.75 ㎎/㎏의 양(또는 체표면적(BSA)에서의 동등한 양)으로 투여될 수 있다.
10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 다른 세포독성 및 항종양 화합물, 예를 들어, 빈카 알칼로이드, 예를 들어, 빈블라스틴(vinblastine), 나벨빈(navelbine), 및 빈데신(vindesine), 뉴클레오타이드 유사체, 예를 들어, 젬시타빈(gemcitabine), 5-플루오로유라실, 및 시타라빈(cytarabine); 알킬화제, 예를 들어, 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide) 또는 이포스파마이드(ifosfamide); 시스플라틴(cisplatin) 또는 카보플라틴(carboplatin); 류코보린(leucovorin); 탁산(taxane), 예를 들어, 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 도세탁셀(docetaxel); 방사성 동위원소를 갖거나 갖지 않는 항-CD20 모노클로날 항체, 및 항생제, 예를 들어, 독소루비신(doxorubicin) 및 미토마이신(mitomycin)과 함께 사용될 수 있다. 10-프로파길-10-데아자아미노프테린과 상기 다른 항종양제 중 여러개 또는 성장 인자 억제제 및 항-혈관형성 작용제의 조합물이 또한 사용될 수 있다.
10-프로파길-10-데아자아미노프테린 및 다른 작용제는 동시에 투여되거나, 통상적인 치료 요법의 일부로서 조합하여 이용될 수 있고, 여기서 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 및 다른 작용제(들)은 상이한 시간에 투여된다. 예를 들어, 다른 작용제가 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 투여 전, 투여 직후 또는 투여 후 일정기간(예를 들어, 24시간) 후에 투여될 수 있다. 따라서, 이러한 적용을 위해, 용어 "투여하는"은 일반적으로 달리 상술하지 않는 한 약물의 동시 투여 또는 순차적 투여, 및 약물 사이에 시간의 분리가 있거나 없는 병행 치료 요법에서 순서에 따른 투여를 의미한다.
염증성 장애의 치료를 위해, 10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 경구, 근내, 정맥내, 동맥내 또는 수막강내 경로에 의해 제공될 수 있다. 다른 경로는 당 분야의 기술의 경로일 것이다. 건선, 류마티스 관절염, 및/또는 소아 류마티스 관절염을 포함하나 이에 제한되지는 않는 염증성 장애의 치료를 위해, 용량은 하기를 포함할 수 있다. 성인 류마티스 관절염 또는 다관절-경로의 소아 류마티스 관절염에 대한 본 발명의 방법은 매주 1회 약 1 내지 약 30㎎의 경구 투여를 포함하고; 일 구체예에서, 약 7.5㎎이 매주 1회 투여된다. 다른 투여량은 매주 1회 10 ㎎/㎡를 포함할 수 있다. 투여량은 최적 반응을 달성하기 위해 점진적으로 조정될 수 있다. 보다 많은 투여량, 예를 들어, 20 ㎎/㎡/wk 이상, 또는 0.65 내지 1.0 ㎎/㎏/wk에서, 근내 또는 피하 투여에 의해 보다 나은 흡수가 달성될 수 있다. 적절한 용량은 또한 주 당 7.5㎎ 또는 약 0.5 내지 약 10㎎의 나누어진 경구 투여량을 포함할 수 있고; 일 구체예에서, 투여량은 매주 1회 과정으로 제공되는 3회 용량에 대한 12시간 간격의 2.5㎎의 나누어진 경구 투여량일 수 있다. 투여는 효과적인 한 지속될 수 있고, 이는 2년 및 이 이상 동안의 요법을 포함한다.
10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 치료의 부작용을 감소시키기 위해 폴산 및 비타민 B12 보충물과 함께 적합하게 사용된다. 예를 들어, 환자는 폴산(10-프로파길-10-데아자아미노프테린을 이용한 치료 1주일 전에 매일 1 ㎎/㎡로 시작하거나, 대안적으로 체표면적(BSA)을 기초로 하지 않은 매일 1㎎ 입주위(p.o.)); 및 B12(매월 1 ㎎/㎡, 또는 대안적으로 1㎎(BSA를 기초로 하지 않음)으로 8-10주 마다 근내(I.M.) 제공되거나, 대안적으로 매일 1㎎(BSA를 기초로 하지 않음) p.o.)로 치료될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 경구 투여용으로 제형화된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 정맥내 투여용으로 제형화된다.
10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 매우 다양한 상이한 투여 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, 10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 바람직하게는 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.
10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 정제, 캡슐, 로젠지(lozenge), 트로키(troche), 경질 캔디, 분말, 스프레이, 크림, 샐브(salve), 좌약, 젤리, 겔, 페이스트, 로션, 연고, 엘릭서(elixir), 시럽 등의 형태의 다양한 약제학적으로 허용되는 비활성 담체와 함께 투여될 수 있다. 이러한 투여 형태의 투여는 단일 또는 다수의 투여로 수행될 수 있다. 담체는 고체 희석제 또는 충전제, 멸균 수성 매질 및 다양한 비-독성 유기 용매 등을 포함한다. 경구용 약제학적 조성물은 적합하게는 감미화되고/되거나 착향될 수 있다. 10-프로파길-10-데아자아미노프테린의 경구 투여를 위해, 활성제 중 하나 또는 둘 모두를 함유하는 정제는 다양한 부형제 중 임의의 부형제, 예를 들어, 미정질 셀룰로스, 소듐 시트레이트, 칼슘 카보네이트, 다이칼슘 포스페이트 및 글리신과 함께 다양한 붕해제, 예를 들어, 전분(및 바람직하게는 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 일긴산 및 특정 복합 실리케이트 및 과립화 결합제, 예를 들어, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로오스, 젤라틴 및 아카시아와 조합된다. 추가로, 윤활제, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 라우릴 설페이트 및 탤크(talc)가 종종 정제화 목적에 매우 유용하다. 유사한 유형의 고체 조성물이 또한 젤라틴 캡슐 내의 충전제로 사용될 수 있고; 이와 관련하여 바람직한 물질은 락토오스 또는 유당뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 수성 현탁액 및/또는 엘릭서가 경구 투여에 요망되는 경우, 10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 다양한 감미제 또는 착향제, 착색 물질 또는 염료, 및 요망시, 에멀젼화제 및/또는 현탁제와 함께 희석제, 예를 들어, 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 글리세린 및 이의 다양한 유사 조합물과 조합될 수 있다. 본 발명의 조성물을 함유하는 정제는 임의로 하나 이상의 보조 성분 또는 애쥬번트와 함께 압착 또는 몰딩에 의해 제조될 수 있다. 압착된 정제는 적합한 기계 내에서 임의로 결합제, 윤활제, 비활성 희석제, 표면 활성제 또는 분산제와 혼합된 유동하지 않는 형태, 예를 들어, 분말 또는 과립의 활성 성분을 압착함으로써 제조될 수 있다. 몰딩된 정제는 적합한 기계 내에서 비활성 액체 희석제로 습화된 분말화된 화합물의 혼합물을 몰딩시킴으로써 제조될 수 있다. 각각의 정제는 바람직하게는 약 0.05㎎ 내지 약 10 g의 활성 성분을 함유하고, 각각의 샤세(cachet) 또는 캡슐은 바람직하게는 약 0.05㎎ 내지 약 10 g의 활성 성분을 함유하며; 정제는 또한 적합하게는 정제 당 약 2.5㎎의 활성 성분 또는 정제 당 약 7.5㎎의 활성 성분을 함유할 수 있다.
10-프로파길-10-데아자아미노프테린의 비경구 투여를 위해, 용액뿐만 아니라 활성제 또는 이의 상응하는 수용성 염을 포함하는 멸균 수성 용액이 사용될 수 있다. 이러한 멸균 수용액은 바람직하게는 적합하게 완충되고, 이는 또한 바람직하게는, 예를 들어, 충분한 염수 또는 글루코스를 이용하여 등장성이 된다. 이러한 특정 수용액은 특히 정맥내, 근내, 피하 및 복막내 주사 목적에 특히 적합하다. 오일 용액은 관절내, 근내 및 피하 주사 목적에 적합하다. 멸균 조건 하에서의 상기 모든 용액의 제조는 당업자에게 널리 공지된 표준 약제학적 기술에 의해 용이하게 달성된다.
수의 목적을 위해, 활성제는 임의의 형태를 이용하고 상기 기재된 경로 중 임의의 경로에 의해 동물에 별개로 또는 함께 투여될 수 있다. 한 바람직한 구체예에서, 10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 캡슐, 볼루스, 정제, 액체 드렌치(drench), 주사 또는 이식물의 형태로 투여된다. 대안으로서, 10-프로파길-10-데아자아미노프테린은 동물 사료와 함께 투여될 수 있고, 이러한 목적을 위해, 농축된 사료 첨가물 또는 프리믹스(premix)가 일반적인 동물 사료를 위해 제조될 수 있다. 이러한 제형은 표준 수의학적 실시에 따라 통상적인 방식으로 제조된다.
본 발명은 또한 유효량의 10-프로파길-10-데아자아미노프테린, 및 이의 약제학적으로 허용되는 염을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 메토트렉세이트-내성 신생물 치료를 필요로 하는 개체를 치료하는 방법을 포함한다.
용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 약제학적으로 허용되는 비독성 염기 또는 산으로부터 제조된 염을 의미한다. 본 발명의 화합물이 산성인 경우, 이의 상응하는 염은 편리하게는 무기 염기 및 유기 염기를 포함하는 약제학적으로 허용되는 비독성 염기로부터 제조될 수 있다. 상기 무기 염기로부터 유래된 염은 알루미늄, 암모늄, 칼슘, 구리(제2구리, 제1구리), 제2철, 제1철, 리튬, 마그네슘, 망간(제2망간 및 제1망간), 포타슘, 소듐, 아연 및 유사 염을 포함한다. 특히 바람직한 것은 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 포타슘 및 소듐 염이다. 일 구체예에서, 염은 염산염이다. 약제학적으로 허용되는 유기 비독성 염기로부터 유래된 염은 또한 일차, 이차 및 삼차 아민뿐만 아니라 시클릭 아민 및 치환된 아민, 예를 들어, 자연 발생 및 합성 치환된 아민의 염을 포함한다. 염이 형성될 수 있는 다른 약제학적으로 허용되는 유기 비독성 염기는 이온 교환 수지, 예를 들어, 아르기닌, 베타인, 카페인, 콜린, N',N'-다이벤질에틸렌다이아민, 다이에틸아민, 2-다이에틸아미노에탄올, 2-다이메틸아미노에탄올, 에탄올아민, 에틸렌다이아민, N-에틸모르폴린, N-에틸피페리딘, 글루카민, 글루코사민, 히스티딘, 히드라바민, 이소프로필아민, 리신, 메틸글루카민, 모르폴린, 피페라진, 피페리딘, 폴리아민 수지, 프로카인, 퓨린, 테오브로민, 트라이에틸아민, 트라이메틸아민, 트라이프로필아민, 트로메타민 등을 포함한다.
상기 기재된 통상적인 투여 형태에 더하여, 10-프로파길-10-데아자아미노프테린(이의 약제학적으로 허용되는 염, 에스터, 용매화물, 및 각각의 성분의 다형태를 포함함)은 또한 조절 방출 수단 및/또는 전달 장치에 의해 투여될 수 있다.
달리 표시하지 않는 한, 명세서 및 청구항에서 사용되는 성분, 치수, 반응 조건 등의 양을 표현하는 모든 수는 모든 예에서 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해되어야 한다.
본 출원 및 청구항에서, 단수의 사용은 달리 특별히 언급하지 않는 한 복수를 포함한다. 또한, "또는"의 사용은 달리 언급하지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 더욱이, 용어 "포함하는" 뿐만 아니라 다른 형태, 예를 들어, "포함하다" 및 "포함된"의 사용은 제한되지 않는다. 또한, "요소" 또는 "성분"과 같은 용어는 달리 특별히 언급하지 않는 한 하나의 단위를 포함하는 요소 및 성분, 및 하나를 초과하는 단위를 포함하는 요소 및 성분 둘 모두를 포함한다.
본 발명은 메토트렉세이트에 대한 획득 내성을 갖는 세포가 프랄라트렉세이트(pralatrexate)에 대한 민감성을 보유하는 한편, 프랄라트렉세이트에 대한 획득 내성을 갖는 세포가 또한 메토트렉세이트에 대한 획득 내성을 갖는 것을 나타내는 데이터를 일부 기초로 한다. 프랄라트렉세이트 민감성의 예측 유전 인자와 관련하여, 약물에 대해 획득 내성을 갖는 2개의 세포주가 DU145(전립선) 및 HEP2(두경부) 암세포주로부터 개발되었다. 모 세포보다 프랄라트렉세이트에 대해 200배 더 내성인 경우, DU-PDX 및 HEP-PDX는 메토트렉세이트에 대해 부분적 교차-내성을 나타내었다. 프랄라트렉세이트 획득 내성은 감소된 RFC-1 발현 및 증가된 MDR1 발현과 관련되었다. 문헌[Fotoohi et al (2009)]에는 메토트렉세이트-내성 세포에서 2배 이상 하향 조절된 RFC-1의 mRNA 수준을 갖는 항폴린산제-내성 백혈병 세포주가 기재되어 있고, 이는 항폴린산제 내성에서의 유입 수송의 중요한 역할을 강조한다. 유사한 데이타가 다른 메토트렉세이트-내성 세포 모델을 이용하는 문헌[Jansen (1998), Rothen (2004), 및 Ifergan (2003)]에 의해 이전에 수득되었다. 증가된 MDR1 발현은 관찰된 프랄라트렉세이트에 대한 획득 내성에서 일정한 역할을 하는 것으로 보이지 않았는데, 이는 MDR1의 억제가 프랄라트렉세이트에 대한 민감성을 회복하지 않았기 때문이다. 감소된 FPGS 활성은 인간 백혈병 CCRF-CEM 세포에서의 메토트렉세이트에 대한 획득 내성과 관련된 것을 밝혀졌다(Mauritz , 2002). 한 연구에서, FPGS 발현에서의 약간의 감소가 프랄라트렉세이트-내성 세포에서 관찰되었고, 이는 프랄라트렉세이트에 대한 내성에서의 폴리글루타메이션(polyglutamation)의 일정한 역할을 암시한다. 30년 전에 수행된 연구로 획득 메토트렉세이트 내성의 또 다른 빈번한 메커니즘은 DHFR 유전자 증폭 및 결과로서 발생하는 효소 과발현임을 발견하였다(Assaraf 2007; Chen et al, 1995에 의해 개관됨). 이러한 연구에서, 메토트렉세이트에 대한 획득 내성을 갖는 세포주 HEP-MTX는 이의 모세포 대응물에 비해 DHFR mRNA 및 단백질 발현에서 극적인 증가를 나타내었다. 증가된 DHFR 발현은 프랄라트렉세이트-내성 세포주에서는 관찰되지 않았다. 이러한 발견은 상기 세포주에서의 메토트렉세이트 및 프랄라트렉세이트에 대한 내성의 다양한 분자 메커니즘을 암시한다.
따라서, 본 발명은 놀랍게도 메토트렉세이트에 대해 내성이 되는 세포주가 프랄라트렉세이트에 대해 내성이 되지 않고/않거나, 프랄라트렉세이트에 대해 본래의 민감성에서 보다 많은 민감성을 보유하게 되는 것을 제시한다.
본 발명의 추가 목적, 장점, 및 신규한 특징은 하기 실시예의 시험 후에 당업자에게 명백해질 것이며, 상기 실시예는 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 기재되고 하기 청구항 섹션에서 청구되는 본 발명의 다양한 구체예 및 양태 각각은 하기 실시예에서 실험적으로 뒷받침된다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시 목적을 위해 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1:
도 1은 10-프로파길-10-데아자아미노프테린을 제조하는데 유용한 합성 반응식을 도시한다. 18㎖의 체(sieve)-건조된 THF 중의 오일 분산액(1.06g, 26.5 m㏖) 중의 60% NaH의 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 냉각된 혼합물에 건조 THF(7㎖) 중 동종테레프탈산(homoterephthalic acid) 다이메틸 에스터(5.0g, 24 m㏖. 도 1의 화합물 1)의 용액을 처리하고, 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 프로파길 브로마이드(26.4 m㏖)를 첨가하고, 혼합물을 추가 1시간 동안 00℃에서 교반한 후, 16시간 동안 실온에서 교반하였다. 생성된 혼합물에 2.4㎖의 50% 아세트산을 처리한 후, 240㎖의 물에 부었다. 혼합물을 에터(2×150㎖)로 추출하였다. 에터 추출물을 조합시키고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 오렌지색-황색 오일로 농축시켰다. 사이클로헥산-EtOAc(8:1)에 의한 용리를 이용한 실리카 겔 상에서의 크로마토그래피(230-400 메시(mesh)의 600㎖)로 백색 고체(4.66)로 생성물 α-프로파길동종테레프탈산 다이메틸 에스터(화합물 2)를 생성시켰고, 이는 TLC(사이클로헥산-EtOAc, 3:1)에 의해 동종성인 것으로 나타났다. 그러나, 상기 생성물에 대한 질량 스펙트럼 데이터는 상기 생성물이 요망되는 생성물 2, 및 다이프로파길화된 화합물의 혼합물인 것을 나타내었다. 시작 물질 1은 검출되지 않았다. HPLC는 모노프로파길화된 생성물 대 다이프로파길화된 생성물의 비가 약 3:1인 것을 나타내었다. 화합물 1과는 달리 다이프로파길화된 생성물은 반응의 다음 단계에서 원치 않는 생성물을 생성시킬 수 없으므로, 이러한 물질이 화합물 3으로의 전환에 적합하였다. 합성에서 진행시키는데 사용되는 생성물에서의 시작 화합물 1의 부재는 최종 생성물을 야기시키는 변환 동안 10-dAM의 이후의 형성을 피하는데 매우 중요한데, 이는 10-프로파길-10-데아자아미노프테린으로부터 10-dAM을 완전히 제거하는 것이 매우 어렵기 때문이다.
혼합물을 오일 분산액 중의 0.36 g의 60% NaH(9 m㏖)과 10㎖의 건조 DMF를 조합시키고, 0-5℃로 냉각시킴으로써 형성시켰다. 냉각된 혼합물에 10㎖의 건조 DMF 중의 첫번째 반응의 생성물(화합물 2)(2.94g, 12 m㏖)의 용액을 적가하여 처리한 후, 30분 동안 0℃에서 교반하였다. -25℃로 냉각시킨 후, 10㎖의 건조 DMF 중의 2,4-다이아미노-6-(브로모메틸)-프테리딘 하이드로브로마이드-0.2 2-프로판올(1.00g, 2.9 m㏖)의 용액을, 온도를 -25℃ 근처로 유지시키면서 적가하였다. 교반된 혼합물의 온도를 2시간의 기간에 걸쳐 -10℃로 상승시켰다. -10℃에서 추가의 2시간 후, 온도를 20℃로 상승시키고, 실온에서의 교반을 2시간 이상 동안 지속시켰다. 이후, 반응물을 고체 CO2의 첨가에 의해 pH 7로 조정하였다. 용매를 제거하기 위한 진공 하에서의 농축 후, 잔여물을 다이에틸 에터와 함께 교반하고, 에터 불용성 물질을 수거하고, 물로 세척하고, 진공 하에서 건조시켜, 1.49 g의 미정제 생성물을 생성시켰다. 이러한 미정제 생성물을 실리카 겔 컬럼으로의 적용을 위해 CHCl3-MeOH(10:1)에 용해시켰다. 동일한 용매 시스템에 의한 용리로 10-프로파길-10-카보메톡시-4-데옥시-4-아미노-10-데아즈압테로산(deazapteroic acid) 메틸 에스터(화합물 3)를 생성시켰고, 이를 40% 수율(485㎎)로 TLC로 동종화시켰다.
2-메톡시에탄올(5㎖) 중의 화합물 3(400㎎, 0.95 m㏖)의 교반된 현탁액에 물(5㎖)을 처리한 후, 10% 수산화나트륨 용액(3.9㎖)을 처리하였다. 혼합물을 4시간 동안 실온에서 교반하였고, 이 시간 동안 용액이 발생하였다. 용액을 아세트산을 이용하여 pH 8로 조정하고, 고진공 하에서 농축시켰다. 생성된 잔여물을 15㎖의 물에 용해시키고, pH 5.5 내지 5.8로 산성화시켜 침전물을 형성시켰다. 침전물을 수거하고, 물로 세척하고, 진공 하에서 건조시켜, 340㎎의 화합물 4(91% 수율)를 회수하였다. HPLC 분석은 90%의 생성물 순도를 나타내었다.
화합물 4(330㎎)를 10분 동안 115 내지 120℃에서 15㎖ DMSO 중에서 가열함으로써 탈카복실화시켰다. 10분 후의 HPLC에 의한 시험으로 전환이 본질적으로 완료된 것을 확인하였다. DMSO를 진공 하에서의 증류(40℃에서의 배쓰(bath))에 의해 제거하였다. 잔여물을 0.5N NaOH와 함께 교반하여 투명한 용액을 생성시켰다. 1N HCl을 이용한 pH 5.0으로의 산성화로 70% 수율의 황색 고체로 10-프로파길-4-데옥시-4-아미노-10-데아즈압테로산(화합물 5)을 발생시켰다. HPLC는 이러한 단계에서의 생성물 순도가 90%인 것을 나타내었다.
화합물 5(225㎎, 0.65 m㏖)를 트라이에틸아민(148㎎, 1.46 m㏖)을 함유하는 DMF(10㎖) 중 BOP 시약(벤조트라이아졸-1-일옥시트리스(다이메틸아미노) 포스포늄 헥사플루오로포스페이트(287㎎, 0.65 m㏖, Aldrich Chemical Co.))을 이용하여 다이메틸 L-글루타메이트 하이드로클로라이드(137㎎, 0.65 m㏖)와 커플링시켰다. 혼합물을 20 내지 25℃에서 3시간 동안 교반한 후, 건조 증발시켰다. 잔여물을 물과 함께 교반하고, 수-불용성 미정제 생성물을 수거하고, 진공 하에서 건조시켰다. 미정제 생성물(350㎎)을 CHCl3-MeOH(10:1) 함유 트라이에틸아민(0.25 부피%)에 의한 용리를 이용하는 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 165㎎의 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 다이메틸 에스터(화합물 6, 50% 수율)를 회수하였고, 이를 TLC(CHCl3-MeOH 5:1)로 동종화시켰다.
화합물 6(165㎎, 0.326 m㏖)을 10㎖의 교반된 MeOH에 현탁시키고, 여기에 0.72㎖(0.72 meq)의 1N NaOH를 첨가하였다. 수시간 후에 용액이 발생할 때까지 실온에서의 교반을 지속시켰다. 용액을 8시간 동안 20 내지 25℃에서 유지시킨 후, 10㎖ 물로 희석시켰다. 감압 하에서의 증발로 메탄올을 제거하고, 농축된 수용액을 또 다른 24시간 동안 20 내지 25℃에서 방치시켰다. 이후의 HPLC는 에스터 가수분해가 완료된 것을 나타내었다. 투명한 수용액을 아세트산을 이용하여 pH 4.0으로 산성화시켜, 담황색 고체로 10-프로파길-10-데아자아미노프테린을 침전시켰다. 수거된 물질을 물로 세척하고, 진공 하에서 건조시켜, 122㎎(79% 수율)로 칭량된 생성물을 생성시켰다. 원소 분석, 양성자 NMR 및 질량 분광학에 의한 검정은 지정된 구조와 완전히 일치하였다. HPLC 분석은 98%의 순도를 나타내었고, 생성물이 10-데아자아미노프테린을 함유하지 않는 것을 확립하였다.
이러한 경우, 10-프로파길-10-데아자아미노프테린(HPLC 피크 영역에 의해 결정됨)의 양은 98%에 도달하였으며, 10-데아자아미노프테린에 해당하는 피크는 처리 소프트웨어에 의해 검출되지 않았으나, 이러한 영역에서 약간의 기준선 잔물결(ripple)이 존재하였다.
실시예 2:
다양한 고형 종양 유형에 걸친 10-프로파길-10-데아자아미노프테린의 활성을 조사하기 위해, 15개의 인간 고형 종양 세포주를 이의 10-프로파길-10-데아자아미노프테린의 세포독성 활성에 대한 민감성에 대해 연구하였다.
재료 및 방법: 세포주
결장(HT29, HCT116, COLO205, HCC2998), 유방(MCF7, MDA-MB-435), 폐(HOP62, HOP92), 난소(OVCAR3, IGROV1), 전립선(DU145, PC3), 및 두경부(SCC61, HEP2, SQ20B) 인간 암세포주의 패널을 ATCC(Rockville, MD) 및 미국 국립암연구소(National Cancer Institute) 수집물로부터 구매하였다. 세포를 10% 우태아 혈청, 2mM 글루타민, 100 유닛/㎖의 페니실린 및 100 μM/㎖의 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 배지에서 단층으로 성장시켰다.
세포 세포독성 검정
생성된 모든 데이터는 이중으로 수행된 3개의 별개의 실험의 결과였다. 세포 생활력을 이전에 기재(Hansen, 1989)된 바와 같이 수행된 MTT 검정을 이용하여 결정하였다. 간단히, 세포를 2 x 103 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포를 120 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 0.4 ㎎/㎖의 MTT 염료(3-[4,5-다이메틸티아졸-2-일]-2,5-다이페닐테트라졸륨 브로마이드)를 37℃에서 4시간 동안 첨가하였다. 단층을 0.1㎖의 DMSO에 현탁시키고, 560 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 측정하였다. 양성 및 음성 대조군은 미처리된 세포 또는 세포가 없는 MTT를 함유하는 배지를 각각 갖는 웰을 포함하였다. 황색의 수용성 테트라졸륨 MTT의 자주색의 불용성 포르마잔으로의 전환이 미토콘드리아 탈수소효소에 의해 촉매되고, 이는 살아있는 세포의 수를 평가하는데 사용된다. 미처리된 세포에 해당하는 대조군 값을 100%로 설정하였고, 처리된 샘플의 생활력을 상기 대조군의 백분율로 표현하였다. IC50 값을 세포 생활력이 50%로 감소된 농도로 결정하였다.
단일 작용제 연구를 위해, 세포를 시딩하고, 24시간 동안 정치시킨 후, 72시간 동안 증가하는 농도의 10-프로파길-10-데아자아미노프테린으로 처리하였다. 인큐베이션 후, 세포를 48시간 동안 화합물을 함유하지 않는 배지로 수거한 후, MTT 검정을 이용하여 성장 억제를 결정하였다.
웨스턴 블롯 분석.
세포를 50mM HEPES(pH 7.6), 150mM NaCl, 1% 트리톤 X-100, 2mM 소듐 바나데이트, 100mM NaF, 및 0.4 ㎎/㎖의 페닐메틸설포닐 플루오라이드를 함유하는 완충액에 용해시켰다. 동등한 양의 단백질(20-50 ㎍/레인)을 SDS-PAGE에 적용시키고, 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 막을 항-분해 PARP, 항-분해 카스파제 3, 항-카스파제 9(Cell Signaling, Saint Quentin Yvelines, France), 항-DHFR(Abcam, France), 항-β-액틴(Sigma Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France) 특이적 일차 항체로 프로빙(probing)시킨 후, 퍼옥시다제-결합된 이차 항체로 프로빙시키고, 화학발광에 의해 시각화시켰다.
도 2는 시험되는 15개의 인간 암세포주의 10-프로파길-10-데아자아미노프테린에 대한 상대 민감성을 도시한다. 세포주 중 9개가 10-프로파길-10-데아자아미노프테린의 세포독성 활성에 대해 민감(IC50 < 0.1 μM)한 것으로 밝혀진 반면, 세포주 중 6개가 비교적 내성(IC50 > 9 μM)인 것으로 밝혀졌다.
단일 작용제 항증식 효과
프랄라트렉세이트의 항증식 효과를 표 1에 제시된 바와 같은 15개의 암세포주에서 시험하였다. 시간 경과 실험은 세포가 72시간 동안 프랄라트렉세이트에 노출된 경우에 최적의 항증식 효과가 달성된 것을 나타내었다(도 1A). 프랄라트렉세이트의 IC50은 전립선 암세포주 PC3에 대한 0.01±0.002 μM로부터 MDA-MB-435 세포주에 대한 >350 μM의 범위였다. 흥미롭게도, IC50에서 100배 이상의 차이를 갖는 세포주의 2개의 군이 관찰되었다: PC3, SCC61, DU145, HT29, HOP62, SQ20B, HOP92, HEP2, 및 IGROV1 세포를 포함하는 한 군은 0.1 μM 미만의 IC50을 나타낸 한편, Colo205, HCC2998, MCF7, HCT116, OVCAR3, 및 MDA-MB-435 세포는 9 μM 이상의 IC50 값을 나타내었다.
프랄라트렉세이트의 항증식 효과를 메토트렉세이트 및 여러 통상적으로 사용되는 항대사물질, 예를 들어, 페메트렉세드(pemetrexed), 5-FU, 및 5'-DFUR, 활성 카페시타빈(capecitabine) 대사물의 항증식 효과와 비교하였다(도 1B 및 표 1). 프랄라트렉세이트의 IC50은 메토트렉세이트에 대해 관찰된 것보다 평균적으로 거의 10배 더 낮았다. 이러한 두 항폴린산제의 세포독성 프로파일은 민감성 및 내성 세포주의 동일한 다른 군과 유사하였다. 프랄라트렉세이트의 세포독성 프로파일은 5-FU, 5'-DFUR 및 페메트렉세드의 세포독성 프로파일과 상이하였고, 이는 프랄라트렉세이트와 상기 다른 항대사물질 사이의 대사, 작용 메커니즘 및/또는 내성에서의 차이를 암시한다. 흥미롭게도, 프랄라트렉세이트와 페메트렉세드 사이에서 제한된 교차-민감성이 관찰되었고, 항폴리산제는 주로 티미딜레이트 신세타제(thymidylate synthetase, TS) 억제제인 것으로 생각되었다.
폴레이트 전달 및 대사와 관련된 유전자의 발현
항폴린산제에 대한 민감성과 관련된 것으로 공지된 유전자의 발현을 암세포주의 패널에서 분석하였다. DHFR, FPGS, TS/TYMS, (티미딜레이트 신세타제), SCL19A1/RFC-1, GARFT(글리신아미드 리보뉴클레오타이드 포르밀 트랜스퍼라제), SLC25A32(미토콘드리아 폴레이트 전달체/담체) 및 ABC 전달체 B1(ABCB1 또는 MDR1) mRNA 발현을 qRT-PCR에 의해 결정하였다(도 3a). 세포주는 다양한 수준의 상기 폴레이트 경로 유전자를 발현하였으나, 프랄라트렉세이트에 대한 민감성과 TS, SCL19A1/RFC-1, GARFT, SLC25A32, 및 MDR1의 mRNA 발현 사이에서 유의한 상관관계가 발견되지 않았다. 프랄라트렉세이트-민감성 세포는 "내성" 군보다 비교적 높은 수준의 프랄라트렉세이트의 표적인 DHFR을 발현하였으나, 이는 통계적 유의성에 도달하지는 않았다(p= 0.083, 도 3a). 프랄라트렉세이트-민감성 세포는 내성 세포보다 유의하게 높은 수준의 FPGS mRNA를 발현하였다(t-시험, p=0.002). 종합적으로, FPGS mRNA 발현과 프랄라트렉세이트 민감성(IC50) 사이에 확실한 상관관계의 경향이 발견되었고(R2=0.47, p<0.01), 이는 프랄라트렉세이트 항증식 활성에서의 폴리글루타메이션의 중요한 역할을 암시한다.
프랄라트렉세이트 활성에서의 폴레이트 전달의 잠재적 역할을 결정하기 위해, 본 발명자는 72시간의 약물 노출 후에 수득된 IC50 값과 9개의 프랄라트렉세이트 민감성 세포주에서의 SCL19A1/RFC-1 및 SLC25A32의 mRNA 발현의 수준을 서로 관련시켰다(도 3b). 높은 수준의 SCL19A1/RFC-1 및 SLC25A32 mRNA를 발현한 세포는 프랄라트렉세이트에 대한 보다 높은 민감성을 나타내었고, 이는 프랄라트렉세이트의 세포 흡수에서의 SCL19A1/RFC-1 및 SLC25A32의 잠재적 역할을 암시한다.
Figure pct00001
실시예 3:
10-프로파길-10-데아자아미노프테린 및 메토트렉세이트 내성 세포주의 개발.
10-프로파길-10-데아자아미노프테린 항증식 효과의 예측 인자를 특정규명하기 위해, 6개월의 기간에 걸쳐 단계적으로 증가하는 농도의 10-프로파길-10-데아자아미노프테린에 대한 노출에 의해 모 DU145 및 HEP2 세포로부터 각각 세포주 DU-PDX 및 HEP-PDX를 개발하였다. 생성된 DU-PDX 및 HEP-PDX 세포는 모 세포보다 10-프로파길-10-데아자아미노프테린에 대해 적어도 200 및 500배 덜 민감하였다. 약물을 함유하지 않는 배지에서 5회의 계대배양 후, 내성 세포는 이의 약물 내성을 유지하였으며, 이는 상기 세포주의 안정성을 암시한다.
10-프로파길-10-데아자아미노프테린 및 메토트렉세이트 내성의 메커니즘을 비교하기 위해, 단계적으로 증가하는 농도의 메토트렉세이트에 대한 노출에 의해 모 DU145 및 HEP2 세포로부터 세포주 DU-MTX 및 HEP-MTX를 개발하였다. DU-MTX 및 HEP-MTX는 모 세포에 비해 메토트렉세이트 및 10-프로파길-10-데아자아미노프테린에 대해 내성을 나타내었다. 그러나, DU-MTX 및 HEP-MTX 암세포에서 10-프로파길-10-데아자아미노프테린의 활성은 메토트렉세이트의 활성에 비해 여전히 우수(약 10배 더 낮은 IC50)하게 남아있었다.
도 3은 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 또는 메토트렉세이트에 적합화된 DU145 세포 및 DU145 세포에 대한, 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 또는 메토트렉세이트에 대한 IC50을 도시한다. 이러한 데이터는 DU-MTX에 대해, 10-프로파길-10-데아자아미노프테린이 유의한 효능을 유지하였고; 메토트렉세이트 적합화된 DU-145 세포주에 대한 10-프로파길-10-데아자아미노프테린에 대한 IC50이 0.02 μM인 것을 나타낸다. 비교하면, 나이브(naive) DU-145 세포에 대한 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 IC50은 0.01 μM이었다. 메토트렉세이트 적합화된 DU-145 세포는 메토트렉세이트에 대한 IC50에서 약 10배의 증가를 나타내었다. 요약하면, 10-프로파길-10-데아자아미노프테린에 대해 적합화된 DU-145 세포는 메토트렉세이트에 대해 둔감하된 반면, 메토트렉세이트 적합화된 DU-145 세포는 여전히 DU-145 나이브 세포와 10-프로파길-10-데아자아미노프테린에 대한 대략 동일한 민감성을 나타내었다.
도 4는 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 또는 메토트렉세이트에 대해 적합화된 HEP2 세포 및 HEP2 세포에 대한, 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 또는 메토트렉세이트에 대한 IC50을 도시한다. 이러한 데이터는 HEP-MTX(메토트렉세이트에 대해 적합화됨)에 대해, 10-프로파길-10-데아자아미노프테린이 유의한 효능을 유지하였고; 10-프로파길-10-데아자아미노프테린이 여전히 IC50 측정에 의해 10배 더 효과적인 것을 나타낸다.
획득 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 내성과 관련된 유전적 변화.
RT-PCR.
ABI Prism 7900 Sequence Detection System(Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용한 정량적 RT-PCR의 이론적 및 실제적 양태가 당업자에게 공지되어 있다. 결과를 가장 작은 양의 표적 유전자 mRNA를 함유한 시험 시리즈로부터의 세포주 샘플로 구성되는 교정기(calibrator)(1X 샘플) 및 TBP 유전자(내인성 RNA 대조군)에 비한 표적 유전자 발현에서의 n배 차이로 표현하였다. 실험을 이중으로 수행하였다.
항폴린산제 내성의 가능한 메커니즘을 결정하기 위해, 본 발명자는 모세포 및 내성 세포에서 DHFR, TS, FPGS, RFC1/SCL19A1, SLC25A32 및 ABCB1/MDR1을 포함하는 폴레이트의 대사와 관련된 여러 유전자의 mRNA 발현을 평가하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, DHFR, TS, 및 SLC25A32의 mRNA 발현은 10-프로파길-10-데아자아미노프테린-내성 세포에서 유의하게 변화하지 않았다. FPGS mRNA 발현에서의 약간의 감소가 모 대응물에 비해 DU-PDX 및 HEP-PDX 세포에서 관찰되었다. 대조적으로, RFC1/SCL19A1 발현은 2개의 10-프로파길-10-데아자아미노프테린-내성 세포주에서 10배 초과로 감소되었다. ABCB1/MDR1의 mRNA 수준은 DU145 및 HEP2에 비해 DU-PDX 및 HEP-PDX에서 각각 40배 및 2배 높았다. 이러한 데이터는 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 항증식 활성 및 획득 내성에서의 전달체의 중요한 역할을 암시한다. 칼슘 채널 차단제인 베라파밀(Verapamil)은 선천적 약리학적 기능과 상관 없이 MDR1의 경쟁적 기질로 작용함으로써 내성을 역전시킨다. 다양한 임상 연구는 또한 베라파밀과 같은 약물이 항암 약물에 대한 내성을 역전시킬 수 있음을 나타내었다. 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 내성에서의 MDR1의 역할을 연구하기 위해, DU-PDX 및 HEP-PDX 세포를 72시간 동안 10-프로파길-10-데아자아미노프테린과 동시에 30μM 베라파밀 및 3μM 사이클로스포린 A와 함께 인큐베이션시켰다. 베라파밀 및 사이클로스포린 A를 이용하거나 이용하지 않고 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 세포독성에서 변화가 관찰되지 않았고, 이는 상기 세포주에서 획득 내성에서 MDR1 과발현의 유의한 역할이 없음을 암시한다(결과는 제시하지 않음).
10-프로파길-10-데아자아미노프테린 및 메토트렉세이트의 표적인 DHFR의 발현의 분석은 모 HEP2 세포와 비교시 HEP-MTX 세포에서 단백질의 유의한 증가를 나타내었고, 이는 유전자 증폭(도 6) 및 mRNA에서의 유의한 증가(도 7)가 가능함을 암시한다. DHFR 단백질 발현은 10-프로파길-10-데아자아미노프테린에 대한 짧은(24시간) 노출 후에 약간 증가하였으나, 10-프로파길-10-데아자아미노프테린에 대한 연장된(6개월) 노출에서는 그렇지 않았는데, 이는 HEP-PDX 세포에서의 10-프로파길-10-데아자아미노프테린에 대한 획득 내성의 분자 메커니즘이 HEP-MTX 세포에서의 메토트렉세이트 내성과 상이함을 암시한다.
다른 약물에 대한 프랄라트렉세이트-내성 세포의 교차-내성을 평가하기 위해, DU145, DU-PDX, HEP2 및 HEP-PDX 세포를 72시간 동안 페메트렉세드 및 5-FU에 노출시켰다. 5-FU 세포독성에 대해 모 세포와 PDX-내성 세포 사이에 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 72시간 동안 페메트렉세드 노출은 모 대응물에 비해 DU-PDX 및 HEP-PDX 세포에서 단지 약간 덜 세포독성이 있었다(데이터는 제시되지 않음). 이러한 데이터는 프랄라트렉세이트에 대한 획득 내성이 페메트렉세드 및 5-FU에 대한 내성으로 해석할 수 없음을 암시하는데, 이는 상기 화합물 작용의 메커니즘에서의 차이로 인한 것일 수 있기 때문이다.
프랄라트렉세이트는 환원 폴레이트 담체 1(reduced folate carrier 1, RFC-1) 단백질 및 폴릴폴리글루타메이트 신세타제(FPGS)에 대해 높은 친화성을 가져 종양 세포 내에서 광범위한 내재화 및 축적을 발생시키는 항폴린산제이다. 프랄라트렉세이트는 다양한 악성종양에서 단일 작용제 및 조합물로 현재 연구되고 있다. 추가의 임상적 개발을 유도하기 위해, 조합 치료에 대한 프랄라트렉세이트에 대한 민감성 및 전임상 데이터의 분자적 상관 관계가 요구된다.
15개의 인간 고형 종양 세포주 중 9개에서 프랄라트렉세이트는 효능있는 항증식 활성(IC50 <0.1 μM)을 나타내었다. 2개의 별개의 군의 세포주인 민감성 세포주 및 비교적 내성인 세포주에서 프랄라트렉세이트 IC50 값에서 100배를 초과하는 차이를 갖는 것이 확인되었다. IC50 값에 의한 프랄라트렉세이트의 시험관내 항증식 효과는 메토트렉세이트를 이용하여 관찰된 시험관내 항증식 효과보다 평균적으로 거의 10배 더 나았다. 5-FU, 5'-DFUR 및 페메트렉세드를 포함하는 다른 항대사물질에 대한 상기 2개의 유사한 항폴린산제의 세포독성 활성을 비교하는 경우, 프랄라트렉세이트는 NSCLC HOP62 및 HOP92 세포주와 같은 5-FU 및 5'-DFUR에 대해 거의 민감하지 않은 여러 세포에서 활성을 보유하는 것으로 보였다. 유사하게, 페메트렉세드에 대한 민감성 프로파일은 프랄라트렉세이트에 대한 민감성 프로파일과 상이하였고, 이는 상기 화합물 작용의 분자 메커니즘에서의 차이로 설명될 수 있다.
요약하면, 10-프로파길-10-데아자아미노프테린에 대한 획득 내성은 DU-PDX 및 HEP-PDX 세포주에서의 감소된 RFC-1 및 증가된 MDR1 발현과 관련되었다. MDR1의 약리학적 억제는 상기 모델에서 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 내성을 변화시키지 않았으며, 이는 관찰된 내성에서의 MDR1의 제한된 역할을 암시한다. 10-프로파길-10-데아자아미노프테린-내성 세포에서 DHFR mRNA 발현에서 변화가 발견되지 않았다. 대조적으로, DHFR mRNA 및 단백질 발현에서의 유의한 증가가 HEP-MTX 세포에서 관찰되었다. 10-프로파길-10-데아자아미노프테린에 대한 획득 내성의 메커니즘에서의 차이가 관찰되었고; 이러한 데이터는 메토트렉세이트 민감성 암뿐만 아니라 획득 메토트렉세이트 내성의 환경에서의 10-프로파길-10-데아자아미노프테린의 추가의 개발을 암시한다.
본 발명의 상기 논의는 예시 및 기재의 목적으로 제공되었다. 상기는 본원에 개시된 형태 또는 형태들로 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다. 본 발명의 기재는 하나 이상의 구체예 및 특정 변화 및 변형의 기재를 포함하나, 예를 들어, 본 발명의 개시의 이해 후에 당업자의 기술 및 지식 범위 내일 수 있는 다른 변화 및 변형이 본 발명의 범위 내에 속한다. 본 발명자는 청구된 권리에 대한 대안적, 상호교환적 및/또는 동등한 구조, 기능, 범위 또는 단계를 포함하는 허용되는 한도까지의 대안적 구체예에 대하여, 이러한 대안적, 상호교환적 및/또는 동등한 구조, 기능, 범위 또는 단계가 본원에 개시되거나 그렇지 않건 간에, 그리고 임의의 특허가능한 주제를 공적으로 제공하고자 하는 것이 아님과 함께, 상기 대안적 구체예를 포함하는 권리를 획득하고자 한다.

Claims (15)

  1. 개체의 메토트렉세이트-내성 장애를 치료하는 방법으로서, 약제학적 유효량의 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물을 메토트렉세이트-내성 장애를 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 메토트렉세이트-내성 장애의 치료방법
  2. 제1항에 있어서, 상기 장애가 암인 것인, 메토트렉세이트-내성 장애의 치료방법.
  3. 제2항에 있어서, 치료될 상기 암이 전립선암, T-세포 림프종, 유방암, 폐암, 혈액암, 두경부암, 위장관의 암, 난소암 및 골육종인 것인, 메토트렉세이트-내성 장애의 치료방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 장애가 염증성 장애인 것인, 메토트렉세이트-내성 장애의 치료방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 염증성 장애가 류마티스 관절염인 것인, 메토트렉세이트-내성 장애의 치료방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 경구 투여용으로 제형화되는 것인, 메토트렉세이트-내성 장애의 치료방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 정맥내 투여용으로 제형화되는 것인, 메토트렉세이트-내성 장애의 치료방법.
  8. 메토트렉세이트-내성 신생물 치료가 필요한 개체를 치료하는 방법으로서, 유효량의 10-프로파길-10-데아자아미노프테린 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 메토트렉세이트-내성 신생물 치료가 필요한 개체의 치료방법.
  9. 제8항에 있어서, 장애가 암인 것인, 메토트렉세이트-내성 신생물 치료가 필요한 개체의 치료방법.
  10. 제9항에 있어서, 치료될 암이 전립선암, T-세포 림프종, 유방암, 폐암, 혈액암, 두경부암, 위장관의 암, 난소암, 및 골육종인 것인, 메토트렉세이트-내성 신생물 치료가 필요한 개체의 치료방법.
  11. 제8항에 있어서, 장애가 염증성 장애인 것인, 메토트렉세이트-내성 신생물 치료가 필요한 개체의 치료방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 염증성 장애가 류마티스 관절염인 것인, 메토트렉세이트-내성 신생물 치료가 필요한 개체의 치료방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 조성물이 경구 투여용으로 제형화되는 것인, 메토트렉세이트-내성 신생물 치료가 필요한 개체의 치료방법.
  14. 제8항에 있어서, 상기 조성물이 정맥내 투여용으로 제형화되는 것인, 메토트렉세이트-내성 신생물 치료가 필요한 개체의 치료방법.
  15. 제1항에 있어서, 메토트렉세이트-내성 장애가 메토트렉세이트에 대한 획득 내성을 갖는 장애인 것인, 메토트렉세이트-내성 신생물 치료가 필요한 개체의 치료방법.
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