KR20130091080A - ｍｅｓｏ-2,3-부탄다이올 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 meso-2,3-부탄다이올 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 다음의 단계를 포함하는 meso-2,3-부탄다이올의 제조방법이다: (a) 크렙시엘라(Klebsiella) 종의 아세토인 환원효소(acetoin reductase) 뉴클레오타이드 서열을 대장균(Escherichia coli)에서의 발현에 적합한 코돈 최적화(codon optimization)하여 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 수득하는 단계; (b) 상기 아세토인 환원효소의 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 발현 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계; (c) 상기 재조합 벡터를 대장균에 형질전환하여 재조합 대장균을 제조하는 단계; 및 (d) 상기 재조합 대장균으로부터 meso-2,3-부탄다이올을 제조하는 단계. 본 발명은 크렙시엘라(Klebsiella) 종의 아세토인 환원효소(acetoin reductase)를 암호화하는 유전자서열의 코돈 최적화(Codon Optimization)를 통해 해당 효소의 활성이 대장균에서 높게 발현 될 수 있도록 코돈을 개량한 것으로 이를 통하여 재조합 대장균에 의한 meso-2,3-부탄다이올의 생산을 가능하게 하였으며, 기존의 효소 활성에 비해 3-7배의 증가된 활성을 나타낸다.

Description

ｍｅｓｏ-2,3-부탄다이올 제조방법{Methods for Preparing meso-2,3-butanediol}

본 발명은 ｍｅｓｏ-2,3-부탄다이올 제조방법에 관한 것이다.

화석연료들의 사용은 지구온난화 가스 및 폐기물을 대량생산하여 인류에게 심각한 환경적인 위기를 초래하고 있다. 화학공업을 대체할 수 있는, 즉 인류에게 유해한 폐기물의 생산 및 에너지 소비를 최소화할 수 있는 바이오매스를 원료로 사용하는 환경 친화적인 새로운 생물 공정의 개발이 필요하다. 바이오에너지로 대표되어지는 바이오에탄올, 바이오디젤, 바이오가스 및 부탄올에 대한 관심이 증가하고 있지만, 언급된 종류의 바이오에너지 모두 전력생산이나 수송용 연료로 사용될 수 있으나, 실적용 및 생산 방법의 몇몇 단점으로 인해 새로운 신재생에너지 자원인 탄화수소 형태의 화합물에 대한 관심이 증가되고 있다. 이에 따라 다양한 산업적 가치를 지닌 플랫폼용 화합물인 meso-2,3-부탄다이올을 대사산물로서 생성할 수 있는 재조합 균주에 대한 관심도 증대되고 있다.

크렙시엘라(Klebsiella) 종은 폐렴 및 장염과 같은 병을 일으키는 병원성균이며, 유당 발효를 하는 조건적 혐기성 균주이다. 일반적으로 크렙시엘라(Klebsiella) 종은 단당류로부터 2,3-부탄다이올의 3 가지 이성질체들의 혼합물을 생합성한다. meso-2,3-부탄다이올의 이성질체로는 (R,R)-, meso- 및 (S,S)- 형태의 이성질체가 존재한다. 이러한 이성질체의 생합성 비율은 균주, 유전자 및 배양 환경 등에 의해서 매우 급격하게 변화되는 것을 볼 수 있다.

meso-2,3-부탄다이올은 용매, 부동액(anti-freeze solution) 및 가소제(plasticizer)의 합성에 이용되는 화학물질이다. 화학적 전환을 통해 합성고무 제조에 사용되는 부타디엔(1,3-butadiene), 액체연료 첨가제(liquid fuel additive)인 MEK(methyl ethyl ketone) 및 식품 첨가제 향료로써 사용되는 아세토인(acetoin), 디아세틸(diacetyl) 및 폴리우레탄의 전구체 등의 생산이 가능하다.

meso-2,3-부탄다이올은 생물학적 방법으로 생산이 가능하며, 2차 세계대전 당시 상업적 규모로 개발되어졌다가, 최근 산업바이오 기술 개발과 함께 다시 관심을 받고 있다. meso-2,3-부탄다이올은 혼합산 발효(mixed acid fermentation) 대사경로를 통해 생산되며 균주와 탄소원에 따라서 다양한 생산 양산을 보여준다. 글루코오즈를 탄소원으로 이용하는 경우, 피부르산염(pyruvate) 및 아세토인(acetoin)을 거쳐 meso-2,3-부탄다이올이 생산되거나 다이아세틸(diacetyl)을 거치는 부탄다이오 순환을 통해 meso-2,3-부탄다이올이 생산되는 선택적 경로를 갖고 있다.

미생물의 meso-2,3-부탄다이올 생산을 위한 균주의 발굴, 재조한 균주의 개량 및 효율적인 전환기술에 해당하는 시도와 노력은 끊임없이 있어왔다. 특히, 크렙시엘라 종은 meso-2,3-부탄다이올 생산량이 높다고 알려져 있는 균주로 많은 연구가 진행되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 유해한 폐기물의 생산 및 에너지 소비를 최소화할 수 있는 신재생에너지 자원인 탄화수소 형태의 화합물을 제조하기 위해 meso-2,3-부탄다이올을 제조할 수 있는 재조합 미생물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 산업용 균주로 유용한 대장균에 크렙시엘라(Klebsiella)의 아세토인 환원효소(acetoin reductase) 뉴클레오타이드를 코돈 최적화한 유전자 도입을 통해 우수한 효율을 갖는 아세토인 환원효소으로부터 효율적으로 meso-2,3-부탄다이올을 제조할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 meso-2,3-부탄다이올의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 meso-2,3-부탄다이올을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 아세토인 환원효소(acetoin reductase)의 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 meso-2,3-부탄다이올의 제조방법을 제공한다:

(a) 크렙시엘라(Klebsiella) 종의 아세토인 환원효소(acetoin reductase) 뉴클레오타이드 서열을 대장균(Escherichia coli)에서의 발현에 적합한 코돈 최적화(codon optimization)하여 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 수득하는 단계;

(b) 상기 아세토인 환원효소의 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 발현 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계;

(c) 상기 재조합 벡터를 대장균에 형질전환하여 재조합 대장균을 제조하는 단계; 및

(d) 상기 재조합 대장균으로부터 meso-2,3-부탄다이올을 제조하는 단계.

본 발명자들은 유해한 폐기물의 생산 및 에너지 소비를 최소화할 수 있는 신재생에너지 자원인 탄화수소 형태의 화합물을 제조하기 위해 meso-2,3-부탄다이올을 제조할 수 있는 재조합 미생물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 산업용 균주로 유용한 대장균에 크렙시엘라(Klebsiella)의 아세토인 환원효소(acetoin reductase) 뉴클레오타이드를 코돈 최적화한 유전자 도입을 통해 우수한 효율을 갖는 아세토인 환원효소으로부터 효율적으로 meso-2,3-부탄다이올을 제조할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 meso-2,3-부탄다이올의 제조방법을 각각의 단계로 나누어 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 코돈 최적화( Codon Optimization )

본 발명은 meso-2,3-부탄다이올의 제조방법을 제공하는 것으로, 본 발명에 의해 제조되는‘meso-2,3-부탄다이올’은 아세토인 환원효소에 의해 아세토인으로부터 전환된다. 아세토인 환원효소는 다음의 반응식을 통해 아세토인(acetoin)을 부탄다이올로 합성하는 효소를 말한다.

[반응식]

본 발명의 주요한 특징은 본 발명의 meso-2,3-부탄다이올 제조에 이용되는 아세토인 환원효소는 코돈 최적화(Codon Optimization)된 뉴클레오타이드를 갖는 것이다.

본 명세서에서, 용어 ‘코돈 최적화(Codon Optimization)’은 단백질 제조를 증가시키는 방법 중 하나이다. 단백질 서열을 코딩하는 핵산 서열은 숙주가 거의 사용하지 않는 코돈으로 구성되어 최대로 발현되지 않는다. 코돈 최적화는 기본적으로 목적하는 핵산 서열의 (발현빈도가 높지 않은) 코돈을 숙주의 코돈 발현 빈도를 반영하여 숙주에 유리하게 변환하는 것이다. 다음은 대장균의 특정 아미노산을 코딩하는 코돈의 빈도를 나타낸다. http://www.kazusa.or.jp/codon/ 는 모든 생물체의 코돈 빈도를 제시하고 있다.

바람직하게는, 본 발명의 코돈 최적화된 아세토인 환원효소는 서열목록 제2서열에 기재된 아미노산 서열을 가지는 핵산 분자이고, 보다 바람직하게는, 상기 핵산 분자는 서열목록 제1서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈(예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.

또한, 뉴클레오타이드에서의 변이가 아세토인 환원효소 자체에 변화를 가져올 수도 있다. 아세토인 환원효소의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 발명의 아세토인 환원효소와 거의 동일한 활성을 나타내는 것이 얻어질 수 있다.

본 발명의 아세토인 환원효소에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 아세토인 환원효소와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 아세토인 환원효소 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 예컨대 최소 99%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)(Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NCBI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

단계 (b): 재조합 벡터의 제조

이어, 상기 아세토인 환원효소의 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 발현 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조한다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, p_L ^λ프로모터, p_R ^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol ., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(p_L ^λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev . Genet ., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

바람직하게는, 상기 아세토인 환원효소의 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 lac 프로모터에 작동적으로(operatively) 결합되어 있다.

본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 벡터는 아세토인 환원효소 유전자가 효소 과발현 기능을 포함하여 최소한의 길이를 가지도록 RBS(Ribosomal binding site) 및 효소발현에 꼭 필요한 부분을 포함하는 염기서열만을 서열로 정하여 삽입시키는 것이 숙주세포의 대사부담(metabolic burden)을 줄이는 측면에서 바람직하며, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 pUC18 벡터를 개량하여 사용하였다.

단계 (c): 재조합 대장균의 제조

이어, 상기 재조합 벡터를 대장균에 형질전환하여 재조합 대장균을 제조한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac. Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic . Acids Res ., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 전기천공방법을 이용하여 재조합 대장균을 제조하였다.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 아세토인 환원효소를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.

본 발명의 서열목록 제2서열에 기재된 아미노산 서열을 가지는 아세토인 환원효소 또는 서열목록 제1서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산분자에 의해 형질전환 될 수 있는 미생물로는, E. coli DH5α, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주를 이용할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

단계 (d): meso -2,3- 부탄다이올의 제조

마지막으로, 상기 재조합 대장균으로부터 meso-2,3-부탄다이올을 제조한다.

바람직하게는, 상기 단계 (d)는 pH 4 내지 pH 8 조건 및 35℃ 내지 45℃조건에서 실시한다.

바람직하게는, 상기 방법은 코돈 최적화 되지 않은 크렙시엘라종의 아세토인 환원효소 뉴클레오타이드 서열을 이용한 경우와 비교하여 meso-2,3-부탄다이올에 대한 수율이 3-7배 증가된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 코돈 최적화된 아세토인 환원효소는 기존의 아세토인 환원효소와 비교하여, 효소 활성이 3-6배 증가하였으며, 아세토인으로부터 meso-2,3-부탄다이올로의 전환율도 5 배 이상 증가하였다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 meso-2,3-부탄다이올을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 크렙시엘라(Klebsiella) 종의 아세토인 환원효소(acetoin reductase)에 대한 대장균(Escherichia coli)에서의 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 크렙시엘라(Klebsiella) 종의 아세토인 환원효소(acetoin reductase)를 암호화하는 유전자서열의 코돈 최적화(Codon Optimization)를 통해 해당 효소의 활성이 대장균에서 높게 발현 될 수 있도록 코돈을 개량한 것으로 이를 통하여 재조합 대장균에 의한 meso-2,3-부탄다이올의 생산을 가능하게 하였다.

(b) 본 발명의 코돈 최적화된 아세토인 환원효소는 기존의 효소 활성에 비해 3-6배의 증가된 활성을 나타낸다.

(c) 본 발명은 화학공업에 유용한 기초가 될 플랫폼용 화합물인 meso-2,3-부탄다이올을 대량 생산하는 것은 친환경적이며 경제적으로도 큰 강점을 갖출 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 크렙시엘라(Klebsiella) 종이 글루코오즈로부터 meso-2,3-부탄다이올 (meso-2,3-butanediol)을 전환하는 대사 경로를 보여주는 도식으로 아세토인을 meso-2,3-부탄다이올로 전환하는 효소를 암호화하는 유전자(budC)를 나타낸다.
도 2는 발현 벡터인 pUC18을 크렙시엘라 및 대장균(E. coli) 셔틀 벡터로 사용하기 위해 카나마이신 내성 유전자를 삽입한 구조의 도식화이다. 이를 pUC18K라 명명하였다. 화살표 머리(▶)는 유전자 서열의 5’에서 3’ 의 방향성을 의미하는 것이고, 가로 마디()는 제한효소 부위가 있는 부분을 나타낸다.
도 3는 셔틀벡터인 pUC18K에 코돈 치환을 통해 대장균에 최적화된 budC 유전자가 삽입되어있는 구조의 도식화이다. 이를 pSBCO3이라 명명하였고, 코돈 최적화된 유전자를 CObudC라 명명하였다. 화살표 머리(▶)는 유전자 서열의 5’에서 3’ 의 방향성을 의미하는 것이고, 가로 마디()는 제한효소 부위가 있는 부분을 나타낸다.
도 4은 크렙시엘라 뉴모니아 염색체를 주형으로 하여 코돈 치환을 통해 대장균에 최적화된 아세토인 환원효소(acetoin reductase)의 유전자를 삽입한 pSBCO3를 제한효소를 처리하여 유전자의 삽입 여부를 확인한 전기영동 사진이다. 1열; 사이즈마커, 2열; E. coli ::pUC18K::CObudC 에 BamHⅠ및 XbaⅠ처리하여 budC가 잘린 결과.
도 5는 본 발명의 E. coli ::pSBCO3 재조합 균주의 pH에 따른 아세토인 첨가 배지에서의 meso-2,3-부탄다이올 생산 수율을 코돈이 치환되지 않은 유전자를 넣은 재조합체와 비교해서 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 E. coli ::pSBCO3 재조합 균주의 온도에 따른 아세토인 첨가 배지에서의 meso-2,3-부탄다이올 생산 수율을 코돈이 치환되지 않은 유전자를 넣은 재조합체와 비교해서 나타낸 그래프이다.

실시예

실시예 1: 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 이용한 CObudC 유전자를 발현하는 재조합 플라스미드의 제조

크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) KCTC 2242의 염색체를 주형으로 하여 meso-2,3-부탄다이올 생산을 위한 아세토인 환원효소를 암호화하는 budC의 유전자서열(Genbank, NCBI)을 기초로 바이오니아(대한민국)에 코돈 최적화를 의뢰하여 CoBudC를 제작하였다. 상기 CObudC의 프라이머(primer)를 제작하여 중합효소연쇄반응(PCR, TaKaRa Korea) 방법을 통해 클로닝 하였다. 표 1의 유전자를 타겟 유전자만 특이적으로 증폭하도록 제작된 표 2의 프라이머를 사용하여 증폭하였다. CObudC는 771 bp의 크기로 증폭되었다.

유전자	생산 효소
CObudC	아세토인 환원효소

유전자	프라이머 서열		제한 효소
CObudC	F	5'-GGATCCATGAAAAAAGTCGCATTAGTTACTGG -3'	BamHⅠ
	R	5'-TCTAGATTAATTAAATACCATACCACCGTCG -3'	XbaⅠ

중합효소연쇄반응은 통상적인 반응조건(10 mM Tris-HCl(pH 9.0), 50 mM KCI, 0.1% 트리톤 X-100, 2 mM MgSO₄ 및 Taq DNA 중합효소(TaKaRa, 일본)) 하에 95℃/5분 (변성), 66℃/1분(어닐링) 및 72℃/1분(신장)의 조건으로 1회 수행한 후, 95℃/1분 (변성), 66℃/30초(어닐링) 및 72℃/1분(신장)의 조건으로 30회 반복 수행하였다. 마지막 단계로 안정적인 신장을 위해 95℃/1분(변성), 66℃/1분(어닐링) 및 72℃/5분(신장) 반응하였다. 중합효소연쇄반응 후 증폭된 DNA는 0.8% 아가로즈 젤 상에서 확인 후 정제하여 T-벡터 클로닝에 이용하였다. pGEM-T 이지 벡터(TaKaRa, 일본)에 라이게이션(ligation)하여 재조합 플라스미드인 pGEM-T::CObudC를 제작하였다. 상기 재조합 플라스미드를 대장균(E. coli DH5α 컴프턴트 세포, RBS)에 형질 전환하여 균주를 제조하였다.

실시예 2: 재조합 플라스미드 pSBCO3의 제조

상기 실시예 1의 재조합 플라스미드인 pGEM-T::CObudC 및 대장균과 크렙시엘라(Krebsiella)의 셔틀 벡터인 pUC18K(도 2)에 표 2의 제한효소를 처리하여 37℃ 항온수조 (water bath)에서 약 2시간 반응하였다. 실시예 2에서 사용한 pUC18K는 기존의 pET28a벡터에 카나마이신에 저항성을 갖는 유전자를 클로닝한 후 pUC18벡터에 삽입하여 제작하였다. 표 2의 제한효소로 각각 DNA 절편을 절단한 후, pUC18K 벡터의 다중삽입부위(multicloning site)에 T4 라이게이즈(Takara, 일본)를 이용하여, 16℃에서 반응시켜 재조합 플라스미드를 완성하였다. 각 단계마다 삽입된 유전자의 삽입여부를 확인하기 위해 대장균(E. coli DH5α 컴프턴트 세포, RBS)에 형질 전환 시킨 후 재조합 플라스미드를 추출하여 제한효소로 처리하고 잘린 DNA를 0.8% 아가로즈 젤 상에 전기영동하여 확인하였다. 도 4에서는 재조합된 플라스미드가 제한효소에 의해 절단된 결과를 보여준다.

증폭된 산물에 표 2의 제한효소를 처리하고 pUC18K 벡터에 도입하여 pSBCO3을 제조하였다. 도 3는 상기 pSBCO3(CObudC를 암호화하는 유전자 포함)라 명명된 벡터의 지도(map)를 나타낸다.

실시예 3: 이종 대장균 형질전환체 제조

통상적으로 클로닝용으로 많이 쓰이는 균주의 경우 CaCl₂ 버퍼를 사용하여 컴피턴트 세포를 만든 후 열 충격(42℃) 방법에 의해 플라스미드를 숙주세포 내로 도입하지만, 본 발명에서는 형질전환체의 안정적 제조와 형질전환 효율을 높이기 위해 전기천공법(electroporation)에 의한 형질전환방법을 사용하였다.

상기 전기 충격에 의한 형질전환방법을 위해 16시간 동안 전배양 된 30 ㎕ (0.1 %)의 야생종 E. coli DH5α 배양액을 시험관에 들어있는 3 ㎖의 LB(10 g/L 트립톤, 10 g/L NaCl 및 5 g/L 효모 추출물)배지에 접종하였다. 배양액의 흡광도 (absorbance)가 600 ㎚ 파장에서 0.6에 이르렀을 때, 배양액 전체에 해당하는 3 ㎖ 배양액을 원심분리(12000 rpm, 1분)하여 상등액과 세포를 분리하였다. 수득한 세포를 10% 글리세롤 1 ㎖로 1회 세척해준 후, 다시 원심분리(12000 rpm, 1분)하여 상등액과 세포로 분리하였다. 세포를 10% 글리세롤 80 ㎕로 현탁하였다. 현탁 한 세포에 1-3 ㎕의 재조합 플라스미드(pSBCO3)을 첨가하였다.

플라스미드를 첨가한 80 ㎕의 세포 및 플라스미드의 혼합물을 전기천공법 (electroporation)용 큐벳(BIO-RAD, Gene pulser cuvette)에 담아 BIO-RAD, Gene pulser Xcell로 전기 충격(1800 v, 25 ㎌, 200 Ω)을 가하였다. 미리 준비해둔 1 ㎖ LB(10 g/L 트립톤, 10 g/L NaCl 및 5 g/L 효모 추출물)를 첨가한 뒤 1시간 동안 200 rpm, 37℃에서 진탕 배양하였다. 배양된 형질전환체는 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 카나마이신(50 ㎍/㎖)이 첨가된 LB 아가배지(10 g/L 트리톤, 10 g/L NaCl, 5 g/L 효모 추출물 및 아가 20 g/L)에서 단일 균체가 생성될 때까지 37℃에서 배양하였다. 이를 통해 재조합 플라스미드인 pSBCO3을 E. coli DH5α 균주에 형질 전환한 E. coli SGJSBCO03 재조합 균주를 개발하였다(표 3).

개발균주	-
E. coli SGJSBCO03	K. pneumoniae KTCT2242::pUC18K::CObudC

실시예 4: 재조합 대장균에서 코돈 최적화된 아세토인 환원효소( codon optimized acetoin reductase, CObudC ) 단백질 생산

E. coli SGJSBCO03 재조합 균주는 LB(암피실린 50 ㎍/㎖ 및 카나마이신 50 ㎍/㎖ 포함) 배지에 16시간 정도 전 배양 시키고 그 배양액을 다시 암피실린 50 ㎍/㎖ 및 카나마이신 50 ㎍/㎖이 포함된 LB 배지에 접종하여 흡광도가 600 ㎚에서 0.6-1.0 되었을 때 글리세롤 농도가 25%가 되게 보관용 균액으로 제조한 다음 -80℃에서 배양실험 시까지 저장하였다.

개발된 재조합 균주의 배양은 보관용 균액 30 ㎕을 10 ㎖ 튜브에 들어있는 암피실린 50 ㎍/㎖ 및 카나마이신 50 ㎍/㎖이 첨가된 3 ㎖의 LB에 16시간 동안 배양한 후, 이를 다시 500 ㎖ 플라스크에 들어있는 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 카나마이신(50 ㎍/㎖)이 첨가된 200 ㎖의 LB (10 g/L 트립톤, 10 g/L NaCl 및 5 g/L 효모추출물) 배지에 아세토인을 15 mM을 넣고 0.5%의 전기 배양액을 접종하여 37℃, 170 rpm 상태에서 54시간 동안 배양하였다. 단백질 발현을 위해 배양액의 흡광도 (absorbance)가 600 ㎚ 파장에서 0.6에 이르렀을 때 유도물질인 IPTG (isopropylthio-β-D-galactoside, sigma, USA)를 첨가(최종농도 0.1 mM/㎖)하여 재조합 단백질의 발현을 유도하였다.

재조합 균주의 배양액 내 meso-2,3-부탄다이올의 농도를 측정하기 위해 배양 중 일정시간마다 채취한 시료를 원심분리(12000 rpm, 10분)후 상등액과 세포를 분리하여 -40℃에서 보관하였다. 상기 배양액로부터 분리된 상등액을 각각 1 ㎖씩 0.2 ㎛ 필터를 이용하여 정제한 후, 표 4의 조건하에서 고속액체크로마토그래피 (HPLC) 정량 분석을 실시하였다.

품 목	조 건
HPLC 모델	(영린기기, Korea) 및 UV730D (영린기기, Korea)
컬럼	Aminex HPX-87H(Biorad, USA)
유속	0.8 mi/min
주입부피	30 ㎕
이동상	0.001 N 황산
오븐 온도	60℃
작동 시간	20분

본 발명에서 개발된 재조합 균주는 아세토인이 첨가된 배지에서 meso-2,3-부탄다이올을 생산하였으며, 이는 코돈 최적화되지 않은 유전자를 넣은 재조합 대장균보다 더 많은 양의 아세토인 환원효소 단백질이 생산 가능함을 보였다.

실시예 5: 재조합 대장균에서 발현된 아세토인 환원효소( acetoin reductase , budC )의 효소 활성 및 전환률 측정

개발된 재조합 균주에서 발현된 아세토인 환원효소의 효소 활성을 측정하기 위하여 배양은 보관용 균액 30 ㎕을 10 ㎖ 튜브에 들어있는 50 ㎍/㎖ 암피실린 및 50 ㎍/㎖ 카나마이신이 첨가된 3 ㎖의 LB에 16시간 동안 배양한 후, 이를 다시 500 ㎖ 플라스크에 들어있는 50 ㎍/㎖ 암피실린 및 50 ㎍/㎖ 카나마이신이 첨가된 200 ㎖의 LB(10 g/L 트립신, 10 g/L NaCl 및 5 g/L 효모추출물) 배지에 0.5%의 전기 배양액을 접종하여 37℃, 170 rpm 상태에서 24시간 동안 배양하였다. 단백질 발현을 위해 배양액의 흡광도(absorbance)가 600 ㎚ 파장에서 0.6에 이르렀을 때 유도물질인 IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside, sigma, USA)를 첨가(최종농도 1 mM/㎖)하여 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. 대장균 야생종의 경우는 항생제가 첨가되지 않은 LB 배지에 위와 동일한 방법으로 배양하였으며 IPTG는 넣어주지 않았다.

효소 활성 측정을 위해 배양액을 4000 rpm에서 10분 동안 원심분리 후 PBS 버퍼로 세척하는 과정을 두 번 반복한 후 5 ㎖ PBS 버퍼에 균액을 부유시켜 3분 동안 음파처리를 통해 세포를 파쇄하였다. 그 후 원심분리하여 상등액 0.7 ㎖에 0.1 ㎖의 1 mM NADH 및 0.1 ㎖의 50 mM 아세토인을 첨가하였다. 이 용액을 60분 동안 반응시킨 후 340 ㎚에서 측정하여 NADH/NAD 전환율을 계산하였다. pH에 따른 효소 활성의 변화를 측정하기 위하여 PBS 버퍼의 pH를 pH 5, pH 6 및 pH 7의 3가지 조건으로 제조하여 첨가해준 후 25℃에서 60분 동안 반응하였다. 온도에 따른 효소 활성의 변화를 측정하기 위하여 pH 7 PBS 버퍼를 사용하여 배양세포를 씻어준 후 25℃, 30℃, 37℃ 및 42℃의 온도로 60분 동안 반응하였다. 이를 통해 온도 및 pH에 따른 아세토인 환원효소의 활성을 측정하였다. 또한 비색정량법을 이용하여 단백질의 양을 측정하고, 단백질 당 효소 활성정도를 산출하였다. 그 결과, 야생종 대장균에서는 아세토인 환원효소가 없기 때문에 NADH의 소모가 없어 효소 활성이 측정되지 않았으며, 코돈 최적화되지 않은 유전자를 넣은 대장균 재조합체에 비하여 코돈 최적화한 재조합체가 4 내지 6 배정도 높은 효소 활성을 나타내었다(표 5 및 표 6). 이는 세포내 아세토인 환원효소의 pH 및 온도에 따른 효소 활성을 의미하며 37℃에서 가장 높은 활성을 나타내었다.

개발된 재조합 균주의 아세토인 환원효소의 세포외의 활성을 측정하기 위하여 위와 동일한 조건의 배지에서 아세토인(15 mM)을 첨가해준 후 pH 5, pH 6 및 pH 7과 온도 25℃, 30℃, 37℃ 및 42℃의 조건에서 각각 24시간 동안 배양한 후 HPLC로 meso-2,3-부탄다이올을 측정하였다. 측정된 부탄다이올의 양을 넣어준 아세토인 양으로 나눠 수율을 g/g의 단위로 계산하였다. 그 결과, 본래의 아세토인 환원효소와 비교하여 약 5 배 증가된 수율을 나타내었다. 특히 본래의 아세토인 환원효소의 효율이 0.1 g/g 이하인 pH 5 및 pH 6 조건에서도 0.8-1.0 g/g 의 수율을 나타내었다. 또한, 본래의 아세토인 환원효소의 효율이 0.2 g/g 이하인 37 ℃ 및 42 ℃ 조건에서도 0.8 g/g 이상의 수율을 나타내었다(도 5 및 도 6). 이는 세포외의 아세토인 환원효소의 활성을 의미하며 pH 6,7에서 높은 활성을 나타내었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Sogang University <120> Methods for Preparing meso-2,3-butanediol <130> PN120027 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 771 <212> DNA <213> CObudC <400> 1 atgaaaaaag tcgcattagt tactggcgcc ggtcaaggga taggtaaagc gatcgcactt 60 cgtctggtga aagatggatt tgccgtggcc attgctgatt ataacgacgc cactgctaag 120 gcggttgcat ctgaaatcaa tcaggccggc ggccgcgcta tggctgtgaa agtggatgtt 180 tctgaccgag accaggtatt tgcagctgtg gaacaggcgc gtaaaacgct gggaggcttt 240 gatgtaattg ttaataacgc tggcgtcgcg ccatcaacac ctattgagtc cattaccccc 300 gaaattgtgg ataaagtcta taatataaat gtcaaaggag ttatctgggg aattcaggca 360 gcggtagaag cctttaaaaa agaaggtcat ggtggtaaaa ttataaatgc atgtagccag 420 gcaggccacg tgggtaaccc tgaattagcg gtttatagca gtagtaaatt cgcggttcgt 480 gggttaaccc agacagcagc gagagatctc gcacctctgg gcattactgt taacggatac 540 tgcccgggga ttgtgaaaac gccgatgtgg gctgaaatcg atcgccaagt atccgaagcg 600 gcaggtaaac cgctgggtta cggtacagct gagttcgcca aacgtataac cttggggcgg 660 ctgtcggagc cggaagatgt tgccgcctgt gtctcatatc ttgctagtcc agattctgat 720 tatatgaccg gtcaatcatt gttaatcgac ggtggtatgg tatttaatta a 771 <210> 2 <211> 256 <212> PRT <213> CObudC <400> 2 Met Lys Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Ala Gly Gln Gly Ile Gly Lys 1 5 10 15 Ala Ile Ala Leu Arg Leu Val Lys Asp Gly Phe Ala Val Ala Ile Ala 20 25 30 Asp Tyr Asn Asp Ala Thr Ala Lys Ala Val Ala Ser Glu Ile Asn Gln 35 40 45 Ala Gly Gly Arg Ala Met Ala Val Lys Val Asp Val Ser Asp Arg Asp 50 55 60 Gln Val Phe Ala Ala Val Glu Gln Ala Arg Lys Thr Leu Gly Gly Phe 65 70 75 80 Asp Val Ile Val Asn Asn Ala Gly Val Ala Pro Ser Thr Pro Ile Glu 85 90 95 Ser Ile Thr Pro Glu Ile Val Asp Lys Val Tyr Asn Ile Asn Val Lys 100 105 110 Gly Val Ile Trp Gly Ile Gln Ala Ala Val Glu Ala Phe Lys Lys Glu 115 120 125 Gly His Gly Gly Lys Ile Ile Asn Ala Cys Ser Gln Ala Gly His Val 130 135 140 Gly Asn Pro Glu Leu Ala Val Tyr Ser Ser Ser Lys Phe Ala Val Arg 145 150 155 160 Gly Leu Thr Gln Thr Ala Ala Arg Asp Leu Ala Pro Leu Gly Ile Thr 165 170 175 Val Asn Gly Tyr Cys Pro Gly Ile Val Lys Thr Pro Met Trp Ala Glu 180 185 190 Ile Asp Arg Gln Val Ser Glu Ala Ala Gly Lys Pro Leu Gly Tyr Gly 195 200 205 Thr Ala Glu Phe Ala Lys Arg Ile Thr Leu Gly Arg Leu Ser Glu Pro 210 215 220 Glu Asp Val Ala Ala Cys Val Ser Tyr Leu Ala Ser Pro Asp Ser Asp 225 230 235 240 Tyr Met Thr Gly Gln Ser Leu Leu Ile Asp Gly Gly Met Val Phe Asn 245 250 255

Claims (7)

1. 다음의 단계를 포함하는 meso-2,3-부탄다이올의 제조방법:
   (a) 크렙시엘라(Klebsiella) 종의 아세토인 환원효소(acetoin reductase) 뉴클레오타이드 서열을 대장균(Escherichia coli)에서의 발현에 적합한 코돈 최적화(codon optimization)하여 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 수득하는 단계;
   (b) 상기 아세토인 환원효소의 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 발현 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계;
   (c) 상기 재조합 벡터를 대장균에 형질전환하여 재조합 대장균을 제조하는 단계; 및
   (d) 상기 재조합 대장균으로부터 meso-2,3-부탄다이올을 제조하는 단계.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 아세토인 환원효소의 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 lac 프로모터에 작동적으로(operatively) 결합된 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 대장균을 형질전환시키는 단계 (c)는 전기천공법으로 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d)는 pH 4 내지 pH 8 조건 및 35℃ 내지 45℃조건에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 코돈 최적화 되지 않은 크렙시엘라종의 아세토인 환원효소 뉴클레오타이드 서열을 이용한 경우와 비교하여 meso-2,3-부탄다이올에 대한 수율이 3-7배 증가된 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 상기 제 1 항 내지 제 5 항의 제조방법에 의해 제조된 meso-2,3-부탄다이올.
   
7. 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 크렙시엘라(Klebsiella) 종의 아세토인 환원효소(acetoin reductase)에 대한 대장균(Escherichia coli)에서의 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열.

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