KR20130088115A - 식물에서 2,4-디클로로페녹시아세트산에 내성을 부여하는 효소에 대한 단일클론 항체 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본원에서는 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제 효소의 존재를 측정 및 정량화하는 데 유용한 단일클론 항체 및 방법을 기술한다.

Description

식물에서 2,4-디클로로페녹시아세트산에 내성을 부여하는 효소에 대한 단일클론 항체 검출 방법{MONOCLONAL ANTIBODIES DETECTION METHODS FOR ENZYMES THAT CONFER RESISTANCE TO 2,4-DICHLOROPHENOXYACETIC ACID IN PLANTS}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2010년 6월 4일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/351,593호의 이점을 주장하며, 이 가출원의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D)은 페녹시산 부류의 제초제에 포함되는 것으로서, 이는 많은 단자엽 작물, 예컨대, 옥수수, 밀, 및 벼에서 원하는 작물 식물은 심각하게 손상시키지 않으면서 활엽 잡초를 선택적으로 방제하는 데 사용되어 왔다. 2,4-D는 정상적인 세포-호르몬 항상성을 탈조절화시키고, 균형잡힌 제어된 성장을 방해하는 작용을 하는 합성 옥신 유도체이지만; 이러한 부류의 제초제의 정확한 작용 모드는 여전히 잘 이해되고 있지 않다. 트리클로피르 및 플루록시피르가 또한 합성 옥신으로서 작용하는 피리딜옥시아세트산 제초제이다.

이러한 제초제는 특정 식물에 대하여 상이한 수준의 선택성을 가진다 (예를 들어, 쌍자엽이 단자엽보다 더 감수성이다). 다양한 수준의 선택성은 다른 식물에 의한 차별적인 기전을 통해 설명될 수 있다. 일반적으로, 식물은 2,4-D를 천천히 대사시키는데, 이로써, 2,4-D에 대한 다양한 반응은 표적 부위에서의 상이한 활성에 의해 설명될 가능성이 있을 수 있다 (문헌 [WSSA, 2002; Herbicide Handbook 8^th edition; Weed Science Society of America; Lawrence, KS pp. 492.]). 전형적으로 식물의 2,4-D 기전은 통상 히드록실화에 이어서 아미노산 또는 글루코스와의 접합으로 이어지는 2 단계 기전을 통해 이루어진다 (문헌 [WSSA, 2002]).

시간이 경과함에 따라, 2,4-D로 인해 장애가 생긴 특정의 미생물 집단은 이러한 생체이물을 분해하여 2,4-D를 완전하게 광화(mineralization)시키는 대체 경로를 개발하였다. 제초제의 연속적인 적용은 성장을 위한 탄소 및 에너지 공급원으로서 상기 제초제를 사용할 수 있는 미생물에게 토양에서의 경쟁적인 이점을 제공하면서, 그 미생물에 대해 선택적이다. 이러한 이유에서, 현재 제제화되어 있는 2,4-D는 상대적으로 짧은 토양 반감기를 가지며, 후속 작물에의 유의적인 이월 효과는 없다.

2,4-D를 분해할 수 있는 그의 능력에 대해 광범위하게 연구된 한 유기체로는 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)가 있다 (문헌 [Streber, et al.; 1987; Analysis, cloning, and high-level expression of 2,4-dichlorophenoxyacetic monooxygenase gene tfdA of Alcaligenes eutrophus JMP134. J. Bacteriol . 169:2950-2955]). 광화 경로 중 초기 단계에서 상기 효소를 코딩하는 유전자는 tfdA이다 (미국 특허 제6,153,401호 및 진뱅크(GENBANK) 수탁 번호 M16730 참조). TfdA 유전자 생성물은 α-케토글루타레이트-의존 디옥시게나제 반응을 통해 2,4-D의 디클로로페놀 (DCP)로의 전환을 촉매화시킨다 (문헌 [Smejkal; et al.; 2001). 클로로페녹시알칸산-분해성 박테리아의 기질 특이성은 식물유전학적으로 관련된 tfdA 유전자 타입에 의존하지 않는다 (문헌 [Biol . Fertil . Sols 33:507-513]). DCP는 2,4-D와 비교하여 제초 활성은 거의 없다. TfdA는 천연적으로 2,4-D에 대하여 감수성인 쌍자엽 식물, 예컨대, 목화 및 담배에서 2,4-D 내성을 부여하기 위해 트랜스제닉 식물에서 사용되어 왔다 (문헌 ([Streber; et al.; 1989). 박테리아 해독 효소를 발현하는 트랜스제닉 담배 식물은 2,4-D에 대해 내성을 갖는다 (문헌 [Bio / Technology 7:811-816], 및 미국 특허 제5,608,147호).

2,4-D를 분해할 수 있는 효소를 코딩하는 다수의 tfdA형 유전자가 토양 박테리아로부터 단리되었고, 그의 서열은 진뱅크 데이터베이스에 기탁되었다. tfdA의 상동체들 (>85%의 아미노산 동일성) 다수가 tfdA와 유사한 효소적인 특성을 가진다. 그러나, tfdA와의 동일성은 유의적으로 더 낮지만 (25-50%), α-케토글루타레이트 디옥시게나제 Fe 디옥시게나제와 관련된 특징적인 잔기는 보유하는 상동체도 다수 존재한다. 그러므로, 이러한 분기성 디옥시게나제의 기질 특이성이 무엇인지에 대해서는 명백하지 않다.

tfdA와의 상동성은 낮은 (31%의 아미노산 동일성) 유일의 일례로는 델프티아 액시도보란스(Delftia acidovorans)로부터 유래된 sdpA가 있다 (문헌 ([Kohler, H.P.E. 1999; Delftia acidovorans MH: a versatile phenoxyalkanoic acid herbicide degrader; J. Ind Microbiol and Biotech. 23:336-340], [Westendorf, et al; 2002. The two enantiospecific dichlorprop/α-ketoglutarate-dioxygenases from Delftia acidovorans MC1-protein and sequence data of Rdpa and SdpA. Microbiol . Res. 157:317-22.])). 이러한 효소는 (S)-디클로르프롭 (및 다른 (S)-페녹시프로피온산) 뿐만 아니라, 2,4-D (페녹시아세트산) 광화에서의 제1 단계를 촉매화시키는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Westendorfet et al.; 2003. Purification and characterization of the enantiospecific dioxygenases from Delftia acidovorans MC1 initiating the degradation of phenoxypropionates and phenoxyacetate herbicides. Acta Biotechnol . 23: 3-17]).

원래 델프티아 액시도보란스로부터 단리된, 상기 효소를 코딩하는 식물 코돈 최적화된 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제 유전자, AAD-12는 제초제 내성 특질로서 사용하기 위한 것으로 WO 2007/053482 (본원에서 참고로 포함된다)에 최초로 기술되었다. 상기 특질은 2,4-D 및 피리딜옥시아세테이트 제초제에 대한 내성을 부여한다. AAD-12 유전자를 보유하는 형질전환된 대두에 관해서는 미국 가특허 출원 번호 제61/263950호 (본원에서 참고로 포함된다)에서 최초로 보고되었다.

종자 생성물을 식재하기 위해 재조합 DNA 특질을 개발하고 시판하는 회사는 엄격한 제품 관린 계획을 공식화하고, 이행하고, 고수하였다. 이러한 관리 계획을 위해서는 특질 이입 및 종자 생산 활성을 추적함과 동시에 상기 특질에 대하여 곡물 수확물을 모니터링하기 위한, 재조합 특질에 대한 입증된 정량적 및 정성적 단백질 검출 방법을 사용하여야 한다. 이러한 검출 방법은 GLP 및 비-GLP 조건하에서 사용하기에 충분할 정도로 용이하고 강건하여야 한다. 또한, 상기 방법은 들판에서는 농부, 사일로에서는 곡물상, 및 국경 지역에서는 세관원이 쉽게 이용할 수 있을 정도로 충분히 사용자 친화적이어야 한다. 그러므로, 강건하고 고품질이며 사용자 친화적인 단백질 검출 방법 및 상업적 키트가 유용하고 필요하다.

당업계에 면역검정법이 주지되어 있지만, 실험실 및 야외 환경, 둘 모두에서 식물 조직 어레이 중 특정 트랜스제닉 생성물을 재현가능한 방식으로 검출할 수 있는 강건하고 고품질인 입증된 ELISA (효소 결합 면역흡착 검정법) 방법은 사소하지도 일반적이지도 않다. AAD-12 트랜스제닉 이벤트를 검출하기 위한 측방 유동 스트립 ELISA의 개발에 대해 특별히 적합화된 항체 쌍을 찾고자 하는 더욱더 많은 도전이 진행되고 있다.

본 발명의 요약

본 발명은 단일클론 항체 (mAb) 패널 및 그를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다. 세포주는 부다페스트 조약(Budapest Treaty) 조건에 따라 아메리칸 타이프 컬쳐 컬랙숀(American Type Culture Collection)에 기탁되었다. 상기 mAb는 놀랍게도 다양한 식물과 식물 조직에서 AAD-12 트랜스제닉 이벤트 유전자 생성물을 검출할 수 있도록 하는 데 잘 적합화된 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 면역글로불린을 사용하는 정량적 및 정성적 면역검정법을 제공한다.

상세한 설명

본 발명은 AAD-12와 반응성인 항체, 상기 mAb를 생산하는 하이브리도마를 포함한다. 하기 표에는 하이브리도마 세포주 지정 번호 및 그의 상응하는 ATCC 기탁 지정 번호가 열거되어 있다.

하이브리도마 / mAb 지정 번호	ATCC 기탁 지정 번호	ATCC 기탁일
539B181.2	PTA-10919	2010년 5월 5일
539B470.2	PTA-10920	2010년 5월 5일
539B498.2	PTA-10921	2010년 5월 5일
539B304.2	PTA-10922	2010년 5월 5일
539B478.2	PTA-10923	2010년 5월 5일

본 발명은 또한 a) 항체 mAb를 표면 상에 고정화시키는 단계; b) 상기 고정화된 항체를 AAD-12 함유 혼합물과 접촉시키는 단계; c) AAD-12에 결합된 상기 고정화된 항체를 상기 혼합물로부터 분리시키는 단계; 및 d) 항체 결합 AAD-12를 상기 고정화된 항체로부터 제거함으로써 AAD-12를 회수하는 단계를 포함하는, AAD-12를 단리시키거나 검출하기 위해 mAb를 사용하는 방법을 포함한다.

본 발명은 또한 a) 청구된 항체를 검정용 표면 상에 고정화시키는 단계; b) 상기 검정용 표면을, AAD-12를 함유할 것으로 의심되는 액체와 접촉시키고, 상기 검정용 표면을 적합한 용액으로 세척하는 단계; c) 상기 검정용 표면을, 리포터 기로 표지된 항-AAD-12 항체와 접촉시키고, 상기 검정용 표면을 적합한 용액으로 세척하는 단계; d) 상기 리포터 기의 존재에 대해 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 중 AAD-12의 존재에 대해 확인하기 위하여 청구된 항체를 사용하는 방법을 포함한다.

본 발명은 추가로 트랜스제닉 식물, 특히, 대두 및 목화 식물에서 발현된 AAD-12 효소를 정량적으로 측정하기 위한 분석 방법을 포함한다. PBS (포스페이트 완충처리된 염수) 용액을 사용하여 대두 샘플로부터 AAD-12 단백질을 추출한다. 추출물을 원심분리하고; 수성 상청액을 수집하고 희석한다. 분취량의 희석된 샘플을, 샌드위치 ELISA 포맷으로 항-AAD-12 다중클론 또는 단일클론 항체 코팅된 플레이트 웰 중에서 효소-접합된 항-AAD-12 단일클론 항체와 함께 인큐베이션시킨다. 샌드위치 쌍으로 두 항체는 모두 샘플 중 AAD-12 단백질을 포획한다. 인큐베이션 기간 종료 후, PBS로 세척하여 플레이트로부터 비결합 시약을 제거한다. AAD-12의 존재는, 효소 접합체를 효소 기질과 함께 인큐베이션시키고, 발색 생성물을 생성함으로써 검출한다. AAD-12가 항체 샌드위치 중에 결합되어 있기 때문에, 발색 수준은 샘플 중 AAD-12의 농도에 비례한다 (즉, 단백질 농도가 더 낮을수록 발색은 더 낮아진다). 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서의 흡광도 마이너스 참조 파장 (예컨대, 650 nm)에서의 흡광도를 측정한다. 2차 회귀식을 사용하여 7개의 표준 농도로부터 보정 곡선을 추정한다. 이러한 AAD-12 ELISA는 식물 조직 샘플 추출물 중 AAD-12를 정량하는 데 충분할 정도로 특이적이고 감수성이다. 추가로, 본 발명의 항체는 표준 웨스턴 블롯팅 방법을 사용하여 AAD-12의 존재를 확인하는 데에도 사용될 수 있다.

관심의 대상이 되는 단백질에 대한 항체 제조법은 당업계에 주지되어 있다 (문헌 ([Galfre and Milstein, Methods in Enzymology, Vol. 73, Academic Press, New York (1981)]; [James W. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, Orlando, Florida (1986)]; [Current Protocols in Molecular Biolopy, F. M. Ausubel, et al. ed., Wiley Interscience, New York, (1987)]) 참조).

관심의 대상이 되는 단백질과 반응성인 항체를 제조하기 위해서는 먼저 단백질을 농축시키거나, 정제한다. 상대적으로 미가공성인 항원성 단백질 제제가 면역화 목적을 위해 사용될 수 있다. 그러나, 하이브리도마가 수요가 많은 단일클론 항체를 생산하는지 여부를 정확하게 측정하기 위해서 또는 면역 혈청의 항체 역가를 검정하기 위해서는 고도로 정제된 단백질이 필요하다.

일단 AAD-12를 단리시키고 나면, 당업계에 주지되어 있는 종래 방법에 의해 AAD-12에 대한 특이적인 항체를 생성할 수 있다. 수주 또는 수개월이라는 기간에 걸쳐 선택된 숙주 내로 반복하여 주사하면 면역 반응은 유도될 것이고, 그 결과 유의적인 항-AAD-12 혈청 역가를 얻게 될 것이다. 바람직한 숙주는 포유동물 종이고, 더욱 고도로 바람직한 종은 토끼, 염소, 양, 및 마우스이다. 확립된 방법에 의해 상기의 면역화된 동물로부터 채혈된 혈액을 프로세싱하여 AAD-12와 반응성인 항혈청 (다중클론 항체)을 수득할 수 있다. 이어서, 당업계에 공지된 기법에 따라 AAD-12에의 흡착에 의해 항혈청을 친화성 정제시킬 수 있다. 당업계에 공지된 방법을 사용하여 항혈청내 면역글로불린 분획을 단리시킴으로써 친화성 정제된 항혈청을 추가로 정제시킬 수 있다. 생성된 물질은 AAD-12와 반응성인 이종성 면역글로불린 집단일 것이다.

정제된 AAD-12를 사용하여 항-AAD-12 mAb를 쉽게 제조할 수 있다. mAb를 제조하는 방법은 수십년 동안 실시되어 왔고, 이는 당업계의 숙련가에는 주지되어 있다. 애주번트 중의 AAD-12를 복강내로 또는 피하로 반복 주사하면 대부분의 동물, 특히 마우스에서 면역 반응이 유도될 것이다. 과면역화된 B-림프구를 동물로부터 제거하고, 무한대로 배양될 수 있는 적합한 융합 파트너 세포주와 융합시킨다. 다수의 포유동물 세포주가 하이브리도마 생산에 적합한 융합 파트너이다. 상기와 같은 세포주 다수는 ATCC 및 상업적 공급업체로부터 상업적으로 이용가능하다.

일단 융합시키고 나면, 생성된 하이브리도마를 1 내지 2주 동안 선별 성장 배지 중에서 배양한다. 융합되지 않은 골수종 세포 또는 골수종 세포 간의 융합물을 제거하는 데에는 주지된 두 선별 시스템이 이용될 수 있다. 선별 시스템의 선택은 면역화된 마우스 계통, 및 사용된 골수종 융합 파트너에 따라 달라진다. 문헌 [Taggart and Samloff, Science 219, 1228 (1982)]에 기술되어 있는 AAT 선별 시스템이 사용될 수 있지만; 문헌 [Littlefield, Science 145. 709 (1964)]에 기술되어 있는 HAT (히포크산틴, 아미노프테린, 티미딘) 선별 시스템은 마우스 세포 및 상기 언급된 융합 파트너와의 그의 화합성 때문에 바람직하다.

이어서, 면역특이 mab 분비에 대해 소모 성장 배지를 스크리닝한다. 다량의 스크리닝을 위한 것으로 적합화된 방사성 면역 검정법 또한 허용되지만, 상기 목적을 위해서는 효소 연결된 면역흡착 검정법이 가장 적합하다. 소수의, 본 발명의 mAb를 단리시키기 위해서는 상당수의 무관한 배양물, 또는 덜 원하는 배양물을 연속하여 서서히 감소시킬 수 있도록 디자인된 다중 스크린이 수행되어야 한다. 상업적으로 이용가능한 검정법을 이용하여 AAD-12와 반응성인 mAb를 분비하는 배양물을 이소형 판별(isotyping)하였다.

단일클론성 및 안정성을 확립하기 위해서는 수요가 많은 AAD-12 mAb를 분비하는 하이브리도마 배양물을 수회에 걸쳐 서브클로닝시켜야 한다. 비부착성 진핵 세포 배양물을 서브클로닝시키는 주지된 방법으로는 제한 희석법, 연질 아가로스 및 형광 활성화된 세포 분류 기법을 포함한다. 매회의 서브클로닝 후, 생성된 배양물을 항체 분비 및 이소형에 대하여 재검정하여 안정한 항체 분비 배양물이 확립되었는지를 확인하여야 한다.

항체 결합부 중 일부가 노출된 상태로 유지되어 AAD-12에 결합할 수 있도록 청구하는 항-AAD-12 항체를 표면에 고정화시킬 수 있다. 항체를 고정화시키는 폭넓은 방식은 지난 수십년 간에 걸쳐 개발되었다. 항체를 원하는 표면에 직접 공유적으로 커플링시키거나, 항체를 표면에 가교시킴으로써 고정화를 달성할 수 있다.

항체의 다당류 기반 비드, 예컨대, 세파로스(Sepharose)® (파마시아(Pharmacia: 미국 뉴저지주 피스카타웨이)에의 CNBr 및 카르보디이미드 커플링이 본 발명과 일치하는 직접 커플링 방식의 일례이다. 직접 커플링은 일반적으로 항체를 어느 특정 방식으로 지향시키지는 않는다; 그러나, 직접 커플링 중 일부 유형은 항체를 고정화 물질 상에 재현가능하게 지향시킬 수 있다.

바람직한 커플링 방식은 항체를 지향시켜 그의 항원 결합 영역이 노출 상태로 유지되게 한다. 그러한 한 방식은 항체의 중쇄에서 발견되는 천연 탄수화물을 이용한다. 먼저 탄수화물 모이어티를 상응하는 알데히드로 산화시킨 후, 상기 알데히드를 표면 상의 1차 아미노기와 반응시킴으로써 항체를 이로운 배향으로 연결시킬 수 있다.

많은 유형의 가교가 가능하며, 항체를 고정화 물질에 공유적으로 결합시키는 소형의 유기 링커를 포함한다. 그러한 스페이서 아암이 허용되며, 바람직하게는 일단 가교가 형성되고 나면, 단백질과 상호작용하지 않아야 한다.

상기 논의 내용은 결코 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다. 항체를 고정화 물질에 연결시키는 다수의 다른 주지 방식이 본 발명과 일치한다.

리포터 기로 표지된 항체를 사용하여 다양한 환경하에서의 항원의 존재를 확인할 수 있다는 것은 주지되어 있다. 매우 정밀하게 고감도로 다양한 생물학적 유체 중 항원의 존재를 확인하는 방사성 면역 검정법에서는 방사성 동위 원소로 표지된 항체가 수십년간 사용되어 왔다. 더욱 최근에는, 인기있는 ELISA에서의 방사성 표지된 항체에 대한 대체물로서 효소로 표지된 항체가 사용되었다.

본 발명의 항체를 고정화 물질, 예컨대, 폴리스티렌 웰 또는 입자에 결합시킬 수 있고, 면역검정법에서 사용하여 AAD-12가 시험 샘플 중에 존재하는지 여부를 측정할 수 있다. 상기와 같은 본 발명의 실시양태에서, 샘플을 면역친화성 표면에 접촉시키고, 인큐베이션시킬 수 있다. 세척 단계 후, 리포터 기로 표지된 본 발명의 또 다른 항체와 표면을 접촉시켜 면역친화성 표면에 결합된 임의의 AAD-12를 검출한다.

청구되는 항체 및 검정 방법과 함께 측방 유동 스트립 또는 면역 크로마토그래피를 사용하는 것은 본 발명과 일치한다. 측방 유동 검정법은 당업계에 주지되어 있다 (예를 들어, US 6,485,982 참조). 이러한 모드에서, AAD-12를 단독으로 또는 다른 피분석물과 함께 동시에 정성적 또는 반-정량적으로 검출하기 위해 측방 유동 검정을 사용할 수 있다. 측방 유동 검정은 본원에 기술된 모든 검정 포맷 중 가장 간단하며, 이는 식물 물질이 빠르게 용액으로 추출되고, 측방 유동 스트립 상에서 검정되는 야외 환경에서 특히 유용하다. 이러한 모드에서는 측방 유동 스트립을 액상 샘플 내에 넣거나, 또는 액상 샘플을 측방 유동 스트립에 적용시키고, 기설정된 시간이 경과한 후, 결과를 판독하는 것만이 필요하다. 모든 측방 유동 검정은 검정 결과를 입증하는 데 사용되는 절차상 대조선 또는 샘플 대조선을 도입하여야 한다. 그러므로, 두 대조선의 출현이 양성 결과를 나타내는 반면, 유효한 음성 검정은 오직 대조선만을 생성한다. 오직 검정선만이 출현할 경우, 또는 어떤 대조선도 출현하지 않을 경우, 이는 무효인 것이다.

전형적인 측방 유동 검정 스트립은 4가지 주성분: 시험 샘플이 적용되는 샘플 패드, 발색 입자 (전형적으로 콜로이드성 금 입자, 또는 라텍스 미소구)에 접합된 본 발명의 항체를 함유하는 접합체 패드; 포획 영역 또는 검정선으로서 본 발명의 상이한 항체가 막 위에 막 전역에 걸쳐서 한 줄로 고정화되어 있는 것인 반응막, 예컨대, 소수성 니트로셀룰로스 또는 셀룰로스 아세테이트 막; 및 모세관 작용에 의해서 반응막 전역의 샘플을 인출하도록 디자인된 폐기물 저장소로 구성된다.

측방 유동 스트립의 성분은 일반적으로 불활성 배면재에 고정되고, 이는 단순한 딥스틱 포맷으로, 또는 포획 및 대조군 영역을 보여주는 반응 윈도우 및 샘플 포트를 포함하는 플라스틱 케이싱 내에 제시될 수 있다. 검정 실시양태의 또 다른 모드에서, AAD-12를 함유하는 것으로 의심되는 시험 샘플을 표면 상에서 건조시켜 고정화된 시험 샘플을 형성한다. 이어서, 본 발명의 표지된 항체를 고정화된 시험 샘플과 접촉시키고, 인큐베이션시킬 수 있다. 샘플이 AAD-12를 함유할 경우, 표지된 항체는 고정화된 AAD-12에 결합할 것이다. 본 방법은 또한 이미 AAD-12에 결합된 본 발명의 항체에 결합하는 표지된 제2 항체가 후속하여 따르는 비표지된 본 발명의 항체를 사용하여 수행될 수 있다. 세척 후, 고정화된 시험 샘플을 측정하여 임의의 리포터 기의 존재를 검출한다.

리포터 기는 전형적으로 효소, 예컨대, 알칼리성 포스파타제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 베타-D-갈락토시다제이다. 적합한 기질은 효소와 반응하였을 때 변색된다. 상기 수행시, 색상 강도의 크기는 분광광도계를 사용하여 정량화할 수 있다. 리포터 기가 방사성 동위 원소일 경우, 적절한 감마 또는 베타 선을 검출하는 기기를 사용하여 리포터 기를 정량화할 수 있다. 리포터 기의 강도는 시험 샘플 중 AAD-12의 양과 정비례한다.

하기 실시예는 본 발명이 수행되는 방법을 기술하는 데 도움이 될 것이며, 청구되는 항-AAD-12 항체 및 검정법의 특징을 예시할 것이다.

실시예 1

면역원 제조

안정화제가 첨가된 PBST (0.05% 트윈(Tween) 20을 포함하는 포스페이트 완충처리된 염수 (pH 7.4)) 기반 완충액 중에서 트랜스제닉 대두로부터 제거된 동결건조된 잎 조직으로부터 AAD-12 단백질을 추출하고, 원심분리 후 상청액 중 가용성 단백질을 수집하였다. 상청액을 여과하고, 가용성 단백질을 페닐 세파로스(Phenyl Sepharose)™ (PS) 비드 (GE 헬쓰케어(GE Healthcare))에 결합할 수 있도록 하였다. 1시간 동안 인큐베이션을 수행한 후, PS 비드를 PBST로 세척하고, 결합된 단백질은 밀리-Q(Milli-Q)™ 워터로 용리시켰다. 염화나트륨을 첨가하여 전도성을 증가시키고, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)에서 생산된 재조합 AAD-12에 대한 AAD-12 특이 다중클론 항체와 접합된 항-AAD-12 면역친화성 칼럼 상에 PS 정제된 단백질을 로딩하였다. 비결합 단백질을 칼럼으로부터 수집하고, 칼럼을 예냉된 PBS (포스페이트 완충처리된 염수 (pH 7.4))로 철저하게 세척하였다. 3.5 M NaSCN, 50 mM 트리스(Tris)™ (pH 8.0) 완충액을 사용하여 결합된 단백질을 칼럼으로부터 용리시켰다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의해 미생물 유래의 AAD-12 및 대두 유래의 AAD-12를 조사하였다.

미생물 유래의 AAD-12에서, 쿠마시(Coomassie) 염색된 SDS-PAGE 겔 상에서 시각화된, 주요 단백질 밴드는 대략 32 kDa이었다. 예상대로, 상응하는 식물 유래의 AAD-12 단백질의 크기는 미생물 유래의 단백질과 동일하였다. 예측대로, 식물 정제된 분획은 AAD-12 단백질 이외에도 소량의 비-면역반응성 불순물도 함유하였다. 칼럼 매트릭스와의 약한 상호작용에 의해 공-정제된 단백질이 칼럼 상에 유지되어 있을 수 있는 개연성도 있었다.

미생물 유래의 AAD-12 및 식물 유래의 추출물은 항-AAD-12 다중클론 항체를 사용하였을 때 웨스턴 블롯 상에서 예상된 크기의 양성 신호를 나타내었다. AAD-12 웨스턴 블롯 분석에서, 음성 대조군 (천연 대두) 추출물에서는 어떤 면역반응성 단백질도 관찰되지 않았고, 트랜스제닉 식물로부터의 샘플에서는 어떤 대체 크기의 단백질 (응집체 또는 분해 생성물)도 관찰되지 않았다.

실시예 2

하이브리도마 제조

마우스를 정제된 AAD-12로 면역화시키고, 표준 융합 기법을 사용하여 항-AAD-12 단일클론 항체를 발현하는 하이브리도마 패널을 제조하였다. 폐 조직 배양물 배지의 샘플을 하이브리도마 배양물을 함유하는 각 웰로부터 무균적으로 제거하고, 하기 항체 포획 ELISA 방법을 사용하여 AAD-12 반응성에 대해 검정하였다. 1-10 ㎍/mL의 정제된 AAD-12 용액으로 마이크로타이터 웰을 코팅하였다. 웰을 세척하고, 폐 조직 배지의 샘플을 웰에 넣고, 인큐베이션시켰다. 웰을 세척하고, 호스래디쉬 퍼옥시다제-표지된 염소 항-마우스 항혈청을 첨가하고, 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척하고, 기질을 첨가하여 발색 반응이 일어나도록 하고, OD (광학 밀도)에 대해 플레이트를 판독하였다. OD 판독값이 높은 웰을 하이브리도마를 함유하는 배양물 웰로 역 맵핑하였다. 계속해서 AAD-12 항체 양성 배양물을 항체 생산에 대해 스크리닝함으로써 배양물 확장에 따른 성장 안정성 및 항체 생산을 확인하였다. 수회에 걸쳐 제한 희석 클로닝을 수행함으로써 각 배양물에 대한 참(true) 단일클론성을 확립하였다. 항체 양성 클론에 대한 추가의 검정법을 수행하여 본 발명에서 청구되는, 식물 물질을 사용하는 야외용의 정량적 검출 방법에서 사용하기 위한 각 항체의 적합성을 측정하였다.

실시예 3

정량적 ELISA

본 실시예는 청구되는 본 발명의 항체 및 방법을 사용하여 대두 조직 중의 AAD-12를 정량적으로 측정하는 방법에 관한 것이다. 보정 표준 곡선의 정량 범위는 완충액 중 0.25 ng/mL 내지 10 ng/mL였다. 1.0 ng/mg의 정량 한계 (LOQ) 및 0.5 ng/mg의 검출 한계 (LOD)를 사용하여 대두 종자, 잎 (V5 및 V10), 뿌리, 및 R3 단계의 목초 중 AAD-12 단백질 수준을 측정할 수 있었다.

시험 물질은 AAD-12 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형된 대표적인 대두 조직 샘플, 및 매버릭(Maverick) 변종의 비-트랜스제닉 대조군 대두였다. 하기 열거된 조직을 온실로부터 수집하였다.

비-트랜스제닉 대두 샘플 목록
샘플군 번호	조직	샘플 설명
081008-001-0001	목초 (전체 식물; 잎 및 줄기; R3)	비-트랜스제닉 대조군
081008-004-0001	뿌리 (R3)	비-트랜스제닉 대조군
081008-009-0001	종자	비-트랜스제닉 대조군
081008-010-0001	잎 (V5)	비-트랜스제닉 대조군
081008-011-0001	잎 (V10)	비-트랜스제닉 대조군

트랜스제닉 대두 샘플 목록
샘플군 번호	조직	설명
081008-003-0001	목초 (전체 식물; 잎 및 줄기; R3)	AAD-12
081008-006-0001	뿌리	AAD-12
081008-007-0001	잎 (R7)	AAD-12
081008-012-0001	종자	AAD-12
081008-013-0001	잎 (V5)	AAD-12
081008-014-0001	잎 (V10)

본 연구에서 사용된 하기의 참조 물질은 ELISA 분석에서 보정 표준으로서 및 강화 물질로서 사용된 정제된 AAD-12 단백질, 정제된 AAD-12 단백질, 및 교차 반응성을 시험하는 데 사용된 정제된 AAD-12 단백질이었다.

시험 물질 및 참조 물질 모두 온도가 모니터링되는 냉동기에 보관하고, 샘플 제조 및 분석을 위해서만 제거하였다. 간략하면, 0.75% 오브알부민 (OVA)을 포함하는 PBST (0.05% 트윈™ 20을 함유하는 포스페이트 완충처리된 염수 용액) 완충액 (PBST/OVA)으로 대두 샘플 (V5, V10, 목초, 및 뿌리)로부터 AAD-12 단백질을 추출하였다. 0.05% 트윈™ 20을 함유하는 PBS 용액 (PBST) 및 0.1% 트리톤™ X-100으로 대두 종자로부터 AAD-12 단백질을 추출하였다. 추출물을 원심분리하고, 수성 상청액을 수집하고, 희석하고 특이 AAD-12 ELISA를 사용하여 검정하였다. 분취량의 희석된 샘플을 샌드위치 ELISA 포맷으로 항-AAD-12 다중클론 항체 코팅된 플레이트의 웰 중에서 효소-접합된 항-AAD-12 단일클론 539B470.2 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 샌드위치 쌍으로 두 항체는 모두 샘플 중 AAD-12 단백질을 포획하였다. 인큐베이션 기간 종료시, PBST로 세척하여 플레이트로부터 비결합 시약을 제거하였다. AAD-12의 존재는, 항체 결합 효소 접합체를 효소 기질과 함께 인큐베이션시켜 발색 생성물을 생성함으로써 검출하였다. AAD-12가 항체 샌드위치로 결합되어 있기 때문에, 발색 수준은 샘플 중 AAD-12의 농도에 비례하였다 (즉, 단백질 농도가 더 낮을수록 발색은 더 낮아진다). 산성 용액을 첨가하여 발색 반응을 중단시키고, 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서의 흡광도 마이너스 650 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 결정 계수가 >0.990인 2차 회귀식을 사용하여 7개의 표준 농도로부터 보정 곡선을 추정하였다. 상기 AAD-12 ELISA는 AAD-12 단백질의 정량에 대해 고도로 특이적이었다.

실시예 4

검정 결과 검증

본 방법에 대한 예비의 정량 범위는 방법 개발 및 사전 검증 연구 동안 독립적으로 확립되었다. 표준 농도는 주어진 농도점에 대한 최저 평균 오차율(%)을 제공하였다. 각 조직에서 AAD-12 측정에 대한 검출 한계 (LOD) 및 정량 한계 (LOQ)는 표준 곡선을 구성하는 검정 파라미터 (흡광도, 배경, 및 선형 범위), 매트릭스 간섭 및 용량에 기초하여 실험적으로 정의되었다. 이는 또한 키스(Keith) 등의 방법 (문헌 [Keith, L. H., Crummett, W., Deegan, J., Jr., Libby, R. A., Taylor, J. K., Wentler, G. 1983. Principles of Environmental Analysis, Anal . Chem., 55, 2210-2218])에 따른 통계학적 접근법에 의해, 및 5 ng/mL (0.5 ng/mg)의 AAD-12 단백질로 강화된 각 대조군 샘플의 시험에 의해 뒷받침되었다.

본 연구에서는 상기 AAD-12 ELISA의 비-표적 단백질 Cry1F, Cry1Ac, Cry34Ab1, Cry35Ab1, PAT 및 AAD-1과의 교차 반응성을 시험하였다. 상기 단백질을 PBST/OVA 중에서 1 ㎍/mL 및 10 ㎍/mL의 농도로 제조하였다. 같은 플레이트 상에서, AAD-12 표준 곡선을 참조로서 작성하였다. 비-표적 단백질에 대한 OD 반응을 AAD-12 표준 곡선으로부터 내삽하고, 교차 반응율(%)은 하기 공식을 사용하여 계산하였다: 교차 반응율(%) = 100 x (AAD-12 표준 곡선에 의해 측정된 농도/표적 단백질의 이론상의 농도).

음성 대조군인 각 대두 조직에 대한 샘플 추출물 (매트릭스) (1X, 5X 및 10X 희석액)을 상이한 농도로 혼합하여 표준 곡선을 작성하였다. 같은 플레이트에서 진행된 비-혼합형 표준 곡선으로부터 매트릭스 혼합형 표준 곡선을 내삽하였다. 각 표준 농도 수준에 대한 관측치의 평균 (매트릭스 혼합형 표준 농도를 내삽하는 데 사용된 비-혼합형 표준 곡선)와 이론치의 평균 (매트릭스 혼합형 표준 곡선의 농도) 사이의 차이가 15%를 초과한다면, 이는 매트릭스 효과가 잠재적으로 있다는 것을 나타내는 것으로 간주되었다.

AAD-12를 발현하는 것으로 알려진 트랜스제닉 대두 조직에 대하여 일련으로 5회에 걸쳐 추출을 수행하였다. 간략하면, 1.5 mL의 완충액을 조직 샘플 (15 mg)에 첨가하고, 상기 기술된 바와 같이 추출하였다. 추출 및 원심분리 후, 피펫팅에 의해 추출된 용액을 제거하였다. 1차 추출 후, 200 ㎕ 분취량의 완충액을 첨가하고 샘플과 혼합하고, 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 1차 추출 용액에 첨가하였다. 또 다른 1.5 mL의 완충액을 조직에 첨가하고, 추출 과정을 반복하였다. 상기 과정을 3회 더 반복하여 5개의 일련의 추출물을 수득하였다. AAD-12 ELISA를 사용하여 각 추출시의 AAD-12의 농도를 측정하였다. 각 조직 샘플에 대하여 5회 이상의 반복 연구를 수행하였다. 5개의 추출물 모두에서의 총 AAD-12 단백질에 대해 1차 추출물 중의 AAD-12 단백질을 비교함으로써 조직 추출 공정의 겉보기 효율을 측정하였다.

낮은 수준 (0.5 ng/mg DW), 중간점 수준 (1, 및 4 ng/mg DW) 및 높은 수준 (8 ng/mg DW)의 AAD-12 단백질과 혼합된 음성 대조군 매트릭스로부터의 AAD-12 단백질의 회수율을 측정함으로써 본 방법의 정확도를 측정하였다. 각 농도에 대해 최소 5회에 걸쳐 반복하여 분석하였다. 검정법의 정확도는 회수율(%)로서 나타내었다. 회수율이 67-120% 사이라면, 이는 허용되는 것으로 간주되었다.

여러 날 동안 2명의 분석가에 의해 분석된, 강화된 대두 대조군 샘플의 결과를 사용하여 방법의 정밀도를 측정하였다. 3가지 수준의 AAD-12 표준 (0.25 ng/mg, 0.5 ng/mg, 4 ng/mg 및 8 ng/mg)을 이용하여 대조군 샘플 추출물을 강화시켰다. 각 ELISA 플레이트 상에서 각 수준의 강화된 추출물에 대해 3회에 걸쳐 반복 수행하였다. 각 샘플에 대해 평균 회수 농도, 표준 편차 (stdev), 및 변동 계수(%) (%CV)를 계산하였다.

양성 샘플 (V5 잎 및 목초 (전체 식물))에 대해서도 또한 정밀도에 대해 시험하였다. 각 샘플에 대한 평균 농도 예측치, 표준 편차 (stdev), 및 변동 계수 (%) (%CV)를 계산하였다. 일간의 및 다른 일간의 정밀도를 계산하였다.

본 실험의 목적은 식물 추출물 중 AAD-12 단백질 표준 및 AAD-12 단백질이 ELISA에서 전반적으로 유사한 반응을 보였음을 검증하는 것이었다. 이는 표준 곡선의 정량 범위로부터 내삽된 단일 추출물의 희석액으로부터 얻은 결과의 일치도를 평가함으로써 모든 트랜스제닉 조직에 대해 수행하였다. 정량가능한 희석액 모두로부터의 내삽된 결과에 대한 각 조직 유형의 변동 계수를 계산하였다.

위-양성 및 위-음성 발생에 대해서 종자, 잎, 목초 (전체 식물) 및 뿌리 조직을 테스트하였다. 비강화된 대조군 샘플 15개, 및 0.25 ng/mg으로 강화된 샘플 15개를 각 조직에 대해 분석하여 위-양성률 및 위-음성률을 측정하였다. 위-양성인 결과는, 피분석물을 함유하지 않는 것으로 알려져 있는 샘플 중 확립된 LOD에서 또는 그 초과에서 잔류물이 발견되었을 때에 발생한다. 위-음성은 강화된 샘플 중 LOD에서 어떤 잔류물도 검출되지 않을 때에 발생한다.

SOFT맥스 PRO(SOFTmax PRO) 소프트웨어 프로그램을 사용하여 몰레큘러 다이내믹스 마이크로플레이트 리더(Molecular Dynamics Microplate Reader)로부터 ELISA 판독값을 기록하였다. 평균, 오차율(%), 통계적 평균, 표준 편차 및 %CV를 계산하기 위해 농도 데이터를 SAS, JMP 또는 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel)로 전송하였다.

면역검정법의 검출 한계 (LOD)는 피분석물 샘플이 0인 반응과 통계학상 유의적인 차이를 가져오는 반응을 일으키는 피분석물 농도로서 정의된다. 검정법의 정량 한계 (LOQ), 또는 작동 범위는 일반적으로는 허용되는 정밀도로 측정될 수 있는 최고 농도 및 최저 농도로서 정의된다. 본 연구에서, 각 조직 중의 AAD-12 측정을 위한 표적화된 LOD 및 LOQ는 검정 파라미터 (예컨대, 흡광도, 배경, 신호대잡음비 및 선형 범위), 매트릭스 간섭 및 표준 곡선 농도에 기초하여 실험적으로 정의되었다. LOD 및 LOQ는 또한 표준 통계학적 접근법에 의해서 결정되었다. 확립된 가이드라인에 따라, 0.5 ng/mg 회수 결과로부터의 표준 편차를 사용하여 LOD 및 LOQ를 계산하였다. 각 매트릭스당 최소 5개의 샘플을 분석함으로써 얻은 결과에 대한 표준 편차의 10배 (10s)되는 값으로서 LOQ를 계산하였고, 상기 표준 편차의 3배 (3s)되는 값으로서 LOD를 계산하였다. 각 조직에 대한 계산 결과와 표적 LOD 및 LOQ는 하기 표에 요약되어 있다.

모든 대두 매트릭스에 대한 표적 LOD는 0.5 ng/mg이었다. 모든 대두 매트릭스에 대한 표적 LOQ는 1.0 ng/mg이었다.

수개의 관련 단백질, 예컨대, Cry1F, Cry1Ac, Cry34Ab1, Cry35Ab1, PAT, 및 AAD-1을 교차 반응성에 대하여 시험하였다. 이들 단백질에 대해 시험된 농도 (10,000 ng/mL)에서는 어떤 교차 반응성도 관찰되지 않았다.

매트릭스 검정 결과는 하기 표에 요약되어 있다.

"예"라는 것은 7개의 표준 농도 수준 모두에 대한 관측치와 이론치 사이의 평균 오차율(%)이 15%를 초과할 때, 표준 곡선이 매트릭스에 의해 영향을 받았음을 나타내는 것이었다. "아니오"라는 것은 매트릭스 효과가 없거나, 또는 7개의 표준 농도 수준 모두에 대한 관측치와 이론치 사이의 평균 오차율(%)이 15% 미만인 것을 나타내는 것이었다.

7개의 표준 농도 수준 중 임의의 것에 대한 관측치 평균과 이론치 평균 사이의 차이가 15%를 초과한다면, 이는 매트릭스 효과가 있다는 것을 나타내는 것으로 간주되었다. 뿌리에서는 1X 혼합형 매트릭스 수준에서 어떤 매트릭스 효과도 관찰되지 않았다. V5 잎, V10 잎, 목초 (전체 식물)의 경우, 5X 혼합형 매트릭스 수준에서 어떤 매트릭스 효과도 발견되지 않았다. 그러나, 종자에서는 5X 수준에서 매트릭스 효과가 있는 것으로 밝혀졌다. 대두 조직에서 AAD-12를 정량화하기 위해서는, 뿌리의 경우에는 적어도 2X 희석률이 권고되고; V5 잎, V10 잎 및 목초의 경우에는 적어도 5X 희석률이 권고되며; 종자의 경우에는 적어도 10X 희석률이 권고되었다.

추출 효율을 조사하는 데에는 샘플 중 AAD-12 단백질의 전체 수준을 측정하는 것이 중요하다. 추출 완충액을 사용하여 5회 연속하여 양성 샘플을 추출하고, ELISA에 의해 각 추출물 중 AAD-12 단백질 단백질을 측정하였다. 겉보기 추출 효율은 5개의 추출물 모두에서의 AAD-12의 총량에 대해 상대적인, 1차 추출물 중의 AAD-12 단백질의 양에 기초하였다. 대두 조직으로부터의 AAD-12 단백질의 추출 효율은 하기 표에 제시되어 있다.

목초 (전체 식물), 뿌리, 종자, V5 잎 및 V10 잎에 대한 추출 효율의 범위는 85.8-97.2%였다.

표준 곡선의 LOQ, 중간점, 및 고 지점과 동일한 수준으로 강화되었을 때의, 모든 조직으로부터의 AAD-12의 평균 회수율 수준이 하기 표에 제시되어 있다.

LOQ 수준으로 또는 그를 초과하는 수준으로 혼합되었을 때, V5 잎, V10 잎 및 종자는 평균 회수율에 대한 67-120% 사양 내에서 67-100%였고, 변동 계수(%) (%CV)는 16%이하였다.

4개의 수준으로 AAD-12 단백질을 함유하는 V5 잎 및 목초 (전체 식물) 추출물을 사용하여 검정의 정밀도 및 견고성을 조사하였다. 수준은 8 ng/mg, 4 ng/mg, 0.5 ng/mg 및 0.25 ng/mg이었다. 8, 4, 0.05 및 0.25 ng/mg으로 강화된 V5 잎 추출물의 경우, 하루 동안의 검정의 정밀도는 각각 6.3%, 10.8%, 9.6% 및 15.0% 이하였다. 8, 4, 0.5 및 0.25 ng/mg으로 강화된 목초 (전체 식물) 추출물의 경우, 하루 동안의 검정의 정밀도는 각각 3.5%, 13.1%, 10.1% 및 10.9% 이하였다. 또한, 양성 V5 잎 및 목초 샘플을 검정의 견고성에 대하여 시험하였다. V5 잎 및 전체 식물의 경우, 하루 동안의 검정의 정밀도는 각각 9.7% 및 19.7% 이하였다.

8, 4, 0.5 및 0.25 ng/mg으로 강화된 V5 잎 추출물의 경우, 분석자들간에 및 다른 모든 날과의 비교로 나타나는 하루 동안의 검정의 정밀도는 각각 4.6%, 10.1%, 6.4% 및 12.9%였다. 8, 4, 0.5 및 0.25 ng/mg으로 강화된 목초 추출물의 경우, 분석자들간에 및 다른 모든 날과의 비교로 나타나는 하루 동안의 검정의 정밀도는 각각 6.0%, 10.5 %, 6.4% 및 10.1%였다. 양성 V5 잎 및 목초의 경우, 분석자들간에 및 다른 모든 날과의 비교로 나타나는 하루 동안의 검정의 정밀도는 각각 11.3% 및 14.1%였다.

AAD-12 양성 조직으로부터의 추출물을 최대 8회까지 일련으로 희석시킴으로써 AAD-12 ELISA에서의 표준 및 시험 물질 반응의 등가성을 입증하였다. 각 조직 추출물에 대한 5개 이상의 희석액은 표준 곡선의 정량 범위 내에 포함되어 있었고, 정량화된 결과의 %CV는 20% 미만이었다.

비강화된 대조군 샘플 (매트릭스 블랭크) 및 0.25 ng/mg로 강화된 샘플 (LOD=0.5 ng/mg)을 분석하여 위-양성률 및 위-음성률을 분석하였다. 비강화된 대조군 샘플로부터의 위-양성은 발생하지 않았고, 본 연구에서 분석된 LOD 강화된 샘플로부터 어떤 위-음성도 보고되지 않았다.

요약하면, 1.0 내지 8.0 ng/mg 건식 중량 (DW)의 농도 범위에 걸쳐 본 방법을 검증하였고, 모든 대두 조직의 입증된 정량 한계 (LOQ)는 1.0 ng/mg DW이고, 모든 대두 조직의 검출 한계 (LOD)는 0.5 ng/mg DW였다. AAD-12 단백질이 모든 조직으로부터 허용되는 수준으로 회수되었다. 종래 연구에서 시험된 비-표적 단백질과 비교하였을 때, 검증된 검정법은 AAD-12 단백질에 대해 특이적이었다. 대두 조직에서 AAD-12 단백질의 정량화를 위해서, 뿌리의 경우, 2X 이상의 희석률이 권고되고, V5 잎, V10 잎 및 목초의 경우, 5X 이상의 희석률이 권고되며, 종자의 경우, 10X 이상의 희석률이 권고되었다. 추가로, AAD-12 단백질이 모든 대두 조직으로부터 효율적으로 추출되었다. 본 검정법은 허용되는 정확도 및 정밀도를 가지는 것으로 밝혀졌으며, 표적 LOD 아래에서는 어떤 위-양성 또는 위-음성 결과도 관찰되지 않았다. 본 AAD-12 ELISA 방법이 대두 조직 중의 AAD-12 단백질을 정량적으로 측정하는 데 적합하다는 것이 입증되었다.

ATCC PTA-10919 20100505 ATCC PTA-10920 20100505 ATCC PTA-10921 20100505 ATCC PTA-10922 20100505 ATCC PTA-10923 20100505

Claims (15)

1. 539B181.2, 539B470.2, 539B489.2, 539B304.2, 및 539B478.2로 이루어진 항체 군으로부터 선택되는 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제 효소 (AAD-12)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체.
2. 제1항에 있어서, 지정 번호가 539B181.2인 하이브리도마에 의해 생산된 단일클론 항체.
3. 제1항에 있어서, 지정 번호가 539B470.2인 하이브리도마에 의해 생산된 단일클론 항체.
4. 제1항에 있어서, 지정 번호가 539B498.2인 하이브리도마에 의해 생산된 단일클론 항체.
5. 제1항에 있어서, 지정 번호가 539B304.2인 하이브리도마에 의해 생산된 단일클론 항체.
6. 제1항에 있어서, 지정 번호가 539B478.2인 하이브리도마에 의해 생산된 단일클론 항체.
7. PTA-10919, PTA-10920, PTA-10921, PTA-10922, 및 PTA-10923으로 이루어진 군으로부터 선택되는 수탁 번호하에 아메리칸 타이프 컬쳐 컬랙숀(American Type Culture Collection; ATCC)에 기탁된 제1항의 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주.
8. 제7항에 있어서, ATCC 수탁 번호 PTA-10919 하에 기탁된 하이브리도마.
9. 제7항에 있어서, ATCC 수탁 번호 PTA-10920 하에 기탁된 하이브리도마.
10. 제7항에 있어서, ATCC 수탁 번호 PTA-10921 하에 기탁된 하이브리도마.
11. 제7항에 있어서, ATCC 수탁 번호 PTA-10922 하에 기탁된 하이브리도마.
12. 제7항에 있어서, ATCC 수탁 번호 PTA-10923 하에 기탁된 하이브리도마.
13. a) 제1항의 제1 단일클론 항체를 검정용 표면 상에 고정화시킨 후, 상기 검정용 표면을 세척하는 단계;
    b) 상기 검정용 표면을 AAD-12를 함유할 것으로 의심되는 액체와, 결합을 허용하는 충분한 기간 동안 접촉시킨 후, 상기 검정용 표면을 세척하는 단계;
    c) 상기 검정용 표면을 리포터 기에 접합된 상이한 제1항의 제2 항체와, 상기 제2 접합된 단일클론 항체의 결합을 허용하는 충분한 기간 동안 접촉시킨 후, 상기 검정용 표면을 세척하는 단계; 및
    d) 상기 리포터 기의 존재 또는 부재에 대해 검출하는 단계를 포함하는, AAD-12 효소의 존재를 확인하는 방법.
14. a) AAD-12 항혈청을 검정용 표면 상에 고정화시키는 단계;
    b) 상기 검정용 표면을 AAD-12를 함유할 것으로 의심되는 액체와, 결합을 허용하는 충분한 기간 동안 접촉시킨 후, 상기 검정용 표면을 세척하는 단계;
    c) 상기 검정용 표면을 리포터 기에 접합된 상이한 제1항의 제2 항체와, 상기 제2 접합된 단일클론 항체의 결합을 허용하는 충분한 기간 동안 접촉시킨 후, 상기 검정용 표면을 세척하는 단계; 및
    d) 보정 곡선과 비교하여 상기 리포터 기의 존재를 정량화하는 단계를 포함하는, AAD-12 효소를 정량적으로 측정하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 접합된 단일클론 항체가 539B470.2인 방법.