BR112012030788B1

BR112012030788B1 - Anticorpo monoclonal, linhagem celular de hibridoma, e métodos para identificar a presença e para determinação quantitativa de uma enzima aad-12

Info

Publication number: BR112012030788B1
Application number: BR112012030788-6A
Authority: BR
Inventors: Guomin Shan; Gaofeng Lin; K.Smith-Drake Joelene; Marcelo J. Sosa
Original assignee: Dow Agrosciences Llc
Priority date: 2010-06-04
Filing date: 2011-06-02
Publication date: 2020-05-12
Also published as: JP2018141003A; EP2576623A4; KR101863384B1; WO2011153300A3; CN102985442B; EP2576623A2; WO2011153300A2; AU2011261411A1; BR112012030788A2; CN102985442A; BR112012030788B8; US20110300556A1; JP2016188219A; CA2799439C; JP2013527241A; KR20130088115A; CL2012003375A1; DK2576623T3; JP6393708B2; EP2576623B1

Abstract

métodos de detecção de anticorpos monoclonais para enzimas que conferem resistência ao ácido 2,4-diclorofenoxiacético em plantas. a presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais e métodos úteis para determinar e quantificar a presença de uma enzima ariloxial canoato dioxigenase.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPO MONOCLONAL, LINHAGEM CELULAR DE HIBRIDOMA, E MÉTODOS PARA IDENTIFICAR A PRESENÇA E PARA DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DE UMA ENZIMA AAD-12.

Referência Cruzada ao Pedido Relacionado.

[0001] O presente Pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório N° US 61/351,593, depositado em 4 de junho de 2010, cuja divulgação é aqui incorporada pela referência em sua totalidade. Antecedentes da Invenção.

[0002] O ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) está na classe de fenoxiácidos de herbicidas e foi usado em muitas colheitas de monocotiledôneo, tais como milho, trigo e arroz, para controle seletivo de ervas daninhas folhosas sem danificar severamente as plantas da colheita desejadas. 2,4-D é um derivado sintético da auxina que atua para desregular a homeostase hormonal de células normais e impedir o crescimento equilibrado e controlado; entretanto, o modo exato da ação desta classe de herbicidas ainda não está completamente entendido. Triclopir e o fluroxipir são herbicidas do ácido piridiloxiacético que também atuam como uma auxina sintética.

[0003] Esses herbicidas têm diferentes níveis de seletividade sobre certas plantas (por exemplo, os dicotiledôneos são mais sensíveis do que os monocotiledôneos). O metabolismo diferenciado por plantas diferentes é uma explicação para níveis variados de seletividade. Em geral, as plantas metabolizam 2,4-D lentamente, portanto uma resposta variada da planta ao 2,4-D pode ser mais provavelmente explicada pelas diferentes atividades nos sítios alvos (WSSA, 2002; Herbicide Handbook 8^a edição; Weed Science Society of America; Lawrence, Kansas, pág 492). O metabolismo da planta do 2,4-D tipicamente ocorre via um mecanismo de duas fases, tipicamente hidroxilação seguida da conjugação com aminoácidos ou glicose (WSSA, 2002).

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2/25 [0004] Ao longo do tempo, certas populações microbianas desafiadas com 2,4-D desenvolveram um caminho alternativo para degradar esse xenobiótico que resultou na completa mineralização do 2,4-D. As aplicações sucessivas do herbicida selecionam micróbios que podem utilizar o herbicida como uma fonte de carbono e energia para crescimento, dando-lhes uma vantagem competitiva no solo. Por essa razão, o 2,4-D atualmente formulado, tem uma meia-vida no solo relativamente curta e nenhum efeito de carreamento significativo sobre as colheitas subsequentes.

[0005] Um organismo que foi extensivamente investigado para a sua capacidade de degradar o 2,4-D foi a Ralstonia eutropha (Streber, et al; 1987; Analysis, cloning, and high-level expression of 2,4dichlorophenixyacetic monooxygenase gene tfdA of Alcaligenes eutrophus JMP134. J. Bacteriol. 169:2950-2955). O gene que codifica a enzima na etapa inicial do caminho de mineralização é o tfdA. Ver a Patente dos Estados Unidos N^o 6.153.401 e a Conta do GENBANK N° M16730. O produto do gene TfdA catalisa a conversão de 2,4-D a diclorofenol (DCP) via um reação de dioxigenase dependente de □cetoglutarato (Smejkal; et al.; 2001. Substrate specificity of chlorophenoxyalkanoic acid-degrading bacteria is not dependent upon phylogenetically related tfdA gene types. Biol. Fertil. Sols 33:507-513). A DCP tem uma baixa atividade herbicida em comparação com o 2,4-D. O TfdA foi usado em plantas transgênicas para comunicar a resistência ao 2,4-D em plantas dicotiledôneas, tais como algodão e fumo que naturalmente são sensíveis ao 2,4-D (Streber; et al.; 1989. Transgenic tobacco plants expressing a bacterial detoxifying enzyme are resistant to 2,4-D. Bio/Technology 7:811-816.), e a Patente dos Estados Unidos N^o 5.608.147).

[0006] Um grande número de genes do tipo tfdA que codificam enzimas capazes de degradar o 2,4-D foi isolado das bactérias do solo

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3/25 e as suas sequências depositadas no banco de dados Genbank. Muitos homólogos do tfdA (identidade de aminoácido >85 %) têm propriedades enzimáticas semelhantes ao tfdA. Entretanto, há diversos homólogos que têm uma identidade significativamente mais baixa ao tfdA (25-50 %), que ainda associam os resíduos característicos com □cetoglutarato dioxigenase Fe⁺² dioxigenases. Assim, não é óbvio quais são as especificidades de substrato dessas dioxigenases divergentes. [0007] Um exemplo único com homologia baixa ao tfdA (identidade de aminoácido de 31 %) é o sdpA da Delftia acidovorans (Kohler, H.P.E. 1999; Delftia acidovorans MH: a versatile phenoxyalkanoic acid herbicide degrade^ J. Ind Microbiol and Biotech. 23:336-340. Westendorf, et al.; 2002. The two enantiospecific dichlorprop/a-cetoglutaratodioxygenases from Delftia acidovorans MC1-protein and sequence data of Rdpa e SdpA. Microbiol. Res. 157:317-22.). Mostrou-se que esta enzima catalisa a primeira etapa na mineralização do ácido (S)dicloropropano (e outro ácido (S)-fenoxipropiônico) bem como na mineralização do 2,4-D (um ácido fenoxiacético) (Westendorfet et al.; 2003. Purification and characterization of the enantiospecific dioxygenases from Delftia acidovorans MC1 initiating the degradation of phenoxypropionates and phenoxyacetate herbicides. Acta Biotechnol. 23: 3-17).

[0008] Um gene de planta para a ariloxialcanoato dioxigenase otimizado pelo codon, AAD-12, que codifica a enzima originalmente isolada da Delftia acidovorans foi primeiro descrito para uso como uma característica de resistência a herbicida na WO 2007/053482, aqui incorporada pela referência. A característica confere a tolerância ao 2,4D e aos herbicidas de piridiloxiacetato. O primeiro relatório da soja transformada que carrega o gene AAD-12 foi no Pedido de Patentes Provisório dos Estados Unidos N° 61/263950, aqui incorporado pela referência.

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4/25 [0009] As companhias que se desenvolvem e comercializam traços de DNA recombinantes para formular produtos para sementes de plantação, implementam e aderem a planos estritos de administração de produto. Estes planos de administração necessitam do uso de métodos de detecção de proteína quantitativos e qualitativos validados para característica recombinante para acompanhar a introgressão das características e as atividades de produção da semente, bem como a monitorização de colheita do grão para essa característica. Estes métodos de detecção devem ser fáceis e bastante robustos para usar sob condições de GLP e não GLP. Além disso, os métodos devem ser suficientemente amigáveis do usuário para que sejam facilmente empregados por agricultores nos campos, negociantes de milho nos silos, e oficiais aduaneiros nas fronteiras. Assim, métodos de detecção de proteína e kits comerciais robustos, de alta qualidade, de fácil utilização pelo usuário, são úteis e necessários.

[00010] Embora os imunoensaios sejam bem conhecidos na técnica, o desenvolvimento de um método ELISA (ensaios de imunosorbente ligado à enzima) robusto, de alta qualidade, validado que seja reprodutivelmente capaz de detectar um determinado produto transgênico em uma sequência de amostras de tecido de planta tanto em laboratório como em assentamentos no campo, eles não são nem triviais nem rotineiros. Ainda mais desafiante é encontrar pares de anticorpo que sejam particularmente adaptados ao desenvolvimento de uma tira de ELISA de fluxo lateral para detectar um evento transgênico AAD12.

Sumário da Invenção.

[00011] A presente invenção fornece um painel de anticorpos monoclonais (mAbs) e as linhagens celulares de hibridoma que os produzem. As linhagens foram depositadas com a Coleção Americana de Cultura de Tipos conforme os termos do Tratado de Budapeste. Estes

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5/25 mAbs são surpreendentemente bem adaptados para detectar um produto do gene de um evento transgênico AAD-12 em diversas plantas e tecidos de plantas. A invenção também fornece imunoensaios quantitativos e qualitativos usando as imunoglobulinas da invenção. Descrição Detalhada.

[00012] A presente invenção abrange anticorpos reativos com

AAD-12 e os hibridomas que produzem o mAbs. A tabela em baixo lista as designações de linhagem de hibridoma e o suas correspondentes designações depositadas no ATCC.

Hibridoma / Designação do mAb	Designação do Depósi- to no ATCC	Data de Depósito no ATCC
539B181.2	PTA-10919	5 de maio de 2010
539B470.2	PTA-10920	5 de maio de 2010
539B498.2	PTA-10921	5 de maio de 2010
539B304.2	PTA-10922	5 de maio de 2010
539B478.2	PTA-10923	5 de maio de 2010

[00013] A presente invenção também inclui métodos de usar o mAbs para isolar ou detectar AAD-12 compreendendo: a) imobilização do dito anticorpo sobre uma superfície; b) contatar o dito anticorpo imobilizado com a mistura contendo AAD-12; c) separar o dito anticorpo imobilizado ligado à AAD-12 da dita mistura; e d) recuperar o AAD12 retirando o AAD-12 ligado ao anticorpo do dito anticorpo imobilizado.

[00014] A presente invenção também inclui um método para usar os anticorpos reivindicados para identificar a presença de AAD-12 em uma amostra biológica compreendendo: a) imobilização do dito anticorpo sobre uma superfície de teste; b) contatar a dita superfície de teste com um líquido suspeito de conter o AAD-12, lavar a dita superfície de teste com uma solução conveniente; c) contatar a dita superfície de teste com um anticorpo anti-AAD-12 marcado com um grupo de relatório e lavar a dita superfície de teste com uma solução convenienPetição 870190091335, de 13/09/2019, pág. 11/85

6/25 te; d) detectar a presença do dito grupo de relatório.

[00015] A invenção adicionalmente inclui um método analítico para determinação quantitativa da enzima AAD-12 expressa em plantas transgênicas, especialmente plantas de soja e algodão. A proteína AAD-12 é extraída de amostras de soja com uma solução de PBS (tampão de fosfato salino). O extrato é centrifugado; o sobrenadante aquoso é coletado e diluído. Uma alíquota da amostra diluída é incubada com o anticorpo monoclonal anti-AAD-12 conjugado com a enzima nos poços de uma microplaca revestida com o anticorpo policlonal ou monoclonal anti-AAD-12 em um ELISA em formato de sanduíche. Ambos os anticorpos no par do sanduíche capturam a proteína AAD12 na amostra. No fim do período de incubação, os reagentes não ligados são retirados da microplaca por lavagem com PBS. A presença de AAD-12 é detectada incubando a enzima conjugada com um substrato de enzima, gerando um produto colorido. Já que o AAD-12 está ligado no sanduíche de anticorpo, o nível do desenvolvimento a cores é proporcional à concentração de AAD-12 na amostra (isto é, as concentrações mais baixas de proteína resultam no desenvolvimento mais fraco de cores). A absorbância em 450 nm menos a absorbância em um comprimento de onda de referência (tal como 650 nm) é medida usando um leitor de microplaca. Uma curva de calibração é estimada a partir de sete concentrações padrão usando uma equação de regressão quadrática. Este ELISA para AAD-12 é específico e bastante sensível para a quantificação de AAD-12 em extratos de amostras de tecidos de planta. Além disso, os anticorpos da invenção podem ser usados para confirmar a presença de AAD-12 pela utilização de um procedimento de western blotting padrão.

[00016] A preparação de anticorpos contra a proteína de interesse é bem conhecido na técnica. Ver Galfre e Milstein, Methods in Enzymology, volume 73, Academic Press, Nova Iorque (1981); James W.

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Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, Orlando, Flórida (1986); Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel, et al. editor, Wiley Interscience, Nova Iorque, (1987).

[00017] Para preparar anticorpos reativos com uma proteína de interesse, a proteína deve ser primeiro enriquecida ou purificada. As preparações antigênicas relativamente brutas de proteína podem ser usadas com objetivos de imunização. Entretanto, a proteína altamente purificada é necessária para determinar precisamente se os hibridomas estão produzindo os anticorpos monoclonais procurados ou para analisar as titulações de anticorpo do soro imune.

[00018] Uma vez que o AAD-12 tenha sido isolado, os anticorpos específicos para AAD-12 podem ser desenvolvidos por métodos convencionais que são bem conhecidos na técnica. As injeções repetidas em um hospedeiro escolhido, durante o período de semanas ou meses provocarão uma resposta imunológica e resultarão em titulações significativas de soro anti-AAD-12. Os hospedeiros preferidos são espécies de mamíferos e as espécies mais altamente preferidas são coelhos, cabras, ovelhas e ratos. O sangue drenado de tais animais imunizados pode ser processado por métodos estabelecidos para obter o antisoro (anticorpos policlonais) reativo com o AAD-12. O antisoro pode ser depois purificado por afinidade pela adsorção ao AAD-12 de acordo com técnicas conhecidas na técnica. O antisoro purificado por afinidade pode ser purificado também isolando a fração de imunoglobulina dentro do antisoro usando procedimentos conhecidos na técnica. O material resultante será uma população heterogênea de imunoglobulinas reativas ao AAD-12.

[00019] Os Anti-AAD-12 mAbs são rapidamente preparados usando AAD-12 purificado. Os métodos para produzir mAbs foram praticados durante várias décadas e são bem conhecidos daqueles com habilidades normais na técnica. As injeções subcutâneas intraperitoniais

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8/25 repetidas de AAD-12 no adjuvante provocarão uma resposta imunológica na maior parte dos animais, especialmente em ratos. Os linfócitos-B hiperimunizados são retirados do animal e fundidos com uma linhagem celular de parceiros de fusão convenientes capazes de serem cultivados indefinidamente. As numerosas linhagens celulares de mamíferos são parceiras de fusão convenientes para a produção de hibridomas. Muitas das tais linhagens estão comercialmente disponíveis pelo ATCC e fornecedores comerciais.

[00020] Uma vez fundidos, os hibridomas resultantes são cultivados em um meio de crescimento seletivo durante uma a duas semanas. Dois sistemas de seleção bem conhecidos estão disponíveis para eliminar as células de mieloma não fundidas ou fusões entre células de mieloma da cultura mista de hibridomas. A escolha do sistema de seleção depende da ninhada de rato imunizada e do parceiro de fusão de mieloma usado. O sistema de seleção AAT, descrito por Taggart e Samloff, Science 219, 1228 (1982), pode ser usado; entretanto, o sistema de seleção HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina), descrito por Littlefield, Science145, 709 (1964), é preferido por causa da sua compatibilidade com células de rato e os parceiros de fusão acima mencionados.

[00021] O meio de crescimento usado é depois avaliado para a secreção de mab imunoespecífica. Os procedimentos de teste de enzima ligada a imunosorbente são melhor adaptados com esta finalidade; embora, os ensaios radioimunológicos adaptados à avaliação de grandes volumes também sejam aceitáveis. Múltiplas avaliações projetadas para reduzir consecutivamente o número considerável de culturas inaplicáveis ou menos desejadas devem ser executadas para isolar a pequena percentagem de mAbs da presente invenção. As culturas que segregam mAbs reativo com AAD-12 foram isotipadas que usando ensaios comercialmente disponíveis.

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9/25 [00022] As culturas de hibridoma que segregam o anti muito procurado AAD-12 mAbs devem ser subclonadas várias vezes para estabelecer a monoclonalidade e a estabilidade. Os métodos de bem conhecido para subclonar culturas de células eucarióticas, não aderentes incluem as técnicas de classificação de célula ativada por diluição restritiva, agarose suave e a fluorescência. Depois de cada subclonagem, as culturas resultantes devem ser reanalisadas para secreção de anticorpo e isotipo para assegurar que uma cultura estável que segrega o anticorpo foi estabelecida.

[00023] Os anticorpos anti-AAD-12 reivindicados podem ser imobilizados em uma superfície para que uma parte do sítio de ligação de anticorpo permaneça exposta e seja capaz de ligação com o AAD-12. Uma ampla variedade de esquemas de imobilização de anticorpos foi desenvolvida durante as algumas décadas passadas. A imobilização pode ser realizada pela ligação covalente do anticorpo diretamente na superfície desejada ou fazendo uma ponte entre o anticorpo e a superfície.

[00024] A CNBr e a ligação de carbodiimida dos anticorpos ao polissacarídio presos em pérolas, tais como Sepharose ® (Pharmacia, Pistcataway, NJ) são ilustrativos de esquemas de ligação diretos que são compatíveis com a invenção. As ligações diretas geralmente não orientam os anticorpos de nenhuma maneira determinada; entretanto, alguns tipos de ligações diretas são capazes de orientar reprodutivelmente o anticorpo para a substância imobilizante.

[00025] Os esquemas de ligação preferidos orientam o anticorpo de tal modo que as suas regiões de ligação com antígeno permanecem expostas. Um desses esquemas utiliza o carboidrato natural encontrado nas cadeias pesadas do anticorpo. Primeiro pela oxidação das partes carboidrato aos aldeídos correspondentes que depois reagindo o aldeído com um grupo amino primário na superfície, é possível

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10/25 ligar o anticorpo em uma orientação vantajosa.

[00026] Muitos tipos de pontes são possíveis e incluem pequenos ligantes orgânicos que covalentemente ligam o anticorpo à substância imobilizante. Tais braços espaçadores são aceitáveis e preferivelmente não devem interagir com a proteína uma vez que a ponte foi formada.

[00027] O exposto acima não se destina de modo nenhum a limitar o alcance da invenção. Outros numerosos esquemas bem conhecidos para ligar anticorpos à substâncias de imobilização são compatíveis com a invenção.

[00028] É bem conhecido que os anticorpos marcados com um grupo de relatório podem ser usados para identificar a presença de antígenos em diversos meios. Os anticorpos marcados com isótopos radiativos foram usados por décadas em ensaios radioimunológicos para identificar, com grande precisão e sensibilidade, a presença de antígenos em diversos fluidos biológicos. Mais recentemente, os anticorpos marcados de enzima foram usados como um substituto para anticorpos radiomarcados em ELISA mais populares.

[00029] Os anticorpos da presente invenção podem ser ligados a uma substância imobilizante, tal como um poço ou partícula de poliestireno e usados em imunoensaios para determinar se o AAD-12 está presente em uma amostra de teste. Nesta modalidade da invenção, uma amostra é contatada com a superfície de imunoafinidade e permitida incubar. Depois de uma etapa de lavagem, qualquer AAD-12 que tenha se ligado na superfície de imunoafinidade é detectado contatando com a superfície com outro anticorpo da invenção marcado com um grupo de relatório.

[00030] O uso de tiras de fluxo lateral ou tiras imunocromatográficas com os anticorpos reivindicados e os métodos de teste são compatíveis com a invenção. Os ensaios de fluxo lateral são bem conheci

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11/25 dos na técnica. Ver por exemplo a US 6.485.982. Nesse modo os testes de fluxo lateral podem ser usados para a detecção qualitativa ou semiquantitativa de AAD-12 sozinho ou simultaneamente com outros analitos. Os testes de fluxo lateral são os mais simples de uso de todos os formatos de teste descritos aqui e são particularmente úteis em assentamentos de campo onde o material da planta é rapidamente extraído em uma solução e testado em uma tira de fluxo lateral. Nesse modo só é necessário colocar a tira de fluxo lateral em uma amostra líquida ou aplicar a amostra líquida na tira de fluxo lateral e ler os resultados depois de um tempo predeterminado. Todos os testes de fluxo lateral devem incorporar uma linha de controle de processo ou uma linha de controle de mostra que é usada para validar o resultado do teste. O surgimento de duas linhas, desse modo, indica um resultado positivo, enquanto um teste negativo válido produz só a linha de controle. Se só a linha de teste aparecer, ou se nenhuma linha aparecer, o teste é inválido.

[00031] Uma tira de teste de fluxo lateral típica compõe-se de quatro componentes principais; uma almofada de amostra na qual a amostra de teste é aplicada, uma almofada de conjugado contendo anticorpos da presente invenção conjugado a partículas coloridas (tipicamente partículas de ouro coloidal, ou microesferas de látex); uma membrana de reação, tal como uma nitrocelulose hidrofóbica ou membrana de acetado de celulose sobre a qual um anticorpo diferente da invenção é imobilizado em uma linha através da membrana como uma zona de captura ou linha de teste; e, um reservatório de rejeitos projetado para drenar a amostra através da membrana de reação pela ação capilar. [00032] Os componentes da tira de fluxo lateral são normalmente fixados a um material de apoio inerte e podem ser apresentados em um formato de tira simples ou dentro de uma embalagem plástica com uma porta de mostra e janela de reação mostrando as zonas de captu

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12/25 ra e controle. Em outro modo da modalidade de teste, uma amostra de teste suspeita em conter AAD-12 é seca sobre uma superfície, formando uma amostra de teste imobilizada. Um anticorpo marcado da invenção é depois contatado com a amostra de teste imobilizada e deixado incubar. Se a amostra contiver o AAD-12, o anticorpo marcado ligará ao AAD-12 imobilizado. Este método também pode ser feito usando um anticorpo não marcado da invenção seguido de um anticorpo secundário marcado que liga a um anticorpo da invenção que já se ligou com o AAD-12. Depois da lavagem, a amostra de teste imobilizada é medida para detectar a presença de qualquer grupo de relatório.

[00033] Os grupos repórteres são tipicamente enzimas, tais como fosfatase alcalina, peroxidase de rabanete silvestre ou beta-Dgalactosidase. Os substratos convenientes produzem uma alteração na cor quando reagido com a enzima. Assim, as medições da intensidade da cor podem ser quantificadas usando um espectrofotômetro. Se o grupo de relatório for um isótopo radiativo, um detector adequado de raios gama ou beta pode ser usado para quantificar o grupo de relatório. A intensidade do grupo de relatório está diretamente em correlação, com a quantidade de AAD-12 na amostra de teste.

[00034] Os seguintes exemplos ajudarão a descrever como a invenção é praticada e ilustrará as características dos anticorpos antiAAD-12 e ensaios reivindicados.

EXEMPLO 1.

Preparação Imunogênica.

[00035] A proteína de AAD-12 foi extraída o tecido de folha liofilizado retirado de soja transgênica em um PBST (Tampão de fosfato salino com Tween 20 a 0,05 %, pH 7,4) a solução tampão de base acrescentada de estabilizadores, e as proteínas solúveis foram coletadas no sobrenadante depois da centrifugação. O sobrenadante foi fil

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13/25 trado e deixou-se que a proteína solúvel ligasse às pérolas de Fenil Sepharose ™ (PS) (GE Healthcare). Depois de uma hora de incubação, as pérolas de PS foram lavadas com PBST e a proteína ligada foi eluída com água Milli-Q ™. O cloreto de sódio foi acrescentado para aumentar a condutividade e a proteína purificada do PS foi carregada em uma coluna de imunoafinidade anti-AAD-12 que tinha sido conjugada com um anticorpo policlonal específico AAD-12 levantado contra AAD-12 recombinante produzido em Pseudomonas fluorescens. A proteína não ligada foi coletada da coluna e a coluna foi lavada extensivamente com PBS previamente gelado (tampão de fosfato salino, pH 7,4). A proteína ligada foi eluída da coluna com um tampão de NaSCN a 3,5 M, Tris™ a 50 mM, pH 8,0. O AAD-12 derivado de microrganismos e AAD-12 derivado da soja foram examinados por SDS-PAGE e western blotting.

[00036] No AAD-12 derivado de microrganismos, a banda de proteína principal, como visualizado no gel de SDS-PAGE corado com Coomassie, foi de aproximadamente 32 kDa. Como esperado, a derivada deproteína do AAD-12 correspondente derivada de planta foi idêntica em tamanho à proteína derivada de micróbios. Previsivelmente, as frações purificadas da planta continham uma quantidade menor de impurezas não imunorreativas além da proteína AAD-12. As proteínas copurificadas foram similarmente retidas na coluna por interações fracas com a matriz da coluna.

[00037] O AAD-12 derivado de microrganismos e o extrato derivado de plantas mostraram um sinal positivo no tamanho esperado no Western blot usando anticorpo policlonal anti-AAD-12. Na análise Western blot do AAD-12, nenhuma proteína imunorreativa foi observada no extrato de controle negativo (soja nativa) e nenhuma proteína de tamanhos alternados (agregados ou produtos de degradação) foi observada nas amostras da planta transgênica.

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EXEMPLO 2.

Preparação de Hibridoma.

[00038] Os ratos foram imunizados com AAD-12 purificado, e as técnicas de fusão padrão foram usadas para preparar um painel de hibridomas que expressam anticorpos monoclonais anti AAD-12. As amostras dos meios de cultura de tecido consumidos foram retiradas assepticamente de cada poço contendo uma cultura de hibridoma e analisadas para a reatividade ao AAD-12 usando o seguinte método ELISA de captura de anticorpo. Os poços de microtitulação foram revestidos de uma solução de 1 a 10 pg/mL de AAD-12 purificado. Os poços foram lavados e as amostras de meios de tecido consumidos foram colocadas nos poços e deixadas incubar. Os poços foram lavados e o anti antisoro de rato, anti cabra, marcado com peroxidase de rabanete silvestre foi acrescentado e deixado incubar. As microplacas foram lavadas, o substrato foi acrescentado para desenvolver uma reação de cor e as microplacas foram lidas para OD (densidade ótica). Os poços com altas leituras de OD foram mapeados retornando aos poços de cultura contendo os hibridomas. As culturas positivas de anticorpo AAD-12 foram continuamente avaliadas para a produção de anticorpo para assegurar a estabilidade do crescimento e a produção de anticorpos conforme as culturas se expandiam. Vários ciclos de clonagem por diluição limitante foram executados para estabelecer a monoclonalidade verdadeira de cada cultura. Os ensaios adicionais nos clones positivos do anticorpo foram conduzidos para determinar a conveniência de cada anticorpo para utilização nos métodos quantitativos de detecção presentemente reivindicados para uso em campo com o material de plantas.

EXEMPLO 3.

ELISA Quantitativo.

[00039] Este exemplo é um método para determinação quantitati

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15/25 va de AAD-12 em tecidos de soja usando anticorpos e métodos da invenção reivindicada. A faixa quantitativa da curva padrão de calibração é de 0,25 ng/mL a 10 ng/mL em tampão. O nível de proteína AAD-12 de soja em sementes, folhas (V5 e V10), raiz, e forragem nos estágios R3 pode ser determinado com um limite da quantificação (LOQ) de 1,0 ng/mg e um limite da detecção (LOD) de 0,5 ng/mg.

[00040] As substâncias de teste foram amostras de tecido de soja representativas que foram geneticamente modificadas para expressar a proteína AAD-12, e a soja de controle não transgênica da variedade Maverick. Os tecidos, listados abaixo, foram coletados da estufa.

Lista de amostras de soja não transgênica.

Grupo de amostra N°	Tecido	Descrição da amostra
081008-001-0001	Forragem (Planta inteira; folha e tronco; R3)	controle não transgênico
081008-004-0001	Raiz (R3)	controle não transgênico
081008-009-0001	Semente	controle não transgênico
081008-010-0001	Folhas (V5)	controle não transgênico
081008-011-0001	Folhas (V10)	controle não transgênico

Lista de amostras de soja transgênica.

Grupo de amostra N°	Tecido	Descrição da amostra
081008-003-0001	Forragem (Planta inteira; folha e tronco; R3)	AAD-12
081008-006-0001	Raiz	AAD-12
081008-007-0001	Folhas (R7)	AAD-12
081008-012-0001	Semente	AAD-12
081008-013-0001	Folhas (V5)	AAD-12
081008-014-0001	Folhas (V10)	AAD-12

[00041] As substâncias de referência empregadas abaixo nesse estudo foram uma proteína AAD-12 purificada usada como um padrão

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16/25 de calibração e como material de fortificação na análise de ELISA, uma proteína AAD-12 purificada, e uma proteína AAD-12 purificada usada no teste para a reatividade cruzada.

Proteína	Número de Substân- cia de Teste	Pureza ou Concentração	Referência
Cry1F	104301	0,164 mg/mL	BIOT033236
AAD-1	105930	0,1805 mg/mL	BIOT09-203007
Cry1Ac	102337	0,26 mg/mL	BIOT08-162946
AAD-12	030732	0,2 mg/mL	BIOT09-203009
PAT	105742	0,3 mg/mL	BIOT063302
Cry35Ab1	104066	0,128 mg/mL	BIOT08-162948
Cry34Ab1	104874	0,248 mg/mL	BIOT09-203014

[00042] Todos os testes e as substâncias de referência foram mantidos em freezers de temperatura monitorada, e removidos somente para preparação de amostra e análise. Resumidamente, a proteína AAD-12 foi extraída de amostras de soja (V5, V10, forragem, e raiz) com tampão PBST (solução tampão de fosfato salino contendo Tween™ 20 a 0,05 %) com ovalbumina a 0,75 % (OVA) (PBST/OVA). A proteína AAD-12 foi extraída de sementes de soja com uma solução de PBS contendo Tween™ 20 a 0,05 % (PBST) e Triton™ X-100 a 0,1%. O extrato foi centrifugado, e o sobrenadante aquoso foi coletado, diluído e analisado utilizando ELISA específico para AAD-12. Uma alíquota da amostra diluída foi incubada com a enzima conjugada com o anticorpo anti-AAD-12 monoclonal 539B470.2 nos poços de uma microplaca revestidos com anticorpo policlonal anti-AAD-12 em um ELISA em formato de sanduíche. Ambos os anticorpos no par do sanduíche capturaram o AAD-12 na amostra. No fim do período de incubação, os reagentes não ligados foram retirados da microplaca por lavagem com PBST. A presença de AAD-12 foi detectada incubando o anticorpo ligado ao conjugado da enzima com um substrato de enzima, gerando um produto colorido. Como o AAD-12 foi ligado no sanduíche

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17/25 de anticorpo, o nível do desenvolvimento a cores foi proporcional à concentração de AAD-12 na amostra (isto é, as concentrações mais baixas de proteína resultam no desenvolvimento mais fraco de cores). A reação colorida foi parada acrescentando uma solução ácida e a absorbância em 450 nm menos a absorbância em 650 nm foi medida usando um leitor de microplaca. Uma curva de calibração foi estimada a partir de 7 concentrações padrão usando uma equação de regressão quadrática com um coeficiente da determinação > 0,990. Esse ELISA para AAD-12 foi altamente específico para a quantificação da proteína AAD-12.

EXEMPLO 4.

Validação do Teste.

[00043] A faixa quantitativa do método foi estabelecida preliminarmente independentemente durante o desenvolvimento do método e um estudo de pré-validação. As concentrações padrão forneceram os mais baixos erros médios percentuais dos pontos dados de concentração. O limite da detecção (LOD) e o limite da quantificação (LOQ) da determinação de AAD-12 em cada tecido foram empiricamente definidos com base nos parâmetros do teste (absorbância, interferência de fundo, e faixa linear de variação), matrizes de interferência e/ou doses constituindo a curva padrão. Eles também foram apoiados por aproximações estatísticas seguindo o método de Keith et al. (Keith, L. H., Crummett, W., Deegan, J., júnior, Libby, R. A., Taylor, J. K., Wentler, G. 1983. Principles of Environmental Analysis, Anal. Chem., 55, 22102218) e testando cada amostra de controle fortificada com 5 ng/mL (0,5 ng/mg) de proteína AAD-12.

[00044] A reatividade cruzada desse ELISA para AAD-12 para proteínas não visadas Cry1F, Cry1Ac, Cry34Ab1, Cry35Ab1, PAT e AAD1 foi testada nesse estudo. Essas proteínas foram preparadas em concentrações de 1 pg/mL e 10 pg/mL em PBST/OVA. Na mesma mi

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18/25 croplaca, uma curva padrão AAD-12 foi gerada como uma referência. A OD de resposta da proteína não visada foi interpolada da curva padrão AAD-12 e a reatividade cruzada percentual foi calculada usando a seguinte fórmula: reatividade cruzada % = 100 x (conc. medida de AAD-12 da curva padrão / conc. teórico da proteína visada).

[00045] Os extratos de amostra (matriz) de cada tecido de soja (diluições 1X, 5X e 10X) do controle negativo foram os picos de concentrações diferentes para criar as curvas padrão. As curvas padrão da matriz de picos foram interpoladas de uma curva padrão sem picos corrida na mesma microplaca. Uma diferença superior a 15 % entre as médias observadas (uma curva padrão sem picos usada para interpolar as concentrações padrão da matriz de picos) e teóricas (concentração da curva padrão da matriz de picos) para cada nível de concentração padrão foi considerado indicativo de um efeito matriz potencial.

[00046] Uma série de cinco extrações foi executada em tecidos de soja transgênicos conhecidos para expressar AAD-12. Resumidamente, 1,5 mL do tampão foi acrescentado à amostra de tecido (15 mg) e extraído tal como descrito acima. Em seguida às extração e centrifugação, a solução extraída foi retirada por pipeta. Depois do primeiro extrato, uma alíquota de 200 pL do tampão foi acrescentada e misturada com a amostra, centrifugada e o sobrenadante retirado e acrescentado à primeira solução de extração. Mais 1,5 mL do tampão foi acrescentado ao tecido, e o processo de extração foi repetido. Este procedimento foi repetido mais três vezes para obter 5 extrações consecutivas. A concentração de AAD-12 em cada extração foi determinada usando ELISA AAD-12. Pelo menos cinco réplicas foram estudadas para cada amostra de tecido. A eficiência aparente do processo de extração de tecido foi determinada pela comparação da proteína AAD12 no primeiro extrato em relação à proteína de AAD-12 total nos cinco extratos.

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19/25 [00047] A precisão do método foi determinada medindo a recuperação da proteína AAD-12 das matrizes de picos de controle negativo com baixos (0,5 ng/mg DW), médios (1, e 4 ng/mg DW) e altos (8 ng/mg DW) níveis da proteína AAD-12. Um mínimo de cinco réplicas de cada concentração foi analisado. A precisão do ensaio foi indicada como um percentual de recuperação. As recuperações entre 67e 120 % foram consideradas aceitáveis.

[00048] A precisão do método foi determinada usando os resultados de amostras de controle fortificadas de soja analisadas por dois analistas em múltiplos dias. Os extratos da amostra de controle foram fortificados com três níveis do padrão AAD-12 (0,25 ng/mg, 0,5 ng/mg, 4 ng/mg e 8 ng/mg). Cada nível do extrato fortificado foi corrido em triplicata em cada microplaca de ELISA. A concentração de recuperação média, desvio padrão (stdev), e coeficiente de variação percentual (%CV) foram calculados para cada uma das amostras.

[00049] As amostras positivas (folha V5 e forragem (planta inteira)) foram também testadas para a precisão. A concentração média predita, desvio padrão (stdev), e coeficiente de variação percentual (%CV) foram calculados para cada amostra. As precisões foram calculadas intra e inter dias.

[00050] O objetivo deste experimento foi verificar que o padrão de proteína AAD-12 e a proteína AAD-12 em extratos de planta expuseram uma resposta total semelhante por ELISA. Isto foi feito para todos os tecidos transgênicos avaliando a concordância dos resultados da diluição de um extrato único interpolado da faixa quantitativa da curva padrão. O coeficiente da variação dos resultados interpolados, de todas as diluições quantificáveis, foi calculado para cada tipo de tecido.

[00051] As semente, folha, forragem (planta inteira) e tecidos de raiz foram testadas para ocorrências de falso positivo e falso negativo. Quinze amostras de controle não fortificadas e quinze amostras fortifi

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20/25 cadas em 0,25 ng/mg foram analisadas para cada tecido para determinar as taxas de falso positivo e falso negativo. Um resultado falso e positivo ocorre quando o resíduo no, ou acima do, LOD estabelecido é encontrado em uma amostra conhecida livre de analitos. Um falso negativo ocorre quando nenhum resíduo é detectado em uma amostra fortificada no LOD.

[00052] As leituras de ELISA foram registradas de um Leitor de

Microplaca da Molecular Dynamics usando o programa SOFTmax PRO. Os dados de concentração foram transferidos para SAS, JMP ou Microsoft Excel para os cálculos de média, erro percentual, média estatística, desvio padrão, e %CV.

[00053] O limite da detecção (LOD) de um imunoensaio é definido como a concentração de analito que dá uma resposta que tem uma diferença estatisticamente significativa da resposta de uma amostra de zero analito. O limite da quantificação (LOQ), ou faixa de trabalho de um ensaio, é geralmente definido como as concentrações mais altas e mais baixas que podem ser determinadas com um grau aceitável de precisão. Neste estudo, o LOD e LOQ visados para a determinação de AAD-12 em cada tecido foram empiricamente definidos com base nos parâmetros do teste (tais como absorbância, interferência de fundo, razão entre sinal e interferência, e faixa linear de variação), interferências matrizes, e as concentrações de curva padrão. Os LOD e LOQ também foram determinados por aproximações estatísticas padrão. Seguindo as diretrizes estabelecidas, os LOD e LOQ foram calculados usando o desvio padrão dos resultados de recuperação de 0,5 ng/mg. O LOQ foi calculado como dez vezes o desvio padrão (10s), e o LOD foi calculado como três vezes o desvio padrão (3s) dos resultados da análise para um mínimo de 5 amostras por matriz. Os resultados calculados e os alvos LODs e LOQs para cada tecido são resumidos na tabela abaixo.

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Resumo do Cálculo de LOD e LOQ do ELISA para AAD-12 em Tecido de Soja.

Tecido	Nível do pico ng/mg	Recuperação Média ng/mg	Desvio Padrão s	3 x s	LOD Alvo ng/mg	10 x s	LOQ Alvo ng/mg
Forragem (Planta inteira)	0,5	0,29	0,06	0,18	0,5	0,60	1,0
Raiz	0,5	0,30	0,05	0,15	0,5	0,50	1,0
Folha V5	0,5	0,32	0,05	0,15	0,5	0,50	1,0
Semente	0,5	0,36	0,03	0,03	0,5	0,10	1,0
Folha V10	0,5	0,46	0,03	0,03	0,5	0,10	1,0

[00054] O LOD alvo é 0,5 ng/mg para todas as matrizes de soja. O

LOQ alvo é 1,0 ng/mg para todas as matrizes de soja.

[00055] Diversas proteínas relevantes, tal como Cry1F, Cry1Ac,

Cry34Ab1, Cry35Ab1, PAT, e AAD-1 foram testadas para a reatividade cruzada. Nenhuma reatividade cruzada foi observada nas concentrações testadas para estas proteínas (10.000 ng/mL).

[00056] Os resultados dos testes matrizes estão resumidos na tabela seguinte.

Resumo dos Efeitos da Matriz.

Tecido	P.15SGN#	Diluição Matriz^a	Diluição mais baixa sem o efeito da matriz
1X	5X	10X
Folha V5	081008-010-0001	Sim	Não	Não	1:5
Folha V10-12	081008-011-0001	Sim	Não	Não	1:5
Forragem R3 (planta inteira)	081008-001-0001	Sim	Não	Não	1:5
Raiz R3	081008-004-0001	Não	Não	Não	1:2
Semente R8	081008-009-0001	Sim	Sim	Não	1:10

[00057] Sim representou que uma curva padrão é afetada pela matriz quando o erro médio percentual entre os valores observados e

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22/25 teóricos de todos os sete níveis de concentração padrão é superior a 15 %. Não representou que nenhum efeito da matriz ou o erro médio percentual entre os valores observados e teóricos de todos os sete níveis de concentração padrão são menores que 15 %.

[00058] Uma diferença dos maiores do que 15 % entre as médias observada e teórica para qualquer um dos sete níveis de concentração padrão foi considerada indicativa de um efeito matriz. Nenhum efeito matriz foi observado na raiz no nível 1X da matriz de picos. Nenhum efeito foi encontrado no nível 5X da matriz de pico para as folha V5, folha V10 e forragem (planta inteira). Entretanto, os efeitos das matrizes foram encontrados na semente no nível 5X. Para a quantificação AAD-12 em tecidos de soja, pelo menos é recomendada a diluição de 2X para a raiz; é recomendada a diluição de pelo menos 5X para folha V5, folha V10 e forragem; e é recomendada a diluição de pelo menos 10X para a semente.

[00059] A determinação do nível total de proteína AAD-12 em uma amostra é crítico para examinar a eficiência da extração. As amostras positivas foram extraídas com a extração com tampão por cinco vezes consecutivas e a concentração da proteína AAD-12 em cada extrato foi determinada por ELISA. A eficiência aparente da extração foi baseada na quantidade da proteína AAD-12 na primeira extração em relação à soma total da AAD-12 nas cinco extrações. As eficiências de extração da proteína AAD-12 dos tecidos de soja são mostradas na tabela abaixo.

Sumário de Eficiência de Extração de AAD-12 do Tecido de Soja.

Amostra	SGN#	Eficiência de Extração Média (%)	Desvio Padrão	%CV	Faixa de %EE
Forragem (Planta Inteira)	081008- 003-0001	93,7	1,1	1,1	92,3- 95,2
Raiz	081008- 006-0001	90,0	0,4	0,5	89,6- 90,6

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23/25

Folha V5	081008- 013-0001	97,2	0,2	0,3	96,9- 97,6
Semente	081008- 012-0001	85,8	5,6	6,6	79,1- 91,1
Folha V10	081008- 014-0001	93,3	1,4	1,5	91,1- 94,7

[00060] As eficiências de extração para forragem (planta inteira), raiz, semente, folha V5 e folha V10 variaram de 85,8 a 97,2 %.

[00061] Os níveis médios de recuperação da AAD-12 de todos os tecidos quando fortificados a níveis comparáveis para o LOQ, os pontos médios e os pontos altos da curva padrão são mostrados na tabela abaixo.

Resumo de Resultados de Precisão.

Matriz	Nível de Fortificação ng/mg ng/mL^a	Taxa de Recuperação (%) Média Faixa	%CV	n
Forra-	8410,50,5	8040105	7170675	59-7760-	9,49,51	55552
gem	-8	5-80	866	7957-	0,315,8	0
(Planta				7646-	14,4
Inteira)				7746-79
Raiz	8410,50,5	8040105	7271696	66-7764-	6,06,27,	55552
	-8	5-80	168	7662-	913,011	0
				7651- 7651-77	,1
Folha	8410,50,5	8040105	7576736	66-8067-	7,48,67,	55552
V5	-8	5-80	572	8366-	812,911	0
				8253- 7853-83	,2
Semen-	8410,50,5	8040105	7575747	72-7774-	2,41,62,	55552
te	-8	5-80	374	7772- 7671- 7571-77	42,62,4	0
Folha	8410,50,5	8040105	9910096	97-	1,85,22,	55552
V10	-8	5-80	9397	10192- 10594- 9991- 9491-	81,44,3	0
				105
^a As amostras foram c	iluídas 10X antes da análise.

[00062] Os picos no nível ou acima do LOQ, da folha V5, da folha

V10 e da semente foram de 67 a 100 % dentro da especificação de 67

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24/25 a 120 % para a recuperação média com os coeficientes percentuais de variação (%CVs) em ou abaixo de 16 %.

[00063] A precisão e a robustez do teste foram examinadas usando extratos de folha V5 e forragem (planta inteira) contendo quatro níveis da proteína AAD-12. Os níveis foram 8 ng/mg, 4 ng/mg, 0,5 ng/mg e 0,25 ng/mg. A precisão intradiária do ensaio foi inferior ou igual a 6,3 %, 10,8 %, 9,6 % e 15,0 % do extrato de folha V5 fortificado em 8, 4, 0,05 e 0,25 ng/mg, respectivamente. A precisão intradiária do ensaio foi inferior ou igual a 3,5 %, 13,1 %, 10,1 % e 10,9 % do extrato de forragem (planta inteira) fortificado em 8, 4, 0,5 e 0,25 ng/mg, respectivamente. A folha V5 e as amostras de forragem positivas também foram testadas para a robustez do teste. A precisão intradiária do ensaio foi inferior ou igual a 9,7 % e 19,7 % para a folha V5 e a planta inteira, respectivamente.

[00064] A precisão interensaio através de todos os dias e analistas foi de 4,6 %, 10,1 %, 6,4 % e 12,9 % dos extratos de folha V5 fortificados em 8, 4, 0,5 e 0,25 ng/mg, respectivamente. A precisão de interensaio através de todos os dias e analistas foi de 6,0 %, 10,5 %, 6,4 % e 10,1 % dos extratos de forragem fortificados em 8, 4, 0,5 e 0,25 ng/mg, respectivamente. A robustez de interensaio através de dias e analistas foi 11,3 % e 14,1 % para a folha V5 e forragem positivas, respectivamente.

[00065] A equivalência de respostas entre o padrão e a substância de teste no ELISA para AAD-12 foi demonstrada usando até oito diluições em série de extratos de tecidos de positivo para AAD-12. Para cada extrato de tecido, cinco ou mais das diluições caíram na faixa quantitativa da curva padrão, e o %CV dos resultados quantificados foi menor que 20 %.

[00066] As amostras de controle não fortificadas (matrizes de espaços em branco) e as amostras fortificadas em 0,25 ng/mg (LOD=0,5

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25/25 ng/mg) foram analisadas para determinar a taxa de falso positivo e falso negativo. Não houve nenhum falso positivo nas amostras de controle não fortificadas e nenhum falso negativo informado das amostras de LOD fortificado analisadas nesse estudo.

[00067] Em resumo, o método foi validado sobre a faixa de concentração de 1,0 a 8,0 ng/mg de peso seco (DW) e tem um limite validado de quantificação (LOQ) em todos os tecidos de soja de 1,0 ng/mg DW e um limite da detecção (LOD) em todos os tecidos de soja de 0,5 ng/mg DW. A proteína AAD-12 foi recuperada a níveis aceitáveis de todos os tecidos. O ensaio validado é específico para a proteína AAD-12 quando em comparação com as proteínas não alvo testadas em estudos anteriores. Para a quantificação de proteína AAD-12 em tecidos de soja, uma diluição de 2X ou maior é recomendada para a raiz, diluição de 5X ou maior é recomendada para folha V5, folha V10 e forragem, e uma diluição de 10X ou maior é recomendada para a semente. Além disso, a proteína AAD-12 foi eficientemente extraída de todos os tecidos de soja. Mostrou-se que o ensaio tinha precisão e acurácia aceitáveis, e nenhum resultado falso positivo ou falso negativo foram vistos abaixo do alvo LOD. Esse método de ELISA AAD-12 foi demonstrado como sendo adequado para medições quantitativas da proteína AAD-12 nos tecidos de soja.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de que especificamente se liga a uma enzima de ariloxialcanoato dioxigenase (AAD-12), selecionada do grupo de anticorpos consistindo em:

539B181.2, produzido pelo hibridoma depositado no ATCC como PTA-10919,

539B470.2, produzido pelo hibridoma depositado no ATCC como PTA-10920,

539B498.2, produzido pelo hibridoma depositado no ATCC como PTA-10921,

539B304.2, produzido pelo hibridoma depositado no ATCC como PTA-10922, e

539B478.2, produzido pelo hibridoma depositado no ATCC como PTA-10923.
2. Anticorpo, monoclonal de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo hibridoma depositado no ATCC como PAT-10919, apresentando uma designação de 539B181.2.
3. Anticorpo, monoclonal de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo hibridoma depositado no ATCC como PAT-10920, apresentando uma designação de 539B470.2.
4. Anticorpo, monoclonal de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo hibridoma depositado no ATCC como PAT-10921, apresentando uma designação de 539B498.2.
5. Anticorpo, monoclonal de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo hibridoma depositado no ATCC como PAT-10922, apresentando uma designação de 539B304.2.

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2/3
6. Anticorpo, monoclonal de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo hibridoma depositado no ATCC como PAT-10923, apresentando uma designação de 539B478.2.
7. Linhagem celular de hibridoma, caracterizada pelo fato de que produz um anticorpo monoclonal, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, que está depositado com a Coleção Americana de Cultura de Tipo (ATCC) sob números de acesso selecionado do grupo consistindo em PTA-10919, PTA-10920, PTA-10921, PTA-10922 e PTA-10923.
8. Linhagem celular de hibridoma, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que está depositada sob o número de acesso ATCC PTA-10919.
9. Linhagem celular de hibridoma, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que está depositada sob o número de acesso ATCC PTA-10920.
10. Linhagem celular de hibridoma, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que está depositada sob o número de acesso ATCC PTA-10921.
11. Linhagem celular de hibridoma, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que está depositada sob o número de acesso ATCC PTA-10922.
12. Linhagem celular de hibridoma, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que está depositada sob o número de acesso ATCC PTA-10923.
13. Método para identificar a presença de uma enzima AAD-12, caracterizado pelo fato de que compreende:

(a) imobilizar um primeiro anticorpo monoclonal, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, sobre uma superfície de teste depois de lavar a dita superfície de teste;

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3/3 (b) contatar a dita superfície de teste com um líquido suspeito de conter AAD-12 durante um período de tempo suficiente para permitir a ligação depois de lavar a dita superfície de teste;

(c) contatar a dita superfície de teste com um segundo anticorpo diferente, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, conjugado a um grupo de relatório durante um período de tempo suficiente para permitir a ligação do dito segundo anticorpo monoclonal conjugado depois de lavar a dita superfície de teste; e, (d) detectar a presença ou ausência do dito grupo de relatório.
14. Método para determinação quantitativa de uma enzima AAD-12, caracterizado pelo fato de que compreende:

(a) imobilizar um antisoro AAD-12 sobre uma superfície de teste;

(b) contatar a dita superfície de teste com um líquido suspeito de conter AAD-12 durante um período de tempo suficiente para permitir a ligação depois de lavar a dita superfície de teste;

(c) contatar a dita superfície de teste com um segundo anticorpo diferente, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, conjugado a um grupo de relatório durante um período de tempo suficiente para permitir a ligação do dito segundo anticorpo monoclonal conjugado depois de lavar a dita superfície de teste; e, (d) quantificando da presença do dito grupo de relatório em comparação com uma curva de calibração.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal conjugado é produzido pelo hibridoma depositado no ATCC como PTA-10920.