JP2013527241A - 植物において２，４−ジクロロフェノキシ酢酸に対する耐性を付与する酵素のモノクローナル抗体検出法 - Google Patents

Abstract

アリールオキシアルカノエートオキシゲナーゼ酵素の存在を決定し、定量化するために有用なモノクローナル抗体および方法が本願明細書に記載されている。

Description

関連出願への相互参照
本出願は2010年6月4日に出願された米国仮特許出願61/351,593号の利益を主張し、その開示は、その全体が本明細書に参考として援用される。

発明の背景
2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）は、除草剤のフェノキシ酸クラスに属し、例えば、トウモロコシ、小麦、イネなどの多くの単子葉植物の作物において、目的の栽培植物に深刻なダメージを与えることなく、広葉雑草を選択的に制御するために使用されてきた。2,4-Dは、正常な細胞ホルモンの恒常性の制御を緩和し、バランスのとれた、制御された成長を妨げるように作用する合成オーキシン誘導体であるが、除草剤のこのクラスの正確な作用態様は、まだ完全には理解されていない。トリクロピルおよびフルロキシピルは、合成オーキシンとしてもまた働くピリジルオキシ酢酸（pyridyloxyacetic acid）系除草剤である。

これらの除草剤は、特定の植物に対する異なるレベルの選択性を有する（例えば、双子葉植物は単子葉植物より敏感である）。異なった植物による差動代謝（differential metabolism）が種々のレベルの選択性の一つの説明である。一般的に、植物は徐々に2,4-Dを代謝するので、2,4-Dに対する植物の応答の変化は、標的部位における異なる活性によって説明される可能性が高いかもしれない（WSSA，2002；Herbicide Handbook 8^th edition; Weed Science Society of America, Lawrence. KS pp.492（除草剤ハンドブック第8版；アメリカ雑草学会、ローレンス、カンザス州の492頁））。2,4-Dの植物代謝は、通常、2相のメカニズム、典型的にはアミノ酸またはグルコースとの結合に続くヒドロキシル化を介して行われる（WSSA、2002）。

時間とともに、2,4-Dに曝露された（challenged）特定の微生物集団は、この生体異物を分解する代替経路を発達させ、その結果、2,4-Dが完全に鉱化（mineralization）される。除草剤の連続的な散布は、成長のための炭素およびエネルギー源として除草剤を利用することができる微生物を選択し、それらに土壌での競争上の優位性を与える。このような理由から、現在処方されている2,4-Dは比較的短い土壌半減期を有し、その後の作物への有意な持ち越し効果（carryover effects）はない。

2,4-Dを分解する能力について広範囲に研究されている生物の1つがユートロファ（Ralstonia eutropha）である（Streberら、1987; Analysis, cloning, and high-level expression of 2,4-dichlorophenixyacetic monooxygenase gene tfdA of Alcaligenes eutrophus JMP134.(アルカリゲネスユートロファスJMP134の2,4-ジクロロフェノキシ酢酸モノオキシゲナーゼ遺伝子tfdAの分析、クローニング、および高レベルの発現。) J.Bacteriol. 169:2950-2955）。鉱化経路の初期段階で酵素をコードする遺伝子はtfdAである。米国特許第6153401号及びGenBank AccM16730号を参照。TfdA遺伝子産物は、α-ケトグルタル酸依存型ジオキシゲナーゼ反応を介して2,4-Dのジクロロフェノール（DCP）への変換を触媒する（Smejkalら; 2001. Substrate specificity of chlorophenoxyalkanoic acid-degrading bacteria is not dependent upon phylogenetically related tfdA gene types.(クロロフェノキシアルカン酸分解菌の基質特異性は系統発生的に関連するtfdA遺伝子型に依存していない。) Biol. Fertil. Sols 33:507-513）。DCPは,2,4-Dに比べてほとんど除草活性を有していない。TfdAは、綿およびタバコ（これらは2,4-Dに対して元々敏感である）などの双子葉植物において2,4-D耐性を付与するためにトランスジェニック植物で使用されてきた（Streberら;1989. Transgenic tobacco plants expressing a bacterial detoxifying enzyme are resistant to 2,4-D.(細菌の解毒酵素を発現するトランスジェニックタバコ植物は2,4-Dに対して耐性である。) Bio/Technology 7:811-816）、および米国特許第5608147号）。

2,4-Dを分解することができる酵素をコードする多数のtfdA型遺伝子は、土壌細菌から単離されており、それらの配列はGenBankデータベースに寄託されている。tfdAの多くのホモログ（>85％のアミノ酸同一性）は、tfdAに似た酵素化学的性質を有する。しかし、tfdAに対する有意に低い同一性（25-50％）を有するがなおα-ケトグルタル酸ジオキシゲナーゼのFe^＋2ジオキシゲナーゼに関連した特徴的残基を有するホモログが多数存在する。したがって、これらの発散的なジオキシゲナーゼの基質特異性が何であるかは明白ではない。

tfdAに対して低い相同性（31％のアミノ酸同一性）を有する一つの独特な例は、デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）由来のsdpAである（Kohler, HPE 1999; Delftia acidovorans MH：a versatile phenoxyalkanoic acid herbicide degrader; J. Microbiol and Biotech:336-340. Westendorf, et al.; 2002. The two enantiospecific dichlorprop/a-ketoglutarate-dioxygenases from Delftia acidovorans MC1-protein and sequence data of Rdpa and SdpA. Bicrobiol. Res. 157:317-22）。この酵素は、（S）-ジクロルプロップ（および他の（S）-フェノキシプロピオン酸）)および2,4-D（フェノキシ酢酸）の鉱化（Westendorfet et al.; 2003. Purification and characterization of the enantiospecific dioxygenases from Delftia acidovorans MC1 initiating the degradation of phenoxypropionates and phenocyacetate herbicides. Acta Biotechnol. 23：3-17）の最初のステップを触媒することが示されている。

Delftia acidovoransから単離された酵素を本来コードする、植物のコドン最適化アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ遺伝子であるAAD-12は、本明細書中で参考として援用するWO2007/053482において初めて除草剤耐性形質としての使用について記載された。その形質は、2,4-Dおよびピリジルオキシアセテート除草剤に対する耐性を付与する。AAD-12遺伝子を有する形質転換された大豆の最初の報告は、本明細書中で参考として援用された米国仮特許出願番号61/263950にてなされた。

植えるための種子製品の組換えDNA形質を開発し販売する会社は、厳格な製品管理計画を策定し、実施し、そしてそれに固執する。これらの管理計画は、形質の形質移入および種子生産活動を追跡するために組換え形質の有効な定量的および定性的タンパク質検出法の使用、ならびに穀物収穫の監視を必要とする。これらの検出方法はGLPおよび非GLP条件下での使用のために十分に容易かつ堅牢でなければならない。またこれらの方法はフィールドの農民、サイロにおける穀物ディーラー、国境での税関当局によって簡単に採用されるほどユーザーフレンドリーでなければならない。そのため、堅牢で高品質、ユーザーフレンドリーなタンパク質検出法および市販のキットは、有用かつ必要である。

イムノアッセイは、当技術分野で周知であるが、研究室およびフィールドの両方の設定で植物組織の配列内の特定の遺伝子産物を再現性よく検出することができる堅牢で高品質の有効なELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）法を開発することは、些細でもルーチンでもない。さらにより挑戦的であるのは、AAD-12トランスジェニックイベントを検出するためのラテラルフローストリップELISA（lateral flow strip ELISA）の開発に特に適している抗体のペアを見つけることである。

米国特許第5608147号

WSSA，2002；Herbicide Handbook 8th edition; Weed Science Society of America, Lawrence. KS pp.492. Streber et al., 1987 J.Bacteriol. 169:2950-2955. Smejkal et al., 2001 Biol. Fertil. Sols 33:507-513. Streber et al., 1989 Bio/Technology 7:811-816. Kohler, HPE 1999 J. Microbiol and Biotech:336-340. Westendorf, et al., 2002 Bicrobiol. Res. 157:317-22. Westendorfet et al., 2003 Acta Biotechnol. 23：3-17.

本発明は、一群の（a panel of）モノクローナル抗体（mAb）およびそれを産生するハイブリドーマ細胞株を提供する。その細胞株は、ブダペスト条約の条項に従って、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された。これらのmAbは、意外にも、様々な植物や植物組織におけるAAD-12トランスジェニックイベント遺伝子産物を検出するのに適している。本発明はさらに、本発明の免疫グロブリンを用いた定量的および定性的な免疫アッセイを提供する。

詳細な説明
本発明は、AAD-12と反応する抗体およびｍAbを産生するハイブリドーマを包含する。下記の表は、ハイブリドーマ系統の名称とそれに対応するATCC寄託の名称を示している。

本発明はまた、AAD-12を単離または検出するためにmAbを使用する方法を含み、この方法は、a）表面上に該抗体を固定化する工程、b）固定化した抗体をAAD-12を含有する混合物と接触させる工程、c）AAD-12に結合した固定化した抗体を混合物から分離する工程、およびd）固定化した抗体から抗体が結合したAAD-12を除去することによってAAD-12を回収する工程を含む。

本発明はまた、生物学的サンプル中のAAD-12の存在を識別するために本発明の抗体を用いる方法を含み、この方法は以下を含む：a）アッセイ表面上に該抗体を固定化する工程、b）アッセイ表面をAAD-12を含む疑いのある液体と接触させ、適切な溶液でアッセイ表面を洗浄する工程、c）アッセイ表面をレポート基で標識した抗-AAD-12抗体と接触させ、適切な溶液でアッセイ表面を洗浄する工程、d）レポート基の存在を検出する工程。

本発明はさらに、トランスジェニック植物、特に大豆と綿植物で発現されるAAD-12酵素の定量分析法を含む。AAD-12タンパク質は、PBS（リン酸緩衝生理食塩水）溶液で大豆サンプルから抽出される。抽出液を遠心分離し、水性の上清を回収し、希釈される。希釈されたサンプルのアリコートを、サンドイッチELISAフォーマットにおいて抗AAD-12ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体でコーティングされたプレートのウェル中で酵素結合抗AAD-12モノクローナル抗体とともにインキュベートする。サンドイッチのペアの両方の抗体がサンプル中のAAD-12タンパク質を捕捉する。インキュベーション期間の終了時に、結合されていない試薬はPBSで洗浄することにより、プレートから除去される。AAD-12の存在は、酵素基質と酵素複合体をインキュベートし、着色された生成物を生成することにより検出される。AAD-12を抗体サンドイッチに結合しているので、発色のレベルは、サンプル中のAAD-12の濃度に比例する（すなわち、より低いタンパク質濃度はより低い発色をもたらす）。450 nmの吸光度から基準波長（例えば650nmのような）の吸光度を差し引いたものが、プレートリーダーを用いて測定される。標準曲線は二次回帰式を用いて7標準濃度から推定される。このAAD-12 ELISAは、植物組織サンプル抽出物中のAAD-12の定量のために十分特異的かつ高感度である。加えて、本発明の抗体は、標準的なウェスタンブロッティングの手順を使用してAAD-12の存在を確認するために用いることができる。

目的のタンパク質に対する抗体の調製は、当該分野において周知である。 GalfreおよびMilstein、Methods in Enzymology, Vol.73, Academic Press, New York（1981）;James W. Goding, Monoclonal Antibodies：Principles and Practice, Academic Press, Orland, Florida (1986）;Current Protocols in Molecular Biolopy, F.M. Ausubelら, 編, Wiley Interscience, New York,（1987）を参照。

目的のタンパク質と反応する抗体を調製するために、タンパク質は最初に濃縮または精製されなければならない。比較的粗製のタンパク質の抗原製剤は、予防接種の目的に使用することができる。しかし、高度に精製されたタンパク質が、ハイブリドーマが要求されているモノクローナル抗体を産生しているかを正確に決定するために、または免疫血清の抗体価を測定するために必要である。

一旦AAD-12が隔離されたら、AAD-12に特異的な抗体は、当技術分野で周知の従来の方法によって惹起させることができる。数週間または数ヶ月の期間にわたる選択した宿主への反復注射により免疫応答が誘発され、有意な抗AAD-12血清抗体価が得られる。好ましい宿主は哺乳動物種であり、より高度に好ましい種はウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウスである。そのような免疫された動物から採取された血液は、AAD-12と反応する抗血清（ポリクローナル抗体）を得るために確立された方法により処理されてもよい。次いで、抗血清は、当技術分野で公知の技術に従って、AAD-12に吸着させてアフィニティー精製することができる。アフィニティー精製した抗血清は、さらに、当技術分野で知られている手順を使用して抗血清中の免疫グロブリン画分を単離することにより精製することができる。得られる材料は、AAD-12と反応する免疫グロブリンの不均一な集団である。

抗AAD-12 mAbは、精製AAD-12を用いて容易に調製される。モノクローナル抗体を産生するための方法は、数十年の間に実施されてきており、当業者に周知である。アジュバント中のAAD-12の反復腹腔内または皮下注射は、ほとんどの動物、特にマウスにおいて免疫応答を惹起する。高度免疫（hyperimmunized）Bリンパ球を動物から取り出し、無期限に培養することができる適切な融合パートナー細胞株と融合させる。多数の哺乳動物細胞株は、ハイブリドーマの産生に適した融合パートナーである。多くのそのような株は、ATCCおよび業者から市販されている。

一旦融合されると、得られたハイブリドーマは、1〜2週間、選択増殖培地で培養される。2つの周知の選択システムが、混合ハイブリドーマ培養物から未融合のミエローマ細胞または骨髄腫細胞間での融合物を排除するための利用可能である。選択システムの選択は、免疫したマウスの系統および使用した骨髄腫融合パートナーに依存する。TaggartおよびSamloff, Science 219, 1228 (1982)によって記載されたAAT選択システムが使用され得る。しかし、マウスの細胞と融合パートナーとの互換性からHAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択システム（Littlefield, Science 145、709（1964）によって記載された）が好ましい。

使用済成長培地は、その後免疫モノクローナル抗体の分泌についてスクリーニングされる。酵素結合免疫吸着検定手順は、この目的に最も適している。しかし、大容量のスクリーニングに適応した放射免疫アッセイでも許容可能である。かなり多数の無関係であまり望まれていない培養物を連続的に削減するように設計されたマルチプルスクリーニングが、小割合の本発明のmAbを単離するために実行される必要がある。AAD-12と反応するモノクローナル抗体を分泌する培養が、市販のアッセイを用いてイソタイプされた。

求められている抗AAD-12モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ培養物は、モノクローン性と安定性を確立するために数回サブクローニングされるべきである。真核生物、非接着細胞培養のサブクローニングのための周知の方法には、限界希釈法、軟寒天、蛍光活性化セルソーティング技術が含まれる。各サブクローニング後、得られた培養物を、安定した抗体を分泌する培養物が確立されたことを確実にするために抗体分泌及びアイソタイプについて再測定しなければならない。

本発明の抗AAD-12抗体は、抗体結合部位の一部が露出し、AAD-12に結合しうるように表面に固定化することができる。固定化抗体のための幅広い種類のスキームが、過去数十年にわたって開発されてきた。固定化は、所望の表面に直接抗体を共有結合させることによって、または表面に抗体を架橋することによって達成することができる。

セファロース（登録商標）（ファルマシア、Pistcataway、ニュージャージー州）のような多糖類ベースのビーズへの抗体のCNBrおよびカルボジイミド結合は、本発明と整合する直接結合方式の例である。直接結合は一般的に任意の特定の方法で抗体を方向付けることはないが、いくつかの種類の直接結合が抗体を再現可能に固定化物質に方向付けることができる。

好ましいカップリング方式は、その抗原結合領域が露出したままであるように抗体を方向付ける。そのようなスキームの一つは、抗体の重鎖に見出される天然糖質を利用している。まず炭水化物部分を対応するアルデヒドに酸化し、次にアルデヒドを表面の第一級アミノ基と反応させることによって、有利な方向に抗体を連結することが可能である。

多くの種類の架橋が可能であり、固定化物質に対して抗体を共有結合で結合する小有機リンカーが含まれる。このようなスペーサーアームは許容可能であり、好ましくは、ブリッジが形成された後はタンパク質と相互作用するべきではない。

上記の説明は、本発明の範囲を限定することを意味することは一切ない。固定化物質に対して抗体を連結させるための多数の他の周知の方式は本発明と整合している。

レポート基で標識された抗体が様々な環境において抗原の存在を識別するために使用できることが周知である。放射性同位元素で標識された抗体は、高い精度と感度で、様々な生物学的流体中の抗原の存在を識別するために、放射免疫アッセイで数十年にわたって使用されている。さらに最近では、酵素標識抗体は、一般的なELISAにおける放射性標識された抗体の代替物として使用されてきた。

本発明の抗体は、ポリスチレンのウェルまたは粒子のような固定化物質に結合され得、AAD-12が試験サンプル中に存在するかどうかを判断するためにイムノアッセイにおいて使用することができる。本発明のこの実施形態では、サンプルは、免疫親和性表面と接触させ、インキュベートする。洗浄工程の後、免疫親和性表面に結合している任意のAAD-12が、レポート基で標識された本発明の別の抗体を表面に接触させることによって検出される。

本発明の抗体およびアッセイ法とラテラルフローストリップ（lateral flow strips）またはイムノクロマトストリップ(Immunochromatograhic strips)の使用は、本発明と整合性がある。ラテラルフローアッセイは、当該分野で周知である。例えば、米国特許第6485982号を参照。この態様では、ラテラルフロー試験は、AAD-12単独で、または他の検体と同時に、定性的または半定量的検出に用いることができる。ラテラルフロー試験は、本明細書に記載された全ての試験の形式を使用する最も簡単な方法であり、植物材料が迅速に溶液中に抽出され、ラテラルフローストリップ上で試験される現場の設定で特に有用である。この態様では、液体サンプル中にラテラルフローストリップを配置するか、またはラテラルフローストリップに液体サンプルを適用し、所定時間後に結果を読み取ることが必要なだけである。全てのラテラルフロー試験は、試験結果を検証するために使用される手続対照ラインまたは試料対照ラインのいずれかを組み込む必要がある。したがって、2つのラインが現れれば、肯定的な結果を示し、一方有効な陰性試験は、対照ラインを生成するのみである。試験ラインのみが表示された場合、またはラインが表示されない場合、それは無効である。

典型的なラテラルフロー試験ストリップは、4つの主要コンポーネント、すなわち、試験サンプルが適用されるサンプルパッド、着色粒子（典型的に金コロイド粒子、またはラテックスマイクロスフェア）に結合した本発明の抗体を含んだコンジュゲートパッド、本発明の異なる抗体が捕捉ゾーンまたは試験ラインとして膜を横切るラインに固定化された疎水性のニトロセルロース又は酢酸セルロース膜などのような反応膜、および毛細管現象により反応膜を横切ってサンプルを吸引するように設計された廃液リザーバで構成される。

ラテラルフローストリップのコンポーネントは、通常、不活性バッキング材に固定されており、シンプルなディップスティック形式またはサンプルポートと捕捉および制御ゾーンを示す反応窓が付いているプラスチックケースの中に提示されてもよい。アッセイの実施形態の他の態様では、AAD-12を含む疑いのある試験サンプルを表面上で乾燥させ、固定化した試験サンプルを形成する。次いで、本発明の標識抗体を固定化した試験サンプルと接触させ、インキュベートする。サンプルはAAD-12が含まれている場合は、標識された抗体は、固定化されたAAD-12に結合する。また、この方法は、本発明の非標識抗体、続いて、すでにAAD-12に結合した本発明の抗体に結合する標識二次抗体を用いて、行うことができる。洗浄した後、固定化された試験サンプルは、任意のレポート基の存在を検出するために測定される。

レポート基は、典型的には、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはβ-D-ガラクトシダーゼなどの酵素である。適切な基質は、酵素と反応したときに色の変化を生じる。そうすることで、色の強度の測定が、分光光度計を用いて定量化されうる。レポート基が放射性同位体である場合には、適切なガンマまたはベータ線検出機器が、レポート基を定量するために使用されうる。レポート基の強度が、試験サンプルにおけるAAD-12の量と直接相関関係がある。

以下の実施例は、本発明を実施する方法を記述するための助けになり、本発明の抗-AAD-12抗体およびアッセイの特徴を説明する。

実施例1
免疫原の調製
添加安定剤を含むPBST（リン酸緩衝生理食塩水（0.05％Tween20を含む），pH7.4）ベースの緩衝液中で、トランスジェニック大豆から取り出した凍結乾燥葉組織からAAD-12タンパク質を抽出し、可溶性タンパク質を遠心分離後の上清中に回収した。上清を濾過し、可溶性タンパク質をフェニルセファローズ（Phenyl Sepharose（登録商標））（PS）ビーズ（GEヘルスケア）に結合させた。１時間のインキュベーション後、PSビーズをPBSTで洗浄し、結合したタンパク質をMilli-Q^TM水で溶出した。塩化ナトリウムを導電性を高めるために添加し、PS精製タンパク質をシュードモナス・フルオレッセンスで産生された組換えAAD-12に対して惹起された抗AAD-12特異的ポリクローナル抗体に結合された抗AAD-12イムノアフィニティーカラムにロードした。非結合タンパク質をカラムから収集し、カラムをあらかじめ冷却したPBS（リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4）で十分に洗浄した。結合したタンパク質を、3.5MのNaSCN、50mMトリス（登録商標）、pH8.0の緩衝液でカラムから溶出した。微生物由来AAD-12及び大豆由来AAD-12を、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット法で調べた。

微生物由来AAD-12では、主要なタンパク質のバンドは、クマシー染色したSDS-PAGEゲル上で可視化したところ、約32 kDaであった。予想通りに、対応する植物由来AAD-12タンパク質のサイズは微生物由来のタンパク質と同一であった。予想通りに、植物精製した画分は、AAD-12タンパク質に加えて、非免疫反応性不純物を少量含んでいた。共精製されたタンパク質は、おそらくカラムマトリックスとの弱い相互作用によってカラムに保持されていた。

微生物由来AAD-12および植物由来の抽出物は、抗-AAD-12ポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット上で予想された大きさの陽性のシグナルを示した。AAD-12ウェスタンブロット解析では、免疫反応性タンパク質は陰性対照（ネイティブ大豆）抽出物には全く観察されず、代替の大きさのタンパク質（凝集や分解産物）はトランスジェニック植物由来のサンプルで見られなかった。

実施例2
ハイブリドーマの調製
マウスを精製AAD-12で免疫化し、標準的な融合技術を使用して、抗AAD-12モノクローナル抗体を発現する一群のハイブリドーマを調製した。消費した組織培養培地のサンプルをハイブリドーマ培養を含む各ウェルから無菌的に取り出して、次の抗体捕捉ELISA法を用いてAAD-12反応性についてアッセイした。マイクロタイターウェルを精製AAD-12の1〜10g/mLの溶液でコーティングした。ウェルを洗浄し、使用済みの組織培養培地のサンプルをウェル内に配置し、インキュベートした。ウェルを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗血清を添加し、インキュベートした。プレートを洗浄した後、呈色反応を発生させるために基質を添加し、プレートのOD（光学密度）を読んだ。高いOD値を有するウェルを、ハイブリドーマを含む培養ウェルにマップした。培養を拡大するにつれ増殖安定性及び抗体産生を確保するために、AAD-12抗体陽性培養を抗体産生について継続的にスクリーニングした。限界希釈クローニングのいくつかのラウンドを、各培養物の真のモノクローン性を確立するために行った。抗体陽性クローンについてのさらなるアッセイを実施して、植物材料とともに現場使用するための本発明の定量的検出方法に使用するために各抗体の適合性を判断した。

実施例3
定量ELISA
この実施例は、本発明の抗体および方法を用いる、ダイズ組織におけるAAD-12を定量的に測定するための方法である。キャリブレーション標準曲線定量範囲は、緩衝液中0.25 ng/mlから10 ng/mLである。R3段階での大豆の種子、葉（V5とV10）、根、および飼料におけるAAD-12タンパク質レベルは、1.0 ng/mgの定量限界（LOQ）および0.5 ng/mgの検出限界（LOD）を用いて測定することができる。

試験物質は、AAD-12タンパク質および様々なマーベリックの（Maverick）非トランスジェニック対照大豆を発現するように遺伝的に改変された代表的な大豆の組織サンプルであった。以下にリストされている組織は、温室から収集された。

本研究で用いた以下の基準物質は、校正標準としておよびELISA分析における強化材料（fortification material）として使用された精製AAD-12タンパク質、精製AAD-12タンパク質、ならびに交差反応試験するために使用された精製AAD-12タンパク質であった。

全ての試験物質および基準物質は温度監視冷凍庫に格納され、サンプル調製及び分析のためにのみ取り出された。簡単に言えば、AAD-12タンパク質を、0.75％卵白アルブミン（OVA）を含むPBST（Tween（登録商標）20 0.05％を含むリン酸緩衝生理食塩水）緩衝液（PBST/OVA）を用いて、大豆サンプル（V5、V10、飼料、および根）から抽出した。AAD-12タンパク質を、0.05％Tween（登録商標）20（PBST）および0.1％トリトンX-100^TMを含むPBS溶液で大豆の種子から抽出した。抽出液を遠心分離し、水性上清を回収し、希釈して、特定のAAD-12 ELISAを用いてアッセイした。希釈されたサンプルのアリコートを、サンドイッチELISAフォーマットで、抗AAD-12ポリクローナル抗体をコーティングしたプレートのウェル中で酵素標識抗AAD-12モノクローナル539B470.2抗体と共にインキュベートした。サンドイッチのペアの両方の抗体がサンプル中にAAD-12を捕獲した。インキュベーション期間の終了時に、結合していない試薬をPBSTで洗浄することにより、プレートから除去した。AAD-12の存在は、抗体に結合した酵素複合体を酵素基質とともにインキュベートし、着色された生成物を生成することにより検出された。AAD-12は抗体サンドイッチにバインドされているので、発色のレベルは、サンプル中のAAD-12の濃度に比例していた（すなわち、より低いタンパク質濃度はより低い発色を生じる）。発色反応を、酸性溶液を加えて停止させ、プレートリーダーを用いて450nmの吸光度から650nmの吸光度を差し引いたものを測定した。標準曲線は、0.990の決定係数とともに二次回帰式を用いて7つの標準濃度から推定した。このAAD-12 ELISAは、AAD-12タンパク質の定量に対して高度に特異的であった。

実施例4
アッセイの妥当性検証
方法のための予備的定量範囲を、方法の開発と事前検証試験中に独立して確立した。標準濃度が所定の濃度点についての最低平均パーセント誤差を提供した。各組織におけるAAD-12測定のための検出限界（LOD）および定量限界（LOQ）は、標準曲線を構成するアッセイパラメータ（吸光度、バックグランド、および直線範囲）、マトリックス干渉、および/または投与量に基づいて経験的に定義された。それらはまた、キースら（Keith et al.）の方法（Keith, L.H., Crummett, W.、Deegan, J.,Jr., Libby, R.A., Taylor, J.K., Wentler, G. 1983. Principles of Environmental analysis, Anal. Chem., 55, 2210-2218）に従った統計的アプローチによって、および5 ng/mL（0.5 ng/mg）のAAD-12タンパク質で強化した（fortified）各対照サンプルを試験することによって支持されていた。

このAAD-12 ELISAの非標的タンパク質であるCry1F、Cry1Ac、Cry34Ab1、Cry35Ab1、PAT、およびAAD-1に対する交差反応性をこの研究で試験した。これらのタンパク質は、PBST/OVA中、1μg/mLおよび10μg/mLの濃度で調製した。同じプレート上で、AAD-12標準曲線を基準として生成した。非標的タンパク質のOD応答をAAD-12標準曲線から補間し、パーセント交差反応性を以下の式、
％交差反応性= 100×（AAD-12 STD曲線による測定濃度/標的タンパク質の理論濃度）
を用いて算出した。

陰性対照の各ダイズ組織（1×、5×および10×希釈）用のサンプル抽出物（マトリックス）は、異なる濃度でスパイクし、標準曲線を作成した。マトリックススパイク標準曲線を同じプレート上で実行する非スパイク標準曲線から補間した。各標準濃度レベルについて観測平均値（マトリックススパイク標準濃度を補間するために使用される非スパイク標準曲線）と理論平均値（マトリックススパイク標準曲線の濃度）との間に15％以上の差があれば、潜在的なマトリックス効果を表すと考えられた。

一連の５回の抽出を、AAD-12を発現することが知られている遺伝子組換え大豆の組織で行った。簡単に説明すると、緩衝液1.5mLを組織サンプル（15 mg）に加えて、上記のように抽出した。抽出及び遠心分離後、抽出液をピペットで除去した。最初の抽出後は、緩衝液200μLのアリコートを添加し、サンプルを混合し、遠心分離し、上清を除去し、最初の抽出液に加えた。緩衝液の別の1.5 mLを組織に加え、抽出プロセスを繰り返した。この手順を、5つの連続した抽出を得るためにさらに3回繰り返した。各抽出におけるAAD-12の濃度をAAD-12 ELISA法を用いて決定した。少なくとも5回の反復を、各組織サンプルについて検討した。組織の抽出プロセスの見かけの効率を5つ全ての抽出物中での総AAD-12タンパク質に対する最初の抽出物中のAAD-12タンパク質の比較によって決定した。

本方法の精度を、低レベル（0.5 ng/mgのDW）、中間レベル（1, 4 ng/mgでDW）、および高レベル（8 ng/mgのDW）のAAD-12タンパク質でスパイクした陰性対照マトリックスからのAAD-12タンパク質の回収率を測定することにより決定した。各濃度について最低でも5反復を分析した。アッセイの精度を回収パーセントとして示した。67から120パーセントの間の回収率を許容可能と考えた。

本方法の精度を、複数の日に2人のアナリストが分析した強化された大豆の対照サンプルの結果を用いて決定した。対照サンプル抽出物をAAD-12標準の3つのレベル（0.25 ng/mg、0.5 ng/mg、4 ng/mg、および8 ng/mg）で強化した。強化された抽出物の各レベルは、各ELISAプレートに三連で実行された。平均回収濃度、標準偏差（STDEV）、及び偏差の％係数（％CV）を、サンプルのそれぞれについて計算した。

陽性サンプル（V5の葉および飼料（植物全体））も同様に精度について試験した。平均予測濃度、標準偏差（STDEV）、及び偏差のパーセント係数（％CV）を、各サンプルについて計算した。日内及び日間精度を計算した。

この実験の目的は、AAD-12タンパク質標準および植物抽出物中のAAD-12タンパク質が、ELISAにおいて同様の全体的反応を示すことを確認することだった。これは、標準曲線の定量範囲から補間されたシングル抽出物の希釈からの結果が一致するかどうかを評価することによって、全てのトランスジェニック組織について行われた。全ての定量希釈からの補間結果の変動係数を、各組織の種類について計算した。

種子、葉、飼料（植物全体）および根の組織を、偽陽性と偽陰性の発生について試験した。強化していない15個の対照サンプルと0.25 ng/mgで強化した15個のサンプルを、偽陽性と偽陰性率を決定するために、各組織について分析した。分析対象成分を含まないことが知られているサンプルで、確立されたLODまたはLODより上の残留物が発見された場合、偽陽性の結果が発生する。残渣がLODで強化したサンプル中に検出されない場合に偽陰性が発生する。

ELISAの測定値はSOFTmax PROソフトウェアプログラムを使用して分子動力マイクロプレートリーダー（Molecular Dynamics Microplate Reader）で記録した。濃度のデータは、平均、パーセント誤差、統計的平均値、標準偏差、および％CVの計算のためにSAS、JMPまたはMicrosoft Excelに移した。

イムノアッセイの検出制限（LOD）が、ゼロ検体サンプルの応答からの統計的に有意な差を有する応答を与える検体濃度として定義されている。定量限界（LOQ）、またはアッセイの動作範囲は、許容可能な精度で一般的に決定することができる最高値と最低濃度として定義されている。本研究では、各組織におけるAAD-12の決定のための標的LODおよびLOQは、アッセイパラメータ（例えば、吸光度、バックグランド、信号対ノイズ比、および直線性の範囲など）、マトリックス干渉、および標準曲線の濃度に基づいて、経験的に定義された。LODおよびLOQはまた、標準的な統計的アプローチにより決定した。確立されたガイドラインに従って、LODおよびLOQを0.5 ng/mgの回収の結果から標準偏差を用いて計算した。LOQを標準偏差の10倍（10S）として計算し、LODをマトリックスあたり5個のサンプルの最小の分析結果の標準偏差の3倍（3S）として算出した。各組織の計算結果ならびに標的LODおよびLOQを以下の表にまとめる。

標的LODは全て大豆マトリックスについて0.5 ng/mgである。標的LOQは全ての大豆マトリックスについて1.0 ng/mgである。

Cry1F、Cry1Ac、Cry34Ab1、Cry35Ab1、PAT、およびAAD-1のようないくつかの関連タンパク質を、交差反応性について試験した。交差反応性は、これらのタンパク質について試験された濃度（10,000 ng/mL）では観察されなかった。

マトリックス試験の結果を次の表にまとめる。

"はい"は、全7個の標準濃度レベルの観測値と理論値との平均誤差率が15％より大きいとき、標準曲線がマトリックスの影響を受けていることを表す。"いいえ"は、マトリックス効果がないか、または全7個の標準濃度レベルの観測値と理論値との平均誤差率が15％未満であることを表す。

7個の標準濃度レベルのいずれかの観測値と理論平均値との間の15％より大きい差がマトリックス効果を示すと考えられた。マトリックス効果は、1×スパイクマトリクスレベルで根では認められなかった。マトリックス効果は、V5葉、V10葉、飼料（植物全体）のスパイクマトリクスレベルの5倍のレベルにおいて見出されなかった。しかし、マトリックス効果は5倍のレベルで種において見出された。ダイズ組織におけるAAD-12の定量のためには、少なくとも2倍希釈液が根について推奨され、少なくとも5倍希釈液がV5葉、V10葉および飼料用に推奨され、少なくとも10倍希釈液が種について推奨される。

サンプル中の総AAD-12タンパク質レベルの決定は、抽出効率を調べるために重要である。陽性サンプルを抽出緩衝液で5回連続して抽出し、各抽出物中のAAD-12タンパク質濃度をELISA法で測定した。見かけの抽出効率は全て5つの抽出においてAAD-12の合計量に対する最初の抽出におけるAAD-12タンパク質の量に基づいていた。大豆組織からのAAD-12タンパク質の抽出効率を下表に示す。

飼料（植物全体）、根、種子、V5の葉、およびV10葉の抽出効率は、85.8〜97.2％であった。

標準曲線のLOQ、中、高ポイントに等しいレベルで強化した場合の全ての組織からのAAD-12の平均回収レベルを以下の表に示す。

LOQレベルまたはそれ以上でスパイクした場合、V5葉、V10葉、および種子は、平均回収が67〜120％仕様の範囲内で67〜100％、および16％あるいはそれ以下の分散のパーセント係数（％CV）であった。

アッセイの精度と耐久性を、AAD-12タンパク質の4つのレベルが含まれているV5葉および飼料（植物全体）抽出物を用いて調べた。レベルは8 ng/mg、4 ng/mg、0.5 ng/mg、および0.25 ng/mgであった。アッセイの日内精度は、8、4、0.05、および0.25 ng/mgで強化されたV5葉抽出についてそれぞれ、6.3％、10.8％、9.6％、および15.0％より小さいか、それと同等であった。アッセイの日内精度は、8、4、0.5、および0.25 ng/mgで強化された飼料（植物全体）抽出物についてそれぞれ、3.5％、13.1％、10.1％、および10.9％より小さいか、それと同等であった。陽性V5葉および飼料のサンプルを、アッセイの堅牢性についても試験した。アッセイの日内精度は、V5葉および植物全体についてそれぞれ、9.7％および19.7％より小さいか、それと同等であった。

全ての日およびアナリストにわたるアッセイ間精度は、8、4、0.5、および0.25 ng/mgで強化されたV5葉抽出物についてそれぞれ、4.6％、10.1％、6.4％、および12.9％であった。全ての日およびアナリストにわたるアッセイ間精度は、8、4、0.5、および0.25 ng/mgで強化された飼料抽出物についてそれぞれ、6.0％、10.5％、6.4％、および10.1％であった。全ての日およびアナリストにわたるアッセイ間耐久性は、陽性V5葉および飼料についてそれぞれ、11.3％、および14.1％であった。

AAD-12 ELISAでの標準および試験物質の応答の等価性は、AAD-12陽性の組織からの抽出物の8連続希釈までを使用して実証した。各組織抽出物について、希釈液の5つ以上が標準曲線の定量範囲内に入り、定量結果の％CVは20％未満であった。

強化されていない対照サンプル（マトリックスブランク）および0.25 ng/mgで強化したサンプル（LOD = 0.5 ng/mg）を、偽陽性および偽陰性率を決定するために分析した。本研究で分析した強化されていない対照サンプルからの偽陽性およびLODで強化されたサンプルから報告された偽陰性はなかった。

要約すると、本方法は1.0〜8.0 ng/mgの乾燥重量（DW）の濃度範囲にわたって検証され、1.0 ng/mg DWの全て大豆組織において有効定量限界（LOQ）、および0.5 ng/mg DWの全ての大豆組織中において検出限界（LOD）を有していた。AAD-12タンパク質は、全ての組織から許容可能なレベルで回収された。以前の研究で試験された非標的タンパク質と比較した場合、有効アッセイは、AAD-12タンパク質に特異的である。ダイズ組織におけるAAD-12タンパク質の定量のために、2倍以上の希釈が根について推奨され、5倍以上の希釈がV5葉、V10葉、および飼料用に推奨され、10倍以上の希釈液が種について推奨される。さらに、AAD-12タンパク質が効率的に全ての大豆組織から抽出された。アッセイは許容可能な精度（accuracy）と精密度（precision）を有することが示され、偽陽性や偽陰性の結果は標的LOD未満では見られなかった。このAAD-12 ELISA法は、大豆組織におけるAAD-12タンパク質の定量的な測定に適していることが実証された。

Claims (15)

1. 539B181.2、539B470.2、539B489.2、539B304.2、および539B478.2からなる抗体の群から選択されるアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ酵素（AAD-12）に特異的に結合するモノクローナル抗体。
2. 539B181.2の名称を有するハイブリドーマによって産生される、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
3. 539B470.2の名称を有するハイブリドーマによって産生される、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
4. 539B498.2の名称を有するハイブリドーマによって産生される、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
5. 539B304.2の名称を有するハイブリドーマによって産生される、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
6. 539B478.2の名称を有するハイブリドーマによって産生される、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
7. PTA-10919、PTA-10920、PTA-10921、PTA-10922、およびPTA-10923からなる群から選択されるアクセッション番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に寄託されている、請求項1に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
8. ATCCアクセッション番号PTA-10919の下に寄託されている、請求項7に記載のハイブリドーマ。
9. ATCCアクセッション番号PTA-10920の下に寄託されている、請求項7に記載のハイブリドーマ。
10. ATCCアクセッション番号PTA-10921の下に寄託されている、請求項7に記載のハイブリドーマ。
11. ATCCアクセッション番号PTA-10922の下に寄託されている、請求項7に記載のハイブリドーマ。
12. ATCCアクセッション番号PTA-10923の下に寄託されている、請求項7に記載のハイブリドーマ。
13. AAD-12酵素の存在を同定するための方法であって：
    ａ）請求項１に記載の第１のモノクローナル抗体をアッセイ表面に固定化し、次いで該アッセイ表面を洗浄する工程、
    ｂ）前記アッセイ表面を、AAD-12を含む疑いのある液体と結合を可能にするのに十分な時間接触させた後、該アッセイ表面を洗浄する工程;
    ｃ）前記アッセイ表面をレポート基と結合した請求項１に記載の異なる二次抗体と、該第２の結合体化モノクローナル抗体との結合を可能にするのに十分な時間接触させた後、該アッセイ表面を洗浄する工程；および
    ｄ）前記レポート基の有無を検出する工程
    を含む、方法。
14. AAD-12酵素の定量法であって：
    ａ）アッセイ表面にAAD-12抗血清を固定化する工程;
    ｂ）前記アッセイ表面をAAD-12を含む疑いのある液体と結合を可能にするのに十分な時間接触させた後、アッセイ表面を洗浄する工程;
    ｃ）前記アッセイ表面をレポート基と結合した請求項１に記載の異なる二次抗体と、前記第２の結合体モノクローナル抗体との結合を可能にするのに十分な時間接触させた後、該アッセイ表面を洗浄する工程、
    ｄ）標準曲線と比較することによって、前記レポート基の存在を定量する工程
    を含む方法。
15. 前記結合体モノクローナル抗体が539B470.2である、請求項１４に記載の方法。