KR20130069587A - 체액 유래 검체를 사용한 횡문근육종의 검출 방법 - Google Patents

체액 유래 검체를 사용한 횡문근육종의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 체액 유래의 검체에서, hsa-miR-1, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b 및 hsa-miR-206으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 miRNA의 발현을 평가하는 것을 특징으로 하는 횡문근육종의 검출 방법을 제공한다.

Description

체액 유래 검체를 사용한 횡문근육종의 검출 방법{METHOD OF DETECTING RHABDOMYOSARCOMA USING SAMPLE DERIVED FROM BODY FLUID}
본 발명은 체액 유래 검체를 사용한 횡문근육종의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 혈청 중의 종양 유래의 유리(遊離) DNA를 사용한 비(非)침습적 진단 기술의 개발에 몰두해 왔다(비특허문헌 1, 2). 최근, microRNA(miRNA)라고 하는 단백질로 번역되지 않는 비코드 RNA의 존재가 밝혀지고, 그 발현 프로파일은 조직이나 종양 특이적인 것이 보고되고 있다(비특허문헌 3, 4). 소아암에 있어서도 세포주를 사용한 검토에서, 발현 프로파일이 종양에 따라 상이하다고 하는 보고가 있다(비특허문헌 5). 또한, 소아암에서 가장 많은 연부육종(軟部肉腫)인 횡문근육종에서는, 근(筋)에 특이적으로 발현되는 miRNA의 발현이 상승하고 있음이 밝혀지고 있다(비특허문헌 5, 6). 한편, 혈청 중에 종양 유래의 miRNA가 존재하는 것도 밝혀져, 대장암, 림프종, 전립선암, 간암 등에서, miRNA의 바이오 마커로서의 유용성이 시사되고 있다(비특허문헌 7∼10).
Gotoh, et al. J Clin Oncol 23:5205-5210, 2005 Yagyu, et al. Clin Cancer Res 14:7011-7019, 2008 Calin GA, et al. Nat Rev Cancer; 6:857-866, 2006 Lu J, et al. Nature; 435:834-838, 2005 Wei JS, et al. Clin Cancer Res; 15:5560-5568, 2009 Subramanian S, et al. Oncogene; 27:2015-2026, 2008 Ng EKO, et al. Gut; 58:1375-1381, 2009 Mitchell PS, et al. PNAS; 105:10513-10518, 2008 Lawrie CH, et al. Br J Haematol; 141:672-675, 2008 Yamamoto Y, et al. Biomarkers; 14:529-538, 2009
본 발명은 진단이 곤란한 횡문근육종을 용이하게 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 소아 종양 환자의 체액 유래 검체에서, 근에 특이적으로 발현되는 miRNA군인 hsa-miR-1, 133a, 133b, 206을 정량하고, 횡문근육종의 비침습적인 진단이 가능한지에 대해서 검토를 행했다. 그 결과, 이들 miRNA에 의해 횡문근육종을 검출할 수 있음을 발견했다.
본 발명은 이하의 횡문근육종의 검출 방법을 제공하는 것이다.
<1> 체액 유래의 검체에서, hsa-miR-1, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b 및 hsa-miR-206으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 miRNA의 발현을 평가 하는 것을 특징으로 하는, 횡문근육종의 검출 방법.
<2> 체액 유래의 검체에서, hsa-miR-1, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b 및 hsa-miR-206으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 발현량이 정상인보다 유의하게 항진(亢進)하여 있음을 검출의 기준으로 하는 <1>에 기재된 횡문근육종의 검출 방법.
<3> hsa-miR-133a, hsa-miR-133b 및 hsa-miR-206으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 miRNA의 발현을 평가하는 것을 특징으로 하는 <1>에 기재된 횡문근육종의 검출 방법.
<4> 적어도 hsa-miR-206의 발현을 평가하는 것을 특징으로 하는, <1>에 기재된 횡문근육종의 검출 방법.
<5> 리얼 타임 PCR법에 의해 검출하는, <1>에 기재된 횡문근육종의 검출 방법.
<6> 체액이 혈액이며, 체액 유래의 검체가 혈장 또는 혈청인 <1>에 기재된 횡문근육종의 검출 방법.
횡문근육종은 진단이 어려운 종양의 하나이지만, 본 발명에 의하면, 종래 무리라고 생각되었던 체액 유래의 검체를 사용하여, 횡문근육종을 검출할 수 있게 되었다.
횡문근육종은, 화학 요법, 방사선 요법 전에 종양을 완전히 절제하는 것이 예후의 개선에 중요하며, 수술 전에 잠정 진단을 행하여 첫회에 완전 절제를 목표로 한 수술 방침을 결정할 수 있는 것이 중요하다. 본 발명에 의해 횡문근육종의 진단을 보다 정확하고 또한 신속하게 할 수 있게 되어, 횡문근육종의 치료 성적의 향상을 기대할 수 있다.
도 1은 횡문근육종 세포주이고, 근(筋)특이적 microRNA의 발현이 항진하여 있음을 나타낸다. 종축은 근특이적 miRNA와 hsa-miR-16의 비이다. RMS: 횡문근육종, NB: 신경아종, EWS: 유윙(Ewing)육종, MRT: 악성 횡문근양(橫紋筋樣) 종양.
도 2는 횡문근육종 종양 검체에서, 근특이적 microRNA의 발현이 항진하여 있음을 나타낸다. 종축은 근특이적 miRNA와 hsa-miR-16의 비이다. RMS: 횡문근육종, nonRMS: 횡문근육종 이외의 종양.
도 3은 hsa-miR-1, hsa-miR-206, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b의 횡문근육종 세포주의 배양 상청(上淸)의 발현량을 나타낸다. 종축은 근특이적 miRNA와 hsa-miR-16의 비이다. RMS: 횡문근육종, NB: 신경아종, EWS: 유윙육종, MRT: 악성 횡문근양 종양.
도 4는 정상인, 담암(擔癌) 환아, 횡문근육종(RMS) 환아의 혈청 hsa-miR-1의 비교. 종축은 hsa-miR-1／hsa-miR-16 비이다. RMS: 횡문근육종, nonRMS: 횡문근육종 이외의 종양.
도 5는 정상인, 담암 환아, 횡문근육종(RMS) 환아의 혈청 hsa-miR-133a의 비교. 종축은 hsa-miR-133a／hsa-miR-16 비이다. RMS: 횡문근육종, nonRMS: 횡문근육종 이외의 종양.
도 6은 정상인, 담암 환아, 횡문근육종(RMS) 환아의 혈청 hsa-miR-133b의 비교. 종축은 hsa-miR-133b／hsa-miR-16 비이다. RMS: 횡문근육종, nonRMS: 횡문근육종 이외의 종양.
도 7은 정상인, 담암 환아, 횡문근육종(RMS) 환아의 혈청 hsa-miR-206의 비교. 종축은 hsa-miR-206／hsa-miR-16 비이다. RMS: 횡문근육종, nonRMS: 횡문근육종 이외의 종양.
도 8은 치료 후의 RMS 환아에 있어서의 근특이적 miRNA／hsa-miR-16 비의 저하. 종축은 근특이적 miRNA／hsa-miR-16 비이다.
도 9는 인간 혈청 중에서의 miRNA의 안정성. 4℃ 보존에서 혈청 microRNA의 안정성을 검증했다. Ct값은 hsa-miR-16, hsa-miR-133b 양자에 있어서, 보존 기간과 함께 점증 경향에 있어 day30에서 3 내지 4 상승했다(절대량으로서 16분의 1 내지 8분의 1). 한편, hsa-miR-133b／has-miR-16에 대해서 큰 변화는 인정되지 않았다.
도 10은 혈청 근특이적 miRNA는, 횡문근육종의 병세를 반영하는 것을 나타낸다.
도 11은 횡문근육종 환아의 혈청 이외의 체액(수액(髓液), 흉수)에서도 근특이적 miRNA가 검출되는 것을 나타낸다.
도 12는 체액 중의 근특이적 miRNA는, 횡문근육종의 병세를 반영하는 것을 나타낸다.
본 발명에서 검출의 대상으로 하는 hsa-miR-1, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b 및 hsa-miR-206의 서열을 이하에 나타낸다. 또한, 발현이 높아, 조직간에서의 발현에 불균일이 적기 때문에 internal control로서 사용 가능한 hsa-miR-16의 서열을 아울러 표 1에 나타낸다.
[표 1]
Figure pct00001
hsa-miR-1, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b 및 hsa-miR-206은, 도 3에 나타내는 바와 같이, 횡문근육종 세포주의 배양 상청에 다량으로 방출되고 있으며, 종양 유래의 miRNA가 종양 세포 내로부터 유리하여 존재한다. 인체 내에서도, 종양 유래의 유리의 miRNA가 체액 중에 존재함으로써, 횡문근육종의 검출, 진단에 이용할 수 있는 것으로 생각된다.
본 명세서에서, 체액으로서는, 혈액, 흉수, 복수, 수액, 소변 등을 들 수 있다. 혈액은 횡문근육종의 발생 부위 혹은 전이 부위에 상관없이 유효하지만, 발생 부위 혹은 전이 부위가 비뇨기일 경우에는 소변이, 중추 신경계 등의 경우에는 수액이, 복강 내 등의 경우에는 복수가, 흉강 내의 경우에는 흉수가 각각 유효하다.
체액으로서 혈액을 사용할 경우, 혈액 유래 샘플(혈장, 혈청)을 18,000g, 10분의 원심 처리를 행하고, 그 상청을 사용하여, 백혈구, 적혈구의 혼입을 방지하는 것이 필요하다.
본 발명에서 사용하는 miRNA는, 20년 전의 -20℃ 보존 혈청 검체로부터도 검출 가능하며, 혈청 중에서 본 발명에 사용하기 위해 충분한 안정성을 갖고 있다(도 9). 예를 들면 혈청을 4℃에서 30일간 보존하면 절대량으로서 16분의 1 내지 8분의 1 정도가 되지만, hsa-miR-133b와 hsa-miR-16의 비에는 큰 변화가 인정되지 않았다.
miRNA의 검출, 정량은, miRNA를 함유하는 샘플을 역(逆)전사하여 cDNA를 얻어, 이를 정량적 리얼 타임 PCR 등의 적당한 방법에 의해 실시할 수 있다. cDNA는, 예를 들면 TaqMan MicroRNA RT kit(Applied Biosystems), TaqMan MicroRNA assays의 Mature microRNA 특이적 RT primer 등을 사용하여, 역전사 반응을 행함으로써 조제할 수 있다. 또한, 정량적 리얼 타임 PCR은, TaqMan MicroRNA assays의 Taqman primer와 probe, TaqMan Universal PCR Master Mix를 사용하여 실시할 수 있다.
횡문근육종의 검출에 관해서는, p<0.05로 유의하게 근특이적 miRNA의 발현이, 횡문근육종군에서 증가한다.
측정 대상의 miRNA로서는, hsa-miR-206이 감도, 특이도 모두 가장 높아, 유용하다고 생각된다. hsa-miR-133a, hsa-miR-133b, hsa-miR-206에 대해서는, 종양과 혈청의 microRNA량의 상관이 인정되었다.
본 발명의 횡문근육종의 검출에 관하여, 근특이적 miRNA(hsa-miR-1, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b 및 hsa-miR-206)와 hsa-miR-16의 비(근특이적 miRNA／hsa-miR-16)는, 횡문근육종의 진단시의 체액, 특히 혈청의 바이오 마커로서 기대된다.
본 발명의 검출 방법에 의하면, 횡문근육종(RMS)을 다른 소아의 종양인 신경아종(NB), 유윙육종(EWS), 악성 횡문근양 종양(MRT)과 구별하여 검출 가능하다. 종래 이들 종양과의 감별은 곤란하며, 본 발명은, 횡문근육종의 특이적인 검출에 매우 유효한 수단을 제공한다.
본 발명의 근특이적 miRNA는, 횡문근육종의 치료 후에 발현량이 저하하므로, 치료의 유효성의 지표도 된다(도 8, 10, 11).
이하의 실시예에 의해 본 발명을 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 의해 한정되는 것이 아니다.
[실시예]
실시예 1
1. 방법
세포주, 종양 검체, 혈청
교토 부립 의과 대학 소아과에서 보유하고 있는 16 세포주(횡문근육종 7, 신경아종 4, 유윙육종 3, 악성 횡문근양 종양 2), 21 종양 검체(횡문근육종 7, 미분화 육종 4, 빌름스 종양 2, 신경아종 2, 유윙육종 1, 악성 횡문근양 종양 1, 부신암 1, 망막아종 1, 포소상(胞巢狀) 연부 육종 1, 골육종 1), 48 혈청 검체(횡문근육종 8, 신경아종 3, 빌름스 종양 2, 유윙육종 2, 간아종 2, 망막아종 2, 골육종 2, 미분화 육종 2, 악성 횡문근양 종양 1, 포소형 연부 육종 1, 부신암 1, 췌아종 1, 기형종 1, 급성 림프아구성 백혈병 1, 랑게르한스(Langerhans) 세포 조직 구증 1, 신경교종 1, 정상인 지원자 17), 15 체액 검체(횡문근육종 2(수액 1, 흉수 1), 신경아종 3(수액 1, 흉수 1, 복수 1), 수아종 3(수액 3), 상의종 1(수액 1), 망막아종 1(수액 1), 악성 횡문근양 종양 1(수액 1), 빌름스 종양 1(수액 1), 배세포 종양 1(복수 1), 유미흉(chylothorax) 1(흉수 1), 자기 면역 질환 1(수액 1))를 사용하여 검토를 행했다.
RNA의 추출
miRNA를 함유하는 total RNA는 mirVana PARIS kit(Ambion)를 사용하여 추출했다. 세포주 배양액의 상청, 혈청에 대해서는, 세포 성분을 제거하기 위해, 15,000rpm, 10분간의 원심 처리를 더 더하고, 그 상청을 사용했다.
역전사 반응
Taqman MicroRNA RT kit(Applied Biosystems), Taqman MicroRNA assays(Applied Biosystems)의 mature miRNA 특이적 역전사 반응용 프라이머를 사용하여 역전사 반응을 행했다.
정량적 리얼 타임 PCR
역전사한 cDNA 용액, Taman MicroRNA assyas의 프라이머와 프로브를 사용하여, 정량적 리얼 타임 PCR을 행했다. 체액 이외의 검체에서는, 조직간에서 발현의 불균일이 적어, 고(高)발현하고 있는 hsa-miR-16을 내재 컨트롤로 하고, 근특이적 miRNA의 발현을 normalize하여, ΔΔCt법을 사용하여 정량했다. 체액 검체에서는, hsa-miR-16의 발현이 일정하지 않았기 때문에, 카피수가 기지(旣知)인 합성 miRNA 를 사용하여 검량선을 작성하고, 절대 정량을 사용하여 정량했다. 혈청 1μl당 hsa-miR-206 카피수를 산출하고 비교했다. 근특이적 miRNA(hsa-miR-1, 133a, 133b, 206), 및 hsa-miR-16의 서열을 표 1에 나타낸다.
통계 해석
혈청에서의 miRNA의 발현은, Mann-Whitney의 U 검정을 사용하여 비교했다. 종양과 혈청의 miRNA의 발현의 상관은 Spearman의 순위 상관 계수를 사용하여 검토했다. 어느 검정도 양측 검정으로 행하고, p<0.05를 유의차 있음으로 했다.
통계 해석
혈청에서의 miRNA의 발현은, Mann-Whitney의 U 검정을 사용하여 비교했다. 종양과 혈청의 miRNA의 발현의 상관은 Spearman의 순위 상관 계수를 사용하여 검토했다. 어느 검정도 양측 검정으로 행하고, p<0.05를 유의차 있음으로 했다.
2. 결과
세포주에서의 근특이적 miRNA의 발현
세포주에서의 검토에서는, 횡문근육종 세포주(n＝7)에서는, 신경아종(n＝4), 유윙육종(n＝3), 악성 횡문근양 종양(n＝2) 세포주에 비해 근특이적 miRNA의 발현이 증가하여 있었다(도 1).
임상 종양 검체에서의 근특이적 miRNA의 발현
임상 종양 검체에서의 검토에서는, 횡문근육종 종양 검체(n＝7)에서 다른 소아암 종양 검체(n＝14)에 비해 근특이적 miRNA의 발현이 증가하여 있었다(도 2).
세포주 배양액 상청에서의 근특이적 miRNA의 발현
세포주 배양액 상청에서의 검토에서는, 횡문근육종 세포주의 배양액 상청(n＝7)에서, 신경아종(n＝4), 유윙육종(n＝3), 악성 횡문근양 종양(n＝2) 세포주의 배양액 상청에 비해 근특이적 miRNA의 발현이 증가하여 있었다(도 3).
혈청에서의 근특이적 miRNA의 발현
혈청에서의 검토에서는, 횡문근육종의 환아 혈청(n＝8)에서, 다른 소아암 환아 혈청(n＝23), 정상인 지원자 혈청(n＝17)에 비해, 근특이적 miRNA의 발현이 통계학적으로 유의차를 갖고 증가하여 있었다(도 4∼7). ROC 곡선을 사용하여, cut off치를 설정하고 감도, 특이도를 산출한 바, hsa-miR-206이 가장 높은 감도, 특이도를 나타내며, 감도 100％, 특이도 91.3％였다(도 7). 또한, 종양과 혈청의 양쪽의 검체가 얻어진 것에 대해서, miRNA의 발현의 상관에 대해서 검토한 바, hsa-miR-1에서는 p＝0.0793으로 통계학적으로 유의가 아니지만 상관하는 경향이 보여지고, hsa-miR-133a, 133b, 206에서는, 유의한 상관이 인정되었다(표 2). 또한, 치료 전후의 페어 혈청이 얻어진 3증례에 대해서, 치료에 의한 근특이적 miRNA의 발현의 변화에 대해서도 검토를 행하고 있고, 치료 후에는, 모두 cut off치를 하회하고 있으며, 발현은 정상인 지원자와 동(同)정도로까지 저하했다(도 8). 혈청 중의 근특이적 miRNA는, 횡문근육종의 병세를 반영하여 증감하고, 치료 주공(奏功)시에는 저하하며, 재발시나 증악(增惡)시에는 상승했다(도 10).
[표 2]
Figure pct00002
체액에서의 근특이적 miRNA의 발현
혈청 이외의 체액인 수액, 흉수에서도, 횡문근육종 환자(n＝2)에서는, 근특이적 miRNA의 발현이, 비횡문근육종 환자(n＝13)와 비교하여 높은 값이었다(도 11). 암성 수막염을 발증한 횡문근육종 환자의 수액에서도, 그 병세를 반영하여 증감하고, 치료 주공시에는 저하하며, 재발시나 증악시에는 상승했다(도 12).
3. 고찰
횡문근육종의 세포주, 임상 종양 검체에서, 모두 근특이적 miRNA의 발현은 증가하여 있으며, 횡문근육종이 미분화한 근세포에 유래하는 종양인 것과 모순하지 않는 결과였다. 또한, 세포 성분을 제거한 세포주 배양액 상청으로부터도 근특이적 miRNA는 검출 가능하며, 횡문근육종에서, 발현이 가장 증가하여 있었다. 이는, 세포 외에도 근특이적 miRNA가 유리해 있음을 시사하고 있으며, 임상 종양 검체의 결과와 합하면, 횡문근육종 환아 혈청 중에도 근특이적 miRNA가 다량으로 존재하고 있다고 생각되었다.
혈청에서의 검토에서는, 어느 근특이적 miRNA의 발현도 횡문근육종 환아 혈청에서 유의하게 증가하여 있어, 횡문근육종의 수술 전 진단에 유용하다고 생각되었다. 그 중에서도, hsa-miR-206은 감도 100％, 특이도 91.3％로 바이오 마커로서 가장 유용하다고 생각되었다. 또한, 임상 종양 검체와 혈청의 miRNA의 발현량은 상관이 인정되고, 또한, 치료 후에는, 횡문근육종 환아 혈청에서 근특이적 miRNA의 발현은 정상인 지원자와 동(同)레벨까지 저하하고 있어, 이들 결과는 혈청에서 검출되는 miRNA는 종양 유래임을 시사하고 있다. 혈청 이외의 체액에서도 횡문근육종 환자에 있어서, 근특이적 miRNA의 발현은 높아, 병세에 따라 발현의 변화가 인정되었다.
횡문근육종은, 소아에서 가장 많은 연부육종임에도 불구하고, 현재, 혈액 검사에서 측정할 수 있는 종양 마커는 존재하지 않아, 그 수술 전 진단은 곤란하다. 한편, 본 종양에서는 첫회 수술 후의 잔존 종양의 존재는 예후 불량 인자이기 때문에, 첫회 수술 전에 횡문근육종의 잠정 진단이 이루어져 있으면, 전적(全摘)을 목표로 한 수술을 계획할 수 있다. 이 때문에, 횡문근육종의 수술 전 진단에 연결되는 비침습적인 바이오 마커의 존재는 중요하다. 이번 검토한 근특이적 miRNA는, 높은 감도, 특이도를 가져, 횡문근육종의 수술 전 진단을 가능하게 하여, 예후의 개선에 기여할 수 있는 신규 바이오 마커라고 생각된다.
SEQUENCE LISTING <110> KYOTO PREFECTURAL PUBLIC UNIVERSITY CORPORATION <110> LSIP, LLC <120> METHOD OF DETECTING RHABDOMYOSARCOMA USING SAMPLE DERIVED FROM BODY FLUID <130> P11-024 <150> JP 2010-089180 <151> 2010-04-08 <160> 5 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uggaauguaa agaaguaugu au 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 uuuggucccc uucaaccagc ug 22 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 uuuggucccc uucaaccagc ua 22 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 uggaauguaa ggaagugugu gg 22 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 uagcagcacg uaaauauugg cg 22

Claims (6)

  1. 체액 유래의 검체에서, hsa-miR-1, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b 및 hsa-miR-206으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 miRNA의 발현을 평가하는 것을 특징으로 하는 횡문근육종의 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    체액 유래의 검체에서, hsa-miR-1, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b 및 hsa-miR-206으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 발현량이 정상인보다 유의하게 항진(亢進)하여 있음을 검출의 기준으로 하는 횡문근육종의 검출 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    hsa-miR-133a, hsa-miR-133b 및 hsa-miR-206으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 miRNA의 발현을 평가하는 것을 특징으로 하는 횡문근육종의 검출 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    적어도 hsa-miR-206의 발현을 평가하는 것을 특징으로 하는 횡문근육종의 검출 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    리얼 타임 PCR법에 의해 검출하는 횡문근육종의 검출 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    체액이 혈액이며, 체액 유래의 검체가 혈장 또는 혈청인 횡문근육종의 검출 방법.
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