CN103108953A - 使用来自体液的样本检测横纹肌肉瘤的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种横纹肌肉瘤的检测方法，其特征在于，对于来自体液的样本，评价选自hsa-miR-1、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b和hsa-miR-206中的至少1种miRNA的表达。

Description

使用来自体液的样本检测横纹肌肉瘤的方法
技术领域
本发明涉及使用来自体液的样本检测横纹肌肉瘤的方法。
背景技术
本发明人等专心致力于使用血清中来自肿瘤的游离DNA的非侵袭性诊断技术的开发（非专利文献1、2）。近年来，证明了不被翻译为蛋白质的叫做microRNA(miRNA)的非编码RNA的存在，并报告其表达谱为组织或肿瘤特异性的（非专利文献3、4）。在儿童癌症中使用细胞株的研究中，有表达谱因肿瘤而异的报告（非专利文献5）。另外，作为在儿童癌症中最多的软组织肉瘤的横纹肌肉瘤中，明确了在肌肉中特异性表达的miRNA的表达上升（非专利文献5、6）。另一方面，明确了血清中存在来自肿瘤的miRNA，这教导了在大肠癌、淋巴瘤、前列腺癌、肝癌等中miRNA作为生物标记是有用（非专利文献7～10）。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Gotoh,et al.J Clin Oncol 23:5205-5210,2005
非专利文献2：Yagyu,et al.Clin Cancer Res 14:7011-7019,2008
非专利文献3：Calin GA,et al.Nat Rev Cancer;6:857-866,2006
非专利文献4：Lu J,et al.Nature;435:834-838,2005
非专利文献5：Wei JS,et al.Clin Cancer Res;15:5560-5568,2009
非专利文献6：Subramanian S,et al.Oncogene;27:2015-2026,2008
非专利文献7：Ng EKO,et al.Gut;58:1375-1381,2009
非专利文献8：Mitchell PS,et al.PNAS;105:10513-10518,2008
非专利文献9：Lawrie CH,et al.Br J Haematol;141:672-675,2008
非专利文献10：Yamamoto Y,et al.Biomarkers;14:529-538,2009
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供容易地检测出难以诊断的横纹肌肉瘤的方法。
解决问题的方法
对于来自儿童肿瘤患者的体液的样本，本发明的发明人等对作为在肌肉中特异性表达的miRNA群的hsa-miR-1、133a、133b、206进行定量，针对横纹肌肉瘤的非侵袭性诊断是否能够进行了研究。其结果，发现能够通过这些miRNA来检测出横纹肌肉瘤。
本发明提供以下的横纹肌肉瘤的检测方法。
项目1．一种横纹肌肉瘤的检测方法，其特征在于，对于来自体液的样本，评价选自hsa-miR-1、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b和hsa-miR-206中的至少1种miRNA的表达。
项目2．项目1中记载的横纹肌肉瘤的检测方法，其中，检测的标准为：在来自体液的样本中，选自hsa-miR-1、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b和hsa-miR-206中的至少1种的表达量相比于健康人显著亢进。
项目3．项目1中记载的横纹肌肉瘤的检测方法，其特征在于，评价选自hsa-miR-133a,hsa-miR-133b和hsa-miR-206中的至少1种miRNA的表达。
项目4．项目1中记载的横纹肌肉瘤的检测方法，其特征在于，至少评价hsa-miR-206的表达。
项目5．项目1中记载的横纹肌肉瘤的检测方法，其中，通过实时PCR（Real Time PCR）法进行检测。
项目6．项目1中记载的横纹肌肉瘤的检测方法，其中，体液为血液，来自体液的样本为血浆或血清。
发明的效果
横纹肌肉瘤为难以诊断的肿瘤之一，但本发明使用以往一直认为不可能用于检测的来自体液的样本就能够检测出横纹肌肉瘤。
就横纹肌肉瘤而言，在化学疗法、放射线疗法之前将肿瘤完全切除对于预后的改善很重要，在术前进行临时诊断以确定初次以完全切除为目标的手术方案很重要的。本发明能够更准确且迅速地实现横纹肌肉瘤的诊断，能够期待提高横纹肌肉瘤的治疗效果。
附图说明
图1表示在横纹肌肉瘤细胞株中，肌肉特异性microRNA的表达亢进。纵轴是肌肉特异性miRNA和hsa-miR-16之比。RMS：横纹肌肉瘤、NB：成神经细胞瘤、EWS：尤文氏肉瘤、MRT：恶性横纹肌样肿瘤。
图2表示在横纹肌肉瘤肿瘤样本中，肌肉特异性microRNA的表达亢进。纵轴是肌肉特异性miRNA和hsa-miR-16之比。RMS：横纹肌肉瘤、nonRMS：横纹肌肉瘤以外的肿瘤。
图3表示hsa-miR-1、hsa-miR-206、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b的横纹肌肉瘤细胞株的培养上清的表达量。纵轴是肌肉特异性miRNA和hsa-miR-16之比。RMS：横纹肌肉瘤、NB：成神经细胞瘤、EWS：尤文氏肉瘤、MRT：恶性横纹肌样肿瘤。
图4是健康人、癌症患儿、横纹肌肉瘤(RMS)患儿的血清hsa-miR-1的比较。纵轴是hsa-miR-1/hsa-miR-16比。RMS：横纹肌肉瘤、nonRMS：横纹肌肉瘤以外的肿瘤。
图5是健康人、癌症患儿、横纹肌肉瘤(RMS)患儿的血清hsa-miR-133a的比较。纵轴是hsa-miR-133a/hsa-miR-16比。RMS：横纹肌肉瘤、nonRMS：横纹肌肉瘤以外的肿瘤。
图6是健康人、癌症患儿、横纹肌肉瘤(RMS)患儿的血清hsa-miR-133b的比较。纵轴是hsa-miR-133b/hsa-miR-16比。RMS：横纹肌肉瘤、nonRMS：横纹肌肉瘤以外的肿瘤。
图7是健康人、癌症患儿、横纹肌肉瘤(RMS)患儿的血清hsa-miR-206的比较。纵轴是hsa-miR-206/hsa-miR-16比。RMS：横纹肌肉瘤、nonRMS：横纹肌肉瘤以外的肿瘤。
图8表示治疗后的RMS患儿中肌肉特异性miRNA/hsa-miR-16比的降低。纵轴是肌肉特异性miRNA/hsa-miR-16比。
图9表示人血清中miRNA的稳定性。在4℃保存下验证了血清microRNA的稳定性。就hsa-miR-16、hsa-miR-133b两者而言，Ct值随着保存期间的延长有渐增趋势，在第30天上升了3到4（绝对量降低为1/16到1/8）。另一方面，对于hsa-miR-133b/has-miR-16没有确认到大的变化。
图10表示血清肌肉特异性miRNA对横纹肌肉瘤病势的反映。
图11表示在横纹肌肉瘤患儿的血清以外的体液（脑脊液、胸腔积液）中也检测到肌肉特异性miRNA。
图12表示体液中的肌肉特异性miRNA对横纹肌肉瘤病势的反映。
具体实施方式
本发明中作为检测对象的hsa-miR-1、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b和hsa-miR-206的序列表示如下。另外，将因表达高、组织间的表达偏差少而能够作为内对照使用的hsa-miR-16的序列一并示于表1。
表1
miRNA RNA序列 序列编号
hsa-miR-1 UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU 序列编号1
hsa-miR-133a UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG 序列编号2
hsa-miR-133b UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUA 序列编号3
hsa-miR-206 UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG 序列编号4
hsa-miR-16 UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG 序列编号5
如图3所示，hsa-miR-1、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b和hsa-miR-206被大量释放至横纹肌肉瘤细胞株的培养上清中，来自肿瘤的miRNA从肿瘤细胞内游离出来并存在。可以认为在人体内，根据在体液中存在来自肿瘤的游离miRNA，就能够用于检测、诊断横纹肌肉瘤。
在本说明书中，作为体液，可以列举血液、胸腔积液、腹水、脑脊液、尿等。不论横纹肌肉瘤的发生部位或者转移部位如何，血液都有效，但在发生部位或者转移部位为泌尿器的情况下，尿是有效的，在中枢神经系统等情况下，脑脊液是有效的，在腹腔内等情况下，腹水是有效的，在胸腔内的情况下胸腔积液是有效的。
在使用血液作为体液时，必须将来自血液的样品(血浆、血清)进行18,000g、10分钟的离心处理，使用其上清，以防止白血球、红血球的混入。
在本发明中使用的miRNA从20年前于-20℃保存的血清样本中也能够检测出来，对于本发明的使用，在血清中具有充分的稳定性(图9)。例如，若将血清在4℃保存30天，则绝对量降低为1/16到1/8左右，但hsa-miR-133b和hsa-miR-16之比没有大的变化。
miRNA的检测、定量能够通过将包含miRNA的样品逆转录而得到cDNA，并对其进行定量的实时PCR等适当的方法实施。cDNA例如通过使用TaqMan MicroRNA RT kit(Applied Biosystems)、TaqMan MicroRNA assays的Mature microRNA特异性RT引物等，进行逆转录反应而制备。另外，定量的实时PCR能够使用TaqMan MicroRNA assays的Taqman引物和探针、TaqMan Universal PCR Master Mix来实施。
关于横纹肌肉瘤的检测，在p＜0.05时，肌肉特异性miRNA的表达在横纹肌肉瘤群中显著增加。
作为测定对象的miRNA，hsa-miR-206的灵敏度、特异度均最高，可以认为有用。关于hsa-miR-133a,hsa-miR-133b、hsa-miR-206，确认到了肿瘤和血清的microRNA量的相关性。
关于本发明的横纹肌肉瘤的检测，肌肉特异性miRNA（hsa-miR-1、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b和hsa-miR-206）和hsa-miR-16之比（肌肉特异性miRNA/hsa-miR-16）被期待作为横纹肌肉瘤诊断时体液、特别是血清的生物标记。
根据本发明的检测方法，能够将横纹肌肉瘤(RMS)与作为其他的儿童肿瘤的成神经细胞瘤(NB)、尤文氏肉瘤(EWS)、恶性横纹肌样肿瘤(MRT)区别进行检测。以前难以与这些肿瘤鉴别开来，本发明为横纹肌肉瘤的特异性检测提供了极为有效的手段。
本发明的肌肉特异性miRNA由于在横纹肌肉瘤的治疗后表达量降低，所以也作为治疗有效性的指标(图8，10，11)。
通过以下的实施例，更具体地说明本发明，但本发明并不受以下实施例限定。
实施例
实施例1
1．方法
细胞株、肿瘤样本、血清
使用京都府立医科大学小儿科保存的16株细胞株（横纹肌肉瘤7株、成神经细胞瘤4株、尤文氏肉瘤3株、恶性横纹肌样肿瘤2株）、21株肿瘤样本（横纹肌肉瘤7株、未分化肉瘤4株、肾母细胞瘤2株、成神经细胞瘤2株、尤文氏肉瘤1株、恶性横纹肌样肿瘤1株、肾上腺癌1株、视网膜成神经细胞瘤1株、腺泡状软组织肉瘤1株、骨肉瘤1株）、48株血清样本（横纹肌肉瘤8株、成神经细胞瘤3株、肾母细胞瘤2株、尤文氏肉瘤2株、肝母细胞瘤2株、视网膜成神经细胞瘤2株、骨肉瘤2株、未分化肉瘤2株、恶性横纹肌样肿瘤1株、腺泡型软组织肉瘤1株、肾上腺癌1株、胰胚细胞瘤1株、畸胎瘤1株、急性成淋巴细胞性白血病1株、朗氏细胞组织细胞增生症1株、神经胶质瘤1株、健康人志愿者17株）、15株体液样本（横纹肌肉瘤2株（脑脊液1株、胸腔积液1株）、成神经细胞瘤3株（脑脊液1株、胸腔积液1株、腹水1株）、成神经管细胞瘤3株（脑脊液3株）、室管膜瘤1株（脑脊液1株）、视网膜成神经细胞瘤1株（脑脊液1株）、恶性横纹肌样肿瘤1株（脑脊液1株）、肾母细胞瘤1株（脑脊液1株）、生殖细胞瘤1株（腹水1株）、乳糜胸1株（胸腔积液1株）、自身免疫疾病1株（脑脊液1株））进行了研究。
RNA的提取
包含miRNA的总RNA使用mirVana PARIS kit（Ambion）进行提取。对于细胞株培养液的上清、血清，为了除去细胞成分，再施加15,000rpm、10分钟的离心处理，使用该上清。
逆转录反应
使用Taqman MicroRNA RT kit（Applied Biosystems）,Taqman MicroRNAassays（Applied Biosystems）的mature miRNA特异性逆转录反应用引物进行逆转录反应。
定量实时PCR
使用逆转录得到的cDNA溶液、Taman MicroRNA assyas的引物和探针，进行定量实时PCR。对于体液以外的样本，将组织间表达偏差少、高表达的hsa-miR-16作为内对照，将肌肉特异性miRNA的表达规范化（normalize），使用ΔΔCt法进行定量。在体液样本中，由于hsa-miR-16的表达不是一定，所以使用拷贝数已知的合成miRNA制作校准曲线，使用绝对定量进行定量。算出每1μl血清的hsa-miR-206拷贝数进行比较。将肌肉特异性miRNA（hsa-miR-1、133a、133b、206）和hsa-miR-16的序列表示在表1中。
统计解析
血清中的miRNA的表达，使用Mann-Whitney的U检验进行比较。肿瘤和血清的miRNA的表达的相关性使用Spearman的秩相关系数进行研究。任何一个检验都以双侧检验进行，将p<0.05设为有显著差别。
统计解析
血清中的miRNA的表达，使用Mann-Whitney的U检验进行比较。肿瘤和血清的miRNA的表达的相关性使用Spearman的秩相关系数进行研究。任何一个检验都以双侧检验进行，将p<0.05设为有显著差别。
2．结果
细胞株中的肌肉特异性miRNA的表达
在细胞株的研究中，在横纹肌肉瘤细胞株（n=7）的情况下，与成神经细胞瘤（n=4）、尤文氏肉瘤（n=3）、恶性横纹肌样肿瘤（n=2）细胞株相比，肌肉特异性miRNA的表达增加（图1）。
临床肿瘤样本中肌肉特异性miRNA的表达
在临床肿瘤样本的研究中，在横纹肌肉瘤肿瘤样本（n=7）时，与其他的儿童癌症肿瘤样本（n=14）相比，肌肉特异性miRNA的表达增加（图2）。
细胞株培养液上清的肌肉特异性miRNA的表达
在细胞株培养液上清的研究中，在横纹肌肉瘤细胞株的培养液上清（n=7）的情况下，与成神经细胞瘤（n=4）、尤文氏肉瘤（n=3）、恶性横纹肌样肿瘤（n=2）细胞株的培养液上清相比，肌肉特异性miRNA的表达增加（图3）。
血清中肌肉特异性miRNA的表达
在血清的研究中，在横纹肌肉瘤的患儿血清（n=8）中，与其他的儿童癌症患儿血清（n=23）、健康人志愿者血清（n=17）相比，肌肉特异性miRNA的表达在统计学上具有显著差别地增加（图4-7）。使用ROC曲线，设定截止（cut off）值算出灵敏度、特异度，结果hsa-miR-206显示最高的灵敏度、特异度，灵敏度为100%，特异度为91.3%（图7）。另外，关于得到肿瘤和血清两者的样本的对象，对于miRNA的表达的相关性进行研究，结果在hsa-miR-1中p=0.0793，虽然在统计学上不显著但观察到了相关的趋势，在hsa-miR-133a、133b、206中，确认到了显著的相关性（表2）。另外，关于得到治疗前后的配对血清的3个病例，对于肌肉特异性miRNA的表达随治疗的变化也进行了研究，在治疗后，都低于截止（cut off）值，表达低至与健康人志愿者相同程度（图8）。血清中的肌肉特异性miRNA的增减反映横纹肌肉瘤的病势，在治疗奏效时降低，复发时或恶化时上升（图10）。
表2
hsa-miRNA Rs P值
1 0.48417 0.0793
133a 0.544 0.044
133b 0.557 0.038
206 0.780 0.001
体液中的肌肉特异性miRNA的表达
在作为血清以外的体液的脑脊液、胸腔积液中，横纹肌肉瘤患者（n=2）的肌肉特异性miRNA的表达高于非横纹肌肉瘤患者（n=13）（图11）。在患有脑膜癌的横纹肌肉瘤患者的脑脊液中，肌肉特异性miRNA的增减反映其病势，在治疗奏效时降低，在复发时或恶化时上升（图12）。
3．考察
在横纹肌肉瘤的细胞株、临床肿瘤样本中，肌肉特异性miRNA的表达都增加，该结果与横纹肌肉瘤为来自未分化的肌肉细胞的肿瘤的事实不矛盾。另外，从除去了细胞成分的细胞株培养液上清中也能够检测出肌肉特异性miRNA，在横纹肌肉瘤中，表达增加的最多。这表明在细胞外也游离有肌肉特异性miRNA，结合临床肿瘤样本的结果，可以认为在横纹肌肉瘤患儿血清中也大量存在肌肉特异性miRNA。
在对血清的研究中，所有的肌肉特异性miRNA的表达在横纹肌肉瘤患儿血清中都显著增加，认为可用于横纹肌肉瘤的术前诊断。其中，hsa-miR-206灵敏度为100%，特异度为91.3％，可以认为作为生物标记是最有用的。另外，确认了临床肿瘤样本和血清的miRNA表达量的相关性，另外，在治疗后，在横纹肌肉瘤患儿血清中，肌肉特异性miRNA的表达降低至与健康人志愿者相同的水平，这些结果表明在血清中检测出的miRNA来自肿瘤。在血清以外的体液中，横纹肌肉瘤患者的肌肉特异性miRNA的表达高，确认到了表达随着病势发生变化。
横纹肌肉瘤尽管是儿童中最多发的软组织肉瘤，但现在不存在能够由血液检查进行测定的肿瘤标记，其术前诊断困难。另一方面，就该肿瘤而言，初次手术后残存肿瘤的存在是预后的不良因素，所以如果在初次手术前进行横纹肌肉瘤的临时诊断，就能够设计以全摘除为目标的手术。因此，与横纹肌肉瘤的术前诊断相关的非侵袭性的生物标记的存在很重要。本次研究的肌肉特异性miRNA具有高灵敏度、特异度，能够进行横纹肌肉瘤的术前诊断，可以认为是能够有助于预后改善的新型生物标记。
Figure IDA00002552998500011
Figure IDA00002552998500021

Claims (6)

1.一种横纹肌肉瘤的检测方法，该方法包括：对于来自体液的样本，评价选自hsa-miR-1、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b和hsa-miR-206中的至少1种miRNA的表达。
2.根据权利要求1所述的横纹肌肉瘤的检测方法，其中，其检测的标准为：与健康人相比，来自体液的样本中选自hsa-miR-1、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b和hsa-miR-206中的至少1种的表达量明显亢进。
3.根据权利要求1所述的横纹肌肉瘤的检测方法，其中，评价选自hsa-miR-133a、hsa-miR-133b和hsa-miR-206中的至少1种miRNA的表达。
4.根据权利要求1所述的横纹肌肉瘤的检测方法，其中，至少评价hsa-miR-206的表达。
5.根据权利要求1所述的横纹肌肉瘤的检测方法，其中，通过实时PCR法进行检测。
6.根据权利要求1所述的横纹肌肉瘤的检测方法，其中，体液为血液，来自体液的样本为血浆或血清。
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张军 等: "横纹肌肉瘤病理学研究进展", 《新疆医学院学报》 *
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