KR20130051605A - 톨라이크리셉터―８ 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭ｒｎａ 및 이를 함유하는 아토피성 피부염 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아토피성 피부염에 치료효과를 갖는 작은 간섭 RNA에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 톨라이크리셉터-8 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭 RNA(siRNA) 및 상기 siRNA를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 박테리아 세포를 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 아토피성 피부염에 치료효과를 갖는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 이용한 치료용 조성물은 난치성 질환으로 적절한 치료제가 부재한 아토피성 피부질환의 치료 및 예방제로서 의약산업에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

톨라이크리셉터―８ 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭ＲＮＡ 및 이를 함유하는 아토피성 피부염 치료용 조성물{TLR8 siRNA for treatment of atopy dermatitis and composition of therapeutic agent comprising the same}

본 발명은 톨라이크리셉터-8 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭RNA 및 이를 함유하는 아토피성 피부염 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 톨라이크리셉터-8(Toll like receptor 8; 이하, TLR8과 혼용함) 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭 RNA(siRNA)와 이를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 박테리아 성분을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 등 염증성 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

아토피성 피부염은 현대인에게 빈번하게 발생되고 있는 의학적으로 원인이 불분명한 만성적 피부질환이다. 아토피성 피부염은 일반적으로 인간 면역체계의 불균형에 의해 초래된 질환으로 알려져 있다. 면역학적으로 외부의 자극에 대해 체내의 면역계가 과민반응을 유도하여 발생하는 것으로 알려져 있다. 주로 혈액 중 IgE의 농도 상승을 지표로 하여 과민하게 히스타민(histamine)류의 분비가 가려움증 및 염증을 유도하는 것으로 알려져 있다.

보다 구체적으로 살펴보면 우리 몸의 면역은 B 림프구가 주관하는 체액성 면역과 T 림프구가 주관하는 세포성 면역으로 이루어져 있다. 세포성 면역을 주관하는 T 세포에는 Tc-세포와 Th-세포가 있으며, Th-세포는 Th-1과 Th-2로 구분된다. 상기 Th-1과 Th-2의 균형이 깨져 Th-2의 양이 갑자기 늘어나고 Th-1의 양이 줄어들면 알레르기 질환, 즉 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 알레르기성 천식 등의 질환이 발생하며, 반대로 Th-1의 양이 많이 늘어나게 되면 자가 면역 질환이 초래된다. 따라서 Th-2 면역반응의 과민은 아토피성 피부질환의 핵심요소이다. Th-2 면역반응은 즉시형 과민반응으로 IL-4, IL-5, IL-13 사이토카인의 분비를 매개로 이루어지며, IL-4와 IL-13은 B 세포의 isotype을 자극하고 Ig-E의 생성을 조절한다.

최근 들어 국내외적으로 아토피성 피부염 발병이 소아에서 성인에 이르기까지 광범위하게 발생하고 있어 치료제의 개발이 시급하다.

현재 아토피 피부염 치료는 양방의 경우 연고나 경구투여, 주사제를 이용하는데 약물들을 살펴보면 스테로이드제, 항히스타민제, 항생제 등이 사용되고 있으나, 부신피질 호르몬제와 같은 스테로이드제의 경우 소염작용과 면역억제 작용이 있어 즉각적으로 증상을 완화하는 효과는 우수하지만 장기간 사용할 경우 심각한 피부 부작용이 생길 우려가 크고 세균의 감염이 발생할 수 있다. 또 항히스타민제는 가려움증을 일시적으로 경감시킬 뿐이며 항생제의 경우 포도상구균 등의 2차 세균 감염을 치료하기 위해 사용될 뿐이다. 최근에 타크로리무스(tacrolimus, Protopic™) 또는 피메크로리무스(pimecrolimus, Elidel™)와 같은 calcineurin 저해제가 아토피성 피부염 치료제로 이용되고 있는데, 이 두 가지 약물도 모두 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 면역억제제이기 때문에 신속한 증상완화를 가져오나 효과는 일시적이며 지속적으로 사용시 피부의 자연방어상태를 약하게 하는 단점이 있다.

따라서, 아토피성 피부염 증상의 일시적인 경감효과가 아닌 원천적인 해결방법으로 부작용이 없는 안전하면서도 우수한 효능을 가진 광범위한 치료제 개발이 필요한 실정이다.

한편, TLR8은 현재까지 바이러스의 단일가닥 RNA에 반응하여 선천면역(INNATE IMMUNITY)을 유도하는 단백질로 주로 알려져 있다(Heil, F., H. Hemmi, H. Hochrein, F. Ampenberger, C. Kirschning, S. Akira, G. Lipford, H. Wagner, S. Bauer. 2004. Species-specific recognition of single-stranded RNA via Toll-like receptor 7 and 8. Science 303: 1526-1529).

본 발명의 배경이 되는 기술로서 대한민국 공개특허공보 제10-2009-0029187호(2009.03.20)의 TLR7 및 TLR8에 대한 안정화된 면역 조절성 RNA[SIMRA] 화합물이 공개되어 있으나, 이는 네키드 RNA(naked RNA) TLR7 및/또는 TLR 8에 대한 리간드로서 지속적으로 인식되도록 RNA를 유지하면서, 생체 내 유용한 분자가 될 수 있도록 그 안정성을 개선시키기 위한 안정화된 면역 조절성 RNA ("SIMRA") 화합물 및 면역 반응을 유도하고/거나 증가시키는 이의 사용 방법에 관한 것이다. 아직까지 TLR8 유전자의 발현을 억제하는 siRNA을 이용한 아토피성 피부염 치료제가 알려져 있지는 않다.

또한, 대한민국 특허공보 제10-0650451(2006.11.27)에는 아토피성 피부염에 치료효과를 갖는 약독화된 살모넬라 균주에 대해 기재가 되어 있으나, 살모넬라 균주를 경구 투여시 아토피성 피부염에 대한 치료효과는 거의 없었다.

대한민국 공개특허공보 제10-2009-0029187호(2009.03.20) 대한민국 특허공보 제10-0650451호(2006.11.27) 대한민국 공개특허공보 제10-2011-0056055호(2011.05.26)

본 발명자는 TLR8 유전자 발현을 억제하는 특정 siRNA가 아토피성 피부염의 개선에 관여한다는 것을 유전체 분석을 통해 최초로 확인하고 이들의 아토피성 피부염 등의 치료효과를 시험하여 경구 투여시에도 피부염억제효과가 유도된다는 것을 규명하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 TLR8 유전자의 발현을 억제시킴으로써 IFN-γ의 발현을 증가시켜 아토피성 피부염에 치료효과를 갖는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 TLR8 유전자의 표적서열에 특이적인 siRNA를 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 TLR8 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 박테리아 세포를 이용한 아토피성 피부염 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 21 ~ 25개 정도의 뉴클레오티드로 구성된 단일 염기 가닥인 siRNA의 RNAi(RNA interference)를 살모넬라를 캐리어로 이용하여 아토피성 피부염이 유발된 실험군에 경구 투여하는 경우, Th-1 면역반응의 지표인 IFN-γ의 발현을 증가시키며, 또한 아토피 질환의 지표인 가려움증을 급격히 감소시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 톨라이크리셉터-8 유전자의 발현을 억제하고 서열번호 2의 염기서열을 갖는 작은 간섭RNA(siRNA)을 제공한다.

본 발명에 있어서 'siRNA(small interfering RNA)'란 특정 mRNA의 절단을 통하여 RNA 간섭을 유도할 수 있는 짧은 이중가닥 RNA를 말한다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중가닥 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 쌍을 이루는 염기 길이는 10 내지 40 염기, 바람직하게는 15 내지 30 염기이다. siRNA 말단 구조는 표적 유전자의 발현을 RNA 간섭 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활 말단 또는 돌출 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출 구조와 5' 말단 돌출 구조 모두 가능하다.

본 발명의 상기 siRNA는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 siRNA인 것을 특징으로 한다. 상기 siRNA는 21 ~ 25 뉴클레오티드의 TLR8 유전자의 mRNA와 상보적인 염기서열로써, 바람직하게는 상기 서열번호 2의 염기서열과 이와 상보적인 서열을 포함하는 이중가닥(double-strand) siRNA일 수 있다. 본 발명에서는 서열번호 1과 서열번호 2의 이중가닥 올리고(top 및 bottom strand)를 합성하여 사용하였다. 상기 siRNA는 TLR8 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하여 번역을 방해하는 과정을 통해 유전자 기능을 억제한다. 다음 표 1 및 표 2는 siRNA에 쓰이는 TLR8 유전자의 target sequence와 siRNA의 서열을 나타낸 것이다.

본 발명의 siRNA는 그 활성을 저하시키지 않는 하나 이상의 치환, 삽입, 결실 및 그 조합을 갖는 변형체를 포함한다. 이러한 변형체는 상기한 siRNA의 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 가질 수 있으며, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는다.

본 발명의 siRNA는 직접 화학적으로 합성하거나(Sui G 등, (2002) A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 5515-5520), 인비트로 전사를 이용하여 합성하는 방법(Brummelkamp TR 등, (2002) A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian celss, Science 296: 550-553) 등 당업계에 공지된다양한 방법에 의해 합성할 수 있다.

본 발명의 siRNA는 기본적으로 두 가닥의 RNA가 쌍을 이루어 이중가닥 siRNA를 형성하고 있는 형태이지만, 플라스미드계 shRNA 벡터와 PCR 발현카세트 등에 의한 트랜스펙션에 이용될 수 있도록 짧은 헤어핀을 갖는 구조로 변형된 형태일 수도 있다.

본 발명에 따른 siRNA 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현벡터 내에 포함될 수 있다. 상기 "작동 가능하게 연결(operably linked)" 된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. 상기 "발현조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 siRNA를 전사하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상기 siRNA를 발현시킬 수 있는 프로모터와 클로닝을 위한 멀티클로닝사이트를 가지고 있는 어떠한 발현벡터도 사용할 수 있다. 특별히 이에 제한되지는 않으나, 통상적인 siRNA 발현용 벡터인 psiRNA(Invitrogen, USA), pRNA(GenScript, USA), psLentGene(Promega, USA), pSIREN(Clontech, USA), pU6shX(VectorCoreA, Korea), 또는 pSilencer(ambion, USA)에 상기 siRNA에 대응하는 DNA 염기 서열이 삽입될 수 있다. 벡터의 컨스트럭트는 형질전환될 형태, 시간 및 siRNA 발현 수준 등과 같은 특정 환경에 의해 결정된다. 바람직하게는 도 1의 A에 도시된 pcDNA-TLR8miRNA의 개열지도에 나타난 발현벡터인 것을 특징으로 한다.

벡터는 순수 플라스미드 DNA 또는 형질감염 시약 또는 표적-전달 물질과 함께 복합체로 또는 재조합 바이러스 벡터의 형태로 세포 내 핵으로 전달될 수 있다. 바이러스 벡터로는 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스, 렌티 바이러스를 포함하는 레트로바이러스 등의 바이러스 등이 사용될 수도 있다. 바람직하게 상기 벡터는 예를 들어 살모넬라와 같은 박테리아 세포에 의해 전달된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 톨라이크리셉터-8 유전자의 발현을 억제하고 서열번호 2의 염기서열을 갖는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 전사하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 박테리아 세포를 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 아토피성 피부염 치료용 조성물에 있어서, 상기 박테리아 세포는 살모넬라 티피머리움(salmonella typhimurium)인 것을 특징으로 한다. 살모넬라 균주는 장티푸스를 유발하는 group D Salmonella에 속하는 병원균으로서, 본 발명에서는 상기 살모넬라 균주의 병원성을 없애기 위해 약독화된(attenuated) 살모넬라 균주를 사용하였다. 상기 약독화된 살모넬라 균주는 장티프스 예방용 약독화 백신인 것을 특징으로 한다. 상기 "약독화(attenuation)"란 살아있는 병원체의 독성을 인공적으로 약하게 만든 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 질병을 일으키지 못하고, 면역 체계만을 자극하여 면역성을 유도하는 것을 의미한다.

본 발명의 구체적인 실시예에 사용된 살모넬라 균주는 살모넬라 티피머리움(salmonella typhimurium) BRD509 균주로, 병원성이 없는 약독화된 균주이다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 TLR8 유전자를 억제시키는 siRNA를 발현하는 재조합 벡터를 약독화된 살모넬라 균주에 형질도입 함으로써 본 발명의 살모넬라를 제작하고, 아토피와 유사한 피부병을 유발시킨 마우스 모델에 상기 형질도입된 살모넬라를 투여함으로써 그에 의한 아토피성 피부질환의 예방 및 치료효과를 형질도입 시키지 않은 대조군 살모넬라 자체에 의한 효과와 비교분석하여 확인하였다. 분석 결과, 도 6 및 도 7에 나타낸 것과 같이, 형질도입시키지 않은 살모넬라만을 경구투여시 아토피 피부염에 거의 효과가 없으며, TLR8 유전자 발현을 억제하는 siRNA를 발현하는 재조합 벡터를 형질도입시킨 살모넬라를 경구투여한 경우 아토피성 피부염을 치료하는 효과가 나타남을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상기 siRNA를 발현시킬 수 있는 프로모터와 클로닝을 위한 멀티클로닝사이트를 가지고 있는 어떠한 발현벡터도 사용할 수 있으나, 바람직하게는 도 1의 A에 도시된 pcDNA-TLR8miRNA의 개열지도에 나타난 발현벡터인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 아토피성 피부염 치료 효과를 유도하는 siRNA를 발현하는 살모넬라 균주는 당업계에서 통상 사용되는 형질도입방법에 의해 제조가능하며, 제조된 살모넬라를 체내에 도입시킬 때, 상기 siRNA가 과발현될 수 있다.

본 발명의 아토피성 피부염 치료용 조성물은 약제로 이용되기 위해서 약제학적 분야에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제, 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있어 이를 참조할 수 있다. 또한 이들은 비경구 투여(예컨대, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여될 수 있다. 바람직하게는 경구 투여된다.

본 발명의 치료용 조성물은 치료학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 "치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강상태, 질병의 증상, 투여시간, 투여방법에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 0.01 ~ 100 mg이 투여될 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 TLR8 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 박테리아 세포를 제조할 수 있으며, 상기 박테리아 세포를 이용하여 아토피성 피부염의 유발을 억제시킬 수 있다. 상기 TLR8 유전자에 특이적인 siRNA(small interfering RNA)를 발현하는 재조합 벡터로 형질도입된 살모넬라 BRD509 균주를 피부염이 유발된 쥐에 투여한 경우, 아토피성 피부염의 억제인자인 IFN-γ의 발현을 증가시켰으며 동시에 아토피 질환의 지표인 Ig-E의 면역반응을 억제시키는 효과를 확인할 수 있었다. 또한 상기 면역반응의 결과로 아토피성 피부염의 증상인 가려움증 및 피부염의 증상완화 효과가 나타남을 확인하였다. 따라서, 아토피성 피부염에 치료효과를 갖는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 이용한 치료용 조성물은 난치성 질환으로 적절한 치료제가 부재한 아토피성 피부질환의 치료 및 예방제로서 의약산업에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 의한 TLR8 유전자의 siRNA를 전사하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pcDNA-TLR8miRNA의 개열지도(도 1의 A)와, 각각의 벡터의 siRNA발현에 의한 특이적으로 TLR8 유전자가 억제된 결과를 보인 도면이다(도 1의 B). control은 PBS, miRCV(CV)는 TLR8 유전자에 특이적인 miRNA가 삽입되지 않은 벡터, miRTLR8(mi-TLR8)은 TLR8 유전자에 특이적인 miRNA를 발현하는 재조합 벡터를 나타낸다. 그 결과 TLR8 유전자의 siRNA는 TLR8을 억제할 수 있음을 보여주었다.
도 2는 본 발명에 의한 TLR8 유전자의 siRNA가 타겟 유전자인 TLR8 뿐 아니라 IL-1a, IL-1b, IL-18, CCL17, CCL22 등도 동시에 억제시킬 수 있는 다중 유전자 억제효과를 가지고 있음을 확인한 도면이다. 본 발명에 의한 하나의 siRNA는 여러 유전자를 동시에 억제할 수 있다.
도 3은 본 발명에 의한 TLR8 유전자 siRNA(또는 miRNA)를 발현하는 벡터와 상기 벡터를 함유한 살모넬라를 세포에 각각 처리한 후 siRNA의 발현을 GFP 발현분석을 통해 확인한 실험 결과를 나타낸다. 이를 통해 본 발명에 의한 siRNA발현 벡터는 유전자건이나 리포좀 등의 별도의 조작 없이는 세포에 일반적으로 들어가 발현할 수 없으나 살모넬라에 들어간 벡터의 경우 효과적으로 세포 내에서 발현될 수 있음을 확인할 수 있다.
도 4는 본 발명에 의한 조성물에 의해 TLR8 유전자 siRNA를 발현하는 살모넬라를 경구투여한 후 염증사이토카인의 변화를 측정한 결과를 보인 도면이다. 도 4의 A는 벡터도 포함하지 않은 대조군 마우스 세럼에서의 염증사이토카인을 측정한 결과이고(control-mouse serum), 도 4의 B는 본 발명에 의한 siRNA를 발현하는 벡터를 투여한 후 마우스 세럼에서의 염증사이토카인 변화를 나타내고(control vector mouse serum), 도 4의 C는 본 발명에 의한 상기 벡터를 함유하는 살모넬라를 투여한 후 마우스 세럼에서의 염증사이토카인 변화를 나타낸다(ST-miR TLR8 mouse serum). 도 4의 C에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의한 siRNA를 발현하는 벡터를 함유하는 살모넬라를 경구투여하면 아토피성 피부염의 억제인자인 IFN-gamma의 발현이 증가한 것을 확인할 수 있다.
도 5는 본 발명에 의한 TLR8 유전자 siRNA를 발현하는 살모넬라를 PBS에 혼탁하여 경구투여할 경우 마우스동물의 체내에 살모넬라가 이동하여 분포하고 체내의 조직에서 신장(kidney), 비장(spleen), 간(liver)에서 발현이 유도됨을 보여주는 도면이다. 대조군으로 벡터 또는 합성 siRNA만을 PBS에 혼탁하여 동일양으로 투여한 경우에는 조직 내에서 siRNA 발현이 관찰되지 않았다.
도 6은 본 발명에 의한 조성물에 의한 아토피성 피부염이 유도된 마우스에서의 miRTLR8을 경구투여한 후에 가려움증(SCRATCH/15MIN)의 저하를 확인한 결과를 보인 도면이다. CON : PBS 경구투여군, CV는 TLR8 유전자에 특이적인 miRNA가 삽입되지 않은 벡터를 형질도입시킨 살모넬라 균주 경구 투여군, miRTLR8 : TLR8 유전자에 특이적인 siRNA를 발현하는 재조합 벡터로 형질도입된 살모넬라 균주 경구 투여군.
도 7은 아토피성 피부염을 유도시킨 마우스에서 본 발명에 의한 조성물에 의한 피부의 염증 완화를 보여주는 도면이다. CON : PBS 경구투여군, CV는 TLR8 유전자에 특이적인 miRNA가 삽입되지 않은 벡터를 형질도입시킨 살모넬라 균주 경구 투여군, miRTLR8 : TLR8 유전자에 특이적인 siRNA를 발현하는 재조합 벡터로 형질도입된 살모넬라 균주 경구 투여군. 도 7의 C에 나타난 바와 같이, TLR8siRNA를 투여한 마우스에서 피부염증의 완화가 뚜렷하게 관찰된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. TLR8 유전자에 특이적인 miRNA 의 구축

TLR8 유전자 염기서열에서 miRNA에 상보적인 타겟(target) 염기서열을 결정하기 위해, miRNA 활성 효율에 영향을 주는 이차 구조(secondary structure), GC contents, cis-acting sequences 등을 고려하여 functional miRNA를 설계할 수 있는 알고리즘 프로그램에 TLR8 유전자 염기서열을 넣어 miRNA 타겟 염기서열을 검색하여 21-뉴클레오티드의 miRNA 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.

각각의 단일 가닥 올리고(single strand oligo)는 miRNA 염기서열을 바탕으로 플라스미드 벡터와 연결할 수 있는 링커(linker) 염기서열(TGCT, CCTG)과 센스 가닥(sense strand)과 안티-센스 가닥(anti-sense strand)을 연결하는 루프(loop) 염기서열(TTGGCCACTGACT)을 삽입하여 설계한 각 64-뉴클레오티드의 top 및 bottom strand를 이중 가닥 올리고(double strand oligo)로 합성한 후, T4 DNA ligase를 통해 pcDNA6.2-GW/±EmGFP-miR vector(INVITROGEN, USA)의 5' 및 3' miR flanking region 사이에 삽입하여 재조합 벡터 pcDNA-TLR8(도 1의 A)를 제조하였다.

상기 합성된 top 및 bottom strand 염기서열은 하기에 나타내었다.

Top strand : 5'-TGC TGA AAC CAG GTA GAA GGA ATC GTG TTT TGG CCA CTG ACT GAC ACG ATT CCC TAC CTG GTT T-3'(서열번호 1),

Bottom strand : 5'-CCT GAA ACC AGG TAG GGA ATC GTG TCA GTC AGT GGC CAA AAC ACG ATT CCT TCT ACC TGG TTT C-3'(서열번호 2)

위 제조된 TLR8-siRNA의 TLR유전자의 억제는 RAW 264.7 Cell에 형질도입하여 발현양상을 RT-PCR기법을 통해 확인하였다(도 2).

실시예 2. 구축된 TLR8 유전자 특이적 miRNA 벡터( vector )의 형질전환

상기 실시예 1에서와 같이 구축된 TLR8 유전자에 특이적인 miRNA벡터(pcDNA-TLR8miRNA)를 약독화된 살모넬라 균주인 BRD509(Salmonellatyphimurium BRD509) competent cell(J Infect Dis. 1994 Dec;170(6):1508-17, Medeva사, London으로 구입가능)에 electrophoration shock을 통해 형질도입시켰다. 본 발명의 구체적인 실시예는 하기에 나타내었다.

먼저, 약독화된 살로넬라 균주 BRD509(Salmonella typhimuriumBRD509)를 37 ℃에서 루리아 벌테니(Luria Bertani) 배지에 배양하였다. 배양된 상기 살모넬라 균주에 마우스의 pcDNA-TLR8 miRNA 벡터를 형질도입하기 위해, 상기 살모넬라 균주를 다시 100 ml의 양으로 24 시간 동안 배양한 후, 600 nm에서 광학흡광도(O.D.600)를 측정하였다. 이후, 0.7을 나타내는 배양농도에서 세균을 5500rpm의 속도로 원심분리하였다. 원심분리 후, 바닥에 가라앉은 세균만을 수집하여 배양부피와 동일한 부피의 차가운 증류수로 희석하였다. 상기 희석된 세균을 다시 상기와 동일한 방법으로 원심분리하여 2 ml의 차가운 20% 글리세롤 증류수에 희석시킨 후, 또다시 원심분리의 과정을 수행하였다. 이후, 수득한 세균을 100 μl의 20% 글리세롤에 희석하였다. 상기 과정에 의해 얻어진 혼합액의 30 μl(2 μg)를 미니원심분리용기에 넣은 후, 상기 용기에 pcDNA-TLR8miRNA 벡터를 3 μl(2 μg)를 가한 후, 275-325V의 전기로 형질도입을 유도하였다.

실시예 3. 동물세포에서 피부염 억제효과의 측정

5주령 된 ICR mouse를 5 마리씩 대조군과 실험군의 두 그룹으로 나눈 후, 각각의 쥐에 피부병 유발 물질인 DNCB를 1%의 농도로 1주일간 100 μl씩 도포하여 아토피와 유사한 피부병을 유발시켰다. 이후 마우스를 해부하여 비장조직을 적출한 후 10ml의 PBS용액 속에서 호모게나이저를 이용하여 단일세포로 분리하였다. 분리된 비장세포는 RBC lysing buffer(Sigma USA)에 의해 적혈구를 제거하고 RPMI1640 배지(100 units/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin and 10% FBS)에서 배양되었다. 5.0 x 10⁷세포를 Lectin (10 μg /ml, Sigma; USA)과 IL-4(20 ng/ml, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 처리하여 배양한 후 TLR8 siRNA 발현 플라스미드를 실시예 2의 방법으로 첨가하여 TLR8, 인터루킨, IFN-gamma 등의 발현을 RT-PCR기법을 이용하여 측정하였다(도 2). 각각의 사용된 probe는 통상의 기법에 준하여 사용하였다.

실시예 4. 생체 내( in vivo ) 실험을 위한 아토피성 피부염 모델 제조 및 아토피성 피부염 지표 측정

5주령 된 ICR mouse를 5 마리씩 대조군과 실험군의 두 그룹으로 나눈 후, 각각의 쥐에 피부병 유발 물질인 DNCB를 1%의 농도로 1주일간 100 μl씩 도포하여 아토피와 유사한 피부병을 유발시켰다. 이후, 실험군 쥐에 TLR8 유전자에 특이적인 miRNA 벡터가 형질도입된 살모넬라 BRD509 균주를 1.6 x 10⁸의 농도로 경구투여 하였다. 투여한 지 일주일이 되는 시점에 안와채취법을 이용하여 각각의 쥐의 혈청을 뽑아 아토피성 피부염의 지표인 IFN-γ, Ig-E의 혈청 내 적정농도를 구하기 위해 ELISA 실험을 수행하였다. 상기 IFN-γ는 아토피를 억제시키는 사이토카인이며, Ig-E는 아토피성 피부염을 유발하는 항체이다.

실험 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 TLR8 유전자에 특이적인 miRNA를 발현하는 재조합 벡터로 형질도입된 살모넬라 BRD509 균주를 세포에 직접 감염시킬 경우 염증세포에서 TLR8 siRNA가 발현됨을 알 수 있다. 또한 동물에 경구 투여할 때에 도 4에 나타난 바와 같이 Th-1 면역반응의 지표인 IFN-γ의 발현이 혈중에 증가함을 관찰하였다. 또한, 도 6에 나타난 바와 같이 아토피 질환의 지표인 가려움증 반응이 급격히 감소하였다. 그리고 도 7에 나타난 바와 같이, 대조군인 CON(PBS로 처리군)와 CV(TLR8 유전자에 특이적인 miRNA가 삽입되지 않은 벡터를 형질도입시킨 살모넬라 균주 처리군)를 각각 처리한 군에 비해 miRTLR8(TLR8 유전자에 특이적인 miRNA를 발현하는 재조합 벡터로 형질도입된 살모넬라 균주 처리군)를 투여한 실험군의 경우 피부염의 증상완화가 눈에 띄게 감소함을 볼 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.　따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> TLR8 siRNA for treatment of atopy dermatitis and composition of therapeutic agent comprising the same <130> P11-111025-01-TLR8 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense of TLR8 target sequence <400> 1 tgctgaaacc aggtagaagg aatcgtgttt tggccactga ctgacacgat tccctacctg 60 gttt 64 <210> 2 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense of TLR8 target sequence <400> 2 cctgaaacca ggtagggaat cgtgtcagtc agtggccaaa acacgattcc ttctacctgg 60 tttc 64

Claims (5)

1. 톨라이크리셉터-8 유전자의 발현을 억제하고 서열번호 2의 염기서열을 갖는 작은 간섭RNA(siRNA).
2. 제1항의 siRNA를 전사하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
3. 제2항의 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 치료용 조성물.
4. 톨라이크리셉터-8 유전자의 발현을 억제하고 서열번호 2의 염기서열을 갖는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 전사하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 박테리아 세포를 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 치료용 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 살모넬라 티피머리움(salmonella typhimurium)인 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 치료용 조성물.

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