KR20140094971A - 흉선 및 활성화-조절 케모카인을 억제하는 재조합 살모넬라 및 이를 함유하는 천식 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 박테리아 세포를 유효성분으로 함유하는 천식 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자의 발현을 억제하여 ROS 발현 및 기도 과민성 등을 완화하여 난치성 질환으로 적절한 치료제가 부재한 천식 질환을 치료할 수 있다.

Description

흉선 및 활성화-조절 케모카인을 억제하는 재조합 살모넬라 및 이를 함유하는 천식 치료용 조성물{Recombinant salmonella suppressing thymus and activation-regulated chemokine for treatment of asthma and composition of therapeutic agent comprising the same}
본 발명은 흉선 및 활성화-조절 케모카인을 억제하는 재조합 살모넬라 및 이를 함유하는 천식 치료용 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 살모넬라를 유효성분으로 함유하는 천식 치료용 조성물에 관한 것이다.
천식(喘息)은 호흡 곤란을 일으키는 염증성 기도 폐쇄 질환이다. 천식 환자는 기도의 폐쇄로 인해 천명(喘鳴, 숨소리가 색색거림), 호흡곤란, 기침 등의 증상을 호소하며, 증상은 낮보다 밤에 심해지는 경향이 있다. 또한 과도한 가래 형성으로 숨을 내쉴 때(호기, 呼氣)에 어려움을 겪기도 한다.
천식은 전 세계적으로 증가하는 추세이며 우리나라에서도 천식인구는 증가하고 있다. 우리나라만 하더라도 공식적으로 알려진 천식환자의 국내 유병률은 6% 정도이며, 이는 당뇨병의 유병률과 맞먹는다. 최근 국민건강영양조사에 따르면 천식은 국내 인구의 17.45%가 앓고 있는 흔한 질환이다.
천식의 원인과 기전은 다양하고 복잡하여 그동안 많은 연구에도 불구하고 아직 확실하게 밝혀져 있지 않다. 최근 연구에 의하면 천식의 기본 기전은 기도의 만성염증에 의한 기류장애와 기도 과민성으로 생각되고 있다. 최근까지는 천식면역 기전은 Th2 면역반응에 주안점을 두고 Th2 면역반응이 Th1 면역반응 보다 우세하게 작용하여 두 면역 반응의 균형이 깨지면 발생한다는 '위생가설(Hygiene hypothesis)'로 설명하고 있다.
소아 천식의 절반은 성인에 이르기까지 이어져 성인 천식으로 지속된다. 천식 소인이 있는 사람은 상기도 감염으로 인한 급성 기도 폐색을 겪을 수 있으며, 심할 경우 이로 인해 사망할 수도 있다. 급성기에는 저농도 산소 투여(2L/m 이하), 스테로이드, 아미노필린, 에피네프린 주사 등으로 치료할 수 있으며, 심할 경우에는 기도 삽관을 해야 하는 경우도 있다. 천식은 일종의 알레르기 질환으로 현재로서는 50% 이상의 치료효과를 가져오는 약제가 없으며 천식을 유발하는 항원을 피하는 것이 가장 좋은 예방법이다.
현재 천식 치료는 알레르기검사에서 알려진 발작원인물질인 진드기, 곰팡이 비듬 등의 유발인자를 제거하든지 회피하는 환경요법과 기관지 수축과 알레르기 염증반응의 과정을 차단함으로 천식을 억제하는 약물요법을 사용하고 있다. 하지만 현존 치료법이 실제 50% 이상의 효능이 나오지 않고 있으며 약물의 적절한 사용과 병용을 통해 조절하고 있는 실정이나 반복적으로 자주 재발하는 특징을 가진 천식질환은 현재로는 완치가 불가능하다.
현재 사용되는 천식치료제는 항염증제, 소염제, 기관지 확장제, 항히스타민제가 있으며, 주치료제는 기도염증을 치료하는 소염제, 즉 스테로이드 제제이며 기관지 확장제는 필요할 경우 증상 완화를 위해 사용할 수 있다.
현재 가장 효과적인 치료약은 염증 반응을 가라앉히기 위해 사용되는 스테로이드 제제이다. 하지만 먹는 스테로이드 제제는 장기간 사용하면 고혈압, 백내장, 골다공증, 면역기능 감소 등 전신 부작용이 심각하게 나타난다. 경구용은 2주 이상 쓰면 부작용이 바로 나타날 정도다.
흡입용 스테로이드를 가장 우선시 되는 약제로 권고하고 있으며, 흡입형 스테로이드로 천식이 조절되지 않는 환자들에게 흡입형 스테로이드와 장시간 작용형 베타투(b-2)를 병용하여 사용하는 것을 권고하고 있다.
현재 가장 1차적인 천식약제로 각광받고 있는 장시간 작용형 b-2 효능약과 흡입용 스테로이드를 병용하는 것이 가장 효과적인 것으로 알려져 있다. 이 두 약물을 병용한 것이 세레타이드 등의 약물이며, 천식치료제로서 현재 전 세계에서 가장 많은 처방이 이뤄지고 있다. 하지만 경구형 스테로이드보다는 완화되었지만 흡입용스테로이드의 경우도 고용량의 스테로이드를 장기적으로 흡입하면 용량과 사용기간에 비례하여 부신 억제, 골밀도 감소, 성장 장애, 눈과 피부 합병증과 같은 전신부작용이 발생할 수 있다.
본 발명의 배경이 되는 기술로서 대한민국 등록특허 10-1091029(2011.12.09)에 아토피성 피부염에 치료효과를 갖는 작은 간섭 RNA에 대해 기재되어 있고, Curr Allergy Asthma Rep. 2005 Mar;5(2):155-60.에는 CCL17이 알러지 치료에 새로운 접근방법이 될 수 있다고 기재되어 있다. 그러나, 흉선 및 활성화-조절 케모카인을 억제하는 재조합 살모넬라를 이용한 천식 치료에 대해서는 전혀 개시되어 있지 않다.
대한민국 등록특허 10-1091029(2011.12.09)
Curr Allergy Asthma Rep. 2005 Mar;5(2):155-60.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 21 ~ 25개 정도의 뉴클레오티드로 구성된 단일 염기가닥인 siRNA의 RNAi(RNA interference)를 살모넬라를 캐리어로 이용하여 천식이 유발된 실험군에 경구 투여하는 경우, Th-2 면역반응의 지표인 IL-4의 발현을 감소시키고, Th-1 면역반응의 지표인 IFN-γ의 발현을 증가시키며, 또한 폐의 염증세포가 억제되고, ROS의 발현이 억제되고 기도과민성이 억제되어 천식을 완화시킬 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자의 표적서열에 특이적인 siRNA를 유효성분으로 포함하는 천식 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 살모넬라를 이용한 경구형 천식 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자의 발현을 억제함으로써 IL-4의 발현을 감소시키고, IFN-γ의 발현을 증가시키고, ROS의 발현 및 기도과민성이 억제시켜 천식에 치료효과를 갖는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자의 표적서열에 특이적인 서열번호 2의 염기서열을 갖는 siRNA를 유효성분으로 포함하는 천식 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자의 발현을 억제하는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 siRNA를 전사하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 살모넬라 티피머리움(salmonella typhimurium)을 유효성분으로 함유하는 천식 치료용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자의 표적서열에 특이적인 siRNA를 유효성분으로 포함하는 천식 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자 표적서열은 서열번호 1인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 'siRNA(small interfering RNA)'란 특정 mRNA의 절단을 통하여 RNA 간섭을 유도할 수 있는 짧은 이중가닥 RNA를 말한다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중가닥 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 쌍을 이루는 염기 길이는 10 내지 40 염기, 바람직하게는 15 내지 30 염기이다. siRNA 말단 구조는 표적 유전자의 발현을 RNA 간섭 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활 말단 또는 돌출 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출 구조와 5' 말단 돌출 구조 모두 가능하다.
본 발명의 인간 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자의 siRNA는 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열과 이와 상보적인 서열을 포함하는 이중가닥 siRNA일 수 있다.
본 발명의 siRNA는 그 활성을 저하시키지 않는 하나 이상의 치환, 삽입, 결실 및 그 조합을 갖는 변형체를 포함한다. 이러한 변형체는 상기한 siRNA의 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 가질 수 있으며, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는다.
본 발명의 siRNA는 직접 화학적으로 합성하거나(Sui G 등, (2002) A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 5515-5520), 인비트로 전사를 이용하여 합성하는 방법(Brummelkamp TR 등, (2002) A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian celss, Science 296: 550-553) 등 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 합성할 수 있다.
본 발명의 siRNA는 기본적으로 두 가닥의 RNA가 쌍을 이루어 이중가닥 siRNA를 형성하고 있는 형태이지만, 플라스미드계 shRNA 벡터와 PCR 발현카세트 등에 의한 트랜스펙션에 이용될 수 있도록 짧은 헤어핀을 갖는 구조로 변형된 형태일 수도 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 전사하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 박테리아 세포를 유효성분으로 함유하는 경구형 천식 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 천식 치료용 조성물에 있어서, 상기 박테리아 세포는 살모넬라 티피머리움(salmonella typhimurium)인 것을 특징으로 한다. 살모넬라 균주는 장티푸스를 유발하는 group D Salmonella에 속하는 병원균으로서, 본 발명에서는 상기 살모넬라 균주의 병원성을 없애기 위해 약독화된(attenuated) 살모넬라 균주를 사용하였다. 상기 약독화된 살모넬라 균주는 장티프스 예방용 약독화 백신인 것을 특징으로 한다. 상기 "약독화(attenuation)"란 살아있는 병원체의 독성을 인공적으로 약하게 만든 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 질병을 일으키지 못하고, 면역 체계만을 자극하여 면역성을 유도하는 것을 의미한다.
본 발명의 구체적인 실시예에 사용된 살모넬라 균주는 살모넬라 티피머리움(salmonella typhimurium) BRD509 균주로, 병원성이 없는 약독화된 균주이다.
본 발명의 상기 siRNA는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 siRNA인 것을 특징으로 한다. 상기 siRNA는 21 ~ 25 뉴클레오티드의 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자의 mRNA와 상보적인 염기서열로써, 바람직하게는 상기 서열번호 2의 염기서열과 이와 상보적인 서열을 포함하는 이중가닥(double-strand) siRNA일 수 있다. 본 발명에서는 서열번호 1과 서열번호 2의 이중가닥 올리고(top 및 bottom strand)를 합성하여 사용하였다. 상기 siRNA는 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하여 번역을 방해하는 과정을 통해 유전자 기능을 억제한다. 다음 표 1은 siRNA에 쓰이는 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자의 표적 서열(target sequence)과 siRNA의 서열을 나타낸 것이다.
Thymus and activation-regulated chemokine(CCL17) TARGET SEQUENCE
서열번호 1. :SENSE SEQUENCE 5`-TGC TGA TCC CTG GAA CAC TCC ACT GAG TTT TGG CCA CTG ACT GAC TCA GTG GAG TTC CAG GGA T-3`
서열번호 2. :ANTISENSE SEQUENCE 5`-CCT GAT CCC TGG AAC TCC ACT GAG TCA GTC AGT GGC CAA AAC TCA GTG GAG TGT TCC AGG GAT C-3`
본 발명에 따른 siRNA 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현벡터 내에 포함될 수 있다. 상기 "작동 가능하게 연결(operably linked)" 된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. 상기 "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자를 억제시키는 siRNA를 발현하는 재조합 벡터를 약독화된 살모넬라 균주에 형질도입 함으로써 본 발명의 살모넬라를 제작하고, 천식을 유발시킨 마우스 모델에 상기 형질도입된 살모넬라를 투여함으로써 그에 의한 천식 질환의 예방 및 치료효과를 형질도입 시키지 않은 대조군 살모넬라 자체에 의한 효과와 비교분석하여 확인하였다. 분석 결과, 도 3 내지 4에 나타낸 것과 같이, 형질도입 시키지 않은 살모넬라만을 경구투여시 천식 질환을 오히려 증가시켰으나, siRNA를 발현하는 재조합 벡터를 형질도입시킨 살모넬라를 경구투여한 경우 천식을 치료하는 효과가 나타남을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상기 siRNA를 발현시킬 수 있는 프로모터와 클로닝을 위한 멀티클로닝사이트를 가지고 있는 어떠한 발현벡터도 사용할 수 있으나, 바람직하게는 도 1에 도시된 pcDNA-CCL17miRNA의 개열지도인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 천식 치료 효과를 유도하는 siRNA를 발현하는 살모넬라 균주는 당업계에서 통상 사용되는 형질도입방법에 의해 제조 가능하며, 제조된 살모넬라를 체내에 도입시킬 때, 상기 siRNA가 과발현될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열을 갖는 siRNA인 것을 특징으로 하는 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 제공한다.
본 발명은 상기 siRNA를 전사하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 박테리아 세포를 제공한다. 본 발명의 상기 박테리아 세포는 살모넬라 티피머리움(salmonella typhimurium)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 천식 치료용 조성물은 약제로 이용되기 위해서 약제학적 분야에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제, 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있어 이를 참조할 수 있다. 또한 이들은 비경구 투여(예컨대, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여될 수 있다. 바람직하게는 경구 투여된다.
본 발명의 치료용 조성물은 치료학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 "치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강상태, 질병의 증상, 투여시간, 투여방법에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 0.01 ~ 100 mg이 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르며, 본 발명은 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 또는 그 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 천식 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine)은 천식 환자에게서 그 발현이 증가한다. 따라서, 본 발명에 따른 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 또는 그 단편은 천식 질환의 진단 마커로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 또는 그 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 천식 질환 진단용 키트는, 상기 마커를 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. 상기 앱타머는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)이다.
상기 천식 질환 진단용 키트는 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 또는 그 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있다.
상기 2차 항체 접합체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluoresceinisothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질(fluorescein), 및 색소(dye) 등이 사용될 수 있다.
상기 발색 기질 용액은 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD(o-phenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색 기질은 완충용액(0.1M NaOAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다.
상기 세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02M 인산염 완충용액, 0.13M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충용액 (PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 가하여 3회 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 황산 용액이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 생물학적 시료에서 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 또는 그 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 또는 그 단편을 검출하여, 천식 질환의 진단 또는 예후를 조기에 예측할 수 있다. 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 복막액, 활막액, 타액, 소변 또는 대변을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로는, 생물학적 시료 내 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 또는 그 단편을 SDS-PAGE에서 전기영동하여 분획하고 고정체로 옮겨 고정시킨 후, 고정된 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 또는 그 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 가하여 항원-항체 결합반응을 수행하고, 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 또는 그 단편의 발현 수준을 측정한다. 즉, 생물학적 시료에서 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 또는 그 단편의 발현 수준이 높으면, 천식 질환을 갖는 것으로 진단하거나 천식 질환의 가능성을 가질 것으로 예측하는 것이다.
상기 항원-항체 결합반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오스 막, PVDF 막 (polyvinylidene difluoride membrane), 폴리비닐 수지 또는 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 사용될 수 있다.
상기 항원-항체 결합반응은 통상의 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 ELISA법, 노던 블롯, 웨스턴 블롯, 면역침강법, 면역조직화학염색법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법, SPR (surface plasmon resonance), 바이오칩(DNA, RNA), 전기영동법, PCR, RT-PCR 등의 방법을 이용하여 측정할 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자의 발현을 억제하는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 박테리아 세포를 제조할 수 있으며, 상기 박테리아 세포를 이용하여 천식 질환의 유발을 억제시킬 수 있다. 상기 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자에 특이적인 siRNA(small interfering RNA)를 발현하는 재조합 벡터로 형질도입된 살모넬라 BRD509 균주를 염증 및 천식질환이 유발된 쥐에 투여한 경우, 천식질환의 활성인자 중 하나인 IL-4의 발현을 억제시키고, 천식 질환의 억제인자인 IFN-γ의 발현을 증가시켰으며 동시에 천식 질환의 지표인 염증세포의 면역반응을 억제시키는 효과를 확인할 수 있었다. 또한 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자의 억제는 혈중에 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 발현양의 억제를 유도하였고 천식동물모델에서 염증유발활성 인자인 ROS의 억제와 천식질환의 증상인 기도과민성 반응의 완화 효과가 나타남을 확인하였다. 따라서, 천식 질환에 치료효과를 갖는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 이용한 치료용 조성물은 난치성 질환으로 적절한 치료제가 부재한 천식 질환의 치료 및 예방제로서 의약산업에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 의한 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자의 siRNA를 전사하는 유전자를 발현할 수 있는 플라스미드를 포함하는 재조합 살모넬라의 개략적 도면이다.
도 2는 본 발명에 의한 조성물에 의해 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자를 발현하는 살모넬라를 마우스에서 분리한 비장세포에 투여한 후 CCL17을 포함한 염증 사이토카인의 변화를 측정한 결과를 보여주는 도면이다. 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine)를 억제하는 siRNA를 발현하는 살모넬라(ST-miR-CCL17)를 투여한 세포주에서는 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine)의 억제와 더불어 IL-4의 억제가 유도되었으며 Th1 사이토카인인 IFN-γ의 유전자가 증가되었음을 보여주는 도면이다.
도 3은 천식 환자군의 혈청분석의 결과를 보여주는 도면이다. 천식환자와 대조군환자의 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine)의 발현양을 분석하여 천식환자군에서 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 발현이 증가하여 있음을 확인해주는 도면이다.
도 4는 본 발명에 의한 조성물에 의해 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자를 억제하는 재조합 살모넬라를 마우스에서 투여한 후에 염증관련 사이토카인의 변화를 측정한 결과를 보여주는 도면이다. 마우스에 투여한 후 마우스 혈액에서 IL-4(a)와 IgE(c)의 억제효과를 확인할 수 있었으며 동시에 IFN-γ(b)의 증가가 유도되었음을 보여주는 도면이다.
도 5는 천식 마우스 동물모델에서 본 발명에 의한 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine)을 억제하는 siRNA를 발현하는 살모넬라(ST-miR-CCL17)를 투여한 후에 1주 후에 ROS의 발현이 억제되어 천식을 완화시킬 수 있음을 보여주는 도면이다.
도 6은 천식 마우스 동물모델에서 본 발명에 의한 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine)을 억제하는 siRNA를 발현하는 살모넬라(ST-miR-CCL17)를 투여한 후에 1주 후에 기도과민성이 억제되어 천식을 완화시킬 수 있음을 보여주는 도면이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 흉선 및 활성화-조절 케모카인( thymus and activation - regulated chemokine) 유전자에 특이적인 miRNA 의 확인
흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자 염기서열(NCBI Accession No. NM_002987)에서 miRNA에 상보적인 타겟(target) 염기서열을 결정하기 위해, miRNA 활성 효율에 영향을 주는 이차 구조(secondary structure), GC contents, cis-acting sequences 등을 고려하여 functional miRNA를 설계할 수 있는 알고리즘 프로그램에 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자 염기서열을 넣어 miRNA 타겟 염기서열을 검색하여 21-뉴클레오티드의 miRNA 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
각각의 단일 가닥 올리고(single strand oligo)는 miRNA 염기서열을 바탕으로 플라스미드 벡터와 연결할 수 있는 링커(linker) 염기서열(TGCT, CCTG)과 센스 가닥(sense strand)과 안티-센스 가닥(anti-sense strand)을 연결하는 루프(loop) 염기서열(TTGGCCACTGACT)을 삽입하여 설계한 각 64-뉴클레오티드의 top 및 bottom strand를 이중 가닥 올리고(double strand oligo)로 합성한 후, T4 DNA ligase를 통해 pcDNA6.2-GW/±EmGFP-miR vector(INVITROGEN, USA)의 5' 및 3' miR flanking region 사이에 삽입하여 재조합 벡터 pcDNA-CCL17miRNA (도 1)를 제조하였다. 상기 합성된 top 및 bottom strand 염기서열은 하기에 나타내었다.
Thymus and activation-regulated chemokine(CCL17) TARGET SEQUENCE
서열번호 1 :SENSE SEQUENCE
(Top strand)		 5`-TGC TGA TCC CTG GAA CAC TCC ACT GAG TTT TGG CCA CTG ACT GAC TCA GTG GAG TTC CAG GGA T-3`
서열번호 2 :ANTISENSE SEQUENCE (Bottom strand) 5`-CCT GAT CCC TGG AAC TCC ACT GAG TCA GTC AGT GGC CAA AAC TCA GTG GAG TGT TCC AGG GAT C-3`
위 제조된 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine)-siRNA의 발현벡터는 살모넬라 균주를 형질전환하는데 사용되었다.
실시예 2. 구축된 흉선 및 활성화-조절 케모카인( thymus and activation -regulated chemokine ) 유전자 특이적 miRNA 벡터( vector )의 형질전환
상기 실시예 1에서와 같이 구축된 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자에 특이적인 miRNA벡터(pcDNA-CCL17miRNA)를 약독화된 살모넬라 균주인 BRD509(Salmonellatyphimurium BRD509) competent cell(J Infect Dis. 1994 Dec;170(6):1508-17, Medeva사, London으로 구입가능)에 electrophoration shock을 통해 형질도입 시켰다. 본 발명의 구체적인 실시예는 하기에 나타내었다.
먼저, 약독화된 살모넬라 균주 BRD509(Salmonella typhimurium BRD509)를 37 ℃에서 루리아 벌테니(Luria Bertani) 배지에 배양하였다. 배양된 상기 살모넬라 균주에 마우스의 pcDNA-CCL17 miRNA 벡터를 형질도입하였다. 보다 구체적으로 상기 살모넬라 균주를 다시 100 ml의 양으로 24 시간 동안 배양한 후, 600 nm에서 광학흡광도(O.D.600)를 측정하였다. 이후, 0.7을 나타내는 배양농도에서 세균을 5500 rpm의 속도로 원심분리하였다. 원심분리 후, 바닥에 가라앉은 세균만을 수집하여 배양부피와 동일한 부피의 차가운 증류수로 희석하였다. 상기 희석된 세균을 다시 상기와 동일한 방법으로 원심분리하여 2 ml의 차가운 20% 글리세롤 증류수에 희석시킨 후, 또다시 원심분리의 과정을 수행하였다. 이후, 수득한 세균을 100 μl의 20% 글리세롤에 희석하였다. 상기 과정에 의해 얻어진 혼합액의 30 μl(2 μg)를 미니원심분리용기에 넣은 후, 상기 용기에 pcDNA-CCL17miRNA 벡터를 3 μl(2 μg)를 가한 후, 275-325V의 전기로 형질도입을 유도하였다.
실시예 3. 동물세포에서 흉선 및 활성화-조절 케모카인( thymus and activation-regulated chemokine ) 억제효과의 측정
5주령 된 ICR mouse를 5 마리씩 대조군과 실험군의 두 그룹으로 나눈 후, 각각의 쥐에 염증 유발 물질인 DNCB를 1%의 농도로 1주일간 100 μl씩 도포하여 마우스에 염증을 유발시켰다. 이후 마우스를 해부하여 비장조직을 적출한 후 10ml의 PBS용액 속에서 호모게나이저를 이용하여 단일세포로 분리하였다. 분리된 비장세포는 RBC lysing buffer(Sigma USA)에 의해 적혈구를 제거하고 RPMI1640 배지(100 units/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin and 10%FBS)에서 배양되었다. 5.0 x 107세포를 Lectin (10 μg /ml, Sigma; USA) 과 IL-4(20 ng/ml, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 처리하여 배양한 후 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine)를 억제하는 siRNA를 발현하는 살모넬라(ST-miR-CCL17)를 100MOI 수준으로 세포에 처리하여 CCL17, IL-4, IFN-gamma의 발현을 RT-PCR기법을 이용하여 측정하였다(도 2). 각각의 사용된 probe는 통상의 기법에 준하여 사용하였다.
실시예 4. 임상환자의 혈청분석을 통한 흉선 및 활성화-조절 케모카인( thymus and activation - regulated chemokine )의 측정
고려대학교 안암병원 천식환자 20여 명을 분석하여 대조군 환자와 비교하여 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine)의 발현양성을 혈액 중의 혈청을 분리한 시료에 대해서 ELISA 기법을 통해 분석하였다. 시험검사는 R&D SYSTEM의 CCL17 ELISA KIT을 이용하여 분석하였다(도 3).
실시예 5. 생체 내( in vivo ) 실험을 통해 흉선 및 활성화-조절 케모카인( thymus and activation - regulated chemokine ) 억제효과의 측정
5주령 된 ICR mouse를 5 마리씩 대조군과 실험군의 두 그룹으로 나눈 후, 각각의 쥐에 염증 유발 물질인 DNCB를 1%의 농도로 1주일간 100 μl씩 도포하였다. 이후, 실험군 쥐에 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine)을 억제하는 siRNA를 발현하는 살모넬라(ST-miR-CCL17)를 1.6 x 108의 농도로 경구투여 하였다. 투여한 지 일주일이 되는 시점에 안와채취법을 이용하여 각각의 쥐의 혈청을 뽑아 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine)의 혈청 내 적정농도를 구하기 위해 ELISA 실험을 수행하였다.
실험 결과, 도 4에 나타낸 것과 같이 천식 환자에서 발현이 되는 IL-4, IgE 등의 사이토카인은 발현양이 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine)을 억제하는 siRNA를 발현하는 살모넬라(ST-miR-CCL17)를 투여한 실험군에서 감소하였다(도면 4a 및 도 4c). 반면 천식환자의 치료에 도움이 되는 IFN-gamma 사이토카인은 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine)을 억제하는 siRNA를 발현하는 살모넬라(ST-miR-CCL17)를 투여한 실험군에서 증가하였다(도 4b)
실시예 6. 천식동물모델을 통한 천식치료효과의 측정
마우스에 Ovalbumin을 처리하여 알레르기 염증반응인 천식을 유발시키고 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine)을 억제하는 siRNA를 발현하는 살모넬라(ST-miR-CCL17)을 경구투여한 후 비장세포 및 폐조직내의 세포활성물질 생성변화(도 5)를 측정하였다. 또한 기압체적기록방(brometric plethysmographic chamber)을 이용한 메타콜린 자극에 대한 기도과민성(Penh)을 분석하였다(도 6).
그 결과, 본 발명에 의한 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자의 발현 억제는 천식동물모델에서 염증유발활성 인자인 ROS의 억제와 천식질환의 증상인 기도과민성 반응의 완화 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현의 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> Recombinant salmonella suppressing thymus and activation-regulated chemokine for treatment of asthma and composition of therapeutic agent comprising the same <130> P11-121203-03 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 64 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tgctgatccc tggaacactc cactgagttt tggccactga ctgactcagt ggagttccag 60 ggat 64 <210> 2 <211> 64 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cctgatccct ggaactccac tgagtcagtc agtggccaaa actcagtgga gtgttccagg 60 gatc 64

Claims (4)

  1. 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자의 표적서열에 특이적인 서열번호 2의 염기서열을 갖는 siRNA를 유효성분으로 포함하는 천식 치료용 조성물.
  2. 흉선 및 활성화-조절 케모카인(thymus and activation-regulated chemokine) 유전자의 발현을 억제하는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 siRNA를 전사하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 살모넬라 티피머리움(salmonella typhimurium)을 유효성분으로 함유하는 천식 치료용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 살모넬라 티피머리움(salmonella typhimurium)은 살모넬라 티피머리움(salmonella typhimurium) BRD509 균주인 것을 특징으로 하는 천식 치료용 조성물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 1의 pcDNA-CCL17miRNA의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 천식 치료용 조성물.
KR1020130007685A 2013-01-23 2013-01-23 흉선 및 활성화-조절 케모카인을 억제하는 재조합 살모넬라 및 이를 함유하는 천식 치료용 조성물 KR20140094971A (ko)

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