KR20130020544A - 유홍초속에서 분리한 신규화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유홍초속에서 분리한 신규화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 유홍초속에서 분리한 신규화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 유홍초속 유래 신규화합물은 우수한 혈당강하, 인슐린 분비촉진, VEGF 발현 저해 등의 효과를 가지고 있어, 당뇨병 및 이로 인한 각종 합병증의 예방 또는 치료에 효능을 가질 뿐만 아니라, 기존 당뇨병치료제와 병행투여시 치료효과를 촉진시킬 수 있다.

Description

유홍초속에서 분리한 신규화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물{Novel Compound Isolated from Quamoclit and Composition for Preventing or Treating Diabetes Containing thereof}
본 발명은 유홍초속에서 분리한 신규화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 유홍초속에서 분리한 신규화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 및 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
당뇨병(diabetes)은 인슐린의 분비 결함 또는 인슐린 작용의 결함에서 기인한 만성 고혈당증(hyperglycemia)의 특징을 나타내는 다중적 병인의 대사장애를 말하며, 혈중의 포도당이 비정상적으로 높은 상태가 장기간 지속될 경우 만성적인 대사장애와 이에 따른 만성적 혈관손상으로 다양한 합병증이 발생한다.
당뇨병은 대표적인 성인성 대사질환으로 세계인구의 약 5%가 앓고 있으며, 그로 인한 인명적, 경제적 손실은 실로 막대하다. 당뇨병 환자의 대부분은 경구용 치료제를 복용하고 있으나, 현재까지 안전한 치료제가 개발되어 있지 않은 실정이다. 인슐린 저항성(insulin resistance)이 가장 중요한 기전적 원인으로 알려져 있지만, 정확한 기전은 아직 확실하지 않으며, 다만 유전적인 소인과 환경의 복합적인 원인이 작용하는 것으로 밝혀져 있다.
당뇨병은 전세계적으로 3번째로 심각한 질병으로 2010년까지 약 2억5천만명의 당뇨병환자가 예상되며, 국내의 경우에도 계속적인 증가가 예견되고 있다. 국내 사망원인 중 7번째로 높으며, 전체 당뇨병환자의 90% 이상을 차지하고 있는 인슐린 비의존성 당뇨병 (Non-lnsulin dependent diabetes, NIDDM)은 주로 40대 이후에 발병되어 성인형 당뇨병이라 불리며 인슐린을 충분히 생성시키지 못하거나 적절히 이용하지 못함으로써 야기되는 대사 장애이다(DeFronzo RA et al., Diabetes Care, 15:318, 1992). NIDDM의 발병 원인은 명확히 밝혀져 있지는 않지만, 서양화된 식생활 및 생활방식 등의 환경적 요인과 비만 및 운동 부족과 같은 유전적인 요인이 모두 작용하는 것으로 생각되어 진다. NIDDM은 보통 식이 요법 및 운동 요법으로 먼저 치료를 시도하고, 이 방법에 의한 치료 효과가 충분치 않은 경우, 일반적으로 약물들이 이용되는데 많은 경우 인슐린이 사용된다. 인슐린은 식사요법과 경구 혈당강하제로 혈당이 조절되지 않는 환자에게 필요하다. 그러나 인슐린은 단백질이므로 소화관에서는 가수 분해되어 비활성화되므로 구강으로는 섭취할 수 없고 정맥이나 피하 내에 주사하여야 한다는 제한점이 있다.
경구 혈당 강하제는 세포의 인슐린 수용체의 감도를 향상 시키고 췌장을 자극하여 인슐린의 분비를 촉진 시키므로 NIDDM환자의 혈당을 조절하는 데에 사용된다. 그러나, NIDDM의 치료를 위한 경구 치료법은 저혈당증, 구역질, 구토, 설사, 발진 등을 일으킬 수 있으며 특히 치명적인 젖산 산증과 같은 심각한 부작용을 야기할 수 있다. 이 외에도 경구 혈당 강하제는 장기간 사용시 심혈관계 장해나 위 장관 및 간의 장해를 유발시키므로 장시간의 사용은 권장되지 않는다. 이와 같은 결점 및 부작용으로 인하여 현재의 치료제 중 만족스러운 효능을 나타내고 동시에 안전성이 높아 부작용 측면에서도 안심할 수 있어 모든 당뇨병 환자에게 적용될 수 있는 약물이 거의 없기 때문에 당뇨병 특히 NIDDM을 치료하기 위한 보다 효율적인 약물의 개발이 절실히 요구되고 있다.
당뇨병에 걸린 후 10년이 지나면 체내의 거의 모든 기관이 손상을 받아 합병증이 유발된다. 이러한 합병증으로 급성 병증에는 저혈당증, 케톤산혈증, 고삼투압성 비케톤성 고혈당증, 고혈당성 혼수, 당뇨병성 산혈증, 저혈당증 등이 있으며 만성 합병증에는 당뇨병성 망막증, 당뇨성 백내장, 당뇨병성 신질환, 당뇨병성 신경장해, 심혈관계 합병증, 바이러스 감염 등이 있다. 만성 당뇨성 신증은 혈액 투석 치료 및 말기 신부전의 가장 중요한 원인이 되고 있으며, 당뇨성 백내장은 실명을 초래하고 결국엔 죽음에 이른다.
이러한 당뇨합병증을 유발하는 기전으로는 크게 단백질의 비효소적 당화반응(nonenzymatic glycation of proein), 폴리올 경로(polyol pathway) 등으로 설명되고 있다. 단백질의 비효소적 당화반응(nonenzymatic glycation of protein)이란, 단백질의 리신 잔기 등의 아미노산 그룹과 환원당이 효소작용 없이 축합반응 즉 밀리아드 반응이 발생하는 것으로, 이 반응의 결과로 최종당화산물이 생성된다. 단백질의 비효소적 당화반응은 (1)단백질의 리신 잔기 등의 아미노산 그룹과 환원당의 알데히드 또는 케톤이 효소 작용없이 친핵성 첨가 반응을 하여 초기 단계 산물인 쉬프염기(schiff base)를 형성하고, 상기 쉬프염기와 인접한 케토아민 어닥트(ketoamine adduct)가 서로 축합하여 가역적인 아마도리(Amadori)형의 조기당화산물이 생성되는 단계와 (2)고혈당 상태가 지속되어 가역적인 아마도리형의 조기당화산물이 분해되지 않고 재배열(rearrangement)되어 단백질과 교차결합(cross-linking)하여 비가역적인 최종당화산물이 생성되는 단계로 나눌 수 있다.
가역적인 아마도리형의 조기당화산물과 달리 최종당화산물은 비가역적인 반응 산물이므로, 일단 생성되면 혈당이 정상으로 회복되어도 분해되지 않고 단백질 생존기간 동안 조직에 축적되어 조직의 구조와 기능을 비정상적으로 변화시켜 조직 곳곳에서 합병증을 유발시킨다 (Vinson, J.A. et al., J. Nutritinal Biochemistry, 7: 559, 1996; Smith, P. R. et al., Eur . J. Biochem., 210:729, 1992).
예를 들면, 포도당과 여러 종류의 단백질이 반응하여 생성된 최종당화산물 중 하나인 당화 알부민은 만성 당뇨성 신증을 일으키는 중요한 요인으로 작용한다. 당화 알부민은 당화가 진행되지 않은 정상 알부민에 비해 더 용이하게 신사구체 세포 내로 유입되고, 고농도의 포도당은 메산지움 세포를 자극하여 세포외 기질(extracellular matrix) 합성을 증가시킨다. 과도하게 유입된 당화 알부민과 증가된 세포외 기질로 인하여 신사구체의 섬유화가 야기된다. 이와 같은 기전으로 신사구체가 계속 손상 받게되어 혈액투석 또는 장기이식 등의 극단적인 치료방법을 쓸 수밖에 없는 단계에 이르게 되는 것이다. 또한, 만성 당뇨로 인하여 동맥벽에서는 콜라겐이, 신사구체에서는 기저막성 단백질이 최종당화산물과 결합되어 조직에 축적됨이 보고된바 있다 (Brownlee, M. et al., Sciences, 232:1629:1986).
이처럼 비효소적 단백질 당화반응에 의하여 기저막, 혈장 알부민, 수정체 단백질, 피브린, 콜라겐 등의 단백질에서 당화가 일어나며, 생성된 최종당화산물이 조직의 구조와 기능을 비정상적으로 변화시켜 당뇨성 망막병증(diabetic retinopathy), 당뇨성 백내장(diabetic cataract), 당뇨성 신증(diabetic nephropathy), 당뇨성 신경병증(diabetic neuropathy) 등의 만성 당뇨합병증을 유발시킨다 (Yokozawa,T. et al., J. of Trad . Med .,18:107, 2001). 따라서, 당뇨합병증의 발병을 지연하거나 예방 또는 치료하기 위해서는 최종당화산물의 형성을 억제하는 것이 매우 중요함이 밝혀졌다 (Brownlee, M. et al., N. Engl . Med., 318:1315, 1988).
또한 최종당화산물은 혈관내피세포 성장인자인 VEGF mRNA와 단백질을 과발현하여 비증식성 또는 증식성 당뇨병성 망막병증을 유발한다. 비정상적인 신생혈관형성 또는 신생 혈관의 병리적(pathogenic) 성장은 다수의 상태와 관련되어 있다. 이러한 상태는 당뇨병성 망막병증, 건선, 삼출성 또는 젖은형(wet) 노인성 황반변성(ARMD), 류마티스 관절염 및 기타 염증성 질환, 및 대부분의 암을 포함한다 (Aiello et al., New Engl . J. Med, 331:1480, 1994; Peer et al . Lab . Invest., 72:638, 1995). 이러한 상태와 관련된 질병에 걸린 조직 또는 종양에서 VEGF는 비정상적인 높은 수준으로 발현되고 혈관신생 또는 혈관투과성이 증가되어 있다. 특히, ARMD는 임상적으로 중요한 혈관신생질환이다. 이 질환은 노인의 한 쪽 또는 양쪽 눈의 맥락막에서 신생혈관이 형성되는 것을 특징으로 하며, 산업화된 국가에서 실명의 주 요인이 되고 있다. 여러 치료요법에서 사용된 항-신생혈관형성 제제는 단지 VEGF 또는 VEGF 수용체의 화학량적 감소를 유도할 수 있고, 이들 제제의 효과는 질병에 걸린 조직에서 비정상적인 고농도로 생성된 VEGF에 의해서 감소된다(Lopez et al ., Invest . Opththalmol . Vis . Sci ., 37:855, 1996).
이에, 본 발명자들은 당뇨병, 그로 인한 합병증 치료를 위한 부작용이 적은 천연 생약물질을 찾고자 예의 노력한 결과, 유홍초속에서 분리한 신규화합물이 당뇨병 마우스에서 혈당, 당화혈색소 및 뇨단백 등의 당뇨지표를 호전시키는 효과를 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 당뇨병 및 그로 인한 합병증 치료를 위한 부작용이 적은 천연 생약물질 유래의 신규 화합물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 이러한 신규화합물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 및 당뇨합병증의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물 또는 건강기능식품을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 구조를 가지는 화합물을 제공한다:
Figure pat00001
여기서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 탄소수 6 내지 30의 아릴기, 탄소수 1 내지 20의 알릴기, 탄소수 6 내지 30의 아릴알킬기 또는 아실기이다.
본 발명은 또한, (a) 유홍초속을 물, 알코올, 유기용매 및 이들의 혼합물로 구성되는 군에서 선택되는 용매로 추출하여 유홍초속 추출물을 제조하는 단계; (b) 상기 유홍초속 추출물에 물을 가하여 현탁시키고, 노르말 헥산, 에틸 아세테이트 및 부탄올로 순차 분획하여 물 분획물을 얻는 단계; 및 (c) 상기 물 분획물을 분리· 정제하여 화학식 2로 표시되는 화합물을 수득하는 단계를 포함하는 화학식 2로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다.
Figure pat00002
본 발명은 또한, 화학식 1로 표시되는 화합물; 그의 염; 또는 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 함유하는 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 화학식 1로 표시되는 화합물; 그의 염; 또는 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 함유하는 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 및 당뇨합병증 예방용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 유홍초속 유래 신규화합물은 우수한 혈당강하, 인슐린 분비촉진, VEGF 발현 저해 등의 효과를 가지고 있어, 당뇨병 및 이로 인한 각종 합병증의 예방 또는 치료에 효능을 가질 뿐만 아니라, 기존 당뇨병치료제와 병행투여시 치료효과를 촉진시킬 수 있다.
도 1는 둥근잎유홍초 유래 신규화합물의 HPLC 스펙트럼이다.
도 2은 둥근잎유홍초 유래 신규화합물의 LC-MS 스펙트럼이다.
도 3는 둥근잎유홍초 유래 신규화합물의 D2O를 용매로 사용한 H-NMR 스펙트럼이다.
도 4는 둥근잎유홍초 유래 신규화합물의 D2O를 용매로 사용한 C-NMR 스펙트럼이다.
도 5은 둥근잎유홍초 유래 신규화합물이 사람 망막색소 상피 세포주에서 VEGF(vascular endothelial growth factor)의 단백질 생산을 저해하는 것을 나타낸 그래프이다.
도 6은 둥근잎유홍초 유래 신규화합물이 마우스 췌장 베타 세포주에서 인슐린 단백질 생산을 촉진시키는 것을 나타낸 그래프이다.
도 7은 둥근잎유홍초 유래 신규화합물이 마우스 수정체의 혼탁도 감소효과를 나타낸 것이다.
도 8은 둥근잎유홍초 유래 신규화합물이 당뇨 모델 동물의 혈당 억제효과를 나타낸 것이다.
도 9은 둥근잎유홍초 유래 신규화합물의 당부하 검사를 나타낸 것으로 혈당 감소 효과를 나타낸 것이다.
도 10은 둥근잎유홍초 유래 신규화합물이 당뇨 모델 동물의 당화 혈색소 억제효과를 나타낸 것이다.
도 11은 둥근잎유홍초 유래 신규화합물이 당뇨 모델 동물의 크레아티닌의 뇨 배출이 정상적임을 나타낸 것이다.
도 12은 둥근잎유홍초 유래 신규화합물이 당뇨 모델 동물에서 간독성이 없음을 나타낸 것이다.
도 13는 둥근잎 유홍초 유래 신규화합물이 당뇨 모델 동물에서 간기능에 이상이 없음을 나타낸 것이다.
도 14은 둥근잎유홍초 유래 신규화합물이 당뇨 모델 동물의 베타 기능성을 높이고 인슐린 내당성 감소 효과를 나타낸 것이다.
도 15은 둥근잎유홍초 유래 신규화합물이 당뇨 모델 동물의 아디포넥틴 발현을 증가 시키는 효과를 나타낸 것이다.
도 16은 둥근잎유홍초 유래 신규화합물이 당뇨 모델 동물의 글루카곤 발현을 감소시키는 효과를 나타낸 것이다.
도 17은 둥근잎유홍초 유래 신규화합물의 당뇨 모델 동물의 DPP-IV 활성 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 18은 둥근잎유홍초 유래 신규화합물의 당뇨 모델 동물의 알파 글루코시데이즈 활성 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 19은 둥근잎유홍초 유래 신규화합물이 당뇨 모델 동물의 종양괴사인자 알파의 발현을 감소시키는 효과를 나타낸 것이다.
도 20은 둥근잎유홍초 유래 신규화합물의 당뇨 모델 동물에서의 항백내장효과를 나타낸 것이다.
일 관점에서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 구조를 가지는 화합물에 관한 것이다:
[화학식1]
Figure pat00003
여기서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 탄소수 6 내지 30의 아릴기, 탄소수 1 내지 20의 알릴기, 탄소수 6 내지 30의 아릴알킬기 또는 아실기이다.
바람직하게는, 상기 화학식 1에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 또는 탄소수 1 내지 20의 알킬기이다.
보다 바람직하게, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 구조를 가질 수 있다.
[화학식 2]
Figure pat00004
또한 상기 화학식 1의 화합물은 유홍초속, 바람직하게는 둥근잎유홍초로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 실시예에서 사용된 둥근잎유홍초(Quamoclit angulata)는 통화식물목 메꽃과의 덩굴성 한해살이 풀로서, 능조라라고도 한다. 열대 아메리카 원산이며 주로 관상용으로 재배되고 있으며, 덩굴은 나팔꽃처럼 자라면서 왼쪽으로 감아 올라가는 특징이 있다. 전초의 길이는 3m 내외이다. 잎은 어긋나고 잎자루가 길며 심장 모양 원형이다. 잎 끝이 갑자기 뾰족해지며 밑부분의 양쪽 끝이 뾰족한 각으로 된다. 꽃은 8～9월에 피고 노란빛을 띤 홍색이며 긴 꽃대 끝에 3～5개씩 달린다. 꽃은 나팔꽃을 축소시킨 것과 같은 모양이고 꽃받침ㅇ수술은 각각 5개씩이며 암술은 1개이다. 열매는 삭과로 둥글고 9월에 익으며 꽃받침이 남아 있다. 유홍초과 비슷하지만 잎이 갈라지지 않는다.
본 발명의 화학식 2의 구조를 갖는 화합물은 유홍초속에서 분리된 신규화합물로, C49H88O24의 분자식을 가지며, 화학식 1의 구조를 가지는 수지배당체의 일종으로 beta-D-fucopyranose등의 당 구조가 연결되어 있다.
본 발명에서는 상기 화학식 2의 구조를 갖는 화합물을 KRIBB-BH-P로 명명하였는데, 상기의 신규화합물은 미황색 분말로서 LC-MS에 의해 분자이온 m/z 1059.4, 916.4(1052.4-145), 786.9 (916.4-136), 514.8(786.9-136), 378.9(514.8-136), 232.9(378.9-146)을 얻을 수 있었으며, 이는 분자식(elemental formula) C49H88O24와 일치하는 것이다. 추가적으로, 1D-NMR(H NMR, C NMR)을 통해 명확한 NMR assignment를 완성하였다.
본 발명에 따른 신규화합물은 공지의 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 유홍초로부터 물, 알코올, 알코올 수용액, 유기 용매, 또는 이들의 혼합물 등의 용매를 이용하여 추출될 수 있으며, 바람직하게는, 물 또는 알코올을 이용하여 추출될 수 있고, 추가적으로 활성탄을 이용하여 분리정제 할 수 있다.
상기 화학식 2로 표시되는 화합물의 경우에는 아래의 방법으로 제조할 수 있다. 즉, 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 유홍초를 물, 알코올, 유기용매 및 이들의 혼합물로 구성되는 군에서 선택되는 용매로 추출하여 유홍초 추출물을 제조하는 단계; (b) 상기 유홍초 추출물에 물을 가하여 현탁시키고, 노르말 헥산, 에틸 아세테이트 및 부탄올로 순차 분획하여 물 분획물을 얻는 단계; 및 (c) 상기 물 분획 물을 분리· 정제하여 상기 화학식 2로 표시되는 화합물을 수득하는 단계를 포함하는 화학식 2로 표시되는 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
상기 (a) 단계에서, 유홍초는 건조하여 사용하는 것이 바람직하며, 유홍초 추출물을 활성탄이 충진된 컬럼을 이용하여 1차 분리·정제하는 것이 바람직하다. (C) 단계에서의 분리ㅇ정제방법은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면 크로마토그래피를 사용할 수 있다.
본 발명의 일양태에서는 다음과 같은 방법으로 둥근잎유홍초로부터 화학식 2의 화합물을 제조하였다. 파쇄한 둥근잎유홍초를 물, 알코올, 유기용매 및 그 혼합용액으로 구성된 군에서 선택되는 용매를 이용하여 실온에서 초음파 추출기로 매 2시간 마다 15분씩 2~3일 추출하거나 또는 물을 용매로 50℃에서 열수추출하였다. 상기 추출된 추출물을 상온에서 진공회전농축기로 감압농축시킨 다음, 추출된 잔사를 진공동결건조기로 건조한 후에 물로 가용한 둥근잎유홍초 추출물을 얻었다. 상기 추출된 추출물을 상온에서 진공회전농축기로 감압농축시킨 다음, 추출된 잔사를 진공동결건조기로 건조한 후에 물로 가용한 둥근잎유홍초 추출물을 얻었다.
상기 수득된 둥근잎유홍초 추출물을 활성탄이 충진된 컬럼에 통과시켜 둥근잎유홍초의 유효성분을 흡착시키고, 활성탄이 충진된 컬럼을 증류수로 세척하여 비흡착성분을 제거하였다. 상기 비흡착성분이 제거된 활성탄 충진컬럼에 10~50%(v/v) 에탄올 등의 유기용매를 연속적 또는 단계적으로 농도를 높여가며 공급하여 활성탄에 흡착된 둥근잎유홍초의 유효성분을 용출시켜 분리 정제한 다음, 둥근잎유홍초 추출물을 수득하였다. 이와 같이 정제된 둥근잎유홍초 추출물은 진공 회전 농축기를 이용하여 상온에서 감압 농축하고, 상기 농축된 추출물을 진공 동결 건조시킨 다음, 물로 가용시켜 물에 용해된 둥근잎유홍초 추출물을 수득하였다.
상기 물에 용해된 둥근잎유홍초 추출물을 증류수에 현탁시킨 후 노르말 헥산(nhexane), 에틸 아세테이트(EtOAc) 그리고 부탄올(BuOH)로 순차적으로 용매분획하여 n-hexane분획물, EtOAc분휙물, BuOH분획물 및 물 분획물을 각각 얻었다.
상기의 용매분획물들을 이용하여, 각각 VEGF 생성억제실험을 실시하여 그 중 가장 우수한 효능을 보이는 물 분획물을 C18 역상 silica gel을 고정상으로 Aetonitril-물 혼합용매(1:9→9:1 v/v)를 이동상으로 한 칼럼크로마토그래피를 실시하여 10개의 분획으로 나누고, 그 중 분획물 ACN20 [Acetonitril-DW(2:8 v/v)로 용출}]에 대해 Sephadex column chromatography(5.0x65 cm, MeOH)를 실시하여 신규화합물을 정제하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 당뇨병 마우스에 둥근잎유홍초 유래 신규 화합물 KRIBB-BH-P를 투여하는 경우, 당뇨지표인 혈당, 당화혈색소 및 뇨단백의 구성이 호전되는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 둥근잎유홍초 유래 신규 화합물 KRIBB-BH-P를 투여한 마우스에서, 간독성 및 간기능 이상이 발견되지 않아, 본 발명의 KRIBB-BH-P는 in vivo 적용시의 안전성을 확인하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는 둥근잎유홍초 유래 신규 화합물 KRIBB-BH-P를 투여한 당뇨병 마우스에서 아디포넥틴의 수치가 증가하여 인슐린 저항성이 개선되었음을 확인하였으며, 당뇨병 마우스에서 비정상 적으로 증가된 글루카곤 농도가 둥근잎유홍초 유래 신규 화합물 KRIBB-BH-P를 투여한 군에서는 정상화되는 것을 확인하였다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물; 그의 염; 또는 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 함유하는 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 화합물은, 화학식 1에서 R1 및 R2가 각각 독립적으로 H 또는 탄소수 1 내지 20의 알킬기인 것이 바람직하며, 상기 화학식 2의 구조를 가지는 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물 및 건강기능식품에는 유홍초의 식물배양 또는 조직 배양을 통해 얻은 추출물을 추가로 첨가할 수 있다.
본 발명의 신규화합물은 당뇨병뿐만 아니라, 당뇨병에 따른 합병증을 예방 또는 치료 효능을 가지며, 상기 합병증으로는, 특별히 이에 제한되는 것은 아니나 고혈당증(hyperglycemia), 고인슐린혈증(hyperinsulinemia), 고중성지방혈증 (hypertriglyceridemia), 인슐린 저항(insulin resistance), 지질대사이상(dyslipidemia), 공복혈당장애(impaired fasting glucose), 내당능 이상(impaired glucose tolerance), 비만, 동맥경화증, 미세혈관병증, 신장질환, 심장질환, 족부궤양, 관절염, 골다공증, 당뇨병성 망막증 및 그 외 하나 이상의 안과질환을 예로 들 수 있다.
여기서, 당뇨병은 제1형 당뇨, 제2형 당뇨, 젊은이에게 발생하는 성인형 당뇨병, 지진성 자가면역성 당뇨병, 췌장 당뇨병 등의 모든 종류의 당뇨병을 포함하는 것이며, 당뇨합병증은 상기한 예들 외에도 사구체 경화증, 발기불능, 당뇨성 신경병증, 월경전 증후군, 혈관 재협착, 궤양성 대장염, 관상동맥심질환, 고혈압, 협심증, 심근경색, 뇌졸중, 피부 및 결합조직질환, 대사성 산증, 손상된 내당력에 의한 증상 등이 포함된다.
또한, 상기의 안과질환은 당뇨병성 망막증 외에 백내장, 황반변성증, 외안근 마비, 홍채 모양체염, 시신경염, 녹내장, 망막퇴행, 안저출혈, 굴절이상, 결막하, 초자체 출혈 등 당뇨병으로 인하여 유발되는 모든 안과질환을 의미한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 유홍초에서 분리한 신규화합물을 필수 성분으로 하되, 이를 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학적 조성물로 제공될 수 있다.
나아가 본 발명의 약학적 조성물은 종래에 알려져 있는 당뇨병 또는 그 합병증의 치료물질과 혼합하여 제공될 수도 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 당뇨병 또는 그 합병증의 예방 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 당뇨병 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 공지의 항당뇨병 화합물을 추가적으로 포함할 수 있다.
이러한 항당뇨병 화합물로는 나테글리니드, 레파글리니드, 글리타존류, 설포닐 우레아계, 메트포르민, 글리메프라이드, 티아졸리딘디온계, 비구아나이드계, 알파-글루코시데이스 억제제인 아카보스, 메글리티나이드계의 프란딘 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편 본 발명에 있어서, 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다.
경구 및 비경구 투여가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
약학적 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액으로서 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예, 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매중의 멸균 주사용액 또는 현탁액(예, 1,3-부탄디올중의 용액)일 수 있다. 허용적으로 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링겔 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 불휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 어떠한 불휘발성 오일도 사용할 수 있다. 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산이 약학적으로 허용되는 천연 오일(예, 올리브유 또는 피마자유), 특히 이들의 폴리옥시에틸화된 것과 마찬가지로 주사 제제에 유용하다.
본 발명의 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만 캡슐, 정제 및 수성 현탁액 및 용액을 포함하여 경구적으로 허용되는 어떠한 용량형으로도 경구 투여될 수 있다. 경구용 정제의 경우, 흔히 사용되는 담체로는 락토즈 및 옥수수 전분이 포함된다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제가 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐형으로 경구 투여하는 경우 유용한 희석제로는 락토즈 및 건조된 옥수수 전분이 포함된다. 수성 현탁액이 경구 투여될 때 활성 성분은 유화제 및 현탁화제와 배합된다. 필요한 경우, 감미제 및/또는 풍미제 및/또는 착색제가 첨가될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 본 발명의 화합물을 실온에서 고형이지만 직장 온도에서는 액상인 적합한 비자극성 부형제와 혼합하여 제조할 수 있다. 이러한 물질로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 코코아 버터, 밀랍 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 경구 투여는 목적하는 치료가 국소 적용으로 접근이 용이한 부위 또는 기관과 관련이 있을 때 특히 유용하다. 피부에 국소적으로 적용하는 경우, 약학적 조성물은 담체에 현탁 또는 용해된 활성 성분을 함유한 적합한 연고로 제형되어야 한다. 본 발명의 화합물을 국소 투여하기 위한 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 광유, 유동 파라핀, 백색 와셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물이 포함된다. 다른 방도로서, 약학적 조성물은 담체에 현탁 또는 용해된 활성 화합물을 함유한 적합한 로션 또는 크림으로 제형될 수 있다. 적합한 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 광유, 솔비탄 모노스테아레이트, 폴리솔베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데카놀, 벤질 알코올 및 물이 포함된다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 좌제에 의해 또한 적합한 관장제로 하부 장관으로 국소 적용할 수 있다. 국소 적용된 경피 패치가 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물은 비내 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 약제의 분야에 잘 알려진 기술에 따라 제조하며 벤질 알코올 또는 다른 적합한 보존제, 생체이용율을 증강시키기 위한 흡수 촉진제, 플루오로카본 및/또는 기타 본 분야에 알려진 가용화제 또는 분산제를 사용하여 염수중의 용액으로서 제조할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 상기한 신규화합물은 치료학적 유효량 또는 예방학적 유효량으로 함유된다.
그러나, 특정 환자에 대한 특정 유효량은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 규정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 변할 수 있음은 이해될 것이다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물을 어류의 피하세포에 투입할 경우 새낭 또는 소화관에 투여할 수 있다. 주사는 근육조직내의 근육세포 또는 다른 세포에 주사할 수 있으며 복강내의 내장세포에 주사할 수 있다.
바람직한 양태로서, 구강내 투여를 위한 의약 조성물은 고체상의 부형제와 함께 활성 성분을 혼합함으로써 제조할 수 있으며 정제 또는 당의정 형태로 제조하기 위해 과립형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제로는 락토스, 수크로스, 만니톨 및 소비톨과 같은 슈가 형태 또는 옥수수, 밀가루, 쌀, 감자 또는 다른 식물로부터 전분, 메틸 셀룰로스, 하이드로시프로필메틸-셀룰로스 또는 나트륨 카복시메틸세룰로스와 같은 세룰로스, 아라빅 검, 타가칸쓰 검을 포함하는 검류와 같은 카보하이드레이트 또는 젤라틴, 콜라겐과 같은 단백질 필러를 사용할 수 있다. 필요한 경우에는, 교차결합된 폴리비닐피롤리돈, 아가 및 알긴산 또는 나트륨 알긴산과 같은 각각의 염 형태의 붕해제 또는 용해제를 첨가할 수 있다.
바람직한 양태로서, 비경구적 투여의 경우 본 발명의 의약 조성물은 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는, 한스 용액 (Hank's solution), 링거 용액 (Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 물리적으로 적절한 완충용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입 (injection) 현탁액은 소디움 카복시메틸 셀루로스, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다. 덧붙여서, 활성 성분의 현탁액은 적합한 유질의 주입 현탁액 (oily injection suspensions)으로 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 담체는 참기름과 같은 지방산 또는 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 복수양이온성 비지질 아미노 폴리머(polycationic amino polymers)도 운반체로서 사용될 수 있다. 임의로, 현탁액은 화합물의 용해도를 증가시키고 고농도의 용액을 제조하기 위해 적합한 안정화제 또는 약제를 사용할 수 있다.
한편 본 발명에 따른 유홍초 유래 신규 화합물은 당뇨병 및 그 합병증의 예방 또는 개선을 위한 식품의 형태로도 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 건강 기능 식품은 식품 조성물로써, 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 건강 기능 식품은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 유홍초 유래 신규 화합물을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 유홍초 유래 신규 화합물을 첨가하여 제조할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 유홍초로부터 신규화합물의 분리
제주 남군 안덕면 서광리에서 채집된 둥근잎유홍초 51g을 물을 용매로 50℃에서 열수 추출 혹은 물, 알코올, 유기용매 및 그 혼합용액으로 구성된 군에서 선택되는 용매를 이용하여 실온에서 음파 추출기로 매 2시간 마다 15분씩 2~3일 추출하였다. 추출한 후 추출물을 진공 회전 농축기로 상온에서 감압 농축한 후 추출된 잔사를 진공 동결 건조기로 건조한 후 건조된 둥근잎유홍초 추출물을 얻었다. 상기 농축액을 물에 현탁하여 활성탄이 충진된 컬럼크로마토그라피에 통과시켜 둥근잎유홍초의 유효성분을 흡착시키고, 활성탄이 충진된 컬럼을 증류수로 세척하여 비흡착성분을 제거하였다. 상기 비흡착성분이 제거된 활성탄 충진컬럼에 10~50%(v/v) 에탄올 등의 유기용매를 연속적 또는 단계적으로 농도를 높여가며 공급하여 활성탄에 흡착된 둥근잎유홍초의 유효성분을 용출시켜 분리 정제한 다음, 둥근잎유홍초 추출물을 수득하였다. 상기 분리정제된 둥근잎유홍초 추출물을 감압농축시키고, 상기 농축된 둥근잎유홍초 추출물 5g에 물을 가용하여 둥근잎유홍초 추출물의 농도가 20mg/ml이 되도록 용해시켰다.
이 물 추출물을 증류수에 현탁시킨 후 노르말 헥산(nhexane,), 에틸아세테이트(EtOAc) 그리고 부탄올(BuOH)로 순차적으로 용매분획하여 n-hexane분획물, EtOAc분휙물, BuOH분획물 및 물분획물을 각각 얻었다.
상기의 용매분획물들을 각각 VEGF 생성억제실험을 실시하여 그 중 가장 우수한 효능을 보이는 물분획물을 C18 역상 silica gel을 고정상으로 acetonitril-물 혼합용매(1:9→9:1 v/v)를 이동상으로 한 column chromatography를 실시하여 10개의 분획으로 나누었다. 그 중 분획물 ACN 20 [MeOH-물(1:9 v/v)로 용출; 에 대해 Sephadex column chromatography(5.0x65 cm, MeOH)를 실시하여 신규화합물을 정제하였다 (도 1). 사용된 조건과 결과는 다음과 같다:
고속 액체크로마토그래피(HPLC)분석(shimadzu 모델)
컬럼: C18 역상컬럼
이동용매: 90% 메탄올
유속: 1ml/min
체류시간: 1.29분.
실시예 2: 유홍초 유래 신규화합물의 구조확인
실시예 1에서 분리한 신규화합물은 미황색 분말로서 LC-MS에 의해 분자이온 m/z 1059.4, 916.4(1052.4-145), 786.9 (916.4-136), 514.8(786.9-136), 378.9(514.8-136), 232.9(378.9-146)을 얻을 수 있었으며(도 2), 이는 분자식(elemental formula) C49H88O24와 일치하는 것이다.
1D-NMR(H NMR, C NMR )을 통해 명확한 NMR assignment를 완성하였다.
듀트륨(D2O)으로 치환된 물을 용매로 사용하고 테트라메칠실란(TMS)을 표준물질로 하여 측정한 수소핵자기 공명 스펙트럼(H-NMR) 결과를 도 3에 나타내었다.
듀트륨(D2O)으로 치환된 물을 용매로 사용하고 테트라메칠실란(TMS)을 표준물질로 하여 측정한 탄소핵자기 공명 스펙트럼(C-NMR) 결과를 도 4에 나타내었다.
상기 결과들에 의하여 실시예 1에서 분리한 둥근잎유홍초 유래 신규 화합물은 C49H88O24의 분자식을 가지고, [화학식 2]의 구조를 가지는 신규화합물임을 확인하였다.
[화학식 2]
Figure pat00005
상기 화합물은 배당체의 일종으로 beta-D-fucopyranose에 당 구조가 연결되어 있으며, KRIBB-BH-P로 명명하였다.
실시예 3: 유홍초 유래 신규화합물의 VEGF 억제능 확인
실시예 1에서 제조된 둥근잎유홍초에서 분리한 신규화합물의 혈관내피세포 성장인자(VEGF)의 억제능을 확인하기 위하여, 사람 망막 색소 상피 세포주인 ARPE 19 세포주에 상기 신규화합물을 처리하고, 당뇨성 망막병증 등의 당뇨 합병증을 유발하는 혈관내피세포 성장인자(VEGF) 단백질의 발현을 확인하였다.
ARPE 19 세포주(ATCC, USA)는 DMEM; F12 media에 10% FBS(Fetal bovine serum)를 첨가하여 배양하였다. ARPE 19 세포주에서 VEGF 단백질의 발현을 유도하기 위해 60Φ 플레이트에 1x 105 cell/플레이트 농도로 세포를 도말하여 DMEM low glucose 배지에 10% FBS무혈청을 첨가하여 24시간 배양 후 DMEM low glucose 배지에 30 mM glucose를 첨가한 배양액으로 바꾸고, 신규화합물 KRIBB-BH-P의 최종 농도가 0.5 ㎍/ml되도록 첨가한 후, VEGF 단백질 생산을 확인하기 위하여 72시간 배양하였다. 이때 대조군으로 5.5mM glucose를 처리하여 VEGF가 발현되지 않는 세포 자체(- 대조군)를 기준으로 하고, 30mM glucose를 처리하였을 때 VEGF 발현 정도(+ 대조군)를 확인하여 둥근잎유홍초 유래 화합물의 VEGF 발현 억제능을 비교하였다. 본 실험에 사용하는 30mM glucose농도는 각각의 실험에서 VEGF의 발현 유도를 최적으로 하는 조건의 농도 이다.
상기 방법으로 배양된 ARPE 19 세포의 배양액을 수득하여, VEGF ELISA kit(R&D, UK)을 이용하여 분비되는 VEGF의 양을 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 신규화합물 KRIBB-BH-P를 처리한 실험군에서 VEGF 발현이 감소됨을 확인하였다.
실시예 4: 유홍초 유래 신규 화합물의 인슐린 분비 촉진 확인
둥근잎유홍초에서 분리한 신규화합물 KRIBB-BH-P의 인슐린 분비촉진능을 마우스 췌장 베타 세포주인 Min 6 세포주에서 확인하였다.
Min 6(ATCC, USA)는 HDMEM 배지에 15% FBS(fetal bovine serum)를 첨가하여 배양하였다. Min 6 세포주에서 인슐린 발현을 유도하기 위해 96 well 플레이트에 1 x 104 cell/플레이트 농도로 세포를 도말하여 DMEM high glucose 배지에 15% FBS무혈청을 첨가하여 72시간 배양 후 PBS 완충용액으로 세척하고 HBSS 완충 용액에 2시간 배양 후 25mM glucose를 첨가한 HBSS 완충용액으로 바꾸고 신규화합물 KRIBB-BH-P의 최종 농도가 0.5ng/ml되도록 첨가한 후, 인슐린 발현 촉진 여부를 확인하기 위해 2시간 배양하였다. 이때 대조군으로 5.5mM glucose를 처리하여 인슐린 발현이 유도 되지 않는 세포자체의 인슐린 발현량을 기준점으로 하고, 양성 대조군으로 아미노 구아니딘 1μM, 아카보스 1μM, 글리메프라이드 1mM이 되도록 첨가하였다. 음성 대조군으로 25mM glucose를 처리하였을 때 인슐린이 발현 되는 정도를 확인하여 둥근잎유홍초 유래 신규화합물이 인슐린 발현을 촉진하는지를 비교 분석하였다. 상기 방법으로 배양된 Min 6 세포의 배양액을 수득하여, 인슐린 ELISA kit(R&D, UK)을 이용하여 분비되는 인슐린의 양을 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 신규화합물 KRIBB-BH-P가 처리된 췌장베타 세포주에서 인슐린 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 마우스의 렌즈 배양실험
당뇨환자의 경우에는 백내장이 일찍 시작하며 또한 빨리 악화하여 시력이 급속히 떨어진다. 당뇨병에 걸리면 수정체에 불투명 현상이 촉진된다. 이에 렌즈 배양 실험을 통하여 당뇨성 백내장 생성 억제 효능을 조사하였다.
마우스의 안구를 적출해 요오드 용액에 넣어 잠시 소독 후 렌즈만을 적출하였다. M199 배지에 넣고 세포배양기에서 배양하였다. 배지에 20mM xylose를 넣어 배양하면 수정체의 혼탁도를 유발할 수 있고, CCD camera를 이용하여 수정체의 혼탁도를 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 백내장 유발을 억제하는 물질로 알려진 quercetin(쿼시틴)을 처리한 양성 대조군보다 본 발명에 따른 신규화합물 KRIBB-BH-P 투여군에서 수정체 혼탁도가 더 억제됨이 확인되었다.
실시예 6: 유홍초 유래 신규 화합물에 처리에 의한 당뇨병 마우스의 당뇨 지표 분석
6-1: 혈당분석
정상 마우스와 실제 당뇨병 마우스에 둥근잎유홍초 유래 신규 화합물을 처리함으로써, 당뇨 지표인 혈당, 당화혈색소 및 뇨단백의 변화를 확인하였다.
6주령의 마우스(Male C57BL/6J mouse, 20g, 중앙실험동물, 서울)와 6주령의 당뇨병 마우스(Male C57BL/Ks DB/DB mouse, 20g, 중앙실험동물, 서울)를 구입하여 일정한 온도(25℃)와 습도(50%)하에서 1주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
마우스를 각 군당 5마리로 하여 정상 마우스 대조군, 당뇨병 마우스 대조군, 당뇨병 마우스 약물 처리(glimepride, acarbose)군, 둥근잎 유홍초 유래 신규 화합물과 약물을 병용투여군으로 나누고, 둥근잎유홍초 유래 신규 화합물 투여군의 경우는 각각 0.1 mg/kg, 1mg/kg, 10mg/kg 농도로 각 군에 경구 투여하여 12주간 사육하였다. 각 군의 마우스는 2주 마다 혈당의 변화를 측정하였고, 또한 6주마다 뇨를 채취하여 뇨단백 농도를 측정하였으며,, 12주간 사육한 후 혈액을 채취하여 당화 혈색소 농도를 측정하였다.
그 결과, 혈당 변화에 있어서는, 도 8에 나타난 바와 같이, 당뇨병 마우스 대조군은 정상 마우스 대조군과 비교하여 혈당이 상승되어 나타났으나, 당뇨병 마우스에 약물 병용 투여군과 둥근잎 유홍초 신규 화합물을 0.1 mg/kg, 1mg/kg, 10mg/kg 농도로 경구 투여한 각 군에서는 유의적인 강하효과를 보였다.
6-2: 당부하 검사
경구 당부하 검사는 5주령의 마우스(Male C57BL/6J, 19g, 코아텍, 평택)를 구입하여 일정한 온도(25℃)와 습도(50%)하에서 1주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 마우스를 각 군당 5마리로 하여 대조군으로는 일반 사료를 먹이로 하는 일반식이군, 고지방 사료를 먹는 고지방식이군으로 나누고 2주간 사육하였다. 고지방 식이 사육 2주째에 실험동물을 16시간 절식시킨 후, 공복시 혈당을 측정하고 시료는 경구로 24시간, 16시간, 8시간, 4시간, 2시간, 1시간 전 투여한 다음 glucose 2 g/kg(body weight)을 경구로 투여하고 이후 30분 간격으로 혈당을 측정하였다.
그 결과, 도 9에서와 같이 시료를 경구투여하고 24시간 후가 가장 높은 효능을 나타내었다.
6-3: 당화혈색소(HbA1c)분석
당뇨를 치료받는 환자에게 발생하는 합병증을 줄이기 위해서는 혈당 수치를 적절한 수준으로 유지하는 것이 중요하다. 한 시점에서 측정하는 혈당 수치는 여러 요인들에 의해 변동이 생길 수 있기 때문에 장기간의 혈당 조절 추이를 파악할 목적으로 가장 널리 사용되는 검사가 당화 혈색소(HbA1c)이다. 당화 혈색소는 적혈구에 정상적으로 존재하는 혈색소에 당이 결합된 형태로 혈당이 높게 유지되었을 경우에 당화 혈색소 수치 또한 높아진다. 당화 혈색소는 2~4 개월 동안의 평균 혈당 수치를 반영하므로 장기간의 혈당 조절 정도를 파악하는데 유용하다.
둥근잎유홍초 유래 신규 화합물의 당화 혈색소에 대한 영향을 확인하기 위해 6주에 한번씩 정상 마우스 대조군, 당뇨병 마우스 대조군 및 둥근잎유홍초 유래 신규 화합물을 0.1 mg/kg, 1mg/kg, 10mg/kg 농도로 경구투여한 군의 혈액을 채취하여 ELISA 키트(Cusabio biotech, Japan)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 10 에 나타낸 바와 같이, 당화 혈색소의 수치에서 정상 마우스 대조군과 비교하여 당뇨병 마우스에 둥근잎유홍초 유래 신규 화합물 10mg/kg 농도로 경구투여한 군에서 유의하게 강하효과를 보였다.
6-4: 크레아티닌 측정
당뇨병 환자들의 경우 신장과 심장 합병증이 동반되는 경우가 흔하다. 당뇨병은 우리 몸의 노폐물을 여과하고 내보내는 신장에 손상을 줄 수 있다. 크레아티닌 검사는 혈액 안에 있는 크레아티닌의 농도를 측정해 신장의 기능을 평가할 수 있다. 크레아티닌은 단백질이 근육에서 사용된 후에 만들어지는 크레아틴의 탈수물로, 아주 소량만이 혈액에 존재한다. 신장의 기능이 떨어지면 크레아티닌을 배설시키지 못한다. 각 군의 당뇨 모델 마우스에 12주간 경구투여 한 마우스의 뇨와 혈액를 채취하여 ELISA 키트(R&D, USA)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 병용 투여군, 둥근잎 유래 신규 화합물 투여군에서 혈액중 크레아티닌 농도는 낮아지는 반면 뇨크레아티닌의 농도는 높아지는 것을 확인하였으며, 이는 크레아티닌 배설이 원활하게 일어나는 것을 보여주는 것이다.
실시예 7: 유홍초 유래 신규 화합물 처리에 의한 당뇨병 마우스의 간 독성 및 간기능 검사
7-1: 알라닌 트랜스아미네이즈 농도분석
실시예 5에서 사용한 것과 동일한 6주령의 마우스와 6주령의 당뇨병 마우스를 일정한 온도(25℃)와 습도(50%)하에서 1주간 적응시킨 후 간 독성 검사에 사용하였다.
마우스를 각 군당 5마리로 하여 정상 마우스 대조군, 당뇨병 마우스 대조군, 둥근잎유홍초 유래 신규 화합물을 각각 0.1 mg/kg, 1mg/kg, 10mg/kg 농도로 경구투여한 군으로 나누어 12주간 사육하였다. 12주간 사육한 후 혈액을 채취하여 알라닌 트랜스아미네이즈 농도를 측정하였다.
알라닌 트랜스아미네이즈는 아미노산의 대사효소로써 진단 및 경과 관찰의 대표적인 검사로 활용된다. 알라닌 트랜스아미네이즈의 농도가 유지되었다는 것은 간의 손상이 없다는 것을 시사한다.
둥근잎유홍초 유래 신규 화합물의 간에 대한 영향을 확인하기 위해 12주간 사육한 후 정상 마우스 대조군, 당뇨병 마우스 대조군, 둥근잎유홍초 유래 신규 화합물 0.1 mg/kg, 1mg/kg, 10mg/kg 농도로 경구투여한 군의 혈액을 채취하여 ELISA 키트(Cusabio biotech, Japan)를 이용하여 알라닌 트랜스아미네이즈 농도 변화를 측정하였다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 당뇨병 마우스에 둥근잎유홍초 유래 신규 화합물을 0.1 mg/kg, 1mg/kg, 10mg/kg 농도로 경구투여한 군이 정상 마우스 대조군과 유사한 수치를 나타내어, 이 화합물에 의한 간 독성은 없는 것으로 확인되었다.
7-2: 빌리루빈 분석
둥근잎유홍초 유래 신규 화합물을 투여한 군의 간 기능 이상 유무를 확인하기 위하여, 상기 실시예에서 채취된 혈액을 이용하여 빌리루빈 수치를 ELISA 키트(Cusabio biotech, Japan)로 측정하였다. 빌리루빈 수치 분석 결과는 도 13에 나타난 바와 같이, 둥근잎유홍초 유래 신규 화합물을 투여한 군의 빌리루빈 수치는 정상적인 범위 안에 포함되는 수치로 나타났다. 따라서, 본 발명의 조성물은 간 기능의 이상을 유발하지 않는 안전한 조성물임을 알 수 있다.
실시예 8: 유홍초 유래 신규 화합물 처리에 의한 당뇨병 마우스의 인슐린 저항성 및 베타세포의 기능성 분석
실시예 7의 조건에서 사육된 당뇨병 마우스군의 공복혈액검사 또는 당부하검사를 통해 인슐린과 혈당을 측정하여 인슐린 감수성 지수를 계산하였다.
인슐린 감수성 지수로는 HOMA(Homeostasis assessment)-IR을 사용하며 인슐린 감수성 지수를 통해 인슐린 저항성을 평가하고, HOMA-beta를 통해 베타세포의 기능성을 평가하였다.
그 결과, 도 14에서 나타난 바와 같이 둥근잎유홍초 유래 신규 화합물 투여군에서 유의한 결과를 나타내었다.
HOMA-IR =(Fasting insulin (μ IU / mL ) X Fasting glucose ( nmol /L)) / 22.5
HOMA-beta = 20 X Fasting insulin (U/mL)/Fasting glucose (mmol/L) - 3.5
실시예 9: 유홍초 유래 신규 화합물 처리에 의한 당뇨병 마우스의 혈중 adiponectin 농도 분석
아디포넥틴(adiponectin)은 지방세포에서 분비되어 혈액 내에 매우 풍부하게 존재하며, 비만하거나 제 2형 당뇨병 환자에서 감소되어 있음이 일관되게 증명되고 있다. 또한 저아디포넥틴혈증은 동맥경화질환의 새로운 위험인자로 대두되고 있는데, 당뇨병 환자들 중에서도 특히 대혈관 합병증이 동반되어 있는 환자에서 아디포넥틴 농도가 감소되어 있다. 즉 아디포넥틴은 항비만작용, 항당뇨작용, 항동맥경화작용 및 활성산소생성의 억제작용 등이 있다. 실시예 7의 조건에서 사육된 당뇨병 마우스군의 혈중 아디포넥틴의 농도를 ELISA 키트(R&D, USA)로 측정하였다.
그 결과, 도 15에서 나타낸 바와 같이, 당뇨 마우스 대조군에서는 아디포넥틴의 발현이 감소되었으나 그 외의 군, 특히 둥근잎유홍초 유래 신규 화합물을 투여한 실험군에서 인슐린 저항성 개선을 나타내는 수치인 아디포넥틴의 발현이 증가됨을 확인하였다.
실시예 10: 유홍초 유래 신규 화합물 처리에 의한 당뇨병 마우스의 글루카곤( glucagon ) 농도분석
적당한 혈당 수치를 유치하는데 핵심적인 역할을 하는 것은 당을 제거하는 인슐린(insulin)뿐만 아니라 당을 늘리는 글루카곤(glucagons)이라는 호르몬도 있다.
제2형 당뇨병 환자에서 혈당이 증가하고, 포도당 섭취에 대한 인슐린 분비가 지연되며 글루카곤(glucagon)이 증가한다. 일반적으로 혈장 글루카곤에 대한 인슐린비의 감소는 당뇨병 악화와 관련되어 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 실시예 7의 조건에서 사육된 당뇨병 마우스군의 글루카곤 농도를 확인하였다.
그 결과, 도 16에서 나타난 바와 같이, 혈장 글루카곤 농도는 당뇨 대조군의 경우 정상군에 비해 유의적으로 높았으나, 본 발명 화합물의 투여로 인해 당뇨 대조군에 비해 현저하게 낮아져 약물 투여군 보다 더 낮게 나타났다. 당뇨 대조군의 경우 글루카곤에 대한 인슐린의 비는 정상군에 비해 유의적으로 낮았다. 그러므로 유홍초 유래 단일 화합물 투여로 인해 글루카곤 농도에 대한 인슐린의 비가 당뇨 대조군에 비해 현저히 증가되었으며, 유홍초 유래 단일 화합물은 당뇨병으로 인한 비정상적인 인슐린 및 글루카곤 농도를 정상화하여 당뇨병의 약화를 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 11: 둥근잎유홍초 유래 신규 화합물에 처리에 의한 당뇨병 마우스의 디펩티딜펩티다이제 - 4(dipeptidyl peptidase IV, DPP-IV)억제 효능 분석
인크레틴에는 GIP(glucose dependent insulinotropic eptide) 와 GLP-1 (glucagon like peptide) 2종류가 있고, 두 호르몬 모두 소장의 상피세포층내의 endocrine cell에서 분비되며, 소장 내 혈당이 증가 시 분비되어 췌장의 베타세포를 자극하여 인슐린 분비를 촉진하고 알파세포에서의 글루카곤 분비를 억제한다.
따라서 인크레틴은 경구로 섭취된 포도당의 농도에 의존적으로 혈당을 강하시키며, 저혈당을 거의 유발 하지 않는다. GIP와 GLP-1 모두 serine protease 계열인 dipeptidyl peptidase (DPP)-4 에 의하여 빠르게 분해된다. 이러한 사실을 바탕으로 실시예 7의 조건에서 사육된 당뇨병 마우스군의 DPP-4 억제 효능을 확인하였다.
그 결과, 도 17에 나타낸는 바와 같이, 둥근잎 유홍초 유래 신규 화합물 투여군에서 DPP IV의 활성이 억제됨을 확인 할 수 있었다. 새로운 당뇨병 치료의 표적으로 주목되고 있는 DPP-IV의 활성 억제를 통해 혈당과 당화혈색소의 상승을 억제하여 당뇨병의 예방 또는 치료에 탁월한 효과를 갖는다.
실시예 12: 유홍초 유래 신규 화합물에 처리에 의한 당뇨병 마우스의 알파 글루코시다제( alpha - glucosidase ) 활성 저해율 측정
알파 글루코시다아제 억제제는 소장점막에 분포하는 알파-글루코시데이즈의 기능을 억제하여 식후에 혈당이 상승하는 것을 억제한다. 즉, 알파-글루코시데이즈(Alpha-glucosidase)는 다당류를 단당류로 분해하여 소장내의 흡수를 촉진하는 역할을 하는데 이를 억제하여 단당류의 흡수를 방해하는 방법으로 섭취한 식이 중의 탄수화물의 소화와 흡수를 지연시켜 식후 혈당 및 혈중 인슐린의 상승을 감소시킴으로써 당뇨병의 치료효과를 나타낸다. 알파 글루코시다아제 억제제는 고인슐린혈증이나 저혈당을 유발하지 않고, 인슐린 분비를 촉진시키며 글루카곤 분비를 억제하는 글루카곤-유사-펩티드-1(glucagon-like peptide-1)의 소장에서의 분비를 촉진하는 장점을 갖고 있다.
이러한 사실을 바탕으로 실시예 7의 조건에서 사육된 당뇨병 마우스군의 알파글루코시데이즈 활성을 측정하였다.
그 결과, 도 18에 나타나는 바와 같이 본 발명의 신규 화합물을 투여한 투여군에서 알파 글루코시데이즈의 활성이 억제됨을 확인할 수 있었다.
실시예 13: 유홍초 유래 신규 화합물에 처리에 의한 당뇨병 마우스의 종양괴사인자 알파( tumor necrosis factor , TNF - alpha )
종양 괴사 인자-알파 (TNF-α)는 지방세포에서 주로 발현되며, 이 사이토카인의 상승 레벨은 비만 및 인슐린 저항성과 관련되어 있다. 지방조직은 종양괴사인자-알파, 레지스틴과 인터루킨-6(IL-6)와 같은 시토카인을 생성하는데 이들 시토카인은 인슐린 작용을 억제하는 것이 확인되었다. 비만인에서 교감신경 활성도가 증가하는데 이는 지방분해를 증가시키며 근육의 혈류를 감소시켜서(포도당의 운반) 인슐린 작용에 직접적으로 영향을 준다. 알파종양괴사인자는 혈당을 높여 당뇨병을 유발하거나, 혈관에 들어가 염증 형성을 막고 콜레스테롤이 쌓이는 것을 억제하는 아디포넥틴의 분비를 막아 혈관 내피 세포의 NF-kB 신호 전달을 저해하며 대식세포의 탐식 작용의 활성을 억제한다.
이러한 사실을 바탕으로 실시예 7의 조건에서 사육된 당뇨병 마우스군의 TNF-α 농도를 측정하였다.
그 결과, 도 19에서 나타나는 바와 같이 유홍초 유래 신규 화합물의 투여군에서 TNF-α 농도가 감소함을 확인 할 수 있다.
실시예 14: 유홍초 유래 신규 화합물에 처리에 의한 당뇨병 마우스의 항백내장 효과
실시예 7의 조건에서 사육된 당뇨병 마우스군에서 적출한 안구로부터 수정체를 분리하여 웰 플레이트로 옮긴 후 LAS 3000 이미지 분석장비로 사진을 찍었다. 혼탁정도는 찍은 사진을 LAS 300 이미지 분석 프로그램을 이용하여 분석하여 수정체의 혼탁도를 측정 하였다.
그 결과, 도 20에서 나타나는 바와 같이 유홍초 유래 신규 화합물의 투여군에서 혼탁도가 감소함을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (20)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 구조를 가지는 화합물:
    [화학식 1]
    Figure pat00006

    여기서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 탄소수 6 내지 30의 아릴기, 탄소수 1 내지 20의 알릴기, 탄소수 6 내지 30의 아릴알킬기 또는 아실기이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 또는 탄소수 1 내지 20의 알킬기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 하기 화학식 2로 표시되는 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 화합물:
    [화학식 2]
    Figure pat00007
    .
  4. 제1항에 있어서, 유홍초속 유래인 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 유홍초속은 둥근잎유홍초인 것을 특징으로 하는 화합물.
  6. 다음 단계를 포함하는 화학식 2로 표시되는 화합물의 제조방법:
    (a) 유홍초속을 물, 알코올, 유기용매 및 이들의 혼합물로 구성되는 군에서 선택되는 용매로 추출하여 유홍초 추출물을 제조하는 단계;
    (b) 상기 유홍초 추출물에 물을 가하여 현탁시키고, 노르말 헥산, 에틸 아세테이트 및 부탄올로 순차 분획하여 물 분획물을 얻는 단계; 및
    (c) 상기 물 분획물을 분리·정제하여 화학식 2로 표시되는 화합물을 수득하는 단계;
    [화학식 2]
    Figure pat00008
    .
  7. 제6항에 있어서, 상기 유홍초속은 둥근잎유홍초인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물; 그의 염; 또는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 함유하는 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식1]
    Figure pat00009

    여기서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 탄소수 6 내지 30의 아릴기, 탄소수 1 내지 20의 알릴기, 탄소수 6 내지 30의 아릴알킬기 또는 아실기이다.
  9. 제8항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 또는 탄소수 1 내지 20의 알킬기인 것을 특징으로 하는 당뇨병 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 유홍초의 식물배양 또는 조직 배양을 통해 얻은 추출물 과 추출물로부터 얻은 화합물을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

  11. 제8항에 있어서, 상기 화합물은 화학식 2로 표시되는 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 당뇨병 또는 당뇨 합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 2]
    Figure pat00010
    .
  12. 제8항에 있어서, 상기 당뇨합병증은 고혈당증, 고인슐린혈증, 고중성지방혈증, 인슐린 저항, 지질대사이상, 공복혈당장애, 내당증 이상, 비만, 동맥경화증, 미세혈관병증, 신장질환, 심장질환, 족부궤양, 관절염, 골다공증 및 당뇨에 의하여 유발되는 안과질환으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 당뇨병 및 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 당뇨에 의하여 유발되는 안과질환은 당뇨병성 망막증, 백내장, 황반변성증, 외안근 마비, 홍채 모양체염, 시신경염, 녹내장, 망막퇴행, 안저출혈, 굴절이상, 결막하 및 초자체 출혈로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 당뇨병 및 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제8항에 있어서, 항당뇨병 화합물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 항당뇨병 화합물은 나테글리니드, 레파글리니드, 글리타존류, 설포닐 우레아계, 메트포르민, 글리메프라이드, 티아졸리딘디온계, 비구아나이드계, 알파-글루코시데이스 억제제인 아카보스, 메글리티나이드계의 프란딘으로 구성된 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 당뇨병 또는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물; 그의 염; 또는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 함유하는 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 및 당뇨합병증 예방용 건강기능식품:
    [화학식1]
    Figure pat00011

    여기서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 탄소수 6 내지 30의 아릴기, 탄소수 1 내지 20의 알릴기, 탄소수 6 내지 30의 아릴알킬기 또는 아실기이다.
  17. 제16항에 있어서, 상기 화합물은 화학식 2로 표시되는 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 당뇨병 또는 당뇨합병증 예방용 건강기능식품:
    [화학식 2]
    Figure pat00012
    .
  18. 제16항에 있어서, 상기 당뇨합병증은 고혈당증, 고인슐린혈증, 고중성지방혈증, 인슐린 저항, 지질대사이상, 공복혈당장애, 내당능 이상, 비만, 동맥경화증, 미세혈관병증, 신장질환, 심장질환, 족부궤양, 관절염, 골다공증 및 당뇨에 의하여 유발되는 안과질환으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 당뇨병 및 당뇨합병증 예방용 건강기능식품.
  19. 제18항에 있어서, 상기 당뇨에 의하여 유발되는 안과질환은 당뇨병성 망막증, 백내장, 황반변성증, 외안근 마비, 홍채 모양체염, 시신경염, 녹내장, 망막퇴행, 안저출혈, 굴절이상, 결막하 및 초자체 출혈로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 당뇨병 및 당뇨합병증 예방용 건강기능식품.
  20. 제16항에 있어서, 유홍초의 식물배양 또는 조직 배양을 통해 얻은 추출물 과 추출물로부터 얻은 화합물을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 및 당뇨합병증 예방용 건강기능식품.
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