KR20130018759A

KR20130018759A - 담체 단백질에 컨쥬게이션된 에스．뉴모니애 다당류를 포함하는 면역원성 조성물

Info

Publication number: KR20130018759A
Application number: KR1020127026422A
Authority: KR
Inventors: 랄프 레온 비에만스; 피에르 두비비어; 올리비에 프란시스 니콜라스 가바르드; 얀 풀만
Original assignee: 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
Priority date: 2010-03-09
Filing date: 2010-08-17
Publication date: 2013-02-25
Also published as: WO2011110241A1; CN102869375B; AU2010348155B2; AU2010348155A1; ZA201206504B; CA2791915A1; MX2012010384A; GB201003924D0; JP2013521315A; EP2544710A1; SG183475A1; BR112012022359A2; CN102869375A; EA201290690A1; US20120321658A1

Abstract

본 발명은 2개 이상의 상이한 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이며, 여기서 하나 이상의 당류는 환원성 아민화 이외의 화학작용을 통해 단백질 담체(들)에 직접 또는 간접적으로 결합된 혈청형 1, 3, 19A 및 19F로 구성된 첫 번째 그룹으로부터 선택되고, 하나 이상의 다른 당류는 환원성 아민화에 의해 단백질 담체(들)에 결합된 혈청형 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C 및 23F로 구성된 두 번째 그룹으로부터 선택된다. 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 감염에 의해 야기된 질병의 치료 또는 예방에서의 그러한 조성물의 용도가 또한 기재된다.

Description

담체 단백질에 컨쥬게이션된 에스．뉴모니애 다당류를 포함하는 면역원성 조성물{IMMUNOGENIC COMPOSITION COMPRISING S. PNEUMONIAE POLYSACCHARIDES CONJUGATED TO CARRIER PROTEINS}

본 발명은 상이한 컨쥬게이션 화학작용이 면역원성 조성물 또는 백신의 상이한 성분에 대해 사용된 폐렴구균 컨쥬게이트 면역원성 조성물 또는 백신의 분야에 관한 것이다. 하나 이상의 혈청형의 컨쥬게이션을 위해 환원성 아민화가 이용되며 상이한 혈청형의 컨쥬게이션을 위해 환원성 아민화 이외의 컨쥬게이션이 이용된다. 본 발명은 또한 그러한 백신을 제조하는 방법 및 치료에서의 이들의 용도에 관한 것이다.

2세 미만의 아동은 대부분의 다당류 백신에 대한 면역 반응을 발생시키지 않으므로, 단백질 담체로의 화학적 컨쥬게이션에 의해 다당류에 면역원성을 제공하는 것이 필요하였다. T 의존성 항원인 단백질에 대한 T 비의존성 항원인 다당류의 커플링은 다당류에 아이소형 전환(isotype switching), 친화성 성숙, 및 기억 유도를 포함하는 T 의존성 특성을 부여한다.

스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)는 침습성 질병, 예를 들어, 폐렴, 균혈증 및 수막염, 및 집락화와 관련된 질병, 예를 들어, 급성 중이염을 발생시키는, 상당한 이환률 및 사망률의 원인(특히, 연소하거나 노령에서)이 되는 그람-양성 박테리아이다. 미국에서 60세 이상의 연령의 인간에 대한 폐렴구균성 폐렴의 비는 100,000명당 3 내지 8명으로 추정된다. 상기 환자중 20%는 항생제 치료에도 불구하고 사망률이 30%에 근접하는 균혈증, 및 기타 증상, 예를 들어, 수막염으로 진행된다.

폐렴구균은 혈청형 특이성을 부여하는 화학적으로 연결된 다당류로 캡슐화되어 있다. 90개의 공지된 폐렴구균 혈청형이 존재하며, 캡슐은 보체로부터 박테리아의 내부 표면을 보호할 뿐만 아니라 그 자체로 불완전한 면역원이므로, 상기 캡슐은 폐렴구균에 대한 주요 독성 결정인자이다. 다당류는 T-비의존성 항원이고, 가공되거나 MHC 분자에 제시되어 T-세포와 상호작용할 수 없다. 그러나, 이들은 B 세포 상의 표면 수용체의 가교를 포함하는 대안적인 메커니즘을 통해 면역계를 자극할 수 있다.

여러 실험에서, 침습성 폐렴구균 질병에 대한 보호가 캡슐에 특이적인 항체와 매우 강하게 관련되고, 상기 보호가 혈청형 특이적인 것으로 밝혀졌다.

스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)는 유아 및 어린 아동에서의 침습성 박테리아 질병 및 중이염의 가장 흔한 원인체이다. 마찬가지로, 중년의 인간은 폐렴구균 백신에 대해 충분치 않은 반응을 발생시키며 [Roghmann et al ., (1987), J. Gerontol. 42: 265-270], 따라서 이러한 집단에서 박테리아성 폐렴의 발생률이 증가한다 [Verghese and Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62: 271-285].

다가 폐렴구균 컨쥬게이트 백신이 개발되어 왔다. Synflorix는 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.에 의해 판매되며 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)로부터의 단백질 D에 컨쥬게이션된 폐렴구균 혈청형 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 및 23F 다당류, 파상풍 톡소이드에 컨쥬게이션된 18C 및 시아닐화 (CDAP) 화학작용을 통해 디프테리아 톡소이드에 컨쥬게이션된 19F를 함유한다. Prevenar는 화이자에 의해 판매되며 환원성 아민화 화학작용 의해 무독성 디프테리아 톡소인(toxoin) CRM197에 모두 컨쥬게이션된 폐렴구균 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F를 함유한다 (Prymula and Schuerman Expert Rev. vaccines 8; 1479-1500 (2009)).

본 발명은 목적은 다수의 혈청형 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 다당류 컨쥬게이트 백신의 개선된 제형을 개발하는 것이다. 이는 상이한 컨쥬게이션 방법을 이용하여 컨쥬게이션된 상이한 폐렴구균 혈청형으로부터의 당류를 조합시킴에 의해 달성될 수 있다. 이러한 방식으로, 당류 에피토프의 최선의 제시를 허락하는 컨쥬게이션 방법을 이용하여 각각의 혈청형이 제시될 수 있도록 상이한 혈청형에 대해 최적의 컨쥬게이션 방법이 선택된다. 일부 폐렴구균 당류 컨쥬게이트가 환원성 아민화를 잘 이용하는데 반해, 그 밖의 폐렴구균 당류의 경우, 상이한 컨쥬게이션 방법은 고리 구조가 파괴되지 않은 채로 남아 있도록 하여 양호한 결과를 제공할 수 있다. 환원성 아민와 또는 다른 컨쥬게이션 방법을 이용하여 가장 잘 작용하는 당류를 선택함으로써 더욱 효과적인 면역원성 조성물을 개발할 수 있다.

따라서, 2개 이상의 상이한 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함하는 면역원성 조성물이 제공되며, 여기서 하나 이상의 당류는 환원성 아민화 이외의 화학작용을 통해 단백질 담체(들)에 직접 또는 간접적으로 결합된 혈청형 1, 3, 19A 및 19F로 구성된 첫 번째 그룹으로부터 선택되고, 하나 이상의 다른 당류는 환원성 아민화에 의해 단백질 담체(들)에 결합된 혈청형 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C 및 23F로 구성된 두 번째 그룹으로부터 선택된다.

도 1. 다당류-단백질 컨쥬게이트의 제조.
A) 7vCRM에서, 19F 다당류는 환원성 아민화를 통해 무독성 디프테리아 CRM₁₉₇ 단백질에 컨쥬게이션된다. (1) 페리오데이트로의 산화는 말단 반응성 알데히드를 도입시킨다. (2) 환원성 아민화에 의해 CRM₁₉₇ 담체 단백질에 대한 연결을 끊고 육당류 고리를 오픈시킨다. (3) 컨쥬게이션 후에, 육당류 고리에 대한 새로운 기의 결합으로 인해 면역원성 에피토프가 생산될 수 있다.
B) PHiD-CV에서, 19F 다당류는 시아닐화 화학작용을 통해 디프테리아 톡소이드에 컨쥬게이션된다. 19F는 화학적으로 활성화되어 시아네이트기를 히드록실기에 도입시킴으로써, 단백질 성분의 첨가시에 아미노 또는 히드라지드기에 대한 공유 결합을 형성한다. 시아닐화 컨쥬게이션 후에, 육당류 고리는 무손상인 채로 남아 있고 그 밖의 화학적 기들은 결합하지 않을 수 있다.
도 2. PHiD-CV 또는 7vCRM 일차 및 추가접종(booster) 면역화 후 폐렴구균 혈청형 19F에 대해 ≥8의 OPA 역가를 달성하는 유아의 비율. 밝은 색 막대는 PHiD-CV에 대한 결과를 도시하고 어두운 색 막대는 7vCRM에 대한 결과를 도시한다. 에러 막대는 95% 신뢰 한계를 나타낸다.
도 3. PHiD-CV 또는 7vCRM 일차 및 추가접종 면역화 후 폐렴구균 혈청형 19A에 대해 ≥8의 OPA 역가를 달성하는 유아의 비율. 밝은 색 막대는 PHiD-CV에 대한 결과를 도시하고 어두운 색 막대는 7vCRM에 대한 결과를 도시한다. 에러 막대는 95% 신뢰 한계를 나타낸다.
도 4. 페리오데이트 처리 후 23F 및 6B 다당류의 크기. 삼각형으로 표시한 선은 10mM 포스페이트 완충액 중 6B의 크기를 도시하고, 다이아몬드로의 선 표시는 10mM 포스페이트 완충액 중 23F의 크기를 도시하며, 사각형으로의 선 표시는 100mM 포스페이트 완충액 중 23F의 크기를 도시한다.
도 5. CDAP 또는 환원성 아민화 컨쥬게이션을 이용한 23F 컨쥬게이트의 면역원성의 비교.
도 6. 환원성 아민화 또는 CDAP에 의해 제조된 6B 컨쥬게이트의 마우스에서 면역원성의 비교. 그래프는 환원성 아민화에 의해 제조된 네 개의 컨쥬게이트 (PS06B-CRM122-125) 및 CDAP에 의해 제조된 두 개의 컨쥬게이트 (PS06B-CRM003 및 PS06B-PD)의 ELISA 역가를 도시한다. OPA 결과가 하기에 도시된다.
도 7. 환원성 아민화 또는 CDAP에 의해 제조된 6B 컨쥬게이트의 기니아 피그에서 면역원성의 비교. 그래프는 환원성 아민화에 의해 제조된 네 개의 컨쥬게이트 (PS06B-CRM122-125) 및 CDAP에 의해 제조된 두 개의 컨쥬게이트 (PS06B-CRM003 및 PS06B-PD)의 ELISA 역가를 도시한다. OPA 결과가 하기에 도시된다.

발명의 설명

본 발명은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 상이한 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며, 여기서 하나 이상의 당류는 환원성 아민화 이외의 화학작용을 통해 단백질 담체(들)에 직접 또는 간접적으로 결합된 혈청형 1, 3, 19A 및 19F로 구성된 첫 번째 그룹으로부터 선택되고, 하나 이상의 다른 당류는 환원성 아민화에 의해 단백질 담체(들)에 결합된 혈청형 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 9V, 14, 18C 및 23F로 구성된 두 번째 그룹으로부터 선택된다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 환원성 아민화 이외의 화학작용을 통해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 혈청형 1 또는 3 또는 19A 또는 19F; 1 및 3; 1 및 19A; 1 및 19F; 3 및 19A; 3 및 19F; 19A 및 19F; 1, 3 및 19A; 1, 3 및 19F, 1, 19A 및 19F; 3, 19A 및 19F; 또는 1, 3, 19A 및 19F로부터의 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류(들)를 포함한다. 구체예에서, 19F는 환원성 아민화 이외의 화학작용을 통해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다.

임의로 혈청형 1, 3, 19A 또는 19F로부터의 캡슐 당류는 이러한 그룹의 추가 구성원이 환원성 아민화 이외의 방법을 이용하여 컨쥬게이션되는 한, 환원성 아민화를 이용하여 컨쥬게이션된다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 CDAP 화학작용과 같은 시아닐화 화학작용을 통해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 혈청형 1 또는 3 또는 19A 또는 19F; 1 및 3; 1 및 19A; 1 및 19F; 3 및 19A; 3 및 19F; 19A 및 19F; 1, 3 및 19A; 1, 3 및 19F, 1, 19A 및 19F; 3, 19A 및 19F; 또는 1, 3, 19A 및 19F로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함한다. 구체예에서, 19F는 CDAP 화학작용 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 카르보디이미드, 예를 들어 EDAC, 화학작용을 통해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 혈청형 1 또는 3 또는 19A 또는 19F; 1 및 3; 1 및 19A; 1 및 19F; 3 및 19A; 3 및 19F; 19A 및 19F; 1, 3 및 19A; 1, 3 및 19F; 1, 19A 및 19F; 3, 19A 및 19F; 또는 1, 3, 19A 및 19F로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함한다.

본 발명의 구체예에서, 하기 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 또는 이의 그룹은 환원성 아민화에 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다; 혈청형 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C 또는 23F, 4 및 5, 4 및 6A, 4 및 6B, 4 및 7F, 4 및 9V, 4 및 14, 4 및 18C, 4 및 23F, 5 및 6A, 5 및 6B, 5 및 7F, 5 및 9V, 5 및 14, 5 및 18C, 5 및 23F, 6A 및 6B, 6A 및 7F, 6A 및 9V, 6A 및 14, 6A 및 18C, 6A 및 23F, 6B 및 7F, 6B 및 9V, 6B 및 14, 6B 및 18C, 6B 및 23F, 7F 및 9V, 7F 및 14, 7F 및 18C, 7F 및 23F, 9V 및 14, 9V 및 18C, 9V 및 23F, 14 및 18C, 14 및 23F 또는 18C 및 23F. 구체예에서, 23F는 환원성 아민화 화학작용 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다.

본 발명의 구체예에서, 혈청형 19F로부터의 폐렴구균 다당류는 시아닐화 화학작용, 예를 들어 CDAP 화학작용에 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션되는 한편, 혈청형 23으로부터의 폐렴구균 다당류는 환원성 아민화 화학작용에 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다.

본 발명의 구체예에서, 혈청형 19F로부터의 폐렴구균 다당류는 시아닐화 화학작용, 예를 들어 CDAP 화학작용에 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션되는 한편, 혈청형 6B로부터의 폐렴구균 다당류는 환원성 아민화 화학작용에 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다.

본 발명의 구체예에서, 혈청형 19F로부터의 폐렴구균 다당류는 시아닐화 화학작용, 예를 들어 CDAP 화학작용에 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션되는 한편, 혈청형 6A로부터의 폐렴구균 다당류는 환원성 아민화 화학작용에 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다.

본 발명의 구체예에서, 혈청형 19F로부터의 폐렴구균 다당류는 시아닐화 화학작용, 예를 들어 CDAP 화학작용에 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션되는 한편, 혈청형 6C로부터의 폐렴구균 다당류는 환원성 아민화 화학작용에 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다.

본 발명의 구체예에서, 상이한 혈청형으로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류는 환원성 아민화 화학작용을 이용하여 담체 단백질에 컨쥬게이션된다.

환원성 아민화 화학작용을 이용하여 컨쥬게이션시키는 경우 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류는 활성화 당류를 형성하기 위해 0.1-1.2, 0.1-0.5, 0.1-0.2, 0.5-0.8, 0.1-0.8, 0.3-1.0 또는 0.4-0.9 몰당량의 페리오데이트를 이용하여 임의로 산화된다. 임의로 페리오데이트 처리 단계는 아민기를 함유하지 않는 완충액, 예를 들어 포스페이트 완충액, 보레이트 완충액, 아세테이트 완충액, 카르보네이트 완충액 및 시트레이트 완충액에서 수행된다. 구체예에서, 완충액은 무기 완충액이다. 구체예에서, 완충액은 포스페이트 완충액, 예를 들어 소디움 포스페이트 완충액 또는 포타슘 포스페이트 완충액이다. 본 발명자들은 환원성 아민화 공정의 산화 단계의 조건을 조절함에 의해, 생성된 컨쥬게이트가 유리하게 당류의 크기 및/또는 면역원성을 보유할 수 있음을 인지하였다.

구체예에서, 완충액, 예를 들어 포스페이트 완충액은 1-100mM, 5-80mM, 1-50mM, 1-25mM, 10-40mM, 1-10mM, 5-15mM, 8-12mM, 10-20mM, 5-20mM, 10-50mM, 약 10mM 또는 약 20mM의 농도를 갖는다. 구체예에서 완충액의 pH는 pH 5.0-7.0, pH 5.5-6.5, pH 5.8-6.3, 또는 약 pH 6.0이다.

용어 "페리오데이트"는 페리오데이트 및 과요오드산 둘 모두를 포함한다. 이러한 용어는 또한 메타 페리오데이트 (IO₄ ^-) 및 오르토페리오데이트 (IO₆ ^5-) 둘 모두를 포함하지만, 특정한 일 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 페리오데이트는 메타페리오데이트이다. 용어 "페리오데이트"는 또한 소디움 페리오데이트 및 포타슘 페리오데이트를 포함하는 페리오데이트의 다양한 염을 포함한다. 항원이 페리오데이트와 반응할 때, 페리오데이트는 근접 히드록실기를 산화시켜 카르보닐 또는 알데히드기를 형성하고 C-C 결합의 절단을 초래한다. 이러한 이유로 "항원을 페리오데이트와 반응시키는"이라는 용어는 페리오데이트에 의한 근접 히드록실기의 산화를 포함하고, 예를 들어 반응은 시스 또는 트랜스 근접 디올의 산화를 포함할 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상이한 혈청형으로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류가 CDAP 화학작용을 이용하여 담체 단백질에 컨쥬게이션된다.

본 발명의 구체예에서, 상이한 혈청형으로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류가 카르보디이미드, 예를 들어 EDAC, 화학작용을 이용하여 담체 단백질에 컨쥬게이션된다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, CRM197, 단백질 D, 뉴몰리신 및 PhtD 또는 이의 단편이나 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 담체 단백질을 함유한다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 적어도 또는 정확히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 상이한 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 혈청형에 별도로 컨쥬게이션된 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 상이한 담체 단백질을 함유한다. 임의로 이러한 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, CRM197, 단백질 D, 뉴몰리신 및 PhtD 또는 이들의 단편이나 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 1을 포함한다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 단백질 D, CRM197, 뉴몰리신 또는 PhtD 또는 이들의 단편이나 융합 단백질에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 3을 포함한다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 4를 포함한다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 5를 포함한다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 6B를 포함한다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 7F를 포함한다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 9V를 포함한다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 14를 추가로 포함한다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 23F를 포함한다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 파상풍 톡소이드 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 18C를 포함한다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 뉴몰리신 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 19A를 포함한다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 CRM197 또는 PhtD 또는 이들의 단편이나 융합 단백질에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 22F를 포함한다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 뉴몰리신 또는 에이치. 인플루엔자(H. influenzae) 단백질, 임의로 단백질 D 또는 PhtD 또는 이의 융합 단백질 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 6A를 포함한다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 뉴몰리신 또는 에이치. 인플루엔자(H. influenzae) 단백질, 임의로 단백질 D 또는 PhtD 또는 이의 융합 단백질 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 6C를 포함한다.

본 명세서에 걸쳐서 용어 "당류"는 다당류 또는 올리고당류를 나타낼 수 있고, 둘 모두를 포함한다. 다당류는 박테리아로부터 분리되고, 공지된 방법(참고: EP497524 및 EP497525) 및 임의로 미세유동화에 의해 일정한 정도로 크기 조절될 수 있다. 다당류는 다당류 샘플의 점성을 감소시키고/거나 컨쥬게이션된 생성물의 여과성을 개선시키기 위해 크기 조절될 수 있다. 올리고당류는 적은 수의 반복 단위(통상적으로, 5 내지 30개의 반복 단위)를 지니고, 통상적으로 가수분해된 다당류이다.

스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)의 캡슐 다당류는 8개 이하의 당 잔기를 함유할 수 있는 반복 올리고당류 단위를 포함한다. 주요 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 혈청형에 대한 올리고당류 단위의 개관을 위해 문헌[JONES, Christopher. Vaccines based on the cell surface carbohydrates of pathogenic bacteria . An . Acad . Bras . Cienc , June 2005, vol.77, no.2, p.293-324. Table Ⅱ ISSN 0001-3765]를 참조하라. 일 구체예에서, 캡슐 당류 항원은 전장 다당류일 수 있으나, 다른 구체예에서 이는 하나의 올리고당류 단위이거나, 반복 올리고당류 단위의 천연 길이의 당류 사슬보다 짧을 수 있다. 일 구체예에서, 백신에 존재하는 모든 당류는 다당류이다. 전장 다당류는 "크기 조절될" 수 있으며, 즉 이들의 크기는 다양한 방법, 예를 들어, 산 가수분해 처리, 과산화수소 처리, 올리고당류 단편을 생성시키기 위한 에멀지플렉스(emulsiflex?)에 의한 크기 조절 후의 과산화수소 처리 또는 미세유동화에 의해 감소될 수 있다.

본 발명자들은 또한 당 분야의 초점이 컨쥬게이트 생성의 용이함을 위해 올리고당류를 사용하는 데에 있음을 인지하였다. 본 발명자들은 천연 또는 약간 크기 조절된 다당류 컨쥬게이트를 사용함으로써 다음과 같은 이점중 하나 이상이 실현될 수 있음을 발견하였다: 1) 여과가능한 높은 면역원성을 지니는 컨쥬게이트, 2) 컨쥬게이트 내의 다당류 대 단백질의 비(w/w)가 증가(담체 억제 효과에 대한 영향력을 지닐 수 있음)될 수 있도록 컨쥬게이트 내의 다당류 대 단백질의 비가 변경될 수 있음, 3) 컨쥬게이션을 위한 보다 큰 당류의 사용에 의해 가수분해되기 쉬운 면역원성 컨쥬게이트가 안정화될 수 있음. 보다 큰 다당류의 사용은 컨쥬게이트 담체와의 보다 많은 가교를 발생시킬 수 있고, 컨쥬게이트로부터의 유리 당류의 유리를 감소시킬 수 있다. 종래에 기술된 컨쥬게이트 백신은 컨쥬게이션을 개선시키기 위해 컨쥬게이션 전에 다당류를 탈중합시키는 경향이 있었다. 본 발명자들은 보다 큰 크기의 당류를 보유하는 당류 컨쥬게이트 백신이 폐렴구균 질병에 대해 우수한 면역 반응을 제공할 수 있음을 발견하였다.

따라서, 본 발명의 면역원성 조성물은 하나 이상의 당류 컨쥬게이트를 포함할 수 있고, 여기서 컨쥬게이션 전의 각각의 당류의 평균 크기(중량-평균 분자량; Mw)는 80kDa, 100kDa, 200kDa, 300kDa, 400kDa, 500kDa 또는 1000kDa 이상이다. 일 구체예에서, 컨쥬게이션 후의 컨쥬게이트는 여과전 샘플에 비해 50, 60, 70, 80, 90 또는 95% 이상의 수득량이 여과 후에 수득되도록 0.2 마이크론 필터를 통해 용이하게 여과될 수 있어야 한다.

본 발명의 목적상, "천연 다당류"는 당류의 크기를 감소시키기 위한 목적의 가공에 적용되지 않은 당류를 의미한다. 다당류는 일반적인 정제 과정 동안 크기가 약간 감소될 수 있다. 이러한 당류는 여전히 천연 당류이다. 단지 다당류가 크기를 조절하는 기술에 적용된 경우에만 다당류가 천연으로 간주되지 않는다. 천연 다당류의 크기는, 예를 들어, 250kDa 내지 2,000kDa, 400 내지 1,500kDa, 750kDa 내지 1,250kDa, 300kDa 내지 600kDa, 500 내지 1,000kDa 또는 1,000 내지 1,500kDa이며, 당업자에 의해 인지되는 바와 같이 다양한 혈청형은 다양한 크기의 천연 다당류를 갖는다.

본 발명의 목적상, "2배 이하로 크기 조절된"은 당류가 당류의 크기를 감소시키기 위한 공정에 적용되나, 천연 다당류 크기의 반 이상이 유지되는 것을 의미한다. 3배 또는 4배 등은 동일한 방식, 즉 당류가 다당류의 크기를 감소시키기 위한 공정에 적용되나, 천연 다당류의 크기의 1/3, 1/4 이상의 크기가 유지되는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 양태에서, 면역원성 조성물은 담체 단백질에 컨쥬게이션된 10개 이상의 혈청형으로부터의 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 당류를 포함하고, 여기서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이상 또는 각각의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 당류는 천연 다당류이다.

본 발명의 양태에서, 면역원성 조성물은 담체 단백질에 컨쥬게이션된 10개 이상의 혈청형으로부터의 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 당류를 포함하고, 여기서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이상 또는 각각의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 당류는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배 이하로 크기 조절된 것이다. 이러한 양태의 일 구체예에서, 대부분의 당류, 예를 들어, 6, 7, 8개 또는 이 이상의 당류는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배 이하로 크기 조절된 것이다.

본원의 당류의 분자량 또는 평균 분자량은 컨쥬게이션 전에 측정된 당류의 중량-평균 분자량(Mw)을 의미하며, MALLS에 의해 측정된다.

MALLS 기술은 당 분야에 널리 공지되어 있고, 통상적으로 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행된다. 폐렴구균 당류의 MALLS 분석을 위해, 두개의 컬럼(TSKG6000 및 5000PWx1)이 조합되어 사용될 수 있고, 당류는 수중에 용리된다. 당류는 광산란 검출기(예를 들어, 488nm에서의 10mW 아르곤 레이저가 장착된 Wyatt Dawn DSP) 및 간섭 굴절계(inferometric refractometer)(예를 들어, 498nm에서의 P100 셀(cell) 및 적색 필터가 장착된 Wyatt Otilab DSP)를 이용하여 검출된다.

구체예에서, 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 당류는 천연 다당류 또는 일반적인 추출 과정 동안 크기가 감소된 천연 다당류이다.

구체예에서, 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 당류는 기계적 절단, 예를 들어, 미세유동화 또는 음파처리에 의해 크기 조절된다. 미세유동화 및 음파처리는 보다 큰 천연 다당류의 크기를 여과가능한 컨쥬게이트를 제공하기에 충분한 크기로 감소시키는 이점을 지닌다. 크기는 20, 10, 8, 6, 5, 4, 3 또는 2배 이하로 조절된다.

구체예에서, 면역원성 조성물은 천연 다당류 및 20배 이하로 크기 조절된 당류의 혼합물로부터 제조된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 컨쥬게이트를 포함한다. 이러한 구체예의 일 양태에서, 대부분의 당류, 예를 들어, 6, 7 또는 8개 이상의 당류는 2, 3, 4, 5 또는 6배 이하로 크기 조절된다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 평균 크기가 100 kDa 이상이고, 예를 들어 110 내지 700 kDa, 110-300, 120-200, 130-180, 또는 140-160 kDa인 19A당류를 포함한다. 구체예에서 19A는 미세유동화에 의해 약간 크기 조절되며, 예를 들어 2, 3, 4 또는 5배 이하로 크기 조절된다. 구체예에서, 19A 컨쥬게이트의 당류 용량은 당류의 1 내지 10 ㎍, 1 내지 5 ㎍, 또는 1 내지 3 ㎍, 임의로 당류의 3 ㎍이다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 22F 당류 컨쥬게이트를 포함하고, 여기서 22F 당류의 평균 크기는 100 kDa 이상이고, 임의로 110 내지 700 kDa, 110-300, 120-200, 130-180, 또는 150-170 kDa이다. 구체예에서, 22F 당류는 미세유동화에 의해 크기 조절되며, 예를 들어 2, 3, 4 또는 5배 이하로 크기 조절된다. 구체예에서, 22F 컨쥬게이트의 당류 용량은 당류의 1 내지 10 ㎍, 1 내지 5 ㎍, 또는 1 내지 3 ㎍, 임의로 당류의 3 ㎍이다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 다수의 당류 컨쥬게이트를 포함하며, 당류의 평균 크기는 50 kDa 이상이다. 구체예에서 혈청형 1 당류의 평균 크기는 300 내지 400 kDa이다. 구체예에서 혈청형 4 당류의 평균 크기는 75 내지 125 kDa이다. 구체예에서 혈청형 5 당류의 평균 크기는 350 내지 450 kDa이다. 구체예에서 혈청형 6B 당류의 평균 크기는 1000 내지 1400 kDa이다. 구체예에서 혈청형 7F 당류의 평균 크기는 200 내지 300 kDa이다. 구체예에서 혈청형 9V 당류의 평균 크기는 250 내지 300 kDa이다. 구체예에서 혈청형 14 당류의 평균 크기는 200 내지 250 kDa이다. 구체예에서 혈청형 23F 당류의 평균 크기는 900 내지 1000 kDa이다. 구체예에서 혈청형(들) 5; 6A, 6B; 23F; 5 및 6A; 5 및 6B, 5 및 23F, 6A 및 6B, 6A 및 23F; 6B 및 23F; 5, 6A 및 6B; 5, 6A 및 23F; 5, 6B 및 23F 또는 5, 6A, 6B 및 23F는 천연 크기의 당류로서 컨쥬게이션되며, 즉 전용 크기 조절 단계가 본 공정에 포함되지 않는다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물에서 캡슐 당류 컨쥬게이트의 당류 용량은 컨쥬게이트 당 1 내지 10 ㎍, 1 내지 5 ㎍, 또는 1 내지 3 ㎍의 당류이다. 예를 들어, 조성물은 혈청형 4, 18C, 19F 및 22F (및 임의로 19A)의 컨쥬게이트를 컨쥬게이트 당 3 ㎍ 용량의 당류로 포함한다. 예를 들어 본 발명의 면역원성 조성물은 혈청형 1, 5, 6B, 7F, 9V, 14 및 23F (및 임의로 6A 및/또는 3)의 컨쥬게이트를 컨쥬게이트 당 1 ㎍ 용량의 당류로 포함한다.

구체예에서, 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 당류는 링커, 예를 들어, 이기능성 링커를 통해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다. 링커는 임의로 예를 들어, 반응성 아미노기 및 반응성 카르복실산기, 2개의 반응성 아미노기 또는 2개의 반응성 카르복실산기를 지니는 이종이기능성(heterobifunctional) 또는 동종이기능성(homobifunctional) 링커이다. 링커는, 예를 들어, 4 내지 20, 4 내지 12, 5 내지 10개의 탄소 원자를 지닌다. 가능한 링커는 ADH이다. 기타 링커는 B-프로피온아미도(WO 00/10599), 니트로페닐-에틸아민(Gever et al (1979) Med. Microbiol. Immunol. 165; 171-288), 할로알킬 할라이드(US4057685), 글리코시드 결합(US4673574, US4808700), 헥산 디아민 및 6-아미노카프론산(US4459286)을 포함한다. 구체예에서, ADH는 혈청형 18C로부터의 당류를 컨쥬게이션시키기 위한 링커로 사용된다.

본 발명의 면역원성 조성물에 존재하는 당류 컨쥬게이트는 임의의 공지된 커플링 기술에 의해 제조될 수 있다. 컨쥬게이션 방법은 1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP)를 이용하여 당류를 활성화시켜, 시아네이트 에스테르를 형성시키는 것을 기초로 할 수 있다. 따라서, 활성화된 당류는 직접적으로 또는 스페이서(링커)기를 통해 담체 단백질 상의 아미노기에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 말레이미드-활성화된 담체 단백질(예를 들어, GMBS를 이용함) 또는 할로아세틸화된 담체 단백질(예를 들어, 아이오도아세트이미드 [예를 들어, 에틸 아이오도아세트이미드 HCl] 또는 N-숙신이미딜 브로모아세테이트 또는 SIAB, 또는 SIA, 또는 SBAP를 이용함)과의 반응 후에 수득된 티오에테르 결합을 통해 담체에 커플링될 수 있는 티올화된 다당류를 제공하는 시스타민 또는 시스테아민일 수 있었다. 임의로, 시아네이트 에스테르(임의로, CDAP 화학작용 의해 제조됨)는 헥산 디아민 또는 ADH와 함께 커플링되고, 아미노-유도된 당류는 단백질 담체 상의 카르복실기를 통해 카르보디이미드(예를 들어, EDAC 또는 EDC) 화학작용을 이용하여 담체 단백질에 컨쥬게이션된다. 이러한 컨쥬게이트는 PCT 공개 출원 WO 93/15760(Uniformed Services University) 및 WO 95/08348 및 WO 96/29094에 기술되어 있다.

기타 적절한 기술은 카르보디이미드, 카르비이니드, 히드라지드, 활성 에스테르, 노르보란, p-니트로벤조산, N-히드록시숙신이미드, S-NHS, EDC 및 TSTU를 이용한다. 다양한 기술이 WO 98/42721에 기술되어 있다. 컨쥬게이션은 당류의 유리 히드록실기와 CDI의 반응(Bethell et al J. Biol. Chem. 1979, 254; 2572-4, Hearn et al J. Chromatogr. 1981. 218; 509-18) 후에 단백질과의 반응에 의해 카르바메이트 결합을 형성함으로써 형성될 수 있는 카르보닐 링커를 포함할 수 있다. 이는 아노머 말단의 일차 히드록실기로의 환원, 임의로 일차 히드록실기의 보호/탈보호, 일차 히드록실기와 CDI의 반응에 의한 CDI 카르바메이트 중간체의 형성, 및 CDI 카르바메이트 중간체와 단백질 상의 아미노기와의 커플링을 포함할 수 있다.

컨쥬게이트는 또한 US 4365170(Jennings) 및 US 4673574(Anderson)에 기술된 바와 같은 직접적인 환원성 아민화 방법에 의해 제조될 수 있다. 기타 방법이 EP-0-161-188, EP-208375 및 EP-0-477508에 기술되어 있다.

한 추가 방법은 카르보디이미드 축합(Chu C. et al Infect. Immunity, 1983 245 256), 예를 들어, EDAC를 이용한, 아디프산 디히드라지드(ADH)로 유도된 시아노겐 브로마이드 (또는 CDAP) 활성화 당류의 단백질 담체로의 커플링을 포함한다.

구체예에서, 당류 상의 히드록실기(임의로, 활성화된 히드록실기, 예를 들어, 시아네이트 에스테르를 제조하기 위해 활성화된 히드록실기[예를 들어, CDAP를 이용함])는 단백질 상의 아미노기 또는 카르복실기에 직접적 또는 간접적(링커를 통함)으로 연결된다. 링커가 존재하는 경우, 당류 상의 히드록실기는, 예를 들어, CDAP 컨쥬게이션을 이용하여 임의로 링커 상의 아미노기에 연결된다. 링커 내의 한 추가 아미노기(예를 들어, ADH)는, 예를 들어, 카르보디이미드 화학, 예를 들어, EDAC를 이용하여 단백질 상의 카르복실산기에 컨쥬게이션될 수 있다. 구체예에서, 폐렴구균 캡슐 당류(들)은 링커가 담체 단백질에 컨쥬게이션되기 전에 먼저 링커에 컨쥬게이션된다. 대안적으로, 링커는 당류로의 컨쥬게이션 전에 담체에 컨쥬게이션될 수 있다.

일부 당류-단백질 컨쥬게이트가 CDAP에 의해 제조되고, 일부가 환원성 아민화에 의해 제조되는 상기 기술의 조합이 또한 이용될 수 있다.

일반적으로, 단백질 담체 상의 하기 유형의 화학기가 커플링/컨쥬게이션에 사용될 수 있다:

A) 카르복실(예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산을 통함). 일 구체예에서, 이러한 기는 당류 상의 아미노기에 직접 연결되거나, 카르보디이미드 화학, 예를 들어, EDAC를 이용하여 링커 상의 아미노기에 연결된다.

B) 아미노기(예를 들어, 리신을 통함). 일 구체예에서, 이러한 기는 당류 상의 카르복실기에 직접 연결되거나, 카르보디이미드 화학, 예를 들어, EDAC를 이용하여 링커 상의 카르복실기에 연결된다. 또 다른 구체예에서, 이러한 기는 당류 상의 CDAP 또는 CNBr를 이용하여 활성화된 히드록실기에 직접 연결되거나, 링커 상의 상기 기에 연결되거나; 알데히드기를 지니는 당류 또는 링커에 연결되거나; 숙신이미드 에스테르기를 지니는 당류 또는 링커에 연결된다.

C) 술피드릴(예를 들어, 시스테인을 통함). 일 구체예에서, 이러한 기는 말레이미드 화학작용을 이용하여 브로모 또는 클로로 아세틸화된 당류 또는 링커에 연결된다. 일 구체예에서, 이러한 기는 비스 디아조벤지딘을 이용하여 활성화되고/변형된다.

D) 히드록실기(예를 들어, 티로신을 통함). 일 구체예에서, 이러한 기는 비스 디아조벤지딘을 이용하여 활성화되고/변형된다.

E) 이미다졸릴기(예를 들어, 히스티딘을 통함). 일 구체예에서, 이러한 기는 비스 디아조벤지딘을 이용하여 활성화되고/변형된다.

F) 구아니딜기(예를 들어, 아르기닌을 통함).

G) 인돌릴기(예를 들어, 트립토판을 통함).

당류에서, 일반적으로 커플링을 위해 다음과 같은 기가 이용될 수 있다: OH, COOH 또는 NH₂. 알데히드기는 당 분야에 공지된 다양한 처리, 예를 들어, 페리오데이트 처리, 산 가수분해, 과산화수소 등의 처리 후에 생성될 수 있다.

직접적 커플링 방법:

당류-OH + CNBr 또는 CDAP ----> 시아네이트 에스테르 + NH₂-Prot ----> 컨쥬게이트

당류-알데히드 + NH₂-Prot ----> 쉬프(Schiff) 염기 + NaCNBH₃ ----> 컨쥬게이트

당류-COOH + NH₂-Prot + EDAC ----> 컨쥬게이트

당류-NH₂ + COOH-Prot + EDAC ----> 컨쥬게이트

스페이서(링커)를 통한 간접적 커플링 방법:

당류-OH + CNBr 또는 CDAP ----> 시아네이트 에스테르 + NH₂----NH₂ ----> 당류----NH₂ + COOH-Prot + EDAC ----> 컨쥬게이트

당류-OH + CNBr 또는 CDAP ----> 시아네이트 에스테르 + NH₂----SH ----> 당류----SH + SH-Prot(노출된 시스테인을 지니는 천연 단백질 또는, 예를 들어, SPDP에 의한 단백질의 아미노기의 변형 후에 수득된 단백질) ----> 당류-S-S-Prot

당류-OH + CNBr 또는 CDAP ----> 시아네이트 에스테르 + NH₂----SH ----> 당류----SH + 말레이미드-Prot(아미노기의 변형) ----> 컨쥬게이트

당류-OH + CNBr 또는 CDAP ----> 시아네이트 에스테르 + NH₂----SH ----> 당류-SH + 할로아세틸화된-Prot ----> 컨쥬게이트

당류-COOH + EDAC + NH₂----NH₂ ----> 당류----NH₂ + EDAC + COOH-Prot ----> 컨쥬게이트

당류-COOH + EDAC+ NH₂----SH ----> 당류----SH + SH-Prot(노출된 시스테인을 지니는 천연 단백질 또는, 예를 들어, SPDP에 의한 단백질의 아미노기의 변형 후에 수득된 단백질) ----> 당류-S-S-Prot

당류-COOH + EDAC+ NH₂----SH ----> 당류----SH + 말레이미드-Prot(아미노기의 변형) ----> 컨쥬게이트

당류-COOH + EDAC + NH₂----SH ----> 당류-SH + 할로아세틸화된-Prot ----> 컨쥬게이트

당류-알데히드 + NH₂----NH₂ ----> 당류----NH₂ + EDAC + COOH-Prot ----> 컨쥬게이트

주의: 상기 EDAC 대신, 임의의 적절한 카르보디이미드가 사용될 수 있다.

요약하면, 당류와의 커플링에 일반적으로 사용될 수 있는 단백질 담체 화학기의 유형은 아미노기(예를 들어, 리신 잔기 상), COOH 기(예를 들어, 아스파르트산 및 글루탐산 잔기 상) 및 SH 기(접근 가능시)(예를 들어, 시스테인 잔기 상)이다.

임의로, 담체 단백질 대 에스. 뉴모니애(S. pneuniae) 당류의 비는 1:5 내지 5:1, 1:2 내지 2.5:1, 1:1 내지 2:1(w/w)이다. 구체예에서, 대부분의 컨쥬게이트, 예를 들어, 6, 7, 8 또는 9개 이상의 컨쥬게이트는 1:1 초과, 예를 들어, 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1 또는 1.6:1 (w/w)의 담체 단백질 대 당류의 비를 지닌다.

일 구체예에서, 하나 이상의 에스. 뉴모니애(S. pneuniae) 당류가 CDAP 및 EDAC를 이용하여 링커를 통해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다. 예를 들어, 18C는 상기 기술된 바와 같이 CDAP 및 EDAC를 이용하여 링커(예를 들어, 말단에 두개의 히드라지노기를 지니는 링커, 예를 들어, ADH)를 통해 단백질에 컨쥬게이션될 수 있다. 링커가 사용되는 경우, 당류를 링커에 컨쥬게이션시키기 위해 CDAP가 사용될 수 있고, 이후 링커를 단백질에 컨쥬게이션시키기 위해 EDAC가 사용될 수 있거나, 대안적으로 링커를 단백질에 컨쥬게이션시키기 위해 먼저 EDAC가 사용되고, 이후 링커를 당류에 컨쥬게이션시키기 위해 CDAP가 사용될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 면역원성 조성물은 0.1 내지 20 ㎍, 1 내지 10 ㎍ 또는 1 내지 3 ㎍의 당류의 각각의 당류 컨쥬게이트의 용량을 포함할 수 있다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 0.1 내지 20 ㎍; 0.5 내지 10 ㎍; 0.5 내지 5 ㎍ 또는 1 내지 3 ㎍의 당류의 용량으로 각각의 에스. 뉴모니애(S. pneuniae) 캡슐 당류를 함유한다. 일 구체예에서, 캡슐 당류는 다양한 용량으로 존재할 수 있고, 예를 들어, 몇몇 캡슐 당류는 약 또는 정확히 1 ㎍의 용량으로 존재할 수 있거나, 몇몇 캡슐 당류는 약 또는 정확히 3 ㎍의 용량으로 존재할 수 있다. 일 구체예에서, 혈청형 3, 18C 및 19F(또는 4, 18C 및 19F)으로부터의 당류는 기타 당류보다 많은 용량으로 존재한다. 이러한 구체예의 일 양태에서, 혈청형 3, 18C 및 19F(또는 4, 18C 및 19F)는 약 또는 정확히 3 ㎍의 용량으로 존재하는 반면, 면역원성 조성물 내의 기타 당류는 약 또는 정확히 1 ㎍의 용량으로 존재한다.

"약" 또는 "대략"은 본 발명의 목적상 제공된 수의 10% 이상 또는 이하의 범위로 정의된다.

구체예에서, 하나 이상의 에스. 뉴모니애(S. pneuniae) 캡슐 당류가 담체 단백질에 직접적으로 컨쥬게이션된다. 바람직하게는, 하나 이상의 에스. 뉴모니애(S. pneuniae) 캡슐 당류는 CDAP에 의해 직접 컨쥬게이션된다. 일 구체예에서, 대부분의 캡슐 당류, 예를 들어, 5, 6, 7, 8 또는 9개 이상의 캡슐 당류가 CDAP에 의해 담체 단백질에 직접 연결된다(참고: WO 95/08348 및 WO 96/29094).

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 하나 이상의 컨쥬게이션되지 않거나 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneuniae) 단백질을 포함한다. 구체예에서, 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 단백질은 컨쥬게이션되지 않은 형태로 첨가되고, 예를 들어 이것은 조성물에 유리 단백질로서 존재한다.

구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 폴리 히스티딘 트라이어드 패밀리(PhtX), 콜린 결합 단백질 패밀리(CbpX), CbpX 트렁케이트(truncate), LytX 패밀리, LytX 트렁케이트, CbpX 트렁케이트-LytX 트렁케이트 키메라 단백질, 무독화 뉴몰리신(Ply), PspA, PsaA, Sp128, Sp101, Sp130, Sp125 및 Sp133으로부터 선택된 적어도 또는 정확히 1, 2, 3 또는 4개의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 단백질을 포함한다. 예를 들어, 조성물은 무독화 뉴몰리신 및/또는 PhtD를 함유한다. 예를 들어, 조성물은 무독화 뉴몰리신 및 PhtD 및 Sp128을 함유한다. 예를 들어, 조성물은 무독화 뉴몰리신 및 PhtD 및 Sp130을 함유한다.

Pht(폴리 히스티딘 트라이어드) 패밀리는 단백질 PhtA, PhtB, PhtD 및 PhtE를 포함한다. 이러한 패밀리는 지질화 서열, 프롤린-풍부 영역에 의해 분리된 두개의 도메인 및 여러 히스티딘 트라이어드를 특징으로 하며, 이는 금속 또는 뉴클레오시드 결합 또는 효소 활성, (3-5) 코일드 코일 영역, 보존된 N-말단 및 이종성 C 말단을 포함할 수 있다. 이는 시험된 폐렴구균의 모든 균주에 존재한다. 동종성 단백질이 또한 기타 스트렙토코쿠스 및 나이세리아에서 발견되었다. 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 Pht 단백질은 PhtD이다. 그러나, 용어 Pht A, B, D 및 E는 하기 인용문에 기술된 서열을 지니는 단백질 뿐만 아니라 참조 단백질과 90% 이상 동일한 서열 상동성을 지니는 이의 천연 발생 (및 인공) 변이체를 의미하는 것이 이해된다. 임의로, 이는 95% 이상 동일하거나 97% 이상 동일하다.

PhtX 단백질에 대해, PhtA는 WO 98/18930에 기술되어 있고, 또한 Sp36으로 언급되어 있다. 상기 기술된 바와 같이, 이는 폴리히스티딘 트라이어드 패밀리로부터의 단백질이며, LXXC의 타입 Ⅱ 신호 모티프를 지닌다. PhtD는 WO 00/37105에 기술되어 있고, 이는 또한 Sp036D로 언급되어 있다. 상기 기술된 바와 같이, 이는 또한 폴리히스티딘 트라이어드 패밀리로부터의 단백질이고, 타입 Ⅱ LXXC 신호 모티프를 지닌다. PhtB는 WO 00/37105에 기술되어 있고, 이는 또한 Sp036B로 언급되어 있다. PhtB 패밀리의 또 다른 일원은 WO 00/17370에 기술된 바와 같은 C3-분해 폴리펩티드이다. 이러한 단백질은 또한 폴리히스티딘 트라이어드 패밀리로부터의 단백질이고, 타입 Ⅱ LXXC 신호 모티프를 지닌다. 예를 들어, 면역학적 기능 동등체는 WO 98/18930에 기술된 단백질 Sp42이다. PhtB 트렁케이트(대략 79kD)가 WO 99/15675에 기술되어 있으며, 이 또한 PhtX 패밀리의 구성원으로 간주된다. PhtE가 WO 00/30299에 기술되어 있으며, 이는 BVH-3로 언급되어 있다. 임의의 Pht 단백질이 본원에 언급되는 경우, Pht 단백질의 면역원성 단편 또는 이의 융합체가 사용될 수 있음을 의미한다. 예를 들어, PhtX에 대한 참고는 임의의 Pht 단백질로부터의 면역원성 단편 또는 이의 융합체를 포함한다. PhtD 또는 PhtB에 대한 참고는, 예를 들어, WO 0198334에서 발견되는 바와 같은 PhtDE 또는 PhtBE 융합체를 참고로 한다.

뉴몰리신은 별개의 세포용해(용혈) 활성 및 보체 활성화 활성을 지니는 다기능성 독소이다(Rubins et al., Am. Respi. Cit Care Med, 153:1339-1346 (1996)). 독소는 폐렴구균에 의해 분비되지 않지만, 자가용해소의 영향하에서 폐렴구균의 용해시에 방출된다. 이의 효과는, 예를 들어, 인간 단핵구에 의한 염증성 사이토카인 생성의 자극, 인간 호흡 상피에서의 섬모의 고동의 억제, 및 호중구의 살균 활성 및 이동의 감소를 포함한다. 뉴몰리신의 가장 명백한 효과는 콜레스테롤로의 결합을 포함하는 적혈구 세포의 용해에 있다. 이는 독소이므로, 생체내에 투여되기 전에 무독화(즉, 보호에 적합한 투여량으로 제공시 인간에 대해 무독성)되는 것이 필요하다. 야생형 또는 천연 뉴몰리신의 발현 및 클로닝은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Walker et al. (Infect Immun, 55:1184-1189 (1987)), Mitchell et al. (Biochim Biophys Acta, 1007:67-72 (1989) and Mitchell et al (NAR, 18:4010 (1990))]을 참조하라. ply의 무독화는 화학적 수단, 예를 들어, 포르말린 처리 또는 글루타르알데히드 처리 또는 둘 모두의 조합으로의 적용(WO 04081515, PCT/EP2005/010258)에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법은 다양한 독소에 대해 당 분야에 널리 공지되어 있다. 대안적으로, ply는 유전적으로 무독화될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 예를 들어, 돌연변이된 단백질일 수 있는 폐렴구균 단백질의 유도체를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "돌연변이된"은 부위 특이적 돌연변이유발 또는 임의의 기타 통상적인 방법을 위한 널리 공지된 기술을 이용하여 하나 이상의 아미노산이 결실, 첨가 또는 치환된 분자를 의미한다. 예를 들어, 상기 기술된 바와 같이, 돌연변이 ply 단백질은 여전히 이의 면역원성 에피토프를 유지하면서 생물학적으로 비활성화 되도록 변경될 수 있다. 예를 들어, WO 90/06951, 문헌[Berry et al (Infect Immun, 67: 981-985 (1999))], WO 99/03884 및 WO 10/71986을 참조하라. 유전적으로 무독화된 뉴몰리신은 WO 10/71986에 기재된 대로 아미노산 65 (트레오닌), 293 (글리신) 및/또는 428 (시스테인)에 점 돌연변이를 함유할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Ply"는 의약 용도에 적합한 돌연변이되거나 무독화된(즉, 무독성) 뉴몰리신을 의미하는 것으로 이해된다.

콜린 결합 단백질 패밀리(CbpX)와 관련하여, 이러한 패밀리의 구성원은 본래 콜린-친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있는 폐렴구균 단백질로 확인되었다. 모든 콜린-결합 단백질은 세포벽 테이코산 및 막-관련 지질테이코산의 포스포릴콜린 부분에 비공유적으로 결합되어 있다. 구조적으로, 이들은 전체 패밀리에 걸쳐서 공통적인 여러 영역을 지니지만, 단백질의 정확한 특성(아미노산 서열, 길이 등)은 다양할 수 있다. 일반적으로, 콜린 결합 단백질은 N 말단 영역(N), 보존된 반복 영역(R1 및/또는 R2), 프롤린 풍부 영역(P) 및 단백질의 대략 절반을 포함하는 다중 반복부로 이루어진 보존된 콜린 결합 영역(C)을 포함한다. 본 출원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "콜린 결합 단백질 패밀리(CbpX)"는 WO 97/41151에서 확인된 콜린 결합 단백질, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD 및 CbpG로 구성된 군으로부터 선택된다. CbpA는 WO 97/41151에 기술되어 있다. CbpD 및 CbpG는 WO 00/29434에 기술되어 있다. PspC는 WO 97/09994에 기술되어 있다. PbcA는 WO 98/21337에 기술되어 있다. SpsA는 WO 98/39450에 기술된 콜린 결합 단백질이다. 임의로, 콜린 결합 단백질은 CbpA, PbcA, SpsA 및 PspC로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 구체예는 CbpX 트렁케이트를 포함하며, 여기서 "CbpX"는 상기 정의되어 있고, "트렁케이트"는 콜린 결합 영역(C)의 50% 이상이 결핍된 CbpX 단백질을 의미한다. 임의로, 이러한 단백질은 전체 콜린 결합 영역이 결핍되어 있다. 임의로, 이러한 단백질 트렁케이트는 (ⅰ) 콜린 결합 영역 및 (ⅱ) 단백질의 N-말단의 절반 부분이 결핍되어 있으나, 하나 이상의 반복 영역(R1 또는 R2)은 여전히 보유한다. 임의로, 트렁케이트는 2개의 반복 영역(R1 또는 R2)을 지닌다. 이러한 바람직한 구체예의 예는 WO 99/51266 또는 WO 99/51188에 예시된 바와 같은 NR1xR2 및 R1xR2이나, 유사한 콜린 결합 영역이 결핍된 기타 콜린 결합 단백질이 또한 본 발명의 범위내에서 고려된다.

LytX 패밀리는 세포 용해와 관련된 막 관련 단백질이다. N-말단 도메인은 콜린 결합 도메인(들)을 포함하나, LytX 패밀리는 상기 기술된 CbpA 패밀리에서 발견되는 모든 특징을 지니지 않으며, 따라서 본 발명에 있어서 LytX 패밀리는 CbpX 패밀리와는 별개의 것으로 간주된다. CbpX 패밀리와는 대조적으로, C-말단 도메인은 LytX 단백질 패밀리의 촉매 도메인을 함유한다. 이러한 패밀리는 LytA, B 및 C를 포함한다. LytX 패밀리와 관련하여, LytA는 문헌[Ronda et al., Eur J Biochem, 164:621-624 (1987)]에 기술되어 있다. LytB는 WO 98/18930에 기술되어 있고, 또한 Sp46으로 언급되어 있다. LytC는 또한 WO 98/18930에 기술되어 있고, 또한 Sp91로 언급되어 있다. 본 발명의 구체예는 LytC를 포함한다.

또 다른 구체예는 LytX 트렁케이트를 포함하며, 여기서 "LytX"는 상기 정의된 바와 같고, "트렁케이트"는 콜린 결합 영역의 50% 이상이 결핍된 LytX 단백질을 의미한다. 임의로, 이러한 단백질은 전체 콜린 결합 영역이 결핍되어 있다. 본 발명의 여전히 또 다른 구체예는 CbpX 트렁케이트-LytX 트렁케이트 키메라 단백질(또는 융합체)을 포함한다. 임의로, 이는 CbpX의 NR1xR2(또는 R1xR2) 및 LytX의 C-말단 부분(Cterm, 즉, 콜린 결합 도메인이 결핍)(예를 들어, LytCCterm 또는 Sp91 Cterm)을 포함한다. 임의로, CbpX는 CbpA, PbcA, SpsA 및 PspC로 구성된 군으로부터 선택된다. 임의로, 이는 CbpA이다. 임의로, LytX는 LytC(또한 Sp91로 언급됨)이다. 본 발명의 또 다른 구체예는 콜린 결합 도메인(C)이 결핍되고, LytX와의 융합 단백질로 발현되는 PspA 또는 PsaA 트렁케이트이다. 임의로, LytX는 LytC이다.

PsaA 및 PspA에 관하여, 둘 모두는 당 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, PsaA 및 이의 막횡단 결실 변이체가 문헌[Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec;64(12):5255-62]에 기술되어 있다. PspA 및 이의 막횡단 결실 변이체는, 예를 들어, US 5804193, WO 92/14488 및 WO 99/53940에 기술되어 있다.

Sp128 및 Sp130은 WO 00/76540에 기술되어 있다. Sp125는 LPXTG의 세포벽 부착 모티프(여기서, X는 임의의 아미노산임)를 지니는 폐렴구균 표면 단백질의 예이다. 상기 모티프를 지니는 상기 부류의 폐렴구균 표면 단백질에서의 임의의 단백질이 본 발명의 상황에서 유용한 것으로 밝혀졌고, 따라서 본 발명의 추가 단백질로 간주된다. Sp125 자체는 WO 98/18930에 기술되어 있고, 이는 또한 ZmpB - 아연 금속단백분해효소로 공지되어 있다. Sp101은 WO 98/06734(여기서, 이는 # y85993의 참고번호를 지님)에 기술되어 있다. 이는 타입 Ⅰ 신호 서열을 특징으로 한다. Sp133은 WO 98/06734(여기서, 이는 # y85992의 참고번호를 지님)에 기술되어 있다. 이 또한 타입 Ⅰ 신호 서열을 특징으로 한다.

조합 백신(특히, 중이염의 예방을 위한 것)에 포함될 수 있는 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis) 단백질 항원의 예는 OMP106 [WO 97/41731(Antex) & WO 96/34960(PMC)]; OMP21 또는 이의 단편(WO 0018910); LbpA 및/또는 LbpB [WO 98/55606(PMC)]; TbpA 및/또는 TbpB [WO 97/13785 & WO 97/32980(PMC)]; CopB [Helminen ME, et al . (1993) Infect. Immun. 61.2003-2010]; UspA1 및/또는 UspA2 [WO 93/03761 (University of Texas)]; OmpCD; HasR(PCT/EP99/03824); PilQ(PCT/EP99/03823); OMP85(PCT/EP00/01468); lipo06(GB 9917977.2); lipo10(GB 9918208.1); lipo11(GB 9918302.2); lipo18(GB 9918038.2), P6(PCT/EP99/03038); D15(PCT/EP99/03822); OmpIA1(PCT/EP99/06781); Hly3(PCT/EP99/03257); 및 OmpE이다. 조합 백신(특히, 중이염의 예방을 위한 것)에 포함될 수 있는 피막이 없는(non-typeable) 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 항원 또는 이의 단편의 예는 핌브린 단백질 [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] 및 이로부터의 펩티드를 포함하는 융합체 [예를 들어, LB1(f) 펩티드 융합체; US 5843464(OSU) 또는 WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638(Cortecs)]; P6 [EP 281673(State University of New York)]; TbpA 및/또는 TbpB; Hia; Hsf; Hin47, Hif; Hmw1; Hmw2; Hmw3, Hmw4; Hap; D15(WO 94/12641); P2; 및 P5(WO 94/26304)를 포함한다.

본 발명의 단백질은 또한 유리하게는 조합될 수 있다. 조합은 면역원성 조합물이 담체 단백질 또는 유리 단백질 또는 이들 둘 모두의 혼합물로서 하기 조합으로부터의 모든 단백질을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 하기에 기술되는 두개의 단백질 조합에서, 둘 모두의 단백질은 담체 단백질로 사용될 수 있거나, 둘 모두의 단백질은 유리 단백질로 존재할 수 있거나, 둘 모두의 단백질은 담체 단백질 및 유리 단백질로 존재할 수 있거나, 하나의 단백질은 담체 단백질 및 유리 단백질로 존재하는 반면 나머지 단백질은 단지 담체 단백질 또는 단지 유리 단백질로 존재할 수 있거나, 하나의 단백질은 담체 단백질로 존재하고 나머지는 유리 단백질로 존재할 수 있다. 세 개의 단백질의 조합물이 제공되는 경우, 유사한 가능성이 존재한다. 조합물은 PhtD + NR1xR2, PhtD + NR1xR2-Sp91 Cterm 키메라 또는 융합 단백질, PhtD + Ply, PhtD + Sp128, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NR1xR2, PhtA + NR1xR2-Sp91 Cterm 키메라 또는 융합 단백질, PhtA + Ply, PhtA + Sp128, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, NR1xR2 + LytC, NR1xR2 + PspA, NR1xR2 + PsaA, NR1xR2 + Sp128, R1xR2 + LytC, R1xR2 + PspA, R1xR2 + PsaA, R1xR2 + Sp128, R1xR2 + PhtD, R1xR2 + PhtA를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 임의로, NR1xR2(또는 R1xR2)는 CbpA 또는 PspC로부터 유래된다. 임의로, 이는 CbpA로부터 유래된다. 기타 조합물은 3개의 단백질 조합물, 예를 들어, PhtD + NR1xR2 + Ply, 및 PhtA + NR1xR2 + PhtD를 포함한다. 일 구체예에서, 백신 조성물은 담체 단백질로서 무독화된 뉴몰리신 및 PhtD 또는 PhtDE를 포함한다. 추가 구체예에서, 백신 조성물은 유리 단백질로서 무독화된 뉴몰리신 및 PhtD 또는 PhtDE를 포함한다.

본 발명은 본 발명의 면역원성 조성물 및 약학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 백신을 추가로 제공한다.

본 발명의 백신은 특히 중년 집단 뿐만 아니라 유아 집단에 사용하려는 경우 애쥬번팅될 수 있다. 적절한 애쥬번트는 알루미늄염, 예를 들어, 알루미늄 히드록시드 겔 또는 알루미늄 포스페이트 또는 명반을 포함하나, 이는 또한 칼슘, 마그네슘, 철 또는 아연의 염과 같은 그 밖의 금속 염일 수 있거나, 아실화된 티로신 또는 아실화된 당, 양이온 또는 음이온적으로 유도된 당류, 또는 폴리포스파젠의 불용성 현탁액일 수 있다.

TH1 유형의 반응의 우선적인 유도인자인 애쥬번트가 임의로 선택된다. 고수준의 이러한 Th1-유형 사이토카인은 제공된 항원에 대해 세포 매개 면역 반응의 유도를 선호하는 경향이 있는 반면, 고수준의 Th2-유형 사이토카인은 항원에 대해 체액성 면역 반응의 유도를 선호하는 경향이 있다.

Th1 및 Th2-유형 면역 반응의 구별은 절대적이지는 않다. 실제로, 개체는 Th1 우선적이거나 Th2 우선적인 것으로 기재되는 면역 반응을 뒷받침할 것이다. 그러나, 모스만 및 코프만(Mosmann and Coffman)에 의한 뮤린 CD4 +ve T 세포 클론에 기술된 것과 관련한 사이토카인 패밀리를 고려하는 것이 종종 편리하다(Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. (Annual Review of Immunology, 7, p145-173)). 전통적으로, Th1-유형 반응은 T-림프구에 의한 INF-γ 및 IL-2 사이토카인의 생산과 관련된다. Th1-유형 면역 반응의 유도와 종종 직접적으로 관련된 기타 사이토카인, 예를 들어, IL-12는 T-세포에 의해 생산되지 않는다. 대조적으로, Th2-유형 반응은 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10의 분비와 관련된다. Th1 반응을 우선적으로 촉진하는 적절한 애쥬번트 시스템은 모노포스포릴 지질 A 또는 이의 유도체 (또는 일반적으로 무독화 지질 A - 예를 들어 WO2005107798 참조), 특히 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)(이의 제법에 대해서는 GB 2220211 A 참조); 및 모노포스포릴 지질 A, 임의로 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A와 알루미늄염(예를 들어, 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 히드록시드) 또는 수중유 에멀젼의 조합물을 포함한다. 이러한 조합물에서, 항원 및 3D-MPL이 동일한 미립자 구조로 함유되고, 이는 항원성 및 면역자극 신호의 보다 효과적인 전달을 가능케 한다. 연구들은 3D-MPL이 명반-흡수된 항원의 면역원성을 추가로 향상시킬 수 있음을 나타내었다[Thoelen et al . Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1].

향상된 시스템은 모노포스포릴 지질 A와 사포닌 유도체의 조합물, 특히 WO 94/00153에 기술된 QS21과 3D-MPL의 조합물, 또는 WO 96/33739에 기술된 바와 같은 QS21이 콜레스테롤로 켄칭된 덜 반응성(reactogenic)인 조성물을 포함한다. 수중유 에멀젼에 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 포함하는 특히 효능있는 애쥬번트 제형이 WO 95/17210에 기술되어 있다. 일 구체예에서, 면역원성 조성물은 추가로 QS21일 수 있는 사포닌을 포함한다. 제형은 또한 수중유 에멀젼 및 토코페롤을 포함할 수 있다(WO 95/17210). 올리고뉴클레오티드(WO 96/02555) 및 기타 면역조절 올리고뉴클레오티드(WO 0226757 및 WO 03507822)를 함유하는 메틸화되지 않은 CpG가 또한 TH1 반응의 우선적인 유도인자이고, 본 발명에 사용하기에 적합하다.

본 발명의 면역원성 조성물을 함유하는 백신 제조물은 상기 백신을 전신 또는 점막 경로를 통해 투여함으로써 감염에 민감한 포유동물을 보호하거나 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 투여는 근내(IM), 복막내(IP), 피내(ID) 또는 피하(SC) 경로를 통한 주사, 또는 경구/소화관, 호흡기, 비뇨생식관으로의 점막 투여를 포함할 수 있다. 폐렴 또는 중이염의 치료를 위해 백신의 비내(IN) 투여(폐렴구균의 비인두 보균(carriage)은 보다 효과적으로 예방될 수 있으므로, 초기 단계에서 감염을 약화시킴)가 가능하다. 본 발명의 백신은 단일 투여로 투여될 수 있으나, 이의 성분은 또한 동시에 또는 상이한 시간(예를 들어, 폐렴구균 당류 컨쥬게이트는 서로에 대해 면역 반응의 최적 협동을 위해 백신의 임의의 박테리아 단백질 성분의 투여와 동시에 또는 투여 1-2주 후에 개별적으로 투여될 수 있음)에 함께 공동투여될 수 있다. 공동투여를 위해, 임의의 Th1 애쥬번트가 임의의 상이한 투여 또는 모든 상이한 투여에 존재할 수 있다. 단일 경로의 투여 외에, 2개의 상이한 경로의 투여가 이용될 수 있다. 예를 들어, 당류 또는 당류 컨쥬게이트가 IM (또는 ID) 투여될 수 있고, 박테리아 단백질이 IN (또는 ID) 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 백신은 프라이밍 투여를 위해 IM 투여되고, 추가접종 투여를 위해 IN 투여될 수 있다.

백신 내의 단백질 항원의 함량은 통상적으로 1 내지 100 ㎍, 임의로 5 내지 50 ㎍, 예를 들어, 5 내지 25 ㎍의 범위로 존재할 수 있다. 최초 백신화 후, 피검체는 적절한 간격으로 1회 또는 수회의 추가 면역접종을 투여받을 수 있다.

백신 제조물은 일반적으로 문헌[Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M. F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York)]에 기술되어 있다. 리포솜 내의 캡슐화는 문헌[Fullerton, US Patent 4,235,877]에 기술되어 있다.

본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물은 용해된 상태로 보관되거나 동결건조될 수 있다. 구체예에서, 용액은 무정형 리오프로텍턴트(lyoprotectant)로서 작용하는 당, 예를 들어, 수크로오스, 트레할로오스, 글루코오스, 만노오스, 말토오스 또는 락토오스의 존재하에서 동결건조된다. 구체예에서, 용액은 무정형 리오프로텍턴트로서 작용하는 당과, 글리신 또는 만니톨과 같이 향상된 케익 구조를 제공하는 벌크화제(bulking agent)의 존재하에 동결건조된다. 결정질 벌크화제의 존재는, 높은 염 농도의 존재하에 동결-건조 주기를 단축시킬 수 있다. 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신의 동결건조에 사용되는 그러한 혼합물의 예는 수크로오스/글리신, 트레할로오스/글리신, 글루코오스/글리신, 만노오스/글리신, 말토오스/글리신, 수크로오스/만니톨/트레할로오스/만니톨, 글루코오스/만니톨, 만노오스/만니톨 및 말토오스/만니톨을 포함한다. 전형적으로, 두 개의 구성요소의 몰 비는 임의로 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 또는 1:6이다. 본 발명의 면역원성 조성물은 임의로 상기 기재된 동결건조 시약을 포함한다.

상기 안정화제 및 안정화제의 혼합물은 제형의 유리 전이 온도 (Tg')를 증가시킬 수 있는 중합체, 예컨대 폴리(비닐-피롤리돈)(PVP), 히드록시에틸 전분 또는 덱스트란, 또는 예를 들어 분자량이 1500 내지 6000인 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 덱스트란과 같이 결정질 벌크화제로서 작용하는 중합체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물은 임의로 동결건조되고, 사용 전에 즉석에서 재구성된다. 동결건조는 더욱 안정적인 조성물(백신)을 발생시킬 수 있고, 3D-MPL의 존재 및 알루미늄 기재 애쥬번트의 부재하에서 보다 높은 항체 역가를 발생시킬 수 있다.

본 발명의 일 양태에서 임의로 동결건조된 형태의 본 발명의 면역원성 조성물을 함유하는 바이얼을 포함하고, 본원에 기술된 애쥬번트를 함유하는 바이얼을 추가로 포함하는 백신 키트가 제공된다. 본 발명의 이러한 양태에서, 애쥬번트는 동결건조된 면역원성 조성물을 재구성시키기 위해 사용될 것이 예견된다.

본 발명은 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 단백질, 예를 들어, 컨쥬게이션된 형태의 단백질 D의 첨가에 의한 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)에 의해 야기된 중이염의 예방 또는 개선을 위한 개선된 백신을 추가로 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 컨쥬게이트 조성물로의 유리 단백질 또는 컨쥬게이션된 단백질로서 하나 또는 두개의 폐렴구균 단백질의 첨가에 의한, 유아에서의 폐렴구균 감염(예를 들어, 중이염)의 예방 또는 개선을 위한 개선된 백신을 추가로 제공한다. 상기 폐렴구균 유리 단백질은 담체 단백질로 사용된 임의의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 단백질과 동일하거나 상이할 수 있다. 하나 이상의 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis) 단백질 항원이 또한 유리 형태 또는 컨쥬게이션된 형태로 조합 백신에 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명은 유아에서의 중이염에 대한(보호) 면역 반응을 유도하는 개선된 방법에 관한 것이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 안전하고 효과적인 양의 본 발명의 백신 [소아 백신]을 투여함으로서 유아(본 발명의 상황에서 0 내지 2세로 정의됨)에서 (보호) 면역 반응을 유도하는 개선된 방법에 관한 것이다. 본 발명의 추가 구체예는 약제로 사용하기 위한 본 발명의 항원성 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 컨쥬게이트 조성물 및 폐렴구균 질병의 예방 (또는 치료)을 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 컨쥬게이트의 용도의 제공을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 임의로 유리 단백질 또는 컨쥬게이션된 단백질로 존재하는 하나 또는 두 개의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 단백질과 함께 안전하고 유효한 양의 본 발명의 백신을 투여함으로써 중년 인간 집단(본 발명의 상황에서, 50세 이상, 통상적으로 55세 이상, 가장 일반적으로 60세 이상의 연령인 경우 환자가 중년인 것으로 간주함)에서 (보호) 면역 반응을 유도하는 개선된 방법에 관한 것으로, 여기서 유리 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 단백질은 담체 단백질로 사용된 임의의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 단백질과 동일하거나 상이할 수 있다.

본 발명의 추가 양태는 면역보호량의 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신 또는 키트를 숙주에게 투여하는 것을 포함하여, 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae)에 의해 야기된 질병 및 임의로 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 감염에 대해 인간 숙주를 면역화시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 추가 양태는 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae)에 의해 야기된 질병 및 임의로 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 면역원성 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 추가 양태는 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae)에 의해 야기된 질병 및 임의로 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 감염의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서, 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신 또는 키트의 용도에 관한 것이다.

본원의 용어 "포함하는", "-들을 포함하다" 및 "-를 포함하다"는 각각의 상황에서 각각 용어 "구성되는", "-들로 구성되다" 및 "-로 구성되다"로 임의로 대용될 수 있다.

본 발명의 "백신 조성물"과 관련된 본원의 구체예는 또한 본 발명의 "면역원성 조성물"과 관련된 구체예에 적용될 수 있고, 그 반대도 마찬가지이다.

본 특허 명세서에 인용된 모든 참고문헌 또는 특허 출원은 참고로서 본원에 포함된다.

본 발명의 보다 나은 이해를 위해, 하기 실시예가 기술된다. 이들 실시예는 단지 예시를 위한 것으로, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 바가 아니다.

실시예

실시예 1. 컨쥬게이션 공정

WO 06/110381에 기재된 것과 유사한 환원성 아민화 공정에 의해 각각의 혈청형 당류를 CRM197 담체 단백질에 컨쥬게이션시킴으로써 7가 Prevnar 백신으로 구성된 폐렴구균 컨쥬게이트를 제조하였다. 모두 CRM197에 컨쥬게이션된 폐렴구균 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F가 7vCRM 백신에 존재한다.

Synflorix는 추가 혈청형 1, 5 및 7F뿐 아니라 7vCRM과 동일한 혈청형을 함유한다. 혈청형 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14 및 23F 다당류는 피막이 없는 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)로부터의 단백질 D에 컨쥬게이션되고, 18C 다당류는 파상풍 톡소이드에 컨쥬게이션되며, 19F 다당류는 디프테리아 톡소이드에 컨쥬게이션된다. 컨쥬게이션 반응은 시아닐화 시약 CDAP를 이용하며 이러한 방법은 WO 09/00824에 본질적으로 기재되어 있다.

혈청형 18C는 ADH 링커를 통해 카르보디이미드 화학작용 (EDAC)을 이용하여 컨쥬게이션되어 ADH를 지닌 파상풍 톡소이드를 활성화시키며 CDAP 화학작용을 이용하여 다당류 18C를 TT-ADH에 커플링시킨다. 이러한 반응은 WO 09/00824에 본질적으로 기재되어 있다.

실시예 1a CDAP 에 의한 에스 . 뉴모니애 ( S. pneumoniae ) 혈청형 23의 컨쥬게 이션

10mg/ml의 농도가 얻어질 때까지 200mg의 미세유동화된 PS23F를 물에 용해시켰다. NaCl을 2M의 최종 농도로 이러한 용액에 첨가하였다.

충분한 CDAP 용액 (5/50 v/v 아세토니트릴 /WFI에서 새로 제조된 100mg/ml)을 첨가시켜 0.75mg/mg PS의 CDAP:PS 비에 도달하였다.

90초 후에, 0.1M NaOH를 첨가시켜 pH를 pH 9.5까지 상승시켰다.

3분 후에 충분한 CRM197 (0.15M NaCL 중 10mg/ml)을 첨가시켜 1.5 (CRM197:PS (w/w))의 비에 도달하였고, pH를 pH 9.5에서 유지시켰다. 이러한 용액을 1시간 동안 pH 9.5에서 인큐베이션하였다.

상기 커플링 단계 후에, 10ml의 2M 글리신 용액을 혼합물에 첨가하고, pH를 pH 9.0 (켄칭 pH)으로 조정하였다. 이러한 용액을 30분간 실온에서 교반하였다. 컨쥬게이트를 5㎛ 필터를 이용하여 정제시킨 다음 세파크릴 S400HR (XK50/100)에 의해 소형 분자 및 컨쥬게이션되지 않은 다당류 및 단백질을 제거하였다. 유량은 150ml/시간으로 고정시켰다. 150mM NaCl을 이용하여 용리를 달성하였다. 관심있는 분획들을 푸울링(pooling)시키고 Milipack 20을 이용하여 여과시켰다. 생성된 컨쥬게이트는 1.35/1 (w/w)의 최종 CRM197/PS 비 (w/w)를 지녔다.

실시예 2. 7 vCRM197 ( Prevnar ) 및 PHiD - CV ( Synflorix ) 백신을 비교한 임상 시험 데이터

7vCRM197 및 PHiD-CV에 의해 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 19F 및 19A에 대해 유도된 면역 반응들을 비교하였다. 두 개의 백신 모두는 19F 컨쥬게이트를 함유하는데, 이러한 컨쥬게이트는 7vCRM197에서는 환원성 아민화에 의해 무독성 디프테리아 독소 CRM197에 컨쥬게이션되어 있고, PHiD-CV에서는 시아닐화 시약 CDAP를 이용하여 디프테리아 톡소이드에 컨쥬게이션되어 있다. 어떠한 백신도 19A 컨쥬게이트를 함유하지 않으나, 19A 및 19F 간의 구조의 유사성으로 인해 19F로의 면역화 이후에 19A에 대한 일부 교차-반응성 항체가 생성된다.

혈청 샘플

3회-용량 일차 시리즈로 유아에게 투여된 7vCRM 및 PHiD-CV를 비교하는 3회 일차 백신화 연구(001, 011 및 012)⁸ ^-10로부터의 데이터를 검토하였다 (일차 연구의 상세설명에 대해서는 표 1 참조). 각각의 일차 연구와 관련된 추가접종 연구로부터의 데이터를 또한 분석하였다 (007⁸, 017⁹ 및 018) (추가접종 연구의 상세설명에 대해서는 표 2 참조).

모든 연구에서, 혈액 샘플을 3회차 용량-1개월 후 (일차 연구) 및 추가접종 용량-1개월 후 (추가접종 연구)에 수집하였다.

면역학적 검정

혈청형 19F 및 관련 혈청형 19A에 대한 항체 반응을 GSK 바이올로지칼즈에 의해 개발된 22F-전인큐베이션 단계를 갖는 ELISA (GSK-22F-ELISA, 여기서 이종성 혈청형 22F 다당류를 첨가하여 비-혈청형-특이적 및 비-옵소닌 항체를 제거한다.^6,7)를 이용하여 평가하였다.

22F-억제 ELISA에 대한 검정 민감성은 0.05 ㎍/mL IgG였다.

기능성 항체 반응을 변형된 HL-60 세포 WHO 참조 방법을 이용한 GSK 및 THL OPA 검정을 이용하여 평가하였다.^2,4

대조군 웰에 비해 ≥50% 박테리아 세포 사멸을 유도한 가장 낮은 혈청 희석율의 역수로서 OPA 역가를 정의하였고, ≥8의 역가 (1:8의 혈청 희석율)를 이러한 검정에 대한 역치로서 이용하였다.^2,4

추가로, 상이한 형태의 혈청형 19F 항원 (컨쥬게이션되지 않은 천연 다당류 및 환원성 아민화 및 시아닐화를 이용하여 컨쥬게이션된 19F)에 의한 결합 및 억제를 위해 혈청형 19F에 대해 ≥2.0 ㎍/mL의 항체 농도를 갖는 혈청 (Dr. David Goldblatt로부터 입수, Institute of Child Health, UK) 및 면역되지 않은 건강한 성인으로부터의 혈청 (the National Institutes of Health blood bank로부터 입수, Bethesda, Maryland)을 이용하였다.

통계적 분석

ELISA IgG 항체 농도가 ≥0.2 ㎍/mL인 혈청 샘플의 비율, 및 OPA 역가가 ≥8인 혈청 샘플의 비율을 95% 신뢰 구간으로 계산하였다.

항체 역가 단독에 비해 기능성 활성을 평가하기 위해 기하 평균 OPA 역가 (GMT) 및 기하 평균 OPA/ELISA 비 (GMR)를 계산하였다.

연결된 GSK 및 THL OPA 검정을 수행하여 다른 시험소에서 OPA 반응에서의 가변성 정도를 평가하였다.

결과

하나 이상의 혈청형 (19A 또는 19F)에 대한 데이터를 PHiD-CV로 프라이밍된 총 709명의 유아 및 7vCRM로 프라이밍된 331명의 유아 (표 1) 그리고 PHiD-CV로 추가접종된 총 690명의 유아 및 7vCRM로 추가접종된 292명의 유아 (표 2)에 대해 이용할 수 있다.

면역원성

혈청형 19F-일차 백신화

3회 일차 연구에 걸쳐서, PHiD-CV를 투여받은 유아의 87.7-99.3%가 혈정형 19F에 대해 ≥8의 OPA 역가를 달성한데 비해, 7vCRM을 투여받은 유아에서는 91.3-92.1%였다 (도 2).

혈청형 19F에 대한 OPA GMT 및 OPA/ELISA GMR은 PHiD-CV를 투여받은 유아에서 더 높았다 (표 1).

혈청형 19F-추가접종 백신화

추가접종 연구에서, 혈청형 19F에 대한 ≥8의 OPA 역가는 7vCRM을 투여받은 유아의 92.5-98.5%에 비해 PHiD-CV를 투여받은 유아의 94.9-100.0%에서 달성되었다 (도 2).

혈청형 19F에 대한 OPA GMT는 PHiD-CV를 투여받은 유아에서 더 높았고 OPA/ELISA GMR은 두 개의 백신 모두에 대해 동일한 범위내에 있었다 (표 2).

혈청형 19A-1차 백신화

교차-반응성 혈청형 19A에 대한 ≥8의 OPA 역가가 PHiD-CV를 투여받은 유아의 19.6-28.7%에서 달성된데 비해, 7vCRM을 투여받은 유아에서는 0.0-3.4%였다 (도 3).

혈청형 19A에 대한 OPA GMT는 PHiD-CV를 투여받은 유아에서 더 높았다 (표 1).

혈청형 19F-추가접종 백신화

교차-반응성 혈청형 19A에 대한 ≥8의 OPA 역가가 PHiD-CV를 투여받은 유아의 37.7-69.2%에서 달성된데 비해, 7vCRM을 투여받은 유아에서는 24.0-37.5%였다 (도 3).

혈청형 19A에 대한 OPA GMT는 PHiD-CV를 투여받은 유아에서 일반적으로 더 높았다 (표 2).

연결 OPA 검정

연결 연구에서 평가시 GSK 및 THL 간의 19F OPA 결과는 동등한 반면, GSK에서의 19A OPA 검정은 반응을 과소평가한 것으로 나타났다.

19F-컨쥬게이트 면역화된 아동의 유의한 비율이 THL에서 19A OPA에 대해 혈청포지티브로 돌아선 반면 GSK에서는 혈청네거티브였다.

결론

시아닐화 컨쥬게이션 화학작용을 통해 제조된 19F-DT를 함유하는 PHiD-CV는 OPA 검정에 의해 측정하는 경우 환원성 아민화에 의해 제조된 19F-CRM₁₉₇을 함유하는 7vCRM 백신화에 비해 더 높은 수준의 기능성 항체를 유도하였다.

시아닐화-컨쥬게이션을 이용하여 달성된 혈청형 19F에 대한 더 높은 OPA 반응은 7vCRM에 비해 PHiD-CV의 경우에 교차-반응성 혈청형 19A에 대한 OPA 반응을 향상시켰다.

연결 데이터는 GSK 19A OPA 검정이 혈청형 19A OPA 반응을 실제보다 낮게 평가하였음을 시사한다.

표 1. PHiD - CV 또는 7 vCRM 일차 면역화 후 폐렴구균 혈청형 19F 및 교차-반응성 혈청형 19A에 대한 기하 평균 옵소닌식작용 활성 ( OPA ) 검정 역가 ( GMT ) 및 기하 평균 OPA / ELISA 비 ( GMR )

GMT, 기하 평균 OPA 역가; GMR, 옵소닌식작용 역가/ELISA 항체 농도 비의 기하 평균; OPA, 옵소닌식작용 활성 검정;

N = 혈청형 19F 또는 교차-반응성 혈청형 19A에 대해 이용가능한 OPA 결과를 갖는 유아의 수

N' = ELISA 농도가 ≥0.05 ㎍/mL이고 OPA 역가가 ≥8인 유아의 수

공동-투여된 백신: ^†DTPa-HBV-IPV/Hib, ^‡DTPa-HBV-IPV + Hib-MenC, ^＃DTPw-HBV/Hib + IPV, ^＊DTPw-HBV/Hib + OPV

표 2. PHiD - CV 또는 7 vCRM 추가접종 면역화 후 폐렴구균 혈청형 19F 및 교차-반응성 혈청형 19A에 대한 기하 평균 옵소닌식작용 활성 ( OPA ) 검정 역가 ( GMT ) 및 기하 평균 OPA / ELISA 비 ( GMR )

N, 혈청형 19F 또는 교차-반응성 혈청형 19A에 대해 이용가능한 OPA 결과를 갖는 유아의 수

N', ELISA 농도가 ≥0.05 ㎍/mL이고 OPA 역가가 ≥8인 유아의 수

실시예 3 - 페리오데이트 를 이용한 23F 및 6B의 산화

다당류(PS) 23F 또는 6B를 100mM KH₂P0₄(pH 7.4), 10mM KH₂P0₄ 또는 WFI에 용해시켜 2 mg PS/ml의 용액을 형성시켰다. 용액을 실온에서 교반하에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 이 시간 후, pH를 1M HCl을 이용하여 pH 6.0으로 조정하였다. 페리오데이트를 다양한 양의 분말 또는 액체 형태(WFI 중 10 mg/ml)로 첨가하여 다양한 몰 비를 달성하였다(표 3). 용액을 실온(20-25℃)에서 17시간 동안 인큐베이션시키고, 이 시간 후, 샘플을 WFI에 대해 투석시키거나 정용여과시켰다.

Zimm 모델을 적용시켜 굴절률 및 다각 레이저 광산란(multiangle laser lights scattering)(MALLS-) 검출기와 커플링된 고성능 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 분자량과 샘플 농도를 측정하였다. 크기 배제 매체(TSK5000PWXL-Tosoh)를 사용하여 다당류의 분자 크기 분포를 프로파일링하였다(NaCl 0.2M-NaN3 0.02% 중 0.5ml/분 용리).

표 3 및 도 4에는 상기 실험의 결과가 기재되어 있다. 이는 23F 당류에 대해, 100mM 포스페이트 완충액 중의 높은 몰당량의 페리오데이트를 이용하여 산화에 대해 실질적 크기 조절이 발생하는 것을 나타낸다. 이러한 크기 조절 효과는 포스페이트 완충액의 농도 또는 사용되는 페리오데이트의 몰당량을 감소시킴으로써 감소될 수 있다.

표 3:

환원성 아민화

1 g의 PS23F를 500 ml의 10mM KH₂P0₄, pH 7.15에 용해시켰다. 이러한 용액을 2시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. pH를 1M HCl을 이용하여 6.0M으로 조정하였다. 111 mg의 페리오데이트(NaI0₄, 0.4 몰당량의 페리오데이트)를 PS23F 용액에 첨가하고, 용액을 실온에서 어두운 곳에서 17시간 동안 인큐베이션시켜 PS23F를 산화시켰다. 이후, 용액을 WFI에 대해 정용여과시켰다 (Pellicon 2, 1000cm²).

산화된 PS23F를 3% 수크로오스 (w/v)의 존재하에서 CRM197 단백질과 함께(CRM/PS 비(w/w):0.625) 동결건조시켰다.

350 ml의 DMSO 용매를 첨가하고, 20℃에서 2시간 동안 인큐베이션시킴으로써 900 mg의 동결건조된 PS23F/CRM197 혼합물을 용해시켰다. PS23F/CRM197 혼합물을 환원시키기 위해, 1 몰당량의 NaBH₃CN을 첨가하였다(WFI 중 100 mg/ml의 용액 735 ㎕). 용액을 교반을 이용하여 실온에서 추가 40시간 동안 인큐베이션시켰다. 이 시간 후, 2 몰당량의 NaBH₄(WFI 중 100 mg/ml)를 첨가하고, 용액을 실온에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 2200 ml의 150 mM NaCl을 첨가하고, 정용여과(컷-오프 100kDa)시키고, DEAE(XK50)에 의해 정제하였다. 관심 분획을 푸울링시키고, 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다.

실시예 4 - 환원성 아민화를 이용하여 컨쥬게이션된 PS23F - CRM 컨쥬게이트와 CDAP 화학작용을 이용하여 컨쥬게이션된 PS23F - CRM 컨쥬게이트의 면역원성의 비교

기니아 피그 모델에서 측정된 면역원성

암컷 기니아 피그를 0.25 ㎍의 PS23F-CRM197 컨쥬게이트를 이용하여 3회 (0, 14 및 28일에) 근내 면역화시켰다. 동물을 42일에 채혈하고, PS23F에 대해 유도된 항체 반응을 ELISA 및 OPA에 의해 측정하였다. 결과를 도 5에 도시한다.

도 5에 도시된 대로 CDAP 화학작용에 의해 컨쥬게이션된 PS23F-CRM197에 비해 환원성 아민화에 의해 컨쥬게이션된 PS23F-CRM197로 면역화시킨 후에 기니아 피그에서 현저하게 높은 항체 반응이 유도되었다.

실시예 5 - 환원성 아민화를 이용하여 컨쥬게이션된 PS6B - CRM 컨쥬게이트와 CDAP 화학작용을 이용하여 컨쥬게이션된 PS6B - CRM 또는 PS6B - PD 컨쥬게이트의 면역원성의 비교

임상전 연구:

40 마리의 암컷 Balb/c 마우스(4 주령)의 그룹을 AIP0₄ 상에서 제형화된 환원성 아민화 또는 CDAP 화학작용에 의해 생산된 0.1 ㎍의 PS6B 컨쥬게이트를 이용하여 0, 14 및 28일에 3회 근내 면역화시켰다. PS6B-PD를 기준으로 이용하였다. 마우스를 42일에 채혈하고, 각각의 항원에 대한 항체 반응을 ELISA 및 OPA에 의해 측정하였다.

20 마리의 암컷 기니아 피그(Hartley로부터 150 gr)의 군을 AIP0₄ 상에서 제형화된 환원성 아민화 또는 CDAP 화학작용에 의해 생산된 0.25 ㎍의 PS6B 컨쥬게이트를 이용하여 0, 14 및 28일에 3회 근내 면역화시켰다. PS6B-PD를 기준으로 이용하였다. 기니아 피그를 42일에 채혈하고, 각각의 항원에 대한 항체 반응을 ELISA 및 OPA에 의해 측정하였다.

환원성 아민화에 의해 제조된 PS6B-CRM의 네 개의 상이한 컨쥬게이트 및 CDAP를 이용하여 제조된 하나를 이용하였다. 다당류를 두 개의 상이한 분자량으로 미세유동화시켰다. 컨쥬게이트의 특성은 다음과 같았다:

마우스 및 기니아 피그 OPA

혈청 샘플을 56℃에서 45분 동안 가열하여 임의의 남아있는 내인성 보체를 불활성화시켰다. 각각의 1:2 희석된 혈청 샘플의 25 마이크로리터의 분취량을 96-웰 둥근 바닥 미세역가 플레이트의 웰 당 25 ㎕의 OPA 완충액(HBSS-14.4% 불활성화 FBS) 중에서 2배 연속 희석시켰다. 이후, 예를 들어, 4/2/1 비(v/v/v)의 25 ㎕의 활성화된 HL-60 세포(1 x 10⁷개 세포/ml), 새로이 해동된 폐렴구균 워킹 시드(working seed) 및 새로이 해동된 새끼 토끼 보체의 혼합물을 희석된 혈청에 첨가하여 50 ㎕의 최종 부피를 생성시켰다. 검정 플레이트를 회전 교반(210 rpm)과 함께 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켜 식작용 과정을 촉진시켰다. 마이크로플레이트를 적어도 1분 동안 얼음 상에 두어 반응을 중지시켰다. 이후, 플레이트의 각각의 웰의 20 ㎕ 분취량을 96-웰 편평 바닥 마이크로플레이트의 해당 웰로 옮기고, 50 ㎕의 Todd-Hewitt Broth-0.9% 아가(agar)를 각각의 웰에 첨가하였다. 37℃ 및 5% C0₂에서의 밤새 인큐베이션 후, 아가 내에서 출현하는 폐렴구균 집락을 자동화 이미지 분석 시스템(KS 400, Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용하여 계수하였다. 혈청 샘플이 없는 8개의 웰을 웰 당 폐렴구균의 수를 결정하기 위한 박테리아 대조군으로 이용하였다. 대조군 웰의 CFU의 평균 수를 결정하고, 각각의 혈청 샘플에 대한 사멸 활성의 계산에 이용하였다. 혈청 샘플에 대한 OPA 역가를 폐렴구균의 50% 사멸을 촉진시킬 수 있는 혈청의 희석율 역수 (reciprocal dilution)에 의해 결정하였다. 4-파라미터 곡선 적합도 분석을 이용함으로써 옵소닌식작용 역가를 계산하였다.

표 4. 임상전 마우스 모델 - ELISA GMC (㎍/ ml ) 및 % 반응자

표 5. 임상전 기니아 피그 모델 - ELISA GMC (㎍/ ml ) 및 % 반응자

Claims

2개 이상의 상이한 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함하는 면역원성 조성물로서, 여기서 하나 이상의 당류는 환원성 아민화 이외의 화학작용을 통해 단백질 담체(들)에 직접 또는 간접적으로 결합된 혈청형 1, 3, 19A 및 19F로 구성된 첫 번째 그룹으로부터 선택되고, 하나 이상의 다른 당류는 환원성 아민화에 의해 단백질 담체(들)에 결합된 혈청형 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C 및 23F로 구성된 두 번째 그룹으로부터 선택되는 면역원성 조성물.
제 1항에 있어서, 환원성 아민화 이외의 화학작용을 통해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 혈청형 1로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
제 2항에 있어서, 혈청형 1로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류가 시아닐화 화학작용, 예를 들어 CDAP 화학작용을 통해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
제 2항에 있어서, 혈청형 1로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류가 카르보디이미드 화학작용을 통해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 환원성 아민화 이외의 화학작용을 통해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 혈청형 3으로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
제 5항에 있어서, 혈청형 3으로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류가 시아닐화 화학작용, 예를 들어 CDAP 화학작용을 통해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
제 5항에 있어서, 혈청형 3으로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류가 카르보디이미드 화학작용을 통해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 환원성 아민화 이외의 화학작용을 통해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 혈청형 19A로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
제 8항에 있어서, 혈청형 19A로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류가 시아닐화 화학작용, 예를 들어 CDAP 화학작용을 통해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
제 8항에 있어서, 혈청형 19A로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류가 카르보디이미드 화학작용을 통해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 환원성 아민화 이외의 화학작용을 통해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 혈청형 19F로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
제 11항에 있어서, 혈청형 19F로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류가 시아닐화 화학작용, 예를 들어 CDAP 화학작용을 통해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
제 11항에 있어서, 혈청형 19F로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류가 카르보디이미드 화학작용을 통해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 환원성 아민화에 의해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 혈청형 4로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 환원성 아민화에 의해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 혈청형 5로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 환원성 아민화에 의해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 혈청형 6A로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 환원성 아민화에 의해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 혈청형 6B로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 환원성 아민화에 의해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 혈청형 7F로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 환원성 아민화에 의해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 혈청형 9V로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 환원성 아민화에 의해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 혈청형 14로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 환원성 아민화에 의해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 혈청형 18C로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 환원성 아민화에 의해 단백질 담체에 컨쥬게이션된 혈청형 23F로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 환원성 아민화 이외의 컨쥬게이션 과정에 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션된 혈청형 19F로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 및 환원성 아민화에 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션된 혈청형 23F로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 환원성 아민화 이외의 컨쥬게이션 과정에 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션된 혈청형 19A로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 및 환원성 아민화에 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션된 혈청형 23F로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 환원성 아민화 이외의 컨쥬게이션 과정에 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션된 혈청형 19F로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 및 환원성 아민화에 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션된 혈청형 6B 및 23F로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 환원성 아민화 이외의 컨쥬게이션 과정에 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션된 혈청형 19A로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 및 환원성 아민화에 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션된 혈청형 6B 및 23F로부터의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
제 23항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 환원성 아민화 이외의 컨쥬게이션 과정이 시아닐화 반응, 예를 들어 CDAP 화학작용인 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 단백질이 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, CRM197, 단백질 D, 뉴몰리신(pneumolysin) 및 PhtD 또는 이들의 단편이나 융합 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 상이한 담체 단백질이 2개 이상의 상이한 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 혈청형에 별도로 컨쥬게이션되는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 3개의 상이한 담체 단백질이 3개 이상의 상이한 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 혈청형에 별도로 컨쥬게이션되는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 4개의 상이한 담체 단백질이 4개 이상의 상이한 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 혈청형에 별도로 컨쥬게이션되는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 5개의 상이한 담체 단백질이 5개 이상의 상이한 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 혈청형에 별도로 컨쥬게이션되는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 혈청형 1을 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 D, CRM197, 뉴몰리신 또는 PhtD 또는 이들의 단편이나 융합 단백질에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 혈청형 3을 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 혈청형 4를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 혈청형 5를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 혈청형 6B를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 혈청형 7F를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 혈청형 9V를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 혈청형 14를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 D 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 혈청형 23F를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서, 파상풍 톡소이드 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 혈청형 18C를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴몰리신 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 혈청형 19A를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서, CRM197 또는 PhtD 또는 이들의 단편이나 융합 단백질에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 혈청형 22F를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 44항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴몰리신 또는 에이치. 인플루엔자(H. influenzae) 단백질, 임의로 단백질 D 또는 PhtD 또는 이의 융합 단백질 또는 CRM197에 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류 혈청형 6A를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청형 1 캡슐 당류가 담체 단백질에 직접 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청형 1 캡슐 당류가 담체 단백질에 링커를 통해 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
제 47항에 있어서, 링커가 말레이미드를 함유하는 면역원성 조성물.
제 47항 또는 제 48항에 있어서, 링커가 카르보디이미드 화학작용에 의해, 임의로 EDAC를 이용하여 당류에 부착되는 면역원성 조성물.
제 47항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청형 1 당류가 말레이미드 화학작용을 이용하여 담체 단백질 또는 링커에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 단백질 대 혈청형 1 당류의 비가 5:1 내지 1:5, 4:1 내지 1:1 또는 3.5:1 내지 2.5:1 (w/w)인 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 51항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청형 3 캡슐 당류가 담체 단백질에 직접 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 51항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청형 3 캡슐 당류가 담체 단백질에 링커를 통해 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
제 53항에 있어서, 링커가 아디프산 디히드라지드(ADH)인 면역원성 조성물.
제 53항 또는 제 54항에 있어서, 링커가 카르보디이미드 화학작용에 의해, 임의로 EDAC를 이용하여 담체 단백질에 부착되는 면역원성 조성물.
제 53항 내지 제 55항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청형 3 당류가 EDAC 화학작용을 이용하여 담체 단백질 또는 링커에 컨쥬게이션된 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 56항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 단백질 대 혈청형 3 당류의 비가 5:1 내지 1:5, 4:1 내지 1:1 또는 2:1 내지 1:1 (w/w)인 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 57항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청형 6B 당류가 단백질 담체에 컨쥬게이션되고, 여기서 담체 단백질 대 혈청형 6B 당류의 비가 5:1 내지 1:5, 4:1 내지 1:1 또는 3.5:1 내지 2:1 또는 2:1 내지 1:1인 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 58항 중 어느 한 항에 있어서, 19A 당류의 평균 크기가 100kDa 이상 또는 110 내지 700kDa, 110-300, 120-200, 130-180 또는 140-160kDa인 면역원성 조성물.
제 59항에 있어서, 19A 당류가 천연 다당류이거나 5배 이하로 크기 조절된 것인 면역원성 조성물.
제 59항 또는 제 60항에 있어서, 19A 당류가 미세유동화(microfluidization)에 의해 크기 조절된 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 61항 중 어느 한 항에 있어서, 19A 당류 컨쥬게이트의 용량이 당류의 1 내지 10㎍, 1 내지 5㎍ 또는 1 내지 3㎍인 면역원성 조성물.
제 62항에 있어서, 19A 당류 컨쥬게이트의 용량이 당류의 3㎍인 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 63항 중 어느 한 항에 있어서, 당류의 평균 크기가 50kDa 이상인 면역원성 조성물.
제 64항에 있어서, 평균 당류 크기가 300 내지 400kDa인 혈청형 1을 포함하는 면역원성 조성물.
제 64항 또는 제 65항에 있어서, 평균 당류 크기가 75 내지 125kDa인 혈청형 4를 포함하는 면역원성 조성물.
제 64항 내지 제 66항 중 어느 한 항에 있어서, 평균 당류 크기가 350 내지 450kDa인 혈청형 5를 포함하는 면역원성 조성물.
제 64항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 있어서, 평균 당류 크기가 1000 내지 1400kDa 또는 500 내지 50kDa 또는 400 내지 200kDa 또는 400-300kDa 또는 50-100kDa인 혈청형 6B를 포함하는 면역원성 조성물.
제 64항 내지 제 68항 중 어느 한 항에 있어서, 평균 당류 크기가 200 내지 300kDa인 혈청형 7F를 포함하는 면역원성 조성물.
제 64항 내지 제 69항 중 어느 한 항에 있어서, 평균 당류 크기가 250 내지 300kDa인 혈청형 9V를 포함하는 면역원성 조성물.
제 64항 내지 제 70항 중 어느 한 항에 있어서, 평균 당류 크기가 200 내지 250kDa인 혈청형 14를 포함하는 면역원성 조성물.
제 64항 내지 제 71항 중 어느 한 항에 있어서, 평균 당류 크기가 900 내지 1000kDa인 혈청형 23F를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 72항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청형 5, 6B 및 23F (및 임의로 6A)를 천연 당류로서 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 73항 중 어느 한 항에 있어서, 캡슐 당류 컨쥬게이트의 용량이 컨쥬게이트 당 1 내지 10㎍, 1 내지 5㎍ 또는 1 내지 3㎍의 당류인 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 74항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청형 4, 18C, 19F 및 22F (및 임의로 19A)의 컨쥬게이트를 컨쥬게이트 당 3㎍ 용량의 당류로 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 75항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청형 1, 5, 6B, 7F, 9V, 14 및 23F (및 임의로 6A 및/또는 3)의 컨쥬게이트를 컨쥬게이트 당 1㎍ 용량의 당류로 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 76항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이션된 당류 혈청형 및 컨쥬게이션되지 않은 당류 혈청형의 수가 23개 미만 또는 23개가 되도록, 컨쥬게이션된 것들과 상이한 혈청형의 컨쥬게이션되지 않은 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 당류를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 77항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 컨쥬게이션되지 않거나 컨쥬게이션된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 단백질을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
제 78항에 있어서, 하나 이상의 컨쥬게이션되지 않은 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 단백질을 포함하는 면역원성 조성물.
제 78항 또는 제 79항에 있어서, 상기 하나 이상의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 단백질이 폴리 히스티딘 트라이어드 패밀리(PhtX), 콜린 결합 단백질 패밀리(CbpX), CbpX 트렁케이트(truncate), LytX 패밀리, LytX 트렁케이트, CbpX 트렁케이트-LytX 트렁케이트 키메라 단백질, 무독화 뉴몰리신(Ply), PspA, PsaA, Sp128, Sp101, Sp130, Sp125 및 Sp133으로부터 선택되는 면역원성 조성물.
제 78항 내지 제 80항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴몰리신을 포함하는 면역원성 조성물.
제 78항 내지 제 81항 중 어느 한 항에 있어서, PhtX 단백질을 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 82항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴몰리신을 유리 단백질 또는 담체 단백질로서 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 83항 중 어느 한 항에 있어서, PhtX 단백질을 유리 단백질 또는 담체 단백질로서 포함하는 면역원성 조성물.
제 84항에 있어서, 상기 PhtX 단백질이 PhtD 또는 PhtBD 또는 PhtDE 융합 단백질인 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 85항 중 어느 한 항에 있어서, 애쥬번트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 86항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 또는 정확히 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19 또는 20개의 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 캡슐 당류를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 87항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 백신.
제 1항 내지 제 87항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 약학적으로 허용되는 부형제와 혼합시키는 단계를 포함하는, 제 88항에 따른 백신을 제조하는 방법.
면역보호량의 제 1항 내지 제 87항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 제 88항의 백신을 숙주에게 투여하는 것을 포함하여, 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 감염에 의해 야기된 질병에 대해 인간 숙주를 면역화시키는 방법.
제 90항에 있어서, 인간 숙주가 중년 집단이고, 질병이 폐렴(pneumonia) 또는 침습성 폐렴구균 질병(invasive pneumococcal disease)(IPD) 중 어느 한 쪽 또는 둘 모두인 방법.
제 90항 또는 제 91항에 있어서, 인간 숙주가 중년 집단이고, 질병이 만성 폐쇄폐병(chronic obstructive pulmonary disease)(COPD)의 악화인 방법.
제 90항에 있어서, 인간 숙주가 유아이고, 질병이 중이염(otitis media)인 방법.
제 90항 또는 제 93항에 있어서, 인간 숙주가 유아이고, 질병이 수막염(meningitis) 및/또는 균혈증(bacteraemia)인 방법.
제 90항, 제 93항 또는 제 94항에 있어서, 인간 숙주가 유아이고, 질병이 폐렴 및/또는 결막염(conjunctivitis)인 방법.
스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 감염에 의해 야기된 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 87항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 제 88항의 백신.
스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 감염에 의해 야기된 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에서 제 1항 내지 제 87항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 제 88항의 백신의 용도.
제 97항에 있어서, 질병이 중년의 인간의 폐렴 또는 또는 침습성 폐렴구균 질병(IPD) 중 어느 한 쪽 또는 둘 모두인 용도.
제 97항 또는 제 98항에 있어서, 질병이 중년의 인간의 만성 폐쇄폐병(COPD)의 악화인 용도.
제 97항에 있어서, 질병이 유아의 중이염인 용도.
제 97항 또는 제 100항에 있어서, 질병이 유아의 수막염 및/또는 균혈증인 용도.
제 97항, 제 100항 또는 제 101항에 있어서, 질병이 유아의 폐렴 및/또는 결막염인 용도.
(i) 제 1항 내지 제 103항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물 또는 백신 및 (ii) 단백질 D가 유리되어 있고/거나 컨쥬게이션될 수 있는 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)로부터의 단백질 D를 분리된 구성요소 또는 조합된 구성요소로서 순차적으로 또는 동시에 투여하는 것을 포함하는, 유아에서 중이염에 대한 유아에서 보호성 면역 반응을 유도하는 방법.
전술한 청구항들 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 백신을 투여함에 의해 유아에서 에스. 뉴모니애(S. pneumonia)에 대한 보호성 면역 반응을 유도하는 방법.
(i) 전술한 청구항들 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 백신 및 (ii) PhtX 패밀리 및 뉴몰리신으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 에스. 뉴모니애(S. pneumonia) 표면 단백질을 함께, 순차적으로 또는 동시에 투여함에 의해 중년 집단에서 에스. 뉴모니애(S. pneumonia)에 대한 보호성 면역 반응을 유도하는 방법.
적어도 하기 혈청형: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F 전부에서 유래된 당류 컨쥬게이트를 포함하고 백신 구성요소 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F 중 하나 이상에 대해 유도된 GMC 항체 역가가 인간 접종자에서 Prevnar? 백신에 의해 유도된 것보다 현저하게 열등하지 않은 제 1항 내지 제 87항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 제 88항의 백신.
제 106항에 있어서, 혈청형 4에 대해 유도된 GMC 항체 역가가 인간 접종자에서 Prevnar? 백신에 의해 유도된 것보다 현저하게 열등하지 않은 면역원성 조성물.
제 106항 또는 제 107항에 있어서, 혈청형 6B에 대해 유도된 GMC 항체 역가가 인간 접종자에서 Prevnar? 백신에 의해 유도된 것보다 현저하게 열등하지 않은 면역원성 조성물.
제 106항 내지 제 108항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청형 9V에 대해 유도된 GMC 항체 역가가 인간 접종자에서 Prevnar? 백신에 의해 유도된 것보다 현저하게 열등하지 않은 면역원성 조성물.
제 106항 내지 제 109항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청형 14에 대해 유도된 GMC 항체 역가가 인간 접종자에서 Prevnar? 백신에 의해 유도된 것보다 현저하게 열등하지 않은 면역원성 조성물.
제 106항 내지 제 110항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청형 18C에 대해 유도된 GMC 항체 역가가 인간 접종자에서 Prevnar? 백신에 의해 유도된 것보다 현저하게 열등하지 않은 면역원성 조성물.
제 106항 내지 제 111항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청형 19F에 대해 유도된 GMC 항체 역가가 인간 접종자에서 Prevnar? 백신에 의해 유도된 것보다 현저하게 열등하지 않은 면역원성 조성물.
제 106항 내지 제 112항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청형 23F에 대해 유도된 GMC 항체 역가가 인간 접종자에서 Prevnar? 백신에 의해 유도된 것보다 현저하게 열등하지 않은 면역원성 조성물.
제 106항 내지 제 113항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청형 3 당류 컨쥬게이트를 포함하는 면역원성 조성물.
제 106항 내지 제 114항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청형 6A 당류 컨쥬게이트를 포함하는 면역원성 조성물.
제 106항 내지 제 115항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청형 19A 당류 컨쥬게이트를 포함하는 면역원성 조성물.
제 106항 내지 제 116항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청형 22F 당류 컨쥬게이트를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항 내지 제 117항 중 어느 한 항에 있어서, 결정질 벌크화제(bulking agent), 임의로 만니톨을 포함하는 면역원성 조성물.
제 118항에 있어서, 당, 임의로 수크로오스를 포함하는 면역원성 조성물.