CN102869375B - 包含与载体蛋白缀合的肺炎链球菌多糖的免疫原性组合物 - Google Patents

包含与载体蛋白缀合的肺炎链球菌多糖的免疫原性组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种包含至少2种不同肺炎链球菌荚膜糖的免疫原性组合物，其中一种或多种选自由血清型1、3、19A和19F组成的第一组并且通过除了还原胺化以外的化学法直接地或间接地与蛋白载体相连，以及一种或多种不同的糖选自由血清型4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C和23F组成的第二组并且通过还原胺化与蛋白载体相连。还公开了这样的组合物在治疗或预防由肺炎链球菌感染造成的疾病中的用途。

Description

包含与载体蛋白缀合的肺炎链球菌多糖的免疫原性组合物
本发明涉及肺炎球菌缀合物免疫原性组合物或疫苗领域，其中为免疫原性组合物或疫苗的不同组分使用不同的缀合化学法。将还原胺化用于至少一种血清型的缀合，将除了还原胺化以外的缀合用于不同血清型的缀合。本发明也涉及生产这种疫苗的方法和它们在治疗中的用途。
不到2岁的儿童对大多数多糖疫苗不产生免疫应答，所以一直以来必须通过与蛋白载体进行化学缀合使多糖成为免疫原性的。将为非T细胞依赖性抗原的多糖与为T细胞依赖性抗原的蛋白偶联，会赋予所述多糖T细胞依赖性特性，包括同种型转换、亲和力成熟和记忆诱导。
肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）为革兰氏阳性细菌，可导致相当高的发病率和死亡率（尤其是对年纪小的人和上年纪的人），引起诸如肺炎、菌血症和脑膜炎等侵袭性疾病以及与定植（colonisation）相关的疾病，如急性中耳炎。在美国，60岁以上的人患有肺炎球菌性肺炎的比例估计为十万分之3-8。在20%的病例中，这会引发菌血症和其它表现诸如脑膜炎，即便采用抗生素治疗，死亡率也接近30%。
肺炎链球菌被赋予血清型特异性的化学连接的多糖包裹。有90种公知的肺炎链球菌血清型，荚膜是肺炎链球菌毒力的主要决定因素，因为荚膜不但保护细菌内表面不受补体影响，而且其本身是弱免疫原性的。多糖是非T细胞依赖性抗原，不能被加工或呈递到MHC分子上，从而不能与T细胞相互作用。但它们能通过一种涉及B细胞表面受体交联的替代机制来刺激免疫系统。
一些实验表明，对侵袭性肺炎链球菌疾病的防护作用与荚膜特异性抗体最为相关，且该防护作用具有血清型特异性。
肺炎链球菌是婴儿和儿童侵袭性细菌疾病和中耳炎的最常见致病因素。同样，老年人对肺炎链球菌疫苗的应答较弱[Roghmann等, （1987）, J. Gerontol. 42:265-270]，因此，在该人群中细菌性肺炎的发病率升高[Verghese和Berk, （1983）Medicine（Baltimore）62:271-285]。
已经开发了多价肺炎球菌缀合疫苗。Synflorix由Glaxosmithkline Biological s.a.销售，且含有肺炎球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F多糖（与来自流感嗜血杆菌的蛋白D缀合）、18C（与破伤风类毒素缀合）和19F（与白喉类毒素缀合），所述缀合是通过氰基化（CDAP）化学法。Prevenar由Pfizer销售，且含有肺炎球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F，它们都通过还原胺化化学法与无毒的白喉毒素CRM197缀合（Prymula和Schuerman Expert Rev. vaccines 8; 1479-1500（2009））。
因此，本发明的一个目的是，开发一种改进的多种血清型肺炎链球菌多糖缀合疫苗的制剂。这可以如下实现：通过组合来自不同的肺炎球菌血清型的糖，所述糖已经使用不同的缀合方法进行缀合。以此方式，使用允许糖表位的最佳呈现的缀合方法，为不同血清型选择最佳的缀合方法，从而允许每种血清型呈现。尽管使用还原胺化时有些肺炎球菌糖会较好地缀合，对于其它肺炎球菌糖而言，不同的缀合方法会允许环结构保持完整，且可以提供更好的结果。选择出使用还原胺化或其它缀合方法时具有最佳表现的糖，允许开发出更有效的免疫原性组合物。
因此，提供了包含至少2种不同的肺炎链球菌荚膜糖的免疫原性组合物，其中一种或多种选自由血清型1、3、19A和19F组成的第一组并且通过除了还原胺化以外的化学法直接地或间接地与蛋白载体相连，以及一种或多种不同的糖选自由血清型4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C和23F组成的第二组并且通过还原胺化与蛋白载体相连。
附图说明
图1. 多糖-蛋白缀合物的制备。
A）在7vCRM中，19F多糖经由还原胺化与无毒的白喉CRM197蛋白缀合。（1）使用高碘酸盐的氧化会导入末端反应性的醛。（2）通过还原胺化与CRM197载体蛋白连接，会破坏和打开己糖环。（3）缀合以后，由于新基团与己糖环的结合，可以生成新的免疫原性的表位。
B）在PHiD-CV中，19F多糖经由氰基化化学法与白喉类毒素缀合。化学地活化19F，以将氰酸酯基团引导至羟基，在添加蛋白组分以后，与氨基或酰肼基团形成共价键。在氰基化缀合以后，己糖环保持完整，且其它化学基团不能结合。
图2. 在PHiD-CV或7vCRM初次和强化免疫接种以后，实现≥8的针对肺炎球菌血清型19F的OPA滴度的婴儿的比例。浅色条显示了PHiD-CV的结果，深色条显示了7vCRM的结果。误差棒代表95% 置信限。
图3. 在PHiD-CV或7vCRM初次和强化免疫接种以后，实现≥8的针对肺炎球菌血清型19A的OPA滴度的婴儿的比例。浅色条显示了PHiD-CV的结果，深色条显示了7vCRM的结果。误差棒代表95% 置信限。
图4. 在高碘酸盐处理以后，23F和6B多糖的大小。用三角形标记的线显示了在10mM磷酸盐缓冲液中的6B的大小，用菱形标记的线显示了在10mM磷酸盐缓冲液中的23F的大小，用正方形标记的线显示了在100mM磷酸盐缓冲液中的23F的大小。
图5. 使用CDAP或还原胺化缀合，23F缀合物的免疫原性的对比。
图6. 通过还原胺化或CDAP制备的6B缀合物在小鼠中的免疫原性的对比。该图显示了通过还原胺化制备的4种缀合物（PS06B-CRM122-125）和通过CDAP制备的2种缀合物（PS06B-CRM003和PS06B-PD）的ELISA滴度。下面显示了OPA结果。
图7. 通过还原胺化或CDAP制备的6B缀合物在豚鼠中的免疫原性的对比。该图显示了通过还原胺化制备的4种缀合物（PS06B-CRM122-125）和通过CDAP制备的2种缀合物（PS06B-CRM003和PS06B-PD）的ELISA滴度。下面显示了OPA结果。
具体实施方式
本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同的肺炎链球菌荚膜糖，其中一种或多种选自由血清型1、3、19A和19F组成的第一组并且通过除了还原胺化以外的化学法直接地或间接地与蛋白载体相连，以及一种或多种不同的糖选自由血清型4、5、6A、6B、6C、7F、9V、14、18C和23F组成的第二组并且通过还原胺化与蛋白载体相连。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含，通过除了还原胺化以外的化学法与蛋白载体缀合的肺炎链球菌荚膜糖，所述荚膜糖来自：血清型1或3或19A或19F；1和3；1和19A；1和19F；3和19A；3和19F；19A和19F；1、3和19A；1、3和19F、1、19A和19F；3、19A和19F或1、3、19A和19F。在一个实施方案中，19F通过除了还原胺化以外的化学法与载体蛋白缀合。
任选地，使用还原胺化缀合来自血清型1、3、19A或19F的荚膜糖，只要使用除了还原胺化以外的方法缀合该组的其它成员即可。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含，通过氰基化化学法诸如CDAP化学法与蛋白载体缀合的肺炎链球菌荚膜糖，所述荚膜糖来自：血清型1或3或19A或19F；1和3；1和19A；1和19F；3和19A；3和19F；19A和19F；1、3和19A；1、3和19F、1、19A和19F；3、19A和19F或1、3、19A和19F。在一个实施方案中，19F通过CDAP化学法与载体蛋白缀合。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含，通过碳二亚胺（例如EDAC）化学法与蛋白载体缀合的肺炎链球菌荚膜糖，所述荚膜糖来自：血清型1或3或19A或19F；1和3；1和19A；1和19F；3和19A；3和19F；19A和19F；1、3和19A；1、3和19F、1、19A和19F；3、19A和19F或1、3、19A和19F。
在本发明的一个实施方案中，下述肺炎链球菌荚膜糖或其基团通过还原胺化与载体蛋白缀合：血清型4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C或23F、4和5、4和6A、4和6B、4和7F、4和9V、4和14、4和18C、4和23F、5和6A、5和6B、5和7F、5和9V、5和14、5和18C、5和23F、6A和6B、6A和7F、6A和9V、6A和14、6A和18C、6A和23F、6B和7F、6B和9V、6B和14、6B和18C、6B和23F、7F和9V、7F和14、7F和18C、7F和23F、9V和14、9V和18C、9V和23F、14和18C、14和23F或18C和23F。在一个实施方案中，23F通过还原胺化化学法与载体蛋白缀合。
在本发明的一个实施方案中，来自血清型19F的肺炎球菌多糖通过氰基化化学法（例如CDAP化学法）与载体蛋白缀合，而来自血清型23的肺炎球菌多糖通过还原胺化化学法与载体蛋白缀合。
在本发明的一个实施方案中，来自血清型19F的肺炎球菌多糖通过氰基化化学法（例如CDAP化学法）与载体蛋白缀合，而来自血清型6B的肺炎球菌多糖通过还原胺化化学法与载体蛋白缀合。
在本发明的一个实施方案中，来自血清型19F的肺炎球菌多糖通过氰基化化学法（例如CDAP化学法）与载体蛋白缀合，而来自血清型6A的肺炎球菌多糖通过还原胺化化学法与载体蛋白缀合。
在本发明的一个实施方案中，来自血清型19F的肺炎球菌多糖通过氰基化化学法（例如CDAP化学法）与载体蛋白缀合，而来自血清型6C的肺炎球菌多糖通过还原胺化化学法与载体蛋白缀合。
在本发明的一个实施方案中，使用还原胺化化学法，使1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种来自不同血清型的肺炎链球菌荚膜糖与载体蛋白缀合。
在使用还原胺化化学法进行缀合的情况下，任选地，使用0.1-1.2、0.1-0.5、0.1-0.2、0.5-0.8、0.1-0.8、0.3-1.0或0.4-0.9摩尔当量的高碘酸盐氧化肺炎链球菌荚膜糖，以形成活化的糖。任选地，所述高碘酸盐处理步骤在缓冲液中进行，所述缓冲液不含有胺基，例如磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液。在一个实施方案中，所述缓冲液是无机缓冲液。在一个实施方案中，所述缓冲液是磷酸盐缓冲液，例如磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液。发明人已经发现，通过控制还原胺化方法的氧化步骤的条件，得到的缀合物可以有利地保留所述糖的大小和/或免疫原性。
在一个实施方案中，所述缓冲液（例如磷酸盐缓冲液）具有1-100mM、5-80mM、1-50mM、1-25mM、10-40mM、1-10mM、5-15mM、8-12mM、10-20mM、5-20mM、10-50mM、约10mM或约20mM的浓度。在一个实施方案中，所述缓冲液的pH是pH 5.0-7.0、pH 5.5-6.5、pH 5.8-6.3或约pH 6.0。
术语‘高碘酸盐’包括高碘酸盐和高碘酸。该术语也包括偏高碘酸盐（IO4 -）和正高碘酸盐（IO6 5-），但是，在一个具体实施方案中，在本发明的方法中使用的高碘酸盐是偏高碘酸盐。术语‘高碘酸盐’也包括高碘酸盐的各种盐，包括高碘酸钠和高碘酸钾。当抗原与高碘酸盐反应时，高碘酸盐会氧化邻位羟基，以形成羰基或醛基，并造成C-C键的断裂。因为该原因，术语‘使抗原与高碘酸盐反应’包括：用高碘酸盐氧化邻位羟基，例如所述反应可能包括：氧化顺式或反式邻位二醇。
在本发明的一个实施方案中，使用CDAP化学法，使1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种来自不同血清型的肺炎链球菌荚膜糖与载体蛋白缀合。
在本发明的一个实施方案中，使用碳二亚胺（例如EDAC）化学法，使1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种来自不同血清型的肺炎链球菌荚膜糖与载体蛋白缀合。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有选自下述的载体蛋白：破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、蛋白D、肺炎链球菌溶血素和PhtD或其片段或融合蛋白。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有2、3、4、5、6或7种不同的载体蛋白，所述载体蛋白分别与至少或准确的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种不同肺炎链球菌荚膜糖血清型缀合。任选地，这些载体蛋白选自：破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、蛋白D、肺炎链球菌溶血素和PhtD或其片段或融合蛋白。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含：与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖1。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含：与蛋白D、CRM197、肺炎链球菌溶血素或PhtD或其片段或融合蛋白缀合的肺炎链球菌荚膜糖3。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含：与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖4。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含：与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖5。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含：与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖6B。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含：与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖7F。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含：与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖9V。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物另外包含与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖14。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含：与蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖23F。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含：与破伤风类毒素或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖18C。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含：与肺炎链球菌溶血素或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖19A。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含：与CRM197或PhtD或其片段或融合蛋白缀合的肺炎链球菌荚膜糖22F。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含，与下述物质缀合的肺炎链球菌荚膜糖6A：肺炎链球菌溶血素或流行性感冒杆菌蛋白，任选地蛋白D或PhtD或其融合蛋白或CRM197。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含，与下述物质缀合的肺炎链球菌荚膜糖6C：肺炎链球菌溶血素或流行性感冒杆菌蛋白，任选地蛋白D或PhtD或其融合蛋白或CRM197。
术语“糖”在整个本说明书中可指示多糖或寡糖，并包括这二者。多糖分离自细菌，并可以在某种程度上通过已知方法（参见例如EP497524和EP497525）并任选地通过微流化调整大小。可对多糖调整大小，以便降低多糖样品的粘度和/或改善缀合产物的过滤性。寡糖具有少量重复单元（通常5-30个重复单元），并通常为水解的多糖。
肺炎链球菌的荚膜多糖包含可含有达8个糖残基的重复寡糖单元。关于关键肺炎链球菌血清型的寡糖单元的综述，参见JONES, Christopher. Vaccine based on the cell surface carbohydrates of pathogenic bacteria. An. Acad. Bras. Ciênc., 2005年6月, 第77卷, 第2册, 293-324页, 表II ISSN 0001-3765。在一个实施方案中，荚膜糖抗原可为全长多糖，但是在其它实施方案中其可为一个寡糖单元，或者比重复寡糖单元的天然长度的糖链短。在一个实施方案中，疫苗中存在的所有糖都是多糖。全长多糖可被“调整大小”，即它们的大小可通过多种方法降低，例如酸解处理；过氧化氢处理；通过emulsiflex?调整大小，然后经过氧化氢处理，以产生寡糖片段；或者微流化。
本发明人还注意到，本技术的核心是使用易于生产缀合物的寡糖。本发明人已发现，通过使用天然的或稍微调整大小的多糖缀合物，可实现一个或多个以下优势：1）具有高免疫原性的可过滤的缀合物，2）可改变缀合物中多糖对蛋白的比率，使得缀合物中多糖对蛋白的比率（w/w）可被增加（其可对载体抑制作用有影响），3）倾向于水解的免疫原性缀合物可通过使用较大的糖进行缀合来稳定。使用较大的多糖可导致与缀合物载体更加交联，并可以减少由缀合物释放游离的糖。在先有技术中描述的缀合疫苗倾向于在缀合前解聚多糖，以便改善缀合。本发明人已发现，保留较大尺寸糖的糖缀合疫苗可提供抵御肺炎链球菌疾病的良好免疫应答。
本发明的免疫原性组合物因此可以包含一种或多种糖缀合物，其中在缀合前每种糖的平均尺寸（重均分子量；Mw）在80kDa、100kDa、200kDa、300kDa、400kDa、500kDa或1000kDa以上。在一个实施方案中，缀合后的缀合物应可容易地通过0.2μm滤器过滤，使得与过滤前样品相比在过滤后获得50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的产量。
为了本发明的目的，“天然的多糖”是指未经处理的多糖，处理的目的是减小糖的尺寸。在常规纯化工艺中多糖的尺寸可被轻微减少。这样的糖仍是天然的。只要多糖已经经过调整大小的工艺，该多糖就不被认为是天然多糖。天然的多糖的尺寸是例如250kDa - 2,000kDa、400 - 1,500kDa、750kDa - 1,250kDa、300kDa - 600kDa、500-1,000kDa或1,000-1,500kDa，技术人员会明白具有不同尺寸的天然多糖的不同血清型。
为了本发明的目的，“以达到x2的因数调整大小”是指糖经过处理，目的是降低糖大小，但仍保留超过天然多糖大小的一半的大小。x3、x4等等以相同的方式解释，即对糖进行处理，以减少多糖的大小，但仍保留天然多糖大小的1/3、1/4等等以上的大小。
在本发明的一个方面，免疫原性组合物包含至少10种血清型的缀合载体蛋白的肺炎链球菌糖，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9种或每种肺炎链球菌糖为天然多糖。
在本发明的一个方面，免疫原性组合物包含来自至少10种血清型的缀合载体蛋白的肺炎链球菌糖，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9种或每种肺炎链球菌糖被达到x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或x10的因数调整大小。在该方面的一个实施方案中，大部分糖，例如6、7、8种或更多种的糖被达到x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或x10的因数调整大小。
糖的分子量或平均分子量在本文是指在缀合前检测的糖的重均分子量（Mw），通过MALLS来检测。
MALLS技术在本领域众所周知，通常如实施例2所述进行。就肺炎链球菌糖的MALLS分析而言，可组合使用两种柱子（TSKG6000和5000PWxl），并用水洗脱糖。用光散射检测器（例如配有10 mW 488 nm氩激光器的Wyatt Dawn DSP）和干涉仪折射计（例如装备P100光电元件和498 nm红光过滤的Wyatt Otilab DSP）检测糖。
在一个实施方案中，肺炎链球菌糖为天然多糖，或者为在常规提取步骤中己经减小了尺寸的天然多糖。
在一个实施方案中，通过机械裂解，例如通过微流化或超声，调整肺炎链球菌糖的大小。微流化和超声具有充分减小较大天然多糖大小从而提供可过滤缀合物的优点。调整大小以不超过x20、x10、x8、x6、x5、x4、x3或x2的因数进行。
在一个实施方案中，免疫原性组合物包含肺炎链球菌缀合物，该缀合物由天然多糖和以不超过x20的因数调整大小的糖的混合物制备。在该实施方案的一个方面，大部分糖，例如6、7、8种或更多种糖以达到x2、x3、x4、x5或x6的因数调整大小。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含：平均大小在100 kDa以上的19A糖，例如，110-700 kDa、110-300、120-200、130-180或140-160 kDa。在一个实施方案中，通过微流化将19A轻微调整大小，例如达到x2、x3、x4或x5的因数。在一个实施方案中，19A缀合物的糖剂量是1-10 μg、1-5 μg或1-3 μg的糖，任选地，3 μg糖。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含22F糖缀合物，其中所述22F糖的平均大小大于100 kDa，任选地，110-700 kDa、110-300、120-200、130-180或150-170 kDa。在一个实施方案中，通过微流化对22F糖调整大小，例如达到x2、x3、x4或x5的因数。在一个实施方案中，the of the 19A缀合物的糖剂量是1-10 μg、1-5 μg或1-3 μg的糖，任选地，3 μg糖。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含多种糖缀合物，其中所述糖的平均大小大于50 kDa。在一个实施方案中，血清型1糖的平均大小是300-400 kDa。在一个实施方案中，血清型4糖的平均大小是75-125 kDa。在一个实施方案中，血清型5糖的平均大小是350-450 kDa。在一个实施方案中，血清型6B糖的平均大小是1000-1400 kDa。在一个实施方案中，血清型7F糖的平均大小是200-300 kDa。在一个实施方案中，血清型9V糖的平均大小是250-300 kDa。在一个实施方案中，血清型14糖的平均大小是200-250 kDa。在一个实施方案中，血清型23F糖的平均大小是900-1000 kDa。在一个实施方案中，血清型5；6A、6B；23F；5和6A；5和6B、5和23F、6A和6B、6A和23F；6B和23F；5、6A和6B；5、6A和23F；5、6B和23F或5、6A、6B和23F作为天然的调整过尺寸的糖进行缀合，即在所述工艺中不包括指定的调整大小的步骤。
在本发明的免疫原性组合物的一个实施方案中，荚膜糖缀合物的糖剂量是1-10 μg、1-5 μg或1-3 μg糖/缀合物。例如，所述组合物包含：剂量为3 μg糖/缀合物的血清型4、18C、19F和22F（和任选地，19A）的缀合物。例如，本发明的免疫原性组合物包含：剂量为1 μg糖/缀合物的血清型1、5、6B、7F、9V、14和23F（和任选地，6A和/或3）的缀合物。
在一个实施方案中，肺炎链球菌糖通过接头如双功能接头与载体蛋白缀合。任选地，接头为异双功能或同双功能接头，具有例如1个反应性氨基和1个反应性羧基、2个反应性氨基或者2个反应性羧基。例如，接头具有4-20、4-12、5-10个碳原子。可能的接头是ADH。其它接头包括B-丙酰胺基（WO 00/10599）、硝基苯-乙胺（Gever等, （1979）Med. Microbiol. Immunol. 165；171-288）、卤代烷基卤（US4057685）、糖苷键（US4673574、US4808700）、己烷二胺和6-氨基己酸（US4459286）。在一个实施方案中，ADH用作缀合血清型18C的糖的接头。
在本发明的免疫原性组合物中存在的糖缀合物可用任何己知的偶联技术制备。缀合方法可依赖于用四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓（CDAP）活化糖而形成氰酸酯。由此，活化的糖可直接或经由间隔臂（接头）基团偶联至载体蛋白上的氨基。例如，间隔臂可以是胱胺或半胱胺，以得到硫醇化多糖，硫醇化多糖可经由与马来酰亚胺活化的载体蛋白（例如使用GMBS）或卤乙酰载体蛋白（例如使用碘乙酰亚胺[例如乙基碘乙酰亚胺HCl]或N-琥珀酰亚胺基溴乙酸盐或SIAB、或SIA、或SBAP）反应后所获得的硫醚键与载体偶联。任选地，氰酸酯（任选地以CDAP化学法制备）可与己二胺或ADH偶联，并采用碳二亚胺（例如EDAC或EDC）化学法经蛋白载体上的羧基使氨基衍生化的糖与载体蛋白缀合。这样的缀合物描述于PCT公开申请WO 93/15760（Uniformed Services University）以及WO 95/08348和WO 96/29094。
其它的合适技术使用碳二亚胺、碳亚胺、酰肼、活化酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。许多都描述于WO 98/42721。缀合可涉及羰基接头，其可如下形成：糖的游离羟基先与CDI反应（Bethell等, J. Biol. Chem. 1979, 254；2572-4, Hearn等, J. Chromatogr. 1981. 218；509-18），再与蛋白反应，形成氨基甲酸酯键。该过程可涉及异头末端还原成伯羟基，任选地，涉及伯羟基与CDI反应的伯羟基的保护/去保护，以形成CDI氨基甲酸酯中间体，并将CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白的氨基偶联。
缀合物也可通过如US 4365170（Jennings）和US 4673574（Anderson）所述的直接还原胺化法制备。其它方法描述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508。
进一步的方法涉及通过碳二亚胺缩合（Chu C.等, Infect. Immunity, 1983 245 256），例如使用EDAC，将溴化氰（或CDAP）活化的、被己二酰肼（ADH）衍生化的糖与蛋白载体偶联。
在一个实施方案中，糖上的羟基（任选活化的羟基，例如被活化以制备氰酸酯的羟基（例如使用CDAP））直接或间接（通过接头）与蛋白的氨基或羧基连接。当存在接头时，糖上的羟基任选地与接头上的氨基连接，例如通过使用CDAP缀合。接头如ADH中的其余氨基可缀合蛋白上的羧酸基团，例如通过使用碳二亚胺化学，例如通过使用EDAC。在一个实施方案中，肺炎链球菌荚膜糖在接头与载体蛋白缀合之前先与接头缀合。或者，接头可在与糖缀合之前与载体缀合。
还可以使用技术组合，一些糖-蛋白缀合物通过CDAP制备，一些通过还原胺化法制备。
通常，蛋白载体上可用于偶联/缀合的化学基团的类型如下：
A）羧基（例如经天冬氨酸或谷氨酸）。在一个实施方案中，该基团直接与糖上的氨基连接，或者用碳二亚胺化学（例如用EDAC）与接头上的氨基连接。
B）氨基（例如经由赖氨酸）。在一个实施方案中，该基团直接与糖上的羧基连接，或者用碳二亚胺化学（例如用EDAC）与接头上的羧基连接。在另一个实施方案中，该基团直接与糖上用CDAP或CNBr活化的羟基连接，或者与接头上的这些基团连接；与具有醛基的糖或接头连接；与具有琥珀酰亚胺酯基团的糖或接头连接。
C）巯基（例如经由半胱氨酸）。在一个实施方案中，该基团与溴乙酰糖或氯乙酰糖连接，或者用马来酰亚胺化学与接头连接。在一个实施方案中，该基团用双二重氮联苯胺活化/改性。
D）羟基（例如经由酪氨酸）。在一个实施方案中，该基团用双二重氮联苯胺活化/改性。
E）咪唑基（例如经由组氨酸）。在一个实施方案中，该基团用双二重氮联苯胺活化/改性。
F）胍基（例如经由精氨酸）。
G）吲哚基（例如经由色氨酸）。
在糖上，能够用于偶联的通常是以下基团：OH、COOH或NH2。醛基能够在本领域已知的不同处理后产生，所述处理例如：高碘酸盐、酸解、过氧化氢等。
直接偶联法：
糖-OH＋CNBr或CDAP----->氰酸酯＋NH2-Prot---->缀合物
糖-醛＋NH2-Prot ---->席夫碱＋NaCNBH3 ----> 缀合物
糖-COOH＋NH2-Prot＋EDAC ----> 缀合物
糖-NH2＋COOH-Prot＋EDAC ----> 缀合物。
通过间隔臂（接头）间接偶联的方法：
糖-OH＋CNBr或CDAP --->氰酸酯＋NH2----NH2 ----> 糖----NH2＋COOH-Prot＋EDAC----->缀合物
糖-OH＋CNBr或CDAP ---->氰酸酯＋NH2-----SH -----> 糖----SH＋SH-Prot（具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白，或是通过例如SPDP将蛋白的氨基改性后获得）-----> 糖-S-S-Prot
糖-OH＋CNBr或CDAP --->氰酸酯＋NH2----SH -------> 糖----SH＋马来酰亚胺-Prot（氨基的改性物）----> 缀合物
糖-OH＋CNBr或CDAP --->氰酸酯＋NH2-----SH ---> 糖-SH＋卤代乙酰胺-Prot ----> 缀合物
糖-COOH＋EDAC＋NH2-----NH2 --->糖------NH2＋EDAC＋COOH-Prot ---->缀合物
糖-COOH＋EDAC＋NH2----SH-----> 糖----SH＋SH-Prot（具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白，或是通过例如SPDP将蛋白的氨基改性后获得）-----> 糖-S-S-Prot
糖-COOH＋EDAC＋NH2----SH----->糖----SH＋马来酰亚胺-Prot（氨基的改性物）---->缀合物
糖-COOH＋EDAC＋NH2----SH--->糖-SH＋卤代乙酰胺-Prot ----> 缀合物
糖-醛＋NH2-----NH2 --->糖------NH2＋EDAC＋COOH-Prot ---->缀合物
注意：可以使用任何合适的碳二亚胺替代以上的EDAC。
总之，通常可以用于与糖偶合的蛋白载体化学基团的类型是氨基（例如赖氨酸残基上的）、COOH基团（例如天冬氨酸和谷氨酸残基上的）和SH基团（如果能够获得的话）（例如半胱氨酸残基上的）。
任选地，载体蛋白对肺炎链球菌糖的比率在1:5至5:1（w/w）之间；1:2至2.5:1（w/w）之间；1:1至2:1（w/w）之间。在一个实施方案中，大部分缀合物，例如6、7、8、9种或更多种缀合物，具有大于1:1的载体蛋白与糖的比率，例如1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1或1.6:1（w/w）。
在一个实施方案中，使用CDAP和EDAC使至少一种肺炎链球菌糖经接头与载体蛋白缀合。例如，可使用如上所述的CDAP和EDAC使18C经接头（例如在其末端具有两个酰肼基团的那些接头，例如ADH）与蛋白缀合。在使用接头时，CDAP可用于使糖与接头缀合，然后可使用EDAC使接头与蛋白缀合，或者可首先使用EDAC使接头与蛋白缀合，此后可使用CDAP使接头与糖缀合。
通常，本发明的免疫原性组合物可含有在0.1-20μg、1-10μg或1-3μg糖之间的每种糖缀合物的剂量。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有剂量为0.1-20 μg、0.5-10 μg、0.5- 5 μg或1-3 μg糖的每种肺炎链球菌荚膜糖。在一个实施方案中，荚膜糖可以不同剂量存在，例如某些荚膜糖可以以约或恰好1 μg的剂量存在，或者某些荚膜糖可以以约或恰好3 μg的剂量存在。在一个实施方案中，来自血清型3、18C和19F（或者4、18C和19F）的糖以高于其它糖的剂量存在。在该实施方案的一个方面，血清型3、18C和19F（或4、18C和19F）以约或恰好3μg的剂量存在，而免疫原性组合物中的其它糖以约或恰好1μg的剂量存在。
“约”或“近似”为了本发明的目的被定义为在给定值的10%左右以内。
在一个实施方案中，至少一种肺炎链球菌荚膜糖与载体蛋白直接缀合。任选地，至少一种肺炎链球菌荚膜糖通过CDAP直接缀合。在一个实施方案中，大部分荚膜糖，例如5、6、7、8、9种或更多种，通过CDAP与载体蛋白连接（参见WO 95/08348和WO 96/29094）。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含：一种或多种未缀合的或缀合的肺炎链球菌蛋白。在一个实施方案中，所述肺炎链球菌蛋白以未缀合的形式添加，例如，它作为游离蛋白存在于所述组合物中。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含至少或准确的1、2、3或4种肺炎链球菌蛋白，所述蛋白选自：聚组氨酸三联体家族（PhtX）、胆碱结合蛋白家族（CbpX）、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白、去毒的肺炎链球菌溶血素（Ply）、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125和Sp133。例如，所述组合物含有去毒的肺炎链球菌溶血素和/或PhtD。例如，所述组合物含有去毒的肺炎链球菌溶血素和PhtD和Sp128。例如，所述组合物含有去毒的肺炎链球菌溶血素和PhtD和Sp130。
Pht（聚组氨酸三联体）家族包括蛋白PhtA、PhtB、PhtD和PhtE。该家族具有以下特征：脂质化序列；由脯氨酸富集区和几个组氨酸三联体分隔开的两个结构域，可能涉及金属或核苷的结合或酶活性；（3-5）卷曲螺旋区；保守的N-末端和异源的C末端。它存在于已检验的所有肺炎链球菌菌株中。同源蛋白已在其它链球菌和奈瑟氏球菌属中发现。在本发明的一个实施方案中，本发明的Pht蛋白为PhtD。然而，要理解的是，术语Pht A、B、D和E是指具有在以下引用文献中公开的序列的蛋白，以及其天然（和人工制备的）变体，所述变体与参比蛋白具有至少90%的序列同源性。任选地为至少95%相同或至少97%相同。
对于PhtX蛋白而言，PhtA在WO 98/18930中公开，也称作Sp36。如上所述，其是聚组氨酸三联体家族蛋白，并具有II型信号基序LXXC。PhtD在WO 00/37105中公开，也称为Sp036D。如上所述，它也是聚组氨酸三联体家族蛋白，并具有II型LXXC信号基序。PhtB在WO 00/37105中公开，也称为Sp036B。PhtB家族的另一成员是C3-降解多肽，在WO 00/17370中公开。该蛋白也来自聚组氨酸三联体家族（triad family），并具有II型LXXC信号基序。例如，免疫功能等效物为在WO 98/18930中公开的蛋白Sp42。PhtB截短物（约79 kD）在WO 99/15675中公开，它也被认为是PhtX家族成员。PhtE在WO 00/30299中公开，称作BVH-3。当本文提到任何Pht蛋白时，意味着可使用Pht蛋白的免疫原性片段或其融合体。例如，提到的PhtX包括来自任何Pht蛋白的免疫原性片段或其融合体。提到PhtD或PhtB也就提到了可见于例如WO 0198334的PhtDE或PhtBE。
肺炎链球菌溶血素是一种具有独特的溶细胞（溶血）作用和补体活化活性的多功能毒素（Rubins等, Am. Respi. Cit Care Med, 153: 1339-1346（1996））。该毒素不由肺炎链球菌分泌，而是在肺炎链球菌于自溶素影响下裂解时释放。其作用包括例如：刺激人体单核细胞产生炎性细胞因子，抑制人体呼吸上皮纤毛颤动，降低嗜中性粒细胞的杀菌活性和迁移性。肺炎链球菌溶血素最明显的作用在于红细胞裂解方面，该作用涉及与胆固醇结合。因为肺炎链球菌溶血素是一种毒素，因此在其可以体内给药前必须脱毒（即以适于保护的剂量提供时对人无毒）。在本领域已知野生型或天然肺炎链球菌溶血素的表达和克隆。参见例如Walker等（Infect Immun, 55:1184-1189（1987）），Mitchell等（Biochim Biophys Acta, 1007:67-72（1989）和Mitchell等（NAR, 18:4010（1990））。Ply的脱毒可以用化学方法进行，例如进行福尔马林或戊二醛处理或二者的组合（WO 04081515，PCT/EP2005/010258）。这些方法在本领域众所周知用于多种毒素。或者，ply可以用基因方法脱毒。因此，本发明包括肺炎链球菌蛋白衍生物，该衍生物可为例如突变蛋白。术语“突变的”在本文用于指已使用公知的定点诱变技术或任何其它常规方法缺失、增加或取代一个或多个氨基酸的分子。例如：如上所述，突变型ply蛋白可以被改变，以使其生物失活，但仍保持其致免疫表位，参见，例如，WO90/06951, Berry等人（Infect Immun, 67:981-985（1999））, WO99/03884和WO 10/71986。遗传地去毒的肺炎链球菌溶血素可以含有如在WO 10/71986中描述的在氨基酸65（苏氨酸）、293（甘氨酸）和/或428（半胱氨酸）处的点突变。
要理解的是，本文所用的术语“Ply”是指适于医用的突变或脱毒的（即无毒的）肺炎链球菌溶血素。
关于胆碱结合蛋白家族（CbpX），该家族的成员最初被鉴定为能用胆碱亲和层析纯化的肺炎链球菌蛋白。所有胆碱结合蛋白都非共价结合于细胞壁磷壁酸和膜结合脂磷壁酸的磷酸胆碱部分。虽然该蛋白质的确切性质（氨基酸序列、长度等）可以不同，但整个家族具有数个在结构上相同的区域。一般来说，胆碱结合蛋白包含N末端区（N）、保守重复区（R1和/或R2）、脯氨酸富集区（P）和保守的胆碱结合区（C），该胆碱结合区由多个重复序列组成，约占该蛋白的一半。本申请中所用的术语“胆碱结合蛋白家族（CbpX）”选自WO97/41151中所鉴定的胆碱结合蛋白、PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD和CbpG。CbpA公开于WO97/41151，CbpD和CbpG公开于WO00/29434，PspC公开于WO97/09994，PbcA公开于WO98/21337。SpsA为WO 98/39450中公开的胆碱结合蛋白。该胆碱结合蛋白任选地选自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。
本发明的一个实施方案包括CbpX截短物，其中“CbpX”在上文定义，“截短物”指缺少50%或更多的胆碱结合区（C）的CbpX蛋白。任选地，这样的蛋白质没有整个胆碱结合区。任选地，这样的蛋白截短物没有（i）胆碱结合区和（ii）该蛋白质的N末端一半的一部分，但至少保留一个重复区（R1或R2）。任选地，该截短物具有两个重复区（R1和R2）。这些实施方案的实例是在WO99/51266或WO99/51188中举例说明的NR1xR2和R1xR2，但是，其它没有相似的胆碱结合区的胆碱结合蛋白也包含在本发明的范围内。
LytX家族是与细胞裂解有关的膜结合蛋白。N末端结构域包含胆碱结合域，但是，LytX家族并不具有在上述CbpA家族中发现的所有特征，因此，对于本发明来说，LytX家族被认为不同于CbpX家族。与CbpX家族相比，LytX的C末端结构域包含LytX蛋白家族的催化域。该家族包含LytA、B和C。对于LytX家族而言，LytA公开于Ronda等, Eur J Biochem, 164:621-624（1987）。LytB公开于WO 98/18930，也被称为Sp46。LytC也公开于WO 98/18930，也被称为Sp91。本发明的实施方案包含LytC。
另一个实施方案包含LytX截短物，其中“LytX”在上文定义，“截短物”指没有50%或更多胆碱结合区的LytX蛋白。任选地，这样的蛋白质没有整个胆碱结合区。本发明的又一个实施方案包含CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白（或融合体）。任选地，该蛋白包含CbpX的NR1xR2（或R1xR2）和LytX的C末端部分（Cterm, 即没有胆碱结合域）（例如LytCCterm或Sp91Cterm）。任选地，CbpX选自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。任选地其为CbpA。任选地Lytx为LytC（也被称为Sp91）。本发明的另一个实施方案为PspA或PsaA截短物，其没有胆碱结合域（C），并与LytX一起表达为融合蛋白。任选地，LytX为LytC。
PsaA和PspA这二者在本领域都是已知的。例如，Berry和Paton, Infect Immun 1996年12月；64（12）:5255-62已描述了PsaA和其跨膜缺失变体。例如US5804193、WO 92/14488和WO 99/53940公开了PspA和其跨膜缺失变体。
Sp128和Sp130公开于WO00/76540。Sp125是带有细胞壁锚定基序LPXTG（其中X为任何氨基酸）的肺炎链球菌表面蛋白的实例。具有此基序的这类肺炎链球菌表面蛋白中的任何蛋白在本发明范围内都已被发现是有用的，因此将其视为本发明的另一种蛋白。Sp125本身公开于WO 98/18930，也称为ZmpB-锌金属蛋白酶。Sp101公开于WO 98/06734（其中它的索引为# y85993）。其特征为I型信号序列。Sp133公开于WO 98/06734（其中它的索引为# y85992）。其也以I型信号序列为特征。
可包含在联合疫苗（尤其是用于预防中耳炎的联合疫苗）中的粘膜炎莫拉菌（Moraxella catarrhalis）蛋白抗原的实例为：OMP106 [WO 97/41731 (Antex)和WO 96/34960 (PMC)]；OMP21或其片段(WO 0018910)；LbpA和/或LbpB [WO 98/55606 (PMC)]；TbpA和/或TbpB [WO 97/13785和WO 97/32980 (PMC)]；CopB [Helminen ME，等人(1993) Infect。Immun。61：2003-2010]；UspA1和/或UspA2 [WO 93/03761 (University of Texas)]；OmpCD；HasR (PCT/EP99/03824)；PilQ (PCT/EP99/03823)；OMP85 (PCT/EP00/01468)；lipo06 (GB 9917977.2)；lipo10 (GB 9918208.1)；lipo11 (GB 9918302.2)；lipo18 (GB 9918038.2)；P6 (PCT/EP99/03038)；D15 (PCT/EP99/03822)；OmplA1 (PCT/EP99/06781)；Hly3 (PCT/EP99/03257)；和OmpE。可包含在联合疫苗（尤其是用于预防中耳炎的联合疫苗）中的不可分型流感嗜血杆菌抗原或其片段的实例包括：丝束蛋白[(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)]和含有来自它的肽的融合体[例如LB1(f)肽融合体；US 5843464 (OSU)或WO 99/64067]；OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)]；P6 [EP 281673 (State University of New York)]；TbpA和/或TbpB；Hia；Hsf；Hin47；Hif；Hmw1；Hmw2；Hmw3；Hmw4；Hap；D15 (WO 94/12641)；P2；和P5 (WO 94/26304)。
本发明的蛋白也可以进行有益的组合。所述组合的是指免疫原性组合物包含来自以下组合中的所有蛋白，其或者为载体蛋白，或者为游离蛋白，或者为二者的混合物。例如，在后文陈述的两种蛋白的组合中，两种蛋白都可以用作载体蛋白，或者两种蛋白都可以作为游离蛋白存在，或者两种蛋白都可以作为载体蛋白和游离蛋白存在，或者一个可作为载体蛋白和游离蛋白存在，而另一个仅作为载体蛋白或仅作为游离蛋白存在。当给出3种蛋白的组合时，存在类似的可能性。组合包括但不限于：PhtD＋NR1xR2、PhtD＋NR1xR2-Sp91Cterm嵌合蛋白或融合蛋白、PhtD＋Ply、PhtD＋Sp128、PhtD＋PsaA、PhtD＋PspA、PhtA＋NR1xR2、PhtA＋NR1xR2-Sp91Cterm嵌合蛋白或融合蛋白、PhtA＋Ply、PhtA＋Sp128、PhtA＋PsaA、PhtA＋PspA、NR1xR2＋LytC、NR1xR2＋PspA、NR1xR2＋PsaA、NR1xR2＋Sp128、R1xR2＋LytC、R1xR2＋PspA、R1xR2＋PsaA、R1xR2＋Sp128、R1xR2＋PhtD、R1xR2＋PhtA。任选地，NR1xR2（或R1xR2）来自CbpA或PspC。任选地，其来自CbpA。其它组合包括3种蛋白组合，例如PhtD＋NR1xR2＋Ply以及PhtA＋NR1xR2＋PhtD。在一个实施方案中，疫苗组合物包含解毒的肺炎链球菌溶血素以及PhtD或PhtDE作为载体蛋白。在又一个实施方案中，疫苗组合物包含解毒的肺炎链球菌溶血素以及PhtD或PhtDE作为游离蛋白。
本发明还提供含有本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂的疫苗。
本发明的疫苗可被佐剂化，尤其是在计划用于老年人群而且用于婴儿人群时。适宜的佐剂包括铝盐，例如氢氧化铝凝胶或磷酸铝或明矾，而且可以为其它金属盐，例如钙盐、镁盐、铁盐或锌盐，或者可为酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生化糖或聚磷腈的不溶性混悬液。
任选地选择为TH1型应答的优先诱导物的佐剂。这些高水平的Th1型细胞因子倾向于支持诱导针对给定抗原的细胞介导的免疫应答，而高水平的Th2型细胞因子倾向于支持诱导针对抗原的体液免疫应答。
Th1和Th2型免疫应答的区别不是绝对的。实际上，个体将支持被描述为以Th1为主或以Th2为主的免疫应答。然而，经常便利地根据Mosmann和Coffman在鼠CD4 +ve T细胞克隆中所描述的（Mosmann, T.R.和Coffman, R.L. （1989）TH1 and Th2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. （Annual Review of Immunology, 7, 145-173页）考虑细胞因子家族。传统上，Th1型应答与T淋巴细胞生产INF-γ和IL-2细胞因子有关。经常与Th1型免疫应答的诱导直接相关的其它细胞因子不由T细胞产生，例如IL-12。相比之下，Th2型应答与Il-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌有关。主要促进Th1应答的适宜佐剂系统包括：单磷酰脂质A或其衍生物（或通常为解毒的脂质A–参见例如WO2005107798），尤其是3-脱-O-酰化单磷酰脂质A（3D-MPL）（关于其制备参见GB 2220211 A）；以及单磷酰脂质A、任选的3-脱-O-酰化单磷酰脂质A连同铝盐（例如磷酸铝或氢氧化铝）或水包油乳剂的组合。在这些组合中，抗原和3D-MPL包含在相同的颗粒结构中，允许更有效地传递抗原性和免疫刺激性信号。研究表明，3D-MPL能够进一步增强明矾吸附抗原的免疫原性[Thoelen等, Vaccine（1998）16:708-14；EP 689454-B1]。
增强的系统包括单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合，尤其是如在WO 94/00153中公开的QS21和3D-MPL的组合，或者如在WO 96/33739中公开的较少反应原性的组合物，其中QS21用胆固醇猝灭。在WO 95/17210中描述了一种特别有效的佐剂制剂，其包含在水包油乳剂中的QS21、3D-MPL和生育酚。在一个实施方案中，免疫原性组合物另外含有皂苷，其可为QS21。制剂还可以包含水包油乳剂和生育酚（WO 95/17210）。含有寡核苷酸的未甲基化CpG（WO 96/02555）和其它免疫调节性寡核苷酸（WO0226757和WO03507822）也是TH1应答的优先诱导物，适用于本发明。
通过将含有本发明的免疫原性组合物的疫苗制备物经全身或粘膜途径给药，所述疫苗制备物可用于保护或治疗易于感染的哺乳动物。这些给药可包括经肌肉内（IM）、腹膜内（IP）、真皮内（ID）或皮下（SC）途径注射；或经粘膜施用至口/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。疫苗的鼻内（IN）施用可能用于治疗肺炎或中耳炎（由于能更有效地阻止肺炎链球菌的鼻咽携带，因此能在其最早期减弱感染）。尽管本发明的疫苗可作为单次剂量施用，但其组分也可以同时或在不同时间一起共施用（例如肺炎链球菌糖缀合物可单独施用、同时施用，或在施用疫苗的任何细菌蛋白组分之后1-2周施用，用于彼此之间免疫应答的最佳协调）。对于共施用，任选的Th1佐剂可存在于任意的或全部的不同给药中。除了单一给药途径之外，还可使用2种不同的给药途径。例如，可IM（或ID）施用糖或糖缀合物，可IN（或ID）施用细菌蛋白。另外，本发明的疫苗可IM施用初次剂量，IN施用加强剂量。
疫苗中的蛋白抗原的含量通常在1-100μg的范围内，任选地5-50μg，例如在5-25μg的范围内。在初始接种后，受试者可接受1次或数次足够间隔的加强免疫。
疫苗制剂一般描述于Vaccine Design（“The subunit and adjuvant approach”（Powell M.F.和Newman M.J.编辑）（1995）Plenum Press New York）。在脂质体中的囊化描述于Fullerton, 美国专利4,235,877。
本发明的疫苗或免疫原性组合物可储存在溶液中，或低压冻干。在一个实施方案中，溶液在用作无定形冻干保护剂的糖存在下冻干，所述糖例如为蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖或乳糖。在一个实施方案中，溶液在用作无定形冻干保护剂的糖和提供改善的块状结构的填充剂（例如甘氨酸或甘露醇）存在下冻干。晶体填充剂的存在允许在高盐浓度存在下缩短冻干周期。用于冻干本发明的免疫原性组合物或疫苗的这些混合物的实例包括蔗糖/甘氨酸、海藻糖/甘氨酸、葡萄糖/甘氨酸、甘露糖/甘氨酸、麦芽糖/甘氨酸、蔗糖/甘露醇/ 海藻糖/甘露醇、葡萄糖/甘露醇、甘露糖/甘露醇和麦芽糖/甘露醇。典型地，两种成分的摩尔比率任选地为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5或1:6。本发明的免疫原性组合物任选地含有上述冻干试剂。
上述稳定剂和稳定剂的混合物还可以包括能够增加制剂的玻璃化温度（Tg’）的聚合物，例如聚（乙烯吡咯烷酮）（PVP）、羟乙基淀粉或葡聚糖，或者用作晶体填充剂的聚合物，例如聚乙二醇（PEG），例如具有1500-6000分子量的聚乙二醇，和葡聚糖。
本发明的免疫原性组合物任选地被冻干，并在使用前临时重配。冻干可产生更稳定的组合物（疫苗），并在存在3D-MPL和没有基于铝的佐剂的情况下可能产生更高的抗体效价。
在本发明的一个方面，提供一种疫苗试剂盒，其包括含有本发明的免疫原性组合物（任选地为冻干形式）的小瓶，并还包括含有本文所述佐剂的小瓶。可预见的是，在本发明的该方面，佐剂将用于重配冻干的免疫原性组合物。
本发明还通过加入缀合形式的流感嗜血杆菌蛋白（例如蛋白D）来提供用于预防或减轻流感嗜血杆菌所致中耳炎的改良疫苗。另外，本发明还通过依靠向本发明的肺炎链球菌缀合组合物加入为游离或缀合蛋白的一种或两种肺炎链球菌蛋白提供在婴儿中预防或减轻肺炎链球菌感染（例如中耳炎）的改良疫苗。所述肺炎链球菌游离蛋白可与用作载体蛋白的任何肺炎链球菌蛋白相同或不同。一种或多种粘膜炎莫拉菌（Moraxella catarrhalis）蛋白抗原也可以游离或缀合形式包含在联合疫苗中。因此，本发明为在婴儿中激发抵御中耳炎的（保护性）免疫应答的改良方法。
在另一个实施方案中，本发明为通过施用安全有效量的本发明疫苗[儿科疫苗]在婴儿（在本发明背景下定义为0-2岁）中激发（保护性）免疫应答的改良方法。此外，本发明的实施方案包括提供用于药物的本发明的抗原性肺炎链球菌缀合组合物以及本发明的肺炎链球菌缀合物在制造用于预防（或治疗）肺炎链球菌疾病的药物中的用途。
在又一个实施方案中，本发明为通过施用安全有效量的本发明疫苗，任选地连同一种或两种作为游离或缀合蛋白存在的肺炎链球菌蛋白，在老年人群（在本发明背景下患者如果为50岁或以上、通常超过55岁以及更通常超过60岁，则被视为老年人）中激发（保护性）免疫应答的改良方法，所述游离的肺炎链球菌蛋白可与用作载体蛋白的任何肺炎链球菌蛋白相同或不同。
本发明的又一方面是免疫人类宿主抵御肺炎链球菌和任选的流感嗜血杆菌感染所致疾病的方法，所述方法包括：给所述宿主施用免疫保护剂量的本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒。
本发明的又一方面是用于治疗或预防肺炎链球菌和任选的流感嗜血杆菌感染所致疾病的免疫原性组合物。
本发明的又一方面是本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒在制造药物中的用途，所述药物用于治疗或预防肺炎链球菌和任选的流感嗜血杆菌感染所致疾病。
在所有情况下，本发明人都意欲用术语“由……组成”分别任选地取代本文的术语“包含”、“含有”和“包括”。
本文的涉及本发明的“疫苗组合物”的实施方案也适用于与本发明的“免疫原性组合物”相关的实施方案，反之亦然。
在本专利说明书中提及的所有参考文献或专利申请都通过引用结合到本文中。
为了可更好地理解本发明，提供以下实施例。这些实施例仅是为了例证目的，不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1. 缀合方法
通过与在WO 06/110381中公开的方法类似的还原胺化方法，使每种血清型多糖与CRM197载体蛋白缀合，制备出构成7价Prevnar疫苗的肺炎球菌缀合物。都与CRM197缀合的肺炎球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F存在于7vCRM疫苗中。
Synflorix含有与7vCRM相同的血清型以及额外的血清型1、5和7F。血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F多糖与来自无法分型的流感嗜血杆菌的蛋白D缀合，18C多糖与破伤风类毒素缀合，19F多糖与白喉类毒素缀合。所述缀合反应使用氰基化试剂CDAP，且基本上如WO 09/00824所述。
如下经由ADH接头缀合血清型18C：使用碳二亚胺化学法（EDAC），用ADH活化破伤风类毒素，并使用CDAP化学法，使多糖18C与TT-ADH偶联。所述反应基本上如WO 09/00824所述。
实施例1a通过CDAP来缀合肺炎链球菌血清型23
将200mg微流化的PS23F溶解于水中，直到得到10mg/ml的浓度。以2M的终浓度，将NaCl加入该溶液中。
加入足够的CDAP溶液（100mg/ml，在5/50 v/v乙腈/WFI中新制备），以达到0.75mg/mg PS的CDAP:PS比。
90秒以后，通过加入0.1M NaOH，使pH升高至pH 9.5。
3分钟以后，加入足够的CRM197（10mg/ml，在0.15M NaCL中），以达到1.5的比例（CRM197:PS（w/w）），使pH维持在pH 9.5。在pH 9.5，温育该溶液1小时。
在该偶联步骤以后，将10ml 2M甘氨酸溶液加入混合物中，并将pH调至pH9.0（猝灭pH）。将所述溶液在室温搅拌30分钟。使用5 μm过滤器纯化缀合物，随后使用Sephacryl S400HR（XK50/100）去除小分子和未缀合的多糖和蛋白。流速固定在150ml/小时。使用150mM NaCl进行洗脱。合并目标级分，并使用Milipack 20进行过滤。得到的缀合物具有1.35/1（w/w）的最终CRM197/PS比例（w/w）。
实施例2. 对比7vCRM197（Prevnar）和PHiD-CV（Synflorix）疫苗的临床试验数据
对比了由7vCRM197和PHiD-CV引起的针对肺炎链球菌19F和19A的免疫应答。两种疫苗都含有19F缀合物，在7vCRM197中，其通过还原胺化与无毒的白喉毒素CRM197缀合，在PHiD-CV中，其使用氰基化试剂CDAP与白喉类毒素缀合。任一种疫苗都不含有19A缀合物，但是，19A和19F之间的结构相似性允许在用19F免疫以后产生一些针对19A的交叉反应性的抗体。
血清样品
评论了来自3个激发免疫接种研究（001、011和012）8-10的数据，所述研究对比了在3剂量激发系列（激发研究细节参见表1）中施用给婴儿的7vCRM和PHiD-CV。还分析了与每个激发研究有关的强化研究数据（0078、0179和018）（强化研究细节参见表2）。
在所有研究中，在第3剂以后1个月（激发研究）和强化剂量以后1个月（强化研究），收集血液样品。
免疫学试验
使用由GSK Biologicals开发的包括22F-预温育步骤的ELISA（GSK-22F-ELISA），评价了针对血清型19F和有关的血清型19A的抗体应答，其中加入异源的血清型22F多糖，以去除非血清型特异性的和非调理素的抗体6,7。
22F-抑制ELISA的试验灵敏度是0.05μg/mL IgG。
使用GSK和THL OPA试验，评价了功能性抗体应答，所述试验使用改进的HL-60细胞WHO参照方法2,4。
将OPA滴度定义为，与对照孔相比，诱导≥50% 细菌细胞死亡的最低血清稀释度的倒数，并使用≥8的滴度（1:8的血清稀释度）作为该试验的阈值2,4。
另外，将具有≥2.0μg/mL的针对血清型19F（来自David Goldblatt博士, Institute of Child Health, UK）的抗体浓度且来自未免疫的健康成年人（来自国立卫生研究院（National Institutes of Health）血库, Bethesda, Maryland）的血清用于不同形式的血清型19F抗原（未缀合的天然多糖，和使用还原胺化和氰基化缀合的19F）的结合和抑制。
统计分析
以95% 置信区间，计算具有≥0.2μg/mL的ELISA IgG抗体浓度的血清样品的百分比，和具有≥8的OPA滴度的血清样品的百分比。
计算几何平均OPA滴度（GMT）和几何平均OPA/ELISA比（GMR），以便评价与单独的抗体滴度相对比的功能活性。
桥连GSK和THL OPA试验，以评估在不同实验室中的OPA应答的变异性水平。
结果
对于共709个用PHiD-CV激发的婴儿和331个用7vCRM激发的婴儿（表1），和对于共690个用PHiD-CV强化的婴儿和292个用7vCRM强化的婴儿（表2），可得到至少一种血清型（19A或19F）的数据。
免疫原性
血清型19F - 激发免疫接种
在3个激发研究中，87.7-99.3% 的接受PHiD-CV的婴儿实现了≥8的针对血清型19F的OPA滴度，与此相比的是，91.3-92.1% 的接受7vCRM的婴儿（图2）。
在接受PHiD-CV的婴儿中，血清型19F的OPA GMT和OPA/ELISA GMR更高（表1）。
血清型19F - 强化疫苗接种
在强化研究中，在94.9-100.0%的接受PHiD-CV的婴儿中实现了≥8的针对血清型19F的OPA滴度，与此相比的是，92.5-98.5% 的接受7vCRM的婴儿（图2）。
在接受PHiD-CV的婴儿中，血清型19F的OPA GMT更高，且就两种疫苗而言，OPA/ELISA GMR是在相同范围内（表2）。
血清型19A - 激发免疫接种
在19.6-28.7%的接受PHiD-CV的婴儿中实现了≥8的针对交叉反应性血清型19A的OPA滴度，与此相比的是，0.0-3.4%的接受7vCRM的婴儿（图3）。
在接受PHiD-CV的婴儿中，血清型19A的OPA GMT更高（表1）。
血清型19A - 强化疫苗接种
在37.7-69.2%的接受PHiD-CV的婴儿中实现了≥8的针对交叉反应性血清型19A的OPA滴度，与此相比的是，24.0-37.5% 的接受7vCRM的婴儿（图3）。
在接受PHiD-CV的婴儿中，血清型19A的OPA GMT通常更高（表2）。
桥连OPA试验
当在桥连研究中评估时，GSK和THL之间的19F OPA结果是相当的，而在GSK处的19A OPA试验似乎会低估应答。
在THL，高比例的19F-缀合物免疫的儿童被证实是19A OPA血清阳性的，而在GSK处是血清阴性的。
结论
通过OPA试验测得，与含有通过还原胺化制备的19F-CRM197的7vCRM疫苗接种相比，PHiD-CV（含有经由氰基化缀合化学法制备的19F-DT）会诱导更高水平的针对血清型19F的功能抗体。
使用氰基化缀合实现的针对血清型19F的更高OPA应答，也导致PHiD-CV与7vCRM相比提高的针对交叉反应性血清型19A的OPA应答。
桥连数据提示，GSK 19A OPA试验会低估血清型19A OPA应答。
实施例3 -使用高碘酸盐氧化23F和6B
将多糖（PS）23F或6B溶解于100mM KH2PO4（pH 7.4）、10mM KH2PO4或WFI中，以形成2mg PS/ml的溶液。在搅拌下在室温温育所述溶液2小时。该时间以后，用1MHCl将pH调至pH 6.0。以不同的量加入粉末或液体形式（10mg/ml，在WFI中）的高碘酸盐，以实现一系列摩尔比（表3）。在室温（20-25℃）温育所述溶液17小时，此时间以后，在WFI中透析或渗滤所述样品。
使用与折射率和多角度激光散射（MALLS-Dawn EOS）检测器偶联的高效凝胶过滤色谱法，测量分子量和样品浓度（使用Zimm模型）。使用尺寸排阻介质（TSK5000PWXL-Tosoh）来描绘多糖的分子尺寸分布（在NaCl 0.2M-NaN3 0.02%中，0.5ml/min洗脱）。
表3和图4描述了这些实验的结果。它们证实，就23F糖而言，使用在100mM磷酸盐缓冲液中的高摩尔当量的高碘酸盐进行氧化时，发生大量的尺寸调整。通过降低磷酸盐缓冲液浓度或使用的高碘酸盐的摩尔当量，可以减小该尺寸调整效应。
表3:
还原胺化
将1g PS23F溶解于500ml 10mM KH2PO4（pH 7.15）中。在室温温育该溶液2小时。用1M HCl调节pH至6.0M。将111mg高碘酸盐（NaIO4, 0.4摩尔当量的高碘酸盐）加入PS23F溶液中，将该溶液在暗处在室温温育17小时，以氧化PS23F。然后在WFI中渗滤该溶液（Pellicon 2, 1000cm2）。
在有3% 蔗糖（w/v）存在下，与CRM197蛋白一起冻干氧化的PS23F（以CRM/PS比（w/w）: 0.625）。
通过加入350ml DMSO溶剂，溶解900mg冻干的PS23F/CRM197混合物，并在20℃温育2小时。为了还原PS23F/CRM197混合物，加入1摩尔当量的NaBH3CN（735 μl在WFI中的100mg/ml溶液）。将该溶液在室温在搅拌下温育另外40小时。该时间以后，加入2摩尔当量的NaBH4（100mg/ml在WFI中），并将该溶液在室温温育4小时。加入2200ml 150mM NaCl，然后渗滤（截止值100kDa），并通过DEAE（XK50）进行纯化。合并目标级分，并通过0.22 μm过滤器过滤。
实施例4–使用还原胺化缀合的PS23F-CRM缀合物与使用CDAP化学法缀合的PS23F-CRM缀合物的免疫原性对比
在豚鼠模型中测量的免疫原性
使用0.25 μg PS23F-CRM197缀合物，肌肉内地免疫雌性豚鼠3次（在第0、14和28天）。在第42天，给动物抽血，并通过ELISA和OPA测量针对PS23F的抗体应答。结果显示在图5中。
与通过CDAP化学法缀合的PS23F-CRM197相比，在用通过还原胺化缀合的PS23F-CRM197免疫以后，在豚鼠中诱导了明显更高的抗体应答，如图5所示。
实施例5 -  使用还原胺化缀合的PS6B-CRM缀合物与使用CDAP化学法缀合的PS6B-CRM或PS6B-PD缀合物的免疫原性对比
临床前研究：
在第0、14和28天，使用在AlPO4上配制的通过还原胺化或CDAP化学法生产的0.1μg PS6B缀合物，肌肉内地免疫一组40只雌性Balb/c小鼠（4周龄）3次。使用PS6B-PD作为基准。在第42天，给小鼠抽血，并通过ELISA和OPA测量针对每种抗原的抗体应答。
在第0、14和28天，使用在AlPO4上配制的通过还原胺化或CDAP化学法生产的0.25μg PS6B缀合物，肌肉内地免疫一组20只雌性豚鼠（150克，来自Hartley）3次。使用PS6B-PD作为基准。在第42天，给豚鼠抽血，并通过ELISA和OPA测量针对每种抗原的抗体应答。
使用通过还原胺化制备的PS6B-CRM的4种不同的缀合物和使用CDAP制备的一种缀合物。将所述多糖微流化成2种不同的分子量。所述缀合物的性质是：
缀合物                                     PS大小               CRM/PS比（w/w）
PS06B-CRM 122                     84kDa                  1.09/1
PS06B-CRM 123                     84kDa                  3/1
PS06B-CRM 124                     350kDa                1.6/1
PS06B-CRM  125                  350kDa                2.9/1
小鼠和豚鼠OPA
将血清样品在56℃加热45 min，以灭活任何残余的内源补体。在96-孔圆底微量滴定板的每个孔内的25μl OPA缓冲液（HBSS- 14.4%灭活的FBS）中，将每个1:2稀释的血清样品的25微升等分试样进行2倍系列稀释。随后，将25μl活化的HL-60细胞（1×107细胞/ml）、新鲜融化的肺炎球菌工作种子和新鲜融化的幼兔补体的混合物（例如以4/2/1比例（v/v/v））加入稀释的血清中，以产生50μl的终体积。在定轨摇动（210 rpm）下将试验板在37℃温育2 h，以促进吞噬过程。通过将微量培养板放置在冰上至少1 min，停止反应。然后将所述板的每个孔的20μl等分试样转移进96-孔平底微量培养板的对应孔中，并将50μl Todd-Hewitt Broth-0.9%琼脂加入每个孔中。在37℃和5% CO2下温育过夜以后，使用自动化的图像分析系统（KS 400, Zeiss, Oberkochen，德国），计数在琼脂中出现的肺炎球菌菌落。使用8个没有血清样品的孔作为细菌对照，以测定每个孔的肺炎球菌的数目。确定对照孔的CFU的平均数，并用于计算每个血清样品的杀死活性。通过能够促进50%肺炎球菌杀死的血清稀释度的倒数，确定血清样品的OPA滴度。使用4-参数曲线拟合分析，计算调理吞噬滴度。

Claims (22)

1.一种包含10-13种不同肺炎链球菌荚膜糖的免疫原性组合物，其中选自由血清型1和19F的肺炎链球菌荚膜糖组成的第一组的一种或多种通过CDAP化学法直接地或间接地与蛋白载体相连，以及选自由血清型6B和23F的肺炎链球菌荚膜糖组成的第二组的一种或多种不同的糖通过还原胺化与蛋白载体相连，其中所述组合物包含与流感嗜血杆菌蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖1、与流感嗜血杆菌蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖4、与流感嗜血杆菌蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖5、与流感嗜血杆菌蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖6B、与流感嗜血杆菌蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖7F、与流感嗜血杆菌蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖9V、与流感嗜血杆菌蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖14、与流感嗜血杆菌蛋白D或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖23F、与破伤风类毒素或CRM197缀合的肺炎链球菌荚膜糖18C。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其包含通过除了还原胺化以外的化学法与蛋白载体缀合的来自血清型1的肺炎链球菌荚膜糖。
3.根据权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述来自血清型1的肺炎链球菌荚膜糖通过CDAP化学法与蛋白载体缀合。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的免疫原性组合物，其包含通过除了还原胺化以外的化学法与蛋白载体缀合的来自血清型19A的肺炎链球菌荚膜糖。
5.根据权利要求4所述的免疫原性组合物，其中所述来自血清型19A的肺炎链球菌荚膜糖通过氰基化化学法与蛋白载体缀合。
6.根据权利要求1-2中任一项所述的免疫原性组合物，其包含通过除了还原胺化以外的化学法与蛋白载体缀合的来自血清型19F的肺炎链球菌荚膜糖。
7.根据权利要求6所述的免疫原性组合物，其中所述来自血清型19F的肺炎链球菌荚膜糖通过CDAP化学法与蛋白载体缀合。
8.根据权利要求1-2中任一项所述的免疫原性组合物，其包含通过还原胺化与蛋白载体缀合的来自血清型4的肺炎链球菌荚膜糖。
9.根据权利要求1-2中任一项所述的免疫原性组合物，其包含通过还原胺化与蛋白载体缀合的来自血清型5的肺炎链球菌荚膜糖。
10.根据权利要求1-2中任一项所述的免疫原性组合物，其包含通过还原胺化与蛋白载体缀合的来自血清型6A的肺炎链球菌荚膜糖。
11.根据权利要求1-2中任一项所述的免疫原性组合物，其包含通过还原胺化与蛋白载体缀合的来自血清型6B的肺炎链球菌荚膜糖。
12.根据权利要求1-2中任一项所述的免疫原性组合物，其包含通过还原胺化与蛋白载体缀合的来自血清型7F的肺炎链球菌荚膜糖。
13.根据权利要求1-2中任一项所述的免疫原性组合物，其包含通过还原胺化与蛋白载体缀合的来自血清型9V的肺炎链球菌荚膜糖。
14.根据权利要求1-2中任一项所述的免疫原性组合物，其包含通过还原胺化与蛋白载体缀合的来自血清型14的肺炎链球菌荚膜糖。
15.根据权利要求1-2中任一项所述的免疫原性组合物，其包含通过还原胺化与蛋白载体缀合的来自血清型18C的肺炎链球菌荚膜糖。
16.根据权利要求1-2中任一项所述的免疫原性组合物，其包含通过还原胺化与蛋白载体缀合的来自血清型23F的肺炎链球菌荚膜糖。
17.根据权利要求1-2中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白选自：破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、流感嗜血杆菌蛋白D、肺炎链球菌溶血素和PhtD。
18.根据权利要求1-2中任一项所述的免疫原性组合物，其另外包含一种或多种未缀合的或缀合的肺炎链球菌蛋白。
19.根据权利要求18所述的免疫原性组合物，其中所述一种或多种肺炎链球菌蛋白选自：聚组氨酸三联体家族（PhtX）、胆碱结合蛋白家族（CbpX）、CbpX、LytX家族、LytX、CbpX -LytX嵌合蛋白、去毒的肺炎链球菌溶血素（Ply）、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125和Sp133。
20.根据权利要求1-2中任一项所述的免疫原性组合物，其另外包含佐剂。
21.根据权利要求1-2所述的免疫原性组合物，其用于治疗或预防由肺炎链球菌感染造成的疾病。
22.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中肺炎链球菌荚膜糖1如Synflorix中缀合至流感嗜血杆菌蛋白D，肺炎链球菌荚膜糖4如Synflorix中缀合至流感嗜血杆菌蛋白D，肺炎链球菌荚膜糖5如Synflorix中缀合至流感嗜血杆菌蛋白D，肺炎链球菌荚膜糖6B如Synflorix中缀合至流感嗜血杆菌蛋白D，肺炎链球菌荚膜糖7F如Synflorix中缀合至流感嗜血杆菌蛋白D，肺炎链球菌荚膜糖9V如Synflorix中缀合至流感嗜血杆菌蛋白D，肺炎链球菌荚膜糖14如Synflorix中缀合至流感嗜血杆菌蛋白D，且肺炎链球菌荚膜糖23F如Synflorix中缀合至流感嗜血杆菌蛋白D。
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