KR20130017825A - 참그물바탕말을 이용한 피부 외용제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 참그물바탕말을 이용한 피부 외용제 조성물을 개시한다. 구체적으로 본 발명은 피부 세균인 스타필로코쿠스 아우레우스, 스타필로코쿠스 에피더미디스 및 프로피오니박테리움 아크네에 대해 항균 활성을 갖고 섬유아세포의 콜라겐 생성 촉진 활성을 가지며 나아가 자외선 차단 활성을 가진 참그물바탕말을 이용한 피부 외용제 조성물을 개시한다.

Description

참그물바탕말을 이용한 피부 외용제 조성물{Composition for External Application to the Skin Using an Extract of Dictyota dichotoma}

본 발명은 참그물바탕말(Dictyota dichotoma)을 이용한 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 피부 세균들에 대해 항균 활성을 갖고 섬유아세포의 콜라겐 생성 촉진 활성을 가지며 나아가 자외선 차단 활성을 가진 참그물바탕말을 이용한 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

인간의 피부는 주위환경과 직접 접촉하는 기관으로서 각종 피부 질환에 관여하는 세균, 곰팡이 등의 감염이 쉽게 일어난다. 예컨대 피부에 화농을 일으키는 황색포도상구균인 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 비롯하여 피부 상재균인 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphyococcus epidermidis), 여드름균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 등이 피부에 존재하며, 이 균들은 피부상에 분비된 피지나 땀을 분해시켜 냄새를 발생시키며, 이와 더불어 그 분해 산물들은 피부에 자극을 주고 염증을 발생시킨다.

또한 인간의 피부는 바람, 온도, 습도, 담배연기, 공해 등의 환경오염, 자외선 등이 직접적인 영향을 받는다. 바람, 온도, 습도, 담배연기, 공해 등의 환경오염, 자외선 등은 피부 주름을 일으키는 외재적 요인으로 알려져 있다(Free radical Biol. & Med . 26:174-183, 1999). 이 중 특히 자외선은 피부 주름뿐만 아니라 홍반, 부종, 멜라닌 합성 촉진, 피부암 등도 일으킨다고 알려져 있다.

인간의 피부는 표피층, 진피층 및 피하지방층으로 이루어져 있는데, 이 중 표피층은 피부 밖으로 수분과 전해질이 소실되는 것을 억제함으로써 피부의 건조를 막고 피부의 정상적인 생화학적 대사를 할 수 있는 환경을 제공하며, 진피층은 섬유아세포 등에 의해서 생성된 콜라겐, 엘라스틴, 프로테오글리칸 등이 세포외 기질(extracellular matrix)을 이루어 피부 탄력을 형성한다. 특히 콜라겐은 진피층의 90% 이상을 구성하고 있어, 자외선, 스트레스, 활성 산소 등에 의하여 그것이 파괴되면, 피부 탄력성이 감소하고 피부 주름이 발생하게 된다(Arch Dermatol. 1989;125(8):1150). 또한 콜라겐은 자체 수분 보유력을 가지기 때문에 콜라겐이 파괴되면 피부는 건조하고 거칠어지게 된다(J Ginseng Res 31(2):86-92, 2007; Toxicol Appl Pharmacol 195: 298-308, 2004).

본 발명은 피부 세균들에 대해 항균 활성을 갖고 섬유아세포의 콜라겐 생성 촉진 활성을 가지며 나아가 자외선 차단 활성을 가진 참그물바탕말을 이용한 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명의 목적은 참그물바탕말 추출물을 이용한 항균성 피부 외용제 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 참그물바탕말 추출물을 이용한 피부 주름 개선용 피부 외용제 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 참그물바탕말 추출물을 이용한 자외선 차단용 피부 외용제 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

일 측면에 있어서, 본 발명은 참그물바탕말 추출물을 이용한 항균성 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 참그물바탕말의 에탄올 수용액 추출물(80%(v/v) 에탄올)을 제조함과 함께 그것의 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 부탄올의 순차적 분획물을 제조하고, 그 추출물과 순차적 분획물의 피부 미생물들 즉 황색포도상구균인 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus KCTC 1927), 스타필로코커스 에피더미디스(S. epidermidis SK4와, 항생제 내성균인 S. epidermidis SK9 및 S. epidermidis SK19), 및 프로피오니박테리움 아크네스(P. acnes ATCC 3314와 항생제 내성균인 P. acnes SKA7 포함)에 대한 항균 활성을 원판 확산법(Disc diffusion assay) 및 최소억제농도(Minimum inhibitory concentration, MIC)로 평가하였다.

그 결과, 처리 농도가 1 mg/ml인 원판 확산법에 의한 항균 활성 평가 결과에 있어서는, 에탄올 수용액 추출물은 P. acnes ATCC 3314를 제외한 모든 피부 미생물에 대해서 항균 활성을 보였고 헥산 분획물 및 디클로메탄 분획물은 항생제 내성균을 포함한 모든 피부 미생물들에 대해서 항균 활성을 보였으며, 에틸아세테이트 분획물은 P. acnes ATCC 3314와 항생제 내성균인 P. acnes SKA7에 대해서 항균 활성을 나타내었다.

또 최소억제농도에 의한 항균 활성 평가 결과에 있어서는, 에탄올 수용액 추출물은 P. acnes ATCC 3314를 제외한 모든 피부 미생물들에 대해서는 1 내지 2 mg/ml 범위에서 최소 억제 농도를 나타내었으며, 헥산 분획물과 디클로메탄 분획물은 모든 피부 미생물에 대해서 0.25 내지 2 mg/ml 범위에서 최소억제농도를 나타내었고, 에틸아세테이트 분획물은 P. acnes ATCC 3314와 항생제 내성균인 P. acnes SKA7에 대해서 0.5 mg/ml 범위에서 최소억제농도를 나타내었다.

상기 실험 결과는 참그물바탕말의 에탄올 수용액 추출물과, 순차적 분획물 중에서 헥산 분획물과 디클로메탄 분획물이 피부 미생물에 대해서 항균 용도로 사용될 수 있음을 보여주는 것이라 할 수 있으며, 에틸아세테이트 분획물의 경우는 여드름균인 P. acnes에 대해서 항균 용도로 유용하게 사용될 수 있음을 보여주는 것이라 할 수 있다.

본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 완성된 것으로서, 본 발명의 항균성 피부 외용제 조성물은 참그물바탕말의 에탄올 수용액 추출물, 그 에탄올 수용액 추출물의 헥산 분획물, 그 에탄올 수용액 추출물의 디클로메탄 분획물 및/또는 그 에탄올 수용액 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.

본 명세서에서, "참그물바탕말 에탄올 수용액 추출물"은 참그물바탕말을 에탄올 수용액(에탄올과 물의 혼합 용매임)에 침지시켜 얻어진 추출물을 의미한다. 참그물바탕말을 에탄올 수용액에 침지시겨 얻는 한, 추출 방법은 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사 등 임의의 추출 방법이 모두 적용될 수 있다.

또 본 명세서에서, "참그물바탕말 에탄올 수용액 추출물의 헥산 분획물"은 상기 참그물바탕말의 에탄올 수용액 추출물을 헥산과 혼합하고 정치시켜 얻어진 헥산층의 분획물 또는 추출 용매가 제거된 고형상의 참그물바탕말 에탄올 수용액 추출물을 물에 현탁하고 이를 헥산과 혼합하고 정치시켜 얻어진 분획물을 의미한다.

또 본 명세서에서, "참그물바탕말 에탄올 수용액 추출물의 디클로메탄 분획물"은 상기 참그물바탕말 에탄올 수용액 추출물을 디클로메탄과 혼합하고 정치시켜 얻어진 분획물, 추출 용매가 제거된 고형상의 참그물바탕말 에탄올 수용액 추출물을 물에 현탁한 후 이를 디클로메탄과 혼합하고 정치시켜 얻어진 분획물, 또는 상기 고형상의 참그물바탕말 에탄올 수용액 추출물을 물에 현탁하고 이를 헥산 및 디클로메탄으로 순차적으로 분획하여 얻은 디클로메탄층의 분획물을 의미한다. 여기서 "헥산과 디클로메탄으로 순차적으로 분획한다"는 의미는 고형상의 참그물바탕말 에탄올 수용액 추출물을 물에 현탁하고 이를 헥산과 혼합하고 정치시킨 후 헥산층의 분획물을 제외한 잔여층인 물층을 사용하여 디클로메탄과 혼합·정치시켜 분획한다는 의미이다.

또 본 명세서에서, "참그물바탕말 에탄올 수용액 추출물의 에틸아세테이트 분획물"은 상기 참그물바탕말 에탄올 수용액 추출물을 에틸아세테이트와 혼합하고 정치시켜 얻어진 분획물, 추출 용매가 제거된 고형상의 참그물바탕말 에탄올 수용액 추출물을 물에 현탁한 후 이를 에틸아세테이트와 혼합·정치시켜 얻어진 분획물, 또는 상기 고형상의 참그물바탕말 에탄올 수용액 추출물을 물에 현탁하고 이를 헥산, 디클로메탄 및 에틸아세테이트로 순차적으로 분획하여 얻은 에틸아세테이트층의 분획물을 의미한다. 여기서 "헥산, 디클로메탄 및 에틸아세테이트로 순차적으로 분획한다"는 의미는 추출 용매가 제거된 고형상의 참그물바탕말 에탄올 수용액 추출물을 물에 현탁하고 이로부터 헥산 분획물과 디클로메탄 분획물을 얻은 후 잔여층인 물층을 사용하여 에틸아세테이트와 혼합·정치시켜 분획한다는 의미이다.

또 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

또 본 명세서에서, "항균성"이란 피부 미생물인 스타필로코쿠스 아우레우스, 스타필로코쿠스 에피더미디스 및 프로피오니박테리움 아크네스로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 미생물을 사멸시키거나 그 증식을 억제하는 성질 또는 용도를 의미한다.

본 명세서에서 특별히 정의되지 아니한 기타의 용어는 국어사전적 의미나 당업계에서 일반적으로 받아들여지고 있는 의미를 따른다.

본 발명의 항균성 피부 외용제 조성물에 있어서, 항균성이 피부 미생물 중 S. aureus 및 S. epidermidis에 대한 항균 활성인 경우, 그 유효성분은 참그물바탕말 에탄올 수용액 추출물의 헥산 분획물 또는 디클로메탄 분획물인 것이 바람직하다. 그것은 아래 실험예의 최소억제농도에서 보여지듯이 이들 분획물이 상기 피부 세균들에 대해 에탄올 수용액 추출물이나 에틸아세테이트 분획물보다는 특히 높은 항균 활성을 보이기 때문이다.

또 본 발명의 항균성 피부 외용제 조성물에 있어서, 항균성이 피부 미생물 중 P. acnes에 대한 항균 활성인 경우, 유효성분은 참그물바탕말 에탄올 수용액 추출물의 에틸아세테이트 분획물인 것이 바람직하다. 그것은 아래의 실험예의 최소억제농도가 보여주듯이, 에틸아세테이트 분획물의 항균 활성이 적어도 에탄올 추출물이나 다른 분획물의 항균 활성에 비해서 2배 내지 4배의 높기 때문이다.

한편 본 발명의 항균성 피부 외용제 조성물은 그 유효성분인 참그물바탕말 에탄올 수용액 추출물 또는 그 분획물을 항균 활성을 나타낼 수 있는 한 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 99.999 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 항균 활성을 나타낼 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 참그물바탕말의 추출물 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

아래의 실험예는 참그물바탕말 에탄올 추출물 및 그 분획물을 사람의 섬유아세포 CCD-986SK에 처리할 경우 에탄올 추출물과 모든 분획물이 타입 Ⅰ콜라겐(type Ⅰ collagen)의 생합성이 촉진시킴을 보여주고 있다. 타입 Ⅰ콜라겐은 피부 탄력 및 피부 보습과 밀접한 관련성을 가지는 것으로 보고되어 있는 콜라겐이다(J. Inv . Der ., 98; 248-254, 1992; Arch Dermatol 138: 1462-1470, 2002).

콜라겐은 전술한 바와 같이 섬유 단백질로서 진피층의 90% 이상을 구성하고 있어 피부의 기계적 견고성을 유지하고 수분 보유력을 가지기 때문에, 자외선, 스트레스, 활성 산소 등에 의하여 그것이 파괴되면, 피부 탄력성이 감소하고 피부 주름이 발생하며, 피부가 건조하고 거칠어지는 것으로 알려져 있다(Ann N Y Acad Sci. 1990;580:8-16; Arch Dermatol. 1989;125(8):1150; J Ginseng Res 31(2):86-92, 2007; Toxicol Appl Pharmacol 195: 298-308, 2004). 따라서 콜라겐의 생합성을 촉진할 수 있는 물질은 피부 주름 개선 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

본 명세서에서, "참그물바탕말 추출물"은 추출 방법을 불문하고 추출 대상인 참그물바탕말을 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 5의 알콜, 아세톤, 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디클로로메탄, 물 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 얻어진 추출물과 그 추출물을 상기 열거된 용매로 분획된 추출물을 포함하는 의미로서 이해된다. 추출 방법을 불문하므로, 추출 대상인 참그물바탕말을 추출 용매에 침지시키는 단계를 통하여 추출되는 한, 추출 방법은 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사 등 임의의 방법이 모두 적용될 수 있다. 그럼에도 상기 "참그물바탕말 추출물"은 바람직하게는 추출 대상인 참그물바탕말을 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하고 얻어진 것으로서, 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물, 그 고형상의 추출물을 물과 헥산, 물과 디클로로메탄, 물과 에틸아세테이트 또는 물과 부탄올로 분획하여 얻어진 어느 한 분획 용매층의 추출물, 또는 그 고형상의 추출물을 물에 현탁한 후, 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 부탄올을 이용하여 순차적으로 분획하여 얻어진 추출물을 의미한다. 여기서 "순차적으로 분획한다"는 것의 의미는 잔여층인 물층을 분획 후에도 계속 사용하여 상기 열거된 순서의 용매로 분획한다는 의미이다.

본 명세서에서, "피부 주름 개선"이란 피부 주름의 예방, 제거 또는 완화를 의미한다.

본 발명의 피부 주름 개선용 피부 외용제 조성물과 관련하여 유효성분의 의미, 유효량 등과 관련하여서는 본 발명의 항균성 피부 외용제 조성물과 관련하여 전술한 바를 따른다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 참그물바탕말의 추출물 유효성분으로 포함하는 자외선 차단용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

자외선은 장파장 자외선(320～400nm, 이하 UVA라 칭함), 중파장 자외선(280～320nm, 이하 UVB라 칭함), 단파장 자외선(200～280nm, 이하 UVC라 칭함)으로 분류되는데, 이중 지상에 도달하는 자외선 영역은 290～400nm이며 그 광량은 태양광선 중 약 6%를 차지하며 이중 UVB가 약 0.5%, UVA가 나머지 5.5%를 차지할 정도로 UVA의 광량이 상대적으로 많다. UVA와 UVB는 홍반, 수포, 피부 주름 등을 유발한다.

아래의 실험예에서 참그물바탕말 에탄올 추출물의 UVA와 UVB 차단 효과를 확인할 수 있다.

본 발명의 자외선 차단제 피부 외용제 조성물의 의미, 참그물바탕말의 추출물의 의미 등과 관련하여서는 이미 전술한 바와 같다.

본 발명의 항균성 피부 외용제 조성물, 주름 개선용 피부 외용제 조성물 및 자외선 차단용 피부 외용제 조성물(이하 "본 발명의 조성물")은 구체적인 양태에 있어서 화장료 조성물로 파악할 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로서 파악될 경우, 그 화장료 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 그 유효성분을 포함하는 이외에 화장료 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다.

여기서 "화장료 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장료 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 50 중량% 내지 약 99 중량 %로 포함될 수 있다.

그러나 상기 비율은 화장료의 전술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴이나 손)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

한편 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다.

상기 담체로서 사용될 수 있는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에 알려진 피부 보습 활성 물질, 항아토피 활성 물질, 항여드름 활성 물질, 미백 활성 물질 등 기능성 물질을 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명의 조성물 중 항균성 피부 외용제 조성물은 피부 세정제 조성물로도 파악할 수 있다.

본 발명의 피부 세정제 조성물은 고형상 또는 액상으로 제조될 수 있으며, 바디용 비누, 핸드용 비누, 세안제 등으로 제품화될 수 있다.

본 발명의 피부 세정제에는 그 유효성분인 참그물바탕말 에탄올 수용액 추출물 또는 분획물의 항균 활성을 저해하지 않은 한, 당업계에서 세정제의 제조에 사용되는 임의의 성분을 포함할 수 있다.

이러한 임의의 성분으로서는 예컨대, 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 등의 음이온 계면활성제, 아민 옥시드, 폴리옥시에틸렌알킬에테르 등의 비이온 계면활성제, 유분, 실리콘류, 저급 또는 고급 알코올 등의 알코올류, 라놀린 유도체, 단백 유도체, 아크릴 수지 분산액, 양이온 성 폴리머, 음이온성 폴리머, 비이온 성 폴리머, 비타민 등의 약제, 살균제, 방부제, pH 조정제, 산화 방지제, 금속 봉쇄제, 자외선 흡수제, 동식물 추출물 또는 그 유도체, 색소, 항료, 안료, 무기물 분체, 점토 광물, 나일론, 폴리에틸렌 등의 수불용성 폴리머 분체, 프로필렌 글리콜, 에틸알콜, 글리세린, 물 등을 들 수 있다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 국소형 제형 예컨대 크림, 로션, 연고(반고형의 외용약), 마이크로로에멀젼, 젤, 페이스트, 경피제제(TTS)(예컨대 패치제, 붕대 등) 등으로 제조될 수 있다.

상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.

약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등), 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.

부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 피부 세균들에 대해 항균 활성을 갖고 섬유아세포의 콜라겐 생성 촉진 활성을 가지며 나아가 자외선 차단 활성을 가진 참그물바탕말을 이용한 피부 외용제 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 피부 외용제 조성물은 항균 용도, 피부 주름 개선 용도 및/또는 자외선 차단 용도로 화장품, 세정제, 또는 약품 등으로 제품화될 수 있다.

도 1은 참그물바탕말 추출물과 그 분획물의 피부 미생물에 대한 항균 활성을 원판 확산법에 따라 평가한 결과 사진이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 > 참그물바탕말 추출물 및 분획물의 제조

제주도 제주시 우도 해안에서 2006년 4월 27에 채집한 참그물바탕말을 부착생물을 제거한 후 음건한 다음 마쇄기로 분쇄하였다. 미세 분말 시료를 80% 에탄올에 상온에서 48시간 침출하고 3회 추출하였으며, 그 후 상층액을 회수하고 감압 농축하여 고형상의 에탄올 추출물을 얻었다.

상기 고형상의 에탄올 추출물 10g을 증류수 1ℓ에 현탁시킨 후, 헥산(1ℓ×3), 디클로로메탄(1ℓ×3), 에틸아세테이트(1ℓ×3), 부탄올(1ℓ×3)로 각각 순차적으로 추출하고 각각의 분획물을 진공 건조하여 헥산층 분획물, 디클로로메탄층의 분획물, 에틸아세테이트층의 분획물 및 부탄올층의 분획물 그리고 잔여 물층(잔사물)을 얻었다. 각 분획물은 해당 용매로 용해시켜 0.2 ㎛의 membrane filter(Advantec MFS Inc. USA)로 제균하여 4℃에 보관하면서 본 연구에 사용하였다.

< 실험예 > 참그물바탕말의 피부 상태 개선·보존 활성 실험

<실험예 1> 피부균에 대한 항균 할성 실험

<실험예 1-1> 원판 확산법에 의한 실험

본 실험에 사용한 균주는 피부에서 흔히 검출되는 3종의 균주인 S. aureus, S. epidermidis, 및 P. acnes를 사용하였으며, S. epidermidis, 및 P. acnes에 대해서는 항생제 내성균을 함께 사용하였다.

혐기성 균인 P. acnes는 anaerobic Jar(Oxoid, USA)에서 배양하였다.

균주들의 배지는 Tryptic soy agar(TSA)는 Difco(USA)사, GAM Broth는 Nissui(Japan)사에서 구입하여 사용하였다.

아래의 [표 1]에 사용 균주, 배지 등을 정리하였다.

항균력 측정은 원판 확산법(Disc diffusion assay)을 사용하였다(Hayes, A.J., Markovic, B., 2002. Toxicity of Australian essential oil Backhousia citriodora (Lemon myrtle). Part 11. Antimicrobial activity and in vitro cytotoxicity. Food . Chem . Toxicol . 40(4): 535-543).

각 균주는 10 mL의 액체배지에 접종하고 37℃에서 18시간씩 3회 계대 배양하여 항균활성 시험 균주로 사용하였으며, 각각의 시험균 농도를 0.5 McFarland으로 10⁶ - 10⁸ CFU/mL 되게 한 후 pour-plate 방법에 균 접종 평판배지를 만들어 사용하였다.

각각의 시료는 1 mg/ml 농도로 조제하여 농도별로 paper disc(Whatman No.5, 8 mm)에 천천히 흡수시킨 후, 용매를 완전히 증발시킨다. 시험용 평판배지 표면에 디스크를 밀착시키고 최적온도 37℃에서 배양한 후 디스크 주변에 생성된 생육저해환(clear zone, mm)의 크기를 측정하여 항균활성을 비교하였다.

결과를 아래의 [표 2] 및 [도 1](1:에탄올 추출물, 2:헥산 분획물, 3:디클로로메탄 분획물, 4:에틸아세테이트 분획물, 5:부탄올 분획물, 6:잔여 물층)에 나타내었다.

[표 2] 및 [도 1]을 참조하여 보면, 에탄올 추출물과 순차적 분획물 중에서 S. aureus, S. epidermidis SK4와 항생제내성균인 S. epidermidis SK9와 S. epidermidis SK19에 대해서는 에탄올 추출물과 헥산 분획물 그리고 디클로로메탄 분획물이 항균 활성을 보였고, 특히 헥산 분획물에서 S. aureus의 생육저해환이 18mm로 가장 높을 활성을 나타내었고, 항생제 내성균인 S. epidermidis SK9와 S. epidermidis SK19에 대해서도 생육저해환이 각각 16mm, 15mm로 매우 높은 항균 활성을 나타내었다. P. acnes는 에탄올 추출물에서는 항균 활성이 나타나지 않았으나, 헥산 분획물, 디클로로메탄 분획물 그리고 에틸아세테이트 분획물에서는 활성을 띠었고, 항생제 내성균인 P. acnes SKA7에 대해서는 에탄올 추출물, 헥산 분획물, 디클로로메탄 분획물 그리고 에틸아세테이트 분획물이 활성을 띠었으며, 특히 에틸아세테이트 분획물이 그 생육저해환이 13mm로 가장 높은 항균 활성을 띠었다.

<실험예 1-2> 최소억제농도( Minimum inhibitory concentration , MIC )의 측정

최소억제농도(MIC)는 Micro-well dilution assay 방법(Amster D. 1996. Susceptibility testing of antimicrobial in liquid media, antibiotics in laboratory medicine. 4th ed. Williams and Wikins, MD, USA. p 52-111)에 따라 측정하였다. 각각의 균 농도를 0.5 McFarland으로 10⁶ - 10⁸ CFU/mL가 되게 한 후 96 well plate에 분주하고, 각 시료를 농도별로 10㎕씩 처리하여 배양하였다. 세균의 증식 정도를 Microplate reader(Powerwave XS, BioTek)로 650 nm에서 측정하였다. 세균만 접종한 well에서의 흡광도 값도 비교하여 최소억제농도를 정하였다.

결과를 아래의 [표 3]에 나타내었다.

참그물바탕말의 에탄올 추출물 및 용매별 분획물의 최소억제농도는 S. aureus과 항생제 내성균인 S. epidermidis SK9에서 헥산 분획물이 0.25 mg/ml, 디클로로메탄 분회물에서 각각 0.25, 0.5 mg/ml 낮은 농도로 억제되었다. S. epidermidis SK4에 비해 항생제 내성균인 S. epidermidis SK9와 S. epidermidis SK19가 낮은 농도로 억제되었으며, 이는 항생제 내성균에서 높은 효과를 보이고 있음을 알 수 있다. P. acnes와 항생제 내성균인 P.acnes SKA7는 에틸아세테이트 분획물에서 0.5 mg/ml로 에탄올 추출물과 다른 분획물에 비해 낮은 농도에서 억제되었다

<실험예 2> 콜라겐 생합성 촉진 활성 실험

<실험예 2-1> 세포 배양

실험에 사용한 사람의 섬유아세포(CCD-986SK, human fibroblasts)는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville,. USA)에서 구입하였으며, 10%의 FBS(fetal bovine serum, Hyclone)와 1% Antibiotic-Antimycotic(Gibco)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium.Hyclone)으로 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

<실험예 2-2> Type I collagen 합성 촉진 효과 실험

사람 섬유아세포를 2××10⁴cell/well 농도로 96 well에 분주한 다음, 24시간 배양하였다. 배지를 버리고 serum free 배지로 시료를 희석하여 50㎍/ml 농도로 넣고 24시간 배양하였다. 양성대조군으로 사용한 ascorbic acid는 200 μM의 농도로 처리하였다. 배양액을 수거하여 실험에 사용하였으며, 세포 배양액 내 콜라겐 합성량은 procollagen type I peptide EIA kit(Takara Biomedical Co.)를 사용하여 측정하였다. Anticody-POD conjugate solution 100 μl를 각 well에 넣은 다음 sample 및 standard 20 μl를 넣고 37℃에서 3시간 배양하였다. 반응이 끝나면 각 well에 배양액을 제거한 뒤 PBS(phosphate buffered saline) 400 μl로 4회 세척하였다. 기질용액 100 μl를 첨가하고 상온에서 15분간 반응시켰다. stop solution(1N H₂SO₄) 100 μl를 첨가하여 반응을 중지시킨 후 ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준농도곡선을 작성하여 콜라겐 양을 확인하였다.

<실험예 2-3> 세포 생존율 평가 실험

사람 섬유아세포를 2××10⁴cell/well 농도로 96 well에 분주한 다음 세포 배양 조건에서 24시간 배양한다. 배지를 버리고 serum free 배지로 시료를 희석하여 50㎍/ml농도로 넣고 24시간 배양하였다. 양성대조군으로 사용한 ascorbic acid는 200μμM의 농도로 처리하였다. MTT용액(2mg/ml 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl-2H-tetrazolium bromid액)을 각 well에 50ul씩 넣고, 4시간 동안 배양한다. 배양액을 제거한 다음 DMSO(dimethyl sulfoxide) 용액을 넣고, 10분간 흔들어 준 후 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정한다

<실험예 2-4> 결과

상기 타입 Ⅰ 콜라겐 생성 촉진 효과 실험 결과와 상기 세포 생존율 평가 실험 결과를 아래의 [표 1]에 나타내었다.

콜라겐 합성 촉진 효과 및 세포 생존율

Sample (50㎍/ml)	콜라겐 합성 촉진 효과(%)	세포생존율(%)
Control	100.0	100
에탄올 추출물	153.6±2.5**	101.2
헥산 분획물	116.0±2.3**	102.2
디클로로메탄분획물	113.0±2.6**	97.2
에틸아세테이트 분획물	114.9±3.2**	96.8
부탄올 분획물	145.1±4.5**	103.2
잔여 물층	133.2±3.2**	106.1
* p < 0.05, ** p < 0.01

상기 [표 5]의 결과는 에탄올 추출물과 분획물 모두가 콜라겐 생합성 촉진 활성을 가짐을 보여주며, 특히 에탄올 추출물과 부탄올 분획물이 가장 높은 활성을 보였다.

<실험예 3> 자외선 차단 활성 실험

본 실험을 위하여 아래의 [표 6]의 성분들과 함량이 포함된 화장료 조성물을 제조하였다.

화장료 조성물의 성분 및 함량

번호	성분	함량 (중량%)
1	참그물바탕말의 에탄올 추출물	2.0
2	스테아린산	2.0
3	세틸알콜	2.0
4	글리세릴모노스테아레이트	2.0
5	폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트	0.5
6	솔비탄세스퀴올레이트	0.5
7	글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트	1.0
8	왁스	1.0
9	유동파라핀	4.0
10	스쿠알란	4.0
11	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
12	카르복시비닐폴리머	0.3
13	부틸렌글리콜	5.0
14	글리세린	3.0
15	트리에탄올아민	0.5
16	정제수	잔량

비교예로서는 참그물바탕말 에탄올 추출물이 포함되지 아니한 화장료 조성물, 즉 참그물바탕말 에탄올 추출물 대신에 정제수가 더 포함된 화장료 조성물을 사용하였다.

상기에서 제조한 제조예 화장료 조성물(참그물바탕말 에탄올 추출물 포함) 및 비교예 화장료 조성물(참그물바탕말 에탄올 추출물 미포함)의 SPF(Sun Protection Factor) 및 PFA(Protection Factor of UVA)를 식품의약품안전청 고시한 기능성 화장품 방법 중 자외선 차단 기능 시험법에 따라 측정하였다. SPF/PFA가 높을수록 UVB/UVA 차단효과가 우수하다는 것을 의미한다.

결과를 아래의 [표 7]에 나타내었다.

SPF/UVA 측정 결과

구분	SPF	UVA
제조예의 화장료 조성물	18.6	6.8
비교예의 화장료 조성물	14.7	4.9

상기 [표 7]의 결과는 참그물바탕말이 자외선 차단 효과를 가지고 있음을 보여준다.

Claims (9)

1. 참그물바탕말의 에탄올 수용액 추출물, 그 에탄올 수용액 추출물의 헥산 분획물, 그 에탄올 수용액 추출물의 디클로메탄 분획물을 포함하며,
   스타필로코쿠스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스 및 프로피오니박테리움 아크네스로 구성된 피부 세균 모두에 대해서 항균 활성을 나타내는 항균성 피부 외용제 조성물.
   
2. 참그물바탕말의 에탄올 수용액 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하며,
   프로피오니박테리움 아크네스에 대해서 항균 활성을 나타내는 항균성 피부 외용제 조성물.
   
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 항균성 피부 외용제 조성물.
   
4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 조성물은 세정제 조성물인 것을 특징으로 하는 항균성 피부 외용제 조성물.
   
5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 항균성 피부 외용제 조성물.
   
6. 콜라겐 생성 촉진 활성을 가진 참그물바탕말의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 피부 외용제 조성물.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 참그물바탕말의 추출물은 아래 (Ⅰ) 내지 (Ⅲ)의 추출물 중 어느 하나 인 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 피부 외용제 조성물.
   (Ⅰ) 참그물바탕말의 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매에 의한 추출물;
   (Ⅱ) 참그물바탕말의 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매에 의한 추출물을 물과 헥산, 물과 디클로로메탄, 물과 에틸아세테이트 또는 물과 부탄올로 분획하여 얻어진 어느 한 분획 용매층의 추출물; 및
   (Ⅲ) 참그물바탕말의 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매에 의한 추출물을 물에 현탁한 후, 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 부탄올을 이용하여 순차적으로 분획하여 얻어진 추출물
   
8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
   상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 피부 외용제 조성물.
   
9. 참그물바탕말의 추출물 유효성분으로 포함하는 자외선 차단용 피부 외용제 조성물.
   

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