KR20130008240A

KR20130008240A - 실리카로 코팅된 지질 단일층 쉘과 생분해성 고분자 코어로 된 나노파티클을 이용한 레티놀의 안정화방법 및 이를 함유하는 화장료조성물

Info

Publication number: KR20130008240A
Application number: KR1020110068855A
Authority: KR
Inventors: 이주희; 장수진; 전지민; 이현상; 천종우
Original assignee: (주)에이씨티
Priority date: 2011-07-12
Filing date: 2011-07-12
Publication date: 2013-01-22
Also published as: KR101314100B1

Abstract

본 발명은 불안정한 지용성 물질인 레티놀을 안정화하여 화장료에 이용하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따르면 (A)가온된 글리세린(glycerin) 1 ~ 54중량%에 녹두 유산균 발효 추출물 1 ~ 10중량%, 항산화제 0.5 ~ 1중량%, 레티놀 또는 그 유도체 1 ~ 6.6중량%를 혼합하면서 용해시키는 단계; (B)생분해성 고분자 1 ~ 5 중량%를 첨가하는 단계; (C)레시틴 1 ~ 3중량%를 혼합하여 용해시키고, 실리카 용액 0.5 ~ 1 중량%와 혼합한 정제수를 넣어 교반하여 에멀젼 조성물을 제조하는 단계; 및 (D)고압호모게나이저(Microfluidizer)를 사용하여 40 ~ 100nm의 크기를 가지는 나노 에멀젼을 형성하는 단계를 포함하는 레티놀의 안정화 방법 및 이에 의하여 안정화된 레티놀을 함유하는 항염 및 피부주름개선용 화장료조성물이 제공된다.

Description

실리카로 코팅된 지질 단일층 쉘과 생분해성 고분자 코어로 된 나노파티클을 이용한 레티놀의 안정화방법 및 이를 함유하는 화장료조성물{Stabilizing method of an unstable retinol using nanoparticles of silica coated lipid monolayer shell and biodegradable polymer core and cosmetic composition containing the same}

본 발명은 지용성 물질이면서 피부의 주름개선에 도움을 주는 레티놀 및 그 유도체를 피부외용제로 사용하기 위하여 안정화하는 기술에 관한 것으로서, 구체적으로는 레티놀 또는 그의 유도체를 생분해성 고분자와 함께 코어로 형성시킨 후, 이에 단일 지질층 쉘을 형성시키고 이를 다시 실리카로 코팅함으로써 레티놀을 보호하여 불안정한 레티놀 또는 그 유도체를 안정화 시키는 기술에 관한 것이다.

레티놀은 비타민 A의 한 종류로 피부의 주름개선에 도움을 주는 기능성 성분이다. 레티놀은 피부의 콜라겐과 엘라스틴을 증가시켜 피부주름을 개선하는데 도움을 준다. 비타민 A 및 그 유도체들을 통칭하여 레티노이드(retinoid)라고 하는데 레티놀은 화장품에 사용되는 대표적인 레티노이드 성분이다. 레티노익산(retinoic acid)은 광손상된 피부치료를 위해 사용되는 레티노이드 성분으로 많은 나라에서 의약품으로 구분하고 있다. 레티노익산을 피부에 바르면 콜라겐, 엘라스틴을 증가시킴으로써 피부주름을 개선하며 멜라닌 색소의 양을 감소시켜 색소침착이 개선된다. 그러나 각질이 벗겨지고 피부가 붉어지며 화끈거리는 부작용이 나타나기도 하는데 이런 부작용은 일시적이며 사용을 중지하면 점차 사라진다. 레티놀은 피부에서 흡수된 후 레티노익산으로 바뀌므로 레티노익산을 바르는 것과 유사한 효과를 기대할 수 있다. 다만, 레티노익산이 레티놀에 비해 10배 정도로 효과가 강하며 피부에 나타날 수 있는 부작용도 이에 비례하므로 레티노익산보다 더 안전한 레티놀을 화장품에 사용하고 있다(식품의약품안전청, 2010. 10., 피부노화현상과 피부노화 예방법에 대한 안내서).

또한, 레티노익산의 불안정성 때문에 많은 레티노익산 유도체가 개발되었다. 그 유도체에는 레티놀(retinol), 레티날데히드(retinaldehyde), 레티닐 팔미테이드(retinyl palmitate)와 트랜스-레티닐 아세테이트(all trans retinyl acetate)가 있다. 이와 같은 많은 유도체 가운데 트랜스-레티닐 아세테이트가 화장품에 많이 사용되고 있지만 그 형태가 레티노익산의 에스터로 되어 있어 피부 자극 유발, 광에 의한 DNA 손상 가능성과 광독성 및 안정성 등에 문제를 나타내고 있다(Yan et al., 2005. Photo-induced DNA damage and photocytotoxicity of retinyl palmitate and its photodecomposition products. Toxicol. Ind. Health 21, 167-175.). 레티놀과 그의 유도체를 안정화하기 위하여 리포좀(liposome), 니오좀(niosome), 고체 지질 나노파티클(solid lipid nanoparticle)과 고분자 나노 파티클(polymer nanoparticle) 등을 통하여 안정성을 높이기 위한 연구가 있었다. 그러나 산업화에 적용할 정도의 안정도에는 미치지 못하고 있는 실정이다. 이를 해결하기 위한 연구 중에 본 발명자들은 실리카로 코팅된 지질 단일층 쉘과 생분해성 고분자 코어 구조로 되는 나노 파티클을 이용하면 레티놀이나 그의 유도체를 효과적으로 안정화시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 열, 빛, 산소, 수분 등에 매우 불안정하여 화장품 내에서 쉽게 산화가 일어나는 레티놀과 그의 유도체를 효과적으로 안정화시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 안정화된 레티놀 또는 그 유도체를 함유하는 항염 및 피부주름개선용 화장료조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면,

(A)가온된 글리세린(glycerin) 1 ~ 54중량%에 녹두 유산균 발효 추출물 1 ~ 10중량%, 항산화제 0.5 ~ 1중량%, 레티놀 또는 그 유도체 1 ~ 6.6중량%를 혼합하면서 용해시키는 단계;

(B)생분해성 고분자 1 ~ 5 중량%를 첨가하는 단계;

(C)레시틴 1 ~ 3중량%를 혼합하여 용해시키고, 실리카 용액 0.5 ~ 1 중량%와 혼합한 정제수를 넣어 교반하여 에멀젼 조성물을 제조하는 단계; 및

(D)고압호모게나이저(Microfluidizer)를 사용하여 40 ~ 100nm의 크기를 가지는 나노 에멀젼을 형성하는 단계를 포함하는 레티놀의 안정화 방법이 제공된다.

상기 제조방법에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 PGA(Polyglycolic acid), PLLA(Poly-L-lactide), PDLLA(Poly-D,L-lactide), PCL(Poly-ε-caprolactone), PDO(Poly-1,4-dioxane-2-one), PTMC(Polytrimethylenecarbonate) 및 PHB(Poly-β-hydroxybutyrate)로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 것이 사용될 수 있다. 상기 제조방법에 있어서, 상기 녹두 유산균 발효 추출물은 녹두를 소수성 용매인 오일로 추출한 후, 이를 다시 유산균 발효시키는 방법에 의하여 제조하는 것이 바람직하다. 상기 제조방법에 있어서, 상기 레시틴은 하이드로제네이티드 포스파티딜콜린, 포스포리피드, 하이드로제네이티드 라이소포스파티딜콜린, 하이드로제네이티드 라이소레시틴, 하이드로옥실레이티드 레시틴 및 불포화레시틴으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 것이다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 상기 방법에 의하여 안정화된 레티놀 또는 그 유도체를 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.0001 중량％ 내지 50 중량％만큼 함유하는 화장료 조성물이 제공된다. 상기 화장료 조성물 염증 및 주름개선용 화장료로 사용될 수 있다. 상기 화장료조성물은 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤, 피부 점착타입의 화장료, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 샴푸, 린스, 바디크렌저, 비누, 치약, 구강청정제, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제의 제형으로 적용될 수 있다.

본 발명의 안정화된 레티놀을 함유하는 화장료 조성물은 삼중으로 안정화된 레티놀을 사용하여 그 안정성이 높고, 경피흡수율이 우수하며, 레티놀을 특정의 크기로 형성되는 나노 고분자캡슐에 포집하여 피부내로 침투시키므로 서방성이 우수하여 활성성분을 피부에 지속적으로 공급함으로써 피부주름을 개선한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 안정화된 레티놀의 역가 유지능을 나타내는 그래프이다.
도 2 내지 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 안정화된 레티놀의 사이토카인 억제능을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 안정화된 레티놀의 프로콜라겐 발현정도를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 공기, 수분이나 열에 불안정한 활성성분인 레티놀을 효과적으로 안정화시키며, 동시에 경피 흡수율을 높여 적은 양의 사용으로도 항염 및 주름개선효과를 확보하며, 활성성분의 서방성을 구현하여 피부자극을 억제하는 것을 특징으로 한다. 이를 달성하기 위하여 레티놀 또는 그 유도체를 생분해성 고분자를 이용하여 캡슐을 제조하여 코어부분으로 하며, 이를 다시 레시틴(lecithin)을 이용하여 쉘(shell)을 형성하여 레티놀 또는 그 유도체를 안정화시킨다. 이를 다시 실리카 용액으로 안정화시킨 후 나노 에멀젼화한다. 이와 같이 삼중으로 안정화된 레티놀 또는 그 유도체를 함유하는 화장료는 안정하여 항염 및 피부주름개선 효과를 오래도록 지속시키게 된다.

이하 레티놀의 안정화방법에 관하여 상세하게 설명한다.

(A) 70℃로 가온한 글리세린(glycerin) 1 ~ 54중량%에 녹두 유산균 발효 추출물 1 ~ 10중량%, 항산화제 0.5 ~ 1중량%, 레티놀 또는 그 유도체 1 ~ 6.6중량%를 혼합하면서 용해시키는 단계;

(B)생분해성 고분자 1 ~ 5 중량%를 첨가하는 단계;

먼저, 활성성분인 레티놀 또는 그 유도체를 녹두 유산균 발효 추출물과 생분해성 고분자를 이용하여 캡슐을 제조하여 1차 안정화한다. 이 후 이를 레시틴(lecithin)을 이용하여 2차 안정화시킨다. 이에 실리카 및 정제수를 포함하는 조성물을 첨가하여 3차 안정화를 위한 에멀젼 조성물을 제조한다. 이 후 고압 호모게나이져를 이용하여 40 ~ 100nm의 크기를 가지는 나노 에멀젼을 형성하여 안정화된 레티놀을 제조한다.

상기 레티놀로는 레티놀 또는 레티놀 유도체가 사용될 수 있다. 상기 항산화제로는 BHT(Butylated hydroxytoluene), BHA(2-tert-Butyl-4-methoxyphenol), 펜타에리스리틸테트라-디-t-부틸하이드록시하이드로신나메이트(Pentaerythrityl tetra-di-t-butyl hydroxyhydrocinnamate), 토코트리에놀(Tocotrienol), 토코페롤(Tocopherol) 및 토코페롤 아세테이트(Tocopherol Acetate)로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 것이 사용될 수 있다. 상기 레시틴은 하이드로제네이티드 포스파티딜콜린, 포스포리피드, 하이드로제네이티드 라이소포스파티딜콜린, 하이드로제네이티드 라이소레시틴, 하이드로옥실레이티드 레시틴 및 불포화레시틴으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 레시틴이며, 바람직하게는 하이드레제네이트 라이소레시틴이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 녹두 유산균 발효 추출물은 녹두를 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드(caprylic/capric triglyceride)를 사용하여 녹두의 지용성 성분을 추출하고, 이를 다시 유산균발효에 의하여 제조되는 것이다. 상기 녹두 유산균 발효 추출물은 항염 및 피부주름개선 효과가 우수한 물질로써 이 효능은 레티놀 함유 에멀젼 내에서 그 효과의 상승이 이루어지며, 에멀젼의 안정화에도 기여하므로, 상기 녹두 유산균 발효 추출물의 첨가는 레티놀의 안정성이 향상된 항염 및 주름개선용 화장료의 제조에 있어서 중요하다. 본 발명에서는 환경 친화적인 생분해성 고분자 소재를 레티놀 안정화 기술에 도입하였는데, 생체 친화성 고분자는 피부에 투과되었을 때 대식세포의 공격을 피할 수 있는 장점이 있다. 상기 생분해성 고분자로는 PGA(Polyglycolic acid), PLLA(Poly-L-lactide), PDLLA(Poly-D,L-lactide), PCL(Poly-ε-caprolactone), PDO(Poly-1,4-dioxane-2- one), PTMC(Polytrimethylenecarbonate) 및 PHB(Poly-β-hydroxybutyrate)로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 것이 사용될 수 있다. 또한, 실리카를 이용한 리포좀 기술을 적용하여 보다 효과적으로 안정화된 레티놀을 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면 상기 나노 에멀젼을 제조하기 위한 에멀젼 조성물은 글리세린 1 ~ 54중량%, 녹두 유산균 발효 추출물 1 ~ 10중량%, 항산화제인 BHT 0.5 ~ 1중량%, 레티놀 또는 그 유도체 1 ~ 6.6중량%, 생분해성 고분자로서 폴리카프로 락톤(polycapro lactone) 1 ~ 5 중량%, 레시틴 1 ~ 3중량%, 실리카용액 0.5 ~ 1 중량% 및 정제수로 이루어진다.

이와 같은 방법에 의하여 불안정한 활성성분인 레티놀을 더욱 안정화함으로써 오랜 기간 동안 역가가 유지되도록 할 뿐 아니라, 나노 에멀젼화 됨에 따라 피부투과율이 향상된다는 효과를 가져온다.

상기 안정화된 레티놀 또는 그 유도체는 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.0001 중량％ 내지 50 중량％만큼 함유된다. 상기 화장료조성물은 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤, 피부 점착타입의 화장료, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 샴푸, 린스, 바디크렌저, 비누, 치약, 구강청정제, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제의 제형으로 적용될 수 있다.

HPLC를 이용하여 안정화된 레티놀에 대한 역가 유지능을 확인한 결과, 본 발명에 의해 안정화된 레티놀은 8주 동안 고온(45℃)에서 90%이상 유지되어 안정성이 우수함을 확인할 수 있었다.

자극완화 효과를 알아보기 위해 TNF-α, IL-1α 및 COX-2 발현 억제효과를 평가한 결과 HaCaT 세포주에 본 발명에 따른 안정화된 레티놀을 처리한 경우에는 이들 사이토카인의 발현이 모두 현저하게 감소하였다. 프로콜라겐 mRNA 발현에 미치는 영향을 확인한 결과 본 발명에 따라 제조된 안정화된 레티놀을 처리하였을 때에는 COL1A1의 발현량이 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명에 따라 안정화된 레티놀은 피부자극이 적고 주름개선 효과가 뛰어난 물질임을 나타낸다.

[실시예]

이하 실시예 및 시험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명이 하기의 예에 의하여 제한되지는 않는다.

실시예 1: 3중 안정화된 레티놀 나노 에멀젼 제조

BHT 5g, 레티놀 66g 및 폴리카프로락톤(Polycaprolactone) 50g을 에탄올에 용해 후 70℃로 가온 한 글리세린 539g에 혼합하였다. 녹두 유산균 발효 추출물 100g을 첨가하여 용해 한 다음에, 레시틴(lecithin) 30g을 혼합하여 30분 동안 호모믹서로 유화시켰다. 이를 용매 증발법을 통해서 에탄올을 제거하였다. 실리카(silica) 용액 10g과 정제수 200g을 혼합하여 넣어주고 30분간 교반한 다음에, 고압 호모게나이저(Microfluidizer M-110F, Microfluidizer, Germany)를 이용하여 1,000bar에서 3회 통과시켜 약 42nm크기의 레티놀 나노 에멀젼을 제조하였다.

비교예 1:레티놀 나노 에멀젼의 제조

BHT 5g, 레티놀 66g 및 폴리카프로락톤(Polycaprolactone) 50g을 에탄올에 용해 후 70℃로 가온 한 글리세린 539g에 혼합하였다. 정제수 390g을 혼합하여 넣어주고 30분간 교반한 다음에, 고압 호모게나이저(Microfluidizer M-110F, Microfluidizer, Germany)를 이용하여 1,000bar에서 3회 통과시켜 레티놀 나노 에멀젼을 제조하였다.

비교예 2:단일 레시친만을 함유한 레티놀 나노 에멀젼의 제조

BHT 5g 및 레티놀 66g을 에탄올에 용해 후 70℃로 가온 한 글리세린 539g에 혼합하였다. 녹두 유산균 발효 추출물 100g을 첨가하여 용해 한 다음에, 레시틴(lecithin) 30g을 혼합하여 30분 동안 호모믹서로 유화시켰다. 이를 용매 증발법을 통해서 에탄올을 제거하였다. 정제수 260g을 혼합하여 넣어주고 30분간 교반한 다음에, 고압 호모게나이저(Microfluidizer M-110F, Microfluidizer, Germany)를 이용하여 1,000bar에서 3회 통과시켜 레티놀 나노 에멀젼을 제조하였다.

비교예 3:단일 생분해성 고분자만을 함유한 레티놀 나노입자의 제조

BHT 5g, 레티놀 66g 및 폴리카프로락톤(Polycaprolactone) 50g을 에탄올에 용해 후 70℃로 가온 한 글리세린 539g에 혼합하였다. 녹두 유산균 발효 추출물 100g을 첨가하여 용해 한 다음에, 30분 동안 호모믹서로 유화시켰다. 이를 용매 증발법을 통해서 에탄올을 제거하였다. 정제수 340g을 혼합하여 넣어주고 30분간 교반한 다음에, 고압 호모게나이저(Microfluidizer M-110F, Microfluidizer, Germany)를 이용하여 1,000bar에서 3회 통과시켜 레티놀 나노 에멀젼을 제조하였다.

비교예 4:레시틴 및 실리카를 함유한 레티놀 나노 에멀젼의 제조

BHT 5g 및 레티놀 66g 을 에탄올에 용해 후 70℃로 가온 한 글리세린 539g에 혼합하였다. 녹두 유산균 발효 추출물 100g을 첨가하여 용해 한 다음에, 레시틴(lecithin) 30g을 혼합하여 30분 동안 호모믹서로 유화시켰다. 이를 용매 증발법을 통해서 에탄올을 제거하였다. 실리카(silica) 용액 10g과 정제수 250g을 혼합하여 넣어주고 30분간 교반한 다음에, 고압 호모게나이저(Microfluidizer M-110F, Microfluidizer, Germany)를 이용하여 1,000bar에서 3회 통과시켜 레티놀 나노 에멀젼을 제조하였다.

비교예 5:레티놀 나노에멀젼의 제조

BHT 5g, 레티놀 66g 및 폴리카프로락톤(Polycaprolactone) 50g을 에탄올에 용해 후 70℃로 가온 한 글리세린 539g에 혼합하였다. 레시틴(lecithin) 30g을 혼합하여 30분 동안 호모믹서로 유화시킨 후에 이를 용매 증발법을 통해서 에탄올을 제거하였다. 실리카(silica) 용액 10g과 정제수 200g을 혼합하여 넣어주고 30분간 교반하였다. 녹두 유산균 발효 추출물 100g을 첨가하여 용해한 후에 고압 호모게나이저(Microfluidizer M-110F, Microfluidizer, Germany)를 이용하여 1,000bar에서 3회 통과시켜 레티놀 나노 에멀젼을 제조하였다.

비교예 6: 레티놀 나노 에멀젼의 제조

BHT 5g, 레티놀 66g 및 폴리카프로락톤(Polycaprolactone) 50g을 에탄올에 용해 후 70℃로 가온 한 글리세린 539g에 혼합하였다. MCT(medium chain triglyceride) 100g을 첨가하여 용해 한 다음에, 레시틴(lecithin) 30g을 혼합하여 30분 동안 호모믹서로 유화시켰다. 이를 용매 증발법을 통해서 에탄올을 제거하였다. 실리카(silica) 용액 10g과 정제수 200g을 혼합하여 넣어주고 30분간 교반한 다음에, 고압 호모게나이저(Microfluidizer M-110F, Microfluidizer, Germany)를 이용하여 1,000bar에서 3회 통과시켜 레티놀 나노 에멀젼을 제조하였다.

시험예 1: 안정성시험

레티놀에 대한 역가 유지능 확인

상기 실시예 1에 의하여 안정화된 레티놀의 역가를 고온(45℃)에서 확인하였다. 제조 직후의 레티놀 역가와 45℃에 8주간 방치시킨 후의 레티놀역가를 HPLC(325nm에서)로 흡광도를 측정하여 확인하였다.

1) 검액제조

레티놀 나노 에멀젼 약 50-100 mg을 취하여 메탄올 100mL로 용해한 액을 검액으로 사용한다.

2) 표준액제조

레티놀 100mL로 한 액 10mL를 정확하게 취하여 메탄올을 넣어 100mL로 한 액을 표준액으로 한다.

3) 분석방법

컬럼은 C18로 충진된 것을 사용하고 검출기는 325nm 파장의 자외부 흡광광도계를 사용하였다. 이동상은 90% 에탄올을 사용하였고 유량조건은 1.0mL/min이다.

검액을 3회 시험하고, 검량선을 토대로 함량을 계산하였다.

HPLC를 이용하여 안정화된 레티놀에 대한 역가 유지능을 확인한 결과, 본 발명에 의해 안정화된 레티놀은 8주 동안 고온(45℃)에서 90%이상 유지되어 안정성이 우수함을 확인할 수 있었다(도 1).

도 1에서 확인되는 바와 같이 3중 안정화시스템과 비교하여 비교예 1 ~ 4의 레티놀 역가유지능은 떨어지는 것을 알 수 있다. 이는 3중 안정화함에 따라 레티놀의 안정성이 우수하여 레시틴의 역가 유지능이 크게 향상됨을 나타내는 것이다.

제타 전위 측정을 통한 레티놀 나노 에멀젼의 안정성 확인

제타전위(Zeta Potential)를 측정하여 레티놀 나노 에멀젼의 안정성을 확인하였다. 제타전위는 입자 사이의 반발력이나 인력의 크기에 대한 단위로, 제타 전위 측정은 분산 메커니즘을 이해하고 정전기 분산을 제어하는 데 중요한 요소이다.

제타전위 값이 +30mV이상 또는 -30mV이하는 안정하다. 상기 실시예 1의 레티놀 나노 에멀젼을 증류수에 희석하여 입도분석기로 제타전위를 측정하였다. 그 결과 -57.4값을 얻었다. 이는 -30 mV이하를 나타냄으로써 에멀젼이 안정함을 보여준다.

안정화된 레티놀의 생리활성을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법으로 시험을 하였다.

세포배양

실험에 사용된 세포는 HaCaT(Human Keratinocytes cell line) 및 CCD986나(Human Fibroblast cell line ATCC, USA)이며 37℃, 5%의 CO_2,10%의 Fetal bovine serum(FBS, Lonza), 50μg/mL의 streptomycin(Sigma)을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Invitrogen)에서 배양하였다.

Cytokine의 발현 측정

RNA 분리

RNA 분석을 위해 세포 내의 total RNA를 세포 배양으로부터 Trizol reagent (Invitrogen, USA)를 사용하여 추출하였다. RNA의 순도와 무결성은 A₂₆₀nm/A₂₈₀nm비율 측정을 통해 확인하였고, RNA 수율은 260nm에서 흡광도로 측정하였다.

Reverse Transcriptase - polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

cDNA합성은 3 ㎍의 total RNA를 Oligo dT 15(500ng/㎕) primer, dNTP (10mM), RTase inhibitor(40 U/㎕), Powerscript Ⅱ RTase(Clontech, USA)를 첨가하여 25℃에서 10분간 primer annealing, 42℃에서 60분간 cDNA를 합성하고 95℃에서 5분간 RTase denaturation 시켰다. PCR은 cDNA로부터 TNF-α, IL-1α, COX-2, COL1A1 와 GAPDH를 증폭하기 위하여 cDNA 3㎕, 10X taq polymerase 5㎕, 2.5mM dNTP 2㎕, 10pmol primer 각각 2㎕, taq polymerase 0.5㎕를 혼합하고 증류수를 더하여 50㎕로 조정한 후 증폭시켰다. Primer 서열은 하기의 표 1에 나타내었다. PCR에 의하여 생성된 산물은 1% agarose gel에서 전기영동하여 image analyzer(UGEN, U:Genius)로 확인하였으며 각 밴드(band)의 농도(density)는 Densitometric program(Gene Tools from Syngene)을 이용하여 측정하였다.

Gene	Primer
GAPDH	Forward 5'-AAC GAA TTT GGT CGA ACA GC-3'
GAPDH	Reverse 5'-TGA GGA GGG ATT CAG TG-3'
TNF-α	Forward 3'-ATG AGC ACT GAA AGC ATG ATC-5'
TNF-α	Reverse 3'-TCA CAG GGC AAT GAT CCC AAA GTA GAC CTG CCC-5'
IL-1α	Forward 5'-GTC TCT GAA TCA GAA ATC CTT CTA TC-3'
IL-1α	Reverse 5'-CAT GTC AAA TTT CAC TGC TTC ATC C-3'
COX-2	Forward 3'-TTC AAA TGA GAT TGT GGA AAA ATT GCT-5'
COX-2	Reverse 3'-AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT-5'
COL1A1	Forward 5'-AGC CAG CAG ATC GAG AAC AT-3'
COL1A1	Reverse 5'-TCT TGT CCT TGG GGT TCT TG-3'

시험예 2:사이토카인 발현 억제 시험

상기 안정화된 레티놀의 항염효과를 평가하기 위하여 상기 시험방법에 의하여 사이토카인 발현 억제능을 평가하였다.

TNF-α, IL-1 α 및 COX-2와 같은 사이토카인의 발현을 증가시키는 자외선(50 mJ/cm²)을 각질형성세포에 조사한 후, 실시예 1과 비교예 1 ~ 6의 사이토카인 발현 억제 효과를 확인하였으며 그 결과를 도 2 내지 도 4에 나타내었다. 그 결과 비교예 1 ~ 6의 경우에는 TNF-α, IL-1 α 및 COX-2의 모발현이 증가하였으나, 실시예 1의 경우에는 이들 사이토카인의 발현이 모두 현저하게 감소하였다. 특히 비교예 5의 결과는 본 발명 레티놀 나노에멀젼의 제조에 있어서 녹두 유산균 발효추출물의 혼합 순서가 중요함을 나타낸다.

시험예 3:콜라겐 생합성 촉진 시험

본 발명의 안정화 레티놀이 COL1A1(Type 1 procollagen)의 발현에 영향을 미치는지 확인하고자 RT-PCR을 시행하여 COL1A1의 발현량을 확인하였다. 그 결과는 도 5 에 나타내었다. 실시예 1의 안정화 레티놀 처리 시 COL1A1의 발현량이 비교예 1 ~ 6에 비해 크게 증가하는 것을 확인하였다.

시험예 4: 엘라스타제 제어 활성시험

0.1 중량% Elastin-Congo red(Sigma, USA)가 포함된 2.5 중량% agar에 시험시료 및 엘라스테이즈 효소 용액(1,000 units/mL, Sigma, USA)을 혼합하고 상온에서 10분간 반응시킨 용액 10 ul 씩 주입 후 37℃에서 18시간 배양하였다. 배양 종료 후 엘라스테이즈의 활성에 의해 Elastin-Congo red agar 주변에 투명대가 형성되면 그 투명대의 직경을 측정하여 엘라스테이즈 활성 저해 효과를 측정할 수 있다.

상기 시험결과 하기의 표 2와 같은 결과를 얻었다.

	Halo diameter (cm)
	실시예 1	비교예 1	비교예 2	비교예 3	비교예 4	비교예 5	비교예 6
Elastase activity	0.85	0.9	0.92	0.91	0.93	0.89	0.92

투명대 직경이 클수록 엘라스틴의 분해가 많이 된 것인데, 상기 표 2에서 확인되는 바과 같이, 실시예 1의 투명대 직경이 가장 작음을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 크림의 제조

상기 실시예 1에서 제조된 안정화 레티놀을 첨가하여 하기 표 3의 조성으로 화장료 조성물을 제조하였다. 상기 비교예 1~6에서 제조된 레티놀 에멀젼을 동일 함량으로 함유하는 크림을 제조하여 비교예 5~10으로 하였다.

조성물 (중량%)	실시예 2
레티놀에멀젼(실시예 1)	3.00
글리세린	1.00
부틸렌글라이콜	2.00
아라키딜알코올/베헤닐알코올/아라키딜글루코사이드	2.50
글리세릴스테아레이트	0.50
피이지-4올리베이트	0.50
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.00
콜레스테릴/베헤닐/옥틸도데실라우로일글루타메이트	1.00
마카다미아씨오일	1.00
디메치콘	0.50
사이클로펜타실록산/사이클로헥사실록산	2.00
세테아릴알코올	1.00
미네랄오일	2.50
디소듐이디티에이	0.03
비에이치티	0.05
토코페릴아세테이트	0.30
판테놀	0.20
에칠헥실메톡시신나메이트	0.20
프로필파라벤	0.10
메칠파라벤	0.20
향	0.01
정제수	잔량

시험예 5: 피부주름개선 및 자극성평가

실시예 2 및 비교예 5~10에 따라 제조된 화장료 조성물에 대한 피부 주름 개선효과 및 자극 정도를 다음과 같이 측정하였다.

30대의 여성 50명을 다섯 그룹(실험구, 대조구 1~6)으로 나누어 실험구에는 실시예 2의 화장료 조성물을, 대조구 1 ~ 6에는 비교예 5 ~ 10의 화장료 조성물을 눈가에 매일 밤 1회 0.2 g의 양으로 12주간 도포한 후 눈가의 주름 부위를 ARAMO TS(아람 휴비스, 대한민국)를 사용하여 측정하여 주름 개선 효과 및 자극정도를 평가하였다. 결과는 아래 표 4 및 표 5와 같다.

피검자	주름 측정 수치
	실시예 2			비교예 5			비교예 6			비교예 7			비교예 8			비교예 9			비교예 10
	T 0	T 12	△ T	T 0	T 12	△ T	T 0	T 12	△ T	T 0	T 12	△ T	T 0	T 12	△ T	T 0	T 12	△ T	T 0	T 12	△ T
1	34	27	7	37	32	5	34	28	6	35	32	3	37	33	4	35	30	5	32	30	2
2	37	29	8	36	33	3	33	29	4	35	33	2	33	29	4	37	30	7	34	28	6
3	34	26	8	38	34	4	38	33	5	33	32	1	32	24	8	34	28	6	33	26	7
4	38	32	6	38	30	8	32	27	5	34	30	4	34	29	5	32	25	7	35	32	3
5	32	24	8	35	29	6	32	29	3	36	35	1	33	28	5	38	33	5	38	28	10
6	36	24	12	34	26	8	32	25	7	35	31	4	35	29	6	35	28	7	40	35	5
7	39	30	9	36	32	4	36	32	4	32	28	4	36	34	2	32	26	6	32	30	2
8	37	29	8	32	28	4	37	35	2	37	29	8	32	30	2	33	25	8	37	27	10
9	36	26	10	39	35	4	36	40	-4	32	28	4	36	34	2	38	27	11	33	30	3
10	35	28	7	35	30	5	35	32	3	31	29	2	35	30	5	35	28	7	38	33	5
평 균	35.8	27.5	8. 3	36.0	30.9	5. 1	34.5	31.0	3. 5	34.0	30.7	3. 3	34.3	30.0	4. 3	34.9	28.0	6. 9	35.2	28.3	5. 3

	자극 정도
	실시예 2	비교예 5	비교예 6	비교예 7	비교예 8	비교예 9	비교예 10
피검자1	0	4	3	3	2	1	2
피검자2	0	3	2	4	1	0	1
피검자3	0	4	3	3	3	1	0
피검자4	1	4	2	3	2	1	1
피검자5	0	3	3	4	3	0	2
피검자6	0	2	3	2	1	1	2
피검자7	1	4	2	3	2	1	0
피검자8	0	3	1	3	3	0	1
피검자9	0	4	2	3	2	1	2
피검자10	0	3	3	2	3	1	2
평 균	0.2	3.4	2.4	3.0	2.2	0.7	1.3

(자극 정도 0: 자극 없음 5: 자극이 심하여 사용 중단)

상기 표 4 및 표 5에서 확인되는 바와 같이, 본 발명에 따른 안정화된 레티놀을 함유하는 화장료의 경우 주름개선효과가 우수하며 피부자극성 역시 적은 것으로 확인되었다.

Claims

(A)가온된 글리세린(glycerin) 1 ~ 54중량%에 녹두 유산균 발효 추출물 1 ~ 10중량%, 항산화제 0.5 ~ 1중량%, 레티놀 또는 그 유도체 1 ~ 6.6중량%를 혼합하면서 용해시키는 단계;
(B)생분해성 고분자 1 ~ 5 중량%를 첨가하는 단계;
(C)레시틴 1 ~ 3중량%를 혼합하여 용해시키고, 실리카 용액 0.5 ~ 1 중량%와 혼합한 정제수를 넣어 교반하여 에멀젼 조성물을 제조하는 단계; 및
(D)고압호모게나이저(Microfluidizer)를 사용하여 40 ~ 100nm의 크기를 가지는 나노 에멀젼을 형성하는 단계를 포함하는 레티놀의 안정화 방법.
제 1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 PGA(Polyglycolic acid), PLLA(Poly-L-lactide), PDLLA(Poly-D,L-lactide), PCL(Poly-ε-caprolactone), PDO(Poly-1,4-dioxane-2-one), PTMC(Polytrimethyl- enecarbonate) 및 PHB(Poly-β-hydroxybutyrate)로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 것임을 특징으로 하는 레티놀의 안정화 방법.
제 1항에 있어서, 상기 녹두 유산균 발효 추출물은 녹두를 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드(caprylic/capric triglyceride)로 추출한 후 유산균 발효시킨 것임을 특징으로 하는 레티놀의 안정화 방법.
제 1항에 있어서, 상기 레시틴은 하이드로제네이티드 포스파티딜콜린, 포스포리피드, 하이드로제네이티드 라이소포스파티딜콜린, 하이드로제네이티드 라이소레시틴, 하이드로옥실레이티드 레시틴 및 불포화레시틴으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 것임을 특징으로 하는 레티놀의 안정화 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 의하여 안정화된 레티놀 또는 그 유도체를 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.0001 중량％ 내지 50 중량％ 함유하는 화장료 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 화장료조성물은 그 제형이 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤, 피부 점착타입의 화장료, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 샴푸, 린스, 바디크렌저, 비누, 치약, 구강청정제, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제인 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항염 및 주름개선용 화장료인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.