KR20130008095A - 산화철 나노입자 기반 림프절 이미징용 ｍｒｉ 조영제 및 이를 이용하여 림프절을 조영하는 방법 - Google Patents

산화철 나노입자 기반 림프절 이미징용 ｍｒｉ 조영제 및 이를 이용하여 림프절을 조영하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 나노 입자를 수계 매질에 분산시키기 위한 홍합 접착단백질 모방 공중합체에 의해 분산 안정화된 산화철 나노입자를 포함하는 림프절 조영을 목적으로 하는 조영제 및 이를 이용하여 림프절을 조영하는 방법에 관한 것이다. 홍합 접착단백질 모방 공중합체는 수계 매질에 친화성을 가지는 폴리에틸렌글리콜계 생체적합성 고분자를 접합한 폴리에틸렌이민과 나노입자 표면에 친화성이 있는 폴리도파를 포함하는 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민-폴리도파 공중합체이며, 상기 홍합 접착단백질 모방 공중합체로 산화철 표면을 변조하여 물에 잘 분산시켜 콜로이드 용액을 만들고 이를 포함한 조영제를 제조하였다. 이 조영제는 독성이 없고 림프절에 잘 침적되어 우수한 림프절 조영효과를 나타내며, 전이암 진단에 유용할 것으로 보인다.

Description

산화철 나노입자 기반 림프절 이미징용 ＭＲＩ 조영제 및 이를 이용하여 림프절을 조영하는 방법{MRI Contrast Agent for Lymph Node Based on Iron Oxide Nanoparticles and Method for Imaging Lymph Node Using The Same}
본 발명은 홍합 접착단백질 모방 공중합체에 의해 수계 매질에 분산 안정화된 산화철 나노입자를 포함하는 림프절 이미징 목적의 조영제 및 이를 이용하여 림프절을 조영하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 상기 홍합 접착단백질 모방 공중합체는 수계 매질에 친화성을 가지는 폴리에틸렌글리콜계 생체적합성 고분자를 접합한 폴리에틸렌이민 (polyethylene-glycol grafted polyethyleneimine)과 나노입자 표면에 친화성이 있는 폴리도파 (poly DOPA)를 포함하는 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민-폴리도파 공중합체이며, 상기 홍합 접착단백질 모방 공중합체로 산화철 입자의 표면을 변조시키고 물에 분산시켜 제조한 콜로이드 용액을 포함한 림프절 이미징 목적의 조영제 및 이를 이용하여 림프절을 조영하는 방법에 관한 것이다.
나노 입자는 나노-전자융합기술, 생물영상기술, 의학분야 등 다양한 분야에 응용 되고 있다. 특히, 초상자성 산화철 나노 입자는 자기공명영상(MRI) 조영제, 세포수준의 치료, 발열요법, 약물전달, 세포 분리, 핵산 분리 등 수많은 생명-의학 분야에서 사용되고 있다.
나노 입자를 생명-의학분야에 응용하기 위한 가장 중요한 요건은 일차적으로 고품질의 나노 입자가 확보되어야 하는 것이며, 이와 더불어 생물학적 매질에서 나노 입자가 우수한 분산도 및 분산안정성을 가져야 한다는 것이다. 여기서 고품질 나노 입자라는 의미는 i) 입자 크기의 균일성, ii) 입자 크기 조절의 용이성, iii) 입자의 결정성 및 iv) 입자 형상의 조절 가능성 등으로 파악할 수 있다.
그러나 현재 상용화되고 있는 나노 입자의 경우 대부분 수계에서 합성하거나 기상(氣狀)에서의 합성과정을 통해 얻어지고, 이와 같은 과정을 통해 얻어진 나노 입자는 균일한 입자 형상을 갖기 힘들며 결정성이 떨어지는 경우가 대부분이다. 균일한 크기의 나노 입자의 제조가 용이하지 아니하며, 그 크기의 조절 또한 어렵다.
최근에 많은 연구자들이 종래의 수계에서 합성하던 나노 입자에 비하여 비교적 고품질, 즉 균일한 크기와 결정성을 갖는 금속 산화물 나노 입자를 유기계에서 제조하는 새로운 방법을 개발해 왔다.
이와 같이 유기용매 상에서 나노 입자를 합성하는 경우 나노 입자의 균일성과 그 크기의 조절이 합성 과정 중에 유기첨가제를 통한 안정화 과정을 통하여 이루어지는 경우가 있다. 결과적으로 나노 입자의 표면 상태는 유기 첨가제의 소수성 부분의 영향을 받기 때문에 금속 산화물 나노 입자는 소수성 유기용매 상에는 용이하게 분산되지만 물에는 용이하게 분산되지 아니하여, 물에 분산시킨 경우에는 분산 상태가 충분한 안정성을 나타내지 아니한다.
이러한 유기용매 중에서 제조된 나노 입자 표면의 소수성 특성은 물에서의 안정한 분산을 방해함으로써 생명-의학분야에서 사용하기에 문제가 있다. 그래서 이러한 응용분야에 적용하기 위해서 나노 입자의 표면을 친수성으로 개질하여 수계 매질에 균질하게 분산시키기에 적합한 상태로 만들기 위한 생체적합성 분산 안정화제의 개발이 요청되고 있으며, 뿐만 아니라 이러한 생체적합성 분산 안정화제의 사용을 통하여 수계에서 안정하게 분산 상태가 유지되는 나노 입자 분산 콜로이드 용액의 개발이 요구되고 있다.
나노입자를 수계에 분산시키기 위한 종래 기술에 따른 방법으로서, 두께가 얇은 실리카층을 이용하는 방법이 최근에 학회지[Journal of American Chemical Society, 2005, 127, 4990]에 발표된 바 있다. 이 논문에서는 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르(polyoxyethylene nonylphenyl ether)를 사이클로헥산 용액에 도입, 혼합하여 미세 마이셀 유화 액적을 형성시킨 다음 테트라에틸오르쏘실리케이트(TEOS)의 졸-겔 반응을 유도하여 나노 입자를 실리카층으로 피복시켜 물에 분산시켰다. 상기 문헌에서는 유기용매 상에서 제조된 나노 입자를 물에 분산시키기 위하여 나노 입자의 외부에 친수성을 나타내는 실리카층을 코팅시키는 과정을 기재하고 있으며, 여기서 사용된 미세 에멀젼(micro emulsion)을 통한 실리카 코팅 방법은 일 회의 공정으로 피복시킬 수 있는 나노 입자의 양이 매우 적기 때문에 결과적으로 일 회의 공정으로 제조할 수 있는 나노 입자 콜로이드의 양이 매우 적다는 문제점이 있다. 또한, 일 회의 공정으로 제조할 수 있는 나노 입자 콜로이드의 양이나 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르 등의 양에 따라 미세 에멀젼의 조건이 변화하기 때문에 필요로 하는 실리카층의 두께를 미세하게 조절하기 어렵고, 실리카층 내부에 포함된 나노 입자의 개수도 변화하므로 코팅된 입자의 균일성을 얻기 어렵다는 문제도 있다. 또한 이러한 종래 기술은, 실리카층을 통해서 나노 입자를 안정화시키는 경우, 실리카 표면의 실란 기능기들이 충분히 안정한 상태가 아니기 때문에 서로 반응하여 실리카로 피복된 채 물에 분산된 나노 입자들이 시간이 지날수록 서로 결합하여 뭉치는 문제가 발생하여 장시간에 걸친 분산물의 보관 안정성(storage stability)을 확보하기 어렵다는 문제점이 있다.
최근에 포스핀 옥사이드(phosphine oxide)와 폴리에틸렌글리콜로 구성된 고분자를 이용하여 나노 입자를 물에 분산시키는 방법이 미국화학회지(Journal of American Chemical Society, 2005, 127, 4556)에 발표되었다. 폴리에틸렌글리콜을 1,2-비스다이클로로포스피노에탄(1,2-bis(dichlorophosphino)ethane)과 반응시켜 폴리에틸렌글리콜들이 서로 연결된 고분자를 합성한 다음 이를 소수성 용매에 분산되어 있는 나노 입자와 리간드 교환하는 방법을 이용하여 나노 입자를 분산 안정화시켜 이를 물에 균일하게 분산시키는 방법이 공개되었다. 이 방법은 비교적 간단한 제조방법을 이용하고 있으며, 리간드 교환법을 이용하여 나노 입자를 물에 분산시키지만, 인(P) 원자가 쉽게 포스포릴기로 산화되기 때문에 아르곤이나 질소를 사용한 비활성 분위기 상태에서 피복용 고분자를 합성하여야 하는 문제가 있다. 또한 상기 고분자가 가교되어 있기 때문에 DNA, RNA, 모노클로날 항체 또는 기타 기능성 단백질과 같은 생체 내의 기능성 리간드를 결합시키기 위한 기능기(functional group)의 도입이 용이하지 아니하다는 문제점이 여전히 존재한다.
최근 과학자들은 홍합을 생체접착제의 잠재적 원천으로써 많은 연구들을 수행하였다. 홍합은 염도, 습도, 조류, 난류, 파도 등에 의해 특징지어지는 해양 환경에서 그들 스스로가 수중 접착할 수 있게 기능적으로 분화된 접착제를 생산하여 분비한다. 이들의 발에서부터 분비된 섬유다발로 구성된 족사(thread)를 사용하여 물속에서 물질표면에 강하게 접착한다. 각각의 섬유 끝에는 내수성 접착제로 구성된 플라크(plaque)가 있어 젖은 고체 표면에 붙을 수 있다. 이러한 족사 단백질은 폴리페놀 산화제(polyphenol oxidase)를 이용해 타이로신(tyrosine)기를 수화(hydroxylation)시켜 얻어지는 아미노산인 3,4-dihydroxyphenyl-L-alanine (DOPA)를 많이 포함한다. DOPA의 곁가지에 있는 3,4-dihydroxyphenyl (catechol)은 친수성 표면과 매우 강한 수소결합을 형성할 수 있으며 금속이온, 금속 산화물(Fe3 +, Mn3 +), 반금속(실리콘) 등과 강한 결합을 이룰 수 있다.
암의 예후와 치료에 있어서 전이암의 발생여부는 결정적인 영향을 끼친다. 전이암의 발생여부는 림프절의 전이 여부를 통해 판단하며 현재 림프절을 수술적 방법으로 절제하여 림프절 전이암의 발생여부를 진단하고 있다. 하지만 이는 침습적 방법으로 환자와 의사에게 많은 어려움을 주고 있다. 비침습적 방법으로 CT, MRI, PET를 이용하여 전이암의 발생여부를 볼 수 있으나, 통상 암의 크기가 5mm이상이 되어야 발견할 수 있다. 따라서, 더 작은 크기의 전이암을 비침습적으로 진단할 수 있는 방법이 필요하다.
산화철 나노입자를 생체에 주입하고, 림프절에 산화철이 침적되는 이미지를 이용하여 전이암을 볼 수 있는 방법이 소개 되었다(Mukesh G. Harisinghani, M.D., Jelle Barentsz, M.D., Ph.D., Peter F. Hahn, M.D., Ph.D., Willem M. Deserno, M.D., Shahin Tabatabaei, M.D., Christine Hulsbergen van de Kaa, M.D., Ph.D., Jean de la Rosette, M.D., Ph.D., and Ralph Weissleder, M.D., Ph.D., N Engl J Med 2003; 348:2491-2499). 이들은 산화철 나노입자를 친수화 물질로 수계에 안정화시킨 후 생체에 투입하고, 일정 시간이 지난 다음 정상 림프절 조직과 암이 발생한 림프절조직을 자기공명이미징으로 관찰하여, 그 차이로부터 암 발생의 유무를 진단할 수 있었다. 이 방법을 이용하여 AMAG사(미국)에서 COMBIDEX○R라는 림프절 조영목적의 MRI 조영제를 개발하였다. 그러나, 생체내 투여 후 부작용 및 선택성 등이 좋지 않아 널리 사용되지 않는다. 따라서, 부작용이 적고, 선택성이 좀 더 우수한 림프절 조영 목적의 산화철계 조영제를 개발할 필요가 있다.
본 발명자들은 상기 종래 기술들의 문제점들을 극복하고 나노 입자를 수계에 분산시키기 위하여 나노 입자의 표면을 친수성으로 개질시킬 수 있는 생체적합성 분산 안정화제를 완성하였으며, 이를 이용함으로써, 나노 입자를 수계에 분산 안정화시켜 생명-의학분야에 응용이 가능하게 됨을 발견하였다. 또한, 본 발명의 생체적합성 분산 안정화제에 의해 분산 안정화되는 나노 입자는, 양자점(quantum dot, Q-Dot) 발광소자 등의 나노-전자융합기술분야, 자기공명영상 조영제 등의 생물 영상분야, 세포 수준의 치료 등의 조직공학분야, 발열요법, 약물전달 등의 생명-의학분야에서 응용될 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 목적은 단순한 공정을 통해 다양한 나노 입자 표면을 친수성으로 개질시켜 수계 매질에서의 분산을 안정화시키면서 생명-의학 분야에 응용할 수 있도록 하는, 홍합단백질을 모방한 공중합체를 이용하여 분산 안정화된 산화철 나노입자를 포함하는 림프절 이미징 목적의 조영제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조영제를 이용하여 림프절을 조영하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 홍합 접착단백질 모방 공중합체에 의해 수계매질에 분산 안정화된 산화철 나노입자를 포함하는 림프절 이미징 목적의 조영제 및 이를 이용하여 림프절을 조영하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 상기 홍합 접착단백질 모방 공중합체는 수계 매질에 친화성을 가지는 폴리에틸렌글리콜계 생체적합성 고분자를 접합한 폴리에틸렌이민과 나노입자 표면에 친화성이 있는 폴리도파를 포함하는 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민-폴리도파 공중합체이며, 상기 홍합 접착단백질 모방 공중합체로 산화철 입자의 표면을 변조시키고, 물에 분산시켜 제조한 콜로이드 용액을 포함한 림프절 이미징 목적의 조영제 및 이를 이용하여 림프절을 조영하는 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에서 사용되는 홍합 접착단백질 모방 공중합체는 수계 매질에 친화성을 가지는 폴리에틸렌글리콜계 생체적합성 고분자를 접합한 폴리에틸렌이민과 나노입자 표면에 친화성이 있는 폴리도파를 포함하는 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민-폴리도파 공중합체로, 홍합접착아미노산, 즉 도파를 포함한다.
상기의 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민-폴리도파 공중합체를 제조하기 위하여 먼저 폴리에틸렌글리콜 및 폴리에틸렌이민을 공유결합시켜 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민의 공유결합체를 형성한다. 상기 형성된 공유결합체는 생체적합성 고분자 개시제 (macroinitiator)로서 사용된다.
상기 폴리에틸렌글리콜은 분자량이 300 내지 50,000인 폴리에틸렌글리콜로 말단에 하이드록시기 또는 카르복실기를 가지고 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 한쪽 말단이 메톡시기로 치환된 메톡시 폴리에틸렌글리콜을 사용하였다.
상기 폴리에틸렌이민은 독성이 없는 것으로 알려진 가지형 폴리에틸렌이민으로, 분자량이 100 내지 10,100, 바람직하게는 100 내지 2000인 것을 사용할 수 있다. 한편, 상기 가지형 폴리에틸렌이민의 분자량이 100 미만일 경우에는 본 발명에 따라 생성된 공중합체가 유용한 생리활성물질과 잘 결합할 수 없으며, 분자량이 10,100이상일 경우에는 체내에서 신장을 통해 몸 밖으로 배출되기 어려운 문제점이 있다. 따라서 본 발명에서는 상기 폴리에틸렌이민을 분자량이 상기 범위 내의 것으로 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민-폴리도파 공중합체는 하기 구조 (A)로 표시되는 폴리에틸렌글리콜 유닛, 하기 구조 (B)로 표시되는 폴리에틸렌이민 유닛 및 하기 구조 (C)로 표시되는 폴리도파 유닛을 포함한다.
Figure pat00001
(A) [a는 2 내지 1200이다.]
Figure pat00002
(B) [A는 가지형 폴리에틸렌이민이고, x는 1 내지 100이다.]
Figure pat00003
(C) [d는 1 내지 100 이다.]
상기 폴리에틸렌이민 유닛 (B)은 구체적으로 하기 구조로 표시될 수 있다.
Figure pat00004
[b 및 c는 각각 1 내지 100이고, 바람직하기로는 1 내지 30이다.]
본 발명에서 사용되는 폴리도파는 도파의 N-카르복실 무수물(NCA)로부터 합성되는 것으로, 상기 도파는 홍합접착 아미노산의 일종으로, L-도파(L-3,4-다이하이드록실페닐알라닌) 및 D-도파(D-3.4,-다이하이드록실페닐알라닌)로부터 선택되는 하나 이상이다. 상기 폴리도파는 L-도파 (L-3,4-다이하이드록실페닐알라닌)의 N-카르복실 무수물(NCA)로부터 합성한 L-폴리도파 및 D-도파 (D-3.4,-다이하이드록실페닐알라닌)의 N-카르복실 무수물(NCA)로부터 합성한 D-폴리도파로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
또한, 상기 홍합 접착단백질 모방 공중합체인 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민-폴리도파 공중합체는 하기의 단계로 제조되어진다:
(a) 친수성 고분자인 폴리에틸렌글리콜 및 폴리에틸렌이민을 공유 결합시켜 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민의 공유결합체를 형성시키는단계; (b) 도파의 하이드록시기를 보호한 후 트라이포스젠 촉매 존재하에서 도파 N-카르복실 무수물(NCA)를 합성하는 단계; 및 (c) 상기 (a)단계에서 형성된 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민의 공유결합체 및 상기 (b) 단계에서 합성된 도파 N-카르복실 무수물(NCA)를 유기용매 상에서 반응시켜 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민-폴리도파 공중합체를 제조하는 단계.
상기 (a) 단계는 홍합단백질 모방 공중합체를 제조하기 위한 생체적합성 고분자 개시제(biocompatible macroinitiator)를 제조하는 단계로, (a) 단계에서의 폴리에틸렌글리콜과 폴리에틸렌이민의 공유결합은 다이사이클로카보디이미드(dicycclohecycarbodiimide, DCC)/N-하이드록시석시닐이미드(N-Hydroxysuccinimide, HOSu)를 이용하거나, 또는 헥사메틸렌다이이소시아네이트(Hexamethylene diisocyanate, HMDI)을 이용하여 수행할 수 있으며, 상기 DCC 및 HOSu는 메톡시 말단과 카르복실기 말단을 각각 가지는 폴리에틸렌글리콜에서 카르복실기를 활성화시켜 폴리에틸렌이민의 일차아민과 반응하여 펩타이드 공유 결합을 형성한다. 또한 상기 HMDI는 메톡시 말단을 가지는 폴리에틸렌글리콜의 하이드록실기를 활성화시켜 폴리에틸렌이민의 일차아민과 결합할 수 있는 역할을 한다. HMDI에 의해 활성화된 폴리에틸렌글리콜과 폴리에틸렌이민의 공유결합은 상기 두 고분자가 공유결합 될 수 있는 반응이라면 모두 사용 가능하고, 본 발명의 일실시예에서는 DCC/HOSu로 활성화된 폴리에틸렌글리콜 및 폴리에틸렌이민을 클로로포름에 각각 녹인 다음, 폴리에틸렌글리콜 용액을 폴리에틸렌이민 용액에 한방울씩 떨어뜨려 두 고분자를 공유결합시켰으며, 이후 반응이 완료되면 반응액을 농축한 후 디에틸에테르에 침전시킴으로써 폴리에틸렌글리콜과 폴리에틸렌이민의 공유결합체를 수득하였다. 상기 DCC/HOSu에 의해 활성화된 폴리에틸렌글리콜의 구조 및 상기 활성화된 폴리에틸렌글리콜과 가지형 폴리에틸렌이민(bPEI)의 공유결합 구조를 하기에 도시하였다.
Figure pat00005
[상기에서, a는 2 내지 1200이다.]
< 메톡시폴리에틸렌글리콜의 활성화( mPEG - NHS )>
Figure pat00006
[상기에서, a는 2 내지 1200이다.]
< 메톡시폴리에틸렌글리콜 -폴리에틸렌이민( mPEG - bPEI )>
상기 2) 단계의 도파 N-카르복실 무수물(NCA)의 합성은 홍합접착 아미노산인 L-도파(L-3,4-다이하이드록실페닐알라닌) 및 D-도파(D-3.4,-다이하이드록실페닐알라닌)로부터 선택되는 하나 이상을 출발물질로하여 당업계에 공지된 아미노산 N-카르복실 무수물(NCA)의 제조방법에 따라 제조될 수 있으며, 바람직하게는 적절한 용매에서 상기 홍합접착 아미노산(D-DOPA 또는 L-DOPA)을 트라이포스젠 촉매 존재하에서 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 하기에 도시된 바와 같이, L-도파의 하이드록실기를 아세트산무수물과 염산을 이용하여 L-도파를 아세틱산에 용해시킨 후 하이드록실기를 아세틸화시켜 보호한 (AC)2-DOPA를 합성한 후 테트라하이드로퓨란(THF) 유기용매 상에서 트라이포스젠(Triphosgene)을 이용하여 L-도파의 N-카르복실 무수물(NCA)를 합성하였다[하기 참조].
Figure pat00007
<L- 도파 N- 카르복실 무수물( NCA )의 반응식>
상기 (c) 단계의 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민-폴리도파 공중합체의 제조는 상기 (a)단계에서 형성된 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민의 공유결합체 및 상기 (b) 단계에서 합성된 도파 N-카르복실 무수물(NCA)를 유기용매 상에서 다중 개시(multi-initiation)하여 중합반응시켜 이루어지는 것으로, 상기 공중합체 내 폴리도파는 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민의 공유결합체에 존재하는 일차아민이 다중개시제로 역할을 하여 도파 N-카르복실 무수물의 중합을 유도함으로써 합성되며, 이와 같은 과정을 통해 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민의 공유결합체에 합성된 폴리도파가 결합됨에 따라 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민-폴리도파 공중합체가 수득된다.
상기 (c) 단계에서 생체모방접합 부위로 사용되는 도파 N-카르복실 무수물(NCA)의 첨가량을 조절할 경우, 본 발명에 따른 공중합체의 접합력 및 소수성을 조절할 수 있다. 바람직하게 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민의 공유결합체 및 도파 N-카르복실 무수물(NCA)의 몰비는 1:1 내지 1:50 이며, 상기 범위를 벗어나게 되면 홍합 접착단백질 모방 공중합체의 소수성이 강해지거나 접합력이 약해지는 문제점이 있다.
상기 (c) 단계의 유기용매로는 디메틸설폭사이드(DMSO), 테트라하이드로퓨란(THF) 및 클로로폼(ClCH3)으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기 (c) 단계에서의 중합과정이 종결된 후 (d) 폴리도파의 하이드록시기 보호기를 탈보호화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 상기 폴리에틸렌글리콜-폴리에티렌이민-폴리도파의 중합과정이 종결된 후 다이메틸포름아마이드(DMF)에 분산시킨 후 적당량의 피페리딘(piperidine)을 첨가하여 아세틸그룹으로 보호된 도파의 하이드록실기를 탈아세틸화 시켜주어 하기 구조의 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민-폴리도파 공중합체를 수득하였다.
Figure pat00008
[상기에서, a는 2 내지 1200이고, d 및 d'는 서로 독립적으로 1 내지 100 이다.]
< 메톡시폴리에틸렌글리콜 -폴리에틸렌이민-폴리도파( mPEG - bPEI - pDOPA )>
본 발명에서 사용되는 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민-폴리도파 공중합체는 홍합 접착 단백질 모방형 생체적합성 고분자로 이루어지면서 폴리도파를 포함하는 생체적합성 가지형 분산 안정화제로서 나노 입자를 수계 매질에 분산시킴으로써 안정화하는데 사용될 수 있다.
상기 나노 입자는 금속, 금속산화물, 금속합금, 유기고분자, 무기고분자로 이루어지며, 크기가 100nm 이하이다. 보다 구체적으로는, 산화철, 코발트 페라이트(CoFe2O4), 망간 페라이트(MnFe2O4), 철-백금 합금(Fe-Pt alloy), 코발트-백금 합금(Co-Pt alloy), 코발트(Co), 카드뮴셀레나이드(CdSe), 카드뮴텔루라이드(CdTe), 카드뮴셀레나이드/징크설파이드 코어/쉘(CdSe/ZnS core/shell), 카드뮴셀레나이드/징크셀레나이드 코어/셀(CdSe/ZnSe core/shell), 카드뮴셀레나이드/카드뮴설파이드 코어/쉘(CdSe/CdS core/shell), 카드뮴텔루라이드/징크설파이드 코어/쉘(CdTe/ZnS core/shell), 카드뮴텔루라이드/징크셀레나이드 코어/쉘(CdTe/ZnSe core/shell), 카드뮴텔루라이드/카드뮴설파이드 코어/쉘(CdTe/CdS core/shell), 카드뮴텔루라이드/카드뮴셀레나이드 코어/쉘(CdTe/CdSe core/shell), 징크설파이드(ZnS), 카드뮴설파이드(CdS), 인듐아세나이드(InAs) 인듐포스파이드(InP), 인듐아세나이드/인듐포스파이드 코어/쉘(InAs/InP core/shell), 인듐아세나이드/카드뮴셀레나이드 코어/쉘(InAs/CdSe core/shell), 인듐아세나이드/징크설파이드 코어/쉘(InAs/ZnS core/shell), 인듐아세나이드/징크셀레나이드 코어/쉘(InAs/ZnSe core/shell), 인듐포스파이드/카드뮴셀레나이드 코어/쉘(InP/CdSe core/shell), 인듐포스파이드/징크설파이드 코어/쉘(InP/ZnS core/shell), 인듐포스파이드/징크셀레나이드 코어/쉘(InP/ZnSe core/shell), 금(Au), 팔라듐(Pd), 백금(Pt), 폴리스티렌 및 테플론으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이다.
상기 산화철에는 FeO, Fe3O4, α-Fe2O3, β-Fe2O3, γ-Fe2O3, ε-Fe2O3, Fe(OH)2, Fe(OH)3, α-FeOOH, β-FeOOH, γ-FeOOH, δ-FeOOH, Fe5HO8·4H2O, 5Fe2O3·9H2O, FeOOH·4H2O, Fe8O8(OH)6(SO)·nH2O, Fe3 + 16O16(OH·SO4)12-13·10-12H2O 등이 포함된다. 보다 바람직하게는 이 중 Fe3O4(magnetite) 또는 γ-Fe2O3(maghemite) 또는 Fe3O4(magnetite)와 γ-Fe2O3(maghemite)의 혼합물을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 산화철의 직경(core diameter)은 바람직하기로는 1nm 내지 25nm이다. 산화철 직경은 투과전자현미경(TEM: Transmission Electron Microscopy)으로 관찰할 수 있다. 산화철의 직경이 1nm보다 작으면 MR T2 조영효과가 작으며, 산화철 직경이 25nm보다 커지면 페리자성을 띠게 되어 MRI에 사용 할 수 없다.
폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민-폴리도파 공중합체로 수계 매질에 안정화된 산화철 나노입자의 수화직경(hydrodynamic diameter)은 바람직하기로는 3nm 내지 100nm이다. 수화직경은 물에 분산시킨 상태에서 광산란법(DLS: Dynamic Light Scattering)으로 측정할 수 있다. 수화직경이 3nm보다 작으면 생체에 주입한 친수화된 산화철 나노입자가 림프절에 침적되기 전에 생체로부터 배출되기 쉬우며, 수화직경이 100nm보다 크면 생체에 주입한 친수화된 산화철 나노입자가 생체내 면역시스템(대식세포 등)에 의해 너무 빨리 제거되어 림프절에 침적되기가 어렵다.
본 발명의 림프절 조영 방법은 상기 홍합 접착단백질 모방 공중합체로 산화철 입자의 표면을 변조시키고 물에 분산시켜 제조한 콜로이드 용액을 포함한 림프절 이미징 목적의 조영제의 투여 전후의 림프절의 MRI 신호의 세기 변화 또는 차이를 이용한다. 상기 림프절의 MRI 신호 세기 변화는 T2 신호 변화를 기준으로 알 수 있다.
본 발명에서 자기공명이미징(MRI)방법에서 조영효과를 극대화하기 위해서 사용하는 조영제(Contrast agent)를 주입하는 방법에는 정맥주입(intravenous injection), 경구투여 등을 들 수 있다. 이 방법들 중 림프절에 산화철 침적을 최대화하기 위해서는 바람직하기로는 정맥주입방법이 좋다.
상기 다양한 나노입자 중에서도 상기의 홍합 접착단백질 모방 공중합체에 의해 분산 안정화된 산화철 나노입자를 이용하여 생체내 MRI조영한 경우, 림프절에서의 T2 신호 감쇄비가 80% 이상으로 나타나 림프절 전이암의 진단에 유용할 것으로 보인다.
본 발명에서 사용되는 홍합 접착단백질 모방 공중합체는 다중 개시 중합을 통해 형성된 폴리도파를 가지며 이로 인해 1분자당 1유닛 이상의 도파가 존재 하여 친수성 표면과 강한 결합력을 가지고 있으며, 또한, 양전하를 띠고 있기 때문에 음전하를 띠는 나노입자의 표면에 추가적인 정전기적 결합력을 제공하고, 가지형 폴리에틸렌이민의 가지에 친수성을 가지는 다수의 폴리에틸렌글리콜 분자들이 결합되어 있어 친수성 및 입체효과를 통해 높은 수계 분산 안정성을 제공한다. 따라서, 본 발명에서와 같이 홍합 접착단백질 모방 공중합체에 의해 수계 매질에 분산 안정화된 산화철 나노 입자 콜로이드 및 이를 포함하는 림프절 조영 목적의 조영제 및 이를 이용하여 림프절을 조영하는 방법은 우수한 생체내 조영결과를 나타내며 이를 통해 림프절 전이암의 진단에 유용할 것으로 판단할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 사용되는 홍합 접착단백질 모방 공중합체의 화학적 구조 및 나노입자의 안정화를 나타낸 것이다.
도 2는 제조예 1의 <1-5>에서 제조된 mPEG-bPEI-pDOPA5 의 1H-NMR (in DMSO) 분석 결과이다.
도 3은 제조예 1의 <1-5>에서 제조된 mPEG-bPEI-pDOPA5 의 1H-NMR (in CDCl3) 분석 결과이다.
도 4는 제조예 1의 <1-5>에서 제조된 mPEG-bPEI-pDOPA15 의 1H-NMR (in DMSO) 분석 결과이다.
도 5는 제조예 1의 <1-5>에서 제조된 mPEG-bPEI-pDOPA15 의 1H-NMR (in CDCl3) 분석 결과이다.
도 6은 실시예 1에서의 콜로이드 용액의 철 농도에 따른 Hep G2 세포의 생존력이다.
도 7은 실시예 2에서의 조영제(PDIE1) 투여 전후 누드 마우스의 T2신호 측정 결과 영상이다.
도 8은 실시예 2에서의 조영제(PDIE2) 투여 전후 누드 마우스의 T2신호 측정 결과 영상이다.
도 9은 실시예 2에서의 조영제(PDIE3) 투여 전후 누드 마우스의 T2신호 측정 결과 영상이다.
도 10은 실시예 2에서의 조영제(PDIE4) 투여 전후 누드 마우스의 T2신호 측정 결과 영상이다.
도 11은 실시예 2에서의 조영제 투여 전후 T2신호 감쇄 효과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 안정화 되기 전에 분산되어 있던 산화철 나노입자 (a: 11 nm)와 홍합 접착단백질 모방 공중합체(MIL2)의 사용으로 인하여 안정화되어 물에 분산된 산화철 노입자 콜로이드(e: 11 nm)의 투과전자현미경 (transmission electron microscopy, TEM) 사진과 광산란 분석(DLS) 장비를 이용한 홍합 접착단백질 모방 공중합체 사용으로 물에 안정적으로 분산된 산화철 나노입자 콜로이드의 수화직경※(i)이다.
※수화직경: HD(Hydrodynamic Diameter), 물에 분산된 상태에서 분산 안정화 물질을 포함하는 직경. 수계에 분산된 상태에서 광산란 분석(DLS: Dynamic Light Scattering)장비(Malvern社, Zetasizer NanoZS)를 통하여 측정된 수평균 직경
도 13은 산화철 나노입자와 홍합 접착단백질 모방 공중합체로 변조되어 물에 분산 안정화된 철 산화물 나노입자 콜로이드의 안정성을 다양한 pH와 이온농도에서 실험한 결과이다. 광산란 분석(DLS) 장비를 이용하여 수화직경(HD: Hydrodynamic Diameter)을 측정 및 비교하여 결과(MIL0(◆), MIL1(▲), MIL2(○))를 얻었다.
이하, 본 발명의 구성 요소와 기술적 특징을 다음의 실시예들을 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 구성요소의 기술적 범위를 실시예들에 예시한 것들로 한정하고자 하는 것은 아니다. 더욱이, 상기 기술의 당업자들은 본 발명의 근본적인 개념과 그 실행을 쉽게 수정하거나 변경할 수 있을 것이다.
L-3,4-다이하이드록시페닐알라닌 (도파, DOPA), mPEG-OH (5,000 Da), 다이메틸포름아마이드 (DMF) N-하이드록시숙신이미드 (NHS), N,N'-다이사이클로헥실카보다이이미드 (DCC), 아세트산 무수물, 빙초산, 메틸렌클로라이드 (MC) 및 클로로포름을 시그마 케미컬사(Sigma Chemical Company (St. Louis, MO))로부터 구입하고, bPEI (1,800 Da (PEI 1,800))는 알파에이사(Alfa Aesar)로부터 구입하고, 사용 전 48시간 동안 40℃에서 진공건조시켰다.
[ 제조예 1] 홍합 접착단백질 모방 공중합체의 합성
Figure pat00009
Figure pat00010
<1-1> 폴리에틸렌글리콜의 활성화
<1-1-1> 다이사이클로카보디이미드 / N- 하이드록시석시닐이미드 ( DCC / HOSu ) 이용하는 방법
환류 응축기 설치 후 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 카르복실(mPEG-COOH, 5000) (10 g)을 250ml의 플라스크를 이용하여 메틸렌클로라이드(CHCl2) (50 ml)에 용해시켰다. 이후 N-하이드록시숙시닐이미드 (0.52 g)과 다이사이클로카보다이이미드(0.74 g)를 첨가한 후 20시간 동안 상온에서 반응시켰다. 다이사이클로헥실우레아를 필터 과정을 통해서 제거한 후 디에틸에테르(diethylether)에 침전시킴으로써 활성화 형태의 폴리에틸렌글리콜 (mPEG-SPA)을 수득하였다. (수율=87%) 1H NMR (300MHz, CDCl3): δ 4.1 (b,-CO-CH2-CH2 - CH 2-O-), 3.5-3.8 (m, -CH 2CH 2O-), 2.8 (b, -CO-CH 2-CH 2-CO-), 1.8 (b, -CO-CH2-CH 2-CH2-CH 2-CH2-O-), 1.2 (b, -CO-CH2-CH2-CH 2-CH2-CH2-O-).
<1-1-2> 헥사메틸렌다이이소시아네이트 ( HDMI ) 이용하는 방법
환류 응축기 설치 후 메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG-OH) (15.23 g)을 100ml의 플라스크를 이용하여 클로로폼(CHCl3) (15 ml)에 용해시켰다. 이후 헥사메틸렌 디이소시아네이트(Hexamethylene diisocyanate, HMDI) (60 ml)을 처리한 후, 24시간 반응시켜 폴리머를 제조하였다. 반응이 끝나면 상기 폴리머를 석유에테르에 침전시켜 정제하였고 석유에테르 (400 ml)로 3번 세척한 다음, 클로로폼(CHCl3) (20 ml)에 다시 녹였다. 그런 다음 석유에테르 (500 ml)에 다시 침전시켜 정제하였다. 상기와 같은 과정을 10번 반복수행한 후 진공건조를 통해 활성화 형태의 폴리에틸렌글리콜을 수득하였다. (수율=80%)
<1-2> 폴리에틸렌글리콜과 폴리에틸렌이민의 공유결합체 ( mPEG - bPEI ) 형성
상기 실시예 <1-1>에서 수득한 활성화 형태의 폴리에틸렌글리콜 (mPEG-SPA, 2 g)을 클로로포름 (200 ml)에 녹였다. 이후, 폴리에틸렌이민(Alfa Aesar, 1800da, 0.5 g)을 클로로포름 (50 ml)에 녹인 다음, 여기에 상기 폴리에틸렌글리콜을 녹인 용액을 한 방울씩 떨어뜨림으로써 폴리에틸렌글리콜과 폴리에틸렌이민의 공유결합 반응을 수행하였다. 이때, 상기 반응은 24시간 동안 수행하였으며, 반응 완료 후 진공농축장치를 이용하여 총 부피가 30 ml가 되도록 농축한 다음, 디에틸에테르(diethylether)에 침전시킴으로써 폴리에틸렌글리콜과 폴리에틸렌이민의 공유결합체(mPEG-bPEI)를 수득하였다. (수율=85%) 1H NMR (300 MHz, D2O) 측정 (-CH 2CH 2O- of PEG at 3.5-3.8 ppm and -CH 2CH 2NH- of PEI at 2.5-3.2 ppm)은 mPEI-bPEG의 Mn 이 약 41,800 Da라는 것을 보여주었다. 각 mPEI-bPEG는 거의 8(이하, mPEG8-bPEI1 라 함)을 가졌다고 추측되었다. 1H NMR (300 MHz, D2O) δ3.5-3.8 (m, -CH 2CH 2O-): δ3.5-3.8 (m, -CH 2CH 2O-), 3.3 (s, CH 3O-), 2.5-3.2 (m, -CH 2CH 2NH-).
<1-3> 도파아미노산의 하이드록실 그룹 보호
L-도파 (3 g)을 빙초산 (100 ml)에 부유시킨 후 건조된 염산 기체를 5시간 동안 상온에서 퍼지(purging)시켰다. 아세트산무수물 (3 ml)을 첨가한 후 상온에서 1시간 30분 동안 반응시킨 후 아세트산무수물 3ml을 첨가한 후 60℃의 오일배스에서 30분동안 반응한 후 진공농축장치에서 농축한 후 에탄올을 첨가하여 미반응 아세트산무수물을 제거시켰다. 그 후 디에틸에테르(diethylether)에 침전시킴으로써 하이드록실 그룹이 보호된 도파 아미노산 (DOPA(Ac)2)을 수득하였다. (수율=80%) 1H NMR (300MHz, D2O): δ 6.7-6.9 (m, -C6 H 3(OH)2), 4.0 (m, C6H3(OH)2-CH2-CH(N-)-C(O)N-), 3.2 (m, C6H3(OH)2-CH 2-CH-), 2.4 (s, CH 3(CO)-).
<1-4> 도파아미노산 N- 카르복실 무수물( NCA )의 합성
THF (50 ml)에 상기 실시예<1-3>에서 합성된 하드록실 그룹이 보호된 도파 아미노산 (0.5 g) 및 트라이포스젠 (triphosgene) (0.5 g)을 분산시킨 후, 오일배스에서 60℃의 온도로 반응시킨 다음, 헥산 (800 ml)에 침전시킨 다음, 다시 THF (50 ml)에 녹인 다음 헥산에 침전시켰다. 이러한 과정은 3번 반복 수행하였으며 정제 후 진공건조기에서 건조시켜 도파 N-카르복실 무수물 (DOPA(AC2)-NCA)을 수득하였다. (수율=65%) 1H NMR (300MHz, DMSO): δ 6.2-6.9 (m, -C6 H 3(OH)2), 4.3 (t,-NHCHCO-), 3.7 (m, C6H3(OH)2-CH2-CH(N-)-C(O)N-), 3.3 (m, C6H3(OH)2-CH 2-CH-), 2.4 (s, CH 3(CO)-).
<1-5> 폴리에틸렌글리콜 -폴리에틸렌이민- 폴리도파아미노산 공중합체 ( mPEG -bPEI-p(DOPA))의 합성
상기 실시예 <1-2>에서 제조된 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민의 공유결합체(mPEG-PEI) (0.5 g)을 <1-4>에서 제조된 도파 N-카르복시 무수물(Phe-NCA)과 각각 다른 몰비율 (1:5 및 1:15)로 사용하여 THF 용매에서 각각 반응시켜 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민-폴리도파 공중합체를 합성하였다. (수율, 몰비율 1:5=85% 몰비율 1:15=87%)
<1-5> 폴리에틸렌글리콜 -폴리에틸렌이민- 폴리도파아미노산 공중합체의 탈보호화
상기 실시예 <1-5>에서 합성된 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민-폴리도파 공중합체 (0.5 g)를 DMF (30 ml)에 녹인 후 피페리딘(piperidine) (8 ml)을 첨가한 후 15분 반응 후 디에틸에테르(diethylether)에 침전시킴으로써 도파의 하이드록실 보호기가 탈보호화된 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민-폴리도파 공중합체를 수득하였다. (수율, 몰비율 1:5=80%[도 2 및 도 3] 몰비율 1:15=81%[도 4 및 도 5])
하기의 표 1은 본 발명에 따른 홍합 접착단백질 모방 공중합체의 구조 및 특성 분석에 관한 것으로 1H-NMR, UV-Vis spectroscopy, 형광표지물질을 이용하여 고분자 공중합체의 구조 및 특성을 분석하였다.
[표 1] 홍합 접착단백질 모방 공중합체의 구조 및 특성 분석
Figure pat00011

[ 제조예 2] 홍합 접착단백질 모방 공중합체로 안정화시킨 철 산화물 나노 입자의 제조
유기 용매에서 합성하고, 올레산(oleic acid)으로 안정화시킨 자성 나노 입자 (Fe3O4) 10 mg과 홍합 접착단백질 모방 공중합체(MIL1 및 MIL2 각각) 60mg을 10 ml의 클로로포름(CHCl3)에 분산시키고 30분 동안 상온에서 교반시켰다. 클로로포름(CHCl3)을 증발시키고 증류수를 첨가한 후에 분산된 결과물을 200 nm 주사기 필터(MCE syringe filter, Fisher Scientific)로 걸렀다. 미반응 안정화제를 제거하기 위하여 원심분리후 스핀 필터(Millipore, 10K NMWL, 10000×g, 10 min)를 이용하여 3-5번 반복한 후 결과물을 pH7인 수계(0.01M PBS: Phosphate Buffered Saline 수용액)에 분산시켰다.
[ 실시예 1] 홍합 접착단백질 모방 공중합체로 안정화시킨 철 산화물 나노 입자 콜로이드 용액의 세포 생존력 실험
제조예 1과 제조예 2의 제시된 방법을 통해 하기 표 2와 같은 물성을 가지는 홍합 접착단백질 모방 공중합체로 안정화 된 철 산화물을 물에 분산시켜 콜로이드 용액을 제조하였다.
[표 2] 홍합 접착단백질 모방 공중합체로 안정화 된 철 산화물의 콜로이드 용액
Figure pat00012

표 2의 분산 안정화 된 철 산화물 나노 입자에 PBS(Phosphate Buffered Saline) powder를 0.01M 농도가 되도록 첨가하고 생체 적용가능성을 알아보기 위해 Hep G2 세포에 대하여 생존력 실험(MTT assay)을 진행하였다.
<1-1> 시료 준비
상기 PBS가 포함된 PD1과 PD2를 0.2μm 멸균 주사기 필터를 통과시킨 다음 유도 결합 플라즈마-원자 방출 분광법(ICP-AES:Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectroscopy)을 이용하여 농도를 측정하였다. 농도를 측정한 PD1과 PD2를 각각 200μL씩 분취하여 배지(DMEM: Dulbeco"s Modified Eagle"s Medium 89%, Pluronic? F-127 10%, AA : antibiotic-antimycotic 1%) 200μL와 혼합한 뒤 이를 0번 시료로 하여 각각의 용액 350μL와 배지 350μL를 섞은 뒤 1번 시료로 하고 각 1번 시료 350μL와 배지 350μL를 섞어 2번 시료로 명명하였다. 이와 같이 처음 농도의 1/2씩 희석하여 PD1, PD2 각각 1-9번의 9개 시료를 만들고 10번 시료는 PD1과 PD2가 없는 배지 100%의 시료를 준비하였다. 대조군으로 PBS용액을 앞의 과정과 동일하게 하여 총 PD1, PD2와 같은 개수의 대조군을 준비 하였다(표 3 참조).
[표 3] 세포 생존력 실험을 위한 철 산화물 나노 입자 콜로이드 시료
Figure pat00013

<1-2> 세포(HepG2)배양 및 준비
HepG2세포를 계대배양하여 증식시킨 후 96홈판에 100,000세포/홈이 되도록 채웠다. 이 때 96개의 홈 중 가장자리를 제외한 나머지 60홈만을 이용하였다. HepG2세포가 홈판의 바닥에 부착될 수 있도록 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.
<1-3> 시료의 첨가
<1-2>에서 준비한 HepG2가 배양된 홈판에서 배지를 제거하였다. 배지가 제거된 홈판의 각 홈에 [표 3]에 나타나 있는 상기 <1-1>에서 준비한 PD1, PD2, 대조군의 각 1번부터 10번의 시료들을 100 μL씩 넣어 주었다. 이 때 각 시료와 대조군을 3배수로 준비하였다. 시료를 넣어 준 뒤 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.
<1-4> 세포 생존력 실험(MTT실험)
MTT실험은 대사작용이 활성화된 세포에 의하여 황색의 테트라졸리움 염 MTT시약이 보라색의 포르마잔 결정으로 바뀌는 원리를 이용하여 세포의 생존력을 측정하는 실험이다.
실험 1시간 전에 생존력 실험에 사용할 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)시약을 37℃ 수조에서 녹였다. 상기 <1-3>에서 준비해 놓은 96홈판의 시료와 대조군이 투입된 각 홈에 MTT시약을 각 20 μL씩 첨가하였다. 이때 빛에 노출되지 않도록 주의한다. 대사작용이 활성화된 세포를 확인하기 위하여 MTT 시약 첨가 후 37℃에서 4시간 배양하였다. 배양 후 보라색의 포르마잔 결정을 녹여내기 위하여 가용화 용액을 각 홈에 100 μL씩 첨가하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 마이크로플레이트 리더기(microplate reader, Molecular Devices社, Spectra Max 190)를 이용하여 550nm와 690nm에서의 광학밀도 값을 측정하고 이를 이용하여 세포의 생존력을 계산하였다. 세포의 생존력은 아래의 [수학식 1]로 계산한다.
[수학식 1]
Figure pat00014
ODi ,550: 시료가 주입 된 i 번 홈판의 550nm에서의 광학밀도 값
ODi ,690: 시료가 주입 된 i 번 홈판의 690nm에서의 광학밀도 값
ODSi ,550: 대조군 i 번 홈판의 550nm에서의 광학밀도 값
ODSi ,690: 대조군 i 번 홈판의 690nm에서의 광학밀도 값
도 6은 세포 생존력 실험의 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 일반적으로 세포 생존력 실험에서 ±20%는 오차 범위로 본다. 본 실시예의 결과는 실험한 농도 구간의 대부분에서 80% 이상의 세포 생존력을 보이는 것을 확인할 수 있다. 본 결과는 홍합 접착단백질 모방 공중합체로 안정화시킨 철 산화물 나노 입자의 세포 독성이 없다는 것을 의미하며 생체내의 이용에도 안전함을 증명하는 것이다.
[ 실시예 2] 홍합 접착단백질 모방 공중합체로 안정화시킨 철 산화물 나노입자 콜로이드 용액을 포함하는 조영제의 체내 자기공명 영상 성능 측정
제조예 1과 제조예 2의 제시된 방법을 통해 하기 표 2와 같은 물성을 가지는 홍합 접착단백질 모방 공중합체로 안정화된 철 산화물 나노 입자 콜로이드 용액을 제조하였다.
[표 4] 홍합 접착단백질 모방 공중합체로 안정화 된 철 산화물 나노 입자 콜로이드 용액
Figure pat00015
표 4의 분산 안정화 된 철 산화물 나노 입자 콜로이드 용액에 PBS(Phosphate Buffered Saline)을 첨가하여 조영제를 제조하고, 이들의 자기공명영상용 조영제로서의 사용 가능성을 평가하기 위해 자기공명영상진단기(Trio 3.0T, Simens)에서 Loop coil을 이용하여 체내 T2 조영 성능을 평가하였다.
체내 조영 성능 평가는 정상 상태의 누드마우스(Balb/nude)를 이용하여 진행하였으며, 누드마우스의 체중은 30g이었다. 쥐를 마취한 뒤 자기공명영상진단기에 수평으로 넣고 단면을 관찰하였다. 누드마우스의 자기공명영상은 조영제 주입 전, 조영제 주입 24시간 후, 측정하여 조영제 주입 전과 후의 림프절을 관찰 비교하였다. 콜로이드 용액에 PBS(Phosphate Buffered Saline) powder를 0.01M 농도가 되도록 첨가하여 조영제를 제조하였다. 철 농도를 ICP-AES를 통해 분석하고 쥐의 무게를 고려한 투여량(표 4)을 계산하여 조영제의 총 부피가 500μL가 되도록 준비하였다. 조영제는 쥐의 꼬리 정맥을 통해 주입하였다.
체내 T2 이미징 성능 측정은 Simens社에서 제공하는 T2Me3d 펄스 대열을 사용하였으며 구체적인 파라미터는 다음과 같다.
TR(repetition time)=40.0msec, TE(echo time)=22.0msec, FOV=49mmx70mm, Matrix size,=256x180, slice thickness=0.6mm, number of acquisition=6
도 7 내지 도 10은 위의 조건으로 얻은 체내 자기공명영상의 일부분을 나타낸 것이다.
제조한 조영제의 T2 감쇄효과를 정량적으로 평가하기 위해 가장 잘 보이는 림프절인 사타구니(inguinal)림프절과 겨드랑이(brachial)림프절의 한 단면을 선정하여 림프절의 변색된 부분을 ROI(Region of Interest)로 선택하고 신호세기를 분석하였다. 획득한 자기공명영상의 전체적인 신호 세기가 측정시에 매번 변화하므로 신호세기의 절대값(S: signal intensity)으로 조영성능을 평가하기에는 무리가 있어 사타구니 림프절은 우측 뒷다리 근육, 겨드랑이 림프절은 우측 앞다리 근육을 대조군(N: noise)으로 하여 상대적 신호세기(SNR:Siganal to Noise Ratio)를 구하였다. 조영제 사용 전후의 SNR을 비교하여 T2신호 감쇄비(ΔR2)를 계산 하였으며 이를 도 11의 그래프로 나타내었다. 다음의 수학식 2는 T2신호 감쇄비(ΔR2)를 계산하는 방법이다.
[수학식 2]
Figure pat00016

도 7 내지 도 10을 보면 누드 마우스의 림프절이 조영제 투여 후 검게 변하는 것을 확인 할 수 있다. 하기 표 5와 표 6에는 각각 사타구니 림프절과 겨드랑이 름프절의 조영제 시료 투여 전 후의 상대적 신호세기(SNR)와 신호 감쇄비(ΔR2)를 나타내었다. 도 11에는 조영제 시료 투여 전 후의 상대적 신호세기(SNR)를 나타내었다. 투여후에는 투여전에 비해 뚜렷한 신호감쇄를 나타내었음을 알 수 있으며, 이를 이용하면 림프절의 암의 존재 파악에 유용하게 사용 될 수 있다.
[표 5] 조영제를 이용한 누드 마우스의 사타구니(inguinal)림프절 T2신호
Figure pat00017

[표 6] 조영제를 이용한 누드 마우스의 겨드랑이(brachial)림프절 T2신호
Figure pat00018

[ 실시예 3] 홍합 접착단백질 모방 공중합체로 안정화시킨 철 산화물 나노입자 콜로이드 용액의 안정성 측정
철산화물 나노입자의 투과 전자 현미경 (Transmission Electron Microscopy) 사진(a: 11nm)과 홍합 단백질 모방 공중합체 (MIL2)로 물에 분산된 산화철 나노 입자 콜로이드(b)의 투과 전자 현미경 (Transmission Electron Microscopy) 사진이 도 12에 나타나 있다.
도 12의 투과 전자 현미경 사진은 본 발명의 방법으로 제조된 홍합 접착단백질 모방 공중합체를 사용하여 물에 안정하게 분산된 산화철 나노 입자가 공중합체 첨가 이전에 소수성 용매에 녹아있는 산화철 나노 입자의 형상과 크기가 동일함을 알 수 있다. 홍합 접착단백질 모방 공중합체(MIL2)로 물에 분산된 산화철 나노 입자 콜로이드의 수화직경(c)을 도 12에 표시하였다. 산화철 나노 입자 콜로이드의 수화직경은 광산란 방법을 통해 측정한 수평균 수화직경으로 균일성을 나타내는 것을 확인 할 수 있다.
도 13은 홍합 접착단백질 모방 공중합체를 사용하여 수계 매질에서 안정하게 분산된 산화철 나노 입자 콜로이드의 안정성을 다양한 pH(a) 및 이온농도(b)에서 확인한 결과이다. 광산란 방법을 통해 수화직경을 다양한 pH와 이온 농도에서 측정하였다. 홍합 접착단백질 모방 공중합체를 사용하여 수계 매질에서 안정하게 분산된 산화철 나노 입자 콜로이드 (MIL1(▲), MIL2(○))는 홍합 접착단백질 모방 공중합체를 적용하지 않은 산화철 나노입자(MIL0(◆))에 비하여 다양한 농도와 pH에서 안정하다는 것을 알 수 있다.

Claims (12)

  1. 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민-폴리도파 공중합체로 수계 매질에 분산 안정된 산화철 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 림프절 조영 목적의 조영제.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 산화철 나노입자는 직경이 1-25nm인 것을 특징으로 하는 림프절 조영 목적의 조영제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 수계 매질에 분산된 산화철 나노입자는 수화직경이 3-100nm인 것을 특징으로 하는 림프절 조영 목적의 조영제
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민-폴리도파 공중합체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌이민 및 폴리도파를 포함하는 것으로, 상기 폴리에틸렌글리콜은 분자량이 300-50,000인 폴리에틸렌글리콜로 말단에 하이드록시기 또는 카르복실기를 가지고 있는 것을 특징으로 하는 림프절 조영 목적의 조영제
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민-폴리도파 공중합체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌이민 및 폴리도파를 포함하는 것으로, 상기 폴리에틸렌이민은 분자량이 100~25,000인 가지형 폴리에틸렌이민인 것을 특징으로 하는 림프절 조영 목적의 조영제.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민-폴리도파 공중합체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌이민 및 폴리도파를 포함하는 것으로, 상기 폴리도파는 L-도파의 N-카르복실 무수물(NCA)로부터 합성된 폴리 L-도파 및 D-도파의 N-카르복실 무수물(NCA)로부터 합성한 폴리 D-도파로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 림프절 조영 목적의 조영제.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민-폴리도파 공중합체는 하기 구조 (A)로 표시되는 폴리에틸렌글리콜 유닛, 하기 구조 (B)로 표시되는 폴리에틸렌이민 유닛 및 하기 구조 (C)로 표시되는 폴리도파 유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 림프절 조영 목적의 조영제.
    Figure pat00019
    (A) [a는 2 내지 1200이다.]
    Figure pat00020
    (B) [A는 가지형 폴리에틸렌이민이고, x는 1 내지 100이다.]
    Figure pat00021
    (C) [d는 1 내지 100 이다.]
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 가지형 폴리에틸렌이민 유닛은 하기 구조로 표시되는 것을 특징으로 하는 림프절 조영 목적의 조영제.
    Figure pat00022
    [b 및 c는 각각 1 내지 30이다.]
  9. 제 1항 내지 제 8항에서 선택되는 어느 한 항에 따른 조영제를 이용하여 림프절을 조영하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 림프절을 조영하는 방법은 조영제 투여 전의 림프절의 MRI 신호와 조영제 투여 후의 림프절의 MRI 신호의 세기 변화 또는 차이를 이용하여 림프절을 조영하는 것을 특징으로 하는 림프절 조영 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 조영제 투여 방법으로 정맥주입을 특징으로 하는 림프절 조영 방법.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 림프절의 MRI 신호 세기 변화는 T2신호 변화를 기준으로 하는 림프절 조영 방법.
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