KR20120123626A - 신이 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신이 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 지환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로 본 발명에 의한 조성물은 독성이 적으며 파골세포의 형성 및 파골세포에 의한 골 흡수를 억제하여 효과적인 골질환 치료제를 제공할 수 있다. 또한, 최근 골 손상 치료에 쓰이는 비스포스포네이트 계열의 치료제의 단점인 턱뼈 괴사 및 뼈나 관절의 무력화와 같은 문제점을 보완할 수 있다.

Description

신이 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 및 치료용 조성물{COMPOSITION FOR TREATMENT AND PREVENTION OF BONE DISEASES COMPRISING EXTRACT OF MAGNOLIAE FLOS}
본 발명은 신이 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
골다공증의 증상인 골밀도 및 뼈 질량의 감소는 뼈(bone)내의 파골세포(osteoclast)와 조골세포(osteoblast)의 불균형(imbalance)에 의한 결과이다. 과도한 파골세포(osteoclast)의 생성은 골다공증과 같은 골밀도를 감소시키는 질병을 유도한다. 뼈 흡수를 수행하는 파골세포는 크고 다핵의 세포로써 골 기질을 무너뜨리고 뼈 미네랄을 분해하는 기능을 한다. 활성화된 파골세포는 세 개 이상의 핵을 가지고 있는데, 파골세포는 파골세포 전구세포(precusor cell)로부터 성숙한 다핵의 파골세포로의 분화를 유도하기 위해 다양한 호르몬들과 인자들을 요구한다. 그 인자들 중 가장 중요한 두 가지 인자는 조골세포(osteoblast)로부터 생산되는 M-CSF(macrophage colony stimulating factor)와 RANKL(receptor activator of nuclear factor-kB ligand)이다 (Mojtaba A. et al., Cancer Biol Ther., 7:1,3-9;1 (2008)).
M-CSF는 조골세포와 골수 기질 세포(stromal cell)로부터 발현되는 사이토카인으로 파골세포 형성에 중요한 역할을 한다(Anne T. et al., J Surg Res., 100:18-24(2001)). M-CSF는 주로 세포의 증식, 생존 그리고 세포골격 형성(cytoskeletal organization)에 중요한 역할을 한다 (Kim SY. et al., J Korean Orthop Assoc., 44:151-158(2009)). 또 다른 중요 인자인 RANKL은 조골세포의 표면에서 발현되며, 활성화된 T-cell에 의해 방출된다. RANKL은 파골세포 전구 세포에 있는 RANK 수용기에 부착되어 파골세포의 성장을 유도하고 분화시킨다 (Mojtaba A. Cancer biology & Therapy 7:1,3-9;1 (2008)). RANKL은 c-fos, NFATc1(nuclear factor of activated T cells), NF-kB(Nuclear factor kappa B)와 같은 전사인자들을 활성화시켜 파골세포의 분화를 촉진시키고, PI-3K(phosphatidylinositol 3-kinase), ERK(extracellular signal-regulated kinase)같은 신호전달 체계를 활성화 시켜 파골세포의 생존 및 기능을 촉진 한다(LEE ZH. et al., Biochem Biophys Res Commun., 305: 211-213(2003)).
이와 같이 파골세포에서 분비된 효소들에 의한 골 흡수는 골다공증 및 통증과 골절을 유도하여, 이들을 치료하기 위한 타겟 세포로 파골세포가 지목되고 있다. 즉, 파골세포의 분화를 억제 시킨다면 뼈 흡수 역시 억제 시킬 수 있고 골 질병, 골다공증 역시 치료할 수 있을 것이라는 가정 하에 파골세포에 대한 많은 약물들과 치료법들에 대한 연구가 진행 중이다. 현재 파골세포에 의한 골다공증과 같은 골 손상 치료에 포사맥스(Fosamax, 성분명:aledronate)와 악토넬(Actonel, 성분명: risedronate)과 같은 비스포스포네이트(bisphosphonate) 계열의 치료제가 널리 이용되고 있다. 이들 비스포스포네이트 제제들은 대부분 뼈를 파괴하는 파골세포의 기능을 약화하고 세포사멸을 유도해 뼈의 손실을 느리게 하거나 멈추게 하는 작용을 한다. 그러나 이들 약제들은 새로운 골 형성을 촉진시키는 기능은 가지고 있지 않으며, 최근 비스포스포네이트를 복용하는 환자들에게서 턱뼈 괴사(osteonecrosis), 중증 심방 세동, 뼈나 관절의 무력화 또는 근골격의 통증이 발생하는 사례가 해마다 증가되고 있다(Coleman RE., Br J Cancer, 98:1736-1740(2008)). 특히, 유방암, 전립선암 환자에서 뼈로 전이된 암세포에 의해 파골세포 형성이 촉진되어 심각한 골질환이 발생하는데 이를 치료하기 위한 약물이 개발되어 있지 않다. 현재 비스포스포네이트 제제를 고용량으로 투여하는데 이로 인해 턱뼈괴사 환자들이 현저히 증가하는 추세이다(Smith MR. Cancer Treat Rev 31(suppl 3):19-25(2005); Lipton A, Cancer 88:1082-1090 (2000); Berenson JR, et al. Cancer 91:1191-1200 (2000); Abrahamsen B. Calcif Tissue Int.;86:421-435(2010)). 따라서, 비스포스포네이트의 단점을 보완하고 독성이 없으며 파골세포에 의한 골 흡수에 효과적인 물질을 발견 하는 것이 아주 중요한 과제이다.
이러한 과제의 해법은 천연물질에서 추출한 추출물을 이용하는 것이다. 식물에서 추출한 물질들은 대부분 화학물질로 합성된 약품들에 비해 독성이 적으며 또한 화학물질로 인한 신체 내 유전자 변형을 예방할 수 있어 각광 받고 있다. 한편, 신이 추출물은 천연물질에서 추출하였고, 비스포스포네이트 제제들과 같이 뼈 손실에 효능을 가지고 있으며, 독성을 가지지 않아 턱뼈 괴사 및 뼈 무력화 같은 비스포스포네이트 제제들에서 보인 문제점을 보완할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 목적은 천연 추출물인 신이 추출물을 이용하여 골다공증과 같은 골 질환에 효과적인 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 구체예에서, 신이 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다. 다른 구체예에서, 상기 골 질환은 암세포의 골전이에 의해 초래되는 뼈의 손상, 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 및 대사성 골질환으로 구성된 군에서 선택되는 것인 골질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 골 질환은 골다공증인 것을 특징으로 하는 골 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 신이 추출물은 파골세포의 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 신이 추출물은 파골세포에 의한 골 흡수를 억제하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물을 제공한다.
일 구체예에서, 신이 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 및 완화용 건강기능식품을 제공한다. 다른 구체예에서, 상기 골 질환은 암세포의 골전이에 의해 초래되는 뼈의 손상, 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 및 대사성 골질환으로 구성된 군에서 선택되는 것인 골질환의 예방 및 완화용 건강기능식품을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 골 질환은 골다공증인 것을 특징으로 하는 골 질환의 예방 및 완화용 건강기능식품을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 신이 추출물은 파골세포의 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 신이 추출물은 파골세포에 의한 골 흡수를 억제하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 "신이(辛夷, Magnoliae Flos)" 는 백목련 (Magnolia denudata DER.) 또는 기타 동속 근연식물 (목련과 Magnoliaceae)의 꽃봉오리로 목련은 쌍떡잎식물 미나리아재비목 목련과의 낙엽교목이다. 성질은 따뜻하고 독이 없으며, 맛은 맵다. 12경맥 중 폐경과 위경으로 들어가 거풍통규(祛風通竅)의 효능을 발휘해서 풍한두통, 비연(鼻淵, 비염), 비색(鼻塞, 코막힘), 비류탁체(鼻流濁涕), 치통 등을 치료한다. 신이는 비염을 치료하는 우수한 한약재로 알려져 있다.
본 발명에서 “골질환”은 뼈 내의 파골세포와 조골세포의 불균형에 의한 결과로서 그 예로는 이에 한정하지는 않지만, 암세포의 골전이에 의해 초래되는 뼈의 손상, 골다공증, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 및 대사성골질환이 있다(한국등록특허 제 10-0399374 및 제 10-0720026 참조).
본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 신이 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다. 본 발명의 신이 추출물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 신이 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 500 mg/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌실내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 신이 추출물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명은 상기 신이 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강 기능 식품을 제공하는데, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 신이 추출물의 양은, 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물의 경우 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 명세서에서 정의되는 식품보조첨가제는 당업계에 통상적인 식품첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함한다. 본 발명에 따른 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서, 상기 신이 추출물 외에 첨가되는 성분에 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린; 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명에 의한 신이 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 독성이 적고, 파골세포의 형성 및 파골세포에 의한 골 흡수를 억제하여 효과적인 골질환 치료제를 제공할 수 있다.
또한, 최근 골 손상 치료에 쓰이는 비스포스포네이트 계열의 치료제의 단점인 턱뼈 괴사 및 뼈나 관절의 무력화와 같은 문제점을 보완할 수 있다.
도 1은 신이 추출물 첨가량에 따른 생쥐 골수 대식세포의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 2 는 파골세포 형성에 대한 신이 추출물의 억제 효과를 나타낸 사진이다.
도 3은 파골세포에 의한 골 흡수에 대한 신이 추출물의 억제 효과를 나타낸 사진이다.
도 4는 파골세포에서 분비되는 MMP의 활성에 대한 신이 추출물의 효과를 나타낸 도이다.
도 5는 파골세포에서 분비되는 Cathepsin K 의 활성에 대한 신이 추출물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 난소적출로 유도한 골다공증 동물모델에서 신이추출물의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 신이추출물에 의한 인간유방암세포의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 8은 유방암세포에서 분비되는 골 용해 인자의 mRNA 발현에 대한 신이추출물의 효과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 신이 추출물의 제조
시장에서 구입한 망춘화(Magnolia biondii, 10.45 ㎏)를 60℃에서 MeOH 20ℓ로 5시간씩 3회 추출하여 그 추출액을 회전진공농축기(rotary vacuum evaporator)로 농축하여 MeOH 추출물 864.91 g을 얻었다.
실시예 2. 생쥐 골수 대식세포 배양
3주령 수컷 ICR 생쥐(중앙실험동물㈜, 대한민국)를 경추 탈골한 뒤 겸좌를 이용하여 뒷다리의 외피를 벗겼다. 수술용 가위로 외피가 벗겨진 뒷다리를 절단 하고 혈청이 없는 α-MEM(Minimum Essential medium alpha; Gibco, 미국)에 넣었다. 핀셋을 이용하여 근육 속의 뼈를 분리하고 신선한 α-MEM에 옮겨 담았다. 1ml 주사기에 600μl의 α-MEM을 넣어 주사기 바늘을 다리뼈 가운데 척수 부분에 꽂고 2~3번 분사하여 골수 세포를 적출하였다. 적출한 골수세포를 원심분리기를 통해 모아준 뒤 신선한 α-MEM으로 섞어 주었다. 그 다음 분리 배지 히스토파크(Histopaque; Sigma, 미국)를 사용하여 적출한 골수세포로부터 골수 대식세포를 분리하였다. 분리한 골수 대식 세포는 1% 항생-항균(Antibiotic-Antimycotic; Gibco, 미국), 10% 우태아혈청(fetal bovine serum(FBS); Gibco,미국), 대식세포-집락 자극 인자(macrophage-colony stimulating factor(M-CSF); R&D system Inc, 미국) 30ng/ml을 포함한 α-MEM에서 배양하였다.
실시예 3. 생쥐 골수 대식세포에서 신이 추출물의 세포 독성 측정
신이 추출물의 생쥐 골수 대식세포에 대한 세포 독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. 실시예 1의 신이 추출물을 DMSO(dimethyl sulfoxide; Sigma, 미국)에 녹인 후 1% 항생-항균 용액, 10% FBS 및 M-CSF(30ng/ml)이 첨가된 α-MEM으로 각각 10, 25, 50 및100 μg/ml의 농도가 되도록 희석하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 1×104개의 생쥐 골수 대식세포를 넣은 후, 희석된 추출물이 포함되어 있는 α-MEM을 각각 200μl씩 첨가하여 생쥐 골수 대식 세포를 배양하였다. 이틀마다 신이 추출물, 10% FBS 및 M-CSF(30ng/ml)를 포함한 신선한 α-MEM 배지로 교환하였다. 37℃, 5% CO2 조건인 세포 배양기에서 5일간 배양한 후 각 웰 당 0.45mg/ml의 농도가 되게 MTT(3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide; Sigma, 미국) 용액을 첨가하였다. 4시간 동안 37℃에서 배양한 후, 배지 및 MTT용액을 완전히 제거하고 각 웰 당 DMSO를 200μl씩을 첨가하였다. 30분 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 대조군(배지만 처리한 웰)의 흡광도에 대한 실험군(추출물을 처리한 웰)의 흡광도의 백분율로 계산하였다.
생쥐 골수 대식세포에 대한 신이 추출물의 세포 독성을 조사한 결과 10, 25, 50 및 100 μg/ml의 농도로 처리 하였을 때 모두 골수 대식세포의 세포 생존율을 유의적으로 감소시키지 않았다. 즉, 신이 추출물은 골수 대식세포에 대하여 세포독성을 나타내지 않았다(도 1 및 표 1).
신이 추출물 농도 (μg/ml) 흡광도 (570nm) 생쥐 골수 대식세포의 세포 생존율(%)
0 0.797 100.0
10 0.754 94.6
25 0.768 96.4
50 0.930 116.6
100 1.014 127.2
실시예 4. 신이 추출물의 생쥐 파골세포 형성 억제능 측정
생쥐 골수 대식세포에서 RANKL에 의해 유도된 파골세포 형성에 대한 신이 추출물의 억제 효능을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법에 따라 다음과 같이 실험을 수행하였다(Park EK.et.al., Biochem Biophys Res Commun., 325(4):1472-1480(2004)). 신이 추출물을 DMSO에 녹인 후 1% 항생-항균 용액, 10% FBS, RANKL(100ng/ml) 및 M-CSF(30ng/ml)가 첨가된 α-MEM으로 신이 추출물은 10, 25, 50 100 μg/ml의 농도가 되도록 희석하였다. 분리한 골수 대식세포를 96-웰 플레이트에 각 웰 당 1×104개씩 넣고 희석된 농도에 따라 α-MEM을 200μl씩 첨가하여 배양하였다. 대조군은 신이 추출물이 포함되지 않은 α-MEM 배지 용액(1% 항생-항균 용액, 10% FBS 및 M-CSF(30ng/ml)은 포함하지만 RANKL은 포함하지 않는 배지)만 첨가 하였다. 96-웰 플레이트는 이틀마다 1% 항생-항균용액, 10% FBS, RANKL(100 ng/㎖) 및 M-CSF(30 ng/㎖)및 물질이 포함된 동일한 α-MEM 배지로 교환하였으며, 37℃, 5% CO2 조건인 세포 배양기에서 5일간 배양한 후 파골세포 형성을 확인하기 위해 TRAP 분석 키트(tartarate resistant acid phosphatase assay kit; Sigma, 미국)를 사용하여 다핵의 파골세포를 염색하였다. 핵이 3개 이상의 파골세포는 광학현미경을 이용하여 카운팅 하였다.
실험결과 RANKL을 처리하지 않은 골수 대식세포(대조군)에서는 파골세포가 생성되지 않은 반면, RANKL을 처리해준 골수 대식세포에서는 파골세포의 수가 확연하게 증가 하였다(p <0.0001). 반면 RANKL과 함께 신이 추출물 10, 25, 50 및 100 μg/ml 로 처리한 생쥐 골수 대식 세포에서는 RNAKL만으로 처리한 골수 대식세포에 비해 파골세포 형성이 농도 의존적으로 현저히 감소되었다(도 2 및 표 2).
신이 추출물 농도 (μg/ml) 생쥐 파골세포 수 생쥐 파골세포 형성 저해율 (%)
대조군 0 0 -
RANKL 0 279±7 0
10 241±4 13.4
25 167±12 40.2
50 3±1 98.9
100 0 100.0
실시예 5. 신이 추출물에 의한 파골세포의 골 흡수 억제능
RANKL로 유도한 파골세포에 의한 골 흡수에 신이 추출물이 억제 효과를 보이는지를 확인하기 위해 문헌에 기재된 방법에 따라 다음과 같이 실험하였다(Myung Hee Kim , J Cell Physiol., 221: 618-628.(2009)). 인산 칼슘(calcium phosphate)으로 특수 코팅된 16-웰 플레이트(Biocoat osteologic multitest slides; BD, 미국)에 3주령 생쥐 뒷다리 골수에서 분리한 대식세포(BMM)를 각 웰 당 1×104개씩 넣고, 실험군에는 1% 항생-항균용액, 10% FBS, RANKL(100ng/ml) 및 M-CSF(30ng/ml)이 첨가된 α-MEM을 200μl씩 첨가하였다. 반면 대조군에는 RANKL이 포함되지 않은 α-MEM 배지만 첨가하였다. 이틀마다 1% 항생-항균 용액, 10% FBS, RANKL(100ng/ml)및 M-CSF(30ng/ml)가 첨가된 신선한 배지로 교환해주고 37℃, 5% CO2 조건인 세포 배양기에서 4일간 배양하였다. 파골세포 형성을 확인한 후 신이 추출물이 포함된 배지를 첨가하였다. 신이 추출물은 DMSO에 녹인 후 1% 항생-항균 용액, 10% FBS, RANKL(100ng/ml)및 M-CSF(30ng/ml)가 첨가된 α-MEM으로 신이 추출물 5, 10 및 20 μg/ml의 농도가 되도록 희석하였다. 역시 이틀마다 추출물이 함유된 신선한 배지로 교환해주고 15일째까지 배양하였다. 15일 후 배지를 제거하고 치아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액을 넣어주었다. 5분 후 치아염소산나트륨 용액을 완전히 제거하고 3차 증류수로 두 번 씻어준 다음 파골세포에 의하여 형성된 흡수구멍(resorption pit)을 광학현미경으로 관찰하였다.
그 결과 골수 대식세포에 RANKL을 처리하였을 경우 RANKL을 포함하지 않은 그룹보다 흡수구멍의 생성이 증가하였다. 그러나 RANKL만 처리한 그룹에 비해 RANKL 및 신이 추출물을 같이 처리한 경우 흡수구멍의 생성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 신이 추출물은 파골세포의 형성을 억제할 뿐만 아니라 파골세포에 의한 골 흡수 역시 억제하였다(도 3).
실시예 6. 신이 추출물에 의한 파골세포에서 분비되는 MMP -9과 MMP -2의 활성 억제능 측정
파골세포에서 분비되어 골 흡수에 영향을 미치는 MMP-9과 MMP-2의 발현에 신이 추출물의 억제 효능을 확인하기 위해 gelatin zymography를 시행하였다. 신이 추출물을 DMSO(dimethyl sulfoxide; Sigma, 미국)에 녹인 후 1% 항생-항균 용액, 10% FBS 및 M-CSF(30ng/ml)이 첨가된 α-MEM으로 신이추출물은 5, 10 및 20 μg/ml이 되도록 희석하였다. 분리한 골수 대식세포를 96-웰 플레이트에 각 웰 당 5×104개씩 넣고 희석된 농도에 따라 α-MEM을 200 μl씩 첨가하여 배양하였다. 대조군은 신이 추출물이 포함되지 않은 α-MEM 배지 용액만 첨가하였다. 96-웰 플레이트는 이틀마다 추출물이 포함된 동일한 α-MEM 배지로 교환하였으며, 37℃, 5% CO2 조건인 세포 배양기에서 5일간 배양한 후 파골세포 형성을 확인하였다. 96-웰 플레이트 내의 배양액을 얻고, 불순물을 제거하기 위해 원심분리기를 이용하여 원심 분리한 뒤 상층액을 얻었다. 5% gelatin이 포함된 10% sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel을 준비하였고, 배양액 내의 단백질을 BSA protein assay를 통해 정량하여 단백질 양이 35μl가 되도록 보정하였다. 보정된 값의 배양액과 sample dye를 혼합한 뒤 준비된 혼합액 20 μl를 loading 하고 60V에서 전기 영동하였다. Gel을 wash buffer로 세척한 뒤, incubation buffer를 넣고 37℃, 50rpm 조건하의 항온수조기에서 24시간동안 배양해주었다. 24시간 후, gel을 세척한 뒤 commassie blue용액을 이용하여 1시간 동안 염색하고, 탈색용액을 이용하여 30분간 2번 탈색 시켜 gel 내의 MMP 발현의 변화를 관찰하였다.
파골세포에서 분비되어 파골세포에 의한 골 흡수능에 연관이 있는 MMP-2와 MMP-9 발현에 대한 신이 추출물의 영향력을 조사한 결과, RANKL을 처리하지 않은 그룹에 비해 RANKL을 처리한 그룹에서 MMP-9의 활성이 현저하게 증가되었다. 하지만 MMP-2는 큰 변화를 보이지 않았다. 신이 추출물을 처리해준 그룹의 경우 RANKL을 처리해준 그룹에 비해 MMP-9의 발현 정도가 현저하게 감소되었다. 반면, MMP-2의 경우는 감소되지 않았다(도 4). 즉, 신이 추출물은 파골세포의 골 흡수능에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 MMP-9에는 영향을 미쳤으나 MMP-2에는 영향을 미치지 않았다(도 4).
실시예 7. 신이 추출물에 의한 파골세포에서 분비되는 Cathepsin K 활성 억제능 측정
파골세포에서 분비되어 골 흡수에 영향을 미치는 Cathepsin K 활성에 신이 추출물의 억제 효능을 확인하기 위하여 신이 추출물을 DMSO(dimethyl sulfoxide; Sigma, 미국)에 녹인 후 1% 항생-항균 용액, 10% FBS 및 M-CSF(30ng/ml)이 첨가된 α-MEM으로 신이추출물은 5, 10 및 20 μg/ml이 되도록 희석하였다. 분리한 골수 대식세포를 96-웰 플레이트에 각 웰 당 5×104개씩 넣고 희석된 농도에 따라 α-MEM을 200 μl씩 첨가하여 배양하였다. 대조군은 신이 추출물이 포함되지 않은 α-MEM 배지 용액만 첨가하였다. 96-웰 플레이트는 이틀마다 추출물이 포함된 동일한 α-MEM 배지로 교환하였으며, 37℃, 5% CO2 조건인 세포 배양기에서 6일간 배양한 후 파골세포 형성을 확인하였다. 6일째 96-웰 플레이트 내의 배양액을 얻고, 불순물을 제거하기 위해 원심분리기를 이용하여 원심 분리한 뒤 상층액을 얻었다. Sensizyme Cathepsin K activity assay kit (Sigma-Aldrich, 미국)를 이용하여 회수한 파골세포 상층액에서 Cathepsin K의 활성 변화를 측정하였다. 회수한 파골세포 상층액과 Cathepsin K standard를 Cathepsin K antibody가 붙어있는 96웰-플레이트에 넣고 상온에서 1시간 반응시킨 후 제거하고 washing buffer로 세척한 뒤, reaction mixture를 넣어 2-4시간 37℃에서 반응시켰다. 405nm에서 흡광도를 읽어 Cathepsin K standard curve를 그리고 수식에 대입하여 Cathepsin K의 활성을 계산하였다.
실험결과 RANKL만 친 그룹에 비해 신이추출물을 처리한 그룹에서는 농도 의존적으로 Cathepsin K의 활성이 감소하는 것을 볼 수 있었다. 그래프는 Cathepsin K의 활성을 단백질정량을 통해서 보정한 값을 나타낸 것이다(표 3 및 도 5).
신이 추출물 농도(μg/ml) Cathepsin K 활성 (pg/mg protein) Cathepsin K 억제율(%)
대조군 0 0.3 -
RANKL 0 7.8 -
10 5.3 32
20 2.5 67
100 1.1 86
실시예 8. 난소적출에 의해 유도되는 골다공증에 대한 신이추출물의 억제능
난소를 적출한 8주령 암컷 ICR 생쥐(중앙실험동물㈜, 대한민국)에서는 에스트로겐의 분비가 억제되어 골다공증이 유발된다. 따라서 난소 적출 생쥐 골다공증 모델에서 신이추출물을 경구투여 하였을 때, 골다공증이 억제되는지 조사하였다. 암컷 ICR 8주령 생쥐를 그룹별로 10 마리씩 배정하고 아래와 같이 그룹을 나눴다.
Control: 아무런 외과적 처치를 하지 않음.
Sham: 개복은 하였으나 난소 적출은 하지 않음.
OVX: 난소적출을 하고 주 5일 vehicle을 먹임.
OVX+E2: 난소적출을 하고 17β-estradiol을 10 μg/kg body weight (b.w)으로 주 5일 피하주사 함.
OVX+신이추출물 0.1 mg/kg b.w: 난소적출을 하고 주 5일 명시된 농도의 신이추출물을 구강 투여함.
OVX+신이추출물 1 mg/kg b.w: 난소적출을 하고 주 5일 명시된 농도의 신이추출물을 구강투여함.
신이추출물을 60일 동안 구강 투여한 후 생쥐의 체중을 재고 심장에서 피를 뽑아 3000 rpm, 4℃에서, 20분 동안 원심분리하여 혈청을 분리하고 -80℃에 나눠 보관하였다. 혈청 내에 존재 하는 골 생성지표와 골 용해지표인 alkaline phosphatase (ALP), 칼슘, tartrate-resistant acid phosphatase form 5b(TRAP5b), 오스테오칼신의 양을 kit를 사용하여 측정하였다.
ALP는 QuantiChrom Alkaline Phosphatase Assay Kit (BioAssay System, 미국)를 이용하였다. 96웰-플레이트에 200 μl의 물과 calibrator, 5μl 의 샘플을 넣고 샘플이 있는 웰에는 working 용액을 넣어 200 μl로 맞추었다. 405nm에서 흡광도를 측정(t=o)하고 4분 뒤(t=4) 다시 한 번 측정하였다. Kit의 data sheet에 주어진 수식에 값을 대입하여 ALP 활성을 구하였다.
칼슘은 QuantiChrom Calcium Assay Kit (BioAssay System, 미국)를 이용하였다. 96웰-플레이트에 5 μl의 스탠다드와 샘플을 넣고 200 μl working 용액을 넣은뒤 3분동안 인큐베이션하다가 612nm에서 흡광도를 측정하였다. Standard 곡선을 그려 수식에 대입하여 샘플의 칼슘농도를 구하였다.
TRAP5b는 MouseTRAP Assay kit (IDS Ltd, 미국)를 이용하였다. 100 μl의 Anti-MouseTRAP antibody를 Antibody 코팅된 플레이트에 넣고 60분동안 상온에서 흔들어주며 인큐베이션 시켰다. 워싱버퍼로 플레이트를 헹군 뒤, 100 μl의 Calibrator와 Control을 플레이트에 넣고 다른 웰에는 75 μl의 0.9% NaCl용액을 넣고 25 μl의 샘플을 위에 얹어 넣어주었다. 모든 웰에 25 μl의 Releasing reagent를 넣고 60분동안 상온에서 흔들어주며 인큐베이션 시켰다. 워싱버퍼로 플레이트를 헹군 뒤, 100 μl의 Substrate solution을 넣고 2시간동안 37℃에서 인큐베이션 하였다. 25 μl의 Stop solution을 넣고 405nm에서 흡광도를 측정하였다. Calibrator를 이용하여 수식을 구하고 대입하여 TRAP5b의 활성을 구하였다.
오스테오칼신은 Mouse Osteocalcin EIA kit（Biomedical Technologies Inc., 미국)를 사용하였다. 25μl의 샘플 버퍼(Blank)와 스탠다드, Cintrol, 샘플을 키트에 제공된 96웰-플레이트에 넣고 100 μl의 osteocalcin antiserum을 그 위에 넣었다. 뚜껑을 닿아 4℃에서 24시간 인큐베이션 하였다. 플레이트를 워싱버퍼를 이용하여 헹군 뒤, 100 μl의 Streptavidin-Horseradish Peroxidase 를 넣고 30분간 상온에서 인큐베이션 하였다. TMB 용액과 Hydrogen Peroxide 용액을 1대1의 비율로 섞어 두고 플레이트는 헹군 뒤, 바로 만들어둔 용액을 100 μl씩 넣고 상온, 어두운 곳(알루미늄 호일이용)에서 15분간 반응시켰다. 그 후 100 μl의 stop solution을 넣고 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 스탠다드 커브를 이용하여 수식을 구하고 샘플값을 대입하여 오스테오칼신의 활성을 구하였다.
실험결과, 난소적출군(OVX)에서는 체중이 증가하고 혈청내 칼슘 농도, ALP 활성, osteocalcin, TRAP5b 활성이 현저히 증가하였으나, 신이추출물을 처리한 군에서는 농도의존적으로 난소 적출군에서 관찰된 체중 증가와 골다공증시 나타나는 지표들의 증가가 유의적으로 억제하였다. 신이추출물은 에스트로겐 투여군에서 관찰되는 효과와 유사한 정도의 골다공증 억제 효과를 보였다(도 6).
실시예 9. 인간 유방암세포에서 신이 추출물의 세포 독성 측정
신이 추출물의 인간유방암세포 (MDA-MB-231)에 대한 세포 독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. 신이 추출물을 DMSO(dimethyl sulfoxide; Sigma, 미국)에 녹인 후 1% 항생-항균 용액, 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지로 각각 신이 추출물은 10, 20, 40, 60, 80 및 100 μg/ml 의 농도가 되도록 희석하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 1×104개의 MDA-MB-231 세포를 200μl 배지 (FBS10%) 안에 넣어 24h 배양 후, 희석된 추출물이 포함되어 있는 DMEM 배지(serum free)를 각각 200μl씩 첨가하여 24h과 72h 동안 37℃, 5% CO2 조건인 세포 배양기에서 배양한 후 각 웰 당 0.45mg/ml의 농도가 되게 MTT(3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide; Sigma, 미국) 용액을 첨가하였다. 4시간 동안 37℃에서 배양한 후, 배지 및 MTT용액을 완전히 제거하고 각 웰 당 DMSO를 200μl씩을 첨가하였다. 30분 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
인간유방암세포인 MDA-MB-231에 신이추출물을 24시간과 72시간 동안 처리하고 세포독성을 조사한 결과, 신이추출물은 유방암 세포의 세포생존율을 감소시키지는 않았다(표 4 및 도 7).
시간 신이 추출물 농도 (μg/ml) 흡광도 (570nm) 유방암세포의 세포 생존율(%)
24h 0 0.388 100
10 0.381 98.3
20 0.385 99.4
40 0.399 102.9
60 0.422 108.9
80 0.417 107.6
100 0.414 106.7
72h 0 0.421 100
10 0.404 95.8
20 0.413 98
40 0.424 100.6
60 0.457 108.5
80 0.482 114.4
100 0.508 120.6
실시예 10. 인간 유방암세포에서 분비되는 골 용해성 인자 mRNA 발현에 대한 신이추출물의 억제능
암세포가 분비하는 골용해성 인자로 인해 조골세포에서 RANKL이 증가하고 이 RANKL이 파골전구세포의 RANK에 결합하여 파골세포 형성이 촉진되는 것으로 알려져 있다. 암세포의 뼈 전이에 의한 치료제가 개발되어 있지 않아 임상에서는 이를 치료하기 위해 골다공증 치료제인 비스포스포네이트를 사용하는데, 암환자에는 고용량으로 사용하기 때문에 턱뼈괴사의 발생율이 골다공증 환자보다 현저히 높은 것으로 알려져 있다. 신이 추출물이나 신이 활성 성분들은 파골세포 형성뿐만 아니라 암세포에서 골용해성인자의 발현을 억제하기 때문에 암환자에서 암세포의 전이로 인한 뼈 손상을 치료하는데 더욱 효과적일 것으로 생각된다. 현재의 비스포스포네이트 제제들은 암환자의 고통을 감소시킬 뿐, 생명연장에는 크게 효과가 없는 것으로 평가하고 있다. 즉, 암세포가 뼈로 전이되고 이로 인해 발생하는 뼈 손상을 억제하는데 효과적이라는 것을 보여주기 위해 다음과 같은 실험을 하였다.
골 용해성 인자의 mRNA 발현을 보기 위하여 역전사 중합 효소 연쇄반응(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction; RT-PCR)을 시행하여 조사하였다. 75T flask에 MDA-MB-231 세포(1x106cells)를 넣고 10% FBS를 넣은 L-15 배지에서 배양하였다. 세포가 80-90% 정도 자랐을 때 배양액을 제거하고 신이 추출물이 함유된 L-15 (FBS 0%)에서 24시간 배양하였다. 유방암세포를 모아 트리졸(TRIZOL) 시약 (Life Technologies, Grand Island, NY, USA)을 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA, 올리고(oligo)-dT15, 리보뉴클레아제 억제제(ribonuclease inhibitor) 및 역전사 효소(reverse transcriptase)가 포함된 반응혼합물 (20 μl)에서 역전사 효소반응을 실행하여 cDNA를 합성하였다. cDNA, 프라이머(10 pmol), dNTP, MgCl2, 태그(Tag) DNA 중합효소(polymerase)를 포함하는 PCR 반응혼합물에서 cDNA를 증폭시켰다. GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 대조군으로 사용하였으며, 사용된 프라이머의 염기서열은 다음과 같았다(표 5).
mRNA Primer sequences Annealing Temp. Expected Size (bp)
PTHrP sence: 5'-AACTCGCCTCCAACCTGCGC-3' 62℃ 212
　antisence: 5'-CGCTCGGGACCTCCTCTGGT-3'
IL-1β 　sence: 5'-ATGGCAGAAGTACCTAAGCTC-3' 56℃ 810
　antisense: 5'-TTAGGAAGACACAAATTGCATGGTGAACTCAGT-3'
IL-6 　sence: 5'-CATCCTCGACGGCATCTCAGC-3' 60℃ 332
antisense: 5'-TTGGGTCAGGGGTGGTTATTG-3'
IL-8 　sence: 5'-ATGACTTCCAAGCTGGCCGT-3' 56℃ 285
antisence: 5'-CCTCTTCAAAAACTTCTCCACACC-3'
IL-11 　sence: 5'-AGCCACCACCGTCCTTCCAAA-3' 60℃ 351
　antisense: 5'-CCTCCGTCCCCACCCCAACAT-3'
GAPDH 　sence: 5'-CCGCCTACTGCCCACTGCCACCAC-3' 52℃ 420
　antisense: 5'-TCCATCCACTATGTCAGCAGGTCC-3'
PCR 산물은 브롬화 에티듐(ethidium bromide)을 넣고 굳힌 2% 아가로오스 겔에 전기영동한 뒤, UV 트랜스일루미네이터(transilluminator)를 이용하여 확인하였다. 밴드의 강도(intensity)는 이미지 분석 소프트웨어(image analysis software; TINA, version 2.0)를 사용하여 측정하였다. 또한 골 용해 인자 밴드의 강도(intensity)는 GAPDH 밴드강도와 비교하여 표준화(normalization) 하였다.
24시간을 기준으로 세포생존율에 영향을 미치지 않는 농도에서 RT-PCR로 MDA-MB-231 유방암 세포에서 골 용해인자의 mRNA 발현에 대한 신이추출물의 효능을 조사한 결과, 신이추출물을 처리한 그룹에서 IL-6와 IL-11의 mRNA의 발현에는 유의적인 변화가 관찰되지 않았으나, IL-1β, IL-8, PTHrP mRNA의 발현은 감소되었다(도 8).
실시예 11. 골질환 치료를 위한 추출물의 생체 내 투여
대한실험공급센터에서 공급받은 6주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 하기와 같이 실시하였다. 각 그룹 당 2마리씩의 동물에 상기 실시예 1의 추출물을 1g/㎏의 용량으로 1회 경구 투여 후, 동물의 폐사여부, 임상증상 및 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 강장기와 흉강 장기의 이상 여부를 관찰하였다. 실험결과, 실험 물질을 투여한 모든 동물에서 특이할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사 및 부검 소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과, 본 발명의 추출물은 랫트에서 각각 1g/㎏까지도 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량(LD 50 )은 1g/㎏이상인 안전한 물질로 판단됨을 확인할 수 있었다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다. 단, 하기 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제제예에 의해 한정되는 것은 아니다.
제제예 1: 산제의 제조
신이 추출물 300 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2: 정제의 제조
신이 추출물 50 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3: 캡슐제의 제조
신이 추출물 50 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4: 주사제의 제조
신이 추출물 50 mg
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5: 액제의 제조
신이 추출물 100 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6: 건강 식품의 제조
신이 추출물 1000 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7: 건강 음료의 제조
신이 추출물 1000 ㎎
구연산 1000 ㎎
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85?에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2l용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
지금까지 예시적인 실시 태양을 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명의 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 신이 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 골 질환은 암세포의 골전이에 의해 초래되는 뼈의 손상, 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 및 대사성 골질환으로 구성된 군에서 선택되는 것인 골질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 골 질환은 골다공증인 것을 특징으로 하는 골 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 신이 추출물은 파골세포의 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 신이 추출물은 파골세포에 의한 골 흡수를 억제하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  6. 신이 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 및 완화용 건강기능식품.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 골 질환은 암세포의 골전이에 의해 초래되는 뼈의 손상, 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 및 대사성 골질환으로 구성된 군에서 선택되는 것인 골질환의 예방 및 완화용 건강기능식품.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 골 질환은 골다공증인 것을 특징으로 하는 골 질환의 예방 및 완화용 건강기능식품.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 신이 추출물은 파골세포의 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 신이 추출물은 파골세포에 의한 골 흡수를 억제하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
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