KR20120118516A

KR20120118516A - 인간 항-상피세포성 성장인자수용체 Ｆａｂ 항체 및 이를 포함하는 종양 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20120118516A
Application number: KR1020100091658A
Authority: KR
Inventors: 차상훈
Original assignee: 주식회사 아이지세라피
Priority date: 2010-09-17
Filing date: 2010-09-17
Publication date: 2012-10-29
Also published as: WO2012036392A2; WO2012036392A3; KR101273918B1

Abstract

본 발명은 인간 항-상피세포성 성장인자수용체 Fab 항체에 관한 것이다. 본 발명에서 DVS-II방법에 의해 선별된 고 친화도 항-EGFR 인간 Fab 항체는 스크리닝에 의해 선별된 중사슬 가변영역 및 경사슬 가변영역을 포함하는 것으로써, 상피세포성 성장인자 수용체에 대하여 특이성이 높아서, 종양 치료용 약학 조성물 및 직장암 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.

Description

인간 항-상피세포성 성장인자수용체 Ｆａｂ 항체 및 이를 포함하는 종양 치료용 약학 조성물{A human anti-epidermal growth factor receptor Fab antibody and a pharmaceutical composition for treating tumor comprising the same }

본 발명은 인간 항-상피세포성 성장인자수용체 Fab 항체 및 이를 포함하는 종양 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

세포표면에서 발현하는 암 관련 항원의 존재는 성공적인 항체신약의 개발에서 중요하게 여겨지고, 암치료용 항체 시약개발에는 유용하다(Brissette et al., 2006; Loo and Mather. 2008). 세포막간 타이로신 키나아제(Transmembrane tyrosine kinase) 수용체 중 하나인 상피세포성 성장인자수용체(EGFR, ErbB-1 또는 HER1)는 암 진행, 특히 상피조직근원의 암에서 잠재적인 역할을 수행하고 (Mendelsohn and Baselga, 2000), 항체 치료제를 위한 중요한 표적으로 고려되어지고 있다(Baselga and Arteaga, 2005). 수용체의 세포외적 도메인에 리간드 결합을 방해하는 cetuximab (IMC-225, Erbitux®, matuzumab (EMD72000), panitumumab (ABX-EGF) 그리고 IMC-11F8 (Lu et al., 2003)과 같은 많은 인간화 항체 또는 인간 단큰론 항체는 현제 치료용으로 이용이 가능하고 직장암의 치료를 위해 시험적인 치료용으로 사용되어지고 있다(Ortega et al., 2010). 하지만 항 EGFR 단큰론 항체의 치료기작은 동일하지 않고, 따라서 여전히 부작용을 최소화하기 위한 인간항체인 항 EGFR 단클론 항체의 다양한 개발이 가치있음을 보여주고 있다. 또한 고형 종양에서 EGFR의 발현 정도가 변이적이기 때문에, 다른 결합 친화력 혹은 다른 항원결합부위를 인식하는 항체의 개발역시 필요하고 하겠다(Martinelli et al., 2009; Kamat et al., 2008).

파지 디스플레이 항체 라이브러리는 특정 항원 결합특이성을 지닌 항체의 획득을 위해 광범위하게 사용되고 있고(Azzazy and Highsmith, 2002; Marks and Bradbury, 2004), 치료용 항체의 개발에서 파지 디스플레이의 중요성은 이미 잘 알려져 있다. 암, 자가면역증, 조직이식거부 그리고 감염성 질병을 포함하는 광범위한 인간질병들은 현재 치료용 항체의 표적이며 (Reichert et al., 2005; Aires da Silva et al., 2008), 특히 미자극(naive) Ig 유전자 레파토어의 이용은 좀 더 적은 면역원성을 제공하기 때문에 치료용 항체 리드의 확보에 유익하다고 할 수 있다. 하지만 보통 미자극 Ig 레파토어로부터 나노몰 정도의 높은 친화력을 지닌 항체를 선별하기는 쉽지 않으며 (Rothe et al., 2008), 따라서 시간과 노력이 많이 수반되는 항체 유전자 조작은 미자극 기원의 항체 친화력을 증가시키기 위해 필요하다. 본 발명에서, 발명자는 표적 특이적 중사슬 선별을 위해 고안된 이중 벡터 시스템 II(dual-vector system-II (DVS-II))으로부터 만들어진 인간 미자극 중사슬 서브라이브러리를 포함하는 계통적 항체 라이브러리 시스템(HuNH2로 명명)과 인간 미자극 중사슬 서브라이브러리를 포함하는 계통적 항체 라이브러리 시스템(HuNL-D3으로 명명)을 이용하여 미자극 기원의 고 친화도 항-EGFR 인간 Fab 항체를 발명하였다.

본 발명은 고 친화도 항-EGFR 인간 Fab 항체를 제조하기 위하여, 선별된 중사슬 가변영역 및 경사슬 가변영역을 포함하는 상피세포성 성장인자 수용체에 대한 단일 클론 항체 Fab 부위의 암호화하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 선별된 중사슬 가변영역 및 경사슬 가변영역을 포함하는 상피세포성 성장인자 수용체에 대한 인간 단일클론 항체 또는 그의 항원결합 단편(Fab) 및 이를 함유하는 종양 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 일 구체예에서, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3로 표시되는 가변영역을 포함하는 상피세포성 성장인자 수용체에 대한 단일 클론 항체 Fab 부위의 중사슬을 암호화하는 유전자를 제공한다.

일 구체예에서, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6로 표시되는 가변영역을 포함하는 상피세포성 성장인자 수용체에 대한 단일 클론 항체 Fab 부위의 경사슬을 암호화하는 유전자를 제공한다.

일 구체예에서, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3을 포함하는 벡터를 제공한다.

일 구체예에서, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6을 포함하는 벡터를 제공한다

일 구체예에서, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 다른 구체예에서, 상기 구체예의 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 숙주세포를 제공한다.

일 구체예에서, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 다른 구체예에서, 상기 구체예의 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 숙주세포를 제공한다.

일 구체예에서, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3을 포함하는 벡터 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 다른 구체예에서, 상기 구체예의 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 숙주세포를 제공한다.

일 구체예에서, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 중사슬 가변영역을 함유하고, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 경사슬 가변영역을 함유하는 상피세포성 성장인자 수용체에 대한 인간 단일클론 항체 또는 그의 항원결합 단편(Fab)을 제공한다.

일 구체예에서, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 중사슬 가변영역을 함유하고, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 경사슬 가변영역을 함유하는 상피세포성 성장인자 수용체에 대한 인간 단일클론 항체 또는 그의 항원결합 단편을 함유하는 상피세포성 성장인자 수용체 저해용 약학조성물을 제공한다.

일 구체예에서, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 중사슬 가변영역을 함유하고, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 경사슬 가변영역을 함유하는 상피세포성 성장인자 수용체에 대한 인간 단일클론 항체 또는 그의 항원결합 단편을 함유하는 종양 치료용 약학 조성물을 제공한다. 다른 구체예에서, 상기 구체예의 종양은 직장암임을 특징으로 하는 종양 치료용 약학 조성물을 제공한다.

도 1, 2 및 3은 ELISA와 유세포분석에 의해 Fab 클론의 항원-결합 특이성을 결정한 것이다.
도 4 및 5는 항-EGFR ELISA에서 증가하는 농도의 NH₄SCN의 첨가가 초기 흡광도에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 6, 7 및 8은 유세포분석 및 공초점 현미경에 의하여 EG-19-11의 세포에 대한 결합력을 나타낸 것이다.
도 9는 항체에 의한 EGF-매개 EGFR 타이로신 인산화의 억제를 보여주는 웨스턴 블롯을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 1차 항체 라이브러리 HuDVFab -8L 로부터 항- EGFR Fab 클론의 분리

1-1. 1차 항체 라이브러리의 제작 및 바이오패닝 공정

1차 조합 Fab 항체 라이브러리인 HuDVFab-8L을 제작하였고, 약간의 변화와 함께 바이오패닝을 진행하였다 (Song et al., 2009). 1차 인간 Fab 항체 라이브러리인 HuDVFab-8L (HuDVFab-L1~L8)는 4.5×10⁹의 인간 미자극 중사슬 다양성을 갖는 HuNH-D2와 항원과의 특이적 결합능력을 보이지 않는 8개의 인간 미자극 경사슬을 조합하는 DVS-II를 이용하여 제작하였다(한국 특허 제 2010-0049731호 참조).

재조합 파아지는 HuDVFab-8L로부터 획득하였고, 면역실험용 튜브(Nunc, Denmark)에 인간 EGFR-Fc 융합 단백질 고정 하여 EGFR-특이적 Fab 클론을 선별 하였다. 재조합 파지는 Ex12 헬퍼 파지 (IG Therapy, South Korea) (Oh et al., 2007)를 이용한 파지 수득을 통해 준비하였으며, 40ml 재조합 파지 분액물로부터 PEG/NaCl 용액으로 재조합 파지를 침전시킨 후 멸균된 PBS (137 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na₂HPO₄, 1 mM KH₂PO₄, pH 7.3) 1ml에 재현탁하였다. 바이오패닝을 위해서 8개의 면역실험용 튜브(Nunc, Denmark)를 코팅 버퍼 (0.1 M NaHCO₃, pH 9.6)에 용해된 10 ㎍/ml의 재조합 인간 EGFR-Fc 단백질로 코팅하였다. 그 다음, PBS 에 용해된 3% 밀크 용액으로 블로킹하였다. 재조합 파지 (total ~8×10¹¹)를 1 M의 인간 IgG1(Sigma-Aldrich, USA)과 4℃에서 밤새 사전 배양한 다음, 8개 튜브에 분액하였으며, 패닝을 3회 반복하였다. 매회 각 패닝 후에는 각각의 경사슬(TG-L1 ~ TG-L8) 중 하나를 코딩하는 pLT-2 플라스미드를 포함하는 E. coli TG1 세포를 경사슬 대응 방법으로 용출한 파지로 감염시킨 다음, 2×YT/AT 플레이트에 플레이팅하고 27℃ 에서 밤새 배양하였다. 이로부터 도출된 E. coli 형질전환체를 2×YT/AT 플레이트에 플레이팅하고 27℃에서 밤새 인큐베이션한 다음, 파지 수득이나 항-EGFR-Fabs를 생산하는 E. coli 클론을 확인하는데 사용하였다.

1-2. 항- EGFR Fab 클론의 선별

상기 1-1과 같이 바이오패닝(biopanning)을 3회 반복 수행한 후, HuL1과 HuL2 경사슬이 내재된 Fab 라이브러리로부터 획득한 재조합 파아지에서 EGFR-특이적 Fab 클론이 다량 함유되어 있다는 사실을 polyphage ELISA을 통하여 확인하였다. 바이오패닝을 모두 수행한 후 획득된 Fab 레퍼토아 중 48개의 단클론을 무작위로 선별하여 모노클로날 ELISA를 수행한 결과, HuL1, HuL2 경사슬을 내재한 Fab 레퍼토아 중 약 60%, 80%가 EGFR-특이적 Fab 클론임을 확인하였다. 이들 중 OD_450nm > 0.4의 EGFR-특이적 결합 반응을 보이는 20개 클론의 V_H 도메인의 DNA 서열을 분석한 결과, HuL1 경사슬을 내재한 Fab 레퍼토아에서는 3개 (EG-L1-1, EG-L1-5, EG-L1-9), HuL2 경사슬을 내재한 Fab 레퍼토아에서는 1개 (EG-L2-11)등 총 4개의 개별적인 V_H 서열을 갖고 있었다. 상기의 4개의 Fab 클론들의 항원 결합 특이성을 ELISA를 이용하여 확인하였다 (도 1).

ELISA는 통상의 방법으로 수행하였다(Song et al., 2009). 재조합 융합 단백질들을 (EGFR-Fc, CD33-Fc (R&D Systems), Her2-Fc (R&D Systems)) MaxiSorb ELISA 플레이트 (Nunc)에 10 ㎍/ml의 농도로 코팅하였다. E. coli 클론으로부터 얻은 수용성 Fab-pIII 융합 단백질을 각 웰에 첨가 한 후 HRPO(horseradish peroxidase)에 컨쥬게이션된 염소 항-인가 kappa L 사슬 pAb (Sigma-Aldrich) 을 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘(TMB) 기질 (Sigma-Aldrich)을 이용하여 결합력을 확인하였다. 450nm의 흡광도에서 ELISA 판독기를 이용하여 측정하였다.

그 결과 4개의 Fab 클론들은 EGFR-Fc 융합 단백질에는 결합하지만, CD33-Fc 융합 단백질, Her-2-Fc 융합 단백질에는 결합하지 않았다. 이러한 결과는 4개의 Fab 클론들은 EGFR에 특이적으로 결합함을 보여주고 있다(도 1).

1-3. A431 세포의 표면에 발현되는 EGFR 에 특이적으로 결합하는 EG - L2 -11 클론의 선별

A431 세포의 표면에 발현되는 EGFR에 특이적으로 결합함을 확인하기 위하여 유세포분석을 수행하였다 (도 2). 그 결과, HuL1 경사슬을 내재하고 있는 세 개의 Fab 클론들은 A431 세포의 표면에 발현되는 EGFR에 특이적으로 결합하지 않았으나, HuL2 경사슬을 내재하고 있는 EG-L2-11 클론은 A431 세포의 표면에 발현되는 EGFR에 특이적으로 결합하였다. 양성 대조군 항체인 cetuximab은 A431에서 높은 형광을 나타낸 반면, 이차 항체만으로 결합시킨 것에서는 형광을 나타내지 않았다 (흰색 영역). A431세포 표면에 발현되는 EGFR과 특이적인 결합을 보이는 EG-L2-11 클론의 항체 중사슬 가변부위의 아미노산 서열은 도 3과 같다.

실시예 2: 2차 항체 라이브러리의 제작 및 경사슬 셔플링( light chain shuffling )에 의한 EG - L2 -11 Fab 의 친화도 성숙

2-1. 2차 항체 라이브러리의 제작

EG-L2-11 Fab의 친화도 성숙을 위하여 EG-L2-11의 중사슬과 경사슬 라이브러리 (HuNL-D3)을 조합하여 새로운 라이브러리를 제작하였다. 2차 항체 라이브러리는 DVS-III를 사용하여 제작하였다(Hur et al., 2010). 보다 구체적으로, Fab EG-L2-11을 이용하여 350 bp V_H 유전자는 재조합 pHg3f1-2 파아지미드 벡터를 Sfi I으로 처리한 다음 DVS-III의 pHg3A-3 플라스미드로 서브클로닝하여 얻었다. 그 후에, 재조합 pHg3A-3 플라스미드를 지니고 있는 대장균 TG1 세포들을 HuNL-D3 서브라이브러리로부터 획득한 10 ㎍ 의 pLf1T-3 파아지미드로 형질전환시켰고, 10 ㎍/ml 테트라사이클린을 포함한 20 ml의 2×YT/ACG 배지에서 37℃, 8시간 동안 배양하였다, 배양 후 50 ㎍/ml 엠피실린과 10 ㎍/ml 테트라사이클린를 포함하는 새로운 200 ml의 2×YT 배지 (2×YT/AT)로 옮기고 37℃에서 OD_600nm 에서 대략 0.5가 될 때까지 배양하였다. 3300×g에서 10분 동안 원심분리한 후, 세포 펠렛(pellet)을 얻었고 2% 글루코스를 포함하는 200 ml의 새로운 2×YT 배지 (2×YT/G) 로 재현탁한 후, Ex12 헬퍼 파아지를 사용하여 파지 수득을 하였다. 배양액을 3300×g에서 10분 동안 원심분리하고 70 ㎍/ml의 카나마이신과 0.001% 아라비노오스 (w/v)가 첨가된 2 L의 새로운 2×YT/AT 배지 (2×YT/ATKA)로 재현탁하였다. 27 ℃에서 밤새 배양한 후, 재조합 파아지 입자들을 원심분리하여 획득하였고 0.45 m 필터로 멸균시켰다. 마지막으로, 파아지들을 PEG/NaCl 침전시키고, 멸균된 1ml의 PBS에 재현탁하였다. 라이브러리의 바이오패닝은 면역실험용 튜브 대신에 Maxisorb ELISA 플레이트를 사용한 것을 제외하고 전술한 바와 같이 실행하였다.

2-2. EGFR - Fc 에 특이적으로 결합하는 Fab 클론의 선별

그 결과 ELISA를 통하여 EGFR-Fc 에 특이적으로 결합하는 12개의 Fab 클론을 선별 하였고, V_L 유전자의 DNA 서열을 분석하여 2개의 서로 다른 경사슬 (EG-19-11, EG-26-11)이 내재 되어 있음을 확인하였다.

2-3. 고친화도를 가진 EG -19-11 클론의 선별

2-3-1. 상대적 결합친화도 측정

결합 친화도는 티오시안산염(thiocyanate) 용출 방법을 이용한 ELISA (Macdonald et al., 1988)로 EG-L2-11와 비교 분석 하였다(도 4). 이 방법은 수용성 Fab-pIII 분자들을 배양한 후에 0.01% tween이 포함된 PBS(PBST)로 세척하고 0.1M 인산화 완충액(pH 6.0)에서 0에서 2.5M의 농도의 티오시안산암모늄을 3배로 적절한 웰에 첨가하는 것을 제외하고 전술한 ELISA 과정과 매우 유사하다. 그 다음, 플레이트를 상온에서 20분 동안 인큐베이션시킨 후 PBST로 3회 세척하였다. ELISA 신호는 전술한 바와 같이 분석하였다.

상대적인 결합친화도는 EGFR-Fc 단백질에 항체의 결합이 50% 감소되는 NH₄SCN의 몰 농도로 측정하였다. 그 결과 EG-L2-11 및 EG-26-11는 0.4 M, EG-19-11는 이보다 높은 1.2 M에서 항체의 결합이 50% 감소 되었으며 이는 EG-19-11가 가장 높은 친화도를 갖고 있으며 경사슬의 최적화가 이루어졌음을 알 수 있었다. EGFR-Fc 단백질에 대하여 상대적으로 강한 결합력을 보이는 EG-19-11 Fab 클론의 경사슬 아미노산 서열은 도 5와 같다.

2-3-2. 표면 플라즈마 공명( surface plasmon resornance ) 분석

정확한 결합 친화도를 측정하기 위하여 EG-19-11을 고정시킨 CM5 센서 칩에 sEGFR을 흘러 보내 주어 친화도를 측정하는 SPR 기술을 이용하였다. 비교 실험을 위하여 cetuximab로부터 Fab (FabC225)를 분리하여 실험하였다 (표 1).

SPR에 의한 sEGFR에 대한 Fab의 결합 친화도 측정

Fab	k _on (1/Ms)	k _off (1/s)	K _A (1/M)	K _D (M)
EG-19-11	1.10 ×10⁵	5.89 ×10^-5	1.87 ×10⁹	5.35 ×10^-10
FabC225	1.33 ×10⁵	4.98 ×10^-4	2.67 ×10⁸	3.74 ×10^-9

* 상기 실험은 2회 수행되어 거의 동일한 결과를 얻었다.

그 결과 EG-19-11 Fab는 sEGFR과 매우 높은 친화도 (K _D = 540 pM)를 가졌다. FabC225의 결합 친화도는 약 2.7 nM로 알려져 있으며 (Kamat et al., 2008), 본 연구에서 측정한 결과 그보다 조금 낮은 3.7 nM이였으며, 따라서 EG-19-11 Fab는 FabC225보다 약 7배 높은 결합 친화도를 갖고 있었다. EG-19-11와 유사하게 비 면역 인간 Ig 레퍼토아로부터 phage display 기술을 이용하여 선별된 또 다른 인간 항-EGFR 항체 중 necitumumab (IMC-11F8)의 Fab11F3 결합 친화도는 K _D ≒3.3 nM (Li et al., 2008)로 알려져 있다. 또한 항-EGFR scFv 항체인 F4-scFv 또한 비 면역 인간 Ig 레퍼토아로부터 획득하였으며 이의 친화도는 472 nM이고, 인간 항-EGFR 항체 유전자 중 가장 높은 친화도를 갖는 것은 2.2 nM (Souriau et al., 2004)이였다. 또한 최근 4개의 항-EGFR 단일 도메인 항체들은 55　nM에서 440　nM (Bell et al., 2010)로 보고되고 있다. 따라서 본 발명자들이 발명한 EG19-11 Fab가 기존 항-EGFR 항체 유전자 중 가장 높은 친화도를 갖고 있음을 시사한다.

2-4. 수용성 Fab - pIII 및 Fab 단백질의 제조와 비오틴화( biotinylation )

수용성 Fab-pIII 단백질은 이전에 발표한 DVS-II(Brian et al., 1996; Joo et al., 2008) 를 포함한 the E. coli TG1 세포로부터 제조하였다. 수용성 Fab 단백질을 생산하는 pFdEx 플라스미드는 pHg3A-3 플라스미드 (Joo et al., 2008)로부터 구축하였다. 보다 구체적으로, Fd (V_H + C_H1) 사슬과 연결된 gIII 유전자를 제거하기 위해 pHg3A-3 벡터를 (Hur et al., 2010) Xho I , Sal I 제한 효소로 처리 한 후, 4.3kb의 유전자 단편을 얻었다. PCR 방법을 이용하여 EG-L19-11의 Fd 단편을 획득한 후, Xho I , Sal I 제한 효소로 처리하였다. (역방향 프라이머: 5'-CTCGAGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCT-3', 순방향 프라이머 5'-GTCGACTTAGGATTCCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCGGATTCTATACTAGTACAAGATTTGGGCTC-3') 획득한 4.3 kb 유전자 단편과 Fd 사슬을 T4 DNA 리가아제(ligase)와 교반하여 16℃에서 4시간 동안 반응시켰다. pFdEx를 포함하고 있는 E. coli TG1 세포에 EG-L9-11의 경사슬을 포함하는 100ng의 pLf1T-3 파아지미드를 형질 전환 시켰다.

수용성 Fab 단백질 유전자를 내재한 E. coli TG1 세포를 2×YT/AT 배지에서 log phase 까지 배양한 후, 아라비노오스와 IPTG를 각각 0.002% (V/V) , 0.1mM (W/V) 농도로 첨가하여 27℃에서 15시간 동안 배양하였다.

원심분리한 후 배양 상등액에 항-인간 IgG (Fab')₂ 항체 (Pierce, USA)가 컨쥬게이션되어 있는 CNBr-활성화 세파로오스 (Amersham-Pharmacia, Sweden)를 첨가하였다. Fab와 CNBr-활성화 세파로오스의 복합체를 브츠너 퓨널(buchner funnel; Amersham-Pharmacia)에 충진한 후 차가운 PBS로 세척하였다. 용출 버퍼 (0.2 M glycine-HCl, pH 2.9)을 첨가하여 수용성 단백질을 얻은 후 바로 1 M Tris-HCl (pH 9.0)로 중화시켜 단백질 변성을 방지하였다. 정제된 수용성 Fab 단백질을 사용 전에 PBS로 4℃에서 16시간 동안 투석하였다. 페리플라스믹(Periplasimc) 추출물을 비오틴화하기 위해 0.1 M 중탄산염 버퍼 (pH 8.6)로 투석한 후 400 g NHS-비오틴 (Pierce)을 첨가하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 유리 바이오틴을 제거하기 위하여 4℃에서 16시간 동안 0.1 M 중탄산염 버퍼에서 투석하였다. 10mg의 Fab C225를 얻기 위해 분해 완충액 (20 mM sodium phosphate, 10 mM EDTA, 20 mM cysteine·HCl, pH 7.0)을 처리한 후에 Cetuximab을 Immobilized Papain (Sigma Aldrich, USA)이 들어 있는 튜브에 첨가하였다. 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 감마바인드 G 세파로스 (Amersham-Pharmacia)를 이용하여 Fab 단편을 정제하였다.

실시예 3: Fab EG -19-11의 특이적 결합력

3-1. 유세포분석

EG 19-11의 특이적 결합력은 A431, DU145, IM9, Jurkat, U937 및 NIH3T3을 포함하는 다양한 세포주를 이용한 유세포 분석(FACScan (Becton-Dickinson, USA))을 통해 평가하였다. 세포주 (A431, DU145, IM9, Jurkat, U937 및 NIH3T3) 들은 한국 세포주 은행(KCLB, 한국)에서 구입하였다. 흡착형 세포인 A431, DU145, NIH3T3는 10% (v/v) FBS (Hyclone, USA), 100 units/ml 페니실린, 100 g/ml 스트렙토마이신 (Gibco Invitrogen, USA)이 첨가된 DMEM으로 배양하였고, 비흡착형 세포인 IM9, U937 및 Jurkat은 10% FBS, 100 units/ml의 페니실린, 100 g/ml의 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI1640 (Welgene, Korea)로 배양하였다. 세포를 각 튜브에 분주하고 (3 x 10⁵) 0.1 % BSA 가 포함된 PBS로 세척한 후, 수용성 Fab-pIII 단편, 키메라 항-EGFR 항체, cetuximab (Erbitux® Merck)을 첨가하여 1시간 동안 4℃에서 반응시켰다. PBSB로 세척한 후, 각각의 튜브에 FITC가 컨쥬게이션된 염소 항-사람 카파 L IgG (Sigma-Aldrich)를 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. PBSB로 다시 세척한 후, 유세포분석기로 분석하였다. 경쟁적인 유세포분석을 위해 A431 세포에 5 uM의 재조합 EGF (PeProtec, USA) 또는 0.3 uM의 cetuximab을 첨가한 후, 비오틴화된 Fab 단편을 첨가하여 반응시켰다. PBSB로 세척한 후, 결합된 Fab 단편은 FITC가 결합된 스트렙타비딘 (BioLegend, USA)을 이용하여 확인하였다.

그 결과, 높은 EGFR 발현을 보이는 A431과 낮은 EGFR 발현을 보이는 DU145에 cetuximab과 EG 19-11 모두 염색되었다. 반면에 EGFR 음성 대조군인 IM9, Jurkat, U937 및 NIH3T3 세포주는 Cetuximab 과 EG 19-11에 염색되지는 않았다 (도 6).

3-2. 면역형광법

EG 19-11 Fab가 A431세포에 내재화를 일으키는지 알아보기 위해 EG 19-11 파지 항체를 A431 세포에 반응시키고, 공초첨 현미경에 의해 분석하였다 (도 7).

파아지 항체들은 EG-19-11 또는 인간 항-IL-15 Fab인 4H10-LP4 (Hur et al., 2010)를 발현하는 대장균 TG1 세포들을 중복감염시켜 준비하였고, 통상의 방법으로 면역형광법을 수행하였다 (Poul et al., 2000). A431과 NIH3T3 세포들을 6 웰 플레이트에서 50%의 컨플루언시(confluency)로 커버슬립(coverslip)에서 배양하고 파아지 항체와 함께 37℃에서 두 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 커버슬립을 PBS로 6번, 글리신 버퍼 (50 mM glycine (pH 2.8), 500 mM NaCl)로 10분 동안 3번 세척하고, PBS로 중화시키고 파라포름알데히드 4% (w/v)가 포함된 PBS로 상온에서 5분 동안 고정하였다. 세포들을 차가운 아세톤으로 30초 동안 투과할 수 있게 만들고 1% BSA가 첨가된 PBS로 포화시켰다. 세포 내의 파아지들을 레트(rat) 항-M13 비오틴(Genetex, Germany)과 그 후의 FITC-컨쥬게이트된 스트렙타비딘 (BioLegend)으로 검출하였다. 커버슬립을 마운팅(mounting) 배지에서 슬라이드 위로 뒤집어 놓고, 면역 형광의 현미경 관찰을 Bio-Rad MRC 1024 스캐닝 레이저 공초점 현미경을 사용하여 수행하였다.

그 결과, EG 19-11 파지 항체는 A431세포에 특이적으로 내재화를 일으켰으나 NIH3T3세포에서는 일어나지 않았다. 이것은 수용체에 매개하는 세균내 도입 작용이 일어남을 보여준다.

3-3. 경쟁적 유세포분석

EG 19-11이 Cetuximab 이나 EGF에 의해 결합되는 EGFR의 에피톱을 인식하는지 결정하기 위해 경쟁적 유세포분석(competitive flow cytometry analysis)을 실행하였다(도 8). Cetuximab으로 처리된 A431세포의 사전 인큐베이션(preincubation)은 세포에서 Fab 분자의 결합을 감소시키는 것으로 나타났다. 하지만 EGF와 처리된 A431의 사전인큐베이션은 부분적으로 Fab 분자를 방해함을 알 수 있었다.

이것은 EG 19-11에 의한 에피톱은 EGFR 도메인 III에 위치한 Cetuximab에 근접한 위치에 있고 EGF 결합 표면에 근처에 있음을 의미한다. 또한 ELISA를 실시한 결과 동일한 결과를 얻어냈다(데이터 나타내지 않음).

3-4. 웨스턴 블롯( western blot )

A431 세포에서 EGFR 타이로신 인산화와 관련하는 EGF의 저해에서 EG 19-11의 영향은 항-타이로신 인산화 mAb을 이용한 웨스턴블롯에 의해 결정하였다 (도 9).

10% FBS (fetal bovine serum) 이 함유된 RPMI 1640 배지에서 유지된 A431 세포들을 cetuximab 또는 EG-19-11 (Fab) 처리 이전에 무혈청 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 혈청에 굶주린(Serum-starved) 세포들을 EGF (20nM)만 처리, 또는 다양한 농도의 cetuximab, FabC225 또는 EG-19-11로 30분 동안 함께 처리하였다. 세포들을 세척하고 Triton X 용출 버퍼 (10 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 2 ㎍/ml leupeptin 및 aprotinin, 1 mM Na₃VO₄, 1 mM PMSF)로 용해시켰다. 동일한 양(500 ㎍/ml)의 단백질을 10% SDS-PAGE로 분리한 다음, 마우스 항-포스포타이로신 4G10 mAb (Millipore, USA) 또는 토끼 항-ß-액틴 pAb (Cell Signaling, USA), 그 뒤를 이어 알칼리포스파타아제(AP)와 컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG (Sigma-Aldrich) 또는 알칼리포스파타아제(AP)와 컨쥬게이트된 염소 항-토끼 IgG (Sigma-Aldrich)를 사용하여 웨스턴블롯을 수행하였다. NBT/BCIP 기질 (Sigma-Aldrich)을 블롯에서 시그널을 시각화하기 위해 사용하였다.

Cetuximab을 이용한 예로서, EGFR에 결합하는 EGF의 방해는 인산화와 카이네이즈와 관련된 수용체의 활성, 그리고 아폽토시스(apoptosis), 감소된 MMPs(Matrix Metallo-Proteinase), VEGF(vascular endothelial growth factor) 생산과 같은 많은 세포의 진행과정을 저해하는 다운스트림 신호전달 (MAPK, PI3K/Akt, Jak/Stat 경로)을 저해하는 것으로 알려져 있다 (Vincenzi et al., 2010). 이는 EG 19-11에 의한 EGFR의 타이로신 인산의 저해가 FabC225, Cetuximab의 결과와 견주어 볼만하다는 결과를 보여준다. A431 세포에서 EGFR의 EGF관련 타이로신 인산화를 막아주는 관점에서 EG 19-11은 Cetuximab에 기능적으로 동등한 가치를 증명하는 것이다.

지금까지 예시적인 실시 태양을 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명의 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

한국생명공학연구원

KCTC11762BP

20100910

<110> IG THERAPY <120> A human anti-epidermal growth factor receptor Fab antibody and a pharmaceutical composition for treating tumor comprising the same <130> IPDC39435 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ile Asn Tyr Asn Ile Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Trp Met Asn Pro Tyr Thr Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Arg Trp Asp Asn Phe Gly Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Thr 1 5

Claims

서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3로 표시되는 가변영역을 포함하는 상피세포성 성장인자 수용체에 대한 단일 클론 항체 Fab 부위의 중사슬을 암호화하는 유전자.
서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6로 표시되는 가변영역을 포함하는 상피세포성 성장인자 수용체에 대한 단일 클론 항체 Fab 부위의 경사슬을 암호화하는 유전자.
서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3을 포함하는 벡터.
서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6을 포함하는 벡터.
제 3항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제 5항에 있어서,
숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제 4항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제 7항에 있어서,
숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제 3항 및 제 4항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제 9항에 있어서,
숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 중사슬 가변영역을 함유하고, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 경사슬 가변영역을 함유하는 상피세포성 성장인자 수용체에 대한 인간 단일클론 항체 또는 그의 항원결합 단편(Fab).
제 11항의 인간 단일클론 항체 또는 그의 항원결합 단편을 함유하는 상피세포성 성장인자 수용체 저해용 약학조성물.
제 11항의 인간 단일클론 항체 또는 그의 항원결합 단편을 함유하는 종양 치료용 약학 조성물.
제 13항에 있어서,
종양은 직장암임을 특징으로 하는 종양 치료용 약학 조성물.