KR20120110117A - 네포팜 화합물을 사용하는 흉터 및 베타-카테닌-매개된 질환의 치료방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 네포팜 화합물을 투여하여 β-카테닌-매개된 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 과도하거나 바람직하지 않은 β-카테닌 발현으로부터 발생하는 질환의 치료에 관한 것이다. 네포팜 화합물로는 네포팜, 및 네포팜의 아날로그, 프로드러그, 염 및 용매화물이 포함된다. β-카테닌-매개된 질환은 바람직하게는 (흉터, 공격성 섬유종증 및 섬유증과 같은) 섬유상증식 질환과 (결장암, 흑색증, 간암, 난소암, 자궁내막암, 수모세포종, 모기질세포종 및 전립선암과 같은) 암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

Description

네포팜 화합물을 사용하는 흉터 및 베타-카테닌-매개된 질환의 치료방법{METHOD OF TREATING SCARS AND β-CATENIN-MEDIATED DISORDERS USING NEFOPAM COMPOUNDS}

본 발명은 일반적으로 흉터 및 β-카테닌-매개된 질환의 치료방법에 관한 것이다.

섬유상증식 과정은 간엽 섬유아세포-유사 방추상 세포의 과도한 증식을 특징으로 하는 일군의 질환이다. 상기 과정은 비후성 상처로부터 공격성 섬유종증(aggressive fibromatosis, 이하 AF)과 같은 신생물의 발전까지 다양하다.

상처치유 동안, 여러 세포유형 및 신호경로는 활성화되어 피부상피층과 피부진피층을 재구성한다. 피부손상에 이어, 3차례 과정: 염증, 증식 및 리모델링은 연속적이지만 중복적으로 개시된다. 증식기 동안 상피세포 장벽층은 개선되는 반면 간엽 섬유아세포-유사 세포는 피부의 진피성분에 축적된다(참조: Singer 1999, Martin 1997, McClain 1996). β-카테닌은 상피와 간엽세포 활성을 매개함으로써, 진피 간엽세포의 증식과 분화를 증진시키고 상피 표피세포(keratinocyte)의 이동을 감소시킬 수 있는 것으로 관찰되었다(참조: Cheon 2002). β-카테닌은 마우스 모델에서 형성된 상처크기를 조절할 수 있는 것으로 증명되었고, 이때 리튬 치료에 의해 유도된 β-카테닌 수치는 더 큰 상처를 치유하였다(참조: Cheon 2006). 또한, 간엽세포에서 안정화된 β-카테닌이 발현되는 형질전환 마우스는 테트라사이클린-조절된 프로모터의 조절하에 생성시켰다. 과형성 피부상처입고 치료받은 상처군 마우스를 야생형 대조군 마우스와 비교하였다(참조: Cheon 2002). 이 비교결과, 간엽세포에서의 β-카테닌 중요성과 상처치유에서의 중요한 β-카테닌 역할이 증명되었다.

β-카테닌-매개된 또다른 섬유상증식 질환은 데스모이드(desmoid) 종양이라고도 칭하는 AF(공격성 섬유종증)이다. AF는 간엽 섬유아세포-유사 방추상 세포로 구성된 국소침략성 연조직 종양이다. AF는 가족성 선종성 용종증(FAP)과 같은 가족성 증후군이나 산발적 병변중 하나로 발생한다. β-카테닌 안정화는 높아진 β-카테닌 수치와 향상된 β-카테닌-매개된 전사활성에 의해 입증된 바와 같이 AF에서는 보편적인 사건이다. 또한, β-카테닌 안정화는 β-카테닌의 안정화 형태를 과발현하는 형질전환 마우스 모델을 이용하여 보인 바와 같이 AF를 일으키기에 충분하다(참조: Cheon 2002). 이 연구는 섬유상증식 질환에서 작용하는 β-카테닌의 중요한 역할과 간엽세포에서의 β-카테닌 중요성을 제안한다.

다수의 연구결과, 섬유상증식 질환에서의 β-카테닌 역할에 더하여, 해제된 β-카테닌 발현은 결장암, 흑색증, 간세포암, 난소암, 자궁내막암, 수모세포종, 모기질세포종 및 전립선암과 같은 다수의 악성종양 기원에 중요한 사건임이 증명되었다. β-카테닌 돌연변이는 이들 암의 부분집합의 진행에 중요한 단계일 것으로 보이므로, 세포증식 또는 세포사망의 조절에 있어서 β-카테닌 돌연변이의 중요한 역할이 제안된다(참조: Polakis P. The many ways of Wnt in cancer. Curr Opin Genet Dev. 2007 Feb; 17(1):45-51).

이와 관련하여, β-카테닌과 관련될 수 있는 질환과 상태를 치료하기에 효과적인 신규한 방법을 개발하는 것은 바람직하다.

본 발명에 따라, 네포팜(Nefopam) 및 그의 아날로그는 섬유상증식 질환과 같은 β-카테닌-매개된 질환뿐만 아니라 흉터조직의 치료에도 유용하다는 사실을 발견하였다.

따라서, 본 발명의 일 국면에서, 네포팜, 또는 네포팜의 기능상 등가의 아날로그, 프로드러그, 염 또는 용매화물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하여 β-카테닌-매개된 질환 또는 상태의 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 국면에서, 치료유효량의 네포팜, 또는 네포팜의 약학적으로 허용가능한 아날로그, 염, 용매화물 또는 프로드러그를 흉터조직에 투여하는 것을 포함하여 흉터조직을 치료하거나 또는 흉터조직 형성을 감소시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 대체국면에서, 네포팜 또는 네포팜의 기능상 등가의 아날로그, 염, 용매화물 또는 프로드러그를 포함하는 조성물과 포장재(packaging)를 포함하여 제조된 제품을 제공한다.

본 발명의 또다른 국면에서, β-카테닌-매개된 질환이나 상태의 치료용 약제, 또는 흉터조직의 치료용 약제 제조를 위한, 네포팜 또는 네포팜의 기능상 등가의 아날로그, 염, 용매화물 또는 프로드러그의 신규한 용도를 제공한다.

본 발명에 따라, 네포팜(Nefopam) 및 그의 아날로그는 섬유상증식 질환과 같은 β-카테닌-매개된 질환뿐만 아니라 흉터조직의 치료에도 유용하다는 사실을 발견하였다.

이제 본 발명은 하기 도면을 참조하여 보다 상세히 설명할 것이다:
도 1a는 2개의 과형성 상처에서 유도된 세포배양물과 정상 섬유아세포 배양물을 DMSO(dimethyl sulfoxide) 치료(대조군) 또는 네포팜 치료한 다음, SRB(Sulforhodamine B) 분석을 이용하여 측정한 세포생존성을 도시하는 막대 그래프이다. 세포생존률(%)은 95%의 신뢰구간을 두고 평균치로 제공된다. 네포팜-치료 배양물에서의 세포생존률(%)은 DMSO 대조군(과형성 상처 세포배양물)에 비해 유의하게 감소하지만, 정상 섬유아세포 배양물에서의 세포생존률은 비교적 변화되지 않았다(별표는 정상 섬유아세포 배양물과 비교한 유의성을 나타냄).
도 1b는 과형성 상처 세포배양물의 β-카테닌 수치의 웨스턴블럿 분석(western blot analysis) 결과를 도시하는 사진이다. 네포팜 치료군의 β-카테닌 단백질 수치는 DMSO 치료된 대조군보다 실질적으로 저하되는 것으로 나타났다.
도 2는 Apc +/ Apc1638N 마우스 수컷에서 네포팜 비치료군, 네포팜 치료군 또는 DMSO 대조군에 형성된 공격성 섬유종증(AF) 종양의 개수를 비교하고, 동일한 치료 하에서 상향 위장관에서의 상피-유도된 폴립 개수를 도시하는 그래프이다. 1) 네포팜 비치료군(n=11), 2) 0.1% DMSO 대조군(n=10) 및 3) 네포팜 치료군: 네포팜 40㎎/체중㎏(n=10).
도 3a는 5일 동안 0.1% DMSO(대조군) 또는 네포팜 치료중 하나를 수행한 다음 인간 공격성 섬유종증(AF) 종양(n=5)-유도된 1차 세포배양물의 추출물 중에서의 β-카테닌 단백질 수치(92kDa)를 웨스턴블럿 분석한 결과를 도시하는 사진이다. β-카테닌 단백질 수치도 역시 네포팜 치료 또는 비치료 하에 Wnt3a로 배양된 1차 섬유아세포 배양물에서 결정하였다. 실험은 3중으로 수행하였다. 액틴(Actin) 발현은 용해물 하중 대조군으로서 표시하고 있다.
도 3b는 인간 AF종양-유도된 세포배양물에서의 총 β-카테닌 단백질 수치 데이터를 밀도측정 분석한 결과, 네포팜 치료군이 0.1% DMSO 대조군보다 약 5배로 저하됨을 도시하는 그래프이다. 평균과 95% 신뢰간격을 도시하고 있다. 대조군에 비해 통계적으로 유의한 차이(p<0.05)는 별표로 표시하고 있다.
도 4a는 5일 동안 DMSO(n=5) 또는 네포팜(n=5) 치료한 인간 AF종양-유도된 1차세포의 세포생존성의 평균과 95% 신뢰간격을 도시하는 그래프이다. 세포생존성은 세포를 트리판 블루 염료(Trypan Blue Dye)로 염색하고 생세포(투명)와 사세포(파란색)를 둘다 계수함으로써 측정하였다. 네포팜은 생세포 개수를 유의하게 감소시킨 반면, 사세포 개수를 변화시키지는 않았다. 대조군에 비해 통계적으로 유의한 차이(p<0.05)는 별표로 표시한다.
도 4b는 5일 동안 DMSO 또는 네포팜으로 3중치료한 인간 공격성 섬유종증 종양(n=2)-유도된 1차세포의 배양물에서의 증식의 척도로서 총 DAPI양성 세포에 대한 BrdU양성/DAPI양성 세포의 증식률(%)을 도시하는 그래프이다. 네포팜은 세포로의 BrdU 혼입을 유의하게 감소시킨다. 평균과 95% 신뢰간격을 도시하고 있다. 대조군에 비해 통계적으로 유의한 차이(p<0.05)는 별표로 표시하고 있다.
도 5a는 불멸화된 인간 섬유아세포에서 추출한 용해물을 웨스턴블럿 분석한 결과를 도시하는 사진이다. 네포팜 치료한 세포에서의 총 β-카테닌 단백질 수치는 DMSO 치료한 세포보다 상당히 저하되었다. GAPDH 발현은 용해물 하중 대조군으로서 도시하고 있다.
도 5b는 도 5a의 웨스턴블럿 데이터에 상응하는 밀도측정 데이터를 도시하는 그래프이다.
도 6a는 Tcf 마우스에서 상처남김후(post-wounding) 14일째에 얻은 세포배양물에서의 β-카테닌 단백질 수치를 웨스턴블럿 분석한 결과를 도시한다. GAPDH 발현은 용해물 하중 대조군으로서 도시하고 있다.
도 6b는 원형의 전층(full-thickness) 상처를 남긴 마우스에서 2주 동안 매일 체중㎏당 40㎎으로 전신투여한 담체 단독치료(대조군) 또는 담체와 함께 제형된 네포팜 치료(네포팜군)를 수행한 다음 정상 흉터 크기를 도시한 그래프이다. 그래프는 직경 4㎜의 생검 펀치를 사용하여 생성시킨 피부상처의 표면적 직경에 대한 평균과 95% 신뢰구간을 도시하고 있다. 상처 직경은 네포팜군이 대조군보다 유의하게 작았다(별표는 유의한 차이를 나타냄).
도 7은 정상적인 상처(정상군)의 치유 동안 및 과형성 상처(과형성군) 중의 상대적 β-카테닌 단백질 수치를 미상처군 조직과 비교하여 시간(주 단위로 측정함)에 걸쳐 도시하는 선 그래프이다. 정상적인 상처(정상군)의 치유기간 동안 β-카테닌 단백질 수치의 일반적인 상승과 하강 패턴은 과형성 상처(과형성군)에서 해제되고, 높아진 β-카테닌 단백질 수치 기간은 유의하게 연장되고 있다.
도 8은 상처남김후 4주된 피부 과형성 흉터의 표면적 직경에 대한 평균과 95% 신뢰구간을 도시하는 그래프이다. 직경 4㎜의 원형 전층 상처는 생검 펀치를 사용하여 생성시켰다. 상처 직경은 ㎜ 단위로 생성시켰다. 별표는 TGF(Transforming Growth Factor: 형질전환 생장인자)-β 치료와 비교할 때 주지된 흉터 크기가 통계적으로 유의한 차이(p<0.01)임을 나타내고, 여기에서 상처남김 당시에 TGF-β를 주사하면 크기가 증가된 과형성 흉터가 유도되는 것으로 공지되어 있다.
도 9는 3가지 상이한 담체: 카복시메틸셀룰로즈(CMC), 페트롤라툼 및 하이프로멜로즈 중에서 네포팜 농도를 다양하게 제형한 네포팜 국소제형을 도시하는 그래프이다. 네포팜을 피부를 통해 전달하는 가장 효과적인 제형을 결정하기 위하여 상기 3가지 담체를 마우스 모델에서 생체내 시험하였다. 피부와 혈청 중의 네포팜 수치를 측정할 때 페트롤라툼계 담체 제형은 네포팜 방출성이 강화된 것으로 결정하였다.
도 10은 임의단위(arbitrary units)로 측정한 상대적 흉터 표면적을 도시하는 그래프이다(상처남김 시의 흉터크기를 100 임의단위로 간주함). 직경 4㎜의 전층 천공된 상처는 14일 동안 매일 2회씩 담체 크림(대조군) 또는 페트롤라툼 담체 중에 제형된 1% 네포팜 크림으로 국소치료하였다. 데이터는 치료군마다 10개 상처의 평균치를 표준편차와 함께 나타낸다.

본 발명은 네포팜 또는 네포팜의 기능상 등가의 아날로그를 β-카테닌-매개된 질환 포유동물에게 투여하는 것을 포함하여 β-카테닌-매개된 질환 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다.

본원에서 사용하는 용어 "β-카테닌-매개된 질환 또는 상태"란 비후성, 과형성 및 켈로이드성 흉터를 포함하는 진피흉터와 같은 형성 중이거나 이미 형성된 섬유상증식 질환과, 공격성 섬유종증, 예를 들면 가족성 선종성 용종증(FAP)과 같은 가족성 증후군 또는 산발적 병변; 간섬유증, 폐섬유증(예: 규폐증, 석면폐증), 신장섬유증(당뇨병성 신증을 포함함), 사구체경화증, 족저건막 섬유종증(Lederhose disease) 및 수장근막 구축(Dupuytren's contracture: DC) 뿐만 아니라, 결장암, 대장암, 흑색증, 간세포암, 난소암, 자궁내막암, 수모세포종, 모기질세포종 및 전립선암과 같은 악성종양을 포함한 섬유조직의 축적("섬유증")이 특징인 질환 또는 상태를 언급하지만 이에 국한되지 않는다.

용어 "네포팜"이란 5-메틸-1-페닐-1,3,4,6-테트라히드로-2,5-벤족사조신, 및 이의 제약적으로 허용가능한 기능상 등가의 아날로그, 프로드러그, 염 및 용매화물을 의미한다. 네포팜의 아날로그, 프로드러그, 염 및 용매화물과 관련하여 사용되는 용어 "기능상 등가의"란 β-카테닌을 조절하도록 선택된 화합물의 능력을 말한다. β-카테닌을 조절할 수 있도록 선택된 화합물의 범위는 화합물의 합성에 따라 다양할 수 있다.

본원에서 사용하는 용어 "아날로그"란 하기 <화학식 I>의 화합물 또는 그의 제약적으로 허용가능한 염을 의미한다:

<화학식 I>

상기 식에서,

R₁은 H이거나, F 또는 C_{3 -6} 시클로알킬로 임의로 치환된 C_{1 -6} 알킬이거나 또는 C_{2 -4} 알케닐이고;

A는 O, CH₂ 또는 S(0)_n(이때, n은 0 내지 2이다)이며;

W, X, Y 및 Z 중 1개는 N, CH 또는 CR₃이고, 나머지는 CH이고;

R₂는 O, N 및 S(0)_n(이때, n은 0 내지 2이다)에서 선택된 1개 이상의 헤테로원자를 임의로 포함하는 C_{5 -6} 헤테로아릴, C_{5 -1O} 시클로알킬 또는 시클로알케닐이고, R₃으로 임의로 치환되거나; 또는

R₂는 할로겐, CN, CF₃, C_{1 -6} 알킬 및 OR₁에서 독립적으로 선택된 1개 이상의 치환체로 1개 이상의 위치에서 임의로 치환된 페닐기이거나, 또는

R₂는 카르보시클릭, 헤테로시클릭(O, N 및 S에서 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 포함함), 방향족 또는 헤테로방향족(O와 N에서 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 포함함)일 수 있는 5원 또는 6원 환에 융합된 페닐기이며;

R₃은 할로겐, CF₃, CN, OR₅, S0₂N(R₅)₂, COR₅, C0₂R₅, CON(R₅)₂, NR₁C0R₄, NR₁SO₂R₄, NR₁CO₂R₄, NR₁CON(R₅)₂; R₃으로 치환된 OC_{1 -6} 알킬, 비치환된 R₃으로 임의로 치환된 C_{1 -6} 알킬, 비치환된 R₃으로 임의로 치환된 C_{3 -6} 시클로알킬, 비치환된 R₃으로 임의로 치환된 C_{2 -6} 알케닐, 비치환된 R₃으로 임의로 치환된 C_{2 -6} 알키닐, 비치환된 R₃으로 임의로 치환된 아릴; 및 N과 O에서 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함하는 5원 또는 6원 방향족 헤테로환에서 선택되고;

R₄는 C_{1 -6} 알킬, C_{2 -6} 알케닐, C_{2 -6} 알키닐, C_{3 -6} 시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이며;

R₅는 H, C_{1 -6} 알킬, C_{2 -6} 알케닐, C_{2 -6} 알키닐, C_{3 -6} 시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이고, 또다른 R₅와 동일 또는 상이하거나; 또는

R₁은 H이거나, F 또는 C_{3 -6} 시클로알킬로 임의로 치환된 C_{1 -6} 알킬이거나 또는 C_{2 -6} 알케닐이고;

R₂ 및 R₃은 동일 또는 상이하고, H, 할로겐, CN, CF₃, C_{1 -6} 알킬 또는 OR₁이거나, 또는

R₂ 및 R₃은 카르보시클릭, 헤테로시클릭(O, N 및 S에서 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 포함함), 방향족 또는 헤테로방향족(O와 N에서 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 포함함)일 수 있는 5원 또는 6원 환을 형성하며;

W, X, Y 및 Z 중 1개는 N 또는 CR₄이고, 나머지는 각각 CH이고;

R₄는 할로겐원자, CF₃, CN, OR₇, S0₂N(R₆)₂, COR₆, C0₂R₆, CON(R₆)₂, NR₁C0R₅, NR₁SO₂R₅, NR₁CO₂R₅, NR₁CON(R₆)₂; R₄로 임의로 치환된 OC_{1 -6} 알킬, R₄로 임의로 치환된 C_{1 -6} 알킬, R₄로 임의로 치환된 C_{3 -6} 시클로알킬, R₄로 임의로 치환된 C_{2 -6} 알케닐, R₄로 임의로 치환된 C_{2 -6} 알키닐, R₄로 임의로 치환된 아릴이거나; 또는

R₄는 N과 O에서 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함하고, 탄소 또는 질소를 통해 연결된 5원 또는 6원 방향족 헤테로환이며;

R₅는 C_{1 -6} 알킬, C_{2 -6} 알케닐, C_{2 -6} 알키닐, C_{3 -6} 시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이고;

(동일 또는 상이할 수 있는) R₆은 각각 H, C_{1 -6} 알킬, C_{2 -6} 알케닐, C_{2 -6} 알키닐, C_{3 -6} 시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이며;

R₇은 아릴 또는 헤테로아릴이거나; 또는

R₁은 H이거나, F 또는 C_{3 -6} 시클로알킬로 임의로 치환된 C_{1 -6} 알킬이거나 또는 C_{2 -4} 알케닐이고;

A는 O, CH₂ 또는 S(0)_n(이때, n은 0 내지 2이다)이며;

W, X, Y 및 Z 중 1개는 N, CH 또는 CR₃이고, 나머지는 CH이고;

R₂는 O, N 및 S(0)_n(이때, n은 0 내지 2이다)에서 선택된 1개 이상의 헤테로원자를 임의로 포함하는 C_{5 -6} 헤테로아릴, C_{5 -1O} 시클로알킬 또는 시클로알케닐이고, R₃으로 임의로 치환되거나; 또는

R₂는 할로겐, CN, CF₃, C_{1 -6} 알킬 및 OR₁에서 독립적으로 선택된 1개 이상의 치환체로 1개 이상의 위치에서 임의로 치환된 페닐기이거나, 또는

R₂는 카르보시클릭, 헤테로시클릭(O, N 및 S에서 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 포함함), 방향족 또는 헤테로방향족(O와 N에서 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 포함함)일 수 있는 5원 또는 6원 환에 융합된 페닐기이며;

R₃은 할로겐, CF₃, CN, OR₅, S0₂N(R₅)₂, COR₅, C0₂R₅, CON(R₅)₂, NR₁C0R₄, NR₁SO₂R₄, NR₁CO₂R₄, NR₁CON(R₅)₂; R₃으로 치환된 OC_{1 -6} 알킬, 비치환된 R₃으로 임의로 치환된 C_{1 -6} 알킬, 비치환된 R₃으로 임의로 치환된 C_{3 -6} 시클로알킬, 비치환된 R₃으로 임의로 치환된 C_{2 -6} 알케닐, 비치환된 R₃으로 임의로 치환된 C_{2 -6} 알키닐, 비치환된 R₃으로 임의로 치환된 아릴; 및 N과 O에서 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함하는 5원 또는 6원 방향족 헤테로환에서 선택되고;

R₄는 C_{1 -6} 알킬, C_{2 -6} 알케닐, C_{2 -6} 알키닐, C_{3 -6} 시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이며;

R₅는 H, C_{1 -6} 알킬, C_{2 -6} 알케닐, C_{2 -6} 알키닐, C_{3 -6} 시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이고, 또다른 R₅와 동일 또는 상이하거나; 또는

R₁은 H이거나, F 또는 C_{3 -6} 시클로알킬로 임의로 치환된 C_{1 -6} 알킬이거나 또는 C_{2 -4} 알케닐이고;

A는 O, CH₂ 또는 S(0)_n(이때, n은 0 내지 2이다)이며;

W, X, Y 및 Z 중 1개는 N, CH 또는 CR₃이고, 나머지는 CH이고;

R₂는 O, N 및 S(0)_n(이때, n은 0 내지 2이다)에서 선택된 1개 이상의 헤테로원자를 임의로 포함하는 C_{5 -6} 헤테로아릴, C_{5 -1O} 시클로알킬 또는 시클로알케닐이고, R₃으로 임의로 치환되거나; 또는

R₂는 할로겐, CN, CF₃, C_{1 -6} 알킬 및 OR₁에서 독립적으로 선택된 1개 이상의 치환체로 1개 이상의 위치에서 임의로 치환된 페닐기이거나, 또는

R₂는 카르보시클릭, 헤테로시클릭(O, N 및 S에서 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 포함함), 방향족 또는 헤테로방향족(O와 N에서 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 포함함)일 수 있는 5원 또는 6원 환에 융합된 페닐기이며;

R₃은 할로겐, CF₃, CN, OR₅, S0₂N(R₅)₂, COR₅, C0₂R₅, CON(R₅)₂, NR₁C0R₄, NR₁SO₂, NR₁CO₂R₄, NR₁CON(R₅)₂; R₃으로 치환된 OC_{1 -6} 알킬, 비치환된 R₃으로 임의로 치환된 C_{1 -6} 알킬, 비치환된 R₃으로 임의로 치환된 C_{3 -6} 시클로알킬, 비치환된 R₃으로 임의로 치환된 C_{2 -6} 알케닐, 비치환된 R₃으로 임의로 치환된 C_{2 -6} 알키닐, 비치환된 R₃으로 임의로 치환된 아릴; 및 N과 O에서 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함하는 5원 또는 6원 방향족 헤테로환에서 선택되고;

R₄는 C_{1 -6} 알킬, C_{2 -6} 알케닐, C_{2 -6} 알키닐, C_{3 -6} 시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이며;

R₅는 H, C_{1 -6} 알킬, C_{2 -6} 알케닐, C_{2 -6} 알키닐, C_{3 -6} 시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이고, 또다른 R₅와 동일 또는 상이하거나; 또는

R₁은 H이거나, F 또는 C_{3 -6} 시클로알킬로 임의로 치환된 C_{1 -6} 알킬이거나 또는 C_{2 -4} 알케닐이고;

R₂ 및 R₃은 동일 또는 상이하고, 각각은 H, 할로겐, CN, CF₃, C_{1 -6} 알킬 또는 OR₁이거나, 또는

R₂ 및 R₃은 카르보시클릭, 헤테로시클릭(O, N 및 S에서 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 포함함), 방향족 또는 헤테로방향족(O와 N에서 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 포함함)일 수 있는 5원 또는 6원 환을 형성할 수 있으며;

W, X, Y 및 Z 중 1개는 N, CH 또는 CR₄이고, 나머지는 CH이고;

R₄는 할로겐, CF₃, CN, OR₇, S0₂N(R₆)₂(이때, R₆ 각각은 동일 또는 상이하다), COR₆, C0₂R₆, CON(R₆)₂(이때, R₆은 동일 또는 상이하다), NR₁C0R₅, NR₁SO₂R₅, NR₁CO₂R₅, NR₁CON(R₆)₂(이때, R₆ 각각은 동일 또는 상이하다); 비치환된 R₄로 치환된 OC_{1 -6} 알킬, 비치환된 R₄로 임의로 치환된 C_{1 -6} 알킬, 비치환된 R₄로 임의로 치환된 C_{3 -6} 시클로알킬, 비치환된 R₄로 임의로 치환된 C_{2 -6} 알케닐, 비치환된 R₄로 임의로 치환된 C_{2 -6} 알키닐 또는 비치환된 R₄로 임의로 치환된 아릴이거나; 또는

R₄는 N과 O에서 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함하는 5원 또는 6원 방향족 헤테로환이며;

R₅는 C_{1 -6} 알킬, C_{2 -6} 알케닐, C_{2 -6} 알키닐, C_{3 -6} 시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이고;

R₆은 H, C_{1 -6} 알킬, C_{2 -6} 알케닐, C_{2 -6} 알키닐, C_{3 -6} 시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴일 수 있으며;

R₇은 아릴 또는 헤테로아릴이다.

네포팜의 추가 아날로그는 본원에서 그 내용을 참조하여 통합한 WO2004/056788, WO2005/103019 및 US2006/0019940에 기술되어 있다. 네포팜 및 그의 아날로그는 당업자에게 널리 공지된 화학합성법을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 네포팜은 상업적으로 이용할 수 있다.

용어 "프로드러그"란 네포팜 구조를 갖는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 아날로그, 염, 수화물 또는 용매화물을 생성하도록 생체내에서 변형되는 화합물(예: 약물 전구체)을 의미한다. 변형은 예를 들어 혈액에서 가수분해를 통하는 것과 같이 다양한 기전(예를 들어, 신진대사 또는 화학공정에 의함)에 의해 발생할 수 있다. 본원에서 언급하는 용어 "염(들)"이란 무기 및/또는 유기 산과 형성된 산성 염 뿐만 아니라 무기 및/또는 유기 염기와 형성된 염기성 염도 나타낸다. 기타 염도 유용하지만 약제학적으로 허용가능한(즉, 무독성, 생리적으로 허용가능한) 염은 바람직하다. "용매화물"은 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 용매 중의, 네포팜 또는 네포팜 아날로그의 혼합물에 의해 형성된다.

본 발명의 방법은 포유동물의 β-카테닌-매개된 질환의 치료를 포함한다. 본원에서 용어 "치료", "치료법" 및 "치료하기"란 표적질환을 순조롭게 변경하는 방법을 나타내기 위해 광범위하게 사용하고, 이때 그 표적질환의 진행을 조절 또는 역전시키거나 그 표적질환의 심각도를 저하시키거나 그 표적질환을 예방 또는 치료하는 행위들을 망라한다. 본원에서 용어 "포유동물"이란 인간과 비-인간 포유동물 둘다를 망라하여 사용한다.

본 발명은 또한, β-카테닌-매개 가능성 여부와 무관하게, 창상, 찰과상, 감염, 여드름, 화상, 수술 등으로 인한 흉터와, 간엽 및 중간엽-유래 세포를 포함하는 비후성, 과형성, 켈로이드성 흉터를 포함하는 진피흉터의 치료방법을 제공한다. 본 발명의 치료방법은 치료유효량의 네포팜 화합물을 표적부위에 투여하는 것을 포함한다. 형성 중의 또는 이미 형성된 흉터의 치료방법은 흉터크기의 감소(예를 들면, 적어도 약 5~10%까지, 바람직하게는 적어도 약 20%까지, 보다 바람직하게는 적어도 약 25% 이상까지) 또는 흉터만연(예: 흉터 상승, 적열상태 등)의 저하로써 흉터외관의 개선까지 포함한다. 이와 관련하여, 숙련가라면 흉터 평가척도, 예를 들면 맨체스터 스케일(Manchester Scale)을 이용하여 표적흉터의 개선도를 평가할 수 있다. 맨체스터 스케일은 주변피부와 비교한 색상, 무광택 또는 윤기나는 외관, 윤곽(흉터/켈로이드까지 주변피부를 갖는 홍조), 결(정상 내지 딱딱함), 가장자리(명료 또는 불명료), 크기 및 개수(1개 또는 다수개)를 평가한다(참고: Disability & Rehabilitation, 2009, Vol. 31, No. 25: pp. 2055~2063; International Journal of Lower Extremity Wounds December 2007 6: 249~253).

따라서 본 발명의 네포팜 화합물은 흉터조직을 줄이고 흉터과 주변지역의 심미적 개선을 위해 성형치료에 활용할 수 있으며, 추가적인 미용기능, 예를 들어 주름방지 효과를 제공할 수 있다.

본 발명은 또다른 양태에서 종양의 치료방법을 제공한다. 종양 치료는 종양개시의 억제 및 종양세포 증식을 포함한다. 본 발명의 종양 치료방법은 공격성 섬유종증과 같은 해제된 β-카테닌 발현으로 인해 발생하는 종양뿐 아니라, 결장암, 흑색증, 간세포암, 난소암, 자궁내막암과 전립선암과 같은 다양한 암에서 발생하는 종양을 치료하는 데 유용하다. 본 발명의 종양 치료방법은 치료를 필요로 하는 포유동물, 즉 종양을 가진 포유동물에게 유효량의 네포팜, 그의 아날로그, 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 프로드러그를 투여하는 것을 포함한다.

임의의 특정이론에도 구속되지 않고자 하지만, 본 발명에 따른 치료는 β-카테닌 발현의 규정 또는 조절을 핵산 수치로 또는 β-카테닌 활성의 규정 또는 조절을 단백질 수치로으로 영향받을 수 있다.

치료유효 복용량의 네포팜을 본 발명에 따른 포유동물에게 투여한다. 복용량과 관련하여 본원에서 사용하는 용어 "치료유효"란 허용불가한 불리한 부작용을 일으키지 않고 β-카테닌-매개된 질환을 치료하기에 효과적인 복용량을 의미한다. 용어 "투여"란 네포팜을 포유동물에게 제공하는 모든 적절한 수단을 의미하며, 설명한 대로 사용되는 투여 형태에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 복용량은 보다 상세히 설명될 바와 같이, 경구, 주사, 점막 및 국소로 투여할 수 있다.

따라서, 본 발명의 방법에 따른 치료유효 복용량은, 약 0.0001 내지 약 1,500㎎ 범위, 예를 들어 약 0.0001 내지 100㎎ 범위에 있다. 그러나 당업계의 숙련가에게는 네포팜 또는 그의 아날로그의 치료유효 복용량은 치료하려는 질환 유형, 질환의 특성과 심각도, 치료하려는 포유동물, 치료받는 포유동물의 증상, 치료에 사용되는 화합물 및 투여경로를 포함하지만 이에 국한되지 않는 여러 가지 요인에 따라 다양하게 투여할 것이다.

네포팜은 본 발명의 방법에 따라 단독 투여할 수 있거나 약제학적으로 허용가능한 보조제 또는 담체와 혼합된 조성물로 투여할 수 있다. 표현 "약제학적으로 허용가능한"이란 약제분야에서 사용하기에 허용가능하다는, 즉 허용불가능하게 독성이 아니라는 의미 또는 포유동물에게 투여하기에 부적합하지 않다는 의미이다. 약제학적으로 허용가능한 보조제의 예로는 희석제, 부형제 등을 포함하지만, 이들로만 제한하지 않는다. 일반적으로 약학제제에 관한 지침으로서 문헌[참고: "Remington's: The Science and Practice of Pharmacy", 21st Ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005]을 참조할 수 있다. 보조제는 조성물의 의도하는 투여양태에 따라 선택한다. 본 발명의 한 양태에서, 본 발명의 화합물은 주입, 피하주사 또는 정맥주사 투여 용으로 제형하고, 그에 따라 멸균 및 발열물질(pyrogen) 부재 형 수용액으로서 활용하고 임의로는 완충시키거나 등장성으로 제조한다. 따라서 본 발명의 화합물은 증류수, 보다 바람직하게는 염수, 인산염-완충 염수 또는 5% 덱스트로즈 용액 중에 투여할 수 있다. 정제, 캡슐, 함당 정제(lozenge), 수성 또는 비수성 액체 중의 액제 또는 현탁액제, 수중유형 또는 유중수형 액체 에멀젼, 엘릭서 또는 시럽을 통한 경구 투여용 조성물은 유당, 포도당 및 자당과 같은 당류; 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 녹말; 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 에틸 셀룰로즈 및 셀룰로즈 아세테이트를 포함하는 셀룰로오스와 그의 유도체; 분말 트라간칸스(tragancanth); 맥아; 젤라틴; 활석; 스테아르산; 마그네슘 스테아레이트; 황산 칼슘; 땅콩유, 면실유, 참기름, 올리브유 및 옥수수유와 같은 식물성 유; 프로필렌 글리콜, 글리세린, 솔비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; 한천; 알긴산; 물; 등장 식염수와 인산염 완충액을 포함하는 보조제를 사용하여 제조한다. 또한 습윤제, 나트륨 라우릴 황산염과 같은 윤활제, 안정화제, 정제화제, 붕해제, 산화방지제, 방부제, 착색제와 풍미제도 존재할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 크림, 로션이나 연고로서 국소도포 용으로 제제할 수 있다. 그러한 국소도포를 위하여 본 발명의 조성물은 트리글리세라이드 기재와 같은 적절한 기재를 포함할 수 있다. 그러한 크림, 로션 및 연고도 역시 향은 물론 계면활성제, 및 피부 연화제 등과 같은 기타 화장품 첨가제를 포함할 수 있다. 적절한 추진 보조제가 사용되는 에어로졸 제제, 예를 들어 비강전달용 에어로졸 제제도 역시 제조할 수 있다. 본 발명의 조성물도 볼러스(bolus), 연약 또는 페이스트로서 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물은 경구, 비강, 직장 또는 질 부분에 영향을 미치는 감염증의 치료를 위한 경구, 비강, 직장 또는 질 투여를 포함하는 점막투여용 조성물도 역시 포함한다. 그러한 조성물은 통상적으로, 예를 들면 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 좌약 왁스, 살리실레이트 또는 기타 적합한 담체를 포함하는 하나 이상의 적합한 비자극적 부형제 또는 담체를 포함한다. 예를 들어, 품질수명의 연장을 도울 수 있는 기타 보조제도 역시 그 투여방법과 무관하게 본 발명의 조성물에 추가할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 네포팜 화합물은 경구, 피하, 정맥, 복강내, 비강, 장, 국소, 설하, 근육내, 동맥내, 골수내, 척추관, 흡입, 안구, 경피, 질 또는 직장 수단을 포함하지만 이들에 국한되지 않는 다수의 임의의 경로로 종래의 방식대로 투여할 수 있다. 본 발명의 네포팜 화합물은 또한 생체외 치료 프로토콜에서 세포에 투여할 수 있다. 본 발명의 네포팜 화합물은 투여 경로에 따라 보호 물질로 코팅하거나 캡슐화하여 그의 치료활성에 영향을 미칠 수 있는 예를 들면 효소, 산 또는 기타 조건에 의한 분해를 방지할 수 있다.

본 발명의 하나의 양태에서 네포팜 또는 그의 아날로그는 예를 들면, 붕대, 드레싱, 폴리머 메쉬(polymer mesh), 임플란트, 디바이스 또는 기타 화장용 관련 아이템과 같은 생체적합성 장치, 고분자 또는 기타 매트릭스에 부착된 대상 부위, 예를 들면 형성 중이거나 이미 형성된 흉터에 국소도포할 수 있다. 또한, 네포팜 화합물을 발현하는 생체공학적 진피 섬유아세포/케라티노사이트(keratinocytes)를 표적부위에 도포할 수 있다. 적합한 매트릭스 또는 폴리머 메쉬, 예를 들어 인조 또는 비-인조 이식피부는 또한 도포용 네포팜 화합물을 함침시켜 일정기간에 걸쳐 대상 부위를 지속적으로 치료하기 위해 화합물의 서방출을 허용할 수 있다.

본 발명의 네포팜 화합물은 예를 들면, 용해- 또는 확산-조절된 일체식 디바이스(monolithic device), 염주상 캡슐화 시스템(beaded encapsulated systems), 삼투압-제어된 시스템, 및 적합한 고분자 및 비-고분자 친수성 및 소수성 물질을 통합하는 개질 필름 코팅시스템을 포함하여 안정된 방법을 이용하여 방출조절 제형으로 투여할 수 있다. 적합한 방출조절 제형은 아크릴계 또는 메타크릴계 중합체 또는 공중합체, 알킬비닐 중합체, 셀룰로즈, 히드록시알킬 셀룰로즈, 카르복시알킬 셀룰로즈, 다당류, 알기네이트, 펙틴, 전분과 그 유도체, 천연 및 합성 검, 폴리카르보필(polycarbophil), 키토산을 포함하지만, 이들에 국한되지 않는 친수성 물질을 포함할 수 있다. 적합한 소수성 물질은 소수성 중합체, 왁스, 지방, 장쇄 지방산, 그들의 상응하는 에스테르, 그들의 상응하는 에테르, 및 그들의 혼합물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 네포팜 화합물은 예를 들면, 반-흉터제(anti-scarring agent); 성장 인자, 예를 들어 표피성장인자, bFCF, PDGF와 같은 상처치유제; 혈소판, 진피 섬유아세포 및 케라티노사이트; 라파마이신(rapamycin), 트로글리타존(troglitazone), 로시글리타존(rosiglitazone), 셀레콕시브(celecoxib), 레티노이드(retinoids)와 이레사(iressa)와 같지만 이들에 국한되지 않는 화학치료제를 포함하는 하나 이상의 추가 치료제와 혼합하여 투여할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 네포팜은 개별 제제로 투여할 수 있거나, 또는 복합 제제 중의 추가 치료제와 함께 투여할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은 기타 치료와 함께, 예를 들면 악성종양의 치료시 방사선 치료와 함께, 또는 일반적인 흉터, 과형성 흉터 등과 같은 흉터조직의 치료시 레이저 치료와 함께 활용할 수 있다.

본 발명의 추가 국면에서 제조된 제품은 기술한 바와 같은 네포팜을 포함하는 조성물과 포장재(packaging)를 포함하여 제공된다. 그러한 포장재의 레이블(label)에는 본 발명의 조성물이 β-카테닌-매개된 질환 치료에 적합하다고 표시되거나 또는 본 발명의 조성물이 형성 중의 흉터 또는 이미 형성된 흉터의 치료에 적합하다고 표시될 수 있다.

본 발명은 첨부된 도면 및 구체적인 실시예를 참조하여 설명되지만 이들로만 제한하는 것으로 해석돼서는 안된다.

< 실시예 >

아래에 설명하는 실시예에서 다음과 같은 재료와 방법을 사용하였다.

Apc ⁺ / Apc ^1638N AF 마우스 모델 및 치료 계획

Apc / Apcl638N 마우스의 생성 및 표현형은 잘 특징지워졌다. 이들 마우스는 네오마이신을 엑손15에서 안티센스 방향으로 삽입한 결과로서 Apc(adenomatous polyposis coli: 선종성결장용종증) 유전자의 코돈 1638에서 표적돌연변이를 잠복시켰다. 마우스 수컷은 6월령까지 평균 45개의 AF병변 및 6개의 위장 폴립으로 발전하는 반면, 마우스 암컷의 AF병변 개수는 마우스 수컷보다 유의하게 적게 발전하였다. Apc / Apcl638N 마우스 수컷은 3개 군: 비처리군(n=11), 0.1% DMSO군(n=10)과 네포팜군(네포팜 40㎎/체중㎏)(n=10)으로 나누어 연구하였다. Apc / Apcl638N 마우스를 이유시킨 후 2개월부터 매일 위관영양(oral gavaging) 치료를 시작하여 3개월 동안 계속 수행하였다. 부검시 AF종양과 창자 폴립 개수를 육안으로 계수하였다. AF종양과 정상 조직은 단백질 추출용으로 수집하여 조직학적 실험을 위하여 고정시켰다.

Tcf 리포터 마우스와 상처남김 ( wounding ) 실험

c-Fos 최소 프로모터의 lacZ 유전자 다운스트림과 3개의 컨센서스(consensus) Tcf-결합 모티프를 포함하는 Tcf-리포터 구성을 이루었다. Tcf 모티프와의 β-카테닌/Tcf 복합체 결합시, lacZ 발현이 활성화된다. Tcf 마우스의 상처남김은 전술한 대로 진피 생검펀치(미국 펜실베이니아주 요크 소재의 Miltex Instrument Company 제품)를 사용하여 직경 4㎜의 전층 피부상처 2개를 생성시켰다. 상처입은 Tcf 마우스는 2개 연구군: 매일 염수를 복강내주사받은 대조군과; 매일 체중㎏당 네포팜 40㎎을 복강내주사받은 네포팜군으로 분리하였다. 상처남김 후 14일째에 상처크기를 검사하였고, 상처조직은 RNA 및 단백질 추출용으로 수집하여 조직학적 실험을 위하여 고정시켰다.

인간 AF 종양과 정상 근막 조직 샘플

인간의 공격성 섬유종증 종양 샘플은 본 출원인(캐나다 토론토 소재의 "the Hospital for Sick Children")의 수술시 얻었다. 동일환자의 종양조직과 정상 근막 주변조직은 수술절단 직후 수거하여 처리하였다. 조직은 저온보존하여(cryopreserved) 액체 질소 증기 중에 저장하였다.

세포 배양 연구

1차 세포배양물은 인간 AF종양과 정상 근막조직 샘플로부터 확정하였다. 단층배양물은 10% 소 태아혈청이 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 배양하였고 5% C0₂ 중에서 37℃로 유지시켰다. 첫 번째 수행(passage)과 다섯째 수행 사이에 지류와 실험을 수행하였을 때 세포가 분열하였다. 실험연구에 앞서, 세포를 밤새 시딩(seeding)하여 익일(제0일)에 치료개시하였는데, 이때 세포는 DMEM 배지 중에 준비해둔 250㎛ 네포팜의 존재 또는 부재 하에 비히클 0.1% DMSO(대조군)로 치료하였다.

세포생존성 분석, 증식 분석 및 세포사멸( apoptosis ) 분석

세포생존성 측정은 트리판 블루 염료 배제법을 이용하여 수행하였다. 세포는 1:1 비의 트리판 블루 염료로 염색하였으며, 생세포(투명)와 사세포(청색) 둘다를 계수하였다. 증식측정은 5-브로모-2-데옥시-우리딘(BrdU) 혼입(Incorporation) 분석을 이용하였다. 12 시간 BrdU 배양 후, BrdU가 혼입된 세포 동정은 알칼리성 포스파타제에 콘쥬게이팅된 안티-마우스 말 항체와 모노클론 안티-BrdU 토끼 항체를 사용하였다. BrdU 존재의 검출은 알칼리성 포스파타제 기질을 사용하였다. 전체 핵 중에서 양성으로 표지된 핵의 비율 분석은 10 고배율 시야(high-powered fields)로 수행하였다.

단백질 추출과 웨스턴블럿 분석

조직 샘플은 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 2회 세척하고 리포터 유전자 분석 용해 완충액(Roche 제품)으로 용해시켰다. 용해물은 5분 동안 16,000 x g로 원심분리하여 세포 파편을 제거한 후 계량은 비신코닌산(Bicinchoninic Acid: BCA) 단백질 분석(Pierce 社)을 이용하였다. 동량의 총 단백질을 SDS(sodium dodecyl sulfate)-폴리아크릴아미드 겔을 통해 전기영동으로 분리한 후 니트로셀룰로즈 막(Amersham 제품)으로 이동시킨 다음 4℃에서 포스포GSK3β(Ser 9, 토끼 폴리클론, New England Biolabs), β-카테닌(마우스 모노클론, Upstate Biotechnology), 총 GSK3β(마우스 모노클론, Transduction Laboratories) 및 GAPDH(마우스 모노클론, Upstate Biotechnology)에 대한 1차 항체로 밤새 면역블러팅(i㎜unoblotting)하였다. 하이브리드화 검출에는 호스래디시 퍼옥시다제(HRP: horseradish peroxidase)-태깅된 2차 항체 및 고급 케미루미네센스(Enhanced ChemiLuminescence: Amersham 제품)를 사용하였다. 밀도측정은 알파이즈(AlphaEase)FC 소프트웨어(Alpha Innotech 제품)를 사용하였다. 웨스턴블러팅은 재현성 보장을 위해 3중으로 수행하였다.

통계 분석

통계분석 데이터는 평균치±95%의 신뢰간격으로 표시한다. 모든 연구는 재현성 보장을 위해 적어도 3중으로 수행하였다.

실시예 1: 과형성 상처에서 네포팜 치료에 의한 세포생존성 저하

본 실시예에서는 2개 기준: 1) β-카테닌 활성화를 나타내는 과형성 상처로부터 얻은 섬유아세포의 세포생존성을 억제하고; 2) 정상적인 진피 섬유아세포 배양물에 대한 영향이 거의 없음을 충족시키는 화합물들을 동정하기 위하여 스크리닝하였다. 본 스크린닝의 생물학적 연관성은 상당했는데, 그 이유는 스크리닝에 사용되는 세포가 과형성 상처뿐만 아니라 건강한 조직도 갖는 환자들로부터 얻었기 때문이다. 본 실험은 96개 웰 플레이트 내에서 3중으로 반복하였고, 이때 웰은 본 발명의 화합물 또는 대조군으로서의 DMSO를 각각 0.1μM, 1.0μM 또는 10μM씩 치료한 4,000개 세포를 포함하였다. 세포생존성 측정은 술포로다민(Sulforhodamine) B(SRB) 분석을 이용하였다. 초기 스크리닝에서 검출된 화합물은 보다 큰 샘플 풀을 사용하여 추가 시험하였고, 이때 이로부터 네포팜을 동정하였다(참조: 도 1a).

네포팜군 또는 대조군의 과형성 흉터-유래 세포배양물에서의 β-카테닌 수치분석은 웨스턴블럿 분석을 이용하였다. 네포팜은 과형성 상처-유래 세포배양물에서의 β-카테닌의 단백질 수치를 실질적으로 저하시키는 것으로 관찰되었다(참조: 도 1b). GAPDH 발현은 하중 대조군으로서 포함시켰다.

실시예 2: Apc / Apcl638N 마우스에서 네포팜에 의한 AF 종양개수 감소

본 실시예에서는 네포팜 치료군이 생체내에서 표현형 AF병변을 조절가능한지 조사하였다. 생후 6월령 Apc / Apcl638N 마우스 수컷에서 네포팜 치료군에 형성된 AF종양 개수(8.18±1.77)는 0.1% DMSO-치료군(12.09±1.31) 또는 0.1% DMSO-비치료군(13.2±2.30)에서보다 유의하게 감소되었다(p<0.03)(참조: 도 2). 상향 위장관에서의 상피-유도된 폴립 개수는 유의한 차이가 없었다(참조: 도 2). 이러한 결과는 네포팜이 종양 개시를 억제할 뿐만 아니라, 간엽세포에 대한 특이성도 보여준다는 것이다.

실시예 3: 인간 AF 종양세포에서 네포팜에 의한 β- 카테닌 수치저하

AF종양은 β-카테닌 수치 상승을 특징으로 한다. 본 실시예에서는 네포팜이 β-카테닌 수치를 조절할 수 있는 성능을 보유하는지 검사하기 위하여 다수의 인간 AF종양-유도된 1차세포배양물을 연구하였다. 총 β-카테닌에 대한 항체를 사용하는 웨스턴블럿 분석결과, 5일 동안 치료한 네포팜군에서 총 β-카테닌과 일치하는 크기 92kDa의 단백질 양을 현저히 감소시켰다(참조: 도 3a). 인간 AF종양 세포배양물에서의 총 β-카테닌 수치를 밀도측정 분석한 결과, 네포팜 치료군이 0.1% DMSO 치료군보다 약 5배나 저하하였다(참조: 도 3b). 액틴 발현은 용해물 하중 대조군으로서 측정하였다.

실시예 4: 인간 AF 종양세포에서 네포팜에 의한 세포생존성 저하와 세포증식 저하

본 실시예에서는 네포팜이 AF 세포거동을 개질할 수 있는지 측정하기 위하여 다수의 인간 AF종양-유도된 1차 세포배양물을 연구하였다. 일단, 인간 AF종양에서의 세포생존성에 대한 네포팜 효과를 연구하였다. 인간 AF종양 세포배양물에서 생세포 개수는 네포팜 치료군이 0.1% DMSO 치료군보다 유의하게 적었다(p<0.05). 종양에 대한 네포팜 치료의 결과로서 계수된 사세포 개수는 유의한 차이가 없었다(p<0.05)(참조: 도 4a).

β-카테닌 수치가 간엽세포의 증식률 조절에 관여한다는 시연후, 1차세포배양물에서의 증식에 대한 네포팜 효과를 조사하였다. 총 DAPI+세포와 비교한 BrdU+/DAPI+세포의 증식률(%) 측정은 BrdU 혼입 분석을 이용하였다. BrdU 혼입에 의해 측정된 네포팜-치료된 인간 AF종양군에 포함된 증식세포는 대조군에서보다 유의하게 적었다(p<0.05)(참조: 도 4b).

상기 두 결과로써, 네포팜은 증식률을 저하시킴으로써 생존가능한 AF세포 개수를 우선적으로 억제한다는 것이 밝혀졌다.

실시예 5: 인간 1차섬유아세포 배양물에서 네포팜에 의한 β- 카테닌 수치저하

과형성 상처는 증식기 동안 높아진 β-카테닌 수치를 특징으로 한다. 본원에 기술한 데이터는 네포팜이 특히 간엽-유도 세포에서의 β-카테닌 수치를 조절할 수 있는 성능을 보유하는 것으로 보여준다. 네포팜이 간엽세포에서의 β-카테닌 수치를 조절할 수 있는지 확인하기 위하여, 불멸화(i㎜ortalized) 인간 섬유아세포를 네포팜으로 치료하였다(참조: 도 5a). 1차 인간 섬유아세포 배양물에서의 총 β-카테닌 수치를 밀도측정 분석으로 측정한 결과, 네포팜 치료군(2)은 0.1% DMSO 치료군(1)보다 약 4배 저하되었다(p<0.05)(참조: 도 5b). 본 실험에는 추가의 대조군으로서 (β-카테닌 발현을 증가시키는 것으로 공지된) 세포의 Wnt3a 치료군(3)과 Wnt3a 치료한 세포에 대한 네포팜 효과군(4)을 포함시켰다.

실시예 6: Tcf 마우스에서 네포팜 전신투여에 의한 B- 카테닌 수치저하와 상처크기 감소

본 실시예에서는 상처 치유기간 동안의 β-카테닌 수치에 대한 네포팜 효과를 시험하기 위하여 Tcf 마우스의 상처조직을 연구하였다. 피부 상처남김은 생검 펀치 절차를 이용하여 직경 4㎜의 원형 전층 상처를 발생시켰다. 규모단위는 ㎜이다. 상처남김 후 14일째의 Tcf 마우스-유도된 상처에서 배양된 세포에서의 β-카테닌 수치는 총 β-카테닌에 대한 항체를 사용하는 웨스턴블럿 결과, 네포팜 치료군이 대조군보다 저하되었다(참조: 도 6a).

또한, 마우스 상처남김 후 14일째 상처를 부검한 결과, 흉터직경은 네포팜 치료군이 담체(염수) 치료군(대조군)보다 유의하게 작았다(별표는 유의한 차이를 나타냄, p<0.001)(참조: 도 6b).

실시예 7: TGF -β-유도된 마우스 과형성 흉터에서 네포팜 전신투여에 의한 흉터크기 감소

β-카테닌 단백질 수치는 미상처군 조직에 비해, 초기의 상처치유단계 동안 상승한 다음 말기단계를 통해 하강하는 것으로 공지되어 있다. β-카테닌 단백질 수치의 정상적인 상승과 하강은 높아진 β-카테닌 수치가 유의하게 연장되는 과형성 상처군의 치유 동안 해제된다(참조: 도 7).

약학 스크리닝 연구 후 네포팜 효과시험은 마우스를 사용하여 생체내에서 수행하였다. 경구와 복강내 투여(1일 체중㎏당 40㎎) 경로 둘다를 평가하였다(대조군: 0.1% DMSO). 두 투여경로에서의 네포팜 확인은 HPLC를 사용하여 혈청에서 검출하였다(데이터는 표시하지 않았음). 피부에 4㎜ 펀치 전층 상처를 남긴 후 네포팜군 또는 대조군에게 매일 투여하였다. 네포팜이 과형성 흉터치료에 효과적인지를 측정하기 위하여, 상처남김 이전에 마우스에게 TGF-®를 주사하여 과형성 흉터를 유도하는 마우스 과형성 흉터 모델을 이용하였다. 중요하게는, 상기한 바와 동일한 처방의 결과, 흉터크기는 네포팜 치료군이 TGF-® 비치료 대조군보다 작았다(참조: 도 8). 따라서 네포팜은 과형성 상처군과 정상 상처군 둘다의 회복단계에서 흉터크기를 감소시킬 수 있다.

실시예 8: 다양한 네포팜 국소전달용 담체

피부상처의 경우, 이상적인 제품은 네포팜 국소제형이다. 3가지 담체: 카르복시메틸셀룰로즈(CMC), 페트롤라툼 및 하이프로멜로즈를 사용하는 네포팜 국소 제형을 제조하여 평가하였다. 상기 3가지 담체는 생체내에서 시험하여, 피부를 통한 네포팜 전달에 효과적인 제형을 결정하였다. 이들 결과를 도 9에 도시하고 있다.

실시예 9: 마우스의 정상 흉터에서 네포팜 국소제형에 의한 크기 감소

피부상처는 Tcf 마우스에서, 전술한 생검 펀치 절차를 이용하여 형성시켰다. 1% 네포팜 크림군 또는 담체 단독 크림 대조군에서 직경 6㎜의 전층 펀치 상처를 최대 21일 동안 매일 2회 국소치료하였다. 네포팜 치료군의 흉터크기는 대조군보다 약 ⅓이 감소되었다. 하기 <표 1>은 마우스 모델에서 페트롤라툼 담체에 제형된 1% 네포팜 크림군 또는 담체 단독 크림 대조군의 0일째의 정상 상처의 평균 크기와 0일 이후 매일 국소투여한 21일째의 정상 상처의 평균 크기를 나타낸다(㎜ 단위임). 각군당 4개 상처에 대한 평균치를 제공한다.

		0일째	21일째
담체 단독 크림 대조군	상처의 평균 크기(㎜)	6	3.116666667
1% 네포팜 크림 치료군	상처의 평균 크기(㎜)	6	2.02

Tcf 마우스에서 직경 4㎜의 펀치 상처를 형성시킨 후 1% 네포팜 크림군 또는 담체 단독 크림 대조군에게 14일 동안 매일 2회 국소치료하였다. 치료 14일후에 형성된 흉터의 표면적 측정은 임의단위로 수행하였고, 이때 100 임의단위란 담체 단독 크림 치료 대조군을 나타낸다. 치료군 각각에 대해 상처 10개를 측정하였고, 데이터는 평균값과 표준편차로 나타내었다. 네포팜 치료군 마우스의 흉터크기는 대조군보다 유의하게 작았고(p<0.05), 이때 대조군이란 0% 네포팜이다(참조: 도 10).

본 발명은 설명한 양태 및 실시예를 참조하여 기술하고 있지만 본 명세서를 이들로 제한하려는 의도는 아니다. 따라서 당업계의 숙련가들에게는 본 명세서를 참조하여 상기에 설명한 양태를 다양하게 변경할 수 있을 뿐만 아니라 본 발명의 기타 양태도 명백할 것이다. 따라서 하기의 특허청구범위는 그러한 변경 또는 양태를 모두 망라할 것임을 숙고하고 있다. 또한, 특허청구범위는 모두 이로써 바람직한 양태의 기재에 참조로서 통합된다.

각각의 개별 출판물, 특허 또는 특허출원이 그 전체를 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되도록 표시하였듯이, 본원에서 언급한 모든 출판물, 특허 및 특허출원은 그 전체를 동일한 범위까지 참조로 통합한다.

Claims (22)

1. 네포팜, 또는 그의 기능상 등가의 아날로그, 프로드러그, 염 및 용매화물 중에서 선택된 네포팜 화합물을 β-카테닌-매개된 질환 포유동물에게 투여하는 것을 특징으로 하여, 포유동물의 β-카테닌-매개된 질환을 치료하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 β-카테닌-매개된 질환은 섬유상증식 질환 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 상기 섬유상증식 질환은 비후성 흉터, 과형성 흉터, 켈로이드성 흉터, 공격성 섬유종증, 간섬유증, 폐섬유증, 신장섬유증, 사구체 경화증, 족저건막 섬유종증(Lederhose disease) 및 수장근막 구축(Dupuytren's contracture, DC)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 β-카테닌-매개된 질환은 흉터 형성임을 특징으로 하는 방법.
5. 제 2항에 있어서, 상기 암은 결장암, 흑색증, 간세포암, 난소암, 자궁내막암, 수모세포종, 모기질세포종 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1항에 있어서, 상기 네포팜 화합물은 약제학적으로 허용가능한 보조제와 혼합하여 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1항에 있어서, 상기 네포팜 화합물은 추가의 치료제와 함께 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1항에 있어서, 상기 네포팜 화합물은 국소투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 8항에 있어서, 상기 네포팜 화합물은 표적부위 도포용 생체적합성 매트릭스에 도포되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 9항에 있어서, 상기 생체적합성 매트릭스는 드레싱(dressage), 붕대, 임플란트 및 고분자 매트릭스로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1항에 있어서, 상기 네포팜 화합물은 복용량 0.0001 내지 100㎎ 범위로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 네포팜, 또는 그의 기능상 등가의 아날로그, 염, 용매화물 및 프로드러그 중에서 선택된 네포팜 화합물을 포함하는 조성물과 포장재(packaging)를 포함하여 제조된 제품에 있어서, 상기 포장재는 상기 조성물이 β-카테닌-매개된 질환 치료에 유용하다는 지시문임을 특징으로 하는 제품.
13. 제 12항에 있어서, 상기 β-카테닌-매개된 질환은 섬유상증식 질환 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 제품.
14. 제 12항에 있어서, 상기 조성물은 추가의 치료제를 함유하는 것을 특징으로 하는 제품.
15. 제 12항에 있어서, 상기 조성물은 국소투여에 적합한 것임을 특징으로 하는 제품.
16. 제 12항에 있어서, 상기 조성물은 생체적합성 매트릭스에 도포된 네포팜 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 제품.
17. β-카테닌-매개된 질환 치료용 약제 제조를 위한 네포팜, 또는 그의 기능상 등가의 아날로그, 염, 용매화물 또는 프로드러그의 용도.
18. 치료유효량의 네포팜, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 아날로그, 염, 용매화물 또는 프로드러그를 흉터조직에 투여하는 것을 특징으로 하여 흉터조직을 치료하거나 또는 흉터조직 형성을 감소시키는 방법.
19. 제 18항에 있어서, 상기 흉터조직은 섬유종증, 켈로이드성 질환 또는 비후성 질환과 관련있는 것임을 특징으로 하는 방법.
20. 제 18항에 있어서, 상기 흉터조직은 양이 감소되거나 외관이 개선되는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제 18항에 있어서, 상기 흉터는 과형성 흉터, 수술 자국 및 화상 자국으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
22. 치료유효량의 네포팜, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 아날로그, 염, 용매화물 또는 프로드러그를 β-카테닌 수치 조절이 필요한 포유동물에게 투여하는 것을 특징으로 하여 포유동물의 β-카테닌 수치 조절하는 방법.
    

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