TWI759633B - 突變角質細胞活性及預防皮膚癌化之薄荷精油 - Google Patents

Abstract

本發明係關於癌症治療及預防之領域。特定言之，本發明指示用於抑制HRAS^Q61L 突變角質細胞活性及預防皮膚癌化之精油及組合物或BRAF抑制劑，一種類型之抗癌藥物誘導皮膚副作用。

Description

抑制HRASQ61L突變角質細胞活性及預防皮膚癌化之薄荷精油

本發明係關於癌症治療及預防之領域。特定言之，本發明指示用於抑制HRAS ^Q61L 突變角質細胞活性及預防皮膚癌化之精油及組合物。

皮膚為人體最大之器官。其包含兩個主要層，表皮及真皮層。皮膚癌係常見類型之癌症，尤其在高加索人中。皮膚癌分成黑素瘤及非黑素瘤皮膚癌(NMSC)，非黑素瘤皮膚癌包括基底細胞癌(BCC)及鱗狀細胞癌(SCC)。在皮膚癌類型中，最惡性的為主要由強烈UV暴露引起之黑素瘤，尤其是在攜帶特異性基因突變之人群中。

黑素之主要功能為保護細胞免於紫外線損傷。由黑素細胞產生之黑素轉移至角質細胞且移動至皮膚表面以呈現皮膚顏色。在黑素細胞中，酪胺酸酶，一種氧化酶，利用酪胺酸作為受質以產生稱為真黑素之深棕色色素或稱為假黑素之金紅色色素。黑素之數量呈現皮膚顏色；然而，過量黑素將引起各種皮膚病，包括雀斑、老年斑及其他色素過多症候群。NMSC為人類中最普遍類型之癌症。BCC出現在皮膚之基底細胞中， 該等基底細胞沿表皮之最深層分佈。BCC之個體風險因素包括年齡、性別、紫外線暴露、免疫抑止、遺傳疾病及皮膚類型。SCC發源於皮膚最外層中之角質細胞中，且與BCC相比更加可能擴散至遠端區域。SCC之風險因素包括UV光暴露、免疫抑止、慢性炎症、砷暴露、基因改變、抽菸、病毒感染及特定藥物治療(A.C.Green及C.M.Olsen.,Cutaneous squamous cell carcinoma：An epidemiological review.British Journal Dermatology,2017.177(2)：第373-381頁)。

在一個態樣中，本發明提供一種抑制HRAS ^Q61L 突變角質細胞活性或治療及/或預防皮膚癌化之方法，其包含向皮膚局部施用包含一或多種來自水薄荷(M.aquatica)之精油的精油組合物，或包含檸檬烯及香芹酮及視情況選用之一或多種來自水薄荷之精油的組合物。

在一個實施例中，水薄荷為水薄荷品種墾丁水薄荷(M.aquatica var.Kenting Water Mint)或水薄荷品種檸檬萊姆薄荷(M.aquatica var.citrata Lime Mint)。

在一些實施例中，精油組合物以約0.1毫克至約10毫克/部位範圍內之量局部施用。在一個實施例中，精油組合物以約5毫克/部位之量局部施用。在一些實施例中，精油組合物以如下範圍內之量局部施用：約0.5毫克至約10毫克/部位、約1毫克至約10毫克/部位、約3毫克至約10毫克/部位、約5毫克至約10毫克/部位、約7毫克至約10毫克/部位、約0.1毫克至約8毫克/部位、約0.1毫克至約6毫克/部位、約0.1毫克至約4毫克/部位、約0.1毫克至約2毫克/部位、約1毫克至約10毫克/部位、約1毫克至約8毫克/部位、約1毫克至約6毫克/部位、約1毫克至約4毫克/部位、約2 毫克至約10毫克/部位、約2毫克至約8毫克/部位、約2毫克至約6毫克/部位、約4毫克至約10毫克/部位、約4毫克至約8毫克/部位、約6毫克至約10毫克/部位或約8毫克至約10毫克/部位。

在一些實施例中，組合物包含約5%(w/w)至約70%(w/w)之檸檬烯及約0.5%(w/w)至約50%(w/w)之香芹酮。在一些實施例中，檸檬烯之量在以下範圍內：約5%(w/w)至約60%(w/w)、約5%(w/w)至約50%(w/w)、約5%(w/w)至約40%(w/w)、約5%(w/w)至約30%(w/w)、約5%(w/w)至約20%(w/w)、約5%(w/w)至約10%(w/w)、約10%(w/w)至約70%(w/w)、約10%(w/w)至約60%(w/w)、約10%(w/w)至約50%(w/w)、約10%(w/w)至約40%(w/w)、約10%(w/w)至約30%(w/w)、約10%(w/w)至約20%(w/w)、約20%(w/w)至約70%(w/w)、約20%(w/w)至約60%(w/w)、約20%(w/w)至約50%(w/w)、約20%(w/w)至約40%(w/w)、約20%(w/w)至約30%(w/w)、約30%(w/w)至約70%(w/w)、約30%(w/w)至約60%(w/w)、約30%(w/w)至約50%(w/w)、約30%(w/w)至約40%(w/w)、約40%(w/w)至約70%(w/w)、約40%(w/w)至約60%(w/w)、約40%(w/w)至約50%(w/w)、約50%(w/w)至約70%(w/w)或約60%(w/w)至約70%(w/w)。在一些實施例中，香芹酮之量在以下範圍內：約0.5%(w/w)至約40%(w/w)之香芹酮、約0.5%(w/w)至約30%(w/w)之香芹酮、約0.5%(w/w)至約20%(w/w)之香芹酮、約0.5%(w/w)至約10%(w/w)之香芹酮、約0.5%(w/w)至約5%(w/w)之香芹酮、約1%(w/w)至約50%(w/w)之香芹酮、約1%(w/w)至約40%(w/w)之香芹酮、約1%(w/w)至約30%(w/w)之香芹酮、約1%(w/w)至約20%(w/w)之香芹酮、約1%(w/w)至約10%(w/w)之香芹酮、約5%(w/w)至約50%(w/w)、 約5%(w/w)至約40%(w/w)、約5%(w/w)至約30%(w/w)、約5%(w/w)至約20%(w/w)、約5%(w/w)至約10%(w/w)、約10%(w/w)至約50%(w/w)、約10%(w/w)至約40%(w/w)、約10%(w/w)至約30%(w/w)、約10%(w/w)至約20%(w/w)、約20%(w/w)至約50%(w/w)、約20%(w/w)至約40%(w/w)或約20%(w/w)至約30%(w/w)。在一個實施例中，組合物來自水薄荷品種檸檬萊姆薄荷精油。在另一實施例中，組合物包含約42.19%(w/w)之檸檬烯及約16.02%(w/w)之香芹酮。

在一些實施例中，精油組合物包含來自水薄荷品種墾丁水薄荷之精油及來自水薄荷品種檸檬萊姆薄荷之精油。

在一個實施例中，皮膚癌化為黑素瘤、基底細胞癌(BCC)、鱗狀細胞癌(SCC)或角化棘皮瘤(KA)之發生。在另一實施例中，鱗狀細胞癌係由PLX誘導。

在一個實施例中，皮膚癌化為兩階段皮膚癌化。在另一實施例中，皮膚癌化為藥物促進之兩階段皮膚癌化。在另一實施例中，藥物為BRAF抑制劑。在另外的實施例中，藥物為維羅非尼(vemurafenib)(PLX4032)、7,12-二甲基苯并[a]蒽(DMBA)或12-O-十四烷醯基佛波醇-13-乙酸酯(TPA)，其引起皮膚乳頭狀瘤之形成。

在一個實施例中，精油組合物或組合物可預防兩階段皮膚癌化。

在一個實施例中，精油組合物或組合物展現針對HRAS ^Q61L 角質細胞之顯著抗增殖作用。

在一個實施例中，精油組合物或組合物誘導G₂/M細胞週期停滯及細胞凋亡。

在一個實施例中，精油組合物或組合物抑制HRAS ^Q61L 角質細胞之遷移及侵襲能力。

在一個實施例中，精油組合物或組合物抑制乳頭狀瘤形成。

在一個實施例中，精油組合物或組合物削弱MAPK信號傳導之再活化。

在另一態樣中，本發明提供一種包含一或多種來自水薄荷之精油的精油組合物。

在一個態樣中，本發明提供一種增白皮膚或減少皮膚色素沉著之方法，其包含向皮膚局部施用包含一或多種來自水薄荷之精油的精油組合物，或包含檸檬烯及香芹酮及視情況選用之一或多種來自水薄荷之精油的組合物。

在另一態樣中，本發明提供一種包含檸檬烯及香芹酮及視情況選用之一或多種來自水薄荷之精油的組合物。

在一些實施例中，精油組合物或組合物可進一步包含一或多種額外皮膚病學上可接受之賦形劑。例示性額外皮膚病學上可接受之賦形劑包括(但不限於)pH值調節劑、螯合劑、防腐劑、共溶劑、滲透增強劑、保濕劑、增稠劑或膠凝劑或黏度建構劑、芳香劑、著色劑及其混合物。

圖1(A)及(B)展示薄荷精油及化合物組合對PDV細胞之細胞存活率之作用。(A)用濃度在0至100μg/mL範圍內之兩種薄荷物種之精油處理PDV細胞24小時。藉由MTT分析法測定細胞存活率。(B)用在0至 100μg/mL範圍內之不同濃度下的檸檬烯及香芹酮、水薄荷品種檸檬萊姆薄荷精油之主要化合物共處理PDV細胞。藉由MTT分析法偵測細胞存活率。媒劑對照組獲自用0.5% DMSO處理之細胞。資料代表三個獨立實驗且表示為平均值±SD。

圖2展示薄荷精油在存在或不存在PLX4032之情況下對PDV細胞之群落形成能力之作用。PDV細胞以250個細胞/孔之密度一式三份地接種於24孔盤中且用指示濃度之薄荷精油或化合物單獨處理或與0.5μM PLX4032一起共處理6天。固定之後，活細胞用0.1%結晶紫染色30分鐘。將結晶紫溶解於20%乙酸中且在OD₅₉₅nm下偵測吸光度。媒劑對照組獲自用0.5% DMSO處理之細胞。資料代表三個獨立實驗且表示為平均值±SD。V：媒劑，AZD：AZD6244(MEK抑制劑)0.5μM，P：PLX4032 0.5μM，KWM：墾丁水薄荷(Kenting Water Mint)，LM：萊姆薄荷(Lime Mint)，L+C：檸檬烯+香芹酮。

圖3藉由跨孔侵襲分析法(transwell invasion assay)展示薄荷精油在具有或不具有PLX4032刺激之情況下對PDV細胞之細胞侵襲能力之作用。用2μM PLX4032及/或指示濃度之薄荷精油或化合物處理PDV細胞(5×10⁴)24小時。基底側上之細胞用0.1%結晶紫染色。將用結晶紫染色之細胞溶解於20%乙酸中且藉由量測595nm下之吸光度來定量。媒劑對照組獲自用0.5% DMSO處理之細胞。資料代表三個獨立實驗且表示為平均值±SD。藉由使用Carl Zeiss Axiovert 200M顯微鏡(放大率：200倍)獲得影像。V：媒劑，P：PLX4032 2μM，KWM：墾丁水薄荷，LM：萊姆薄荷，L+C：檸檬烯+香芹酮。

圖4(A)及(B)藉由創傷癒合分析法展示薄荷精油在具有或 不具有PLX4032刺激之情況下對PDV細胞之細胞遷移能力之作用。(A)用薄荷精油或化合物處理PDV細胞且在0、6、12、24小時之後觀測。(B)用2μM PLX4032及薄荷精油或化合物共處理PDV細胞且在0、6、12、24小時之後觀測。藉由使用ImageJ定量遷移之細胞。媒劑對照組獲自用0.5% DMSO處理之細胞。資料代表三個獨立實驗且表示為平均值±SD。無共同字母之平均值不同，p<0.05。藉由使用Carl Zeiss Observer D1顯微鏡(放大率：200倍)獲得影像。V：媒劑，P：PLX4032 2μM，KWM：墾丁水薄荷50μg/mL，LM：萊姆薄荷50μg/mL，L+C：檸檬烯+香芹酮40μg/mL。

圖5(A)及(B)展示在具有或不具有PLX4032處理之情況下用薄荷精油或化合物處理的PDV細胞之DNA分佈分析及西方墨點法。(A)PDV細胞藉由與逐漸降低百分比之血清一起培育而同步。隨後，用0.5μM PLX4032及/或指示濃度之薄荷精油或化合物處理細胞12、24小時。將細胞用20μg/mL碘化丙錠染色30分鐘且藉由流式細胞計分析。計算子G₁、G₀/G₁、S及G₂/M期之DNA百分比。(B)PDV細胞經同步且用0.5μM PLX4032及/或指示濃度之薄荷精油或化合物投與24小時。收集細胞溶胞物且偵測p-cdc2及cdc2蛋白質。計算磷酸化蛋白質與原始蛋白質之比率。媒劑對照組獲自用0.5% DMSO處理之細胞。資料代表三個獨立實驗且表示為平均值±SD。V：媒劑，P：PLX4032 0.5μM，KWM：墾丁水薄荷75μg/mL，LM：萊姆薄荷75μg/mL，L+C：檸檬烯+香芹酮60μg/mL。

圖6(A)及(B)展示在具有或不具有PLX4032處理之情況下薄荷精油在PDV細胞中誘導細胞凋亡及對細胞凋亡標誌蛋白質表現之作用。(A)在存在或不存在0.5μM PLX4032之情況下用薄荷精油或化合物處 理PDV細胞。24小時後，用磷脂結合蛋白V及碘化丙錠將細胞共染色，且藉由流式細胞計偵測螢光表現。凋亡細胞之百分比包括磷脂結合蛋白V陽性/PI陰性及磷脂結合蛋白V陽性/PI陽性。媒劑對照組獲自用0.5% DMSO處理之細胞。(B)在具有或不具有0.5μM PLX4032及/或指示濃度之薄荷精油或化合物之情況下投與PDV細胞。6小時後，收集細胞溶胞物且偵測PARP及凋亡蛋白酶3蛋白質。媒劑對照組獲自用0.5% DMSO處理之細胞。資料代表三個獨立實驗且表示為平均值±SD。V：媒劑，P：PLX4032 0.5μM，KWM：墾丁水薄荷75μg/mL，LM：萊姆薄荷75μg/mL，L+C：檸檬烯+香芹酮60μg/mL。

圖7展示薄荷精油對反常MAPK活化相關蛋白質表現之作用。用0.5μM PLX4032及75μg/mL薄荷精油或60μg/mL化合物共處理PDV細胞6、12、24小時，且偵測MAPK信號傳導相關蛋白質之表現。媒劑對照組獲自用0.5% DMSO處理之細胞。V：媒劑，AZD：AZD6244(MEK抑制劑)0.5μM，P：PLX4032 0.5μM，KWM：墾丁水薄荷75μg/mL，LM：萊姆薄荷75μg/mL，L+C：檸檬烯+香芹酮60μg/mL。

圖8(A)及(B)展示薄荷精油對LPS刺激之RAW264.7巨噬細胞之NO抑制之作用。(A)水薄荷品種墾丁水薄荷(B)水薄荷品種檸檬萊姆薄荷。用濃度在0至100μg/mL範圍內之精油預處理細胞1小時，且接著與或不與0.1μg/mL LPS一起培育24小時。媒劑對照組獲自用0.5% DMSO處理之細胞。資料代表三個獨立實驗且表示為平均值±SD。

圖9(A)至(F)展示薄荷精油對回應於DMBA/TPA處理的乳頭狀瘤誘導之作用。(A)代表性影像展示第12週之結果。(B)在12週處理期間每週計算腫瘤發生率。(C)在12週處理期間記錄每隻小鼠之乳頭狀瘤之 平均數目。(D)點陣圖展示在第12週時每隻小鼠之腫瘤量。呈現每組乳頭狀瘤數目之中值。(E)每週量測小鼠體重。(F)在第12週處死小鼠之後記錄器官重量。器官指數藉由下式計算：器官指數=器官重量/體重。各組由8隻小鼠組成。資料呈現為平均值±SD。D：DMBA，T：TPA，KWM：墾丁水薄荷，LM：萊姆薄荷，L+C：檸檬烯+香芹酮。

圖10(A)至(F)展示薄荷精油對回應於DMBA/TPA/PLX4032處理的乳頭狀瘤誘導之作用。(A)代表性影像展示第12週之結果。(B)在12週處理期間每週計算腫瘤發生率。(C)在12週處理期間記錄每隻小鼠之乳頭狀瘤之平均數目。(D)點陣圖展示在第12週時每隻小鼠之腫瘤量。呈現每組乳頭狀瘤數目之中值。(E)每週量測小鼠體重。(F)在第12週處死小鼠之後記錄器官重量。器官指數藉由下式計算：器官指數=器官重量/體重。各組由8隻小鼠組成。資料呈現為平均值±SD。D：DMBA，T：TPA，P：PLX4032，KWM：墾丁水薄荷，LM：萊姆薄荷，L+C：檸檬烯+香芹酮。

圖11展示來自兩階段皮膚癌化模型之皮膚切片之組織學檢驗。用DMBA/TPA或DMBA/TPA/PLX4032及指示濃度之薄荷精油或化合物局部處理雌性FVB小鼠之背側皮膚。藉由蘇木精及曙紅之雙重染色偵測組織之形態。展示各組中八隻經處理小鼠中之代表性影像。藉由使用Carl Zeiss Axio Imager.Z1顯微鏡(放大率：200倍)獲得影像。D：DMBA，T：TPA，P：PLX4032，KWM：墾丁水薄荷，LM：萊姆薄荷，L+C：檸檬烯+香芹酮。

圖12展示薄荷精油及化合物對來自兩階段皮膚癌化的乳頭狀瘤之MAPK信號傳導的作用之免疫組織化學分析。用薄荷精油或化合物 處理來自在具有或不具有PLX4032加速之情況下之DMBA/TPA刺激小鼠之乳頭狀瘤，且在12週投藥後偵測到p-ERK之陽性表現。展示各組中八隻經處理小鼠中之代表性影像。藉由使用Carl Zeiss Axio Imager.Z1顯微鏡(放大率：200倍)獲得影像。

圖13(A)及(B)展示兩種薄荷精油對B16黑素瘤細胞之抗癌細胞活性。用指示濃度之LM-EO(A)或KWM-EO(B)處理B16細胞24小時，且藉由MTT分析法測定細胞存活率。

圖14(A)及(B)展示LM-EO及曲酸對B16黑素瘤細胞之脫色作用。用媒劑(0.5% DMSO)、15及25μg/mL LM-EO及100μg/mL KA處理B16細胞6、12、24小時。經處理細胞之相片(A)及在405nm下量測溶解於NaOH中之黑素之吸光度(B)。對具有相同處理之B16細胞之總細胞蛋白質進行西方墨點法。偵測酪胺酸酶之表現量。肌動蛋白用作內部對照組。

整個文獻意欲作為統一的揭示內容相關聯，且應理解，即使在此文獻的相同句子或段落或部分中沒有一起找到特徵組合，仍然涵蓋本文所述的特徵的所有組合。如下文說明性描述之本發明可在本文未特定揭示之任何一或多種元素、一或多種限制不存在之情況下合適地實踐。

除非另外指示，否則技術術語係根據其常見含義使用。若為某些術語賦予特定意義，則下文將在使用該等術語之情形下給出術語定義。

除非另外特定陳述，否則單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該」可指複數個物品。

術語「精油」係指自植物材料萃取之揮發性液體。精油通常為含有揮發性化合物之濃縮疏水性液體。此類油通常以微小液滴形式存在於植物細胞之間，且可藉由熟習此項技術者已知之若干方法(例如，蒸汽蒸餾、油萃法(亦即，藉由使用脂肪萃取)、浸解、溶劑萃取或機械按壓)萃取。當此等類型之油暴露於空氣時，其傾向於蒸發(亦即揮發性油)。精油不溶於水且可溶於醇、醚、不揮發性油(植物的)及其他有機溶劑中。

術語「抑制」或「降低」或此等術語之任何變化形式包括達成所要結果之任何可量測的降低或完全抑制。術語「促進」或「增加」或此等術語之任何變化形式包括達成所要結果之蛋白質或分子的任何可量測的增加或產生。

術語「有效量」為達成特定作用所必需的量，根據一般熟習此項技術者經由常規實驗能夠容易地測定該量。

術語「局部施用」意謂將組合物施用或擴散至嘴唇(lips)或角質組織之表面上。

術語「預防」或此術語之任何變化形式意謂減緩、停止或逆轉朝向結果的進展。預防可為朝向結果之進展的任何減緩。

術語「治療(treatment)」及「治療(treating)」涵蓋預防性，亦即防治性，或治療性，亦即治癒性及/或緩解性治療。因此術語「治療(treatment)」及「治療(treating)」包含治療性治療已發生該病狀(尤其呈明顯形式)之患者。治療性治療可為對症治療以便緩解特定適應症之症狀，或可為病因治療以便逆轉或部分逆轉適應症之病狀，或以便停止或減緩疾病進展。因此，本發明之化合物、組合物及方法可例如用作一段 時間內之治療性治療以及慢性療法。

術語「預防(prevention)」及「預防(preventing)」包含防治性治療，亦即治療處於發生上文提及之病狀之風險下的患者，由此降低該風險。

由BRAF抑制劑誘導之皮膚副作用之機制

BRAF(v-raf鼠類肉瘤病毒同系物B1)為RAF激酶家族調節之絲胺酸/蘇胺酸特異性信號轉導蛋白質激酶之成員，其涉及細胞分裂、分化及分泌。BRAF抑制劑維羅非尼係I型BRAF抑制劑，其藉由形成1-3個氫鍵而呈其活性構形與蛋白質激酶結合。已證明維羅非尼(亦稱為PLX4032)有益於BRAF ^V600E 突變黑素瘤患者之腫瘤反應率及整體存活率。PLX4032針對腫瘤之作用機制與抑制致癌有絲分裂原活化蛋白質激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)路徑(BRAF激酶之下游效應子)之磷酸化相關。

約20-30%經過PLX4032治療之患者中發展出鱗狀細胞癌(SCC)及角化棘皮瘤(KA)。在近期研究中，對接受投與BRAF抑制劑之患者出現的cuSCC及/或KA進行致癌突變之分析。其中，HRAS ^Q61L 為最普遍。因此，選擇HRAS ^Q61L 來進行臨床前機制研究(Fei Su,Amaya Viros,Carla Milagre，等人，RAS mutations in cutaneous squamous-cell carcinomas in patients treated with BRAF inhibitors.The New England Journal of Medicine,2012.366(3)：第207-215頁)。功能性研究已證明此等嚴重副作用係由反常MAPK活化引起。在用PLX4032治療期間觀測到攜帶致癌RAS突變或上游受體酪胺酸激酶活性之野生型BRAF細胞株之MAPK路徑的反常活化。該現象由RAS非依賴型RAF二聚作用驅動，如藉 由具有受損激酶活性之BRAF突變體仍可與CRAF二聚合且後續之RAS非依賴型MAPK信號傳導過度活化的觀測結果所證明(Fei Su,Amaya Viros,Carla Milagre，等人，RAS mutations in cutaneous squamous-cell carcinomas in patients treated with BRAF inhibitors.The New England Journal of Medicine,2012.366(3)：第207-215頁)。

兩階段皮膚癌化小鼠模型

多階段化學癌化之小鼠皮膚模型為用於理解皮膚鱗狀細胞癌之發展的活體內模型。癌化之兩階段機制在1947年由Berenblum及Shubik首次提出。誘癌物7,12-二甲基[a]蒽(DMBA)作為腫瘤引發劑之局部暴露在小鼠皮膚中引起HRAS ^Q61L 突變。腫瘤促進劑12-O-十四烷醯基-佛波醇-13-乙酸酯(TPA)之隨後局部處理接著引起病變之形成、KA及SCC之發生。化學誘導之兩階段皮膚癌化模型之優勢在於可明顯觀測到在整個生命過程中在小鼠背側皮膚中涉及引發及促進階段之腫瘤進展，且長期癌化測試之時段縮短(Erika L Abel,Joe M Angel,Kaoru Kiguchi，等人，Multi-stage chemical carcinogenesis in mouse skin：fundamentals and applications.Nature Protocols,2009.4(9)：第1350-1362頁)。先前研究證明，與BRAF抑制劑PLX4720一起投與DMBA/TPA之FVB小鼠展示病變出現之顯著加速、發生率之增加及增強進展為KA及SCC，與臨床中由BRAF抑制劑誘導之乳頭狀瘤類似(Fei Su,Amaya Viros,Carla Milagre，等人，RAS mutations in cutaneous squamous-cell carcinomas in patients treated with BRAF inhibitors.The New England Journal of Medicine,2012.366(3)：第207-215頁)。腫瘤發生不僅與癌細胞，且亦與基質、血管及浸潤性發炎元件之增殖及擴增相關。發炎之參與在癌症進展中起重要 作用。急性發炎反應被視為消除病原體之防禦反應；然而，發展成慢性發炎反應之急性發炎反應與腫瘤引發相關聯。贅生性生長與由外在或內在路徑引起之長期發炎性病狀有關。外在路徑與持續發炎性病狀相關。內在路徑係由引起致癌基因活化或腫瘤抑制基因不活化之基因轉化來刺激。具有改變之表型之細胞擴散發炎介體之分泌，因此觸發腫瘤微環境(TME)之形成及腫瘤之發生。

慢性發炎及腫瘤微環境

腫瘤微環境包含細胞外基質以及肌纖維母細胞及細胞作用物(cellular player)，諸如纖維母細胞、神經內分泌細胞、脂肪細胞、免疫細胞、骨髓衍生之發炎細胞、淋巴球及血液血管網路。已報導免疫發炎細胞在瘤形成早期階段具有關鍵作用。巨噬細胞已鑑別為各種腫瘤類型，諸如黑素瘤、肺癌、神經膠瘤、胃癌及創傷誘導之皮膚癌中惡性腫瘤之重要促成因素。呈現於實體腫瘤之微環境中之腫瘤相關巨噬細胞(TAM)取決於不同巨噬細胞極化分成兩種亞型：經典活化巨噬細胞(M1)及替代活化巨噬細胞(M2)。經歷藉由干擾素γ(IFNγ)與脂多醣(LPS)或腫瘤壞死因子(TNF)進行之經典活化之M1巨噬細胞具有促炎性及細胞毒性活性。另一方面，具有藉由介白素4(IL-4)進行之替代活化的M2巨噬細胞為抗發炎、免疫抑止性的且促進創傷癒合。回應於來自TME之信號，巨噬細胞展示顯著適應性且可分化成不同譜系之細胞。因此，受TME影響之巨噬細胞極化為研發癌症中新穎治療劑的極重要目標。

許多研究證明，薄荷物種之精油(EO)展示抗病毒、抗微生物、抗氧化、抗發炎及抗腫瘤活性。150μg/mL之西洋薄荷(Mentha piperita L.)EO展示針對金黃色葡萄球菌(S.aureus)之活體外抗微生物作 用及針對黑素瘤細胞(A375)及乳癌細胞(MDA-MD-231)之抗增殖活性(Ersilia Alexa,Corina Danciu,Isidora Radulov，等人，Phytochemical screening and biological activity of Mentha x piperita L.and Lavandula angustifolia Mill.extracts.Analytical Cellular Pathology 2018.2018)。西洋薄荷EO亦藉由肝損傷標記物、脂質過氧化及抗氧化能力的改善，證明在大鼠中具有針對肝毒性及CCL₄誘導之肝纖維化的保護作用(50mg/kg，腹膜內注射)。在另一文章中，胡椒薄荷(西洋薄荷)及巧克力薄荷(西洋薄荷)經證明具有針對大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌及綠膿桿菌(P.aeruginosa)之抗微生物活性、抗氧化特性、清除氧化氮(NO)自由基活性及抗發炎活性(Mei-Lin Tsai,Chin-Tung Wu,Tsen-Fang Lin，等人，Chemical composition and biological properties of essential oils of two mint species.Tropical Journal of Pharmaceutical Research,2013.12(4)：第577-582頁)。

本發明意外地發現薄荷精油具有癌症化學預防活性且可預防藥物誘導之皮膚副作用。本發明發現來自水薄荷品種墾丁水薄荷(指示為KWM-EO)及水薄荷品種檸檬萊姆薄荷(指示為LM-EO)的兩種精油，其針對具有HRAS ^Q61L 突變細胞株的角質細胞展現顯著抗增殖作用。亦評價存在於LM-EO中之兩種主要化合物，亦即檸檬烯及香芹酮之組合(指示為L+C)的生物活性。KWM-EO、LM-EO及L+C減少群落形成，且誘導G₂/M細胞週期停滯及細胞凋亡。本發明進一步研究EO及L+C組合治療兩者在兩階段皮膚癌化中之活體內生物功效。總體而言，本發明證明來自水薄荷品種墾丁水薄荷及水薄荷品種檸檬萊姆薄荷之精油，及亦具有預防由藥物誘導之皮膚副作用的巨大潛能的檸檬烯及香芹酮之組合的新穎癌症化 學預防作用。

因此，本發明提供一種抑制HRAS ^Q61L 突變角質細胞活性或治療及/或預防皮膚癌化之方法，其包含向皮膚局部施用包含一或多種來自水薄荷之精油的精油組合物，或包含檸檬烯及香芹酮及視情況選用之一或多種來自水薄荷之精油的組合物。

水薄荷(Mentha aquatica；water mint；Mentha hirsuta Huds)為薄荷家族唇形花科(Lamiaceae)中之常年開花植物。水薄荷品種墾丁水薄荷或水薄荷品種檸檬萊姆薄荷為本發明之較佳實施例。

用於本發明方法之精油組合物以約1毫克至10毫克/部位範圍內之量局部施用。在一個實施例中，精油組合物以約5毫克/部位之量局部施用。

在包含檸檬烯及香芹酮及視情況選用之一或多種來自水薄荷之精油的組合物中，使用約15%(w/w)至70%(w/w)之檸檬烯及約5%(w/w)至50%(w/w)之香芹酮。在一個實施例中，組合物來自水薄荷品種檸檬萊姆薄荷精油。在另一實施例中，組合物包含約42.19%(w/w)之檸檬烯及約16.02%(w/w)之香芹酮。

精油組合物包含來自水薄荷品種墾丁水薄荷之精油及來自水薄荷品種檸檬萊姆薄荷之精油。

皮膚癌化為黑素瘤、基底細胞癌(BCC)、鱗狀細胞癌(SCC)或角化棘皮瘤(KA)之發生。在另一實施例中，鱗狀細胞癌係由PLX誘導。皮膚癌化為兩階段皮膚癌化；特定言之，為藥物促進之兩階段皮膚癌化。在一實施例中，藥物為BRAF抑制劑，諸如維羅非尼(PLX4032)，其促進皮膚乳頭狀瘤之形成。

在一個實施例中，精油組合物或組合物可預防兩階段皮膚癌化。精油組合物或組合物展現針對HRAS ^Q61L 角質細胞之顯著抗增殖作用且誘導G₂/M細胞週期停滯及細胞凋亡。因此，精油組合物或組合物抑制HRAS ^Q61L 角質細胞之遷移性及侵襲能力且抑制乳頭狀瘤形成。

此外，精油組合物或組合物削弱MAPK信號傳導之再活化。

本發明亦發現水薄荷品種檸檬萊姆薄荷之精油具有脫色或抗黑素生成活性。因此，本發明提供一種用於增白皮膚或減少皮膚色素沉著之方法，其包含向皮膚局部施用包含一或多種來自水薄荷之精油的精油組合物，或包含檸檬烯及香芹酮及視情況選用之一或多種來自水薄荷之精油的組合物。

本發明進一步提供一種包含一或多種來自水薄荷之精油的精油組合物。此外，本發明提供一種包含檸檬烯及香芹酮及視情況選用之一或多種來自水薄荷之精油的組合物。

精油組合物或組合物可進一步包含一或多種額外皮膚病學上可接受之賦形劑。例示性額外皮膚病學上可接受之賦形劑包括(但不限於)pH值調節劑、螯合劑、防腐劑、共溶劑、滲透增強劑、保濕劑、增稠劑或膠凝劑或黏度建構劑、芳香劑、著色劑及其混合物。

精油組合物或組合物可進一步包含一或多種乳化劑。精油部分可與乳化劑及乾燥載劑組合，或替代地如上文所揭示可將精油部分與乳化劑及液體載劑組合以形成乳液。一或多種乳化劑可用於形成乳液。在一些實施例中，一或多種乳化劑可另外或替代地用作穩定劑。穩定劑可用於改變乳液之黏度。改變黏度可包括維持黏度、增加黏度或降低黏度。適 合乳化劑可為能夠實現臨界液滴大小之乳化劑。

在一實施例中，乳液為水包油乳液。在另一實施例中，乳液為油包水乳液。適合地，乳液可調配為乳霜。乳霜可為水包油乳霜或油包水乳霜。在一個特定實施例中，乳霜為水包油乳霜。在另一實施例中，乳液可調配為乳劑。乳劑可為水包油乳劑或油包水乳劑。

在一個實施例中，精油組合物或組合物為軟膏。在一個實施例中，其可為油性軟膏、可乳化軟膏基及乳液軟膏基及水溶性軟膏基。乳液軟膏基實際上為w/o及o/w類型之產物。其兩者均准許併入一些額外量之水，而不會使乳液軟膏基之稠度降低至低於柔軟乳霜之稠度。w/o乳液可用油來稀釋。軟膏亦可包含至少一種皮膚病學上可接受之賦形劑，諸如共溶劑、保濕劑、螯合劑、抗氧化劑、防腐劑、芳香劑、著色劑或滲透增強劑或其組合或混合物。

精油組合物或組合物可進一步包含膠凝劑。在一個實施例中，膠凝劑為兩種或更多種膠凝劑之混合物。例示性膠凝劑包括(但不限於)瓊脂、海藻酸酯、阿拉伯木聚糖、角叉菜膠、羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、纖維素、卡德蘭、明膠、結蘭膠、β-葡聚糖、黃蓍膠、瓜爾膠、阿拉伯膠、刺槐豆膠、果膠、澱粉、卡波姆、丙烯酸酯共聚物、矽石、三仙膠、其鹽或其組合或混合物。

熟習此項技術者將容易地顯而易見，在不脫離本文所揭示之實施例之範疇的情況下，可修改本文所描述之組合物及方法且可使用適合之等效物進行取代。現已詳細地描述某些實施例，參考以下實例將更清楚地理解該等實施例，該等實例僅出於說明之目的包括在內且不意欲為限制性的。

實例 材料及方法

化學品及試劑

二甲亞碸(DMSO)、(R)-(-)-香芹酮、溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四銼鹽(MTT)、脂多醣(LPS)、碘化丙錠(PI)、聚氧伸乙基辛基苯基醚(Triton X-100)、過氧化氫(H₂O₂)、放射性免疫沈澱分析法(RIPA)、Na₃VO₄、苯基甲磺醯基氟(PMSF)、過硫酸銨(APS)、TEMED、脫脂乳、7,12-二甲基苯并[a]蒽(DMBA)、12-O-十四烷醯基佛波醇-13-乙酸酯(TPA)、NaHCO₃、HEPE、結晶紫、甘油明膠、聚乙二醇300(PEG300)及聚山梨醇酯(Tween20)係購自Sigma-Aldrich Corporation(Missouri,United States)。(+)-檸檬烯及丙酮係購自Acros Organic(Belgium)。丙烯醯胺/bis溶液(30%)係購自Bio-Rad(California,United States)。Matrigel基質係購自BD Bioscience(California,United States)。司美替尼(Selumetinib)(AZD6244)及維羅非尼(PLX4032)係購自Medkoo Biosciences(North Carolina,United States)。達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)、抗生素混合物(青黴素/鏈黴素)、胰蛋白酶、普洛尼克(pluronic)F68、4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)係購自Invitrogen(Massachusetts,United States)。胎牛血清(FBS)係購自GE Healthcare(Illinois,United States)。Griess試劑係購自Cayman Chemical(Michigan,United States)。牛血清白蛋白(BSA)及甘胺酸係購自Alpha Bio-chemistry(Texas,United States)。RNase A、3,3'-二胺基聯苯胺四鹽酸鹽(DAB)及交叉吸附之山羊抗兔IgG(H+L)(goat anti-rabbit IgG(H+L)Cross-Adsorbed)係購自Thermo Fisher Scientific(Massachusetts,United States)。蘇木精及曙紅(H&E)、福馬林及二甲苯係購自MUTO Pure Chemicals(Tokyo,Japan)。通用免疫過氧化酶聚合物係購自Nichirei Bioscience(Tokyo,Japan)。石蠟係購自Leica Biosystems(Wetzlar,Germany)。PBS、TBS、Tris-甘胺酸SDS操作緩衝液(Tris-Glycine SDS Running Buffer)、西方轉移緩衝液(Western Transfer Buffer)、1M Tris pH 6.8及1.5M Tris pH 8.8係購自Omics Bio(Taipei,Taiwan)。

包括ERK 1、wee1、細胞週期素B1、cdc2 p34、p-cdc2 p34、PARP-1及細胞角蛋白14(K14)之初級抗體係購自Santa Cruz(Texas,United States)。包括磷酸-p44/42 MAPK(Erk1/2)、MEK1/2及磷酸-MEK1/2之抗體係購自Cell Signaling Technology(Massachusetts,United States)。包括ras及Ki67之抗體係購自Abcam(Cambridge,United Kingdom)。凋亡蛋白酶3抗體係購自GeneTex(Texas,United States)。

薄荷栽培及精油之蒸餾

水薄荷(唇形花科)之兩種品種，亦即水薄荷品種墾丁水薄荷及水薄荷品種檸檬萊姆薄荷在實驗田中栽培2年。收集成熟嫩芽且使其經受水蒸氣蒸餾以收集精油。用4公升水蒸餾來自各品種之兩公斤新鮮嫩芽。蒸發薄荷精油，使其通過冷凝器，隨後用分液漏斗收集油及水溶膠。在收集1公升水溶膠/精油之後，蒸餾結束。隨後分開地收集水溶膠及精油以用於以下實驗。薄荷精油在-20℃下儲存於密封小瓶中。活體外基於細胞之分析法中使用之精油用DMSO稀釋至不同濃度且活體內動物研究中使用之精油稀釋於丙酮中。

細胞株及細胞培養

具有HRAS ^Q61L 突變之PDV細胞係獲自CLS Cell Lines Service(Eppelheim,Germany)。RAW 264.7巨噬細胞係獲自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，Virginia,United States)。在37℃下在補充有10% FBS、含有100個單位/毫升青黴素及100μg/mL鏈黴素之DMEM中在潮濕5% CO₂培育箱中培養細胞。對於此研究，在10個繼代內使用細胞。

PDV細胞存活率之量測

細胞以5×10³個之密度接種在96孔盤中16小時且用EO或化合物處理24小時。根據Scudiero等人，藉由基於MTT之比色分析法測定細胞增殖。僅用媒劑(0.5% DMSO)處理之細胞之存活率定義為100%存活。使用下式計算在用EO或化合物處理之後細胞之存活率：細胞存活率(%)=[OD₅₇₀(經處理細胞)/OD₅₇₀(媒劑對照組)]×100。

RAW 264.7細胞中氧化氮產生之量測

將RAW 264.7細胞，一種鼠類巨噬細胞細胞株，以每孔2×10⁵個細胞之密度接種在96孔盤中1小時。用濃度在0至100μg/mL範圍內之EO預處理細胞1小時，且隨後與或不與1μg/mL LPS一起培育24小時。藉由Griess試劑(Cayman,United States)測定培養基中NO之穩定氧化最終產物，即亞硝酸根NO^2-的積聚。簡言之，使80μL上澄液與40μL Griess試劑R1及40μL Griess試劑R2於96孔盤中反應30分鐘，且使用ELISA讀取器在540nm下偵測吸光度。除亞硝酸根含量以外，亦藉由基於MTT之比色分析法來檢驗巨噬細胞之細胞存活率。NO抑制(%)={OD₅₄₀(LPS組)-[OD₅₄₀(EO處理組)-OD₅₄₀(空白組)]/OD₅₄₀(LPS組)}×100。

群落形成分析法

藉由使具有指示EO或化合物濃度之24孔盤中之250個細胞/孔之PDV細胞生長6天來形成群落。在第3天，更新培養基一次。細胞用冷卻甲醇固定且用0.1%結晶紫染色。用20%乙酸溶解保留結晶紫之細胞且藉由量測595nm下之吸光度來定量。將各處理中之相對群落形成百分比與媒劑對照組處理進行比較。

細胞侵襲分析法

細胞侵襲分析法藉由Millicell細胞培養小室(Millicell Cell Culture Inserts)(Merck Millipore,United States)進行。對於侵襲分析法，將100μL Matrigel(300μg/mL)施用於8-mm聚碳酸酯膜濾器且在37℃下培育2小時。將PDV細胞(5×10⁴)一式三份地接種至200μL無血清培養基中之塗佈Matrigel之過濾器16小時。設備之底部腔室含有具有10% FBS作為化學引誘劑之1mL培養基及指示濃度之EO或化合物。使細胞在37℃下遷移24小時。培育24小時之後，用棉拭子移除膜頂側上之未遷移細胞。膜之基底側上之遷移細胞用冷100%甲醇固定20分鐘且用PBS洗滌3次。將細胞用0.1%結晶紫染色，且隨後用PBS洗滌以移除額外染料溶液。使用逆相顯微鏡(Zeiss Axiovert 200M)捕捉影像。用20%乙酸溶解保留結晶紫之細胞且藉由量測595nm下之吸光度來定量。

創傷癒合分析法

創傷癒合分析法係藉由使用細胞培養小室(Culture-Insert)(ibidi GmbH,Germany)進行。在接種細胞之前，將細胞培養小室插入24孔盤中。PDV細胞以於70μL培養基中5×10⁵個細胞/毫升之密度接種於細胞培養小室中。在16小時之後，移除細胞培養小室，其產生兩個500±50 μm之無細胞間隙。藉由PBS洗掉未脫離之細胞，隨後將剩餘的附著之細胞浸沒於含有或沒有EO或化合物之1mL培養基中。每6小時使用逆相顯微鏡(Zeiss Observer D1)觀測細胞遷移。

細胞週期分析

將PDV細胞以1×10⁵個細胞/孔之密度接種在含10% FBS之各別培養基之6孔盤中16小時。為了使細胞週期同步，用PBS洗滌細胞且與含有5% FBS之新鮮培養基一起培育8小時，隨後用PBS洗滌且與含有0.5% FBS之新鮮培養基一起培育24小時。接著，在指示時間點，由細胞培養物與含有10% FBS及EO或化合物之培養基一起培育。收集黏附與漂浮細胞，用PBS洗滌且在4℃下用500μL冰冷70%乙醇固定一夜。在室溫及暗處下，用500μL碘化丙錠溶液(其含有20μg/mL PI、20μg/mL RAase A、0.1% Triton X-100)染色細胞30分鐘，接著藉由流式細胞計(Flow cytometry BD Accuri C6,United States)分析。

細胞凋亡分析法

細胞以1.5×10⁵個細胞/孔之密度接種在6孔盤中16小時，且用EO或化合物處理。24小時後，收集黏附與漂浮細胞且用PBS洗滌。根據製造商說明書，藉由使用FITC磷脂結合蛋白V細胞凋亡偵測套組(FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit)(BD Bioscience,United States)分析凋亡細胞。簡言之，由PDV細胞懸浮於500μL 1×磷脂結合蛋白V(Annexin V)結合緩衝液中，且在室溫及暗處下，使用FITC磷脂結合蛋白V及碘化丙錠共同染色15分鐘。藉由流式細胞計分析螢光結合細胞。FITC磷脂結合蛋白V及PI染色結果為(+/-)之細胞正經歷細胞凋亡。FITC磷脂結合蛋白V及PI染色結果為(+/+)之細胞係處於細胞凋亡末期、正經歷壞死或已經死 亡。

西方墨點分析

細胞用指示濃度下之EO或化合物處理且分解於RIPA分解緩衝液中。藉由DC蛋白質分析法(Bio-Rad,United States)量測蛋白質濃度。如Shyur等人所述進行西方墨點法。藉由10%或12% SDS-PAGE分離蛋白質樣品，且將其電轉移至PVDF膜(Merck Millipore,United States)上。膜在室溫下用含5%脫脂乳之TBST阻斷1小時。用TBST洗滌膜三次之後，在4℃下將膜與合適初級抗體一起培育隔夜(12-16小時)。用TBST將膜洗滌三次，隨後在室溫下與辣根過氧化酶(HRP)結合之抗小鼠IgG或抗兔IgG二級抗體一起培育2小時。反應蛋白條帶使用增強的化學發光偵測試劑(GE Healthcare,United States)可見且暴露於化學發光膜(chemiluminescence light film)(GE Healthcare,United States)。藉由ImageJ軟體(National Institutes of Health,United States)定量靶向蛋白質之表現量。

實驗動物

雌性FVB/NJNarl小鼠(3週齡)係購自國家實驗動物中心(the National Laboratory Animal Center)(Taipei,Taiwan)且在實驗動物核心設施(Agricultural Biotechnology Research Center,Academia Sinica,Taiwan)中育種。任意給與動物標準實驗室飲食及蒸餾水且在22±2℃及濕度55±5%下保持12小時亮/暗循環。使動物適應1週，隨後進行實驗。

兩階段皮膚癌化研究

此研究之實驗設計概述於方案1中。將雌性FVB/NJNarl小鼠(5-6週齡)隨機分為9組，各組含有8隻小鼠。在局部施用25μg於200μL 丙酮中之7,12-二甲基苯并[a]蒽(DMBA)之前三天，將小鼠背部毛髮刮去。引發腫瘤之後的第一週，將4μg於200μL丙酮中之12-O-十四烷醯基佛波醇-13-乙酸酯(TPA)一週兩次局部施用至刮過毛之背部皮膚持續12週。在TPA處理之後一天藉由局部施用來一週兩次用指示濃度之薄荷EO或化合物(於200μL丙酮中)處理小鼠持續12週。每週計數直徑大於1mm之腫瘤尺寸。在處死小鼠之後，收集內臟(心、肝、脾、肺及腎)、血清、皮膚及乳頭狀瘤且用10%福馬林固定或儲存在-80℃下。

組織病理學及免疫組織化學分析

在處死小鼠之後收集皮膚及乳頭狀瘤組織。隨後將組織用10%福馬林固定一週且包埋於石蠟中。以4μm厚度切割組織切片，隨後用100%二甲苯去除石蠟兩次，隨後在100%、75%、70%、50%下降乙醇浴中復水且用PBS最終洗滌。用合適pH抗原修復緩衝液煮沸經去除石蠟之切片且與3%過氧化氫酶一起培育5分鐘以減少非特異性染色。將於PBS中 含有10% BSA及0.4% Triton X-100的阻斷溶液添加至組織切片中持續1小時。將切片用合適稀釋倍數之所指示初級抗體在4℃下染色隔夜(12-16小時)。載片用通用免疫過氧化酶聚合物(Nichirei Bioscience,Japan)處理，且用3,3'-二胺基聯苯胺四鹽酸鹽(DAB)顯影過氧化酶偵測之部位。使用蘇木精溶液進行對比染色。用封固介質(Fisher Scientific,United States)封固載片以更長地儲存。使用立式顯微鏡(Carl Zeiss Axio Imager,Z1)觀測靶向蛋白質之表現。

MTT分析法

藉由基於MTT之比色分析法來分析水薄荷品種檸檬萊姆薄荷(LM-EO)及墾丁水薄荷精油(KWM-EO)之抗黑素瘤細胞增殖活性。鼠類黑素瘤B16細胞用LM-EO或KWM-EO處理24小時。僅用媒劑(0.5% DMSO)處理之細胞的存活率定義為100%存活率。使用下式計算在用化合物處理之後的活細胞：細胞存活率(%)=[OD₅₇₀(經處理之細胞培養物)/OD₅₇₀(媒劑對照組)]×100。

脫色分析法

B16細胞(1×10⁶個細胞/15-cm培養皿)用媒劑(0.5% DMSO)、15及25μg/mL LM-EO(LM15及LM25)或100μg/mL曲酸(KA100)處理6、12、24小時。在用PBS洗滌兩次之後，藉由細胞刮取器及離心收集細胞。隨後獲取細胞集結粒之相片，之後在60℃下溶解於1N NaOH中1小時。基於細胞群體調節用於溶解細胞集結粒之NaOH體積以得到相同濃度。接著在405nm下量測吸光度。

統計分析

所有資料表示為平均值±標準差(SD)。藉由預測分析套件 工作站(Predictive Analysis Suite Workstation)(PASW Statistics,United States)來進行統計分析，且藉由單因子變異數分析(ANOVA)來確定不同處理組之間的顯著差異。小於0.05之P值被視為統計學上顯著的。

實例1 對HRAS ^Q61L 突變PDV細胞之增殖之作用

PDV細胞株為攜帶HRAS ^Q61L 基因突變之DMBA轉化之小鼠皮膚鱗狀細胞癌(cuSCC)細胞株。HRAS ^Q61L 突變角質細胞通常在DMBA/TPA誘導之小鼠cuSCC中觀測到。選擇PDV細胞株以研究EO作用及反映兩階段皮膚癌化之潛在機制。兩種薄荷EO對PDV細胞存活率之作用係藉由基於MTT之比色分析法測定。圖1A中之資料展示水薄荷品種檸檬萊姆薄荷EO(指示為LM-EO)及水薄荷品種墾丁水薄荷EO(指示為KWM-EO)對PDV細胞增殖具有顯著抑制活性，其中在100μg/mL下具有29.4%及53.3%細胞存活率。

藉由GC×GC-TOF MS分析LM-EO及KWM-EO之化學概況(表1)。資料指示LM-EO中最豐富之化合物為檸檬烯(相對含量33.11%)及(-)-香芹酮(相對含量12.57%)。儘管如此，在KWM-EO中不存在含量超過25%之主要或主導化合物。因此並行研究檸檬烯及(-)-香芹酮化合物之組合生物活性。吾人使用在0至100μg/mL範圍內之LM-EO中約2.5：1之含量比率，研究組合之檸檬烯與(-)-香芹酮(指示為L+C)之抗PDV細胞存活率(圖1B)。在稱作LM-EO之低於100μg/mL之分析濃度下觀測到L+C之濃度依賴型細胞毒性。

實例2 薄荷精油抑制群落形成

利用群落形成分析法來評估具有KWM或LM之薄荷EO、L+C處理或與PLX4032一起共處理的單一PDV細胞生長為群落之能力。MEK抑制劑AZD6244作為陽性對照組並行測試。KWM-EO及LM-EO對抑制群落形成能力具有顯著作用，但L+C組合處理不具有作用(圖2)。同 時，PLX4032處理在處理六天之後顯著促進PDV細胞群落形成。由0.5μM PLX4032刺激之PDV細胞之群落形成能力由KWM-EO、LM-EO及L+C在測試濃度下削弱。來自萊姆薄荷之EO展示比KWM-EO之抑制活性更好的抑制活性。在存在或不存在PLX4032之情況下，0.5μM下之MEK抑制劑降低PDV細胞之細胞群落形成能力。

實例3 薄荷精油抑制PDV細胞之遷移及侵襲能力

細胞遷移為在晚期癌症之進展中起重要作用之高度整合及多步驟過程。細胞侵襲涉及細胞外基質降解及蛋白分解。在該研究中，在具有或不具有PLX4032刺激之情況下，使用創傷癒合分析法及跨孔侵襲分析法分別檢驗PDV細胞之遷移及侵襲能力。在侵襲分析法中，PLX4032促進PDV細胞之侵襲能力(圖3)。另外，在存在或不存在PLX4032之情況下，KWM-EO、LM-EO及L+C處理24小時以濃度依賴性方式減少受侵襲細胞。

在創傷癒合分析法中，在24小時處理下50μg/mL KWM-EO、50μg/mL LM-EO及40μg/mL L+C降低PDV細胞遷移能力，且LM-EO之作用優於其他的作用(圖4)。另一方面，2μM PLX4032處理在24小時處理內強烈促進PDV細胞之細胞遷移，KWM-EO、LM-EO及L+C組合，類似地EO兩者及僅化合物，顯著抑制PLX4032刺激之PDV細胞之遷移能力。

實例4 對PDV細胞之細胞週期機制之作用

吾人確定與或不與0.5μM PLX4032一起共處理之KWM-EO、LM-EO及L+C的組合對PDV細胞之細胞週期之分期的作用(圖5A)。相較於經媒劑處理之細胞，當細胞用75μg/mL KWM-EO處理12小時時， G₀/G₁期DNA自58.8%降至25.4%，而G₂/M期DNA自25.5%增加至40.0%，細胞凋亡子G₁ DNA自5.1%增加至30.1%。用75μg/mL LM-EO處理之PDV細胞中之G₀/G₁期DNA自58.8%降至25.0%，而G₂/M期DNA自25.5%增加至46.8%，且細胞凋亡子G₁自5.1%增加至23.4%。用60μg/mL L+C化合物處理之PDV細胞之細胞週期中之細胞DNA分佈類似於媒劑對照組細胞。0.5μM PLX4032處理不影響PDV細胞中之細胞週期DNA。與EO或L+C一起共處理PLX4032揭露與在單獨用EO或L+C處理之細胞中類似之細胞週期DNA分佈。綜合而言，在12-24小時處理後，KWM-EO及LM-EO可誘導PDV細胞中之G₂/M停滯。

吾人進一步研究由精油處理誘導之PDV細胞中G₂/M停滯之潛在機制。細胞分裂週期蛋白質2同系物(cdc2)在G₂至M期之細胞週期轉變中為必需的，且吾人檢驗經處理細胞中此蛋白質之含量。圖5B中之資料揭露相較於媒劑組，用75μg/mL KWM-EO、75μg/mL LM-EO及60μg/mL L+C處理24小時之PDV細胞的磷酸-cdc2與原始cdc2蛋白質之比率分別增加2.9倍、2.2倍及1.7倍；而0.5μM PLX4032處理使p-cdc2/cdc2之比率增加2.1倍。當細胞用PLX4032及KWM-EO、LM-EO或L+C共處理時，p-cdc2/cdc2之比率亦增加2.4倍、1.4倍、1.2倍。此等結果支持流式細胞計資料，指示特定薄荷精油及L+C實際上可誘導PDV細胞在G₂/M期中停滯。

實例5 薄荷精油在具有或不具有PLX4032共處理之情況下在PDV細胞中誘導細胞凋亡

當觀測到子G₁ DNA在用EO處理之PDV細胞中顯著增加時，使用磷脂結合蛋白V及碘化丙錠雙重染色進一步定量凋亡細胞之百分 比且藉由流式細胞計分析。磷脂結合蛋白V，一種磷脂結合蛋白，對於磷脂醯絲胺酸具有較大親和力，當細胞主動地經歷細胞凋亡時，該磷脂醯絲胺酸自內部質膜易位至外層。(B.Schutte,R.Nuydens,H. Geerts，等人，Annexin V binding assay as a tool to measure apoptosis in differentiated neuronal cells.Journal of Neuroscience Methods,1998.86(1)：第63-69頁)。碘化丙錠用於自死亡群體區分活細胞。圖6A中之結果展示在具有或不具有PLX4032共處理之情況下，用75μg/mL KWM-EO或75μg/mL LM-EO處理相對於經媒劑處理之細胞，顯著誘導86.9%及84.5%之凋亡細胞群體。PLX4032(0.5μM)處理未引起細胞凋亡。L+C 40-60μg/mL之組合處理在具有或不具有PLX4032共處理之情況下在PDV細胞中未引起細胞凋亡。

凋亡細胞死亡係藉由活化一組半胱胺酸蛋白酶凋亡蛋白酶來誘導。在細胞凋亡過程中，凋亡小體將促凋亡蛋白酶形式裂解成其凋亡蛋白酶9之活性形式，其此後活化效應子凋亡蛋白酶3。多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)隨後經活化以修復受損DNA。藉由西方墨點法偵測凋亡蛋白酶3及PARP之表現量(圖6B)。在75μg/mL KWM-EO及LM-EO處理6小時之後，凋亡蛋白酶3之原始形式裂解為其活性形式。同時，在用兩種EO處理細胞6小時之後觀測到PARP之活性裂解形式。在KWM-EO處理中觀測到最顯著作用。然而，L+C處理未影響彼等細胞凋亡標記蛋白質。

實例6 PLX4032在PDV細胞中誘導反常MAPK活化

熟知BRAF抑制劑PLX4032可誘導反常MAPK活化且引起RAS突變細胞中之異常細胞增殖。藉由西方墨點法檢驗PDV細胞中MAPK信號傳導路徑相關蛋白質之表現量(圖7)。在6-24小時處理下，0.5μM之 PLX4032促進p-MEK及p-ERK蛋白質表現。MEK抑制劑，AZD6244逆轉由PLX4032誘導之p-ERK上調，而75μg/mL之KWM-EO、LM-EO及60μg/mL之L+C顯著消除PLX4032刺激之PDV細胞中之p-MEK及p-ERK蛋白質表現。KWM-EO、LM-EO及L+C處理亦降低MEK而非ERK之表現。

實例7 薄荷精油減少RAW264.7巨噬細胞中LPS刺激之氧化氮產生

薄荷精油(EO)之潛在抗發炎活性係藉由LPS刺激之鼠類RAW264.7巨噬細胞上之氧化氮(NO)產生來評估。並行檢驗具有EO處理之巨噬細胞之細胞存活率。LM-EO及KWM-EO展示對LPS刺激之RAW264.7細胞中NO產生之抑制活性，其中IC₅₀值分別為86.5及95.8μg/mL(圖8)。同時，兩種薄荷精油在至多100μg/mL之相同量測濃度下對RAW264.7細胞具有極少或無可偵測之細胞毒性。

實例8 薄荷精油減少DMBA/TPA誘導之皮膚癌化

使用兩階段皮膚癌化小鼠模型研究薄荷精油之化學預防作用。圖9A展示藉由引發劑DMBA及促進劑TPA刺激(DMBA/TPA)，小鼠背側皮膚成功地形成乳頭狀瘤。由DMBA/TPA處理刺激之多發性(multiplicity)由KWM-EO、LM-EO及L+C局部處理抑制。值得注意的是，LM-EO顯示最佳作用(圖9B)。與DMBA/TPA組相比，LM-EO及L+C分別延遲病變出現5至7週及5至6週。在處理12週之後，DMBA/TPA組、KWM-EO及L+C組之乳頭狀瘤發生率達到75%(圖9C)。如圖9D中所示，儘管LM-EO處理組之發生率達到87.5%，高於DMBA/TPA組，但在LM-EO處理組小鼠中，乳頭狀瘤之平均數目顯著減少。與DMBA/TPA組相比，LM-EO與L+C化合物處理組之中值更小(圖9D)。每週記錄小鼠體 重，且資料展示群組內不存在差異(圖9E)。器官指數使得能夠比較不同器官中由毒劑引起之損傷程度。在實驗結束時(12週)，收集內臟且計算器官重量對比體重之比率以獲得特定器官指數。已知在兩階段皮膚癌化模型中，小鼠脾重量增加。藉由KWM-EO、LM-EO及L+C處理逆轉脾之腫脹(圖9F)。

實例9 薄荷精油減少由PLX4032加速之DMBA/TPA誘導之皮膚癌化

進一步研究薄荷精油對由BRAF抑制劑加速之DMBA/TPA誘導之皮膚上皮乳頭狀瘤的化學預防作用。圖10A展示經DMBA/TPA處理之背側乳頭狀瘤尤其由PLX4032處理促進。如先前所述，PLX4032極大地增加腫瘤多發性。L+C組合之局部施用顯著減少每隻小鼠之皮膚乳頭狀瘤之平均數目，KWM-EO及LM-EO處理略微減少乳頭狀瘤之平均數目(圖10B)。另外，PLX4032之腹膜內注射加速DMBA/TPA誘導之可觸皮膚乳頭狀瘤的出現，且在重複施用TPA及PLX4032歷時8週之後，所有小鼠均帶有乳頭狀瘤。KWM-EO、LM-EO及L+C處理延遲乳頭狀瘤之出現。其全部展示延遲5至6週之潛伏期。在12週實驗之後，DMBA/TPA/PLX4032組、KWM-EO及L+C處理組中的乳頭狀瘤發生率達到100%；然而，發生率因施用LM-EO而減少，在75%處(圖10C)。L+C處理組之中值小於DMBA/TPA/PLX4032組(圖10D)。每週量測小鼠體重，其中未觀測到對小鼠重量之作用(圖10E)。在觀測12週之後，收集內臟且計算器官重量對比體重之比率以獲得特定器官指數。用PLX4032處理加劇脾之腫脹，其轉而由KWM-EO、LM-EO及L+C化合物處理恢復(圖10F)。

實例10 小鼠皮膚之免疫病理學

進行H&E染色以檢驗小鼠皮膚組織之病理組織學(圖11)。在假處理組小鼠中觀測到具有表皮、真皮、皮下組織、肌肉及毛囊之典型皮膚架構。DMBA/TPA之局部施用引起表皮厚度增加，其經證實為表皮之異常增殖及增生。表皮之不規則厚度藉由KWM-EO、LM-EO及L+C組合處理而減小。在DMBA引發及TPA促進之皮膚中，PLX4032之腹膜內注射加劇表皮之增殖及增生。薄荷EO及主要化合物之施用亦尤其抑制表皮之不自然厚度。

實例11 乳頭狀瘤組織中反常MAPK活化由薄荷精油抑制

ERK之磷酸化為調節細胞增殖、分裂、運動及死亡之MAPK信號傳導路徑之重要標誌。藉由IHC進一步分析乳頭狀瘤中之p-ERK之蛋白質表現量。在DMBA/TPA刺激之小鼠皮膚中，大部分p-ERK蛋白質在皮下層與乳頭狀瘤之接合處之間表現，且其可藉由KWM-EO、LM-EO及L+C處理來下調(圖12)。先前研究指示，PLX4032注射增強RAS基因突變組織上p-ERK之活化，其在此研究中亦很好地觀測到。p-ERK之反常活化由KWM-EO、LM-EO及L+C局部施用顯著阻斷。

實例12 EO之抗癌細胞作用

藉由MTT分析法測定LM-EO及KWM-EO針對B16黑素瘤細胞之抗癌細胞增殖作用。圖13中之結果揭示，LM-EO及KWM-EO兩者都以劑量依賴性方式抑制B16黑素瘤細胞存活率。B16細胞上LM-EO之IC₅₀為25.39μg/mL(圖13A)且KWM-EO之IC₅₀為53.32μg/mL(圖13B)。

實例13 LM-EO之脫色活性

檢驗LM-EO之脫色或抗黑素生成活性。選擇化妝品工業中常用於皮膚增亮化妝產品中之曲酸(KA)作為陽性對照組。用LM-EO或KA 處理6、12及24小時之B16細胞之光影像展示，LM-EO可能具有脫色作用(圖14A)。圖14A中所示之進一步定量資料實際上揭露，當細胞經處理24小時時，15及25μg/mL LM-EO及100μg/mL KA均展示具有統計顯著性之脫色作用。酪胺酸酶為黑素形成過程中之關鍵蛋白質，藉由西方墨點法研究酪胺酸酶之表現量。圖14B中之資料展示LM-EO或KA以時間依賴性方式抑制B16細胞中之酪胺酸酶表現，該現象可稱為其脫色作用。結果指示來自水薄荷品種檸檬萊姆薄荷之精油可進一步發展成增白皮膚或減少色素沉著之產品。

Claims (16)

1. 一種包含一或多種來自水薄荷(M.aquatica)之精油之精油組合物之用途，其係用於製備抑制HRAS ^Q61L 突變角質細胞活性或治療及/或預防皮膚癌化及/或增白皮膚或減少皮膚色素沉著之製劑，其中該水薄荷為水薄荷品種墾丁水薄荷(M.aquatica var.Kenting Water Mint)或水薄荷品種檸檬萊姆薄荷(M.aquatica var.citrata Lime Mint)。
2. 一種包含檸檬烯及香芹酮的組合物之用途，其係用於製備抑制HRAS ^Q61L 突變角質細胞活性或治療及/或預防皮膚癌化及/或增白皮膚或減少皮膚色素沉著之製劑，該組合物視情況包含一或多種來自水薄荷之精油，其中該水薄荷為水薄荷品種墾丁水薄荷(M.aquatica var.Kenting Water Mint)或水薄荷品種檸檬萊姆薄荷(M.aquatica var.citrata Lime Mint)。
3. 如請求項1或2之用途，其中該精油組合物以0.1毫克至10毫克/部位範圍內之量局部施用。
4. 如請求項2之用途，其中該組合物包含5%(w/w)至70%(w/w)之檸檬烯及0.5%(w/w)至50%(w/w)之香芹酮。
5. 如請求項1或2之用途，其中該精油組合物包含來自水薄荷品種墾丁水薄荷之精油及來自水薄荷品種檸檬萊姆薄荷之精油。
6. 如請求項1或2之用途，其中該皮膚癌化為黑素瘤、基底細胞癌(BCC)、鱗狀細胞癌(SCC)或角化棘皮瘤(KA)之發生。
7. 如請求項1或2之用途，其中該精油組合物或組合物能夠抑制發炎。
8. 如請求項1或2之用途，其中該精油組合物或組合物能夠預防兩階段皮膚癌化。
9. 如請求項9之用途，其中該皮膚癌化為化學或藥物誘導之兩階段皮膚癌化。
10. 如請求項10之用途，其中該藥物為BRAF抑制劑。
11. 如請求項1或2之用途，其中該精油組合物或組合物展現針對HRAS ^Q61L 角質細胞之顯著抗增殖作用。
12. 如請求項1或2之用途，其中該精油組合物或組合物誘導G₂/M細胞週期停滯及細胞凋亡。
13. 如請求項1或2之用途，其中該精油組合物或組合物抑制乳頭狀瘤形成。
14. 如請求項1或2之用途，其中該精油組合物或組合物削弱MAPK信號傳導之再活化。
15. 如請求項1或2之用途，其中該精油組合物或組合物抑制黑素瘤之增生。
16. 一種來自水薄荷品種墾丁水薄荷(M.aquatica var.Kenting Water Mint)或水薄荷品種檸檬萊姆薄荷(M.aquatica var.citrata Lime Mint)之精油組合物，其中該精油組合物包含檸檬烯及香芹酮，及檸檬烯為約20%(w/w)至約50%(w/w)及香芹酮為約1%(w/w)至約30%(w/w)。

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