KR20120081291A

KR20120081291A - 마테 발효물을 함유하는 피부 외용제 조성물

Info

Publication number: KR20120081291A
Application number: KR1020110002549A
Authority: KR
Inventors: 표형배; 이근수; 배준태; 송민현; 정현관; 이상길
Original assignee: 한불화장품주식회사
Priority date: 2011-01-11
Filing date: 2011-01-11
Publication date: 2012-07-19
Also published as: KR101301012B1

Abstract

본 발명은 무환자나무목 감탕나무과 마테(Mate) 전초(全草)로부터 추출물을 추출하는 단계; 상기 추출물에 잎새버섯(KCTC 10337BP) 균사체 또는 잎새버섯(KCTC 10337BP) 균사체의 전 배양액을 혼합한 후, 본 배양하는 단계; 상기 본 배양 후, 본 배양액으로부터 잎새버섯(KCTC 10337BP) 균사체를 제거하는 단계;로부터 수득된 여과액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 항산화 효과, 콜라겐 합성 촉진효과, 피부 잔주름 개선효과, 미백효과, 보습효과, 피부자극 완화효과, 여드름 방지효과, 아토피 개선효과 및 항염 효과 등 피부개선에 우수한 효과를 나타낸다.

Description

마테 발효물을 함유하는 피부 외용제 조성물{Skin agent composition containing Ilex paraguariensis extract using microbial fermentation}

본 발명은 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 무환자나무목 감탕나무과에 속하는 마테(Mate)의 전초(全草) 추출물을 발효시켜 수득한 여과액을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부는 나이를 먹으면서 끊임없이 변화하게 된다. 피부 노화는 크게 자연노화(혹은 내인성 노화)와 외적 노화로 구분되며(E.B. Doris, Cosmetics & Toiletories, 111, 31-37, 1996), 자연 노화(내인성 노화)는 유전적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 어려운 반면 외적 노화는 환경적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 비교적 용이하다. 대표적인 외적 노화 인자로는 자외선을 들 수 있으며, 가장 두드러진 외적 노화현상이 바로 주름형성이다(H.W. Daniell, Ann Intern Med, 75, 873-880, 1971, G.L. Grove, J Am Acad Dermatol, 21, 631-637, 1989, C.E. Griffiths et al, Arch Dermatol, 128, 347-351, 1992).

한편, 자외선에 노출된 피부는 프리라디칼과 활성산소종을 생성시켜 피부암, 광독성, 자기면역장애, 광과민증과 피부노화 등을 유발하게 된다(Norins, J. Invest. Dermatol., 39:445, 1962; Cadenas, Ann. Rev. Biochem., 58:79, 1989). 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다.

한편, 멜라닌은 색소 세포 내에 존재하는 티로시나제의 작용에 의해 타이로신으로부터 도파(dopa), 도파퀴논(dopaquinone)으로 변환되어 도파크롬(dopachrome) 등을 거처 생성된다. 멜라닌은 피부에 존재하여 자외선 등으로부터 신체를 보호하고 체내 호르몬 분비 조절에 중요한 기능을 나타낸다. 그러나, 멜라닌이 과잉생산되면 기미, 주근깨 등을 형성하고 피부노화를 촉진하며 피부암 유발에 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 멜라닌 과잉생산을 예방하기 위한 연구개발이 활발히 진행되고 있다. 이미 아스코르빈산(일본특개평 4-9320), 하이드로퀴논(일본특개평 6-192062), 코직산(일본특개소 56-7710), 알부틴(일본특개평 4-93150) 및 식물 추출물 등이 티로시나제 저해 활성을 나타내어 미백 화장료로 이용되고 있으나 화장품 제형 중에서의 안정성이 나빠 분해되어 착색되거나, 이취가 발생하거나, 생체 수준에서의 효능, 효과가 불분명하거나 또는 안전성이 문제가 되어 그 사용이 제한되고 있는 실정이다.

한편, 아토피 피부염(atopic dermatitis)은 아토피 알러지를 가진 사람에게서 나타나는 대표적인 질환으로, 아직까지 아토피 피부염의 원인은 명확히 밝혀지지 않았지만 아토피 피부염 환자의 약 70%에서 아토피의 병력이 있었으며, 알레르기성 체질인 사람에서 호발하고, 특히 다른 알러지 질환인 알러지성 비염, 천식 등을 동반하기 때문에 유전적 요인에 의한 질병이나 면역 질환 중의 하나로 이해되고 있다. 아토피성 피부염의 치료에는, 높은 약리효과를 기대할 수 있는 부신피질 호르몬 등의 약제가 사용되고 있으나 부신피질 호르몬제의 부작용이 문제가 되고 있고, 부신피질 호르몬제의 사용 중지에 의하여 리바운드(약물의 사용정지 후에 일어나는 극적인 환부의 병세악화)가 생기는 것도 잘 알려져 있다. 이와 같은 부작용의 대책으로서, 부신피질 호르몬 등의 호르몬을 포함하지 않는 비스테로이드성 항염증제 또는 항히스타민제 등이 사용되고 있으나 완치가 어려운 상태이기 때문에 부작용이 없는 아토피 피부염의 개선제 또는 치료제 개발이 매우 절실한 실정이다.

최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연 추출물로부터 얻어진 항산화, 주름완화, 미백, 가려움 완화 등의 기능을 가진 기능성 화장료(functional cosmetics) 에 많은 관심이 집중되고 있다. 예를 들어, 미국 특허공보 US 5,972,341는 코미포라 무쿨(Commiphora mukul)추출물의 주름 개선효과에 관하여, 일본특허공개 평9-672662는 히알우로니다제(Hyaluronidase)억제 효능을 가지는 해초류 추출물들에 관하여, 일본특허공개 평10-85905는 와카메(Wakame)로부터 추출된 푸코이단 (Fucoidan)의 피부감촉 개선효과에 관하여, 일본특허공개 평2-245087은 사르가숨(Sargassum)속 추출물의 항산화 효과에 관하여, 대한민국 특허 제0431076호는 백급, 자소, 에키나시아 및 발효대두 추출물을 포함하는 아토피 피부의 치유 개선용 화장료 조성물을, 대한민국 특허 제0511494호는 하수오, 시엽, 일라이트를 포함하는 아토피 피부염 치료를 위한 추출물 및 조성물을, 대한민국 특허출원 공개 제2004-0011584호는 감초, 창이자, 홍화, 돈지(돼지비계)와 같은 천연성분의 물질을 정제 혼합하여 구성된 아토피성 피부질환의 치료에 우수한 조성물에 관해 개시하고 있다.

한편, 한방 생약재를 단순 추출한 추출물의 경우 생체 외에서는 유효한 효능을 나타내지만, 이를 함유하는 피부 외용제 경우는 그 효과가 만족스럽지 못한 문제점이 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 마테(Mate) 추출물을 잎새버섯 균사체에 의해 발효시켜 수득한 여과액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 화장품 제형 중에서의 안정성이 나빠 분해되어 착색되거나, 이취가 발생하거나, 생체 수준에서의 효능, 효과가 불분명한 문제점 및 안전성 문제가 개선된 마테(Mate) 발효 조성물을 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 화장료 또는 약제에 적용시 피부 미백, 노화 방지, 피부자극 완화 및 아토피 피부 개선에 효과를 나타내는 마테(Mate) 발효 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명자들의 연구 결과, 무환자나무목 감탕나무과의 마테(Mate) 전초(全草)로부터 추출물을 추출하는 단계; 상기 추출물에 잎새버섯(KCTC 10337BP) 균사체 또는 잎새버섯(KCTC 10337BP) 균사체의 전 배양액을 혼합한 후 본 배양하는 단계; 상기 본 배양 후, 본 배양액으로부터 잎새버섯(KCTC 10337BP) 균사체를 제거하는 단계;로부터 수득된 여과액을 유효성분으로 하여 화장료 또는 피부 외용제로 이용하는 경우 상기 목적을 달성할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

이하 본 발명의 마테(Mate) 발효 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 대해 상세히 설명하고자 한다.

본 발명자들은 상기 마테(Mate)로부터 추출한 추출물에서 효능 효과를 나타내는 주요성분이 플라보노이드(Flavonoid)임을 확인하였다. 식물에 풍부한 페놀성 화합물(Polyphenols)인 플라보노이드, 탄닌(tannins) 및 안토시아닌(anthocyanins) 등은 자외선으로 인해 손상된 피부를 보호할 수 있는 우수한 항산화 후보물질이며(Shibamot, American Chem. Soc., 564:247-256, 1994), 특히, 플라보노이드 또는 이들의 유도체 성분들은 항염증, 항알레르기, 항암 및 당뇨병 등의 약리학적 효능이 알려져 있을 뿐만 아니라(Middleton et al., Pharmacol. Rev., 52:673, 2000) 자외선으로 인해 발생한 라디칼 소거능, 지질과산화생성 억제능 등의 항산화력과 미백작용인 티로시나제 활성 억제능이 우수한 것으로 보고되고 있다(Nijveldt et al., Am. J. Clin. Nutr., 74:418, 2001).

일반적으로, 친수성 물질보다는 소수성 물질이 피부투과에 효과적인데, 각질층 중에 분포되어 있는 성분이 세라마이드라는 소수성 물질로, 친수성 물질보다는 소수성 물질과의 상호작용에 더 효과적이며 소수성 물질이 좀더 용이하게 피부 최외각 층을 통과할 수 있기 때문이다.

한편, 플라보노이드는 대부분 당(sugar) 한 분자 이상이 결합된 배당체(glycosides)로서 자연계에 존재하고 분자량은 상대적으로 크며, 수용성의 성질도 일부 지니기 때문에 각질층을 쉽게 통과하지 못하고 이에 따라 피부 내부로의 유입이 어렵게 되어 효과적으로 흡수가 어렵다는 문제점이 있다.

따라서 본 발명은 피부투과율이 용이하여 피부 외용제로서의 효과적인 역할을 하는 피부 외용제 조성물을 제공하기 위해 마테(Mate)를 추출하는 단계; 상기 추출물에 잎새버섯(KCTC 10337BP) 균사체 또는 잎새버섯(KCTC 10337BP) 균사체의 전 배양액을 혼합한 후, 본 배양하는 단계; 상기 본 배양 후, 본 배양액으로부터 잎새버섯(KCTC 10337BP) 균사체를 제거하는 단계;로부터 수득된 여과액을 유효성분으로 함유하는데, 상기의 단계를 통해 수득된 여과액은 마테(Mate) 추출물보다 총 페놀함량 및 총 플라보노이드 함량이 증가한 것을 본 실험예에서 확인하였다.

또한, 상기 본 발명에 유효성분으로 함유되는 여과액의 제조과정에 있어서, 마테(Mate) 추출물에 잎새버섯(KCTC 10337BP) 균사체 또는 잎새버섯(KCTC 10337BP) 균사체의 전 배양액을 혼합한 후, 본 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 여기서 전 배양은 본 배양 전에 잎새버섯(KCTC 10337BP) 균사체의 양을 증가시키기 위한 배양을 의미하고, 본 배양은 전 배양을 통해 균사체의 양이 증가된 잎새버섯(KCTC 10337BP)을 이용하여 마테(Mate) 추출물을 원활하게 발효시키는 과정이다. 발효 화장료를 제조하기 위한 발효 균주로서 다양한 균주들이 이용되고 있으나, 본 발명에서 이용하는 잎새버섯 균사체는 다른 잎새버섯 균주나 유산균주 등의 기타 다른 발효 균주로 발효시킨 것에 비하여 플라보노이드 화합물 비배당체로의 전환율이 2~3배 이상 현저히 높게 나타나며, 고보습 특성을 나타내는 베타-글루칸 등의 다당류가 다량 생산되는 특징을 나타내어 KCTC 10337BP 잎새버섯 균주를 이용하였다(데이터 나타내지 않음).

한편, 본 발명에서 "유효성분으로 포함된다"는 의미는 본 발명의 피부 외용제 조성물로부터 피부질환의 예방 및 개선 효과를 나타낼 수 있는 정도로 피부 외용제 조성물에 여과액이 첨가되는 것을 의미하고, 약물전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 제형화 (formulation)하는 것을 포함하는 의미이다.

또한, 본 발명은 유효성분으로 함유되는 여과액이 항산화 효과, 세포 내 활성산소 제거 효과, 기질 금속단백질분해효소(MMP-1) 활성 저해효과, 기질 금속단백질분해효소(MMP-1) 발현 억제효과, 프로콜라겐 생합성 촉진효과, 엘라스틴 생성 촉진효과, 미백효과, 염증유발관련 효소(hyaluronidase) 활성 억제효과, 자외선 조사에 의한 세포독성 완화효과, 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과, 여드름균에 대한 항균효과, 아토피 피부염에 대한 항염증효과, 수분흡습성이 우수한 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 여과액의 함량이 피부 외용제 조성물 전체에 대해 0.001~30.0중량%인 것을 특징으로 하는 마테(Mate) 발효 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 상기 여과액 함량이 0.001중량% 미만으로 포함되는 경우에는 피부개선효과가 거의 없으며, 30.0중량% 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하여 경제적이지 못하다.

또한, 본 발명은 상기 추출시 추출용매로 에탄올이 85~99(v/v) 함유된 수용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 추출물에 감압농축 또는 동결건조 공정을 부가하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 감압농축 또는 동결건조된 추출물은 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜 중 선택되는 1종 이상의 용매에 용해된 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 감압농축 또는 동결건조된 추출물은 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜 중 선택된 1종 이상의 용매에 0.001~30.0중량%로 용해된 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 배양시 배양액의 pH를 5.0~6.0으로 조정하고, 잎새버섯(KCTC 10337BP) 균사체를 4~6%(v/v)되도록 접종한 후, 온도 22~32℃, 회전수 120~180rpm, 통기량 1.2~1.8vm 조건에서 5~7일간 배양하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 마테(Mate) 발효 추출물을 함유하는 피부 미백 효능을 나타내는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 마테(Mate) 발효 추출물을 함유하는 노화 방지 효능을 나타내는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 마테(Mate) 발효 추출물을 함유하는 피부자극 완화 효능을 나타내는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 마테(Mate) 발효 추출물을 함유하는 아토피 피부 개선 효능을 나타내는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 마테(Mate) 발효 추출물을 함유하는 여드름 예방 효능을 나타내는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 피부 외용제 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초 화장료 제형; 수중유형 또는 유중수형의 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류 중에서 선택된 화장료 조성물임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 피부 외용제 조성물이 경고제(PLASTERS), 로션제(LPTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 첩부제, 서방화 제제 중에서 선택되는 약학 조성물로 사용하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 상기 약학적 조성물은 약리학적으로 허용되는 기제; 운반제; 부형제; 전분, 트래거캔스 고무, 젤라틴, 당밀, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐에테르, 폴리비닐 피롤리돈, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스를 포함하는 결합제; 한천, 전분, 벨라틴 가루, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘, 결정 셀룰로오스, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨 및 알긴산 나트륨을 포함하는 분쇄제; 스테아린산 마그네슘, 활석 및 수첨 식물유를 포함하는 윤활제; 및 착색제 등을 포함할 수 있고, 상기 운반제 및 부형제로는 젖당, 글루코오스, 수크로오스, 만니톨, 감자녹말, 옥수수녹말, 탄산칼슘, 인산칼슘 및 셀룰로오스 등이 있다. 상기 외에도 안정화제, 용해보조제, 경피흡수 촉진제 등의 보조제 방향제, 방부제 등의 첨가제가 더 첨가될 수 있다.

또한, 본 발명 피부 외용제 조성물의 표준 투여량은 환자의 개별적 특성에 따라 그 양이 변화될 수 있으며, 실질적으로 숙련된 임상 의사는 환자를 위해 본 발명의 피부 외용제 조성물에 대한 이상적인 투여량 및 투여 계획, 예를 들어 특정 필요 및 환자의 전체적인 조건의 관점에서 가장 적절한 치료 전략을 정할 수 있다. 본 발명의 피부 외용제 조성물에 대하여 적절한 투여량을 결정하는 데는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 수많은 참조 문헌을 참조할 수 있다.

또한, 본 발명 피부 외용제 조성물의 적절한 투여량은 시험관 내 또는 동물 모델에서 일반적으로 결정될 수도 있다. 예를 들어 시험관 내에서 표적 세포에 대해 여러 농도의 본 발명 피부 외용제 조성물을 첨가하여 그 적절한 투여량을 결정할 수도 있다.

본 발명의 마테 발효 추출물을 함유하는 조성물은 항산화, 콜라겐 합성 촉진, 피부 미백, 피부 노화 방지, 피부자극 완화, 여드름 방지, 아토피 개선 및 항염증 효과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

비교예 1: 마테(Mate)로부터 추출물 제조(단순 추출)

세절하여 음건한 마테 10kg을 95%(v/v) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 얼지 않는 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조시킨 후, 수득된 동결 건조물을 15 중량% 함유되도록 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜 혼합용매에 용해시킴으로써 마테(Mate)로부터 추출물을 제조하였다.

실시예 1: 마테 발효 추출물 제조

잎새버섯 KCTC 10337BP 균사체를 효모-맥아즙 한천배지가 든 시험관에 사면배양하여 4℃에 보관하고 1개월마다 계대배양하여 사용하였다. 상기 사면배지에서 계대배양된 균사체를 무균적으로 균질화하여 비교예 1에서 수득한 마테 추출물과 당이 혼합된 최적화된 합성배지(대한민국 특허등록: 10-0461960)를 제조하였으며, pH 5.5로 조정한 액체배지에 잎새버섯 균사체가 5%(v/v)되도록 접종한 후, 발효조 내에서 온도 27℃, 회전수 150rpm, 통기량 1.5vvm의 조건으로 6일간 배양하였다. 배양 후 배양액으로부터 잎새버섯 균사체를 제거한 다음 여과액(이하 '마테 발효 추출물'이라고 칭함)을 수득하였다.

실험예 1: 마테 발효 추출물에 함유된 성분 및 성분의 함량 측정

본 실험예 1에서는 상기 비교예 1에서 제조된 마테 추출물과 실시예 1에서 제조된 마테 발효 추출물의 주요성분 중 페놀성 물질, 플라보노이드, 플라보노이드 배당체 등의 정성분석 및 페놀함량과 총 플라보노이드 함량을 비교하였다.

먼저 페놀성 물질, 플라보노이드, 플라보노이드 배당체 등의 정성분석은 하기와 같이 수행하였다.

(1) 페놀성 물질, 플라보노이드의 정성분석

비교예 1(단순 추출에 의한 마테 추출물)와 실시예 1(마테 발효 추출물)에 각각 2.5% FeCl₃ 에탄올 용액을 1~2 방울 떨어뜨려 방치할 때, 암녹색으로 정색하거나 침전의 생성 여부를 관찰하였다.

(2) 플라보노이드 배당체의 정성분석

진한 황산법을 이용, 비교예 1과 실시예 1에 각각 5㎖의 진한 황산을 점적하여 황색 및 황적색 침전의 생성을 관찰하였다.

(3) 당의 정성분석

비교예 1과 실시예 1에 각각 5% a-나프톨 알콜 시액 2-3 방울을 넣은 후 농황산을 기벽을 통하여 가할 때 경계면에 적자색이 나타나는지 관찰하였다.

정성분석을 수행한 결과, 비교예 1과 실시예 1은 페놀성 물질, 플라보노이드 플라보노이드 배당체가 함유되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

총 페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량 측정은 하기와 같이 수행하였다.

(1) 총 페놀함량 측정

비교예 1과 실시예 1 1㎖에 각각 증류수 10㎖을 첨가한 후, 2㎖의 Folin-Ciocalteu phenol reagent(Sigma)첨가하여 혼합한 다음, 실온에서 5분간 반응시켰다. 이 반응물에 20% 소듐 카보네이트를 2㎖ 첨가하여 혼합한 다음, 상온에서 1시간 반응시킨 후 680nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 지표물질은 갈릭산(gallic acid)을 사용하였다.

(2) 총 플라보노이드 함량 측정

비교예 1과 실시예 1 각 1.5㎖에 동량의 메탄올에 용해된 2% AlCl₃ H₂O을 혼합한 다음, 상온에서 10분간 반응을 시킨 후 367nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 지표물질은 카테킨(catechin)을 사용하였다.

시료명	총 페놀 함량 (㎍/㎎ of extract)	총 플라보노이드 함량 (㎍/㎎ of extract)
비교예 1 (단순 추출에 의한 마테 추출물)	447.3	35.1
실시예 1(마테 발효 추출물)	640.7	68.2

총 페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량 측정한 결과(표 1), 비교예 1보다 실시예 1이 총 페놀함량 및 총 플라보노이드 함량이 높은 것을 확인할 수 있었는데, 특히 플라보노이드 함량은 약 2배 이상 증가한 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 단순 추출에 의해 제조된 마테 추출물을 잎새버섯 균사체로 발효시킴으로써 총 페놀함량 및 총 플라보노이드 함량을 증가시킬 수 있다는 사실을 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 잎새버섯 균사체에 의해 발효된 마테 발효 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 피부 외용제 조성물을 제조하였다.

실험예 2: NBT 법을 이용한 항산화 효과 측정

상기 실시예 1에서 수득된 마테 발효 추출물의 항산화 수준을 확인하기 위해 항산화제로 잘 알려진 BHT(Butylated hydroxytoluene)를 비교샘플로 사용하였고, 항산화 측정은 NBT법을 이용하였다.

NBT법은 잔틴과 잔틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시키고, 생성된 활성산소와 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)가 반응하여 생성된 청색을 파장 560㎚에서 측정하는 방법으로, 활성산소 소거율을 측정하였으며, 측정방법은 하기와 같다.

바이엘병에 0.05M의 Na₂CO₃ 2.4㎖, 3mM의 잔틴 용액 0.1㎖, 3mM의 EDTA 용액 0.1㎖, BSA 용액 0.1㎖, 0.72mM의 NBT 용액 0.1㎖를 가하고 여기에 시료용액을 각각 첨가한 후, 25℃에서 10분간 방치하였다. 방치 후, 잔틴 옥시다제 용액 0.1㎖를 가하여 빠르게 교반한 다음, 25℃에서 20분간의 배양을 하였고, 여기에 6mM의 CuCl₂용액 0.1㎖을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도(St)를 측정하였다. 공시험은 시료용액 대신 증류수를 사용한 것으로 상기와 동일한 방법으로 흡광도(Bt)를 측정하였다. 시료용액의 블랭크(Blank)는 잔틴 옥시다제 용액 대신 증류수를 사용해 상기와 동일한 방법으로 흡광도(Bo)를 측정하였다.

측정 결과는 수학식 1에 의하여 산출하였다.

시료명	활성산소 소거율(항산화 효과;%)
마테 발효 추출물 0.1 중량%	91
마테 추출물 0.1 중량%	69
BHT 0.1 중량%	85

NBT법을 이용한 항산화 효과를 측정한 결과(표 2), 마테 발효 추출물은 마테 추출물과 BHT와 같은 농도에서 좀더 우수한 항산화효과를 발휘하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 본 발명의 유효성분인 마테 발효 추출물의 우수한 항산화효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명 조성물의 우수한 항산화 효과를 추론할 수 있었다.

실험예 3: DPPH 법을 이용한 항산화 효과 측정

본 실험예 3에서는 실시예 1에서 수득된 마테 발효 추출물의 항산화 수준을 확인하기 위해 항산화제로 잘 알려진 BHT를 비교시료로 사용하였고, 항산화 측정은 DPPH법을 이용하였다.

DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 자유라디칼 소거활성을 측정하는 것이다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정한다.

0.1% 농도의 마테 발효 추출물, 마테 추출물, BHT를 준비한 후, 각각의 시료를 96-웰 프레이트에 넣었다. 여기에 100㎛ 메탄올용액으로 제조된 DPPH를 첨가하여 용액의 총 부피가 200㎕ 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 30분간 방치한 후 560nm에서 흡광도(St)를 측정하였다.

자유라디칼 소거활성(%)은 다음의 수학식 2로 산출하였다.

시료명	자유라디칼 소거율(항산화 효과; %)
마테 발효 추출물 0.1 중량%	94
마테 추출물 0.1 중량%	79
BHT 0.1 중량%	82

DPPH 법을 이용하여 항산화 효과를 측정한 결과(표 3), 마테 발효 추출물은 마테 추출물과 BHT보다 우수한 항산화 효과를 발휘하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 마테 발효 추출물의 우수한 항산화 효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명 조성물의 우수한 항산화 효과를 추론할 수 있었다.

실험예 4: 세포내 활성산소 소거 효과 측정

본 실험예 4에서는 실시예 1에서 수득된 마테 발효 추출물의 자외선에 의해 세포 내에서 생성되는 활성산소의 소거 효과를 측정하기 위해 EGCG(Epigallocatechin gallate)를 비교시료로 사용하였고, 형광물질을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

본 실험예 4에서 사용한 세포주는 독일 암연구센터의 퓌세니그 박사(Dr. Fusenig)로부터 분양받은 인간 각질세포 HaCaT 세포주(Human keratinocytes HaCaT cell line)로서 이를 형광측정용 96-웰 블랙 플레이트(well black plate)에 웰당 2.0×10⁴개로 분주하고 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin) 첨가된 DMEM(Dulbeccos Modification of Eagles Medium, FBS 10%, Gibco, USA)배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 1일간 배양한 후, 0.01% 농도의 마테 발효 추출물, 마테 추출물, EGCG를 처리하였다.

시험시료를 넣고 24시간 배양한 후, HCSS(HEPES-buffered control salt solution)로 세척하여 남아있는 배지를 제거하고 HCSS에 20㎛로 준비된 DCFH-DA (2',7'- dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Molecular Probes, USA)를 100 가하고 37, 5% CO₂ 조건에서 20분간 배양한 후, HCSS로 세척하였다. 이후 농도별로 처리된 HCSS를 100㎕ 가한 후, 초기에 활성산소로 산화된 DCF(dichlorofluorescein)의 형광도를 형광플레이트 판독기(Ex;485nm, Em;530nm)로 측정하였다. 이후 UVB(20mJ/㎠)를 조사하고 각각의 시료를 처리한 후, 형광도를 형광플레이트 판독기(Ex;485nm, Em;530nm)로 측정하였다.

시료명	활성산소 소거 효과(%)
마테 발효 추출물 0.01 중량%	44
마테 추출물 0.01 중량%	26
EGCG 0.01 중량%	42

활성산소의 소거 효과를 측정한 결과(표 4), 마테 발효 추출물은 동일한 농도에서 마테 추출물보다 활성산소 소거율이 높았고, EGCE와 유사한 활성산소 소거율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 마테 발효 추출물의 우수한 활성산소 소거 효과를 확인할 수 있었다.

실험예 5: 시 험관 내( in vitro )에서 금속단백질분해효소 ( MMP -1) 활성 저해율 측정

노화가 진행되면 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외 기질의 합성이 감소되고, 콜라겐을 분해하는 효소인 금속단백질분해효소(MMP-1)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하될 뿐만 아니라, 주름도 형성된다.

본 실험예 5에서는 실시예 1에서 수득한 마테 발효 추출물의 시험관 내(in vitro) 금속단백질분해효소(MMP-1) 활성 저해율을 측정하기 위해 녹차추출물을 비교시료로 사용하였고, 형광분석법을 이용하였다.

실험에 사용한 기질은 형광물질이 표지된 DQ-콜라켄, 효소(collagenase)는 Molecular probe사(Eugene, OR, USA)에서 시판중인 제품을 사용하였으며, 반응완충액(0.5M Tris-HCl, 1.5M NaCl, 50mM CaCl₂, 2mM sodium azide, pH7.6)은 10배 희석 후 사용하였다. 반응완충액 100㎕에 0.25㎎/㎖로 반응완충액에 용해한 DQ 콜라겐 20㎕와 마테 발효 추출물(0.02%) 40㎕을 첨가하고 0.5단위(unit)로 희석한 콜라게나제 40㎕를 첨가하였다. 암소, 실온에서 20분 경과 후, 형광 분광광도계(Perkin Elmer, UK)를 이용하여 흡수파장 495nm, 방출파장 515nm로 형광값을 측정하였다. 대조군은 효소액 대신 반응완충액을 효소와 동량 첨가한 후, 형광값을 측정하였으며 시료 자체의 형광값도 측정하여 효소활성 계산시 보정하였다.

시료명	금속단백질분해효소(MMP-1) 활성 저해율(%)
마테 발효 추출물 0.02 중량%	90
마테 추출물 0.02 중량%	49
녹차 추출물 0.2 중량%	67

시험관 내(in vitro)에서 금속단백질분해효소(MMP-1) 활성 저해율을 측정한 결과(표 5), 마테 발효 추출물은 동일한 농도의 마테 추출물보다 금속단백질분해효소(MMP-1) 저해 활성이 우수하였으며, 녹차 추출물에 비해 낮은 농도에서도 MMP-1의 활성을 효과적으로 저해하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 마테 발효 추출물의 금속단백질분해효소(MMP-1) 활성 저해효과가 우수하다는 사실을 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 본 발명의 피부 외용제 조성물은 금속단백질분해효소를 효과적으로 저해함으로써 피부의 탄력 저하 및 주름 형성을 예방할 수 있음을 추론할 수 있었다.

실험예 6: 자외선 조사 후 금속단백질분해효소 ( MMP -1) 발현억제 정도 측정

콜라겐을 분해하여 피부의 탄력 저하 및 주름 형성에 영향을 미치는 금속단백질분해효소(MMP-1)는 자외선 조사에 의해 활성화되기도 한다.

본 실험예 6에서는 실시예 1에서 수득된 마테 발효 추출물의 자외선 조사 후 금속단백질분해효소(MMP-1) 발현억제 정도를 측정하기 위해 레티놀을 비교시료로 사용하였다.

UV 조사 및 시료 첨가(마테 발효 추출물, 마테 추출물, 레티놀) 후, 금속단백질분해효소(MMP-1) 농도를 측정하기 위해서 효소면역 시험법(ELISA)를 수행하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 6.3J/㎠의 에너지로 조사하였고, 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP-1 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간 유지하였고, UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후, 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후, 배지를 회수하여 96-웰 플레이트에 코팅하였다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분 반응시켰다. 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액(1mg/-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 판독기로 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였다.

시험군	MMP-1 발현억제율(%)
음성 대조군	-
마테 발효 추출물 0.02중량%	69
마테 추출물 0.02중량%	37
레티놀	35

자외선 조사 후 금속단백질분해효소(MMP-1) 발현억제 정도를 측정한 결과(표 6), 시료를 처리하지 않은 음성 대조군에 반해 마테 발효 추출물은 69% 이상의 억제율을 보였는데, 이는 비교시료로 사용한 마테 추출물과 레티놀의 억제율에 비해서도 상당히 우수한 결과였다.

상기 결과로부터 마테 발효 추출물의 금속단백질분해효소(MMP-1) 발현 억제효과가 우수하다는 사실을 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 본 발명의 피부 외용제 조성물은 금속단백질분해효소의 발현을 효과적으로 억제함으로써 피부의 탄력 저하 및 주름 형성을 예방할 수 있음을 추론할 수 있었다.

실험예 7: 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진효과 측정

본 실험예 7에서는 실시예 1에서 수득한 마테 발효 추출물의 피부기질 성분인 타입 1 프로콜라겐의 생합성을 촉진시키는 효과를 확인하기 위하여 TGF-β 양성대조군으로 사용하였고, 프로콜라겐 분석(procollagen assay)을 하기와 같이 수행하였다.

신생아의 포피조직에서 분리한 사람진피섬유아세포(human dermal fibroblast)는 Modern Tissue Technology(MTT, Korea)로부터 분양받아 DMEM/F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12)(3:1)배지에 10% 우태아혈청(FBS)을 첨가하여 1×10⁴cell/㎠ 농도로 배양하였다. 70-80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3~4차 계대배양된 세포를 실험에 이용하였다.

프로콜라겐의 양을 측정하는 실험을 위해서 섬유아세포를 48 웰 플레이트에 90% 이상 배양한 후, 마테 발효 추출물, 마테 추출물을 각각 0.02% 농도로 가하고, 24시간 후에 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐타입-1C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit)(MK101, Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다.

시료명	프로콜라겐 생합성 촉진효과(%)
마테 발효 추출물 0.02 중량%	35
마테 추출물 0.02 중량%	14
TGF-β.001 중량%	36

프로콜라겐 생합성 촉진효과를 측정한 결과(표 7), 마테 발효 추출물을 0.02% 처리시 프로콜라겐의 생합성은 36% 촉진되었으며, 세포신호전달 물질 TGF-β와 유사한 효과를 나타내었다.

상기 결과로부터 마테 발효 추출물의 우수한 프로콜라겐 생합성 촉진효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 제조된 본 발명 조성물의 피부 개선효과를 추론할 수 있었다.

실험예 8: 엘라스타제 활성 억제효과 측정

본 실험예 8에서는 실시예 1에서 수득된 마테 발효 추출물의 엘라스틴 생성 촉진효과를 측정하기 위해, 사람으로부터 직접 채취하거나 상업적으로 구입한 사람의 섬유 아세포에 0.02% 농도의 마테 발효 추출물과 마테 추출물을 처리하여 엘라스타제(elastase) 활성 억제효과를 측정하는 실험을 하기와 같이 수행하였다.

먼저, 사람의 섬유 아세포를 배양용 플라스크에 넣고 약 70~80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 이후, 마테 발효 추출물을 1일간 처리한 후 세포배양액을 채취하여 상업적으로 이용 가능한 엘라스틴 측정기구를 이용하여 엘라스틴 생성 정도를 측정하였다[Bieth J: Biochem med., 11, 350-357(1974), Schwartz DE: J.Invest Dermatol., 86, 63-68(1986)]. 즉, 엘라스타제의 기질인 Suc-(Ala) 3 NA를 이용하여, NA가 분해되면서 생기는 색의 변화를 흡광도를 이용하여, 엘라스타제의 활성도를 측정하였다. 이때 시료를 처리하지 않은 군을 대조군으로 사용하였다.

시료명	엘라스타제 활성 억제율(엘라스틴 생성 촉진효과; %)
마테 발효 추출물 0.02 중량%	41
마테 추출물 0.02 중량%	21
대조군	0

엘라스타제 활성 억제율을 측정한 결과(표 8), 마테 발효 추출물은 마테 추출물 보다 엘라스타제의 활성 억제율이 우수한 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 마테 발효 추출물의 우수한 노화 방지 및 탄력 증진 효과를 확인할 수 있었다.

실험예 9: 티로시나제 활성 억제효과 측정

본 실험예 9에서는 상기 실시예 1에서 수득된 마테 발효 추출물의 티로시나제 활성 저해효과를 확인하기 위해 미백제로 잘 알려진 알부틴을 비교샘플로 사용하였다.

티로시나제는 생체 내에서 티로신(tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되도록 하는 효소이다. 티로시나제는 버섯에서 분리 및 정제된 것으로 Sigma 사에서 구입하여 사용하였다. 기질인 L-티로신(Sigma)은 0.05M 인산나트룸 완충용액(pH 6.8)에 용해하여 0.1㎎/㎖ 용액으로 만들어 사용하였다. 마테 발효 추출물, 마테 추출물, 알부틴은 0.05M 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)에 적당한 농도로 조절하여 용해한 후 사용하였다. L-티로신 용액 0.5㎖를 시험관에 넣고 여기에 각각의 시료액 0.5을 가하고 37℃ 항온기에서 10분간 방치하였다. 그 후, 시료액에 200unit/㎖ 티로시나제 0.5㎖를 첨가하고 3℃7에서 10분간 반응시켰다. 이 반응액이 든 시험관을 얼음 위에 놓아 급냉시켜 반응을 중지시킨 후, 분광광도계를 파장 475nm에서의 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 상기 시료 대신 완충용액 0.5㎖를 넣은 것을 사용하였다.

상기 각 시료의 티로시나아제 활성 저해율은 수학식 3에 따라 계산하였다.

시료명	티로시나제 활성 저해율(%)
대조군	-
마테 발효 추출물 0.02 중량%	55
마테 추출물 0.02 중량%	24
알부틴 0.2 중량%	58

티로시나제의 활성 저해효과를 측정한 결과(표 9), 마테 발효 추출물을 0.02중량% 처리시 알부틴 0.2중량%와 유사한 티로시나제 활성 저해율이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 마테 발효 추출물의 우수한 티로시나제 활성 저해효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명 조성물의 우수한 미백효과를 추론할 수 있었다.

실험예 10: B16F1 멜라닌 세포를 이용한 멜라닌 합성 억제효과 측정

본 실험예 10에서는 실시예 1에서 수득된 마테 발효 추출물의 멜라닌 합성 억제효과를 확인하기 위해 미백제로 알려진 알부틴을 비교시료로 사용하였고, B16F1 멜라닌 세포를 이용하였다.

본 실험예 10에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다.

B16F1 멜라닌 세포의 멜라닌 합성 억제효과 측정은 다음과 같이 수행하였다. B16F1 멜라닌 세포를 6-웰 플레이트에 각 웰당 2×10⁶농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후, 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후, 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄(R. Lotan and D. Lotan, Cancer Res, 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후, 균질화 완충액(50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2mM PMSF) 1㎖를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10% DMSO(Dimethyl sulfoxide))를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후, 마이크로 플레이트 판독기로 405㎚에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음, 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다.

B16F1 멜라닌 세포의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 4에 의하여 계산하였다.

시료명	멜라닌 합성 저해율(%)
음성 대조군	-
마테 발효 추출물 0.02 중량%	36
마테 추출물 0.02 중량%	19
알부틴 0.2 중량%	35

B16F1 멜라닌 세포를 이용한 멜라닌 합성 억제효과를 측정한 결과(표 10), 마테 발효 추출물 0.02중량%는 알부틴 0.2중량%일 때와 유사한 멜라닌 합성 저해율을 나타내었다.

상기의 결과로부터 마테 발효 추출물의 우수한 멜라닌 합성 저해율을 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명 조성물의 우수한 미백효과를 추론할 수 있었다.

실험예 11: 염증유발관련 효소( hyaluronidase ) 활성 억제효과 측정

본 실험에 11에서는 실시예 1에서 수득한 마테 발효 추출물과 비교예 1에서 수득한 마테 추출물의 항염증 효과를 측정하기 위해 컴프리 추출물, 시소 추출물, 유용성 감초 추출물을 양성 대조군으로 사용하였고, 염증유발효소인 히아루로니디아제(hyaluronidase) 활성 억제효과를 측정하였다.

히아루로니디아제(hyaluronidase)는 히아루론산을 가수분해하는 효소로 염증유발하는 효소이다. 본 실험예에서는 히아루로니디아제(hyaluronidase)의 활성을 억제하여 항염증효과를 측정하는 방법(Kakegawa Y: Japanese J. of Inflammation, 4, 437-438, 1984)을 응용해 항염증 효과를 판정하였다.

시료 100㎕와 히아루로니디아제 용액(type Ⅳ-S, Sigma, 400U/㎖) 50㎕를 넣고 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 효소활성화용액(compound 48/80 CaCl₂ _?2H₂O, Sigma, 0.1㎎/㎖)을 100㎕를 첨가하고 다시 37℃에서 20분간 반응시켰다. 히아루론산(hyaluronic acid) 용액(0.4㎎/㎖)을 250㎕ 넣고 37℃에서 40분간 반응시키고, 0.4N NaOH 100㎕를 넣어 반응을 종결시켰다. 포타슘보레이트 용액을 100㎕ 첨가하여 95℃에서 3분간 반응시키고 냉각시킨 다음 ρ-디메틸아미노벤즈알데히드 용액을 3㎎ 넣고 다시 20분간 37℃에서 반응시킨 후 발색시켰다. 585㎚에서 흡광도를 측정하여 히아루로니디아제 활성 저해율을 측정하였다.

히아루로니디아제의 활성 저해율(%)은 수학식 5에 의하여 계산하였으며, IC₅₀ 값은 히아루로니디아제 효소 활성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

시료명	히아루로니디아제 활성 저해효과 (IC50)
마테 발효 추출물	0.25%
마테 추출물	0.19%
컴프리 추출물	0.24%
시소 추출물	0.52%
유용성 감초 추출물	0.21%

히아루로니디아제(hyaluronidase)의 활성 저해효과를 측정한 결과(표 11), 마테 발효 추출물의 IC₅₀값이 0.25%로 나타나 항염증제로 잘 알려진 컴프리 추출물 및 유용성 감초 추출물과 유사한 효과를 나타내었다.

상기 결과로부터 마테 발효 추출물의 우수한 항염증 효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명 조성물의 우수한 항염증 효과를 추론할 수 있었다.

실험예 12: 자외선 조사에 의한 세포독성 완화 효과 측정

본 실험예 12에서는 실시예 1에서 수득한 마테 발효 추출물과 비교예 1에서 수득한 마테 추출물의 자외선 조사에 의한 세포독성 완화효과를 측정하였다.

섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1x10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것) 1을 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 시료를 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500㎕ 배지와 MTT 용액(2.5㎎/㎖) 60㎕를 넣은 후, 2시간 동안 37℃ CO₂배양기에서 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04 N)을 500㎕씩 넣어주었다. 그리고 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565nm 흡광도를 측정하였다.

수학식 6에 의해 세포생존율(%)을 측정하고 자외선에 의한 세포독성 완화율은 수학식 7에 의하여 계산하였다.

시료명	처리농도(%)	세포독성 완화율(%)
마테 발효 추출물	0.02	49
	0.01	32
	0.005	19
마테 추출물	0.02	22
	0.01	18
	0.005	9

자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과를 측정한 결과(표 12), 마테 발효 추출물은 자외선에 의한 세포 독성을 0.02% 농도에서 49%의 세포독성을 완화하여, 마테 추출물에 비해 자외선에 의한 세포독성을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다.

상기 결과로부터 마테 발효 추출물의 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과가 우수함을 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명 조성물의 자외선에 의한 피부자극 완화효과를 추론할 수 있었다.

실험예 13: 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과 측정

본 실험예 13은 실시예 1에서 수득한 마테 발효 추출물의 항염증효과를 측정하기 위해 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제 정도를 측정하였다.

사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5X10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후, PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 마테 발효 추출물을 처리한 후, 5시간 동안 배양하였다. 배양을 한 후, 배양 상층액을 150㎕ 취하여 IL-1a를 정량함으로서 마테 발효 추출물의 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 판단하였다. IL-1a의 양은 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)을 이용하여 정량화하였으며, IL-1a의 생성율은 수학식 8에 의해 계산하였다.

시료명	염증성 사이토카인 발현 억제율(%)
마테 발효 추출물 0.02 중량%	40
마테 추출물 0.02 중량%	23

자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 측정한 결과(표 13), 0.02% 농도에서 40% 억제하여, 마테 발효 추출물은 마테 추출물에 비해 자외선에 의한 염증 발생을 효과적으로 방어함을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 본 발명 조성물의 항염증 효과를 추론할 수 있었다.

실험예 14 : 자외선조사에 의한 프로스타글란딘 생합성 억제효과 측정

본 실험예 14에서는 실시예 1에서 수득한 마테 발효 추출물의 프로스타글란딘(prostaglandin E₂ _;이하, PGE₂로 칭함) 생합성 억제효과를 평가하기 위하여 사람의 표피 조직에서 분리한 각질형성세포(Keratinocyte)를 24-웰 시험 플레이트에 5x10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하고, 18시간 동안 배양한 다음, 상기의 각질형성세포에 최종농도가 50㎛이 되도록 아스피린(aspirin)을 처리하여 각질형성세포에 존재하는 프로스타글란딘 생합성 효소(prostaglandin E₂ synthetase, 또는 cyclooxygenase, 이하 COX)의 활성을 제거하였다. 아스피린 처리 2시간 후에 각질형성세포가 들어있는 각 웰을 PBS로 2회 세척하고 각 웰에 100㎕의 PBS를 넣었다. 이 각질형성세포에 UVB 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 30mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 각 웰에 각질형성세포 배양액(keratinocyte growth media, Clonetics, Biowhittacker사, MD, USA) 250㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 시료를 처리한 후 16시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 적당량 취하여 16시간 동안 생합성된 PGE₂(prostaglandin E2)를 정량함으로써 시료의 프로스타글란딘 억제효과를 판단하였다. PGE₂의 양은 효소면역분석법(enzyme immunoassay)을 이용하여 정량화하였다.

시료명	PGE2 억제율(%)
(-)UV B	대조군
(+)UV B	-
(+)UV B + 마테 발효 추출물 0.02 중량%	57
(+)UV B + 마테 추출물 0.02 중량%	22

자외선조사에 의한 프로스타글란딘 생합성 억제효과를 측정한 결과(표 14), 마테 발효 추출물은 자외선에 의한 프로스타글란딘의 생성을 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다. 특히 생성되는 PGE₂는 주로 COX-2 효소에 의해 만들어지는 것으로 알려져 있으므로 상기 실험을 통해 마테 발효 추출물이 COX-2 효소의 유도작용 또는 활성을 억제함을 추론할 수 있었다.

상기 결과로부터 마테 발효 추출물의 우수한 프로스타글란딘 생합성 억제효과를 확인할 수 있었다.

실험예 15: 여드름균에 대한 항균력 측정

본 실험예 15에서는 실시예 1에서 수득한 마테 발효 추출물과 비교예 1에서 수득한 마테 추출물의 여드름균에 대한 항균력을 확인하기 위한 페이퍼 디스크 테스트(Paper Disc Test)를 실시하였다. 먼저, 여드름 발생 원인인 피부 상재균 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)를 활성화시키기 위하여 BHI 액체배지(Brain-Heart Infusion Broth;3.7%)에서 48시간 전배양하였다. 이렇게 준비한 균 배양액을 BHI 고체배지(Brain-Heart Infusion Broth;3.7%;agar1.5%)에 0.1㎖씩 도말한 후, 건조시켰다. 실시예 1과 비교예 1에서 수득한 시료를 각각 95% 에탄올 수용액에 12%(w/v)로 희석하여 직경 8㎜의 페이퍼 디스크에 50㎕씩 점적한 후 앞서 준비한 고체배지 위에 올려놓은 후 이것을 35㎕ 혐기 배양조에서 3일간 배양하였다. 페이퍼 디스크 주변에 생긴 균 성장 저지 영역을 관찰하고 저지환의 크기를 측정함으로써 항균력을 평가하였다.

여드름륜에 대한 항균력을 측정한 결과, 마테 발효 추출물의 균 성장 저지환의 크기는 24㎜이고, 마테 추출물은 11㎜인 것으로 나타났다.

실험예 16: 화합물( Compound) 48/80에 의한 아토피 피부염 유발 후 마테 발효 추출물의 항염증 효과 측정

BALB/c 마우스(5wks, male)의 등쪽 목부위 피부의 진피 내로 마리당 30㎕의 화합물 48/80(Sigma, Co.; 1㎎/㎖ in saline)을 주사한 후 케이지에 집어넣고 60분 동안 마우스가 목을 긁는 행동을 관찰하였다. 마테 발효 추출물의 항염 치료 효능을 검정하기 위하여 화합물 48/80을 주사하기 5일 전부터 마테 발효 추출물을 250㎎/㎖의 농도로 마리당 100씩 마우스의 등쪽 목 부위에 도포하였다. 도포방법은 5일 동안 하루에 두 번씩 총 10회에 걸쳐 마우스의 등쪽 목 부위에 도포하여 전처리 한 다음 화합물 48/80을 주사한 후 총 1시간 동안 5분 간격으로 마우스가 뒷발로 목을 긁는 시간을 측정하여 소양증 정도를 측정하였다.

	목을 긁은 회수 (5분)
	5	10	15	20	25	30	35	40	45	50	55	60
마테 발효 추출물	22	24	28	32	35	36	40	43	46	25	20	17
마테 추출물	35	40	45	58	68	78	65	60	51	48	43	31
대조군	39	42	50	62	82	92	97	70	57	52	42	37

아토피 피부염 유발 후 마테 발효 추출물의 항염증 효과를 측정한 결과(표 15), 마테 발효 추출물은 화합물 48/80에 의한 아토피 피부염 (피부 소양증) 유발을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 마테 발효 추출물의 아토피 예방 또는 개선 효과를 확인할 수 있었고, 그로부터 본 발명 조성물의 아토피 예방 또는 개선 효과를 추론할 수 있었다.

실시예 2: 마테 발효 추출물을 함유하는 화장료 제조

본 실시예 2에서는 실시예 1에서 수득한 마테 발효 추출물을 함유하는 화장료를 제조하였다. 제조된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 16에 나타낸 바와 같다.

우선 표 16에 기재되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존하였고, 나)상에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 서서히 냉각하여 크림(실시예 2, 비교예 2)을 제조하였다.

단위: 중량%

원료		실시예 2	비교예 2
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2
나	마테 발효 추출물	1	-
	프로필렌글리콜	5	5
	정제수	100에 대한 나머지	100에 대한 나머지

실험예 17: 화장료의 피부 탄력 개선효과 측정

상기 실시예 2 및 비교예 2의 피부 탄력 개선효과를 측정하기 위해 실험자(20세~35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 2를 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 2를 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

피부 탄력 개선효과를 확인하기 위해 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험결과는 하기 표 17에 Cutometer SEM 575의 △R7 값으로 기재하였는데 R7 값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)을 나타낸다.

실험제품	피부탄력효과(△R7)
실시예 2	0.24
비교예 2	0.11

n=20, p<0.05

화장료의 피부 탄력 개선효과를 측정한 결과(표 17), 마테 발효 추출물을 함유하는 실시예 2를 도포한 실험자의 피부 탄력개선효과가 비교예 2보다 우수한 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 본 발명 피부 외용제 조성물의 우수한 피부 탄력 개선효과를 확인할 수 있었다.

실험예 18: 화장료의 피부 주름 개선효과 측정

상기 실시예 2 및 비교예 2의 피부 주름 개선효과를 측정하기 위해 실험자(20세~35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 2를, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 2를 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

피부 주름개선효과를 알아보기 위하여 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 실리콘 재질의 모사판(replica)을 제작하여 지정 부위의 주름의 상태를 화상분석기인 비지오미터(visiometer: SV60, C+K Electronic Co., Germany)로 측정하였다. 그 결과를 하기 표 18에서 나타내었으며, 표 18은 2개월 후 각각의 파라미터 값에서 2개월 전 파라미터 값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다. 값이 음수로 나올수록 주름 개선효과가 높다는 것을 의미한다.

실험제품	R1	R2	R3	R4	R5
실시예 2	-0.24	-0.15	-0.12	-0.09	-0.07
비교예 2	-0.11	-0.06	-0.05	-0.04	-0.02
R1: 주름 등고선의 최고치와 최저치의 차이 값 R2: 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1 값들의 평균 R3: 5개씩 나눈 R1 값 중 최고치 R4: 주름 등고선의 기선(baseline)에서 각각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값 R5: 주름 등고선의 기선에서 각각의 주름 윤곽을 뺀 값의 평균값

화장료의 피부 주름 개선효과를 측정한 결과(표 18), 마테 발효 추출물을 함유한 실시예 2의 피부 주름 개선효과가 비교예 2보다 우수함을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 본 발명 피부 외용제 조성물의 우수한 주름 개선효과를 확인할 수 있었다.

실험예 19: 화장료의 미백효과 측정

본 실험예 19에서는 실시예 2 및 비교예 2의 미백효과를 측정하기 위해 실험자(20세~35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 2를, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 2를 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

2개월 후, 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 피부색의 변화를 크로마메타(Minolta CR300)를 이용하여 색의 밝기변화(L)를 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안 관찰과 피검자에 의한 주관적 육안 관찰을 실시하여 하기 등급 분류에 따라 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 19에 나타내었고, 미백 효능 정도를 7등급으로 분류하여 평가하였다(-3: 매우 악화, -2: 악화, -1: 약간 악화, 0: 변화 없음, 1: 약간 개선, 2: 개선, 3: 매우 개선).

	피부색의 밝기 변화(L)		숙련자의 객관적 평가		피검자의 주관적 평가
	실시예 2	비교예 2	실시예 2	비교예 2	실시예 2	비교예 2
평균값	4.38	1.81	3.4	2.1	2.4	1.2

화장료의 미백효과를 측정한 결과(표 19), 마테 발효 추출물을 함유하는 실시예 2가 비교예 2보다 미백효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 본 발명 피부 외용제 조성물의 우수한 미백효과를 확인할 수 있었다.

실험예 20: 화장료의 아토피성 피부염에 대한 개선효과 측정

본 실험예 20에서는 실시예 2와 비교예 2의 아토피성 피부염에 대한 개선효과를 비교측정하기 위해 다음과 같이 임상실험을 실시하였다.

5~30세의 아토피 환자로서, 2년 이상 아토피성 피부염을 앓고 있는 환자 30명에 대하여 아토피성 피부염 개선효과를 조사하였다. 동일인에게 왼쪽 손에는 실시예 2를, 오른쪽 손에는 비교예 2를 매일 저녁 세정 후, 피부에 1일 1회 60일간 도포하고 아토피성 피부염 상태 개선 정도를 측정하였다. 측정은 설문조사에 의한 관능평가로 실시하였다. 그 결과는 하기 표 20에 나타내었다.

	매우 좋다	좋다	그저 그렇다
실시예 2	75% (23명)	25% (7명)	0%
비교예 2	9% (2명)	16% (5명)	75% (23명)

아토피성 피부염에 대한 개선효과를 측정한 결과(표 20), 마테 발효 추출물을 첨가하여 제조한 실시예 2가 비교예 2보다 아토피성 피부개선효과가 우수하다는 사실을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 본 발명의 피부 외용제 조성물의 우수한 아토피성 피부염 개선효과를 확인할 수 있었다.

실험예 21 : SLS 에 의한 피부 자극 완화효과 측정

본 실험예 21에서는 실시예 1에서 수득한 마테 발효 추출물을 함유한 화장료의 자극 완화 효과를 인체 첩포 실험으로 평가하였다.

일반적 화장품 처방(크림, 로션, 스킨, 에센스)에 자극을 일으키는 SLS(sodium lauryl sulfate) 1%와 실시예 2를 혼용하여 24시간, 48시간, 72시간 동안 첩포한 후, 자극 유발지수를 바탕으로 자극완화 효과를 평가한 것이다.

20~50세의 건강한 남녀 50명의 팔 상박 부위에 FINN CHAMBER(FINLAND)를 이용하여 제품을 0.3㎎씩 첩포하고, 24시간 후 급성 자극 지수를 평가하였다. 평가 후 재차 동일한 부위에 동량의 제품을 첩포하고 48시간 및 72시간 후의 지연성 자극 지수를 평가하였다.

SLS에 의한 피부 자극 완화효과를 측정한 결과, SLS를 단독으로 첩포한 부분은 24시간 후부터 피부에 붉게 자극이 나타났으나, 마테 발효 추출물을 함유하는 실시예 2는 첩포하고 24시간, 48시간, 72시간 경과 후에도 아무런 피부 발작을 일으키지 않았다.

상기 결과로부터 마테 발효 추출물이 화장료에 혼용되었을 때 자극을 유발시키는 기재(계면 활성제, 향, 알콜)에 의한 피부 자극을 감소시킬 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다.

실시예 3 : 마테 발효 추출물을 함유하는 화장수 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합 용해하였다. 실시예 1에서 수득한 마테 발효 추출물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 마테 발효 추출물을 함유하는 화장수를 제조하였다.

실시예 4 : 마테 발효 추출물을 함유하는 유액 제조

세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열, 혼합 용해하고, 실시예 1에서 수득한 마테 발효 추출물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해시켰다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 유액을 제조하였다.

실시예 5: 마테 발효 추출물을 함유하는 미용액 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히야론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 1에서 수득한 마테 발효 추출물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 미용액을 제조하였다.

Claims

마테(Mate) 추출물을 수득하는 단계;
상기 마테 추출물에 잎새버섯(KCTC 10337BP) 균사체 또는 잎새버섯(KCTC 10337BP) 균사체의 전 배양액을 혼합한 후, 본 배양하는 단계;
상기 본 배양 후, 본 배양액으로부터 잎새버섯(KCTC 10337BP) 균사체를 제거하는 단계;를 거쳐 얻어진 여과액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 여과액의 함량이 피부 외용제 조성물 전체에 대해 0.001~30.0중량%인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 추출시 추출용매로 에탄올이 85~99%(v/v) 함유된 수용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 본 배양 단계는 배양액의 pH를 5.0~6.0으로 조정하고, 잎새버섯(KCTC 10337BP) 균사체를 4~6%(v/v)되도록 접종한 후, 온도 22~32℃, 회전수 120~180rpm, 통기량 1.2~1.8vvm 조건에서 5~7일간 수행하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
청구항 1에 있어서,
피부 외용제 조성물은 피부 미백용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
청구항 1에 있어서,
피부 외용제 조성물은 노화 방지용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
청구항 1에 있어서,
피부 외용제 조성물은 피부자극 완화용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
청구항 1에 있어서,
피부 외용제 조성물은 아토피 피부 개선용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
청구항 1에 있어서,
피부 외용제 조성물은 여드름 예방용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 피부 외용제 조성물은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초 화장료 제형; 수중유형 또는 유중수형의 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류 중에서 선택되어 화장료로 사용하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 피부 외용제 조성물은 경고제(PLASTERS), 로션제(LPTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 첩부제, 서방화제제 중에서 선택되어 약학 조성물로 사용하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.