KR20120079494A - 돼지 육질 형질과 연관성이 있는 에스엔피 마커 및 이를 이용하여 육질이 우수한 돼지를 선별하는 방법 - Google Patents

돼지 육질 형질과 연관성이 있는 에스엔피 마커 및 이를 이용하여 육질이 우수한 돼지를 선별하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 버크셔종을 Multiplex sequencing 분석하여 돼지의 육질형질과 관련된 신규한 유전자형을 확인하고 이들 유전자형을 활용하여 조기에 육질이 우수한 종돈을 선발하는 기법에 관한 것으로서, SNP는 엑손(exon)에 속하는 부위에서의 변이로서 생산물인 단백질에서의 변이도 발생시키며, 이러한 변이는 생체 내 반응기작에 영향을 미치고 유전형질에 영향을 미칠 수 있는 가능성이 매우 높으므로 SNP를 이용하여 육질이 우수한 종돈을 조기에 선발할 수 있다.

Description

돼지의 신규한 유전자 및 육질 형질과 연관성이 있는 에스엔피와 이에 따른 유전자형, 그리고 육질 우수 개체 선별 방법{New SNPs and Genotype associated to meat quality according to variation, and method for identification of high quality pigs}
본 발명은 버크셔종을 Multiplex sequencing 분석하여 돼지의 육질형질과 관련된 신규한 유전자형을 확인하고 이들 유전자형을 활용하여 조기에 육질이 우수한 종돈을 선발하는 기법에 관한 것이다.
한국 소비자의 식육 종류별 선호도는 돼지고기 59%, 닭고기 21.6%, 쇠고기 18.5%, 기타 0.9%로서 돼지고기가 전체 육류 소비량의 절반이상을 차지하고 있는 것으로 보고되고 있다(농림수산식품부, 2006). 또, 돼지고기 중에서도 국내 소비자가 선호하는 부위는 삼겹살 67%, 목심 26%로서 지방 함량이 높은 부위가 압도적으로 우위를 점하고 있는 것으로 조사되고 있다(농협중앙회, 2006).
한편, 국내 소비자의 1인당 연간 돼지고기 소비량은 18.1kg이지만 국산 돼지고기 자급률은 73%에 불과하며, 특히 한미 FTA에 이은 한유 FTA 체결에 따라 값 싼 지방부위의 물량이 더욱 많이 수입될 것으로 판단되고 이에 반비례하여 국내 양돈산업의 경쟁력은 더욱 약화될 것으로 보인다.
따라서 국내 소비자의 기호에 맞는 고품질의 브랜드 돈육을 생산하여 차별화함으로써 수입산 돈육과 경쟁함은 물론 나아가 국내 양돈산업의 경쟁력을 강화시킬 필요가 있다.
상기 과제는 육질이 우수한 버크셔종 유래의 신규한 37개 유전자의 SNP(single nucleotide polymorphism)를 제공하고, 상기 유전자로부터 디자인된 SNP 특이적 프라이머를 제공하며, 이들 프라이머를 이용하여 육질 형질과 관련된 우수 개체를 조기에 선별하여 육종함으로써 달성할 수 있다.
본 발명에 의하면, 육질이 우수한 돼지의 SNP를 선점할 수 있고, 나아가 상기 SNP를 활용하여 육질이 우수한 종돈을 조기에 선발하여 육종할 수 있으므로 국내 양돈산업의 경쟁력을 키울 수 있음은 물론 값 싼 수입 돼지고기와도 충분히 경쟁할 수 있다.
이상에서 상세히 설명된 바와 같이, 본 발명의 신규한 SNP는 돼지의 중요 유전자로서 앞으로 더욱 많은 연구를 통해 경제형질과의 가능성이 매우 높다. 특히 이 유전자들은 엑손부위에서의 변이로서 단백질의 변이를 유발하므로서 돼지에게 중요한 영향을 미칠 수 있을 것이라 판단된다.
또한 일부의 SNP는 본 연구를 통해 분석한 결과에서도 육질 형질과 높은 연관성을 확인할 수 있어 육질이 우수한 고품질 돈육을 생산할 수 있는 종돈의 조기선발에 활용할 가치가 대단히 높은 것이다.
특히 육질 형질은 고도의 유전력을 보유하고 있어 돼지의 중요한 유전자들에 대한 SNP 분석으로 유전자형을 확인하게 된다면 높은 종돈의 개량효과를 확인할 수 있을 것이라 본다. 이들 유전자의 조합으로 다량의 유전자를 한번에 분석하므로서 종돈을 조기 선발한다면 앞으로 세계 무역화 시대를 맞이하여 국제경쟁력을 확보할 수 있는 좋은 발판을 마련하는데 매우 유용할 것이다.
도 1 : 유전자의 SNP를 확인하기 위해 RNA sequencing을 수행하고자 분리한 total RNA의 농도와 순도를 확인한 결과.
도 2는 : 전체 37개 유전자 중 AB529450 유전자에 대해서 Illumina GoldenGate 분석 결과 나타난 유전자형.
본 발명은 버크셔종을 Multiplex sequencing 분석하여 돼지의 육질형질과 관련된 신규한 유전자형을 확인하고 이들 유전자형을 활용하여 조기에 육질이 우수한 종돈을 선발하는 기법에 관한 것이다.
한국인이 선호하는 구이 및 수육 문화에 적합한 돈육을 생산할 수 있는 방안으로 삼겹살이나 목살과 같이 지방함량이 높은 육질을 많이 공급할 수 있는 품종의 돼지 사육에 집중할 필요가 있고 그 방안으로서 버크셔종을 이용하는 방법이 제시되고 있다. 그 이유는 버크셔종이 육질이 부드럽고, 다즙하며, 근내지방도가 우수하고, 고소한 맛을 내는 것으로 보고된 바 있다(종돈개량, 2005). 품종별로 돼지의 등심 부위 육질 형질(Loin meat quality trait)에 대한 능력을 평가한 결과에서도 버크셔종이 가장 우수한 것으로 나타나 국내에서 육종할 고품질 종돈으로서 활용가치가 매우 높다(김, 2005).
육질에 크게 영향을 미치는 요인으로는 육색, 육즙삼출, 조직감, 근내지방도 등이 있는데 이들 형질 간에는 높은 상관관계가 존재하게 된다. 돈육의 육색은 특히 보수성과 관계가 있으며(Offer, 1991), pH는 육의 보존성(keepability), 가열감량 등 다른 많은 기술적인 특성에 영향을 미치기 때문에 가장 중요한 육질특성 중 하나이며(Girard 등, 1986), 육색, 육즙손실, 그리고 보수력과도 상관관계가 알려져 있다(Huff-Lonergan 등, 2002).
육질에 영향을 미치는 형질들은 또한 유전력이 40~60%로 높아 유전자 분석에 따른 우수한 종의 선발은 육종의 개량효과가 크게 나타날 수 있다. 특히 오랜 기간 유전자 지도 작성 연구에 따른 노력의 결과로 경제형질과 연관된 QTL(quantitative trait loci)이 더욱 정확하게 밝혀지게 되었고(Bidanel과 Rothschild, 2002; Liu 등, 2007; Grisart 등, 2002; Winter 등, 2002; van Laere 등, 2003; Takeda 등, 2006), 유용한 후보유전자(candidate gene)에 대한 결과도 많이 알려지고 있다. 후보유전자 분석은 어떤 유전자가 형질의 생리적인 기초에 의해 선발되었을 때 이용되어 형질의 능력에 영향을 미치는 것으로 추정된다(Rothschild와 Soller, 1997). 이러한 유전적 요인에 의한 개량의 효과는 경제형질 관련 유전자나 유전자군의 기능에 대한 이해가 증가함에 따라 더욱 높아지게 되었다(Rothschild, 2004).
현재까지 알려진 육질에 관련된 유전자들은 HAL 혹은 RYR1 유전자(Fujii 등, 1991) 그리고 RN-(LeRoy 등, 1990; Milan 등, 2000; Looft 등, 2000)를 포함한다. 현재까지 육질 관련 형질에 유의성이 있는 영향을 미치는 염색체 부위로서는 1번, 5번, 6번, 7번, 8번, 12번, 15번, 17번 그리고 X에서 검정되었다(Bidanel 와 Rothschild, 2002). 그 중 전체 게놈 QTL 분석을 통해 육질 형질 중 연도와 관련된 4와 14번 염색체, 육색과 관련된 5와 6번, 그리고 X염색체, 그리고 conductivity에 대한 16번 염색체의 관련성을 보고하였다(Harmegnies 등, 2006).
미래사회에서는 유전자에 대한 소유권의 선점이 대단히 중요한 역할을 수행하게 된다. 특히 어떠한 형질과 연관을 나타내는 유전자와 이를 활용한 분석기술의 가치는 엄청나게 높다고 할 수 있다. 그러므로 본 발명에서 확인된 유전자의 변이는 대단히 중요한 자료가 될 수 있고, 특히 세계적으로 확인되지 않은 신규한 SNP의 선점은 앞으로의 돼지 연구에 높은 가치가 있다고 할 수 있다.
그러므로 본 발명에서는 고품질 돈육을 생산하기 위해 버크셔종을 이용하여 아래와 같은 단계를 거쳐 유전자의 변이를 확인하였고, 대량분석을 통해 신규한 SNP를 확보할 수 있었다. 또한 이들 SNP에 대해 육질 형질과의 연관성을 확인하여 육질 우수 개체를 조기에 선발할 수 있게 되었다.
본 발명은 돼지의 모근, 혈액 등의 시료로부터 분리한 genomic DNA를 이용하여 37개 유전자 각각에 대한 특이적 프라이머를 사용하여 Multiplex sequencing으로 나타나는 peak를 확인하며 그 결과로부터 어떠한 유전자형인지 검증하는 특징이 있다. 나아가, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 37개 유전자의 SNP를 감별하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
(1) 돼지 시료로부터 gDNA를 얻는 단계;
(2) 상기 단계 (1)에서 얻어진 gDNA를 주형으로 하고, 표 2에 나타낸 primer(Oligo1, Oligo2, Oligo3)를 사용하여 PCR을 수행하는 단계
(3) 상기 단계 (2)에서 얻어진 반응물을 Illumina GoldenGate 기법을 이용하여 VeraCode BeadPlate를 스캔 확인하는 단계.
(4) 상기 단계 (3)에서 얻어진 스캔 결과물을 BeadStudio software (Illumina)를 사용해서 유전자형을 확인 및 분류하는 단계
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명하지만, 본 발명의 범위가 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
1. 실험동물
실험동물은 다산종돈(전북 남원시 운봉읍 가산리 64-2, 대표 박화춘)에서 동일한 환경에서 사육된 버크셔 종돈 480두를 선발하여 도축장에서 도축하여 이용하였다. 육질 분석을 위해 도축된 돼지는 24시간 동안 냉동실에 보관한 후, 등심 조직을 절단하였고, 동일개체의 도축시 10cc정도의 혈액을 EDTA가 함유된 튜브에 채취하였다. 그리고 돼지에서 SNP 존재여부를 확인하기 위한 RNA sequencing 분석에 이용하기 위해 랜드레이스, 요크셔, 듀록, 버크셔 4 품종을 도축하여 간 조직을 채취하였다.
2. 육질 형질 분석
등심의 일반성분 분석은Anderson 등(2007)의 방법에 따라 단백질, 지방, 수분, 그리고 콜라겐의 함량을 각각 일반적인 방법에 따라 측정하였다. 드립감량(drip loss), 가열감량(Cooking loss), 그리고 전단력 분석은 각각 일반적인 분석 방법으로 측정하였다. 보수력(Water holding capacity; WHC)은 Laakkonen 등(1970)의 방법을 약간 변형한 Park 등(2001)의 방법에 의하여 측정하였다. 육색은 등심을 절개하여 30분 노출시킨 후 Chroma meter (Minolta Co. CR 300, Japan)로 CIE(Commision Internationale de Leclairage) L*, a*, b* 값을 9반복으로 측정하였고, 이때의 표준판은 Y=92.40, x = 0.3136, y = 0.3196의 백색 타일을 사용하였다. 시료의 pH 측정은 도축 후 45분(pH45)과 24시간(pH24)에 도체 pH meter(pH*K21, NWK-BinGmbH Co., Germany)로 측정하였다.
3. 돼지로부터 genomic DNA의 분리
채취한 혈액은 Wizard genomic DNA purification kit (promega, USA)를 이용하여 genomic DNA를 분리하였다. 혈액 300㎕에 cell lysis solution 900㎕을 첨가하여 invert 한 후에 상온에 정치시켰다. 15분 후 13,000rpm에서 5분간 원심 분리하여 white pellet만 남겨두고 상층액을 버렸다. 남은 White pellet을 voltex로 충분히 풀어 준 후 nucleic lysis solution 300㎕를 첨가하여 피펫으로 잘 섞어주었다. 80㎕ Protein precipitation solution을 첨가하여 voltex로 단백질 등을 제거하였다. 맑은 상층액을 새 튜브로 옮겨 Ethanol down 과정을 거쳐 DNA를 분리하였다. 채취한 시료가 모근이나 조직 등 기타 다른 부위일 경우에도 동일한 genomic DNA 분리 과정을 거쳐 이용하면 된다.
4. RNA sequencing을 통한 돼지 SNP 확인
우선 돼지의 SNP 존재여부를 확인하기 위해 랜드레이스, 요크셔, 듀록, 버크셔 4개 품종의 돼지에 대해 RNA를 분리하였다. Total RNA는 각 개체의 간 조직을 채취하여 homogenizer로 분쇄한 후 Trizol 시약(MRC Inc.)을 사용하여 일반적인 방법으로 순수 분리하였다. 분리된 total RNA는 분석에 용이한 농도와 순도를 확인하였다(그림 1). 이 검증에 통과된 RNA를 이용하여 RNA sequencing 을 실시하였고(DNA Link(주)), 전사체상에서 4 품종에서 차이가 나타나는 SNP가 있는 유전자를 확인하였다.
5. Illumina GoldenGate에 의한 Multiplex sequencing 분석
RNA sequencing 분석은 4두의 개체분석으로 확인된 돼지의 SNP이므로 SNP 유무에 대한 정확성을 확인하기 위해 이중 37개 유전자를 선발하여 437두 버크셔종을 이용하여 GoldedGate 기법(Illumina)에 의한 multiplex sequencing 분석을 실시하였다. 37개 유전자의 각 SNP 위치에 특이적인 2개의 allele-specific oligos(ASO)와 유전자에 특이적인 locus-specific oligo (LSO)를 genomic DNA와 함께 PCR한다. 그러면 이들은 SNP에 대해 각각 ASO에 특이적인 결과물을 생산하게 된다. 만약 1개의 SNP가 A/G 변이를 가진다면, A 유전자형을 가지는 개체는 A-ASO(프라이머 1)와 반응하게 되고, G 유전자형을 가지는 개체는 G-ASO(프라이머 2)와 반응하게 된다. 이들 프라이머에는 각각 Cy3-와 Cy5- 라는 형광물질을 붙여두어서 VeraCode Beadplate에 혼성화시킨 후 이것을 Illumina BeadXpress Reader에서 스캔하면 붙여진 형광물질에 따라 어떠한 유전자형을 가지는지 확인할 수 있게 된다. 이 분석방법은 96-plex와 384-plex 규모의 mulitple plate를 사용함으로써 이용한 plate의 규격에 따라 각각 한번에 96개, 384개의 유전자에 대한 SNP를 확인할 수 있게 된다(Illumina, Technical note). 본 연구에서는 96-plex를 이용하였고, 96개 유전자 중 37개 유전자에 대해서 결과를 확인할 수 있었다.
6. 각 SNP의 개체별 유전자형 분석
Plate 혼성화로 얻어진 결과는 437두 개체 각각의 SNP를 확인하기 위해 Illumina의 GenomeStudio data analysis 소프트웨어를 이용하였다. 유전자 각각에 대해 붙여진 형광물질의 종류(Oligo 1과 Oligo 2)를 확인하여 만약 A/G 변이라면 AA, AG, 그리고 GG 유전자형을 개체별로 분석하였다. 이 분석법은 48개의 분석 컨트롤이 존재하여 결과에 대한 정확성을 높이게 된다.
7. 통계분석
이용된 버크셔 480두 개체의 도체성적 및 육질 분석 결과와 37개 유전자 각각의 genotype간의 연관성을 확인하기 위해 통계분석을 실시하였다.
우선 Kolmogorov-Smirnov Test로 형질별 정규성을 확인한 후, 정규성을 만족하는 형질의 경우(육의 명도, 적색도, pH45L)에는 Student's t-test(2그룹간 분석)과 Anova test(3그룹 간 분석)를 실시하였고, 비정규성인 경우(등지방두께, 도체중, 황색도, 사후24시간 pH, 보수력, 지방함량, 수분함량, 단백질함량, 콜라겐 함량, 드립감량, 가열감량, 전단력, pH45B)에는 Mann-Whitney test(2그룹간 분석)과 Kruskal Wallis test(3그룹간 분석)로 연관성을 확인하였다.
표1은 실험에 이용한 437두의 전체 도체 및 육질 형질 분석 결과를 나타낸다.
<표 1>
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표 2는 본 발명에서 확인된 37개 유전자에 대한 SNP 정보와 각 SNP 특이적으로 증폭할 수 있는 allele-specific Oligomer(Oligo1과 Oligo 2)와 유전자에 특이적인 Locus-specific Oligomer에 대한 염기서열, 그리고 이들의 PCR 분석을 통해 증폭되어지는 유전자의 염기서열을 나타낸다.
<표 2>
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표 3은 돼지의 중요 37개 유전자의 SNP의 437두 개체와의 육질 형질과의 상관관계 분석 결과이다. 각 유전자는 우성인지, 열성인지, 그리고 공우성인지 확인할 수 없으므로 세 가지 모델로 구분하여 형질에 미치는 영향을 각각 통계분석하여 유의적인 연관성이 있는지를 확인하였다(p<0.05, p<0.01).
<표 3>
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표 4는 실험동물로 이용한 다산육종의 버크셔 437두의 37개 유전자의 유전자형과 에 대한 도체 형질(성별, 등지방두께, 도체중) 및 육질 형질(그 외 전체 형질) 분석 결과를 나타낸 것이다. 육질형질은 육질에 가장 큰 영향을 미치는 요인인 도축 24시간 후 pH(pH24), 가열감량(Cooking loss), 보수력(WHC, water holding capacity)을 비롯하여 육의 성분을 분석하여 국내 소비자의 선호에 가장 중요한 역할을 하는 근내지방함량(fat content)까지 모두를 포함하고 있다.
통계분석을 통해 각 유전자는 육질 형질과의 유의성이 확인되었다(*p<0.05, **p<0.01).
<표 4>
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위와 같은 통계분석을 통해 각 유전자는 육질 형질과의 유의성이 확인되었다(*p<0.05, **p<0.01).
<표 5> 37개 유전자의 SNP 유전자형을 이용한 육질형질을 분석
Figure pat00136

Claims (3)

  1. 서열번호 1 내지 37의 염기서열을 갖는 알렐레 특이성 프라이머(allele specific primer(oligo1)) 세트 또는 서열번호 38 내지 74의 염기서열을 갖는 알렐레 특이성 프라이머(oligo2) 세트에서 선택되는 것을 특징으로 하는 육질이 우수한 우량 돼지 선별을 위한 프라이머 세트.
  2. 서열번호 1 내지 37의 염기서열을 갖는 프라이머 세트에 의해 증폭되어 얻어진 SNP 마커 또는 서열번호 38 내지 74의 염기서열을 갖는 프라이머 세트에 의한 중합연쇄반응(PCR)을 통해 얻어진 SNP 마커 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 육질 연관 다형성(SNP) 마커.
  3. 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 육질이 우수한 종돈을 선별하는 방법:
    (1) 돼지 시료로부터 gDNA를 얻는 단계;
    (2) 상기 단계 (1)에서 얻어진 gDNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 37의 염기서열을 갖는 알렐레 특이성 프라이머(oligo1) 또는 서열번호 38 내지 74의 염기서열을 갖는 알렐레 특이성 프라이머(oligo2)를 사용하여 PCR을 수행하는 단계;
    (3) 상기 단계 (2)에서 얻어진 반응물을 일루미나 골든게이트(Illumina GoldenGate) 기법을 이용하여 베라코드 비드플레이트(VeraCode BeadPlate)를 스캔 확인하는 단계; 및
    (4) 상기 단계 (3)에서 얻어진 스캔 결과물을 비드스투디오 소프트웨어(BeadStudio software (Illumina))를 사용해서 유전자형을 확인 및 분류하는 단계.
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