KR20120047912A - 암 요법에서 항ｅｇｆｒ 항체의 효능을 결정하기 위한 바이오마커 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 EGFR 발현 암의 치료에서 항-EGFR 항체의 효능을 결정하기 위한 방법 및 유전자 발현 산물에 기초한 바이오마커에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특정 항-EGFR 항체로 상기 환자의 치료하는 것에 대해 EGFR 발현 암을 앓고 있는 환자의 민감성 및 저항성을 예측하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 바람직하게는 KRAS 야생형 종양 환자에서 항-EGFR 항체로 치료하는 것의 임상적 결과를 보다 양호하게 예측하게 하는 각 바이오마커의 동정에 관한 것이다. 본원에서, 본 발명은 특히 항-EFGR 항체 c225/세툭시마브 (Erbitux®) 및 대장암 (CRC) 을 앓고 있는 환자에서 이의 용도에 관한 것이다.

Description

암 요법에서 항­ＥＧＦＲ 항체의 효능을 결정하기 위한 바이오마커 및 방법{BIOMARKERS AND METHODS FOR DETERMINING EFFICACY OF ANTI­EGFR ANTIBODIES IN CANCER THERAPY}
본 발명은, EGFR 발현 암의 치료에서 항-EGFR 항체의 효능을 결정하기 위한 방법 및 유전자 또는 유전자 발현 산물에 기초한 바이오마커에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특정 항-EGFR 항체로 상기 환자를 치료하는 것에 대해, EGFR 발현 암을 앓고 있는 환자의 민감성 또는 저항성을 예측하는 것이다. 본 발명은 바람직하게는 KRAS 야생형 종양을 갖는 환자에서 항-EGFR 항체로 치료하는 것의 임상 결과의 보다 양호한 예측을 허용하는 각각의 바이오마커의 동정에 관한 것이다. 특히, 본 문맥에서, 본 발명은 특히 대장암 (colorectal cancer; CRC) 을 앓고 있는 환자에서의 항-EFGR 항체 c225/세툭시마브 (Erbitux®) 및 이의 용도에 관한 것이다.
모노클로날 항체는 통상적으로 암 치료에 사용된다. 항체가 본 보건당국에 비싸게 청구되는 약물이고, 종종 원치않는 부작용을 야기하기 때문에, 이는 심각한 병 및 종종 불치병을 앓고 있는 환자에게 스트레스 및 추가적인 부담감을 유발하게 되며, 특정 항체 약물로 특정 환자를 치료하는 것이 실제로 환자의 상태를 개선시키거나 심지어 환자를 치료할 수 있는가를 미리 아는 것이 바람직하다. 특정 약물 및/또는 치료 처방계획이 질병을 치료하는데 성공적일 수 있는 가에 대한 예후를 산출하기 위해 사용되는 몇 개의 임상적 및 조직학적 파라미터가 이미 존재한다. 그러나, 종양은 종종 개인에 따라 변할 수는 다양한 유전학적 패턴을 끌어내는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 첫 번째 환자의 임상적 병태를 개선시킬 수 있는 특정 약물 또는 특정 치료는 동일한 암을 앓고 있는 두 번째 환자에서 덜 효과적이거나 효과적이지 않다. 예를 들어, 대장암을 앓고 있는 환자는 어떠한 특정 항체 약물에 상이하게 반응할 수 있다. 최악의 경우, 특정 환자 군은 그 약물에 전혀 반응하지 않는 반면, 또다른 환자 군은 상이한 유전학적 종양 패턴 및 배치에 의존적인 그에 대한 만족스러운 치료학적 반응을 이끌어낸다.
비록 현대 분자 생물학 및 생화학이 수백개의 유전자, 종양 세포의 거동에 영향 미치는 이의 활성, 이들의 분화 상태, 및 특정 치료 약물, 예컨대 항체에 대한 민감성 또는 저항성을 밝혀냈지만, 이들 유전자의 상태는 통상적으로 약물 치료에 대한 임상 판단을 일상적으로 하게 될 목적으로 개발되지 않았다. 예외적인 것은, Her2 길항제 약물 Herceptin®(Genentech) 로 환자를 선별하기 위한 유방 암종에서의 ErbB2 (Her2) 단백질 발현의 사용이다. 또다른 예외적인 것은, EGFR 발현 종양의 KRAS 유전자에서 돌연변이가 항-EGFR 항체에 반응하거나 민감한 것이 부족한 것과 연계되었다는 것을 발견하는 것이다 (Allegra et al. 2009, J Clin Oncol [Epub ahead of print]).
요법을 위해 환자를 선별하는 것을 촉진하는 신규한 예후 및 예측 마커가, 병원에서 소 분자 또는 생물학적 분자 약물과 같은 치료에 반응하는 환자를 보다 양호하게 예측하기 위해 요구되고 있다. 환자 샘플의 분류는 암 진단 및 치료의 결정적인 양상이다. 분자 및 유전적 마커로 치료하는 것에 대한 환자의 반응의 연계는, 반응이 없는 환자에서 치료의 개발의 여지를 남길 수 있거나, 효능에서 보다 높은 자신감으로 인해 다른 치료 선택 중에서 치료의 징후를 구별할 수 있다. 또한, 약물 또는 약물의 조합 또는 특정 처방계획에 잘 반응할 것 같은 환자를 예비-선별하는 것은, 임상 연구에서 필요한 환자의 수를 감소시킬 수 있거나 임상 개발 프로그램을 완료하는데 필요한 시간을 앞당길 수 있다.
표피 생장 인자 수용체 (EGFR) 및 이의 다운스트림 시그널링 효과기, 특히 Ras/Raf/MAP 키나아제 경로의 구성원은 정상 및 악성 상피 세포 둘 모두에서 생물학적으로 중요한 역할을 하고(Normanno et al., 유전자 366, 2-16 (2006)) 따라서 치료학적 개발을 위해 수립된 표적이 된다.
수 개의 모노클로날 키메라화, 인간화 또는 완전한 인간 모노클로날 항체 (EGFR 를 인식하고 저해함) 가 개발되어 왔다. 그 동안 시판되고 있는 항체의 2 개의 예는 세툭시마브 (ERBITUX®) 및 파니투무마브 (VECTIBIX®) 이다.
항-EGFR 항체 c225 (세툭시마브), 키메라화 IgG1 는 EGF-중재 종양 세포 성장 (시험관내) 을 저해하고 인간 결장직장 종양 성장 (생체내) 을 저해하는 것으로 입증되었고 2003 년에 승인받았다. 이의 서열은 우선 WO 96/40210 에 개시되어 있다. 항체 및 일반적으로 모든 항-EGFR 항체는 무엇보다도 이종이식 마우스 모델에서 인간 종양 (생체내) 을 근절하기 위한 임의의 화학요법제 (즉, 독소루비신, 아드리아마이신, 탁솔, 및 시스플라틴) 와 상승효과를 내면서 작용하는 것으로 보인다 (예: EP 0667165). 게다가, 항-EGFR 항체 c225 와 제 2 인간화 항-EGFR 항체 마투주마브 (Mab h425) 와의 조합은, 시험관내 모델에서 상승 효과를 내는 것으로 나타났고, 이들 2 개의 항체가 비록 동일한 수용체로 향할지라도 수용체 상에서 상이한 에피토프에 결합함을 보여준다 (WO 2004/032960).
과거에, 각각의 소 분자 저해제 또는 세툭시마브를 포함하는 항-EGFR 항체로 치료된 환자의 약 75% 가 치료 시작 직후 어느정도 심각한 피부 발진으로 발전하는 것으로 나타났다. 비록 참을만하고 관리될 수 있으나, 약 10% 의 환자는 심각한 증상으로 인해 투여 중단 및/도는 투여량 감소가 요구되었고, 몇몇 환자는 요법을 중지했다. 피부독성과 EGFR 저해제에 대한 유리한 임상 결과의 높은 명백한 연계는, 치료학적 이점을 겪은 환자에서 바람직하나 잠재적으로 고질적인 독성인 발진이 "달성"되게 하며, 때때로 이들 작용제의 이용을 제한하게 된다. 그럼에도 불구하고, 항-EGFR 항체 치료 동안 피부 발진의 발생은 상기 항체, 예를 들어, 세툭시마브로 치료하는 것에 대해 치료학적으로 반응하는 것에 대한 신뢰할만한 대용 마커로서 취할 수 있다.
그러나, 대용 마커로서 피부 발진 발생을 선택하는 것은, 항-EGFR 항체로 치료하는 것에 일반적으로 반응하지 않는 암 환자의 확인이, 약물을 환자에게 보다 장기간 동안 투여하기 전에 가능하지 않기 때문에 최적이 아니다.
그러므로, EGFR 발현 종양에서 KRAS 유전자 (코돈 12/13) 및 유전자 산물의 돌연변이가 EGFR 저해제로 전이성 대장암의 치료에 민감하지 않는 것에 책임이 있다는 것을 발견한 것은, 치료가 성공적일지 그렇지 않을지에 대한 예측을 개선시키는 것으로 여겨질 수 있다. WO 2008/112269 는 오직 KRAS 야생형 종양 환자에서만 효과적인 인간 항-EGFR 항체인 파니투무마브를 보고하고 있다. 문헌 [Khambata-Ford et al. (2007, J. Clin. Oncol. 25, 3230)] 은 에피레귤린 및 암피레귤린의 높은 유전자 발현 수준을 갖는 전이성 대장암 환자, 및 야생형 KRAS 종양을 갖는 환자가 세툭시마브 치료 상에서 질병이 제어되기가 보다 쉽다는 것을 기재하고 있다.
상기 언급된 최근 이점에도 불구하고, 결과를 최적화하기 위해 발병학적 및/또는 유전적 마커에 기초한 특정 치료 처방계획을 위해 환자를 선별하는 것이 암 치료에서 주요 도전과제로 남아 있다. 이들 종양의 성장을 저해하는 항-EGFR 항체로 EGFR 발현 종양을 치료시, 이들 항체로 의도한 치료에 반응할 수 있는 환자를 보다 이해하고 잘 아는 것이 도움이 되며, 특히 모든 환자가 아닌 (약 40%) 심지어 KRAS-야생형 종양 군에서 항-EGFR 항체 및 다른 EGFR 저해제로 치료하는 것에 잘 반응한다는 새로운 발견 측면에서 그러하다.
그러므로, 개개인의 상이한 종양 유전자형을 포함하는 다양한 치료 선택사항에 반응하는 환자에 대한 예측 정보를 제공할 수 있으면서 바이오마커를 사용하는 진단 시험, 방법 및 툴에 대한 필요성이 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 암의 치료에서 항-EGFR 항체의 효능을 결정하기 위한 예측성 바이오마커를 개시하고 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, KRAS 야생형 환자 또는 KRAS 유전자에서 돌연변이를 갖는 환자의 종양 치료에서 항-EGFR 항체의 효능을 환자에게 투여 전에 예측하기 위해 사용될 수 있는 특정 바이오마커가 기재되어 있다.
본 발명의 추가의 구현예에서, KRAS 유전자에서 돌연변이가 없는 (KRAS 야생형) 환자에서 종양 치료에서 항-EGFR 항체의 효능 정도 또는 보다 정확한 효능을 예측하기 위해 사용될 수 있는 특정 바이오마커가 개시되며, 이는 통상적으로 항-EGFR 항체 요법에 양성 반응한다 (통계적으로, 반드시는 아님).
본 발명의 또다른 구현예는, 대장암 (CRC), 바람직하게는 전이성 대장암 (mCRC), 편평상피 세포 두경부암 (SCCHN) 또는 비-소세포 폐암 (NSCLC) 을 앓고 있는 환자에서 항-EGFR 항체 치료에 반응하는 양호한 (양성적 바이오마커) 또는 불량한 (음성적 바이오마커) 의 높은 가능성을 나타내는 바이오마커에 관한 것이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 항-EGFR 항체 세툭시마브 (Erbitux®) 로 종양 관련 (고형 또는 전이성 종양) 요법의 효능 또는 비-효능에 대한 예측성인 바이오마커가 개시된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 항-EGFR 항체 세툭시마브 (Erbitux®) 로 종양 관련 (고형 또는 전이성 종양) 요법 (이때 종양은 CRC, mCRC, SCCHN 또는 NSCLC 임) 의 효능 또는 비-효능에 대한 예측이 개시된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서 항-EGFR 항체 세툭시마브 (Erbitux®) 로 종양 관련 (고형 또는 전이성 종양) 요법 (이때 종양은 CRC, mCRC, SCCHN 또는 NSCLC 이고, 이때 상기 암을 앓는 환자는 바람직하게는 개별 KRAS 야생형 유전자 패턴을 나타냄) 의 효능 또는 비-효능에 대한 예측이 개시된다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 EGFR 항체로 치료하기 위한 후보자인, KRAS 야생형 EGFR 발현 종양을 앓고 있는 환자가 상기 항-EGFR 항체로 치료하는 것에 반응하거나 반응하지 않을 가능성을 진단 수단 및/또는 진단 장치에 의해 예측하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법은 상기 환자로부터 수득되는 조직 샘플에서 하나 이상의 예후 유전자 또는 이의 유전자 발현 산물의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하고, 이때 유전자/유전자 산물의 높은 또는 낮은 발현을 임상 관련 참조 값과 비교하는 것은 환자가 치료에 반응할 것 같다거나 치료에 반응하지 않을 것 같다는 것을 나타낸다.
항-EGFR 항체, 바람직하게는 세툭시마브로 치료하는 것에 반응할 가능성이 높거나 반응하게 되는 종양 환자의 샘플에서 높은 발현을 야기하는 유전자 또는 유전자 산물은, 본 발명에 따라 하기로 이루어진 유전자 군으로부터 선택된다: ADAMDEC1, BSDC1, C1orf144, CAPZB, CDC42, DHCR7, DNAJC8, ECSIT, EXOSC10, FADS1, GBA, GLT25D1, GOSR2, IMPDH1, KLHL21, KPNA6, KPNB1, LSM12, MAN1B1, MIDN, PPAN, SH3BP2, SQLE, SSH3, TNFRSF1B, URM1, ZFYVE26, RGMB, SPIRE2, ABCC5, ACSL5, AOAH, AXIN2, CD24, CEACAM5, CEACAM6, ETS2, FMNL2, GPSM2, HDAC2, JUN, ME3, MED17, MYB, MYC, NEBL, NOSIP, PITX2, POF1B, PPARG, PPP1R14C, PRR15, PSMG1, RAB15, RAB40B, RNF43, RPS23, SLC44A3, SOX4, THEM2, VAV3, ZNF337, EPDR1, KCNK5, KHDRBS3, PGM2L1, STK38, 및 SHROOM2.
항-EGFR 항체, 바람직하게는 세툭시마브로 치료하는 것에 반응할 가능성이 낮거나 반응하지 않는 종양 환자의 샘플에서 높은 발현을 야기하는 유전자 또는 유전자 산물은, 본 발명에 따라 하기로 이루어진 유전자 군으로부터 선택된다: C7orf46, CAST, DCP2, DIP2B, ERAP1, INSIG2, KIF21A, KLK6, NGRN, NRIP1, PHGDH, PPP1R9A, QPCT, RABEP1, RPA1, RPL22L1, SKP1, SLC25A27, SLC25A46, SOCS6, TPD52, ZDHHC2, ZNF654, ASB6, ATM, BMI1, CDC42EP2, EDEM3, PLLP, RALBP1, SLC4A11, TNFSF15, TPK1, C11orf9, C1QC, CABLES1, CDK6, EHBP1, EXOC6, EXT1, FLRT3, GCNT2, MTHFS, PIK3AP1, ST3GAL1, TK2, ZDHHC14, ARFGAP3, AXUD1, CAPZB, CHSY1, DNAJB9, GOLT1B, HSPA5, LEPROTL1, LIMS1, MAPK6, MYO6, PROSC, RAB8B, RAP2B, RWDD2B, SERTAD2, SOCS5, TERF2IP, TIAL1, TIPARP, TRIM8, TSC22D2, TGFA, VAPA, 및 UBE2K, (참조 값과 비교시 상기 치료에 반응할 것 같지 않은 환자를 나타냄).
본 발명의 또다른 구현예에서, 바람직한 바이오마커 (이는 상기-평균 발현되고 각 항-EGFR 항체 (예: 세툭시마브) 로 치료하는 것에 반응할 것 같거나 반응할 것이 우세한 환자를 나타냄) 는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: EPDR1, KCNK5, KHDRBS3, PGM2L1, SHROOM2, STK38, RGMB, SPIRE2 및 VAV3 또는 상기 군의 각 유전자 발현 산물.
본 발명의 또다른 구현예에서, 바람직한 바이오마커 (상기 평균 발현되고 각 항-EGFR 항체 (예: 세툭시마브) 로 치료하는 것에 반응하지 않을 것 같거나 반응하지 않을 것이 우세한 환자를 나타냄) 는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: ASB6, ATM, BMI1, CDC42EP2, EDEM3, PLLP, RALBP1, SLC4A11, TNFSF15, TPK1, ARFGAP3, AXUD1, CAPZB, CHSY1, DNAJB9, GOLT1B, HSPA5, LEPROTL1, LIMS1, MAPK6, MYO6, PROSC, RAB8B, RAP2B, RWDD2B, SERTAD2, SOCS5, TERF2IP, TIAL1, TIPARP, TRIM8, TSC22D2, TGFA, VAPA, 및 UBE2K 또는 상기 군의 각 유전자 발현 산물.
추가의 구현예에서, 항-EGFR 항체에 환자의 양성적 반응을 예측하는 본 발명에 따른 바람직한 바이오마커는 VAV3 이고, 항-EGFR 항체에 환자의 음성적 또는 무시할만한 반응을 예측하는 본 발명에 따른 바람직한 바이오마커는 TGFa 이다.
또다른 구현예에서 각 방법이 적용되고, 이때 환자가 항-EGFR 항체, 바람직하게는 세툭시마브로 치료하는 것에 특별히 또는 우세하게 또는 아마도 잘 반응할 것임을 나타내는 (각 평균 환자 코호트로부터 계산된 임상 평균 또는 표준 반응 및/또는 발현 값과 비교시) 하나 이상의 상당히 또는 높게 발현되는 청구항 및 상기에서 구체화되는 바와 같은 제 1 바이오마커가 사용되고, 환자가 항-EGFR 항체 바람직하게는 세툭시마브 (각 평균 환자 코호트로부터 계산된 임상 평균 또는 표준 반응 및/또는 발현 값과 비교시) 로 치료하는 것에 특별히 또는 우세하게 또는 아마도 잘 반응하지 않을 것임을 나타내는 하나 이상의 상당히 또는 높게 발현되는 청구항 및 상기에서 구체화되는 바와 같은 제 2 바이오마커가 사용된다.
또다른 구현예에서 각 방법은 KRAS 야생형 EGFR 발현 종양을 앓고 있고 EGFR 항체로 치료하는 것에 대한 후보자인 환자가 상기 항-EGFR 항체에 반응할 가능성을 예측하기 위한 시험관내 방법에 적용되며, 이때 상술 및 후술되는 바이오마커의 하나 이상의 발현 수준은 항-EGFR 항체, 바람직하게는 세툭시마브로 종양 환자를 치료하는 맥락에서 AREG 및/또는 EREG 와의 조합으로 결정된다.
바람직하게는, VAV3 및 ARAG 또는 EREG 의 유전자 또는 유전자 산물 발현 수준이 종양 환자, 바람직하게는 CRC 또는 mCRC 종양 환자를, 항-EGFR 항체, 바람직하게는 세툭시마브로 치료하는 맥락에서 결정되는 각 방법이 적용된다.
또한 특정 구현예에서, VAV3 및 ARAG 또는 EREG 의 유전자 또는 유전자 산물 발현 수준이 종양 환자, 바람직하게는 CRC 또는 mCRC 종양 환자를, 항-EGFR 항체, 바람직하게는 세툭시마브로 치료하는 맥락에서 결정되는 각 방법이 적용된다.
본 발명에 따른 또다른 바람직한 구현예에서, TGFa 및 ARAG 또는 EREG 의 유전자 또는 유전자 산물 발현 수준이 종양 환자, 바람직하게는 CRC 또는 mCRC 종양 환자를, 항-EGFR 항체, 바람직하게는 세툭시마브로 치료하는 맥락에서 결정되는 각 방법이 적용된다.
본 발명에 따른 또다른 바람직한 구현예에서, VAV3 및 TGFa 의 유전자 또는 유전자 산물 발현 수준이 종양 환자, 바람직하게는 CRC 또는 mCRC 종양 환자를, 항-EGFR 항체, 바람직하게는 세툭시마브로 치료하는 맥락에서 결정되는 각 방법이 적용된다.
본 발명에 따른 또다른 바람직한 구현예에서, VAV3, TGFa 및 ARAG 또는 EREG 의 유전자 또는 유전자 산물 발현 수준이 종양 환자, 바람직하게는 CRC 또는 mCRC 종양 환자를, 항-EGFR 항체, 바람직하게는 세툭시마브로 치료하는 맥락에서 결정되는 각 방법이 적용된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는, KRAS 야생형 EGFR 발현 암을 앓고 있는 환자가 항-EGFR 항체, 바람직하게는 세툭시마브로 치료하는 것에 치료학적으로 반응할 가능성을 예측하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다:
(a) 상기 환자의 종양 조직 또는 혈장으로부터의 생검 조직 샘플에서 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 진단 수단 및/또는 진단 장치로 측정하는 것:
군 (i) : ADAMDEC1, BSDC1, C1orf144, CAPZB, CDC42, DHCR7, DNAJC8, ECSIT, EXOSC10, FADS1, GBA, GLT25D1, GOSR2, IMPDH1, KLHL21, KPNA6, KPNB1, LSM12, MAN1B1, MIDN, PPAN, SH3BP2, SQLE, SSH3, TNFRSF1B, URM1, ZFYVE26, RGMB, SPIRE2, ABCC5, ACSL5, AOAH, AXIN2, CD24, CEACAM5, CEACAM6, ETS2, FMNL2, GPSM2, HDAC2, JUN, ME3, MED17, MYB, MYC, NEBL, NOSIP, PITX2, POF1B, PPARG, PPP1R14C, PRR15, PSMG1, RAB15, RAB40B, RNF43, RPS23, SLC44A3, SOX4, THEM2, VAV3, ZNF337, EPDR1, KCNK5, KHDRBS3, PGM2L1, STK38, SHROOM2, 및/또는
군 (ii) : C7orf46, CAST, DCP2, DIP2B, ERAP1, INSIG2, KIF21A, KLK6, NGRN, NRIP1, PHGDH, PPP1R9A, QPCT, RABEP1, RPA1, RPL22L1, SKP1, SLC25A27, SLC25A46, SOCS6, TPD52, ZDHHC2, ZNF654, ASB6, ATM, BMI1, CDC42EP2, EDEM3, PLLP, RALBP1, SLC4A11, TNFSF15, TPK1, C11orf9, C1QC, CABLES1, CDK6, EHBP1, EXOC6, EXT1, FLRT3, GCNT2, MTHFS, PIK3AP1, ST3GAL1, TK2, ZDHHC14, ARFGAP3, AXUD1, CAPZB, CHSY1, DNAJB9, GOLT1B, HSPA5, LEPROTL1, LIMS1, MAPK6, MYO6, PROSC, RAB8B, RAP2B, RWDD2B, SERTAD2, SOCS5, TERF2IP, TIAL1, TIPARP, TRIM8, TSC22D2, TGFA, VAPA, 및 UBE2K,
(b) 상기 항-EGFR 항체로 상기 환자의 종양 또는 혈장으로부터 조직 샘플을 생체-외 (ex-vivo) 노출시키는 것,
(c) 단계 (a) 에서 구체화되는 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 단계 (b) 의 상기 노출된 조직 샘플에서 다시 측정하는 것, 및
(d) 단계 (b) 및 (c) 에서 측정되는 발현 수준의 차이를 계산하는 것,
이때 단계 (a) 와 비교시 단계 (c) 에서 수득되는 군 (i) 의 바이오마커의 증가된 발현 수준은 상기 환자가 상기 항-EGFR 항체로 치료하는 것에 치료학적으로 반응하는 가능성이 증가된 것을 나타내고, 이때 단계 (a) 와 비교시 단계 (c) 에서 수득되는 군 (ii) 의 바이오마커의 증가된 발현 수준은, 상기 환자가 상기 항-EGFR 항체로 치료하는 것에 대해 치료학적으로 반응하는 가능성이 감소된 것을 나타낸다.
또다른 양태에서, 본 발명은 상기 및 하기 개시되는 바와 같은 각 시험관내 방법에 관한 것이며, 이때 환자는 단지 KRAS 야생형 EGFR 발현 종양을 앓을 뿐만 아니라 종양 조직의 EGFR 유전자에서 돌연변이를 나타낸다. 특정 구현예에서 이러한 돌연변이는 항-EGFR 항체, 바람직하게는 세툭시마브의 투여와 연계된 피부 발진에 대한 책임이 있다. 이러한 돌연변이는 바람직하게는 EGFR 에서 R521K 다형을 야기한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 상기 및 하기 개시되는 바와 같은 각 시험관내 방법에 관한 것이며, 이때 환자는 오직 KRAS 야생형 EGFR 발현 종양, 특히 CRC/mCRC 을 앓고 있을 뿐만 아니라, 종양 조직의 BRAF 유전자에서 돌연변이를 나타낸다.
추가의 양태에서, 본 발명은 하기 유전자 하나 이상에 하이브리드화되거나 이에 의해 제시되는 폴리뉴클레오티드의 정렬을 포함하는 DNA 또는 RNA 배열에 관한 것이다: ADAMDEC1, BSDC1, C1orf144, CAPZB, CDC42, DHCR7, DNAJC8, ECSIT, EXOSC10, FADS1, GBA, GLT25D1, GOSR2, IMPDH1, KLHL21, KPNA6, KPNB1, LSM12, MAN1B1, MIDN, PPAN, SH3BP2, SQLE, SSH3, TNFRSF1B, URM1, ZFYVE26, RGMB, SPIRE2, ABCC5, ACSL5, AOAH, AXIN2, CD24, CEACAM5, CEACAM6, ETS2, FMNL2, GPSM2, HDAC2, JUN, ME3, MED17, MYB, MYC, NEBL, NOSIP, PITX2, POF1B, PPARG, PPP1R14C, PRR15, PSMG1, RAB15, RAB40B, RNF43, RPS23, SLC44A3, SOX4, THEM2, VAV3, ZNF337, EPDR1, KCNK5, KHDRBS3, PGM2L1, STK38, SHROOM2, C7orf46, CAST, DCP2, DIP2B, ERAP1, INSIG2, KIF21A, KLK6, NGRN, NRIP1, PHGDH, PPP1R9A, QPCT, RABEP1, RPA1, RPL22L1, SKP1, SLC25A27, SLC25A46, SOCS6, TPD52, ZDHHC2, ZNF654, ASB6, ATM, BMI1, CDC42EP2, EDEM3, PLLP, RALBP1, SLC4A11, TNFSF15, TPK1, C11orf9, C1QC, CABLES1, CDK6, EHBP1, EXOC6, EXT1, FLRT3, GCNT2, MTHFS, PIK3AP1, ST3GAL1, TK2, ZDHHC14, ARFGAP3, AXUD1, CAPZB, CHSY1, DNAJB9, GOLT1B, HSPA5, LEPROTL1, LIMS1, MAPK6, MYO6, PROSC, RAB8B, RAP2B, RWDD2B, SERTAD2, SOCS5, TERF2IP, TIAL1, TIPARP, TRIM8, TSC22D2, TGFA, VAPA, 및 UBE2K, (이때 상기 유전자 또는 유전자 산물은 고형 표면 상에 고정되어 있음).
바람직한 구현예에서, DNA 또는 RNA 배열은 상기 유전자에 하이브리드화되거나 하기 유전자의 하나 이상을 포함한다 : TNFRSF1B, DNAJC8, ECSIT, GOSR2, PPP1R9A, KLK6, C7orf46, SSH3, SERTAD2, AXIN2, C10orf99, ETS2, PITX2, PRR15, VAV3, IKK 상호작용 단백질을 코딩하는 유전자, EDEM3, LY6G6D, 및 임의로는 또한 AREG 및/또는 EREG 및/또는 TGFA.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 DNA 또는 RNA 배열은 하기 유전자에 하이브리딩 되거나 제시되는 폴리뉴클레오티드의 하기 정렬로 이루어진다:
(a) TNFRSF1B, DNAJC8, ECSIT, GOSR2, PPP1R9A, KLK6, C7orf46, SSH3, SERTAD2, AXIN2, C10orf99, ETS2, PITX2, PRR15, VAV3, IKK 상호작용 단백질을 코딩하는 유전자, EDEM3, LY6G6D, AREG, EREG and TGFA; 또는
(b) TNFRSF1B, DNAJC8, VAV3, ARAG 또는 EREG, TNFa; 또는
(c) VAV3; ARAG 또는 EREG, TNFa; 또는
(d) VAV3, TNFa; 또는
(e) ARAG 또는 EREG, TNFa.
도 1: 유전자 (기준선 샘플에서 이의 발현은 야생형 KRAS 유전자를 갖는 환자에서 세툭시마브 단일요법의 6 주 후 질병 제어와 현저히 연계됨) (p < 0.002, 중간 t-시험). 연구 EMR 62202-045 (전이성 CRC 의 제 1-선 치료) 를 기초로 함.
도 2: 유전자 (기준선 샘플에서 이의 발현은 세툭시마브 단일요법의 6 주 후 질병 제어와 현저히 연계됨) (p < 0.002, 중간 t-시험). 연구 EMR 62202-045 (제 1-선 치료 of 전이성 CRC) 을 기초로 함.
도 3: 연구 EMR 62202-502 (이리노테칸-불응 전이성 CRC 환자의 세툭시마브 + 이리노테칸 치료), 야생형 KRAS 유전자을 갖는 환자의 분석: 유전자 (기준선 샘플에서 이의 발현은 최선의 전체적인 반응과 현저히 연계됨) (p < 0.002, Welch t-시험)
도 4: 연구 EMR 62202-502 (이리노테칸-불응 전이성 CRC 환자에서 세툭시마브 + 이리노테칸 치료): 유전자 (기준선 샘플에서 이의 발현은 최선의 전체적인 반응과 현저히 연계됨) (p < 0.002, Welch t-시험)
도 5: 연구 EMR 62202-502 (이리노테칸-불응 전이성 CRC 환자에서 세툭시마브 + 이리노테칸 치료), 야생형 KRAS 유전자를 갖는 환자의 분석: 유전자 (기준선 샘플에서 이의 발현은 전체 생존 시간과 현저히 연계됨) (p < 0.002, Cox 비례하는 위험 회귀)
도 6: 연구 EMR 62202-502 (이리노테칸-불응 전이성 CRC 환자에서 세툭시마브 + 이리노테칸 치료): 유전자 (기준선 샘플에서 이의 발현은 전체 생존 시간과 현저히 연계됨) (p < 0.002, Cox 비례하는 위험 회귀)
도 7: 연구 EMR 62202-502 (이리노테칸-불응 전이성 CRC 환자에서 세툭시마브 + 이리노테칸 치료): 유전자 (기준선 샘플에서 이의 발현은 진행-없는 생존 시간과 현저히 연계됨) (p < 0.002, Cox 비례하는 위험 회귀)
도 8: 연구 EMR 62202-502 (이리노테칸-불응 전이성 CRC 환자에서 세툭시마브 + 이리노테칸 치료), 야생형 KRAS 유전자를 갖는 환자의 분석 : 유전자 (기준선 샘플에서 이의 발현은 진행-없는 생존 시간과 현저히 연계됨) (p < 0.002, Cox 비례하는 위험 회귀)
도 9: 종양 생검의 간 조직 오염 정도를 평가하기 위해 사용되는 Affymetrix 탐검 세트
도 10: KRAS 야생형 종양을 갖는 환자에서 6 주에서 질병 제어와 기준선 발현 데이터의 연계: P <.002 인 57 탐검 세트. Log-비 값은 질병이 제어되는 환자의 평균 log2 발현 수준에서 진행성 질병을 갖는 환자의 그것을 뺀 것임 (샘플의 간 오염 정도에 대해 조정됨).
도 11: 최선의 전체적인 반응으로 기준선에서 4 주까지의 발현에서 치료 상의 변화의 연계를 나타내는 47 탐검 세트. Log-비 값은 부분적 반응하는 환자의 치료 상의 변화의 평균에서 안정적 또는 진행성 질병을 갖는 환자의 그것을 뺀 것임 (샘플의 간 오염 정도에 대해 조정됨).
도 12: 최선의 전체적인 반응으로 기준선에서 4 주까지 후보 유전자 발현에서 치료 상의 변화의 연계. Log-비 값은 부분적 반응하는 환자의 치료 상의 변화의 평균에서 안정적 또는 진행성 질병을 갖는 환자의 그것을 뺀 것임 (샘플의 간 오염 정도에 대해 조정됨).
도 13: KRAS 야생형 상태를 갖는 종양에서 6 주에서 질병 제어되는 후보 유전자의 기준선 발현의 연계. Log-비 값은 질병 제어되는 환자의 평균 log2 발현 수준에서 진행성 질병을 갖는 환자의 그것을 뺀 것임 (샘플의 간 오염 정도에 대해 조정됨).
도 14: Luminex 혈장 단백질체학 데이터의 통계학적 분석 결과. 분석은 기준선과 4 주 샘플의 일반적인 변화를 지칭하고, 모든 환자 중에서 및 KRAS 야생형 종양을 갖는 환자 중에서 6 주에서 반응으로 치료 상의 변화의 연계. 이들 분석 각각에 대해, log2 -비 값, p-값 및 q-값은 각각의 측정된 단백질에 대해 주어진다. Log2-비 값은 4 주와 기준선 샘플 사이의 log2 농도의 변화 평균을 지칭하거나 (일반적인 변화), 또는 응수자 및 비-응수자 사이의 이들 평균 차이간의 차이를 지칭한다 (반응과 연계).
도 15: 항체 시약 및 면역조직화학 검정 조건.
도 16: 대장암 (청색 박스) 및 정상 간 (보라색 박스) 에서 우세하게 발현되는 유전자의 발현에 기초한 고 (녹색), 중 (적색) 및 저 (검정색) 간 오염의 RNA 샘플의 동정. 칼라 스케일은 정상화 후 절대적 구성요소의 신호 강도를 반영한다.
도 17: 최선의 전체적인 반응으로 기준선에서 4 주까지의 발현에서 치료 상의 변화의 연계 (부분적 반응 대 안정적인 질병 + 진행성 질병). P<0.002 의 47 탐검 세트를 보여준다. 유전자 명, 이어서 구성요소 ID 는 이미지의 우측에 주어진다. 구성요소 강도는 기준선에서 유전자 발현에 대한 4 주에서 유전자 발현의 log2 비를 나타낸다.
약어; PD, 진행성 질병; SD, 안정적 질병; PR, 부분적 반응.
도 18: 최선의 전체적인 반응 (부분적 반응 대 안정적 질병 + 진행성 질병) 으로 기준선에서 4 주까지 후보 유전자 발현 후보자에서 치료-상의 변화의 연계. 유전자 명, 이어서 구성요소 ID 는 이미지의 우측 상에 주어짐. 구성요소 강도는 기준선에서 유전자 발현에 대한 4 주에서 유전자 발현의 log2 비를 나타낸다.
약어; PD, 진행성 질병; SD, 안정적 질병; PR, 부분적 반응.
도 19: KRAS 야생형 상태를 갖는 종양에서 질병 제어 (부분적 반응 + 안정적 질병 대 진행성 질병) 후보 유전자 후보의 기준선 발현의 연계. 유전자 명, 이어서 구성요소 ID 는 이미지의 우측에 주어짐. 강도 스케일은 모든 샘플에 걸쳐 각각의 탐검 세트에 대한 각 구성요소에 대한 log2 비를 반영한다.
약어; PD, 진행성 질병; SD, 안정적 질병; PR, 부분적 반응.
도 20: 세툭시마브 (Erbitux) 로 치료된 mCRC 환자에서 반응률 및 진행-없는 생존과 KRAS 상태의 상호관계.
도 21: 피부 (A) 및 종양 (B) 샘플에서 선별된 EGFR 시그널링 경로 연계된 마커의 발현의 면역조직화학 분석: 쌍으로 된 4주/기준선 샘플 사이의 변화.
도 22: KRAS 종양 돌연변이 상태에 따른 질병 진행 없는 환자 대 진행-없는 생존 시간 (개월) 의 비율
도 23: KRAS 야생형 종양을 갖는 환자에서 6 주에서 질병 제어 (부분적 반응 + 안정적 질병 대 진행성 질병) 와 기준선 유전자 발현 데이터의 연계. P<.002 의 57 탐검 세트를 보여준다. 유전자 명, 이어서 구성요소 ID 가 이미지 우측에 주어진다. 칼라 스케일은 모든 샘플에 걸쳐 각각의 탐검 세트 평균에 대해 각 구성요소에 대한 log2 비를 반영한다.
약어; PD, 진행성 질병; SD, 안정적 질병; PR, 부분적 반응.
도 24: 모든 환자 (패널 A, C, 및 E, 각각) 및 KRAS 에 대한 야생형인 환자 (패널 B, D, 및 F, 각각) 에서 6 주에서 반응에 따른 기준선 샘플에서 AREG (구성요소 205239_at), EREG (구성요소 205767_at) 및 TGFA (구성요소 205016_at) 발현 수준. P-값은 질병 제어와의 연계를 지칭함 (부분적 반응, PR 및 안정적 질병, SD 대 진행성 질병, PD).
도 25: (ITT) 개체군 (패널 A) 을 치료하는 것으로 의도되는 45 명의 환자 중에서 및 KRAS 야생형 종양 (패널 B) 을 갖는 24 명의 ITT 환자 중에서 6 주에서 반응과 기준선에서 4 주까지에서 혈장 단백질 농도의 치료 상의 변화의 연계 (부분적 반응, PR 대 안정적 질병, SD + 진행성 질병, PD). P<.01 인 모든 단백질을 보여준다. 구성요소 강도는 기준선에서 단백질 농도에 걸쳐 4 주에서 단백질 농도의 log2 비를 나타낸다.
도 26: 박스플롯은 반응과 VAV3 의 연계를 나타낸다. PD: 진행성 질병, PR: 부분적 반응, SD: 안정적 질병. 녹색 도트: KRAS 및 BRAF 야생형 종양을 갖는 환자, 적색 도트: KRAS 돌연변이를 갖는 환자, 검정색 도트: BRAF 돌연변이를 갖는 환자, 청색 도트: 알려지지 않은 돌연변이 상태. P-값은 Welch t-시험을 기초로 함.
도 27: Kaplan-Meier 플롯은 VAV3 발현에 의한 진행-없는 생존 분포 층상 함수를 나타낸다. 환자는, 이들의 기준선 VAV3 발현 수준이 각 환자에 걸쳐 중간값 수준 초과 또는 미만인 지에 의존적인 높은 또는 낮은 VAV3 발현자로서 분류되었다. p-값은 Cox 비례하는 위험 모델로부터 유래된다.
도 28: Kaplan-Meier 플롯은 VAV3 발현에 의한 전체적인 생존 분포 층상 함수를 나타낸다. 환자는 이들의 기준선 VAV3 발현 수준이 환자 각각에 걸쳐 중간값 수준의 초과 또는 미만인지에 의존적인 높은 또는 낮은 VAV3 발현자로서 분류되었다. p-값은 Cox 비례하는 위험 모델로부터 유래된다.
도 29: Kaplan-Meier 플롯은 VAV3 발현 및 KRAS 돌연변이 상태에 의한 진행-없는 생존 분포 층상 함수를 나타낸다. 환자는 4 개의 단층으로 군집화되었고, KRAS 돌연변이 상태 및 기준선 VAV3 발현 (중간값 초과 및 미만) 의 모든 가능한 조합을 나타낸다.
도 30: Vav3 은 활성화된 EGFR 와 상호작용한다. VAV3 및 EGFR 단독 또는 조합으로 HEK 293 세포의 형질감염 후, 세포를 용균시키고 면역침강법 (IP) 및 Western 블롯팅 (WB) 처리하였다.
발명의 상세한 설명
EGFR-표적화 면역글로불린 (Ig) G1 모노클로날 항체, 세툭시마브는 고형 종양의 치료용으로 승인된 제 1 모노클로날 항체였다.
세툭시마브 치료로부터 가장 현저하게 이점을 가질 환자를 확인하기 위해 세툭시마브 반응을 예측하기 위한 이용가능한 바이오마커를 집중 연구하였다. 면역조직화학에 의해 평가된 바와 같이 종양 EGFR 발현은 CRC 에서 EGFR-표적화된 치료의 효능에 대한 실망스러운 바이오마커인 것으로 증명되었다. 보다 유망한 데이터가 KRAS 유전자의 돌연변이에 대해 보고되었고, 이는 EGFR 시그널링 케스케이드 경로의 세포내 경로로의 GDP/GTP-결합 단백질 링크 리간드-의존적인 수용체를 인코딩한다. 전이성 CRC (mCRC), EMR 62202-047 및 EMR 62202-013 에서 제 1-선 치료의 2 개의 무작위 연구를 포함하는 다수의 임상 연구에서 KRAS 돌연변이 상태의 회고적 분석 및 무작위 C0.17 연구 (화학요법 전에 실패한 mCRC 를 갖는 환자에서 세툭시마브 단일요법을 조사) 는, CRC 에서 KRAS 코돈 12/13 돌연변이 상태가 세툭시마브 활성에 대한 예측인 것으로 나타났다. 종양 반응은 KRAS 에 대해 야생형인 환자 및 세툭시마브 요법으로부터 이점을 갖지 않는 KRAS 코돈 12/13 돌연변이를 갖는 환자의 하위그룹에서 우세하게 나타났다. 그러므로, KRAS 의 돌연변이 상태는 현저한 이점을 유래시킬 수 없는 하위개체군의 치료로부터 배제를 허용하는, CRC 에서 세툭시마브 활성을 위한 강력한 예측성 바이오마커인 것으로 보인다.
그러나, 전부가 아닌 KRAS 야생형 종양을 갖는 약 60% 의 CRC 환자가 세툭시마브 치료로부터 이점을 갖는다. KRAS 야생형 종양을 갖는 약 40% 의 환자가 세툭시마브 치료에 반응하지 않고 이들 환자의 상당한 분율이 초기 진행되고 전체적인 생존기간이 짧다.
그러므로, CRC 환자에서 세툭시마브 치료의 임상 결과를 보다 양호하게 에측하기 위한 KRAS 돌연변이 상태 외에도 사용될 수 있는 추가의 바이오마커의 동정 및 사용이 필요하다. KRAS 돌연변이 상태 외에도 CRC 의 치료에서 세툭시마브 효능의 보다 양호한 예측을 허용하는 바이오마커의 동정이 추가로 필요하다.
KRAS 야생형 종양을 갖는 환자에서 일반적인 환자 개체군에서 반응, 진행-없는 생존 또는 전체적인 생존과 연계된 유전자를 동정하기 위한 2 개의 세툭시마브 CRC 연구 EMR 62202-502 및 EMR 62202-045 에서 신선하게 냉동된 간 전이 생검의 마이크로배열 분석이 행해졌다. 이들 유전자의 발현은 CRC 에서 세툭시마브의 효능에 대한 예측성 바이오마커로서 사용될 수 있고 CRC 에서 세툭시마브 치료로부터 가장 이점이 되는 환자를 보다 잘 확인하기 위한 예측성 바이오마커로서 사용될 수 있다.
상기 기술되는 유전자의 발현은 병동에서 치료 판단을 촉진하기 위해 (즉, 환자가 세툭시마브 또는 다른 항-EGFR 지향화 치료학적 항체를 받아들이는지 받아들이지 않는지) 및 CRC 를 갖는 환자에서 세툭시마브 및 다른 항-EGFR 지향화 치료학적 항체의 효능을 예측하기 위한 바이오마커로서 사용된다. 임상 적용은 하기와 같다:
1. 포르말린-고정된 파라핀 내장된 (FFPE) 또는 신선한 종양 생검으로부터 이들 유전자의 mRNA 발현의 분석 (후자는 보존 RNA 통합성 보존을 위해 RNA-이후로 처리되거나 액체 질소에서 직접 냉동됨). 생검은 1차 종양 또는 전이로부터 수득될 수 있다. mRNA 발현의 분석은 유전자 배열 상에 고정된 하이브리드 탐검에 특정 관심 유전자의 mRNA 의 하이브리드화에 의해 또는 관심 유전자의 증폭을 위해 유전자의 mRNA 의 하이브리드화에 의해 관심 유전자의 증폭을 위해 유전자 특정 프라이머를 사용하여 PCR-기재 방법에 의해 수행된다 (예: 실시간 PCR, qPCR).
2. FFPE 또는 신선한 종양 생검 (후자는 RNA-이후 RNA 통합성 보존을 위해 RNA-이후로 처리되는 또는 액체 질소에서 직접적인 냉동 중 하나로 처리됨) 으로부터 이들 유전자의 단백질 발현의 분석. 생검은 1차 종양 또는 전이로부터 수득될 수 있다. 단백질 발현 분석은 방법, 예컨대 면역조직화학, 효소 면역측정법 (ELISA), Luminex, 블롯팅 및 막 상의 단백질 검출, 질량 분석법을 포함한다.
가용성 단백질에 대해선: 방법학, 예컨대 ELISA, Luminex, 질량 분석법을 포함하는 혈장 또는 혈청으로부터 단백질 발현을 분석한다.
임상 실시에 대한 진단 검정을 수립하기 위해, 후보자 유전자(들) 또는 단백질(들) 의 발현 수준은 또다른 유전자 또는 단백질 (또는 유전자 및 단백질의 조합) 의 발현에 대항하여 정상화될 필요가 있으며 이는 동일한 검정 방법으로 동일한 생검으로부터 평가된다. 이들 "정상화" 유전자 또는 단백질은 환자에서 환자로의 낮은 다양성을 나타내는 것으로 공지된 세포의 보조관리 유전자를 포함할 수 있다. 대안적으로는, "양호한 예후" (또는 결국 사용하는 용어가 무엇이든지 간에) (예를 들어, "민감한") 군으로부터의 유전자 또는 단백질의 발현 수준 (또는 유전자 또는 단백질의 조합) 및 "불량한-예후" (또는 예를 들어, "저항성") 군으로부터의 유전자 또는 단백질의 발현 수준 (또는 유전자 또는 단백질의 조합) 의 비가 결정될 수 있다. 후자의 접근법은 항-EGFR 요법의 효능에 직접 연결되는 유전자 또는 단백질의 발현 수준 만을 이용한다는 이점을 제공한다. 이러한 접근법은 적합한 보조관리 유전자 또는 단백질의 의존에서 높은 역학 범위를 생성한다.
진단 검정의 실행 전에, 역치는 각각 항-EGFR 요법으로 환자를 치료하는 것에 대해 양성적 판단을 촉발하기 위해 달성되어야만 하는 적용된 마커 (상기 기재된 바와 같음) 의 발현 수준의 비인 것으로 규정되어야 한다. 이러한 역치는 최선의 가능한 방식으로 항-EGFR 치료로부터 이점을 갖지 않는 환자 및 이점을 갖는 환자 사이를 구별해야만 한다. 그러한 역치는 항-EGFR 요법으로 치료되는 환자로부터 종양 샘플의 "트레이닝세트" 로부터 유래해야만 한다. 그 후, 역치는 치료로부터 이점을 갖지 않는 환자를 배제하기 위해 또는 가장 이점을 갖는 환자를 선별하기 위한 이의 능력을 증명하기 위해 충분한 환자의 수로부터 종양 샘플의 상이한 세트에서 이후 유효해야만 한다.
세툭시마브로 CRC 환자의 치료에 대한 2 개의 독립적인 임상 연구에서 (EMR 62202-502 및 EMR 62202-045), 상기 및 하기 기술되는 유전자 발현은 반응 및/또는 진행-없는 생존 및/또는 전체적인 생존과 연계된 것으로 밝혀졌다.
Figure pct00001
EGFR 유전자 증폭은 항-EGFR 요법에 대해 유리한 결과를 예측할 수 있음
Figure pct00002
후속적인 연구는 EGFR 유전자 증폭의 낮은 발생정도를 밝혀냄
Figure pct00003
방법론/비교가능한 과제
Figure pct00004
EGFR 유전자 증폭된 환자에서 "오버라이드" 이점이 있는 K-Ras 돌연변이
Figure pct00005
피부 발진은 이제 특히 Erbitux 활성 (mCRC, NSCLC) 에 대해 최선의 예측할 수 있는 바이오마커까지임
Figure pct00006
Erbitux 의 PhIII 연구 FLEX: 연장된 전체적 생존 (OS) 과 연계된 피부 발진 (첫번째 21 일) 의 초기 온셋
Figure pct00007
5% 의 환자에서 발견되는 BRAF 돌연변이
Figure pct00008
BRAF 및 KRAS 돌연변이는 상호간에 배제적임
Figure pct00009
BRAF 돌연변이는 Erbitux 효능에 대한 예측성 마커는 보다 불량한 예후 마커인 것으로 보임
Figure pct00010
mCRC 에서 AREG 및 EREG 발현은 KRAS 돌연변이 상태에 독립적임
Figure pct00011
AREG 및 EREG 발현 상태와 KRAS 돌연변이 상태와의 조합에 의한 추가의 예측력
본 발명의 실험에 따른 세툭시마브 치료는 p-EGFR, p-MAPK 의 상당한 하향조절 및 증식 및 기저 케라티노사이트에서 p27Kip1 및 p-STAT3 수준의 상당한 상향조절 에 연계되어 있다. 이들 결과에서 마킹된 차이가 없다는 것이, 투여 및 투여량 수준의 상이한 스케쥴에 대해 주목된다. 세툭시마브 단일요법 단계에서, 반응은 KRAS (8/29 대 0/19 (KRAS 돌연변이체 종양에 대해) ; P=.015) 에 대해 야생형 종양을 갖는 환자에서만 달성된다. 진행-없는 생존은 KRAS 돌연변이체 종양과 비교시 KRAS 야생형을 갖는 환자에 대해서 보다 장기간이다 (logrank, P=.048). 유전학/단백질체학 분석은 반응과 연계된 후보자 마커를 확인한다.
세툭시마브 단일요법의 단계 I 투여량-확대 시도에서 수행되는 이러한 해독 연구는 제 1-선 세팅에서 세툭시마브-반응성 mCRC 을 위한 예측성 예비치료 바이오마커를 동정하기 위한 게놈약학 및 단백약학 분석을 사용하는 것을 우선적 시도로 하여 구성된다.
(이외에 보고된) 임상 연구는 세툭시마브가 400-700 mg/㎡ 의 투여량에서 매 제 2 주로 환자에게 제 1-선 요법으로서 안전하게 투여될 수 있다는 것을 입증한다. MTD 는 가장 높은 투여량 수준에 도달하지 않고, 상이한 투여량 수준에서 세툭시마브의 활성 또는 반대 경우의 중증도 또는 발생정도에서 차이를 만들지 않는다. 피부를 사용하여 표적 영향을 측정하기 위해, 약력학 바이오마커 평가에서 IHC 데이터는 투여량-확대 군에 걸쳐 EGFR 경로 내에서 시그널링 단백질의 일관된 저해를 나타냈다. 이들 데이터는 매주 및 매 제 2 주 투여 처방계획의 기능적 평형을 지지하기 위한 생물학적 이유를 제공한다.
단일 암 (arm) 및 무작위 mCRC 연구의 회귀 분석은 코돈 12 및 13 에서 KRAS 의 종양에서 돌연변이 상태가 세툭시마브 활성의 강한 예측자임을 확인하였고, 야생형 상태에 엄격히 링크된 치료학적 이점을 갖는다4 ,7-13. 현재 연구는 mCRC 환자의 제 1-선 치료에서 세툭시마브 단일요법 상에 KRAS 돌연변이 상태의 영향 미치는 제 1 시간에 대해 어드레싱된다. 화학요법-불응 환자의 이전의 시리즈로부터의 데이터와 일치, (단일 작용제로서 또는 화학요법제와 조합으로 세툭시마브로 치료됨),8,11,13 (연구의 단일요법 부분에서 목적 반응) 는, KRAS 야생형 종양 환자에서만 관찰되었고 (8 - 29 환자, 28%), 유전자에서 돌연변이를 수행하는 종양을 갖는 환자에서 반응이 나타나지 않았다 (0 - 19) (P=.015). KRAS 야생형 종양 (55%) 및 KRAS 돌연변이된 종양 (32%) 을 갖는 환자에서 최선의 전체적인 반응률 (FOLFIRI 첨가 후 반응 포함) 는 CRYSTAL 및 OPUS 연구에서 수득되는 결과와 비교할 만하고, 여기서 세툭시마브는 각각 FOLFIRI 및 FOLFOX4 , 12으로 제 1-선 치료로서 조합되었다. 제 1-선 치료 현재 연구에서 제 1-선 치료로서 화학요법과 조합으로 세툭시마브를 수용하는 KRAS 돌연변이된 종양을 갖는 mCRC 환자에서 관측된 반응은 화학요법의 결과에 가장 기인하기 쉽다. 보다 전체적인 PFS 는 KRAS에 대해 야생형 종양을 갖는 환자에서 보다 현저하게 길다는 것은, 세툭시마브 치료와의 관계에서 예측성 바이오마커로서 KRAS 종양 돌연변이 상태의 현저한 임상을 나타낸다.
KRAS 야생형 종양을 갖는 환자의 부분집합은 세툭시마브 치료로부터 이점을 나타내지 않는다. 그러므로, 세툭시마브에 반응할 이들 환자에게 치료의 보다 정확한 재단을 촉진하는 추가의 예측성 바이오마커를 동정하는 것이 가능할 수 있다. 최근, BRAF 18 및 PI3K 19 ,20 돌연변이 및 PTEN 탈조절19 - 21 의 음성적 예측정 값은, 사전에 기술되었다. 세툭시마브의 임상 활성과 추정되는 다른 분자 마커는 하기를 포함한다: VEGF , IL8, EGFR, 및 PTGS2 (COX2) 의 종양 발현 수준22 ; 치료 동안 VEGF 의 순환 수준23; PTGS2 및 EGFR 24 및 TP53 종양 돌연변이 상태의 구성적 다형25.
항암제 범위에 대해, 높은 처리량의 유전학 기술이 예측성 바이오마커 연구에서 이용되는 것이 증가하고 있다26 -29 . 세툭시마브의 경우에서, 종양에서 EGFR 리간드 AREG (암피레귤린) 및 EREG (에피레귤린) 를 인코딩하는 유전자의 고-수준 발현은, mCRC 환자에서, 마이크로배열10 ,30 (선별되지 않은 개체군 및 KRAS 야생형 종양을 갖는 개체군) 및 양적인 역 트랜스크립타제-PCR31 (세툭시마브 + 이리노테칸을 수용하는 환자) 접근 둘 다에 의해 임상 활성과 연계된 것으로 나타났다. 유사하게, 현재 제 1-선 연구에서, AREG 및 EREG 발현은 질병 진행 없는 환자의 종양에서 평가되는 것으로 나타났다 (둘 모두의 총 개체군 및 KRAS 야생형 종양 하위군에서). 대조적으로, TGFa (TGF-α를 인코딩함) 는 질병 진행 없는 환자에서 낮은 발현 수준을 나타냈다. KRAS 야생형 종양의 전반적인 유전자 발현 분석은, 6 주 (P<.002) 에서 질병 제어와 연계되어 추정되는 57 개의 유전자를 동정하였다. 이들 후보자 중에서, 6 개의 유전자 (TNFRSF1B , DNAJC8 , ECSIT , GOSR2 , PPP1R9A , 및 KLK6) 는 0.1 미만의 False Discovery Rate 를 갖는 것으로 밝혀졌다. KRAS 야생형 mCRC 에서 세툭시마브 효능의 예측을 개선시키기 위한 이들 추정되는 바이오마커 값은 추가의 탐사를 필요로 한다.
혈장 단백질의 Luminex 분석은 세툭시마브 단일요법 치료 동안 암피레귤린 및 TGF-α의 수준을 강하게 증가시키는 것으로 밝혀졌고, 또한 EGF 에 대한 것으로 보여지는 경향이 있다. 이들 EGFR 리간드의 상향조절은 EGFR 저해에 보상 작용할 수 있다. 흥미롭게도, 암피레귤린 수준에서 증가는 세툭시마브 치료에 반응하는 환자에서 현저하게 낮춰졌다. 발암배아성 항원 및 암 항원 125 및 19-9 의 현저한 감소는, 응수자에서 세툭시마브 단일요법 하에서 관측되었다. 또한, 현저하게는, IL-8 수준에서 감소는, 모든 종양 및 KRAS 야생형 종양에서 반응과 현저하게 연계되어 있다. IL-8 은 종양 세포의 증식 및 생존을 촉진하는 염증유발인자 사이토카인이고 종양 마이크로환경상에 깊은 효과를 낸다32. IL-8 은 세툭시마브 효능에 대한 예측성 바이오마커인 것으로 보인다.
게다가 본 발명에 따라, EGFR 및 VAV3 의 직접적인 상호작용은 EGFR 및 VAV3 가 HEK 293 세포에서 발현될 때 검출될 수 있었다. 이는 EGFR 시그널링에서 VAV3 에 대한 직접적이고 뛰어난 역할을 하고 세툭시마브로 항-EGFR 요법의 활성의 조절 및 관측되는 높은 VAV3 발현 수준 사이를 직접 연결한다.
본 발명은 KRAS 야생형 종양을 갖는 mCRC 환자에서 이점이 있는 제1-선 세팅에서 단일 작용제로서 항-EGFR 항체, 바람직하게는 세툭시마브 (매 2 주 및 매주 투여) 로 우선적으로 치료하는 것을 나타내다. 또한, 이러한 초기-단계 연구의 전반적인 유전자 발현 분석은, 수많은 세툭시마브의 임상 활성 및 어떠한 유전자의 발현에 관한 흥미로운 결과를 갖는다. 이들 관측은 상이한 방법학을 이용하는 보다 많은 수의 일련의 환자 상에서 유효성을 가능하게 한다. 이들 연구 결과는, 상이한 암, 특히 CRC 또는 mCRC 를 앓고 있는 환자에서 세툭시마브 또는 항-EGFR 항체가 동시에 활성이게 하는 최적화 치료에 대한 기초를 합리적으로 제공한다.
EGFR 경로 구성요소의 면역조직화학적 분석
평가된 마커의 약력학 변화를 분석하기 위해 평가가능한 쌍으로 된 기준선/4주 피부 생검을, 35 명 이하의 환자로부터 입수했다. p-EGFR, p-MAPK 및 증식의 상당한 하향조절은 (Ki67 염색에 의해 평가되는 바와 같음), 기준선 샘플과 비교시 4-주에서 관찰되었다. 평행적으로, p27Kip1 및 p-STAT3 의 상당한 상향조절이 관찰되었다. 투여 및 투여량 수준의 상이한 스케쥴의 분석에서, 환자 군 사이의 이들 마커의 수준에서의 변화에 대한 면에서 관련 차이가 없었다 (기준선에서 치료-상의 시점까지) (도 21A).
평가 가능한 쌍으로 된 기준선/4주 종양 생검은 17 명 이하의 환자로부터 입수했다. p-EGFR 및 p-MAPK 의 깊은 하향조절 및 증폭에서 감소는 요법 후 종양 세포에서 관측되었다 (도 21B). 그러나, p27Kip1, p-STAT3 및 p-AKT 수준은 세툭시마브 치료에 의해 현저하게 변형되었다 (데이터는 나타나지 않음). 보다 적은 수의 이용가능한 쌍으로 된 종양 생검은 투여량 군 및 반응 변수로 바이오마커 수준에서의 변화의 비교를 허용하지 않았다.
KRAS 돌연변이 분석
KRAS 코돈 12 또는 13 돌연변이는 19/48 (40%) 환자 샘플 (G12V, 9 환자; G13D, 5 환자; G12D, 4 환자; G12A, 1 환자) 에서 검출되었다. 세툭시마브 단일요법 단계에서, 48 명의 환자 중에서 8 개의 부분적 반응 (PR) 이 있었다. 모두 KRAS (8/29; 28%) 에 대한 야생형 종양 환자에서 였다. KRAS 돌연변이 종양 환자 19 명에서 반응이 없었다 (P=.015) (표 1). 전체적인 연구에서 (단일요법 및 병용 요법 단계), 반응은 KRAS 야생형 환자의 16/29 (55%) 및 KRAS 돌연변이체 종양을 갖는 환자의 6/19 (32%) 에서 나타났다 (P=.144). PFS 는 야생형 종양을 갖는 환자에서 현저하게 보다 길었다 (돌연변이를 갖는 종양과 비교시) (도 22; 중간값 9.4 대 5.6 개월, 위험 비 0.47; logrank P=.048).
유전자 발현의 마이크로배열
기준선 및 4-주 시점으로부터 106 종양-유래된 샘플의 총계를 Affymetrix GeneChip HG-U133 Plus 2.0 배열로 하이브리드화하였다. 일반적인 품질 제어 파라미터를 기초로 하여 추가 분석으로부터 4 개의 배열을 제외하고, 24 개의 샘플을 정상 간 조직 오염의 존재로 인해 제외하고 (도 16; 보충 재료) 추가로 분석하지 않았다. 복제의 배제 후, 42 명의 ITT 환자 (36 기준선, 26 주 4: 20 쌍) 로부터 62 개의 배열 데이터 세트를 분석용으로 남겼다.
종양 샘플을 분석하기 위해, 54,675 탐검 세트로부터 데이터를 변수, 신호 강도 및 탐검 세트 주석 (Supplementary 방법 참조) 에 기초하여 예비-여과하였다. 이러한 방법은 15,230 탐검 세트로의 종양 발현 분석을 제한하였고, 10,538 유전자를 나타냈다. 반응에 따른 기준선 예비-여과된 데이터의 전반적인 비교는: 진행성 질병 (PD; n=12) 대 질병 제어 (6 주 에서) (n=23; 1 환자 (측정 불가)) 및 최선의 전체적인 반응: PD 및 안정적 질병 (SD) (n=19) 대 PR (n=14; 3 환자 (측정 불가)), P 값의 분포는 (데이터에 나타나지 않음) 본질적으로 예상된 바와 우연히 같았고, 반응의 유전자 발현 특성 예측이 전반적인 개체군에 대해 확인되지 않았음을 제시한다. 그러나, KRAS 야생형 종양 (8 명의 환자 (PD) 대 11 명의 환자 (질병 제어)) 으로 분석을 제한하는 것은, 발현 패턴을 갖는 57 탐검 세트가 (6 주에서 질병 제어와 연계된 것으로 추정됨) 확인되었다 (P<.002; 도 23). 0.1 의 False Discovery Rate (FDR) 역치를 부과한 (FDR 정의에 대해서는 Supplementary Methods 구획 참조) 은, 6 개의 유전자는 질병 제어와 현저하게 연계된 것으로 밝혀졌다 (TNFRSF1B , P=6.90E-07; DNAJC8 , P=1.60E-06; ECSIT , P=6.80E-06; GOSR2 , P=3.90E-05 (질병 제어를 나타내는 환자에서 보다 높은 발현) 및 PPP1R9A , P=8.90E-07 및 KLK6, P=3.00E-05 (PD를 갖는 환자에서 보다 높은 발현).
반응과 연계된 치료 상의 변화는, 기준선 및 4 주 시점으로부터 이용가능한 샘플을 갖는 환자로부터 데이터를 사용하여 시험하였다. 발현 변화가 확인되지 않았고 이는 PD (n=8) 와 비교시 6 주 (n=12) 에서 질병 제어와 엄격히 연계된 것으로 나타났다. 화학요법과 조합으로 고려하여, PR (n=7) 대 SD/PD (n=13) 에 대한 비교 특성, 치료-상의 변화에서 차이를 나타내는 47 탐검 세트를 나타냈다 (P<.002, 중간 t-시험, 도 17 참조).
KRAS 야생형 종양을 갖는 환자에서, 및 분석된 환자의 완료 세트에서, 기준선 EREG (에피레귤린) 및 AREG (암피레귤린) 발현 수준은 세툭시마브에 반응하는 종양에서 보다 높았다 (도 24; 도 18). 이러한 발견은, 문헌 [Khambata-Ford et al]10 에 보고된 결과와 비슷한 것이다. 흥미롭게도, TGFA (TGF-α) 는 상호간의 발현 패턴을 입증한다 (도 24; 도 18). ERBB 수용체 및 리간드 ERBB3 (HER3) 및 ERBB2 (HER2) 와 같은 EGFR 시그널링에 직접적으로 또는 간접적으로 포함된 것으로 공지된 다른 유전자 중에서, 최선의 전체적인 반응으로서 PR 을 갖는 종양에서 보다 강한 하향조절을 위한 경향을 나타냈다 (도 19).
혈장 단백질학
Luminex 기술을 사용하는 혈장 샘플에서 97 개의 상이한 단백질의 농도를 분석하였다. 단백질 패널은 EGFR 리간드, 다른 성장 인자, 인터루킨 및 다양한 다른 후보자 단백질을 포함했다. 세툭시마브 단일요법 단계 동안, 인터루킨 (IL)-8, 대식세포 염증성 단백질 (MIP)-1, 및 종양 마커 발암배아성 항원, 암 항원 125 및 19-9 의 혈장 수준 감소는 (기준선과 주 4 사이에서) 6 주에서 반응과 현저하게 연계되어 있다 (P<.01) (도 25A). 암피레귤린의 혈장 농도에서 일반적인 강한 증가가, 세툭시마브 단일요법에 부분적으로 반응하는 환자에서 보다 현저하게 약하게 되었다 (P<.01) (도 25). 또한, 6 주에서 반응과의 연계는 KRAS 야생형 종양을 갖는 환자로 분석을 제한할 때 (24 명의 환자로부터의 데이터, 도 25B) 발암배아성 항원, 암 항원 19-9, IL-8 및 암피레귤린에 대해 밝혀졌다. 게다가, 일반적인 TGF-α 및 EGF 수준의 증가 (반응에 독립적) 및 가용성 EGFR 의 감소는, 세툭시마브 단일요법 치료의 첫번째 4 주 동안 혈장에서 관찰되었다.
세툭시마브를 수용하는 전이성 대장암 (mCRC) 환자에서 요법의 성공 및 발현 수준 사이의 연계를 나타내는 조사된 유전자 및 후보자 중에서, VAV3 이 특히 관심대상이다. 연구 EMR 62202-502 에서, 높은 종양의 VAV3 mRNA 발현 수준은 이리노테칸과 조합으로 세툭시마브에 보다 양호하게 반응하는 것과 강하게 연계되어 있을 뿐만 아니라 (도 26), 진행 없는 생존 (PFS) (도 27) 및 전체적인 생존 (OS) (도 28) 과도 연계되어 있다. 게다가, 높은 종양의 VAV3 발현 수준은 KRAS 야생형 종양 환자에서 반응 및 연장된 PFS 와 특히 연계된 것으로 밝혀졌다 (도 1 및 도 29 참조). 그러므로, VAV3 발현은 KRAS 야생형 종양 환자에서 CRC 에서 세툭시마브 요법의 임상 결과를 예측하기 위한 양호한 바이오마커 후보자인 것으로 나타났고, 이는 세툭시마브 요법로부터 가장 이점을 갖는 환자의 선별을 추가로 최적화하는데 도움이 된다.
흥미롭게도, EGFR 및 VAV3 의 직접적인 상호작용은, EGFR 및 VAV3 가 HEK 293 세포에서 발현될 때 검출될 수 있었다 (도 30). 이는, VAV3 발현 수준 및 항-EGFR 요법의 활성 조절 사이에 직접적인 연결 및 EGFR 시그널링에서 VAV3에 대한 직접적인 역할을 제시한다.
실시예
임상 연구:
EMR 62202-502: 이러한 무작위 연구는 이리노테칸-포함 요법에 실패한 EGFR-발현하는 mCRC 환자 (pts) 에서 세툭시마브 투여량-확대를 조사한 것이다. Pts 는, 세툭시마브로 출발 후 무작위 22 일이었고 (400 mg/m2 초기 투여량, 이어서 250 mg/m2/주 [w]) (I (180 mg/m2 q 2 w) 으로) (>등급 (G) 1 피부 반응, >G 2 인 임의의 다른 세툭시마브-관련 반대 경우을 경험하지 않은 경우) I 에 대해 저항성이 있었다. 무작위화는 표준 세툭시마브 투여량 (Arm A; 250 mg/m2/w) 또는 투여량-확대 (Arm B; 세툭시마브 투여량은 50 mg/m2 q 2 w 로 증가됨, >G 2 독성까지, 종양 반응 또는 투여량 = 500 mg/m2) 에 대한 것이었다. Pts 는, 표준 세툭시마브 투여량에 무작위로 계속되지 않았다 (Arm C). 1차 종결점을 피부 및 종양 생검에서 비교하였고, 치료 전 및 동안 취하였고, EGFR 상의 투여량-확대의 결과 및 다운스트림 시그널링 마커 표준 세툭시마브 처방계획의 그것과 함께였다. 2차 종결점은 PK, 효능, 안전성, 저항성, 바이오마커 분석 (종양 생검 및 혈장 샘플상에서) 이었다. KRAS 돌연변이 상태는 종양 생검으로부터 분석되었다.
EMR 62202-045: 이 연구는, 전이성 대장암 환자에서 세툭시마브의 매 2 주 투여의 약물동태학 및 안전성을 시험한 것이다. 2차 목표는 약력학 바이오마커 분석을 포함했다. 환자는, 6 주 동안 세툭시마브 단일요법, 이어서 세툭시마브 + FOLFIRI (질병 진행까지) 를 수용하였다. 제어 암 (arm) 에서의 환자는 세툭시마브를 400 mg/m2 초기 투여량으로 이어서 250 mg/m2/주로 및 투여량-확대 암 (arm) 에서, 400-700 mg/m2 에서, 매 2 주 수용하였다. KRAS 돌연변이 상태를 종양 생검으로부터 분석하였다.
유전자 발현 (마이크로배열) 분석을 위한 종양 재료:
EMR 62202-502: 종양 재료를 오픈 수술, 내시경검사 또는 코어/미세 침 생검에 의해 취하였다 (기준선 (예비-치료) 에서, 22 일에서 (가능한 경우), 투여량-확대 암 (arm) 에서 환자의 질병 진행에서 (Arm B)). 샘플을 액체 질소 중에서 스냅 냉동시켰다.
EMR 62202-045: 종양 재료를 오픈 수술, 내시경검사 또는 코어/미세 침 생검에 의해 취하였다 (기준선에서, 4 에서(가능한 경우), 질병 진행에서). 샘플을 액체 질소 중에서 스냅-냉동시켰다.
RNA 발현 특성화
마이크로배열 분석과 관련된 실험 절차는 Supplementary Methods 구획에서 상세히 설명되어 있다. 간략하게, 스냅-냉동된 종양 생검을 균질화하고, 총 RNA 를 RNeasy Micro Kit® (Qiagen, Hilden) 를 사용하여 추출하였다. 배열 하이브리드화 실험을 위한 비오틴화 표적 cRNA 를 Affymetrix Two-Cycle Eukaryotic Target 라벨링 프로토콜에 따라 모든 샘플로부터 제조하였다. 각 종양을 분석하기 위해, 초기 50 ng 의 총 RNA 를 이러한 cRNA 증폭/라벨링 방법의 제 1 cDNA 합성 반응에 포함시켰다. 라벨링된 cRNA 를 45 ℃ 에서 60 rpm 에서 16 시간 동안 Affymetrix GeneChip HG-U133 Plus 2.0 유전자 발현 배열로 후속적으로 하이브리드화시켰다. 하이브리드화 이후, 배열을 Affymetrix Fluidics Station 450 상에서 염색하고 GeneChip Scanner 를 사용하여 신호 정량화하였다. 가공되지않은 발현 데이터의 품질 제어 및 예비가공을 Affymetrix GCOS 소프트웨어 및 Bioconductor 패키지, affyPLM (지적재산권 소유) 를 사용하여 수행하였다.
EMR 62202-502: 모든 품질 제어 체크 후 예비가공 단계를 (ITT) 개체군을 치료하는 것으로 의도되는 47 명의 환자로부터 총 68 배열 데이터 세트로 수행하였다 (추가 분석을 위해 적임임). 기준선 샘플은 35 명의 환자로부터 입수했다.
EMR 62202-045: 모든 품질 제어 체크 후 예비가공 단계를 추가 분석을 위해 적임인 42 명의 ITT 환자로부터 총 62 배열 데이터 세트로 수행하였다. 기준선 샘플을 36 명의 환자로부터 입수했다.
하나 이상의 2 개의 연구에서 신호 강도 및 가변성에 기초한 초기 필터에 통과시킨 신뢰할만한 유전자 주석을 갖는 모든 Affymetrix 탐검 세트에 대해 통계학적 분석을 수행하였다 (16414 Affymetrix 탐검 세트 10785 유전자를 나타냄).
이의 발현이 임상적 반응과 연계된 유전자는, 응수자와 비-응수자 사이에서 (EMR 62202-502), 또는 세툭시마브 단일요법의 질병 제어 6 주 후 환자 대 진행성 질병 환자 각각 사이에서 (EMR 62202-045) 비교하여 Welch t-시험으로 확인하였다. 이의 발현이 진행-없는 생존 또는 전체적인 생존과 연계된 유전자를 Cox 비례하는 위험 회귀 (EMR 62202-502) 를 사용하여 확인하였다. 이들 분석을 환자의 완전한 세트뿐 아니라 오직 KRAS 야생형 종양 환자에 대해서 수행하였다.
둘 모두의 연구에 걸쳐 반응-연계된 유전자를 동정하기 위한 메타-분석을 이들 생성물의 널 (null) 분포로부터 P-값을 유도하고 시험 통계학으로서 단일-연구 단일-측 P-값의 생성물을 사용하여 수행하였다.
0.01 미만 내지 0.0001, 특히 0.01 미만, 바람직하게는 0.005, 보다 바람직하게는 0.002, 가장 바람직하게는 0.0005 또는 0.0001 범위의 p-값은 (임상적 반응과의 연계에 대해 메타-분석으로부터, 및 진행-없는 및 전체적인 생존과의 연계에 대해 EMR 62202-502의 분석으로부터), 통계적으로 유의한 것으로 고려되었다. 이러한 기준은 하나 이상의 비교에서 179 개의 알려진 유전자를 나타내는 200 Affymetrix 탐검 세트에 대해 수행되었다.
적임 환자 및 연구 설계
적임 표준 및 연구 설계는 분리된 사본에서 전체적으로 보고되었다. 간략하게, 연구는 2 개의 부분으로 나누어졌다; 세툭시마브 단일요법 단계 (6 주간 지속) 및 병용 요법 단계 (환자가 세툭시마브를 수용하는 동안, 동일한 투여량/스케쥴에서 (단일요법 단계 동안에서와 같이), 및 이리노테칸-기재 스케쥴 FOLFIRI 에서). 환자는, 세툭시마브 의 표준 매주 스케쥴 및 투여량 (400 mg/㎡, 이어서 250 mg/㎡ 의 매주 투여량) 또는 세툭시마브 투여량-확대 치료 (400 내지 700 mg/㎡ 의 상이한 코호트로 격주 스케쥴 상에서) 세툭시마브 투여량-확대 치료 또는 세툭시마브 중 하나로 순차적으로 임명되었다. 임상적 반응이 세툭시마브 단일요법의 6 주 후 및 최선의 전체적인 반응으로서 (단일요법 및 병용 요법 단계) 보고되었다.
환자 재료의 수집 및 저장
기준선에서 및 26-28 (주 4) 일 상에서 피부 생검을 수득하였다. 피부 발진이 존재하는 경우, 샘플을 발진-없는 영역으로부터 취하였다. 생검을 즉시 ≥20 시간으로 4 ℃ 에서 중성-완충된 포름알데히드 용액의 이의 부피로 함침시키고, 실온에서 8 내지 16 시간 동안 유지시켰다. 고정된 표본을 60 ℃ 에서 진공 하에 파라핀 왁스 중에서 내장된 경도로 및 등급화된 에탄올 시리즈를 사용하여 자일렌으로 탈수시켰다. 종양 재료를 오픈 수술, 내시경검사 또는 코어/미세 침 생검에 의해 취하였다 (기준선에서, 4 주에서 (가능한 경우), 질병 진행에서). 시점 당 하나의 샘플을 포르말린 고정시키고 전술된 바와 같이 파라핀 내장시키고13a 3 개의 샘플을 액체 질소 중에서 스냅-냉동시켰다. 정상 DNA 를 제공하기 위해, 10 ml 의 전혈을 기준선에서 각 환자로부터 수득하고, -20 ℃ 에서 저장하거나 또는 사용시까지 온도를 낮추었다. 혈장 (2.5 ml) 을 기준선 및 4 주에서 Luminex 분석에 대해 수집하고, -80 ℃ 에서 저장하였다.
면역조직화학
포르말린 고정된 파라핀 내장된 (FFPE) 조직의 면역조직화학 (IHC) 분석을 사용하여 하기 단백질의 발현을 조사하는데 사용하였다: EGFR, 포스포(p)-EGFR, p-MAPK, Ki67 (MIB1), p27Kip1 (CDKN1B) 및 p-STAT3 (피부 및 종양 생검); HER2, p-HER2 및 p-AKT (종양 생검). 면역조직화학 분석을 이미 기술된 바와 같이 수행하였다1 3 a. 사용되는 항체 및 방법의 상세한 설명을 Supplementary Methods 구획에 제공하였다.
KRAS 돌연변이 분석
FFPE 환자-유래된 기록 보존 종양 조직을 (ITT) 개체군을 치료하기 위해 의도되는 48 명의 환자로부터 입수하였다. DNA 를 추출하고 폴리머라제 사슬 반응 (PCR) 클램핑 및 용융 곡선 기술 (문헌 [Chen et al, 200414 (LightMix, k-ras Gly12, TIB MOLBIOL, Berlin, Germany)] (상술된 바와 같음)12로부터 적합화됨) 을 사용하는 KRAS 코돈 12 및 13 돌연변이의 존재에 대해 스크리닝하였다.
RNA 발현 특성화
마이크로배열 분석에 관련된 실험적 절차는 Supplementary Methods 구획에서 상세히 기술되어 있다. 간략하게, 스냅-냉동 종양 생검을 균질화하고 총 RNA 를 RNeasy Micro Kit® (Qiagen, Hilden) 를 사용하여 추출하였다. 배열 하이브리드화 실험을 위한 비오틴화 표적 cRNA 를 Affymetrix Two-Cycle Eukaryotic Target 라벨링 프로토콜에 따른 모든 샘플로부터 제조하였다. 각 종양 분석에 대해, 초기 50 ng 의 총 RNA 를 이러한 cRNA 증폭/라벨링 방법의 첫번재 cDNA 합성 반응에서 포함시켰다. 라벨링된 cRNA 를 후속적으로 60 rpm 에서 45 ℃ 에서 16 시간 동안 Affymetrix GeneChip HG-U133 Plus 2.0 유전자 발현 배열로 후속적으로 하이브리드화시켰다. 하이브리드화 이후, 배열을 Affymetrix Fluidics Station 450 로 염색하고 GeneChip 스캐너를 사용하여 신호 정량화하였다. 원료 발현 데이터의 품질 제어를 Affymetrix GCOS 소프트웨어 및 Bioconductor 패키지 affyPLM15 (지적 재산권 소유) 를 사용하여 수행하였다. 복제품 배열이 개별 샘플로부터 입수가능한 경우, 최선의 품질 제어 평가된 데이터 세트를 분석을 위해 선별하였다. 원료 탐검-수준 강도 데이터의 가공을 GCRMA algorithm16 를 사용하여 수행하였다.
단백질체학 분석
uminex xMAP® 기술dmf 사용하여 혈장으로부터 97 단백질 (HumanMAP 버전 1.6 + 암피레귤린, 베타셀룰린, EGFR, 헤파린-결합 (HB)-EGF, 에피레귤린, 인터루킨-18, 변형 성장 인자 (TGF)-α 및 트롬보스폰딘-1) 의 다중 분석을 Rules-Based Medicine (Austin, Texas, US) 에서 수행하였다. 베타셀룰린, EGFR 및 HB-EGF 를 시험에 후기 등록된 환자로부터 23 개의 샘플에서만 평가하였다.
통계학적 분석
세툭시마브 및 FOLFIRI 의 조합 하에서 제 1 방사선학으로 확인된 질병 진행까지 세툭시마브의 제 1 주입으로부터의 기간으로서 규정되는 진행-없는 생존 (PFS) 및 반응률을 KRAS 에 대해 야생형 또는 돌연변이체 종양을 갖는 환자) 에 대해서, Fisher's 정확도 및 logrank 시험 각각을 사용하여 비교하였다.
IHC, 마이크로배열 및 단백질체학 데이터 (Supplementary Methods 참조) 의 모든 통계학적 분석을, Bioconductor 소프트웨어15 및 SAS 버전 9.1 을 사용하여 수행하였다. 이들 실험적 분석을 가설을 내는 관점으로 보았다.
참조 (본 명세서에 관련되고/되거나 사용되는 참조)
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Claims (45)

  1. 환자의 종양 샘플로부터의 핵산 샘플을 PCR 또는 RNA 또는 DNA 배열 또는 비교가능한 진단 툴 또는 장치로 처리함으로써 상기 환자로부터 수득되는 조직 샘플에서 하나 이상의 예후 유전자 또는 이의 유전자 발현 산물의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하는, EGFR 항체로 치료 받을 후보자인 KRAS 야생형 EGFR 발현 종양을 앓고 있는 환자가 상기 항-EGFR 항체로 치료하는 것에 반응할 가능성을 예측하기 위한 시험관내 방법으로서,
    (i) 하기로 이루어진 유전자 군으로부터 선택되는 유전자 또는 유전자 산물의 높은 발현은 참조 값에 비교하여 환자가 상기 치료에 반응할 것 같음을 나타내고: ADAMDEC1, BSDC1, C1orf144, CAPZB, CDC42, DHCR7, DNAJC8, ECSIT, EXOSC10, FADS1, GBA, GLT25D1, GOSR2, IMPDH1, KLHL21, KPNA6, KPNB1, LSM12, MAN1B1, MIDN, PPAN, SH3BP2, SQLE, SSH3, TNFRSF1B, URM1, ZFYVE26, RGMB, SPIRE2, ABCC5, ACSL5, AOAH, AXIN2, CD24, CEACAM5, CEACAM6, ETS2, FMNL2, GPSM2, HDAC2, JUN, ME3, MED17, MYB, MYC, NEBL, NOSIP, PITX2, POF1B, PPARG, PPP1R14C, PRR15, PSMG1, RAB15, RAB40B, RNF43, RPS23, SLC44A3, SOX4, THEM2, VAV3, ZNF337, EPDR1, KCNK5, KHDRBS3, PGM2L1, STK38, 및 SHROOM2,
    (ii) 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 또는 유전자 산물의 높은 발현은 참조 값에 비교하여 환자가 상기 치료에 반응하지 않을 것 같음을 나타냄: C7orf46, CAST, DCP2, DIP2B, ERAP1, INSIG2, KIF21A, KLK6, NGRN, NRIP1, PHGDH, PPP1R9A, QPCT, RABEP1, RPA1, RPL22L1, SKP1, SLC25A27, SLC25A46, SOCS6, TPD52, ZDHHC2, ZNF654, ASB6, ATM, BMI1, CDC42EP2, EDEM3, PLLP, RALBP1, SLC4A11, TNFSF15, TPK1, C11orf9, C1QC, CABLES1, CDK6, EHBP1, EXOC6, EXT1, FLRT3, GCNT2, MTHFS, PIK3AP1, ST3GAL1, TK2, ZDHHC14, ARFGAP3, AXUD1, CAPZB, CHSY1, DNAJB9, GOLT1B, HSPA5, LEPROTL1, LIMS1, MAPK6, MYO6, PROSC, RAB8B, RAP2B, RWDD2B, SERTAD2, SOCS5, TERF2IP, TIAL1, TIPARP, TRIM8, TSC22D2, TGFA, VAPA, 및 UBE2K.
  2. 제 1 항에 있어서, 치료가 제 1-선 요법으로서 항-EGFR 항체로 치료하는 것이고 군 (i) 의 유전자로부터 선택되는 유전자 또는 유전자 발현 산물이 하나 이상의 ADAMDEC1, BSDC1, C1orf144, CAPZB, CDC42, DHCR7, DNAJC8, ECSIT, EXOSC10, FADS1, GBA, GLT25D1, GOSR2, IMPDH1, KLHL21, KPNA6, KPNB1, LSM12, MAN1B1, MIDN, PPAN, SH3BP2, SQLE, SSH3, TNFRSF1B, URM1, VAV3 및 ZFYVE26 이고; 군 (ii) 의 유전자로부터 선택되는 유전자 또는 유전자 발현 산물이 하나 이상의 C7orf46, CAST, DCP2, DIP2B, ERAP1, INSIG2, KIF21A, KLK6, NGRN, NRIP1, PHGDH, PPP1R9A, QPCT, RABEP1, RPA1, RPL22L1, SKP1, SLC25A27, SLC25A46, SOCS6, TPD52, TGFA, ZDHHC2, 및 ZNF654 인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 환자가 화학요법-불응 종양으로 발전된 후 항-EGFR 항체로 치료하는 것이 화학요법제와 병용 요법인 치료이고, 군 (i) 로부터 선택되는 유전자 또는 유전자 발현 산물이 하나 이상의 RGMB, SPIRE2, ABCC5, ACSL5, AOAH, AXIN2, CD24, CEACAM5, CEACAM6, ETS2, FMNL2, GPSM2, HDAC2, JUN, ME3, MED17, MYB, MYC, NEBL, NOSIP, PITX2, POF1B, PPARG, PPP1R14C, PRR15, PSMG1, RAB15, RAB40B, RNF43, RPS23, SLC44A3, SOX4, THEM2, VAV3, ZNF337, EPDR1, KCNK5, KHDRBS3, PGM2L1, STK38, 및 SHROOM2 이고; 군 (ii) 로부터 선택되는 유전자 또는 유전자 발현 산물이 하나 이상의 ASB6, ATM, BMI1, CDC42EP2, EDEM3, PLLP, RALBP1, SLC4A11, TNFSF15, TPK1, C11orf9, C1QC, CABLES1, CDK6, EHBP1, EXOC6, EXT1, FLRT3, GCNT2, MTHFS, PIK3AP1, ST3GAL1, TK2, ZDHHC14, ARFGAP3, AXUD1, CAPZB, CHSY1, DNAJB9, GOLT1B, HSPA5, LEPROTL1, LIMS1, MAPK6, MYO6, PROSC, RAB8B, RAP2B, RWDD2B, SERTAD2, SOCS5, TERF2IP, TIAL1, TIPARP, TRIM8, TSC22D2, TGFA, VAPA, 및 UBE2K 인 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 임상적 반응이 전체 생존 시간 (OS) 이고, 군 (i) 로부터 선택되는 유전자가 하나 이상의 EPDR1, KCNK5, KHDRBS3, PGM2L1, SHROOM2, STK38, 및 VAV3 이고, 군 (ii) 로부터 선택되는 유전자가 하나 이상의 ASB6, ATM, BMI1, CDC42EP2, EDEM3, PLLP, RALBP1, SLC4A11, TNFSF15, 및 TPK1 이거나, 또는 상기 군 각각의 유전자 발현 산물 각각인 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 임상적 반응이 진행 없는 생존 시간 (PFS) 이고, 군 (i) 로부터 선택되는 유전자가 하나 이상의 ACSL5, AOAH, AXIN2, CD24, CEACAM5, CEACAM6, ETS2, FMNL2, GPSM2, HDAC2, JUN, ME3, MED17, MYB, MYC, NEBL, NOSIP, PITX2, POF1B, PPARG, PPP1R14C, PRR15, PSMG1, RAB15, RAB40B, RNF43, RPS23, SLC44A3, SOX4, THEM2, VAV3, 및 ZNF337 이고, 군 (ii) 로부터 선택되는 유전자가 하나 이상의 C11orf9, C1QC, CABLES1, CDK6, EHBP1, EXOC6, EXT1, FLRT3, GCNT2, MTHFS1, PIK3AP1, ST3GAL1, TK2, 및 ZDHHC14 이거나, 또는 상기 군 각각의 유전자 발현 산물 각각인 방법.
  6. 제 3 항에 있어서, 임상적 전체 반응 (OR) 이 부분적 반응 대 안정적 또는 진행성 질병으로서 측정되고, 군 (i) 로부터 선택되는 유전자가 하나 이상의 VAV3, RGMB, 및 SPIRE2 이고, 군 (ii) 로부터 선택되는 유전자가 하나 이상의 ARFGAP3, AXUD1, CAPZB, CHSY1, DNAJB9, GOLT1B, HSPA5, LEPROTL1, LIMS1, MAPK6, MYO6, PROSC, RAB8B, RAP2B, RWDD2B, SERTAD2, SOCS5, TERF2IP, TIAL1, TIPARP, TRIM8, TSC22D2, TGFA, VAPA, 및 UBE2K 이거나, 또는 상기 군 각각의 유전자 발현 산물 각각인 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 참조 값이 참조 환자 또는 참조 환자 군으로부터 수득되는 하나 이상의 특정 기능적 또는 임상적 속성 및/또는 특정 발현 특성에 의해 규정되는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 참조 값이 상기 유전자 또는 유전자 산물을 발현하지 않거나 거의 발현하지 않는 참조 환자 또는 환자군으로부터 수득되는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 참조 값이 대조군 유전자의 발현 역치 값 또는 군 (ii) 로부터 선택되는 유전자의 유전자 발현과 비교한 군 (i) 로부터 선택되는 유전자의 유전자 발현의 비이거나, 참조 값이 측정되는 특정 임상적 반응 파라미터에 의해 또는 특정 예비-치료 또는 치료 조건에 의해 규정되는 발현 역치 값인 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 임상적 반응 파라미터가 진행 없는 생존 시간 (PFS), 전체 생존 시간 (OS), 부분적 반응 (PR), 안정적 질병 (SD), 진행성 질병 (PD) 또는 이의 조합인 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 항-EGFR 항체로 치료하기 전에 환자로부터 조직 샘플을 취하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 항-EGFR 항체로 치료하는 중에 환자로부터 조직 샘플을 추가로 취하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 치료 중에 수득되는 유전자 또는 유전자 발현 산물의 발현 수준을 상기 환자의 치료 시작 전에 수득된 값과 비교하는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 환자 샘플이 종양 조직으로부터 유래되는 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 환자 샘플이 혈장으로부터 유래되는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자에 의해 인코딩되는 발현되는 단백질 수준을 측정하는 방법.
  17. 하기 단계를 포함하는, KRAS 야생형 EGFR 발현 암을 앓고 있는 환자가 항-EGFR 항체로 치료하는 것에 치료학적으로 반응할 가능성을 예측하기 위한 시험관내 방법:
    (a) 상기 환자의 종양 조직 또는 혈장으로부터 생검 조직 샘플에서 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 진단 수단 및/또는 진단 장치에 의해 측정하는 단계:
    군 (i): ADAMDEC1, BSDC1, C1orf144, CAPZB, CDC42, DHCR7, DNAJC8, ECSIT, EXOSC10, FADS1, GBA, GLT25D1, GOSR2, IMPDH1, KLHL21, KPNA6, KPNB1, LSM12, MAN1B1, MIDN, PPAN, SH3BP2, SQLE, SSH3, TNFRSF1B, URM1, ZFYVE26, RGMB, SPIRE2, ABCC5, ACSL5, AOAH, AXIN2, CD24, CEACAM5, CEACAM6, ETS2, FMNL2, GPSM2, HDAC2, JUN, ME3, MED17, MYB, MYC, NEBL, NOSIP, PITX2, POF1B, PPARG, PPP1R14C, PRR15, PSMG1, RAB15, RAB40B, RNF43, RPS23, SLC44A3, SOX4, THEM2, VAV3, ZNF337, EPDR1, KCNK5, KHDRBS3, PGM2L1, STK38, SHROOM2,
    및/또는 군 (ii) : C7orf46, CAST, DCP2, DIP2B, ERAP1, INSIG2, KIF21A, KLK6, NGRN, NRIP1, PHGDH, PPP1R9A, QPCT, RABEP1, RPA1, RPL22L1, SKP1, SLC25A27, SLC25A46, SOCS6, TPD52, ZDHHC2, ZNF654, ASB6, ATM, BMI1, CDC42EP2, EDEM3, PLLP, RALBP1, SLC4A11, TNFSF15, TPK1, C11orf9, C1QC, CABLES1, CDK6, EHBP1, EXOC6, EXT1, FLRT3, GCNT2, MTHFS, PIK3AP1, ST3GAL1, TK2, ZDHHC14, ARFGAP3, AXUD1, CAPZB, CHSY1, DNAJB9, GOLT1B, HSPA5, LEPROTL1, LIMS1, MAPK6, MYO6, PROSC, RAB8B, RAP2B, RWDD2B, SERTAD2, SOCS5, TERF2IP, TIAL1, TIPARP, TRIM8, TSC22D2, TGFA, VAPA, 및 UBE2K,
    (b) 상기 환자의 종양 또는 혈장으로부터의 생체-외 조직 샘플을 상기 항-EGFR 항체에 노출시키는 단계,
    (c) 단계 (b) 의 상기 노출된 조직 샘플에서 단계 (a) 에서 구체화된 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 다시 측정하는 단계, 및
    (d) 단계 (b) 및 (c) 에서 측정된 발현 수준에서 차이를 계산하는 단계,
    이때 단계 (a) 에 비해 단계 (c) 에서 수득되는 군 (i) 의 바이오마커의 발현 수준에서의 증가는, 상기 환자가 상기 항-EGFR 항체로 치료하는 것에 치료학적으로 반응할 가능성이 증가된 것을 나타내고, 이때 단계 (a) 에 비해 단계 (c) 에서 수득되는 군 (ii) 의 바이오마커의 발현 수준에서의 증가는 상기 환자가 상기 항-EGFR 항체로 치료하는 것에 치료학적으로 반응할 가능성이 감소된 것을 나타냄.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 또는 유전자 발현 산물이 TNFRSF1B, DNAJC8, ECSIT, GOSR2, PPP1R9A, VAV3 및 KLK6 로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 군 (i) 로부터의 유전자 또는 유전자 발현 산물 및 TGFa 중 하나인 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, VAV3 및 TGFa 의 발현 수준이 측정되는 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 군 (ii) 로부터의 유전자 또는 유전자 발현 산물 및 AREG 또는 EREG 중 하나인 방법.
  22. 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, TGFa, 및 AREG 또는 EREG 및 임의로는 VAV3 및/또는 EGF 의 발현 수준이 측정되는 방법.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, KRAS 야생형 EGFR 발현 종양을 앓고 있는 환자가 종양 조직에서 EGFR 돌연변이를 추가로 갖는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, EGFR 돌연변이가 R521K 다형인 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 항-EGFR 항체가 c225 (세툭시마브) 인 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 환자가 앓고 있는 종양이 대장암 (CRC) 또는 전이성 대장암 (mCRC) 인 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, AREG 및/또는 EREG 또는 이의 발현 산물의 발현 수준을 추가로 측정하고 군 (i) 및/또는 군 (ii) 의 유전자 또는 유전자 발현 산물 중 하나 이상과 비교하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, AREG 및/또는 EREG 및 하나 이상의 TGFA 및/또는 VAV3, 및/또는 EGF 또는 이의 유전자 발현 산물의 발현 수준을 측정하는 방법.
  29. 고형 표면상에 고정되어 있는 유전자 TNFRSF1B, DNAJC8, ECSIT, GOSR2, PPP1R9A, KLK6, C7orf46, SSH3 에 하이브리드화되거나 또는 이에 의해 제시되는 폴리뉴클레오티드의 정렬을 포함하는 DNA 또는 RNA 배열.
  30. 제 29 항에 있어서, 유전자 SERTAD2, AXIN2, C10orf99, ETS2, PITX2, PRR15, VAV3, IKK 상호작용 단백질을 코딩하는 유전자, EDEM3, LY6G6D 에 하이브리드화되거나 이에 의해 제시되는 폴리뉴클레오티드의 정렬을 추가로 포함하는 유전자 배열.
  31. 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 유전자 AREG 및/또는 EREG 및/또는 TGFA 에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 유전자 배열.
  32. 유전자 TNFRSF1B, DNAJC8, ECSIT, GOSR2, PPP1R9A, KLK6, C7orf46, SSH3, SERTAD2, AXIN2, C10orf99, ETS2, PITX2, PRR15, VAV3, IKK 상호작용 단백질을 코딩하는 유전자, EDEM3, LY6G6D, AREG, EREG 및 TGFA 에 하이브리드되거나 이에 의해 제시되는 폴리뉴클레오티드의 정렬로 이루어지는 DNA 또는 RNA 배열.
  33. 배열 상에 정렬된 유전자에 하이브리드화되거나 이에 의해 제시되는 고형 표면 상에 고정되어 있는 폴리뉴클레오티드의 정렬을 포함하는 DNA 또는 RNA 배열로서, 이때 폴리뉴클레오티드의 정렬은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택됨 :
    (a) ADAMEC1, C7orf46, CAST, DHCR7, ERAP1, FADS1, INSIG2, KLK6, MIDN, PHGDN, PPP1R9A, QPCT, RABEP1, RPL22L1, SLC25A27, SOCS6, SQLE, TNFRSF1B, TPD52, ZDHHC2,
    (b) GOLT1B, HSPA5, LEPROTL1, MAPK6, PROSC, RGMB, RWDD2B, SERTAD2, SPIRE2,
    (c) ASB6, ATM, BMI1, CDC42EP2, EDEM3, KCNK5, PGM2L1, RALBP1, SHROOM2, TNFSF15;
    (d) ACSL5, C1QC, CBALES1, CDK6, EHBP1, ETS2, EXOC6, EXT1, FMNL2, HDAC2, JUN, MED17, MTHFS, PITX2, POF1B, PRR15, PSMG1, RAB15, RAB40B, RNF43, SLC44A3, SOX4, TK2, TNFSF15, ZDHHC14,
    (e) ZDHHC14, TK2, PRR15, MTHFS, CABLES1, EHBP1, MED17, BMI1, CDC42EP2, EDEM3, PGM2L1, RGMB, ADAMEC1, ERAP1, FADS1, KLK6, PHGDH, PPP1R9A, QPCT, SLC25A27, TNFRSF1B, ZDHHC2.
  34. 제 33 항에 있어서, 유전자 AREG 및/또는 EREG 및/또는 TGFA 에 하이브리드화되거나 또는 이에 의해 제시되는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 유전자 배열.
  35. 제 1 항에 구체화된 바와 같은 군 (i) 및/또는 군 (ii) 의 유전자 하나 이상의 DNA 또는 RNA 를 포함하는 제 1 패키지; 상기 제 1 패키지의 상기 DNA/RNA 분자로 구체적으로 하이브리드화하는 PCR 프라이머를 포함하는 제 2 패키지; 웰-플레이트를 포함하는 제 3 패키지; 및 실시간 PCR 증폭이 수행될 수 있는 진단 수단 및 용매를 포함하는 제 4 패키지를 포함하는 유전적 항-EGFR 항체 바이오마커의 실시간 PCR 증폭용 키트.
  36. 제 35 항에 있어서, 제 1 패키지가 하기 유전자의 DNA/RNA 를 포함하는 키트: TNFRSF1B, DNAJC8, ECSIT, GOSR2, PPP1R9A, KLK6, C7orf46, SSH3, SERTAD2, AXIN2, C10orf99, ETS2, PITX2, PRR15, VAV3, IKK 상호작용 단백질을 코딩하는 유전자, EDEM3, LY6G6D, AREG, EREG 및 TGFA, 임의로는 또한 AREG 또는 EREG.
  37. 치료에 사용되는 것으로 의도되는 항-EGFR 항체에 대한 KRAS 야생형 EGFR 발현 암을 앓고 있는 환자의 임상적 반응 및/또는 약학적 효능을 예측하기 위한, 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 상기 바이오마커를 포함하는 유전적 항-EGFR 항체 바이오마커의 실시간 PCR 증폭용 키트 또는 유전자 배열 또는 유전적 바이오마커 하나 이상의 용도:
    ADAMDEC1, BSDC1, C1orf144, CAPZB, CDC42, DHCR7, DNAJC8, ECSIT, EXOSC10, FADS1, GBA, GLT25D1, GOSR2, IMPDH1, KLHL21, KPNA6, KPNB1, LSM12, MAN1B1, MIDN, PPAN, SH3BP2, SQLE, SSH3, TNFRSF1B, URM1, ZFYVE26, RGMB, SPIRE2, ABCC5,ACSL5, AOAH, AXIN2, CD24, CEACAM5, CEACAM6, ETS2, FMNL2, GPSM2, HDAC2, JUN, ME3, MED17, MYB, MYC, NEBL, NOSIP, PITX2, POF1B, PPARG, PPP1R14C, PRR15, PSMG1, RAB15, RAB40B, RNF43, RPS23, SLC44A3, SOX4, THEM2, VAV3, ZNF337, EPDR1, KCNK5, KHDRBS3, PGM2L1, STK38, SHROOM2;
    C7orf46, CAST, DCP2, DIP2B, ERAP1, INSIG2, KIF21A, KLK6, NGRN, NRIP1, PHGDH, PPP1R9A, QPCT, RABEP1, RPA1, RPL22L1, SKP1, SLC25A27, SLC25A46, SOCS6, TPD52, ZDHHC2, ZNF654, ASB6, ATM, BMI1, CDC42EP2, EDEM3, PLLP, RALBP1, SLC4A11, TNFSF15, TPK1, C11orf9, C1QC, CABLES1, CDK6, EHBP1, EXOC6, EXT1, FLRT3, GCNT2, MTHFS, PIK3AP1, ST3GAL1, TK2, ZDHHC14, ARFGAP3, AXUD1, CAPZB, CHSY1, DNAJB9, GOLT1B, HSPA5, LEPROTL1, LIMS1, MAPK6, MYO6, PROSC, RAB8B, RAP2B, RWDD2B, SERTAD2, SOCS5, TERF2IP, TIAL1, TIPARP, TRIM8, TSC22D2, TGFA, VAPA, 및 UBE2K, 임의로는 AREG 및/또는 EREG 과 조합으로, 또는 이의 각 단백질 발현 산물,
    이때, 상기 예측은, 근본적 임상 결정 파라미터로부터 측정되는 역치 값을 향한 발현 수준에서의 차이를 계산하는 것으로부터 생성됨.
  38. 제 37 항에 있어서, 하기 바이오마커의 하나 이상이 사용되는 용도: TNFRSF1B, DNAJC8, ECSIT, GOSR2, PPP1R9A, KLK6, C7orf46, SSH3, SERTAD2, AXIN2, C10orf99, ETS2, PITX2, PRR15, VAV3, IKK 상호작용 단백질을 코딩하는 유전자, EDEM3, LY6G6D, TGFA 또는 AREG 및/또는 EREG 를 포함하는 이의 조합.
  39. 하나 이상의 하기 유전자 또는 유전자 산물이 상기 환자의 종양 샘플에서 발현되거나 과다발현될 때 환자에서 KRAS 야생형 EGFR 발현 CRC 또는 mCRC 의 치료용 항-EGFR 항체인 약제의 제조를 위한, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커 하나 이상을 포함하는 유전적 항-EGFR 항체 바이오마커의 실시간 PCR 증폭용 키트 또는 유전자 배열 또는 유전적 바이오마커의 하나 이상의 용도: TNFRSF1B, DNAJC8, ECSIT, GOSR2, PPP1R9A, KLK6, C7orf46, SSH3, SERTAD2, AXIN2, C10orf99, ETS2, PITX2, PRR15, VAV3, IKK 상호작용 단백질을 코딩하는 유전자, EDEM3, LY6G6D, TGFA 또는 AREG 및/또는 EREG 을 추가로 포함하는 이의 조합.
  40. 제 37 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 발현 산물이 혈장을 포함하는 환자의 체액으로부터 측정되는 용도.
  41. 제 37 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 의도되는 근본 치료가 제 1-선 치료인 용도.
  42. 제 37 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 의도되는 근본 치료가 화학요법제와 상기 항-EGFR 항체의 병용 치료이고, 상기 환자가 화학요법-불응 암으로 발전되어진 용도.
  43. 제 37 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 항-EGFR 항체가 c225 (세툭시마브) 인 용도.
  44. 제 37 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 대장암 (CRC) 또는 전이성 대장암 (mCRC) 인 용도.
  45. 치료에 사용되도록 의도되는 항-EGFR 항체에 대해 KRAS 야생형 EGFR 발현 암을 앓고 있는 환자의 시험관내 약학적 효능 및/또는 임상적 반응을 결정하기 위한, 제 37 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에서 구체화된 바와 같은 유전자 또는 유전자 산물의 단백질 발현 산물에 특이적으로 결합하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 용도.
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