ES2844229T3

ES2844229T3 - Mutaciones génicas y alteraciones en el número de copias de EGFR, KRAS y MET

Info

Publication number: ES2844229T3
Application number: ES15792393T
Authority: ES
Inventors: Scott Kopetz; Amirali Talasaz
Original assignee: University of Texas System; Guardant Health Inc
Current assignee: University of Texas System; Guardant Health Inc
Priority date: 2014-05-13
Filing date: 2015-05-13
Publication date: 2021-07-21
Anticipated expiration: 2035-05-13
Also published as: EP3143163A4; US20170145516A1; WO2015175705A1; EP3805404A1; US11085086B2; EP3143163A1; EP3143163B1; US20190256927A1; US20210395836A1

Abstract

Un método que comprende: (a) en una muestra que comprende ácidos nucleicos de una célula cancerosa de un sujeto, enriquecer selectivamente uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos de EGFR, para producir una muestra enriquecida; (b) secuenciar el uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos de EGFR a partir de la muestra enriquecida para producir lecturas de secuencia; (c) determinar, entre las lecturas de secuencia, una presencia o una ausencia de por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de EGFR que codifica una variante de secuencia de aminoácidos o codones seleccionada del grupo que consiste de G465V, D1083N, I491R, K467I, y K1061T, en donde la numeración corresponde a la secuencia de aminoácidos de EGFR en el Número de Registro NCBI NP_005219.2; y (d) clasificar que el sujeto tiene un cáncer que no responde a terapia con cetuximab cuando se detecta la presencia de por lo menos una de las variantes de secuencia de nucleótidos de EGFR.

Description

DESCRIPCIÓN

Mutaciones génicas y alteraciones en el número de copias de EGFR, KRAS y MET

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El ADN libre de células (‘ADNcf’) permite la evaluación no invasiva de mutaciones génicas, pero no se ha informado de alteraciones en el número de copias. Las metodologías para integrar la mutación y el número de copias permitirían un mejor conocimiento de los mecanismos de resistencia y las oportunidades terapéuticas. La EP 2 554 551 A1, Buch et. al (Journal of Chemical Information and Modeling, 2013, vol. 53(12): p 3123-3126) y Montagut et. al. (Nature Medicine, 2012, vol. 18(2): p 221-223) divulgan mutaciones en el gen del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un método que comprende:

(a) en una muestra que comprende ácidos nucleicos de una célula cancerosa de un sujeto, enriquecer selectivamente uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos de EGFR, para producir una muestra enriquecida;

(b) secuenciar el uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos de EGFR a partir de la muestra enriquecida para producir lecturas de secuencia;

(c) determinar entre las lecturas de secuencia, una presencia o una ausencia de por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de EGFR que codifica una variante de secuencia de aminoácidos o codones seleccionada del grupo que consiste de G465V, D1083N, I491R, K467I, y K1061T, en donde la numeración corresponde a la secuencia de aminoácidos de EGFR en el Número de Registro NCBI NP_005219.2; y

(d) clasificar que el sujeto tiene un cáncer que no responde a terapia con cetuximab cuando se detecta la presencia de por lo menos una de las variantes de secuencia de nucleótidos de EGFR.

La invención también proporciona una composición para su uso en el tratamiento de un cáncer, en donde se ha clasificado que el sujeto tiene un cáncer que no responde a terapia con cetuximab mediante el método de la invención, y la composición comprende imatinib, gefitinib, afatinib, dacomitinib, vandetanib, neratinib, BMS-690514, RG7160, o Sym004.

También se divulga en la presente un método que comprende: (a) detectar, en una muestra que comprende polinucleótidos de un sujeto, por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de EGFR que codifica una variante de secuencia de aminoácidos o codones seleccionada de la que consiste de G465V, T130A, D1083N, I491R, K467I, T211T, K1061T y V876M; y (b) administrar al sujeto un tratamiento contra el cáncer distinto de la terapia anti-EGFR. En algunos casos, por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos EGFR se selecciona del grupo que consiste de G>T G465V, A>G T130A, G>A D1083N, T>G I491R, A>T K467I, C>G T211T, A>C K1061T, y G>A V876M. En algunos casos, el sujeto tiene cáncer colorrectal. En casos adicionales, el sujeto tiene cáncer colorrectal y ha sido tratado con terapia anti-EGFR. En algunos casos, la detección comprende detectar una pluralidad de variantes de secuencias de nucleótidos de EGFR. La detección puede comprender además detectar la amplificación de un gen de EGFR. La administración puede comprender administrar al sujeto un tratamiento contra el cáncer distinto de cetuximab. En algunos casos, la muestra comprende ADN libre de células. En algunos casos, la muestra es una muestra de sangre o una muestra de tumor. En algunos ejemplos, el sujeto tiene un cáncer que no responde al cetuximab. El sujeto puede tener un cáncer seleccionado del grupo que consiste de cáncer colorrectal y cáncer de cabeza y cuello. En algunos casos, el tratamiento contra el cáncer comprende administrar un anticuerpo dirigido a un epítopo de EGFR distinto del epítopo contra el que se dirige cetuximab. En algunos casos, el tratamiento contra el cáncer distinto de la terapia anti-EGFR comprende un tratamiento distinto de la administración de un anticuerpo dirigido a EGFR. El sujeto puede ser refractario a la terapia basada en 5-FU. La detección puede comprender además secuenciación de ADN. En algunos casos, la detección comprende una secuenciación de ADN de alto rendimiento. En algunos casos, la detección comprende la captura de secuencias de polinucleótidos que contienen la por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de EGFR. En algunos casos, la detección se realiza con una sensibilidad de por lo menos cualquiera del 1%, 0,1% o 0,01%. En algunos casos, la detección se realiza con una especificidad del 99%, 99,9% o 99,99%.

También se divulga un método comprende: (a) monitorizar, en uno o más momentos, a un sujeto sometido a terapia anti-EGFR, en donde la monitorización comprende detectar la presencia de por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de EGFR que codifica una variante de secuencia de aminoácidos o codones seleccionada del grupo que consiste deG465V, T130A, D1083N, I491R, K467I, T211T, K1061T y V876M; y (b) cuando se detecta la variante de secuencia de aminoácidos o codones, administrar al sujeto un tratamiento contra el cáncer distinto de la terapia anti-EGFR. En algunos casos, el sujeto padece cáncer colorrectal. En algunos casos, la monitorización comprende monitorizar al sujeto en una pluralidad de momentos diferentes. En algunos ejemplos, la presencia de por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de EGFR se monitoriza en una muestra del sujeto, en donde la muestra comprende ADN libre de células. La monitorización puede comprender además monitorizar al paciente para detectar la amplificación de un gen de EGFR y, cuando se detecta la amplificación del gen de EGFR, administrar al sujeto un tratamiento contra el cáncer distinto de la terapia anti-EGFR. Los métodos pueden comprender además cesar la terapia anti-EGFR cuando se detecta la presencia de por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de EGFR.

También se divulga un método que comprende: (a) en una muestra que comprende ácidos nucleicos de una célula cancerosa de un sujeto, enriquecer selectivamente uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos de EGFR, para producir una muestra enriquecida; (b) secuenciar el uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos de EGFR de la muestra enriquecida para producir lecturas de secuencia; (c) determinar, entre las lecturas de secuencia, la presencia o ausencia de por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de EGFR que codifica una variante de secuencia de aminoácidos o codones seleccionada del grupo que consiste de G465V, T130A, D1083N, I491R, K467I, T211T, K1061T yV876M; y (d) clasificar al sujeto con un cáncer que no responde a la terapia anti-EGFR. En algunos casos, la determinación comprende determinar la presencia o ausencia de una pluralidad de variantes de secuencia de nucleótidos de EGFR.

También se divulga un método comprende administrar a un sujeto que tiene un cáncer caracterizado por al menos una variante de secuencia de nucleótidos de EGFR que codifica una variante de secuencia de aminoácidos o codones seleccionada del grupo que consiste de G465V, T130A, D1083N, I491R, K467I, T211T, K1061T y V876M, un tratamiento contra el cáncer distinto de la terapia anti-EGFR.

También se divulga una composición que comprende uno o más soportes sólidos, cada uno de los uno o más soportes sólidos teniendo unida al mismo una sonda de captura de ácidos nucleicos, en donde cada sonda de captura de ácidos nucleicos comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida, bajo condiciones de hibridación rigurosas, con una secuencia de nucleótidos de EGFR dentro de 200 nucleótidos de un codón que codifica un aminoácido seleccionado de cualquiera de las posiciones: 465, 130, 1083, 491, 467, 211, 1061 y 876. En algunos casos, el uno o más soportes sólidos tienen unidas a los mismos una pluralidad de sondas de captura de ácidos nucleicos, cada una de la pluralidad de sondas de captura de ácidos nucleicos hibridando con una diferente de las secuencias de nucleótidos de EGFR. En algunos casos, el uno o más soportes sólidos comprenden partículas atraíbles magnéticamente.

También se divulga un sistema que comprende un medio legible por ordenador que comprende un código ejecutable por máquina que, tras la ejecución por un procesador informático, implementa un método que comprende: (a) recibir en la memoria lecturas de secuencia de polinucleótidos; (b) determinar, entre las lecturas de secuencia, una identidad de nucleótidos dentro de los codones que codifican un aminoácido de EGFR seleccionado de cualquiera de las posiciones: 465, 130, 1083, 491, 467, 211, 1061 y 876; (c) informar la presencia de por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de EGFR que codifica una variante de secuencia de aminoácidos o codones seleccionada del grupo que consiste de G465V, T130A, D1083N,1491 R, K467I, T211T, K1061T y V876M y, opcionalmente, una cantidad relativa de la variante de secuencia de nucleótidos en comparación con una secuencia de nucleótidos en la misma posición de un genoma humano de referencia.

También se divulga un método que comprende: (a) detectar, en una muestra que comprende polinucleótidos de un sujeto, por lo menos una mutación de KRAS y por lo menos una amplificación del gen de KRAS; y (b) administrar al sujeto un tratamiento contra el cáncer distinto de la terapia anti-EGFR. En algunos casos, el sujeto tiene cáncer colorrectal. En otros casos, el sujeto tiene cáncer colorrectal y ha sido tratado con la terapia anti-EGFR. En algunos casos, la muestra comprende ADN libre de células. En algunos casos, la por lo menos una mutación de KRAS se selecciona del grupo que consiste de G12C, G12R, G13D y Q61H.

También se divulga un método que comprende: (a) monitorizar, en uno o más momentos, a un sujeto sometido a terapia anti-EGFR, en donde la monitorización comprende detectar la presencia de por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de KRAS y por lo menos una amplificación del gen de KRAS; y (b) cuando se detectan por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de KRAS y por lo menos una amplificación del gen de KRAS, administrar al sujeto un tratamiento contra el cáncer distinto de la terapia anti-EGFR. En algunos casos, la por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de KRAS no se detecta en un tumor primario del sujeto o no se detecta en una prueba previa para la presencia de una variante de secuencia de nucleótidos de KRAS en el sujeto. En algunos casos, la por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de KRAS se selecciona del grupo que consiste de G12C, G12R, G13D y Q61H.

También se divulga un método que comprende: (a) en una muestra que comprende ácidos nucleicos de una célula cancerosa de un sujeto, enriquecer selectivamente uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos de KRAS, para producir una muestra enriquecida; (b) secuenciar el uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos de KRAS de la muestra enriquecida para producir lecturas de secuencia; (c) determinar, entre las lecturas de secuencia, la presencia de por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de KRAS y la presencia de por lo menos una amplificación del gen de KRAS; y (d) clasificar que el sujeto tiene un cáncer que no responde a la terapia anti-EGFR. En algunos casos, la por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de KRAS no se detecta en un tumor primario del sujeto o no se detecta en una prueba previa para la presencia de una variante de secuencia de nucleótidos de KRAS en el sujeto. En algunos casos, la por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste de G12C, G12R, G13D y Q61H.

También se divulga un método que comprende administrar a un sujeto que tiene un cáncer caracterizado por al menos una variante de secuencia de nucleótidos de KRAS y por lo menos una amplificación del gen de KRAS, un tratamiento contra el cáncer distinto de la terapia anti-EGFR. En algunos casos, la por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de KRAS no se detecta en un tumor primario del sujeto o no se detecta en una prueba previa para la presencia de una variante de secuencia de nucleótidos de KRAS en el sujeto. En algún caso, la por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de KRAS se selecciona del grupo que consiste de G12C, G12R, G13D y Q61H.

También se divulga un sistema que comprende un medio legible por ordenador que comprende un código ejecutable por máquina que, tras la ejecución por un procesador informático, implementa un método que comprende: (a) recibir en la memoria lecturas de secuencia de polinucleótidos; (b) determinar, entre dichas lecturas de secuencia, (i) una identidad de variantes de nucleótidos de un gen de KRAS y (ii) amplificación de un gen de KRAS; y (c) informar, la presencia de por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de KRAS y la cantidad de amplificación del gen de KRAS.

También se divulga un método que comprende: (a) detectar, en una muestra que comprende polinucleótidos de un sujeto, por lo menos una mutación de KRAS no detectada en un tumor primario del sujeto; y (b) administrar al sujeto un tratamiento contra el cáncer distinto de la terapia anti-EGFR. En algunos casos, la por lo menos una mutación de KRAS se selecciona del grupo que consiste de G12C, G12R, G13D y Q61H.

También se divulga un método que comprende: (a) monitorizar, en uno o más momentos, a un sujeto sometido a terapia anti-EGFR, en donde la monitorización comprende detectar una nueva aparición de por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de KRAS; y (b) cuando se detecta la por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de KRAS, administrar al sujeto un tratamiento contra el cáncer distinto de la terapia anti-EGFR. En algunos casos, la por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de KRAS se selecciona del grupo que consiste de G12C, G12R, G13D y Q61H.

También se divulga un método que comprende administrar a un sujeto que tiene un cáncer caracterizado por al menos una variante de secuencia de nucleótidos de KRAS no presente en un tumor primario, un tratamiento contra el cáncer distinto de la terapia anti-EGFR. En algunos casos, la por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de KRAS se selecciona del grupo que consiste de G12C, G12R, G13D y Q61H.

También se divulga un método que comprende: (a) detectar, en una muestra que comprende polinucleótidos de un sujeto, la presencia de una amplificación génica en MET; y (b) cuando se detecta la amplificación génica, administrar al sujeto un tratamiento contra el cáncer distinto de la terapia anti-EGFR. En algunos casos, la detección comprende además detectar la presencia de una amplificación génica en uno o ambos de EGFR y KRAS.

También se divulga un método que comprende: (a) detectar, en una muestra que comprende polinucleótidos de un sujeto, la presencia de por lo menos una variante de secuencia y/o por lo menos una amplificación génica en un gen seleccionado de EGFR, KRAS, BRAF, MET, SMO, MYC, NRAS, ERBB2, ALK, Notch, PIK3CA y APC; y (b) cuando se detecta por lo menos una variante de secuencia y/o la por lo menos una amplificación génica, administrar al sujeto un tratamiento contra el cáncer distinto de la terapia anti-EGFR. En algunos casos, el tratamiento contra el cáncer distinto de la terapia anti-EGFR se administra cuando se detecta por lo menos una variante de secuencia y/o por lo menos una amplificación génica en por lo menos cualquiera de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 de los genes. En algunos casos, el tratamiento contra el cáncer distinto de la terapia anti-EGFR es una terapia eficaz sobre un cáncer en el que se detecta dicha variante de secuencia y/o amplificación génica.

También se divulga un método que comprende: (a) detectar, en una muestra que comprende polinucleótidos de un sujeto, por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de EGFR que codifica una variante de secuencia de aminoácidos o codones seleccionada del grupo que consiste de G465V, T130A, D1083N, I491R, K467I, T211T, K1061T y V876M; (b) detectar, en la muestra que comprende polinucleótidos del sujeto, la presencia de por lo menos una de una variante de secuencia de nucleótidos de KRAS y una amplificación del gen de KRAS; y (c) administrar al sujeto un tratamiento contra el cáncer distinto de la terapia anti-EGFR. En algunos casos, el sujeto tiene cáncer colorrectal. En casos adicionales, el sujeto tiene cáncer colorrectal y ha sido tratado con terapia anti-EGFR. En algunos casos, el paso (a) comprende detectar una pluralidad de variantes de secuencia de nucleótidos de EGFR. En algunos casos, el paso (a) comprende además detectar la amplificación de un gen de EGFR. En otro caso, la por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de KRAS es una mutación en KRAS. En algunos casos, la mutación en KRAS se selecciona del grupo que consta de G12C, G12R, G13D y Q61H. En casos adicionales, el paso (b) comprende detectar por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de KRAS y por lo menos una amplificación del gen de KRAS. En algunos casos, la muestra comprende ADN libre de células.

También se divulga un método que comprende: (a) detectar, en una muestra que comprende polinucleótidos de un sujeto, una amplificación génica en por lo menos uno de EGFR, BRAF, MYC y SMO; (b) cuando se detecta la amplificación génica en por lo menos uno de EGFR, BRAF, MYC y SMO, administrar al sujeto un tratamiento contra el cáncer distinto de la terapia anti-EGFR.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 representa una representación esquemática de un sistema para analizar una muestra que comprende ácidos nucleicos de un usuario, que incluye un secuenciador, software bioinformático y conexión a Internet para el análisis de informes mediante, por ejemplo, un dispositivo de mano o un ordenador de escritorio. La Figura 2 muestra mutaciones recién detectadas en pacientes con KRASwt después de la progresión al tratamiento estándar (el tumor progresó después del tratamiento con cetuximab).

La Figura 3 muestra mutaciones recién detectadas en pacientes con KRASmut después de la progresión al tratamiento estándar.

La Figura 4 muestra la alteración génica de EGFR, KRAS y MET concomitante.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Introducción

Esta divulgación proporciona métodos y composiciones para usar variantes genéticas en el diagnóstico, pronóstico y selección de tratamiento de un sujeto, en particular, un sujeto que padece cáncer. Las variantes genéticas pueden ser variaciones de secuencias de nucleótidos o variaciones del número de copias. En casos particulares, los métodos prevén el uso de variantes genéticas en el gen de EGFR, el gen de KRAS y el gen de MET en el diagnóstico, pronóstico y selección del tratamiento de un sujeto, en particular, un sujeto que padece cáncer.

Los mutantes y amplificaciones de KRAS y EGFR se correlacionan con la resistencia a la terapia anti-EGFR en pacientes con cáncer, en particular pacientes con cáncer colorrectal. La detección de estas variantes de secuencia y/o amplificaciones de genes puede usarse para monitorizar a los pacientes con cáncer y para dirigir la terapia (por ejemplo, como diagnóstico complementario).

Métodos de divulgación

Puede analizarse una muestra de un sujeto para detectar la presencia o ausencia de una o más variantes genéticas y, si se detecta, la terapia anti-EGFR se reduce o cesa. En otros aspectos, se analiza una muestra de un sujeto para detectar la presencia o ausencia de una o más variantes genéticas y, si se detecta, se comienza una terapia distinta a la terapia anti-EGFR. En algunos casos, la variante genética es un biomarcador.

En un caso, se monitoriza a un sujeto, en uno o más momentos, para detectar cambios genéticos que indiquen la aparición del biomarcador y, cuando se detecta el biomarcador, se reduce o cesa una terapia anti-EGFR y/o se introduce una terapia diferente de la terapia anti-EGFR. En particular, la terapia puede ser una a la que se sabe que responde un cáncer caracterizado por tal variante genética. La monitorización de un sujeto en uno o más momentos puede incluir, sin limitación, la monitorización antes y después de una terapia o cirugía, la monitorización dos o más veces antes y después de una terapia o cirugía, y la monitorización dos o más veces después de una terapia o cirugía. La monitorización puede incluir determinar una evaluación de referencia o el estado de valor de referencia de un sujeto. La determinación de una evaluación o estado de referencia de un sujeto puede incluir determinar la presencia o ausencia de una variante genética en uno o más genes antes del tratamiento con terapia anti-EGFR. Las variantes genéticas pueden ser cualquiera de las variantes genéticas enumeradas en la Tabla 1. Una evaluación de referencia puede determinar que un sujeto es de tipo salvaje o variante de un gen. Un sujeto que se ha determinado que tiene un estado de referencia de tipo salvaje puede comenzar con la terapia anti-EGFR. Un sujeto que se ha determinado que tiene un estado de referencia mutante o variante puede comenzar con un tratamiento diferente a la terapia anti-EGFR. La monitorización puede comprender además monitorizar a un sujeto durante o después del tratamiento con terapia anti-EGFR. El sujeto puede probarse para detectar la presencia o ausencia de una variante genética en un gen. La variante genética puede ser cualquiera de las variantes genéticas enumeradas en la Tabla 1. En un ejemplo, puede detectarse una variante genética en un gen de un sujeto durante o después de la terapia anti-EGFR. La variante genética puede ser una que no se haya detectado anteriormente en el mismo sujeto antes de la terapia anti-EGFR. La aparición de una nueva variante genética puede indicar que el sujeto es resistente a la terapia anti-EGFR. La aparición de una nueva variante genética puede indicar que el sujeto debe ser tratado con una terapia anti-EGFR alternativa o un tratamiento distinto de la terapia anti-EGFR.

En un ejemplo particular, los polinucleótidos de un sujeto se enriquecen selectivamente para secuencias de uno o más de los genes como se describe en la presente y se determina la presencia o ausencia de una o más variantes genéticas de esta divulgación. Si se detecta, el sujeto se clasifica como que tiene un cáncer que no responde a la terapia anti-EGFR, o que tiene un cáncer para el cual la terapia anti-EGFR debe complementarse o reemplazarse con una terapia anti-EGFR diferente o una terapia distinta a la terapia anti-EGFR. Puede proporcionarse un soporte sólido que esté configurado para capturar selectivamente polinucleótidos que tienen secuencias (por ejemplo, una secuencia que comprende una alteración genética que incluye, específicamente, una forma mutante asociada con la resistencia a la terapia anti-EGFR). Este soporte puede usarse para capturar selectivamente tales polinucleótidos. Los polinucleótidos capturados pueden ser secuencias y las secuencias pueden analizarse para uno o más de los biomarcadores descritos en la presente. Dicho análisis puede realizarse mediante un ordenador programable que informa de la presencia o ausencia de una o más variantes genéticas. Biomarcadores

La divulgación proporciona métodos para usar biomarcadores para el diagnóstico, pronóstico y selección de terapia de un sujeto que padece, por ejemplo, de cáncer. Un biomarcador puede ser cualquier gen o variante de un gen cuya presencia, mutación, deleción, sustitución, número de copias o traducción (es decir, a una proteína) es un indicador de un estado de enfermedad. Los biomarcadores de la presente divulgación pueden incluir la presencia, mutación, deleción, sustitución, número de copia o traducción en uno cualquiera o más de EGFR, KRAS, MET, BRAF, MYC, NRAS, ERBB2, ALK, Notch, PIk3cA, APC y SMO. Los biomarcadores pueden ser cualquiera de las variantes genéticas enumeradas en la Tabla 1 siguiente.

EGFR

Un biomarcador puede ser una variante genética detectada en el gen de EGFR. Las secuencias de nucleótidos que codifican EGFR pueden encontrarse en Secuencia de Referencia NCBI NG_007726 (genómica), Secuencia de referencia NCBI Nm_201284.1 (ARNm), Secuencia de referencia NCBI NM_005228.3 (ARNm), Secuencia de referencia NCBI NM_201282.1 (ARNm), Secuencia de referencia NCBI NM_201283.1 (ARNm). Las secuencias de aminoácidos para EGFR pueden encontrarse en Secuencia de referencia NCBI NP_958441.1, Secuencia de referencia N^cBⁱ958440.1, Secuencia de referencia NCBI NP_958439.1, y N° de Registro NCBI NP_005219.2.

En algunos casos, el biomarcador es una variante de secuencia de nucleótidos en EGFR. La variante de secuencia de nucleótidos puede incluir, sin limitación, G>T G465V, A>G T130A, G>A D1083N, T>G I491R, A>T K467I, C>G T211T, A>C K1061T, A>T K1061T, y G>A V876M. La variante de secuencia de nucleótidos puede codificar una variante de secuencia de aminoácidos o codones que incluye, sin limitación, G465V, T130A, D1083N, I491R, K467I, T211T, K1061T, y V876M correspondientes a las secuencias de aminoácidos para EGFR como se expone en el Número de registro NCBI NP_005219.2. En algunos ejemplos, la variante de secuencia de nucleótidos codifica una variante de secuencia de aminoácidos o codones en el ectodominio de EGFR. Por tanto, las mutaciones del ectodominio pueden funcionar como biomarcadores de la resistencia anti-EGFR. Ejemplos de tales mutaciones de ectodominio pueden incluir, sin limitación, S492R, G465V, I491R, y K467I. Una variante de secuencia de nucleótidos de EGFR puede prevenir o reducir la unión de un anticuerpo anti-EGFR a EGFR. El anticuerpo anti-EGFR puede ser cetuximab. En un ejemplo particular, la variante de EGFR evita o reduce la unión de cetuximab a EGFR. En tales casos, el sujeto puede tratarse con una terapia de anticuerpos anti-EGFR alternativa (por ejemplo, panitumumab) o un tratamiento distinto de la terapia anti-EGFR. En algunos casos, puede usarse una mutación en el ectodominio de EGFR para seleccionar un anticuerpo adecuado como terapia anti-EGFR. En este ejemplo, puede elegirse un anticuerpo que reconozca un epítopo con la mutación particular. En esta situación, el anticuerpo puede usarse como una terapia anti-EGFR alternativa para tratar a sujetos que han desarrollado resistencia a la terapia anti-EGFR primaria.

En algunos casos, el biomarcador es una variación del número de copias en el gen de EGFR. La variación del número de copias puede ser una amplificación o una deleción o truncamiento del gen de EGFR. En casos particulares, puede detectarse una amplificación del gen de EGFR. Una amplificación de EGFR puede ser 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 10 o más copias de EGFR. Una deleción o truncamiento de EGFR puede ser 0 o 1 copias de EGFR. En algunos casos, puede detectarse una variante de secuencia de nucleótidos de EGFR y una amplificación del gen de EGFR.

En algunos casos, se monitoriza a un sujeto, en uno o más momentos, para detectar la presencia o ausencia de una o más variantes genéticas en EGFR. La monitorización de un sujeto en uno o más momentos puede incluir, sin limitación, la monitorización antes y después de una terapia o cirugía, la monitorización dos o más veces antes y después de una terapia o cirugía, y la monitorización dos o más veces después de una terapia o cirugía. En algunos casos, la presencia de una variante genética en EGFR puede indicar que el sujeto es resistente a la terapia anti-EGFR. En algunos casos, la presencia de una variante genética en EGFR puede indicar que la terapia anti-EGFR ya no es eficaz para tratar un cáncer en el sujeto. En algunos casos, la presencia de la variante genética se detecta en un sujeto sometido a tratamiento con terapia anti-EGFR. En algunos casos, la variante genética es indetectable en el tumor primario del sujeto. En algunos casos, la variante genética es indetectable en una prueba previa para detectar la presencia de la variante genética EGFR. Si se detecta una variante genética, la terapia anti-EGFR puede reducirse o interrumpirse y puede iniciarse una terapia alternativa. La terapia alternativa puede ser una terapia anti-EGFR alternativa o una terapia diferente a la terapia anti-EGFR.

KRAS

Un biomarcador puede ser una variante genética detectada en el gen de KRAS. Las secuencias de nucleótidos que codifican KRAS pueden encontrarse en la Secuencia de referencia NCBI NG_007524.1 (genómica), Secuencia de referencia NCBI NM_033360.3 (ARNm), Secuencia de referencia NCBI XM_006719069.1 (ARNm) y Secuencia de referencia NCBI NM_004985.4 (ARNm). Las secuencias de aminoácidos para KRAS pueden encontrarse en Secuencia de referencia NCBI XP_006719132.1, Secuencia de referencia NCBI NP_203524.1 y Secuencia de referencia NCBI NP_004976.2.

En algunos casos, un biomarcador es una variante de secuencia de nucleótidos en KRAS. La variante de secuencia de nucleótidos de KRAS puede codificar una variante de secuencia de aminoácidos o codones que incluye, sin limitación, G12C, G12R, G13D y Q61H correspondientes a la secuencia de aminoácidos como se expone, por ejemplo, en la Secuencia de referencia NCBI NP_004976.2. En algunos casos, la variante genética es una variación en el número de copias en KRAS. La variación en el número de copias puede ser una amplificación o deleción de un gen. En casos particulares, puede detectarse una amplificación del gen de KRAS. Una amplificación de KRAS puede ser de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 10 o más copias de KRAS. Una deleción o truncamiento de KRAS puede ser 0 o 1 copias de KRAS. En algunos casos, puede detectarse una variante de secuencia de nucleótidos KRAS y una amplificación del gen de KRAS.

En algunos casos, se monitoriza a un sujeto, en uno o más momentos, para detectar la presencia o ausencia de una o más variantes genéticas en KRAS. La monitorización de un sujeto en uno o más momentos puede incluir, sin limitación, la monitorización antes y después de una terapia o cirugía, la monitorización dos o más veces antes y después de una terapia o cirugía, y la monitorización dos o más veces después de una terapia o cirugía. En algunos casos, la presencia de una variante genética en KRAS puede indicar que el sujeto es resistente a la terapia anti-EGFR. En algunos casos, la presencia de una variante genética en KRAS puede indicar que la terapia anti-EGFR ya no es eficaz para tratar un cáncer en el sujeto. En algunos casos, la presencia de la variante genética se detecta en un sujeto sometido a tratamiento con terapia anti-EGFR. En algunos casos, la variante genética es indetectable en el tumor primario del sujeto. En algunos casos, la variante genética es indetectable en una prueba previa para la presencia de la variante genética de KRAS. Si se detecta una variante genética, la terapia anti-EGFR puede reducirse o interrumpirse y puede iniciarse una terapia alternativa. La terapia alternativa puede ser una terapia anti-EGFR alternativa o una terapia diferente a la terapia anti-EGFR.

MET

Un biomarcador puede ser una variante genética detectada en el gen de MET. Las secuencias de nucleótidos que codifican MET pueden encontrarse en la Secuencia de referencia NCBI NG_008996.1 (genómica), Secuencia de referencia NCBI XM_006715991.1 (ARNm), Secuencia de referencia NCBI XM_006715990.1 (ARNm), Secuencia de referencia NCBI XM_006715989.1 (ARNm), Secuencia de referencia NCBI XM_006715988.1 (ARNm), Referencia NCBI NM_001127500.1 (ARNm) y la secuencia de referencia NCBI NM_000245.2 (ARNm). Las secuencias de aminoácidos para MET pueden encontrarse en la Secuencia de referencia NCBI XP_006716054.1, Secuencia de referencia NCBI XP.006716053.1, Secuencia de referencia NCBI XP.006716052.1, Secuencia de referencia NCBI XP_006716051.1, Secuencia de referencia NCBI NP_001120972.1, y Secuencia de referencia NCBI NP_000236. 2.

Una variante genética puede ser una variación del número de copias en MET. La variación del número de copias puede ser una amplificación génica o un truncamiento. En casos particulares, se analiza una muestra derivada de un sujeto para una amplificación del gen de MET. Una amplificación de MET puede ser 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 10 o más copias de MET. Una deleción o truncamiento de MET puede ser 0 o 1 copias de MET. En algunos casos, se detecta una amplificación del gen de MET con una amplificación en por lo menos uno de EGFR y KRAS. El sujeto está preferiblemente en terapia anti-EGFR, o tiene necesidad de ella.

En algunos casos, se monitoriza al sujeto, en uno o más momentos, para detectar la presencia o ausencia de una o más variantes genéticas en MET. La monitorización de un sujeto en uno o más momentos puede incluir, sin limitación, la monitorización antes y después de una terapia o cirugía, la monitorización dos o más veces antes y después de una terapia o cirugía, y la monitorización dos o más veces después de una terapia o cirugía. En algunos casos, la presencia de una variante genética en MET puede indicar que el sujeto es resistente a la terapia anti-EGFR. En algunos casos, la presencia de una variante genética en MET junto con una amplificación en por lo menos uno de EGFR y KRAS puede indicar que el sujeto es resistente a la terapia anti-EGFR. En particular, las variaciones en el número de copias en dos o los tres de EGFR, KRAS y MET pueden ser indicativas de resistencia a la terapia anti-EGFR. En algunos casos, la presencia de la variante(s) genética se detecta en un sujeto sometido a tratamiento con terapia anti-EGFR. En algunos casos, la variante(s) genética es indetectable en el tumor primario del sujeto. En algunos casos, la variante(s) genética es indetectable en una prueba previa para detectar la presencia de las mismas variantes genéticas. En estos ejemplos, la terapia anti-EGFR puede reducirse o interrumpirse y puede iniciarse una terapia alternativa. La terapia alternativa puede ser una terapia anti-EGFR alternativa o una terapia diferente a la terapia anti-EGFR.

Otros genes

Un sujeto resistente a las terapias anti-EGFR puede presentar variantes de secuencia y/o variaciones en el número de copias en por lo menos uno de una pluralidad de genes diferentes. Estas incluyen, sin limitación, variaciones de secuencia en los genes de EGFR, KRAS, BRAF, MYC, NRAS, ERBB2, ALK, Notch, PIK3CA y APC; y variaciones en el número de copias en los genes de Eg Fr , KrAs , b Ra F, m Et , SMO, My C, ALK y Notch.

En algunos casos, se monitoriza al sujeto, en uno o más momentos, para detectar la presencia o ausencia de una o más variantes genéticas en cualquiera de estos genes. En algunos casos, la presencia de una variante genética en cualquiera de los genes de eGf R, KRAS, MET, BRAF, MYC, NRAS, ERBB2, ALK, Notch, PIK3CA, SMO y APC puede indicar que el sujeto es resistente a terapia anti-EGFR. En algunos casos, la presencia de una variante genética en cualquiera de estos genes junto con una amplificación en por lo menos uno de EGFR y KRAS puede indicar que el sujeto es resistente a la terapia anti-EGFR. En algunos casos, la presencia de una variante genética en cualquiera de estos genes puede indicar que la terapia anti-EGFR ya no es eficaz para tratar un cáncer en el sujeto. En algunos casos, la presencia de una variante genética en cualquiera de estos genes junto con una amplificación en por lo menos uno de EGFR y KRAS puede indicar que la terapia anti-EGFR ya no es eficaz para tratar un cáncer en el sujeto. En algunos casos, la presencia de la variante(s) genética se detecta en un sujeto que se somete a tratamiento con terapia anti-EGFR. En algunos casos, la variante(s) genética es indetectable en el tumor primario del sujeto. En algunos casos, la variante(s) genética es indetectables en una prueba previa para detectar la presencia de las mismas variantes genéticas. En estos ejemplos, la terapia anti-EGFR puede reducirse o interrumpirse y puede iniciarse una terapia alternativa. La terapia alternativa puede ser una terapia anti-EGFR alternativa o una terapia diferente a la terapia anti-EGFR.

Terapia anti-EGFR

Terapia anti-EGFR puede referirse a cualquier terapia dirigida a bloquear la expresión o actividad de EGFR, por ejemplo, directamente o a través de su vía. La terapia de EGFR puede implicar el uso de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, dirigidos contra EGFR. Los ejemplos no limitativos de anticuerpos adecuados para su uso como terapia anti-EGFR incluyen cetuximab (nombre comercial: Erbitux) y panitumumab (nombre comercial: Vectibex). En algunos casos, la terapia anti-EGFR puede implicar el uso de inhibidores de tirosina quinasa de EGFR. Los ejemplos no limitativos de inhibidores de tirosina quinasa de EGFR incluyen gefitinib (nombre comercial: Iressa), erlotinib (nombre comercial: Tarceva), lapatinib y canertinib. En casos particulares, la terapia anti-EGFR es cetuximab. En algunos casos, la terapia anti-EGFR puede usarse en combinación con una terapia distinta a la terapia anti-EGFR. La terapia anti-EGFR puede usarse en combinación con cualquier combinación de agentes quimioterapéuticos o regímenes quimioterapéuticos, por ejemplo, FOLFOX (fluorouracil [5-FU]/leucovorin/oxaliplatino), FOLFIRI (5-FU/leucovorin/irinotecan), y similares.

Tratamientos contra el cáncer distintos a la terapia anti-EGFR

Puede administrarse a un sujeto un tratamiento contra el cáncer distinto a la terapia anti-EGFR. En algunos casos, el tratamiento contra el cáncer distinto de la terapia anti-EGFR se administra en combinación con la terapia anti-EGFR. En algunos casos, el tratamiento contra el cáncer distinto de la terapia anti-EGFR es un anticuerpo que se dirige a un epítopo de EGFR distinto del epítopo contra el que se dirige cetuximab. En algunos casos, el tratamiento contra el cáncer distinto de la terapia anti-EGFR incluye, sin limitación, imatinib, gefatinib, afatinib, dacomitinib, sunitinib, sorafenib, vandetanib, brivanib, cabozantib, neratinib, tivantinib, bevacizumab, cixutumumab, dalotuzumab, figitumumab, rilotumumab, onartuzumab, ganitumab, ramucirumab, ridaforolimus, tensirolimus, everolimus, BMS-690514, BMS-754807, EMD 525797, GDC-0973, GDC-0941, MK-2206, AZD6244, GSK1120212, PX-866, XL821, IMC-A12, MM-121, PF-02341066, RG7160, y Sym004..

Cánceres

Pueden usarse terapias anti-EGFR en el tratamiento de varios cánceres, incluyendo cáncer colorrectal metastásico, cáncer de pulmón de células no pequeñas metastásico y cáncer de cabeza y cuello. Sin embargo, estos cánceres pueden eventualmente volverse resistentes a las terapias anti-EGFR. Los sujetos y pacientes con cáncer que pueden beneficiarse de los métodos de esta divulgación incluyen aquellos que se sospecha que tienen cáncer, aquellos que tienen cáncer para quienes no se ha iniciado un tratamiento, aquellos en el curso del tratamiento que no son resistentes a las terapias anti-EGFR y aquellos resistentes a terapias anti-EGFR.

Muestras biológicas

La divulgación proporciona la detección de variaciones genéticas en muestras biológicas de un sujeto. Las muestras biológicas pueden incluir polinucleótidos de células cancerosas. Los polinucleótidos pueden ser ADN (por ejemplo, ADN genómico, ADNc), ARN (por ejemplo, ARNm, ARN pequeños) o cualquier combinación de los mismos. Las muestras biológicas pueden incluir tejido tumoral, por ejemplo, de una biopsia. En algunos casos, las muestras biológicas pueden incluir sangre o saliva. En casos particulares, las muestras biológicas pueden comprender ADN libre de células ("ADNcf"). El ADN libre de células puede estar presente, por ejemplo, en la sangre.

Análisis genético

El análisis genético incluye la detección de variantes de secuencia de nucleótidos y variaciones del número de copias. Las variantes genéticas pueden determinarse mediante secuenciación. El método de secuenciación puede ser secuenciación masivamente paralela, es decir, secuenciación simultáneamente (o en rápida sucesión) de cualquiera de por lo menos 100.000, 1 millón, 10 millones, 100 millones o mil millones de moléculas de polinucleótidos. Los métodos de secuenciación pueden incluir, pero no están limitados a: secuenciación de alto rendimiento, pirosecuenciación, secuenciación por síntesis, secuenciación de moléculas individuales, secuenciación de nanoporos, secuenciación de semiconductores, secuenciación por ligación, secuenciación por hibridación, RNA-Seq (niumina), Digital Gene Expression (Helicos), secuenciación de próxima generación, secuenciación de moléculas individuales por síntesis (SMSS) (Helicos), secuenciación masivamente paralela, matriz de moléculas individuales clonal (Solexa), secuenciación de escopeta, secuenciación de Maxam-Gilbert o Sanger, paseo con cebador, secuenciación usando plataformas PacBio, SOLiD, Ion Torrent, o Nanopore y cualquier otro método de secuenciación conocido en la técnica.

La secuenciación puede hacerse más eficaz realizando captura de secuencia, es decir, el enriquecimiento de una muestra para secuencias objetivo de interés, por ejemplo, secuencias que incluyen los genes KRAS y/o EGFR o partes de ellos que contienen biomarcadores de variantes de secuencia. La captura de la secuencia puede realizarse usando sondas inmovilizadas que se hibridan con los objetivos de interés.

El ADN libre de células puede incluir pequeñas cantidades de ADN tumoral mezclado con ADN de la línea germinal. Los métodos de secuenciación que aumentan la sensibilidad y la especificidad de la detección del ADN tumoral y, en particular, las variantes de secuencia genética y la variación del número de copias, pueden ser útiles en los métodos de esta invención. Tales métodos se describen, por ejemplo, en la WO 2014/039556. Estos métodos no solo pueden detectar moléculas con una sensibilidad de hasta el 0,1% o más, sino que también pueden distinguir estas señales del ruido típico de los métodos de secuenciación actuales. Pueden lograrse aumentos en la sensibilidad y especificidad de muestras de ADNcf a base de sangre usando varios métodos. Un método incluye el etiquetado de alta eficacia de las moléculas de ADN en la muestra, por ejemplo, el etiquetado de por lo menos el 50%, el 75% o el 90% de los polinucleótidos en una muestra. Esto aumenta la probabilidad de que una molécula objetivo de baja abundancia en una muestra se etiquete y posteriormente se secuencie, y aumenta significativamente la sensibilidad de detección de moléculas objetivo.

Otro método implica el seguimiento molecular, que identifica las lecturas de secuencia que se han generado redundantemente a partir de una molécula parental original, y asigna la identidad más probable de una base en cada locus o posición en la molécula parental. Esto aumenta significativamente la especificidad de detección al reducir el ruido generado por los errores de amplificación y secuenciación, lo que reduce la frecuencia de falsos positivos.

Los métodos de la presente divulgación pueden usarse para detectar la variación genética en material genético de partida inicial etiquetado de manera no única (por ejemplo, ADN raro) a una concentración que es inferior al 5%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05 %, o 0.01%, con una especificidad de por lo menos el 99%, 99,9%, 99,99%, 99,999%, 99,9999% o 99,99999%. Las lecturas de secuencia de polinucleótidos etiquetados pueden seguirse posteriormente para generar secuencias de consenso para polinucleótidos con una tasa de error de no más del 2%, 1%, 0,1% o 0,01%.

La determinación de la variación del número de copias puede implicar la determinación de una medida cuantitativa de polinucleótidos en una muestra de mapeo para un locus genético, como el gen de EGFR o el gen de KRAS. La medida cuantitativa puede ser un número. Una vez que se ha determinado el número total de polinucleótidos mapeados para un locus, este número puede usarse en métodos estándar de determinación de la variación del número de copias en el locus. Una medida cuantitativa puede normalizarse frente a un estándar. En un método, una medida cuantitativa en un locus de prueba puede estandarizarse frente a una medida cuantitativa de polinucleótidos que mapean para un locus de control en el genoma, como un gen de número de copias conocido. En otro método, la medida cuantitativa puede compararse con la cantidad de ácido nucleico en la muestra original. Por ejemplo, la medida cuantitativa puede compararse con una medida esperada de diploidía. En otro método, la medida cuantitativa puede normalizarse frente a una medida de una muestra de control y pueden compararse medidas normalizadas en diferentes loci. En otro método, la cuantificación implica cuantificar moléculas parentales u originales en una muestra que mapea un locus, en lugar del número de lecturas de secuencia. Una variación del número de copias puede ser una amplificación o una deleción o truncamiento de un gen. Una amplificación puede ser de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 10 o más copias de un gen. Una deleción o truncamiento puede ser 0 o 1 copias de un gen.

Un ejemplo de un método para detectar la variación del número de copias puede incluir una matriz. La matriz puede comprender una pluralidad de sondas de captura. Las sondas de captura pueden ser oligonucleótidos que se unen a la superficie de la matriz. Las sondas de captura pueden hibridar con por lo menos uno de los genes expuestos en la Tabla 1. Las sondas de captura pueden unirse a por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 genes como se expone en la Tabla 1. El ADN derivado del sujeto puede marcarse (por ejemplo, con un fluoróforo) antes de la hibridación para la detección.

En otros ejemplos, un gen de interés puede amplificarse usando cebadores que reconocen el gen de interés. Los cebadores pueden hibridar con un gen en sentido ascendente y/o en sentido descendente de una región de interés particular (por ejemplo, en sentido ascendente de un sitio de mutación). Puede hibridarse una sonda de detección con el producto de amplificación. Las sondas de detección pueden hibridar específicamente con una secuencia de tipo salvaje o con una secuencia mutada/variante. Las sondas de detección pueden marcarse con un marcador detectable (por ejemplo, con un fluoróforo). La detección de una secuencia de tipo salvaje o mutante puede realizarse detectando el marcador detectable (por ejemplo, imagenología por fluorescencia). En ejemplos de variación del número de copias, un gen de interés puede compararse con un gen de referencia. Las diferencias en el número de copias entre el gen de interés y el gen de referencia pueden indicar amplificación o deleción/truncamiento de un gen. Los ejemplos de plataformas adecuadas para realizar los métodos descritos en la presente incluyen plataformas de PCR digitales como, por ejemplo, Fluidigm Digital Array.

Métodos de diagnóstico

Los biomarcadores, es decir, variantes de secuencia y/o variantes de número de copias, pueden usarse en métodos de diagnóstico. En un método, el biomarcador se detecta en una muestra y luego se correlaciona con una condición, por ejemplo, resistencia a la terapia anti-EGFR. En otro método, la presencia del biomarcador se usa para estratificar las opciones de tratamiento. Por ejemplo, si una persona tiene un biomarcador de esta divulgación, las terapias anti-EGFR pueden clasificarse por debajo de otras terapias, como la inhibición de la quinasa dual de EGFR y HR2, regímenes que contienen bevacizumab, o la mejor atención de apoyo. En otro método, la detección de estos biomarcadores en un sujeto se puede seguir iniciando una terapia alternativa, como una terapia sin anti-EGFR o una terapia de EGFR diferente además de o en lugar de una terapia anti-EGFR. En otro método, la detección de los biomarcadores de esta divulgación se usa para hacer un pronóstico para un sujeto. Por ejemplo, la detección de biomarcadores puede correlacionarse con una esperanza de vida más corta. En otro método, un paciente que se está sometiendo a tratamiento para un cáncer que responde a la terapia anti-EGFR se monitoriza para los biomarcadores de esta divulgación. La aparición de los biomarcadores puede indicar que las terapias anti-EGFR pueden fallar o están fallando, y puede indicar al médico que inicie un régimen de terapia diferente.

Composiciones

La divulgación proporciona composiciones adecuadas para realizar los métodos descritos en la presente. En algunos casos, la composición puede usarse para enriquecer selectivamente uno o más ácidos nucleicos que comprenden cualquiera de los genes descritos en la presente. En algunos casos, la composición comprende uno o más soportes sólidos. El uno o más soportes sólidos pueden ser una partícula atraíble magnéticamente (es decir, una perla magnética). El soporte sólido puede comprender una pluralidad de sondas de captura (por ejemplo, oligonucleótidos que hibridan específicamente con ciertas secuencias). Por ejemplo, las sondas pueden hibridar dentro de ciertas regiones genómicas, por ejemplo, genes. En algunos casos, las regiones genómicas, por ejemplo, genes, pueden ser regiones asociadas con enfermedades, por ejemplo, cáncer. Después del enriquecimiento, el fragmentado seleccionado puede unirse a cualquier adaptador de secuenciación adecuado para su uso en cualquier plataforma de secuenciación divulgada en la presente. Por ejemplo, un adaptador de secuencia puede comprender una secuencia de celda de flujo, un código de barras de muestra, o ambos. En otro ejemplo, un adaptador de secuencia puede ser un adaptador con forma de horquilla y/o comprender un código de barras de muestra. Además, los fragmentos resultantes pueden amplificarse y secuenciarse. En algunos casos, el adaptador no comprende una región de cebador de secuenciación.

En algunos ejemplos, el soporte sólido puede ser una matriz. La matriz puede comprender una pluralidad de sondas de captura. Las sondas de captura pueden ser oligonucleótidos que se unen a la superficie de la matriz. Las sondas de captura pueden hibridar selectivamente con una secuencia de interés. La secuencia de interés puede ser una secuencia de tipo salvaje o una secuencia mutante/variante. Las secuencias de tipo salvaje y mutante/variante pueden representar cualquier gen o cualquier variante genética como se expone en la Tabla 1. Las sondas de captura pueden unirse por lo menos a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 genes como se expone en la Tabla 1.

En un caso particular, pueden usarse uno o más soportes sólidos que comprenden una sonda de captura de ácidos nucleicos unida a los mismos para enriquecer selectivamente uno o más ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos de EGFR. En este ejemplo, la sonda de captura puede comprender una secuencia de nucleótidos que hibrida, en condiciones rigurosas de hibridación, con una secuencia de nucleótidos de EGFR. En algunos casos, las sondas de captura pueden hibridar con la secuencia de nucleótidos de EGFR dentro de los 200 nucleótidos de un codón que codifica un aminoácido seleccionado de cualquiera de las posiciones, sin limitación: 465, 130, 1083, 491, 467, 211, 1061 y 876. Las secuencias de aminoácidos para EGFR son las que se exponen en, por ejemplo, N° de Registro NCBI NP_005219.2. En algunos casos, una pluralidad de sondas de captura, cada una de las cuales hibrida con una diferente de las secuencias de nucleótidos de EGFR, se unen al uno o más soportes sólidos. En algunos casos la composición comprende reactivos para enriquecer preferentemente moléculas con la variación de nucleótidos de moléculas sin la variación de nucleótidos.

Sistemas

Los datos de secuencia pueden analizarse por ordenador para identificar variantes de secuencia entre lecturas de secuencia y/o realizar medidas cuantitativas de secuencias de interés, por ejemplo, para la determinación de la variación del número de copias. La Figura 1 ilustra esquemáticamente un sistema para analizar una muestra que comprende ácidos nucleicos de un sujeto. El sistema incluye un secuenciador, software bioinformático y una conexión a Internet para el análisis de informes mediante, por ejemplo, un dispositivo manual o un ordenador de escritorio.

La divulgación también proporciona un sistema que comprende un medio legible por ordenador que comprende un código ejecutable por máquina que, tras la ejecución por un procesador informático, implementa un método de la presente divulgación. El procesador informático puede estar especialmente adaptado para implementar métodos proporcionados en la presente, como con la ayuda de software que tiene uno o más algoritmos que están dirigidos a implementar tales métodos. El sistema puede recibir en la memoria lecturas de secuencia de polinucleótidos. Las lecturas de secuencia pueden ser generadas mediante cualquier plataforma de secuenciación divulgada en la presente. El sistema puede entonces determinar una identidad de nucleótidos a partir de las lecturas de secuenciación. Entonces, el sistema puede informar luego de la presencia de por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos presente en un gen como se divulga en la presente. En algunos casos, el sistema puede informar opcionalmente de una cantidad relativa de la variante de secuencia de nucleótidos en comparación con una secuencia de nucleótidos en la misma posición de un genoma humano de referencia. El informe puede indicar que un sujeto tiene un cáncer que no responde a la terapia anti-EGFR. El informe puede indicar que debe suspenderse o reducirse la terapia anti-EGFR. El informe puede indicar además que debe iniciarse una terapia de EGFR alternativa o un tratamiento diferente a la terapia anti-EGFR. El informe puede proporcionarse directamente al sujeto o puede proporcionarse al proveedor de atención médica.

En un ejemplo particular, el sistema puede determinar una identidad de nucleótidos que codifican un aminoácido del gen de EGFR en cualquiera de las posiciones 465, 130, 1083, 491,467, 211, 1061 y 876. El sistema puede además informan de la presencia de por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de EGFR que codifica una variante de secuencia de aminoácidos o codones seleccionada del grupo que consiste de G465V, T130A, D1083N, I491R, K467I, T211T, K1061T y V876M.

En otros ejemplos, el sistema puede determinar una identidad de variantes de nucleótidos de un gen de KRAS y la amplificación del gen de KRAS. El sistema puede informar además, a partir de las lecturas de secuencia, de la presencia de por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de KRAS y una cantidad de amplificación del gen de KRAS. El informe puede indicar que el sujeto sea tratado con una terapia distinta a la terapia anti-EGFR. Kits

La divulgación también proporciona kits adecuados para realizar los métodos descritos en la presente. En algunos casos, el kit puede incluir materiales para la recogida de una muestra biológica. Estos materiales pueden incluir, sin limitación, un dispositivo para recoger una muestra biológica, por ejemplo, una aguja y una jeringuilla para recoger una muestra de sangre o un hisopo para recoger una muestra de saliva de un sujeto. Alternativamente, un sujeto puede escupir en un tubo. El kit puede incluir además un recipiente para recoger la muestra biológica, una toallita con alcohol para desinfectar la piel, instrucciones para recoger la muestra biológica y similares.

En algunos casos, el kit puede incluir una pluralidad de sondas de oligonucleótidos que hibridan selectivamente con por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 genes seleccionados del grupo que consiste de EGFR, KRAS, BRAF, MET, SMO, MYC, NRAS, ERBB2, ALK, Notch, PIK3CA, APC. Las sondas de oligonucleótidos pueden ser sondas de captura. Las sondas de captura pueden unirse a la superficie de un soporte sólido. El soporte sólido puede ser una partícula atraíble magnéticamente. El kit puede incluir un recipiente que incluye la pluralidad de sondas de oligonucleótidos e instrucciones para realizar cualquiera de los métodos descritos en la presente.

En algunos casos, los kits pueden incluir además cualquier componente adecuado para su uso con los métodos de análisis genético descritos en la presente. Los ejemplos no limitativos de estos componentes incluyen códigos de barras o etiquetas moleculares, adaptadores de secuenciación adecuados para su uso en, por ejemplo, secuenciación Illumina, reactivos para la amplificación de secuencias enriquecidas para el objetivo, y similares. EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se proporcionan con el propósito de ilustrar varias realizaciones de la invención y no se pretende que limiten la presente invención de ninguna manera. Los presentes ejemplos, junto con los métodos descritos en la presente, son ejemplares.

Ejemplo 1. Identificación de variantes genéticas correlacionadas con la resistencia a la terapia anti-EGFR.

Las alteraciones genéticas son una característica común del cáncer colorrectal (CCR), y algunas de ellas se han identificado como biomarcadores predictivos para selecciones de tratamiento. La aplicación de metodologías para evaluar los cambios genéticos de los tumores en la rutina clínica es una herramienta estratégica para mejorar la detección de pacientes y la selección de tratamientos. El ADN libre de células (ADNcf) proporciona una fuente adecuada de material genético tumoral para monitorizar la evolución genética del tumor del paciente bajo la presión del tratamiento. Se usó ADN libre de células (ADNcf) extraído de muestras de plasma de pacientes con CCR metastásico para detectar nuevas mutaciones después de la progresión del tratamiento de atención estándar.

Métodos: el ADNcf extraído de muestras de plasma de pacientes con CCR metastásico (pt) se analizó mediante tecnología de secuenciación de Guardant Health, Inc. para detectar mutaciones y amplificación de 54 genes como se expone en la Tabla 2. Se realizó una evaluación en los sujetos, antes del tratamiento, para determinar el estado de referencia de estos genes (es decir, de tipo salvaje o mutante/variante). El tratamiento se seleccionó en base al estado inicial (por ejemplo, un valor de referencia de tipo salvaje indicaba que el sujeto debería ser tratado con terapia anti-EGFR, mientras que un estado mutante/variante indicaba que un paciente debería ser tratado con un tratamiento diferente a la terapia anti-EGFR). Los pacientes fueron monitorizados durante el tratamiento usando un ensayo basado en secuenciación de próxima generación (NGS) para identificar potenciales alteraciones genómicas relacionadas con el tumor como mutaciones y números de copias de genes. El límite inferior de detección fue del 0,1% de alelos mutantes en un fondo de tipo salvaje. Todos los pacientes se inscribieron en el programa ATTACC para pacientes con mCCR que progresaron con el tratamiento estándar, y tenían secuenciación del tumor primario realizado para un panel de 46 genes.

continuación

Características de la muestra:

• Se analizaron 71 muestras de plasma de CCR en estadio IV inscritas en el programa ATTACC del MDACC. • 56 tenían el estado KRASwt y BRAFwt en la evaluación inicial y 49/56 recibieron y progresaron al tratamiento estándar y al tratamiento anti-EGFR.

• 25 eran KRASmut y/o BRAFmut y recibieron y progresaron a quimioterapia de atención estándar sin incluir el tratamiento anti-EGFR.

• A los pacientes se les realizó una secuenciación del tumor primario para el panel de 46 genes.

Resultados: se analizaron muestras de plasma de 71 pacientes. Todos los pacientes fueron refractarios a la terapia basada en 5-FU, y 49 pacientes habían sido tratados anteriormente con anticuerpos monoclonales anti-EGFR (mAb).

En los pacientes tratados con EGFR mAb, el 30% de los pacientes (n=15) tuvieron detección de mutaciones de KRAS no detectables en el tumor primario, en comparación con el 5% (n=1) de los pacientes sin tratamiento con mAB de EGFR (cociente de probabilidades 8,6, P=0,027). (Figura 2) En 6 de los 15 casos, las mutaciones de KRAS recientemente detectables se asociaron con la amplificación del gen de KRAS, en comparación con 0 de 16 casos con mutaciones de KRAS detectadas en el tumor primario (P=0,007). (Figura 3) Se detectaron 7 mutaciones de ectodominio en EGFR que pueden alterar la afinidad de unión de los mAb de EGFR en pacientes tratados con mAb de EGFR, incluyendo S492R (n=4) y tres mutaciones G465V, 1491R, K467I no informadas anteriormente; Hubo amplificaciones concurrentes de EGFR en 6 de los 7 casos.

El 14% de los pacientes tratados con mAb de EGFR desarrollaron amplificaciones de MET detectables, que coexistieron con mutaciones de KRAS o EGFR en 4 de los 7 casos.

Se detectaron amplificaciones en EGFR, BRAF, MYC y SMO en el plasma en el 23%, 11%, 11% y 4% de sujetos resistentes a la terapia anti-EGFR, respectivamente, lo que representa tasas más altas que las informadas en tumores primarios no tratados.

Conclusiones: Los avances en la secuenciación y la bioinformática permiten la detección de alteraciones en el número de copias de ADNcf en plasma. Las alteraciones en el número de copias en el mCRC refractario al tratamiento son más comunes de lo que se había descrito anteriormente y con frecuencia coexisten con mutaciones después del tratamiento con mAb de EGFR.

Ejemplo 2. Protocolo para tratar a un paciente con una terapia distinta a la terapia anti-EGFR.

Un paciente se presenta en el hospital con cáncer colorrectal metastásico (mCRC). Se recoge ADN libre de células del paciente para determinar una evaluación de referencia del estado de EGFR, KRAS y MET. Se determina que el paciente es de tipo salvaje en los genes KRAS y MET. El paciente se somete a una terapia anti-EGFR (por ejemplo, cetuximab). Se monitoriza al paciente cada seis meses para determinar cualquier cambio en el estado de EGFR, KRAS y MET. Después de dos años de terapia anti-EGFR, se detectan una mutación no detectada anteriormente en EGFR (por ejemplo, G465V) y una amplificación en KRAS (por ejemplo, 8 copias en comparación con 2 copias). Se interrumpe el tratamiento con cetuximab y se inicia al paciente una terapia distinta a la terapia anti-EGFR.

Ejemplo 3. Protocolo para la selección de la terapia por primera vez

Un paciente se presenta en el hospital con cáncer colorrectal metastásico (mCRC). Se recoge ADN libre de células del paciente para determinar una evaluación de referencia del estado de EGFR, KRAS y MET. Se determina que el paciente tiene una amplificación genética y una variación de secuencia de nucleótidos en KRAS (por ejemplo, G13D) que indica resistencia a la terapia de EGFR. El paciente es tratado con quimioterapia estándar de atención sin incluir la terapia anti-EGFR.

Ejemplo 4. Protocolo para tratar a un paciente con una terapia anti-EGFR alternativa

Un paciente se presenta en el hospital con cáncer colorrectal metastásico (mCRC). Se recoge ADN libre de células del paciente para determinar una evaluación de referencia del estado de EGFR, KRAS y MET. Se determina que el paciente es de tipo salvaje en los genes KRAS y MET. El paciente se somete a terapia anti-EGFR con cetuximab. Se monitoriza al paciente cada seis meses para determinar cualquier cambio en el estado de EGFR, KRAS y MET. Después de dos años de terapia anti-EGFR, se detectan una mutación no detectada anteriormente en EGFR (por ejemplo, G465V) y una amplificación en KRAS (por ejemplo, 8 copias en comparación con 2 copias). Se interrumpe el tratamiento con cetuximab y se inicia al paciente una terapia alternativa con anticuerpos anti-EGFR (por ejemplo, panitumumab).

Ejemplo 5. Protocolo para tratar a un paciente con una terapia distinta a la terapia anti-EGFR.

Un paciente se presenta en el hospital con cáncer colorrectal metastásico (mCRC). Se recoge ADN libre de células del paciente para determinar una evaluación de referencia del estado de EGFR, KRAS, MET, BRAF, ERBB2, MYC, NRAS, ALK, Notch, PIK3CA, SMO y APC. Se determina que el paciente es de tipo salvaje en los genes KRAS, MET, BRAF, ERBB2, MYC, NRAS, ALK, Notch, PIK3CA, SMO y APC, lo que indica que el paciente es candidato para la terapia anti-EGFR. El paciente se somete a una terapia anti-EGFR (por ejemplo, cetuximab). Se monitoriza al paciente cada seis meses para determinar cualquier cambio en el estado de los genes. Después de dos años de terapia anti-EGFR, se detectan una amplificación genética en BRAF (por ejemplo, 12 copias en comparación con 2 copias), así como una variación en la secuencia de nucleótidos en EGFR (por ejemplo, K467I), lo que indica que el sujeto ha desarrollado resistencia a cetuximab. Se detiene el tratamiento con cetuximab y se inicia al paciente en una terapia distinta de la terapia anti-EGFR (por ejemplo, estándar de quimioterapia de atención) Aunque en la presente se han mostrado y descrito realizaciones preferidas de la presente invención, resultará obvio para los expertos en la técnica que tales realizaciones se proporcionan a modo de ejemplo solamente. A los expertos en la técnica se les ocurrirán ahora numerosas variaciones, cambios y sustituciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método que comprende:

(c) determinar, entre las lecturas de secuencia, una presencia o una ausencia de por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de EGFR que codifica una variante de secuencia de aminoácidos o codones seleccionada del grupo que consiste de G465V, D1083N, I491R, K467I, y K1061T, en donde la numeración corresponde a la secuencia de aminoácidos de EGFR en el Número de Registro NCBI NP_005219.2; y

2. El método de la reivindicación 1, en donde la determinación comprende determinar la presencia o ausencia de una pluralidad de variantes de secuencias de nucleótidos de EGFR.

3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende etiquetar de manera no única los ácidos nucleicos en la muestra enriquecida en el paso (a), generando de este modo ácidos nucleicos etiquetados que se siguen posteriormente para generar una lectura de secuencia de consenso para cada uno de los ácidos nucleicos etiquetados con una tasa de error de no más del 2% y usar las lecturas de secuencia de consenso resultantes en el paso (c).

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la por lo menos una variante de secuencia de nucleótidos de EGFR incluye uno o más miembros seleccionados del grupo que consiste de G>T G465V, G>A D1083N, T>G I491 R, A>T K467I, y A>C K1061T.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el sujeto tiene o se sospecha que tiene cáncer colorrectal o cáncer de cabeza y cuello.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el sujeto tiene o se sospecha que tiene cáncer colorrectal y ha sido tratado con terapia de cetuximab.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde (c) comprende además detectar la amplificación de un gen DGFR.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la muestra comprende ADN libre de células.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el sujeto es refractario a terapia basada en 5-FU.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde enriquecer selectivamente comprende captura de secuencias de polinucleótidos que contienen la por lo menos una variante de secuencia de nucleótido de EGFR.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la determinación se realiza con una sensibilidad de por lo menos aproximadamente el 0,01% o una especificidad de por lo menos el 99%.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el método comprende además generar un informe que indique la presencia o ausencia de por lo menos una de las variantes de secuencia de nucleótidos de EGFR, opcionalmente en donde el informe (i) se proporciona directamente al sujeto; o (ii) se proporciona a un proveedor de atención médica.

13. Una composición para su uso en el tratamiento de un cáncer, en donde se ha clasificado que el sujeto tiene un cáncer que no responde a terapia con cetuximab mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y la composición comprende imatinib, gefitinib, afatinib, dacomitinib, vandetanib, neratinib, BMS-690514, RG7160, o Sym004.