KR20120006543A

KR20120006543A - 튜불린 중합 저해제로서 치환된 4-아미노-5-벤조일-2-(페닐아미노)티오펜-3-카르보니트릴및 치환된 4-아미노-5-벤조일-2-(페닐아미노)티오펜-3-카르복스아미드

Info

Publication number: KR20120006543A
Application number: KR1020117026836A
Authority: KR
Inventors: 폴 피 베로자; 코마스 브이 다모다란; 스텔라 루이; 웬리 마; 줘 왕; 화 쉬
Original assignee: 텔리크 인코포레이티드
Priority date: 2009-04-16
Filing date: 2010-02-09
Publication date: 2012-01-18
Also published as: WO2010120400A2; EP2419424A2; BRPI1013328A2; CA2757573A1; US8410163B2; SG175198A1; IL215552A0; JP2012524066A; AU2010236980A1; US20120101286A1; CN102395581A; EP2419424A4; WO2010120400A3; ZA201107487B

Abstract

치환된 4-아미노-5-벤조일-2-(페닐아미노)티오펜-3-카르보니트릴 및 치환된 4-아미노-5-벤조일-2-(페닐아미노)티오펜-3-카르복스아미드 및 이의 염은 튜불린 중합 저해제이고, 암 치료에 유용하다.

Description

튜불린 중합 저해제로서 치환된 4-아미노-5-벤조일-2-(페닐아미노)티오펜-3-카르보니트릴 및 치환된 4-아미노-5-벤조일-2-(페닐아미노)티오펜-3-카르복스아미드{SUBSTITUTED 4-AMINO-5-BENZOYL-2-(PHENYLAMINO)THIOPHENE-3-CARBONITRILES AND SUBSTITUTED 4-AMINO-5-BENZOYL-2-(PHENYLAMINO)THIOPHENE-3-CARBOXAMIDES AS TUBULIN POLYMERIZATION INHIBITORS}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 35 USC 119 (e) 하에서, 2009 년 4 월 16 일자로 출원된 미국 가출원 제 61/169,785 호 (발명의 명칭: "튜불린 중합 저해제로서 치환된 4-아미노-5-벤조일-2-(페닐아미노)티오펜-3-카르보니트릴 및 -3-카르복스아미드{Substituted 4-amino-5-benzoyl-2-(phenylamino)thiophene-3-carbonitriles and -3-carboxamides as tubulin polymerization inhibitors}", 이의 전체 개시가 본원에 참조로서 포함되어 있음) 에 우선권을 주장한다.

기술분야

본 발명은 암 치료에서 튜불린 중합 저해제로서, 치환된 4-아미노-5-벤조일-2-(페닐아미노)티오펜-3-카르보니트릴 및 4-아미노-5-벤조일-2-(페닐아미노)티오펜-3-카르복스아미드, 이의 염, 이를 함유하는 약학 조성물, 및 이의 용도에 관한 것이다.

미세소관은 α-튜불린 및 β-튜불린 중합체로 구성된 세포골격 단백질 중합체이다. 이들은 모든 세포의 생명유지 성분이고 형태학적으로 세포를 유지하는데 중요한 성분이다. 미세소관은 세포에서 유사분열 장치의 기반을 형성하고, 동역학적으로 기능하는 미세소관은 세포 이동 및 부착뿐 아니라 정상 세포 분열에 중요하다. 미세소관 역학 간섭은 세포 주기를 통해 정상적으로 진행되는 세포 분열을 막고, G2/M 세포 주기 정지 및 세포사멸을 야기한다. 암 세포는 무제한적으로 복제하는 잠재능력을 획득한 것이며 정지 또는 노화로 가지 않고 계속해서 분열한다. 결과적으로, 암 세포는 미세소관 역학에 매우 의존적이고 따라서 튜불린 중합을 저해하거나 미세소관 중합체를 안정화시키는 것을 통해 미세소관 역학을 간섭하는 작용제에 민감하다.

세포 주기의 M-상 동안, 세포 유사분열 방추사를 포함하는 동역학적인 미세소관은 공지된 튜불린-지향적 작용제의 대부분의 표적이다. 비록 다양한 항-유사분열 작용제의 궁극의 작용 기전이 본질적으로 동일할지라도 (즉, 정상 미세소관 형성 및 역학의 붕괴), 상이한 암 유형에 대항하는 다양한 작용제의 활성에서 차이가 있다. 예를 들어, 빈카 알칼로이드 (예컨대, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 비노렐빈) 는 일반적으로 혈액암에 대항하는 것에 보다 효능이 있고 고형 종양에 대항하는 것에 보다 덜 효과적이나, 비노렐빈은 비-소세포 폐암 및 유방암에서 활성을 가지는 반면; 탁산 (예컨대, 파클리탁셀 및 도세탁셀) 은 난소, 유방 및 폐의 고형 종양에 대항하는데 효과적이나, 결장 및 신장의 고형 종양 및 혈액암에 대항해서는 상대적으로 비효과적이다.

항암제로서 잠재적인 튜불린 중합 저해제인 화합물을 개발하는 것이 요구되고 있다.

미국 특허 출원 공보 제 US　2005/0085531 호 (Amphora) 는 ATP-이용 효소 저해 활성을 나타내는 것으로 여겨지는 544 티오펜계 화합물을 개시하고 있다. 이들 화합물은 GSK-3α, GSK-3β, KIT 및 MAPKAPK 의 저해제인 것으로 여겨지는 4-아미노-5-벤조일-2-[(2-메톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴; Aurora-A, GSK-3α, GSK-3β 및 KIT 의 저해제인 것으로 여겨지는 4-아미노-5-벤조일-2-(페닐아미노)티오펜-3-카르복스아미드; 및 Aurora-A, GSK-3α 및 GSK-3β의 저해제인 것으로 여겨지는 4-아미노-2-(1,3-벤조디옥솔-5-일아미노)-5-(4-클로로벤조일)티오펜-3-카르복스아미드 (하기 화합물 27A) 를 포함한다. 특정 활성이 주어지진 않았지만, 상기 화합물은 동일한 표적 효소에 대해 대부분 비활성인 화합물의 개체군에 대한 평균 활성값 보다 3σ 초과로 상기 목록의 표적 효소 각각에 대한 활성을 갖는 것으로 여겨진다.

미국 특허 출원 공보 제 US　2006/0041006 호 (Plexxikon) 는 포스포디에스터라제 (PDE) 4B 에 대한 리간드인 것으로 여겨지는 281 티오펜계 화합물, 및 PDE4B-중재 병태의 치료에서의 이의 용도를 개시한다. 이들 화합물은 4-아미노-5-(2,4-디메톡시벤조일)-2-[(4-메톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴 (하기 화합물 7A) 을 포함하는 43 개의 4-아미노-5-벤조일-2-(페닐아미노)티오펜-3-카르보니트릴, 및 하나의 4-아미노-5-벤조일-2-(페닐아미노)티오펜-3-카르복스아미드를 포함한다.

문헌 [Graschenkova et al., Farmatsevtichnii Zhurnal, 4, 69-73 (2007)] 은 다양한 2-아로일-3-아미노-4-니트릴-5-아릴아미노-티오펜의 합성 및 저지혈증 활성을 개시하는 것으로 여겨진다. Chemical Abstracts 으로부터의 요약 및 인덱스에 따르면, 화합물 4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-[(4-에틸페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴 (하기 화합물 15A) 이 개시된 것으로 여겨진다.

하기 화합물 1A, 4A, 12A, 17A 및 38A 를 포함하는 수많은 치환된 4-아미노-5-벤조일-2-(페닐아미노)티오펜-3-카르보니트릴 및 4-아미노-5-벤조일-2-(페닐아미노)티오펜-3-카르복스아미드는 과학 카타로그로부터 이용가능하다.

본원에 지칭되는 모든 문헌의 전체 개시가 본원에서 참조로서 포함되어 있다.

발명의 개시

제 1 양태에서, 본 발명은 튜불린 중합 저해제에 의해 치료 가능한 질환, 특히 암의 치료에 사용하기 위한, 튜불린 중합 저해제로서의 하기 화학식 A 의 치환된 4-아미노-5-벤조일-2-(페닐아미노)티오펜-3-카르보니트릴 및 치환된 4-아미노-5-벤조일-2-(페닐아미노)티오펜-3-카르복스아미드 및 이의 염의 용도; 튜불린 중합 저해제에 의해 치료 가능한 질환, 특히 암의 치료에 사용하기 위한, 튜불린 중합 저해제로서 사용되는 상기 화합물을 포함하는 약학 조성물; 튜불린 중합 저해제에 의해 치료 가능한 질환, 특히 암의 치료에 사용하기 위한, 튜불린 중합 저해제로서 사용되는 약제의 제조에서 상기 화합물의 용도; 및 상기 화합물을 투여하는, 튜불린 중합 저해제에 의해 치료 가능한 질환, 특히 암의 치료 방법이다:

[식 중,

X 는 CN 또는 CONH₂ 이고;

m 및 n 은 독립적으로 0, 1, 2, 또는 3 이며, 단 m 및 n 중 하나 이상은 0 이 아니고;

각각의 R 은 독립적으로 할로, 시아노, 니트로, 또는 임의 치환되는 알킬, 또는 -OR', -SR', -C(O)OR' 또는 -NR'R" (이때, R' 는 임의 치환되는 알킬이고, R" 는 수소 또는 알킬임) 이거나, 동일한 페닐기 상의 2 개의 인접한 R 기는 함께 메틸렌디옥시임].

제 2 양태에서, 본 발명은 약학제로서 화합물 1A, 4A, 12A, 17A 및 38A, 상기 화합물을 포함하는 약학 조성물, 상기 화합물을 투여함으로써 질환을 치료하는데 사용하기 위한 약제의 제조에서 상기 화합물의 용도이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 제 1 양태에 기재된 화합물 내의 신규한 화합물, 예컨대 하기 화합물 2A, 3A, 5A, 6A, 8A 내지 11A, 13A, 14A, 16A, 18A 내지 26A, 28A 내지 37A, 및 39A 내지 41A, 및 이의 염, 및 이를 함유하는 약학 조성물; 약제의 제조에서 약제로서의 이의 용도; 및 본 발명의 제 1 및 제 2 양태에서 기재된 바와 같이, 이를 투여하는 치료 방법을 포함한다. 이들 화합물 각각은 개별적으로, 또한 모든 조합형으로 개시된다.

본 발명의 바람직한 구현예는 출원된 본원의 명세서 및 청구의 범위를 특징으로 한다.

발명을 수행하기 위한 방식

정의

"알킬" 은 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자를 제거함으로써, 선형, 분지형 또는 시클릭일 수 있는 포화 C₁ _-3　탄화수소로부터 유래되는 1가 기, 즉, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 및 시클로프로필을 의미한다. 본원에서 "알킬" 의 정의는 통상적인 정의보다 넓은 범주이며 보다 통상적으로는 "시클로알킬" 로 지칭되는 기를 포함한다.

"치환된 알킬" 은 3 개 이하의 할로겐 원자 및/또는 -CN, -OR, -SR 및 -NR₂ 로부터 선택되는 치환기로 치환되는, 상기 정의된 바와 같은 알킬이고, 이때 각각의 R 은 독립적으로 수소 또는 알킬이다. 따라서, 예를 들어, 치환된 알킬기는 트리플루오로메틸, 2-(디메틸아미노)에틸 및 3-클로로프로필과 같은 그러한 기를 포함한다.

"할로겐" 또는 "할로" 는 F, Cl 또는 Br 을 의미한다.

"염" 은 "본 발명의 화합물" 란에 기재된 것이다.

"치료학적 유효량" 은 암을 치료하기 위해서 인간에게 투여하는 경우, 암 치료 효과를 내기에 충분한 양을 의미한다. 인간에서 암의 "치료" 에는 다음 중 하나 이상이 포함된다:

(1) 암 성장의 제한/저해, 즉, 그 암의 발전의 제한/저지,

(2) 암 확산의 감소/방지, 즉, 전이의 감소/방지,

(3) 암의 경감, 즉, 암의 퇴보 유발,

(4) 암의 재발 감소/방지, 및

(5) 암 증상의 완화.

"병용 요법" 은 암 화학요법의 과정 동안 본 발명의 화합물의 투여와 질환의 치료를 위한 또다른 요법, 특히 또다른 항암 요법을 의미한다. 이러한 병용 요법은 또다른 요법의 투여 전, 동안 및/또는 후에 본 발명의 제 1 양태의 화합물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 제 1 양태의 화합물의 투여는 또다른 항암 요법의 투여 시기에서부터 수 주까지의 기간 동안 분리될 수 있고, 이를 앞서거나 또는 뒤따를 수 있으나, 더 통상적으로는 48 시간 이하 이내로, 가장 통상적으로는 24 시간 미만 이내에 본 발명의 제 1 양태의 화합물의 투여는 또다른 요법의 하나 이상의 양태 (항암 요법의 경우, 예컨대 1회 투여량의 화학요법제, 분자 표적화 요법제, 생물적 요법제 투여 또는 방사선 요법) 를 수반할 것이다.

"또다른 요법" 은 본 발명의 화합물로 치료하는 것이 아닌 질환을 위한 요법이다. 암에 대한 그러한 "또다른 요법" 에는 화학요법, 분자 표적화 요법, 생물학적 요법, 및 방사선 요법이 포함된다. 상기 요법은 단독요법 또는 병용 요법으로서 사용되는 것들이다.

암에 대한 화학요법제는 알킬화제, 대사길항제, 항종양 항생제를 포함하는 천연 생성물, 안트라시클린, 효소, 탁산, 빈카 알칼로이드, 캄프토테신 및 에토포시드, 호르몬 및 호르몬 길항제 및 다음을 포함하는 기타 작용제 (miscellaneous agent): 알트레타민, 아르센 트리옥시드, 갈륨 니트레이트, 히드록시우레아, 레바미솔, 미토탄, 옥트레오티드, 프로카바진, 수라민, 탈리도미드, 레날리도미드, 포토다이나믹 화합물, 예컨대 메톡살렌 및 나트륨 포르피머 및 프로테아솜 저해제, 예컨대 보르테조미브를 포함한다.

암에 대한 분자 표적화 요법제는 기능적 치료제, 모노클로날 항체를 포함하는 표현형-지향 요법제, 및 암 백신을 포함한다.

암에 대한 생물학적 요법제는 인터페론 및 인터루킨을 포함한다.

암 세포에 대항하여 작용하는 것으로 의도되는 이들 작용제에 더하여, 항암 요법은 다음을 포함하는 보호 또는 부속제의 사용을 포함한다: 세포보호제, 예컨대 아미포스틴, 덱스라족산, 및 메스나; 포스포네이트, 예컨대 파미드로네이트 및 졸레드론산; 및 자극 인자, 예컨대 에포에틴, 다르베오페틴, 필그라스팀, PEG-필그라스팀, 및 사르그라모스팀.

본 발명의 화합물과 조합될 수 있는 병용 암 요법의 처방계획에는 둘 이상의 항암 요법 (항암제) 예컨대 상기 단락 <0037> 내지 <0039> 에서 언급한 것들 및/또는 방사선요법의 사용을 포함하며, 임의로는 보호 및 부속제 예컨대 상기 단락 <0040> 에서 언급한 것들을 포함하는 모든 처방계획이 포함되고; 본 발명의 화합물을 각종 암의 치료에 알려져 있는 현존하는 항암 처방계획, 예컨대 문헌 [Chabner and Longo, eds., "Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and Practice, 3rd ed. (2001)], 및 문헌 [Skeel, ed., "Handbook of Cancer Chemotherapy", 6th ed. (2003)] (두 문헌 모두 출처는 Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pennsylvania, U.S.A. 임) 와 같은 서적에서 언급한 처방계획에 첨가할 수 있고; 항암 요법, 특히 화학요법을 위한 처방계획은 웹 사이트 예컨대 National Cancer Institute (www.cancer.gov), American Society for Clinical Oncology (www.asco.org), 및 National Comprehensive Cancer Network (www.nccn.org) 에서 관리하는 것들에서 찾을 수 있다.

"포함하는" 또는 "함유하는" 및 그의 문법상의 변형은 포괄의 표현이지 제한의 표현이 아니며, 언급한 성분, 기, 단계 등의 존재를 명시함을 의미하는 것이지, 기타 성분, 기, 단계 등의 존재 또는 첨가를 배제함을 의미하지는 않는다. 따라서, "포함하는" 은 "~로 이루어지는", "실질적으로는 ~로 이루어지는", 또는 "~로만 이루어지는" 을 의미하지 않고; 예를 들어, 어떤 화합물을 "포함하는" 제형은 그 화합물을 함유해야 하지만 또한 기타 활성 성분 및/또는 부형제를 함유할 수 있다.

본 발명의 화합물

화학식 A 의 화합물의 염 (예를 들어, 약학적으로 허용가능한 염) 은 본 발명에 포함되고, 본 출원에 기재된 조성물, 방법 및 용도에 유용하다. 그러한 염은 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 산과 형성된다. 예를 들어 약학적 염, 이의 선별, 제조 및 용도의 광범위한 논의를 위하여 문헌 [Stahl and Wermuth, eds., "Handbook of Pharmaceutically Acceptable Salts", (2002), Verlag Helvetica Chimica Acta, Zurich, Switzerland] 을 참조한다. 문맥에 달리 요구되지 않는 한, 본 발명의 임의의 화합물에 대한 언급은 화합물 및 이의 염 모두를 언급하는 것이다.

이들 염은 존재하는 산성 양자가 무기 또는 유기 염기와 반응할 수 있을 때 형성될 수 있는 염을 포함한다. 전형적으로, 모화합물을 히드록시드, 카르보네이트 또는 알콕시드와 같은 적절한 양이온을 함유하는 과량의 알칼리 시약으로 처리한다. Na⁺, K⁺, Ca² ⁺, Mg² ⁺ 및 NH₄ ⁺ 과 같은 양이온은 약학적으로 허용가능한 염에 존재하는 양이온의 예이다. 따라서, 적합한 무기 염기로는 수산화칼슘, 수산화칼륨, 탄산나트륨 및 수산화나트륨을 포함한다. 염은 유기 염기, 예컨대 1 차, 2 차 및 3 차 아민, 자연-발생 치환된 아민을 포함하는 치환된 아민, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 트로메타민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 히드라브아민, 콜린, 베타인, 에틸렌디아민, 글루코사민, N-알킬글루카민, 테오브로민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘 등을 포함하는 시클릭 아민을 사용하여 또한 제조할 수 있다.

본 발명의 제 1 양태의 화합물이 -NR₂ 기와 같은 염기성 기를 함유하는 경우, 이는 산 부가 염으로서 제조될 수 있다. 상기 화합물의 산 부가 염을 모화합물 및 과량의 산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산 (황산염 및 아황산염 제공), 질산, 인산 등 및 유기산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 살리실산, 4-톨루엔술폰산, 헥산산, 헵탄산, 시클로펜탄프로피온산, 락트산, 2-(4-히드록시벤조일)벤조산, 1,2-에탄디술폰산, 2-히드록시에탄술폰산, 벤젠술폰산, 4-클로로벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 캠퍼술폰산, 4-메틸비시클로[2.2.2.]옥트-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 4,4'-메틸렌비스(3-히드록시-2-나프토)산, 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, tert-부틸아세트산, 라우릴황산, 글루쿠론산, 글루탐산, 3-히드록시-2-나프토산, 스테아르산, 뮤콘산 등으로부터 적합한 용매 중에 표준 방법으로 제조한다.

본 발명의 대표적인 화합물은 하기 중 하나 이상을 충족하는 화학식 A 의 화합물을 포함한다:

(1a) X 는 CN 임; 또는

(1b) X 는 CONH₂ 임;

(2) m 은 1 이상, 바람직하게는 1 또는 2 임;

(3) n 은 1 이상, 바람직하게는 1 또는 2 임; 및

(4) 하나 이상의 R 은 이가 부착되어 있는 페닐의 4-위치이고 (페닐을 티오펜에 연결하는 카르보닐 또는 아미노기에 부착하는 지점이 1-위치임), 또는 2 개의 R 이 함께 메틸렌디옥시인 경우, 메틸렌디옥시는 페닐의 3- 및 4-위치에서 부착되며; 바람직하게는 둘 모두의 페닐이 R 에 의해 4-위치 상에서 치환되거나, 하나의 페닐이 R 에 의해 4-위치에서 치환되고 다른 페닐이 3,4-메틸렌디옥시로 치환됨.

일반적으로, 이들 특성을 더 많이 갖는 화합물은 이들 특성을 더 적게 갖는 화합물보다 바람직하고; 특히 이들 특성들 중의 하나를 모든 특성들에 비해 적게 갖고 있는 화합물에 부가하는 것은 일반적으로 이러한 특성을 갖고 있지 않는 화합물보다 바람직한 화합물이 될 것이다.

본 발명의 화합물은 실시예 및 하기 표의 화합물을 포함하는 명세서 및 이의 청구범위에 기재된 화합물 각각을 포함하며, 예를 들어 화합물 2A, 3A, 5A, 6A, 8A 내지 11A, 13A, 14A, 16A, 18A 내지 26A, 28A 내지 37A, 및 39A 내지 41A; 특히 화합물 2A, 3A, 5A, 6A, 8A 내지 11A, 13A, 14A, 및 16A; 특히 화합물 6A 및 10A; 및 이의 염이다. 본 발명의 조성물 및 방법 등은 화합물이 선행 문장에 열거된 화합물 중 하나인 화합물과 함께 화합물 1A, 4A, 7A, 12A, 15A, 17A, 27A, 및 38A 인 조성물 및 방법을 포함한다.

단순화 및 일관성을 위해, 화학식 A 의 화합물 각각은 통상적인 IUPAC 명명법의 우선순위 규칙에 따르기 보다는 본 명세서 및 청구범위에서는 4-아미노-5-벤조일-2-(페닐아미노)티오펜-3-카르보니트릴 또는 4-아미노-5-벤조일-2-(페닐아미노)티오펜-3-카르복스아미드로서 명명된다. 따라서, 예를 들어, 하기 화학식의 화합물 (화합물 6A) 은 4-아미노-5-(2,4-디메톡시벤조일)-2-[(4-에톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴로 명명되고:

;

하기 화학식의 화합물 (화합물 1A) 은 4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-[(4-메톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르복스아미드로 명명된다:

.

화합물의 제조

일반 합성법을 논의하는데 있어서 하기 나타낸 반응식에서, 어떠한 치환기도 벤젠 고리 중 하나에 제시되어 있지 않으나 치환기 (목적하는 화합물에서의 최종 치환기 또는 이들 최종 치환기에 대한 전구체 중의 하나는 화합물 코어 (core) 형성 후에 개질됨) 는 본 명세서에서 이후 논의되고 실시예에 의해 예시된 바와 같이 존재할 수 있음이 명백할 것이다.

카르보니트릴 및 카르복스아미드 둘 모두에 적용가능한, 편리한 일반적인 합성 방법은 말로노니트릴 또는 2-시아노아세트아미드의 음이온을 페닐 이소티오시아네이트 및 2-L-아세토페논과 반응시키는 것을 포함하고, 하기에 나타낸다.

극성 용매, 예컨대 디메틸포름아미드 중에서 용해시킨 말로노니트릴 (1,　X　=　CN) 또는 2-시아노아세트아미드 (1,　X　=　CONH₂) 를 염기로 처리하여 상응하는 음이온을 형성한다. 말로노니트릴이 사용되는 경우, 염기는 약염기, 예컨대 탄산칼륨일 수 있으나; 2-시아노아세트아미드가 사용되는 경우, 염기는 일반적으로 보다 강염기, 예컨대 금속 히드라이드 또는 에톡시드이다. 이후, 페닐 이소티오시아네이트 (2), 이어서 2-L-아세토페논 (3, L 은 이탈기, 예컨대 브롬, 염소, 알킬술포닐옥시 또는 아릴술포닐옥시, 특히 브롬임) 이 첨가된다. 화학식 A 의 생성되는 카르보니트릴/카르복스아미드 생성물은 물의 첨가에 의해 편리하게 단리되어 (임의로는 용매의 제거가 선행됨) 미정제 생성물이 침전될 수 있고; 통상적인 수단, 예를 들어 실리카 겔 상의 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.

말로노니트릴 및 2-시아노아세트아미드는 상업적으로 이용가능하고, 많은 페닐 이소티오시아네이트 및 2-L-아세토페논, 예컨대 2-브로모아세토페논도 마찬가지다. 또한, 페닐 이소티오시아네이트는 티오포스겐과의 반응에 의해 상응하는 아닐린으로부터 제조될 수 있고 (또한, 아닐린은 환원에 의해 상응하는 니트로벤젠으로부터 제조됨); 2-브로모아세토페논은 또한 아세트산 중의 브롬과의 반응에 의해 이의 상응하는 아세토페논으로부터 제조될 수 있고, 다량의 출발 물질 및 따라서 화학식 A 의 화합물의 편리한 제조를 허용한다.

화학식 A 의 화합물은 산 부가 염의 형성을 위한 당업자에게 잘 공지된 기술을 사용하여, 적절한 산과의 반응에 의해 염으로 전환될 수 있다. 사용되는 산 및 반응 조건은, 약학적으로 허용가능하고 단리에 편리한 형태 및 제형, 예컨대 고체 형태 (예를 들어, 무정형 또는 결정질) 를 갖는 염을 제공하도록 선택될 수 있다.

사용되는 화합물, 조성물 및 용도

본 발명의 화합물을 치료받을 대상체 및 대상체의 병태의 특성에 적합한 임의의 경로로 투여할 수 있다. 투여 경로는 정맥내, 복강내, 근육내 및 피하 주사를 포함하는 주사, 국소 도포를 통한 점막관통 또는 경피 전달, 비강 분무, 좌제 등에 의한 투여를 포함하거나 또는 경구적으로 투여할 수 있다. 제형은 임의적으로는 리포좀 제형, 에멀전, 점액질 막을 통해 약물을 투여하도록 고안된 제형 또는 경피 제형일 수 있다. 이들 투여 방법 각각에 대해 적합한 제형을 예를 들어 문헌 [Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., A. Gennaro, ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pennsylvania, U.S.A] 에서 발견할 수 있다. 전형적인 제형은 경구적이거나 또는 정맥내 주입용 용액일 것이다. 전형적인 투여 형태는 경구 투여용 정제 또는 캡슐, 정맥내 주입용 용액 및 정맥내 주입용 용액으로서 재구성하기 위한 동결건조된 분말일 것이다.

의도되는 투여 방식에 따라, 약학 조성물은 고체, 반고체 또는 액체 투여 형태, 바람직하게는 정확한 투여량으로의 단일 투여에 적합한 단위 투여 형태일 수 있다. 유효량의 활성 화합물(들) 이외에, 조성물은 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 활성 화합물의 가공을 촉진하는 보조제를 포함하는, 적합한 약학적으로 허용가능한 부형제를 함유할 수 있다. "약학적으로 허용가능한 부형제" 는 활성 화합물(들) 의 생물학적 활성의 유효성을 간섭하지 않고, 투여되는 대상체에 독성이 없거나 또는 다르게는 바람직하지 않은 것이 없는 부형제 또는 부형제 혼합물을 지칭한다.

고체 조성물에 대하여, 종래의 부형제는 예를 들어 약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 탈크, 셀룰로오스, 글루코오스, 수크로오스, 탄산마그네슘 등을 포함한다. 액체의 약리학적으로 투여가능한 조성물은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 활성 화합물 및 임의적인 수 중의 약학적 보조제 또는 수성 부형제, 예컨대 물, 식염수, 수성 덱스트로스 등의 용해, 분산 등을 수행함으로써 제조하여 용액 또는 현탁액을 형성할 수 있다. 원하는 경우, 투여될 약학 조성물은 소량의 비독성 보조 부형제, 예컨대 습윤제 또는 에멀전화제, pH 완충제 등, 예를 들어 나트륨 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 나트륨 아세테이트, 트리에탄올아민 올레에이트 등을 또한 함유할 수 있다.

경구 투여에 대하여, 조성물은 일반적으로 정제 또는 캡슐의 형태를 취하거나 또는 수용액 또는 비수용액, 현탁액 또는 시럽일 수 있다. 정제 및 캡슐은 바람직하게는 경구 투여 형태이다. 경구적 용도를 위한 정제 및 캡슐은 일반적으로 하나 이상의 통상 사용되는 부형제, 예컨대 락토오스 및 옥수수 전분을 포함할 것이다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제를 또한 전형적으로 첨가한다. 액체 현탁액을 사용하는 경우, 활성제를 에멀전화 부형제 및 현탁 부형제와 조합시킬 수 있다. 원하는 경우, 향미제, 착색제 및/또는 감미제를 또한 첨가할 수 있다. 경구 제형으로의 혼입을 위한 기타 임의 부형제로는 보존제, 현탁제, 증점제 등을 포함한다.

주사용 제형을 액체 용액 또는 현탁액으로서의 종래 형태, 주입 이전에 액체 중의 가용화 또는 현탁에 적합한 고체 형태로서, 또는 에멀전 또는 리포좀 제형으로서 제조할 수 있다. 무균 주사용 제형은 또한 무독성의 비경구적으로 허용가능한 희석물 또는 용매 중의 무균 주사용 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 (vehicle) 및 용매 중에는, 물, 링거 용액 (Ringer's solution) 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 무균의 고정유, 지방 에스테르 또는 폴리올이 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다.

본 발명의 약학 조성물을 비경구 투여를 위한 동결건조된 형태로 또한 제형화될 수 있다. 물 또는 기타 수성 매질을 첨가한 후, 사용하기 전에 추가로 적합한 희석물과 희석시킴으로써 동결건조된 제형을 재구성할 수 있다. 액체 제형은 일반적으로 완충 등장성 수용액이다. 적합한 희석물의 예로는 등장성 식염액, 수 중의 5 % 덱스트로스 및 완충 나트륨 또는 암모늄 아세테이트 용액이 있다. 약학적으로 허용가능한 고체 또는 액체 부형제를 첨가하여 조성물을 향상 또는 안정화시키거나 또는 조성물의 제조를 촉진시킬 수 있다.

전형적으로, 본 발명의 약학 조성물은 튜불린 중합 저해제의 투여에 의해 치료 가능한 질환, 특히 암 치료에서 약학 조성물의 사용을 지시하는, 라벨 또는 지시사항, 또는 그 둘 모두를 갖는 용기에 포장된다.

약학 조성물은 본 발명의 화합물 이외에 하나 이상의 기타 약리학적 활성제를 추가로 함유할 수 있다. 이들 추가 활성제는 전형적으로 본 발명의 화합물에 의해 암을 치료하는데 있어서 유용하거나 또는 암 치료를 향상시키는데 있어서 유용할 것이다.

화합물의 사용 방법

본 발명의 제 1 양태의 화합물은 하기 시험관내 및 생체내 실시예에 나타낸 바와 같은 인간 암 세포주에 대항하는 활성을 갖고, 따라서 인간 암의 치료를 위한 인간 암 화학요법제로서 유용한 것으로 고려된다.

따라서, 본 발명은 치료학적 유효량의 본 발명의 화합물 또는 이를 함유하는 약학 조성물을 인간에 투여함으로써 인간에서 암을 치료하는 방법; 및 인간에서 암을 치료하기 위한 약제의 제조에서 본 발명의 화합물의 용도를 포함한다. 임의적으로는, 상기 방법은 또다른 항암 요법, 예컨대 치료될 암에 대해 이미 관용되는 요법으로 인간을 치료하는 것을 추가로 포함한다.

특히 본 발명의 방법에 의해 치료가능한 암은 튜불린 중합 저해제에 민감한 암이다. 이러한 암은 상기 단락 <0005> 에 언급되는 것들, 예컨대 혈액성 악성종양, 예컨대 백혈병, 림프종 및 골수형성이상증후군을 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 특히 치료가능한 다른 암은 고형 악성종양, 예컨대 결장암, 폐암, 유방암, 난소암, 췌장암, 방광암, 뇌암, 위장암 및 신장암, 및 혈액성 악성종양, 예컨대 백혈병, 특히 ALL 및 CML, 림프종 및 골수이형성 증후군을 포함한다.

인간에 투여되는 (단독으로 또는 더 통상적으로는 본 발명의 조성물로) 본 발명의 화합물의 양은 단독으로 사용되는 경우 또는 또다른 항암 요법과 함께 사용되는 경우 (본 발명의 화합물을 또다른 항암 요법과 함께 투여하는 경우) 치료학적으로 유효량이어야 하고; 유사하게 인간에 투여되는 (본 발명의 화합물을 또다른 항암 요법과 함께 투여하는 경우) 또다른 항암 요법의 양은 본 발명의 화합물과 함께 사용되는 경우 치료학적으로 유효량이어야 한다. 그러나, 본 발명의 화합물의 치료학적 유효량 및 또다른 항암 요법의 양은 병용 암 화학요법으로 투여되는 경우 각각 인간에 단독으로 전달된다면 치료학적으로 유효한 양보다 적을 수 있다. 그러나, 암 요법에 있어서, 단지 사용된 요법의 통상적인 독성 또는 하나의 요법의 또다른 요법에 의한 강화된 독성의 이유만으로 당해 또는 각 요법의 최대의 내성 용량을 낮추어 사용하는 것이 통상적이다.

따라서, 본 발명의 화합물 또는 이를 함유하는 약학 조성물은 치료학적 유효량의 선택된 화합물 또는 조성물을 투여함으로써 이러한 치료를 필요로 하는 인간에서의 암을 치료하는데 사용된다. 본 발명의 화합물의 치료학적 유효량은 10 - 10,000 mg/㎡, 예를 들어, 30 - 3000 mg/㎡ 또는 100 - 1000 mg/㎡ 범위이다. 투여량은 1 - 35 일 간격으로, 예를 들어 1 - 5 주 간격으로, 특히 1, 2, 3 또는 4 주 간격으로 또는 투여를 매 2, 3 또는 4 주마다 반복하면서 수일 동안 (예컨대 5 또는 7 일) 1 회/1 일의 빈도를 비롯하여 더 높은 빈도로, 또한 투여를 매 2, 3 또는 4 주마다 반복하면서 6 - 72 시간의 기간 동안 일정하게 주입하는 약 500 - 1000 mg/㎡ 일 수 있다. 적합한 투여량과 투여 빈도는 상기 기술 및 본 개시물과 관련 있는 당업자에 의해 쉽게 결정될 것이다. 본 발명의 화합물이 본 발명에 따라 투여되는 경우 어떠한 허용가능하지 않는 독성학적 효과도 기대되지 않는다.

암 요법 분야에서의 당업자는 치료학적 유효량의 본 발명의 화합물 및 치료학적 유효량의 또다른 항암 요법 (본 발명의 화합물이 화학요법적 조합의 일부로서 투여되는 경우) 를 과도한 실험 없이 제시된 암 및 질환 단계에 대해 및 개인적 지식 및 본 출원의 개시물에 기대어 확인할 수 있을 것이다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 화합물의 제조 및 예측되는 시험관내 및 생체내 항암 검정에서의 그 활성을 예시한다. 이들 결과는 이들 검정에서 시험된 항암제가 인간에서 항암 활성을 나타내는 것과 같이, 인간 항암 화학요법에서 효능이 예상되는 것으로 여겨진다. 이들은 당업자가 본 발명을 보다 명확하게 이해하고 실시할 수 있게 제공된 것으며, 본 발명의 범주를 제한하고자 함이 아니며 단지 예시로서 본 발명을 나타낸 것이다.

제조예 및 합성예

본 발명의 화합물을 유기 화학의 종래 방법에 의해 제조한다. 예를 들어 문헌 [Larock, "Comprehensive Organic Transformations", Wiley-VCH, New York, New York, U.S.A] 을 참조한다. 일부 경우에 있어서, 보호기를 도입시킬 수 있고, 후에 제거할 수 있다. 적합한 보호기는 문헌 [Greene et al. "Protective Groups in Organic Synthesis", 2nd ed., 1991, John Wiley and Sons, New York, New York, U.S.A] 에 기재되어 있다. 일반적으로 본 출원에서 보다 먼저 예시된 반응식에 따라 본 발명의 화합물을 하기 실시예에 나타낸 바와 같이 또는 당업자에 공지된 방법에 의해 예시된 합성을 변형시킴으로써 합성할 수 있다. 제조예는 본 발명의 화합물의 합성에 유용한 중간체의 제조를 지칭하고; 합성예는 본 발명의 화합물의 합성을 지칭한다. 화합물 번호는 이들 실시예에 바로 뒤따르는 표에서 지칭된다.

제조예 1. 4-[2-(디메틸아미노)에톡시]페닐 이소티오시아네이트 (화합물 36A 에 대한 중간체) 의 제조

디이소프로필에틸아민 (344　mg, 2.66　mmol, 2.4　eq.) 을 0 ℃ 에서 테트라히드로푸란 (2　㎖) 중의 4-[2-(디메틸아미노)에톡시]아닐린 (200　mg, 1.11　mmol, 1　eq.) 용액에 교반 하에 첨가한 후, 티오포스겐 (153　mg, 1.33　mmol, 1.2　eq.) 을 교반 하에 적가하였다. 반응 혼합물을 교반 하에 실온으로 가온하고, 침전물이 형성되는 동안 40 분 동안 실온에서 교반하였다. 테트라히드로푸란을 진공 하에 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트 중에서 용해시키고 식염수 (3×10　㎖) 로 세척한 후, 에틸 아세테이트 층을 황산 마그네슘 상에서 건조시키고 에틸 아세테이트를 증발시켜 4-[2-(디메틸아미노)에톡시]페닐 이소티오시아네이트 (0.20　g) 를 진갈색 오일로서 수득하였고, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다.

제조예 2. 2-브로모-4'-[2-(디메틸아미노)에톡시]-아세토페논 (화합물 39A 에 대한 중간체) 의 제조

2-(디메틸아미노)에틸 클로라이드 히드로클로라이드 (3.49　g, 23.2　mmol, 1.1　eq.) 를 아세톤 (100　㎖) 중의 4'-히드록시아세토페논 (3.00　g, 22.0　mmol, 1　eq.) 용액에 첨가한 후, 탄산 칼륨 (9.12　g, 66.0　mmol, 3　eq.) 을 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류 하에 밤새 가열하고, 냉각하고, 여과하고; 여과물을 농축시키고 물 (50　㎖) 을 첨가하고, 탁한 용액을 형성시켰다. 염산 (0.1N, 20　㎖) 을 첨가하고, 생성된 맑은 용액을 에틸 아세테이트로 3 회 추출하였다. 수성 상을 수성 수산화 나트륨으로 염기성으로 만들고, 탁한 혼합물을 형성시키고, 이를 에틸 아세테이트 (5×50　㎖) 로 추출한 후, 에틸 아세테이트 층을 황산 마그네슘 상에서 건조시키고 에틸 아세테이트를 증발시켜 4'-[2-(디메틸아미노)에톡시]아세토페논 (2.90　g) 을 약간 황색의 오일로서 수득하였고, LC-MS 로 순도 및 고유성을 확인하였다. 브롬 (1.62　g, 10.1　mmol, 1.4　eq.) 을 아세트산 (5　㎖) 중의 4'-[2-(디메틸아미노)에톡시]아세토페논 (1.5　g, 7.24　mmol) 용액에 적가하고 반응 혼합물을 24 ℃ 에서 3　시간 동안 교반하여, 진한 적색 용액을 수득하였다. 반응 혼합물을 냉각하고, 물 (5　㎖) 을 첨가하고, 혼합물을 밤새 동결건조하였다. 미정제 2-브로모-4'-[2-(디메틸아미노)에톡시]아세토페논을 분취용 HPLC 로 정제한 후, 적절한 분획을 동결건조하여 2-브로모-4'-[2-(디메틸아미노)에톡시]아세토페논 (0.7　g) 을 황백색 (off-white) 고체로서 수득하였다.

합성예 1. 4-아미노-5-(2,4-디메톡시벤조일)-2-[(4-에톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴 (화합물 6A) 의 합성

디메틸포름아미드 (DMF) (5　㎖) 중의 말로노니트릴 (0.40　g, 6.1　mmol) 의 교반 용액에 탄산 칼륨 (1.68　g, 12.2　mmol, 2　eq.) 을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15 분 동안 교반하고, 4-에톡시페닐 이소티오시아네이트 (1.07　g, 6.1　mmol) 를 첨가하였다. 추가의 30 분 동안 교반 후, 2-브로모-2',4'-디메톡시-아세토페논 (1.57　g, 6.1　mmol, 1　eq.) 을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 물 (20　㎖) 을 잔류물에 첨가하였다. 생성된 고체를 여과로 수합하고 진공 하에 건조시켜 2.80　g 의 미정제 생성물을 황색 고체로서 수득하였다. 이러한 미정제 생성물을 2 개의 유사한 배치로 조합하고 (다함께 총 7.7　g 의 미정제 생성물) 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하고, 헥산/에틸 아세테이트 (2:1 이후 1:1) 로 용리하여 4-아미노-5-(2,4-디메톡시벤조일)-2-[(4-에톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴 (2.2　g) 을 황갈색 고체로서 수득하였다.

합성예 2. 4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-[(4-메톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르복스아미드 (화합물 1A) 의 합성

DMF (50　㎖) 중의 2-시아노아세트아미드 (3.0　g, 36　mmol) 의 교반된 용액에 수소화 나트륨 (광유 중 60 %, 1.43　g, 35.7　mmol, 1　eq.) 을 첨가하고, 혼합물을 0 ℃ 에서 1 시간 동안 교반하여 맑은 용액을 수득하였다. DMF (10　㎖) 중의 4-메톡시페닐 이소티오시아네이트 (15.90　g, 35.7　mmol, 1　eq.) 를 첨가하고, 30 분 동안 교반한 후, 2-브로모-4'-클로로아세토페논 (8.33　g, 35.7　mmol, 1　eq.) 및 탄산 칼륨 (4.93　g, 35.7　mmol, 1　eq.) 을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1 주 동안 교반하였다. 물 (200　㎖) 을 첨가하고; 형성된 진한 침전물을 여과하고, 물 (3×50　㎖), 에틸 아세테이트 (3×15　㎖) 및 아세톤 (3×15　㎖) 으로 세척한 후, 진공 하에 건조시켜 4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-[(4-메톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르복스아미드 (5.6　g) 를 밝은 오렌지색 고체로서 수득하였다.

하기 표에 나타낸 바와 같은 화학식 A 의 화합물을 하나 이상의 상기 방법으로 제조하거나, 여기에 상세히 기재하지 않은 유사한 방법으로 제조하였다. 화학식 A 의 화합물을 분석하여 고유성 및 순도를 확인하였고, 순도에 대해선 HPLC 를 이용하였고, 고유성에 대해선 하나 이상의 질량 분광측정법 (양성 또는 음성 이온화 둘 중 하나를 이용) 및 NMR (¹H 및/또는 ¹³C) 을 이용하였고, 예상되는 생성물이 양호한 순도임을 확인하였다. 화학식 A 의 수많은 다른 화합물을 유사하게 제조하고, 화학식 A 의 추가의 화합물을 유사하게 제조하였다.

화학식 A 의 대표적인 화합물은 하기를 포함한다 ("정확한 질량" 이란 모 화합물의 것이며; 질량 스펙트럼은 양성 이온화로 인한 것이며, 빈칸은 측정이 이루어지지 않음을 의미함):

본 발명의 기타 화합물을 상기 기술 및 본 개시물과 관련 있는 당업자에 익히 공지된 방법을 사용하여 유사하게 제조할 수 있다.

시험관내 실시예.

하기 실시예는 시험관내 인간 암 세포주에 대항하는 화합물의 세포독성/세포증식억제 효과를 예시한다. 이들 검정에서 시험된 기타 항암제가 인간에서 항암 활성을 나타내는 경우, 이러한 결과들은 인간 암 화학요법에서의 효능이 예측되는 것으로 간주된다.

세포주 A549 (인간 폐 선암종), OVCAR-3 (인간 난소 암종), HL60 (인간 전골수구성 백혈병), DLD1 (인간 결장 선암종) 및 HCT116 (인간 결장 암종) 을 미국 버지니아 매나사스의 American Type Culture Collection 으로부터 입수하였다. 모든 제품을 제조업체의 지시사항에 따라 사용하였다. 히스톤 인산화 (p-H3) 검정을 2 중으로 수행하였고, 세포 독성 검정을 각 경우 용매 대조군을 사용하여 3 중으로 수행하였다.

시험관내 실시예 1: 세포독성 검정.

대수증식기 세포를 트립신으로 처리하고, 원심분리로 수합하고, 작은 부피의 신선한 배지에 재현탁시키고, 생존 세포의 밀도를 하기 트립판 블루 염색법 (Trypan Blue staining) 으로 측정하였다. 세포를 신선한 배지 중에 희석하고, 최종 DMSO 농도가 0.5 % 가 되도록 희석한 직후, 시험 화합물 (0.1 μM 내지 200 μM 의 농도, DMSO 중에 용해, 50 ㎕) 을 첨가한 다음 현탁액을 150 ㎕/웰로 96-웰 플레이트에 첨가하고, 부착성 세포의 경우에 밤새 인큐베이션함으로써 부착시켰다. 세포를 3 일 (약 3 번의 배가시간) 동안 배양하였다. 이후, 세포를 원심분리로 수합하고, 100 ㎕ 의 배양 상청액을 CellTiter-Glo 시약으로 대체하였다. 실온에서 15 분 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 광도계로 판독하였다. 화학식 A 의 화합물은 이들 검정에서 하기 세포독성을 나타내었다. 표는 μM 단위로 세포독성 IC₅₀ 을 제공하고, 유효 숫자 1 로 반올림 하였다.

시험관내 실시예 2: A549 세포에서 세포 주기 분석.

대수증식기 세포를 75-㎖ 의 플라스크에서 밤새 시딩하여 세포를 부착하고, 시딩 밀도는 세포 배양물이 수확일에 80 % 미만의 합류성이도록 선택한다. 시험 화합물 (DMSO 중 용해) 을 약 IC₈₀ 에서 첨가하여 0.1 % 의 최종 DMSO 농도를 달성한 후, 세포를 1, 2 또는 3 일 동안 추가로 인큐베이션하였다. 인큐베이션에 따라, 세포를 수확하고, 차가운 PBS 로 세척하고, 75 % 수성 에탄올 중에서 고정하고, 추가로 분석할 때까지 -20 ℃ 에서 저장하였다. 세포 주기 상태를 반영하는 세포 DNA 함량을 결정하기 위해, 고정된 세포를 인산 완충 식염수로 2 회 세척한 후 30 분 동안 37 ℃ 에서 RNase 로 처리하였다. 이후, 프로피듐 요오다이드로 염색하고 이어서 Becton Dickinson FACSCalibur 시스템 상에서 FACS 분석하였다. 상기 기재된 화학식 A 의 화합물 41 개 중에서, 35 개를 시험하였고 30 개가 G2/M 세포주기 정지를 나타냈다.

시험관내 실시예 3: 히스톤 인산화 (p-H3) 검정.

대수증식기 A549 세포를 96-웰 플레이트 중에 시딩하고, 밤새 부착시켰다. 시험 화합물을 DMSO (일련의 3 배 일련 희석물로 8 개 농축물) 중에 희석하고, 세포 (DMSO 최종 농도 0.5 %) 에 첨가하고, 세포를 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 차가운 인산 완충 식염수 (PBS) 로 3 회 세정하고, 용균 완충액을 첨가하였다. 4 ℃ 에서 30 분간 진탕 및 원심분리 후, 상청액을 "닷-블롯(dot-blot)" 장치에 의해 니트로셀룰로오스 막으로 이동시켰다. 웰을 세정한 후, 웨스턴 블롯 (Western blot) 을 위해 막을 처리하였다. 1 차 토끼 항-p-H3 및 마우스 항-β-액틴 항체, 이어서 2 차 염소 항-토끼 IRDye800 및 염소 항-마우스 AlexaFluor 680 항체로 동일 막 상에서 p-H3 및 β-액틴의 검출을 수행하였다. 상기 막을 Odyssey 스캐너로 스캐닝하였다. 화합물 1A 내지 15A 중 11 개를 시험하였고 (IC₅₀ 범위는 0.02　μM (화합물 2A) 내지 0.5　μM (화합물 15A) 임), 저해성 효능 경향은 일반적으로 세포독성의 경우와 동일하였다.

시험관내 실시예 4: 튜불린 중합의 저해.

화합물 2A, 9A, 12A, 14A 및 21A 를 세포-미함유 형광 검정에서 튜불린 중합 저해에 대해 시험하였고, 모든 화합물은 튜불린 중합 저해를 나타냈다. 화합물 2A, 4A 내지 10A, 12A, 14A, 15A, 19A, 29A, 30A 및 40A 를 면역현미경관찰법 및 세포 분획법에 의해 A549 세포 중 튜불린 중합 저해에 대해 시험하였고 (IC₅₀ 범위는 0.009　μM (화합물 7A) 내지 2　μM (화합물 30A) 임), 저해성 효능 경향은 일반적으로 세포독성의 경우와 동일하였다. 화합물 40A 는 이 검정에서 비활성이었다.

시험관내 실시예 5: 기타 검정.

화합물 2A, 9A 및 12A 를 P388 및 P388/ADR (독소루비신-저항성) 세포 둘 모두에서 이의 세포독성을 검정함으로써 P388 (마우스 백혈병) 세포주에서 교차-저항성에 대해 시험하였다. 독소루비신 그 자체가 260-배 저항비를 나타내는 경우, 빈블라스틴은 50-배 저항비를 나타냈고, 콜치신 (튜불린 저해제) 은 70-배 저항비를 나타냈고, 화합물 2A, 9A 및 12A 는 모두 2-배 미만의 저항비를 나타냈다. 화학식 A 의 보다 세포독성인 화합물 수 개를 시험하였고 P-글리코단백질에 대해 기질이 아닌 것으로 밝혀졌고, 유출 펌프는 통상적으로 암 세포에서 다중약물-저항성과 연계되어 있었다.

생체내 실시예.

생체내 실시예 1: HL60 이종 이식 검정, 경구 투여.

6-8 주령된 수컷 흉선제거 nu / nu 마우스 (약 20 g) 를, 2 세대 이상 동안 항생제 없는 배지에서 성장시킨 약 1 ×10⁷ 세포의 HL60 (인간 전골수구성 백혈병) 주로 우측 앞 옆구리에 피하로 이식하였다. 종양 이식 약 6 일 후, 종양 중량이 약 50-250 mg 이었을 때, 마우스를 치료군으로 지정하였다. 시험 화합물을 0.55 중량% 의 수성 카르복시메틸셀룰로오스 중에 20 mg/㎖ 로 현탁하였다. 비히클 대조군과 함께, 치료 시작부터 1-5 일 및 8-10 일에 1 회/1 일 강제사육에 의해 200 mg/Kg 의 화합물 2A, 9A 및 12A 로 마우스 군을 치료하였다. 치료 마지막 날에, 종양 성장 저해를 측정하였다. 시험된 모든 3 개의 화합물은 상기 검정에서 활성이 있었는데, 화합물 2A 는 비히클과 비교해 보았을 때 46 % 의 종양 성장 저해를 야기하였고, 화합물 9A 는 43 % 저해를 야기하였고, 화합물 12A 는 66 % 저해를 야기하였다.

생체내 실시예 2: HCT116 이종 이식 검정, 경구 투여.

6-8 주령된 수컷 흉선제거 nu / nu 마우스 (약 20 g) 를, 2 세대 이상 동안 항생제 없는 배지에서 성장시킨 약 1 ×10⁷ 세포의 HCT116 (인간 결장 암종) 주로 우측 앞 옆구리에 피하로 이식하였다. 종양을 이식한 지 약 14-21 일 후, 종양 중량이 약 50-250 mg 이었을 때, 마우스를 치료군으로 지정하였다. 시험 화합물을 0.55 중량% 의 수성 카르복시메틸셀룰로오스 중에 20 mg/㎖ 로 현탁하였다. 비히클 대조군과 함께, 치료 시작부터 1-5 일 및 8-12 일에 1 회/1 일 강제 사육에 의해 200 mg/Kg 의 화합물 2A, 9A 및 12A 로 마우스 군을 치료하였다. 치료 마지막 날 후 2 일에, 종양 성장 저해를 측정하였다. 시험된 모든 3 개의 화합물은 상기 검정에서 활성이 있었는데, 화합물 2A 는 비히클과 비교해 보았을 때 35 % 종양 성장 저해를 야기하였고, 화합물 9A 는 36 % 저해를 야기하였고, 화합물 12A 는 46 % 저해를 야기하였다.

생체내 실시예 3: HL60 이종 이식 검정, 경구 투여.

생체내 실시예 1 에서 기재된 바와 같이 실험을 일반적으로 수행하였다. 마우스 군을 비히클 대조군을 사용하여, 치료 시작부터 1-5 일 및 8-10 일에 1 회/1 일 강제 사육에 의해 200 mg/Kg 의 화합물 5A, 6A, 7A, 8A 및 10A 로 마우스 군을 치료하였다. 치료 마지막 날에, 종양 성장 저해를 측정하였다. 시험된 화합물 5 개 중 4 개는 상기 검정에서 활성이 있었는데, 화합물 5A 는 비히클과 비교해 보았을 때 45 % 종양 성장 저해를 야기, 화합물 6A 는 89 % 저해를 야기, 화합물 7A 는 45 % 저해를 야기, 화합물 10A 는 67 % 저해를 야기한 반면; 화합물 8A 는 10 % 저해를 야기하였다 (통계학적으로 유의하지 않음).

제형예

제형예 1. 경구 투여용 제형.

경구 투여용 고체 제형을 하기를 조합함으로써 제조하고 상기 혼합물을 압착하여 정제를 형성하거나 또는 예를 들어 100 mg 의 본 발명의 화합물을 함유하는 경질 젤라틴 캡슐로 충전한다:

본 발명의 화합물 25.0% w/w

마그네슘 스테아레이트 0.5% w/w

전분 2.0% w/w

히드록시프로필메틸셀룰로오스 1.0% w/w

미세결정성 셀룰로오스 71.5% w/w.

원하는 경우, 정제를 필름-형성제 (예를 들어, 히드록시프로필메틸셀룰로오스), 안료 (예를 들어, 티타늄 디옥시드) 및 가소제 (예를 들어, 디에틸 프탈레이트) 의 현탁액을 도포하고 용매를 증발시켜 필름을 건조시킴으로써 코팅할 수 있다.

제형예 2. IV 투여용 제형.

예를 들어 약학적으로 허용가능한 염으로서의 본 발명의 화합물을 인산 완충 식염수 중에 농도가 1% w/v 가 되도록 용해시킴으로써 IV 투여용 제형을 제조하고; 용액을 예를 들어 살균 여과에 의해 살균하고, 예를 들어 100 mg 의 본 발명의 화합물을 함유하는 살균 용기 중에 밀봉시킨다.

대안적으로, 다시 예를 들어 약학적으로 허용가능한 염으로서의 본 발명의 화합물을 적합한 완충액, 예를 들어 상기 언급된 인산 완충 식염수의 포스페이트 완충액 중에 용해시키고, 임의로는 벌크화제 및 기타 약학적으로 유용한 부형제를 첨가하고, 용액을 살균하고, 이를 적합한 살균 바이알에 분배시키고, 용액을 동결건조시켜 물을 제거하고, 바이알을 밀봉시킴으로써 동결건조된 제형을 제조한다. 살균수를 첨가함으로써 동결건조된 제형을 재구성하고, 0.9 % 염화나트륨 정맥내 주입액 또는 5 % 덱스트로스 정맥내 주입액과 같은 용액으로, 재구성된 용액을 투여용으로 추가로 희석시킬 수 있다.

본 발명이 특정 구현예 및 실시예를 기재하고 있지만, 구체적으로 개시되어 있는 재료 및 방법의 등가물 또한 본 발명에 적용됨은, 관련 기술 및 개시 내용을 알고 있는 당업자에게 명백하며; 그러한 등가물은 하기 특허청구범위 내에 포함되도록 의도된다.

Claims

튜불린 중합 저해제에 의해 치료 가능한 질환, 특히 암의 치료를 위한 약제의 제조에서 화학식 A 의 화합물 또는 이의 염의 용도:

[식 중,
X 는 CN 또는 CONH₂ 이고;
m 및 n 은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3 이며, 단 m 및 n 중 하나 이상은 0 이 아니고;
각각의 R 은 독립적으로 할로, 시아노, 니트로, 또는 임의 치환되는 알킬, 또는 -OR', -SR', -C(O)OR' 또는 -NR'R" (이때, R' 는 임의 치환되는 알킬이고, R" 는 수소 또는 알킬임) 이거나, 동일한 페닐기 상의 2 개의 인접한 R 기는 함께 메틸렌디옥시임].
튜불린 중합 저해제에 의해 치료 가능한 질환, 특히 암의 치료를 위한 것과 같은 약제의 제조에서 하기로부터 선택되는 화학식 A 의 화합물의 용도:
1A, 4A, 12A, 17A, 38A,
4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-[(4-메톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르복스아미드,
4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-[(4-에톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-메톡시벤조일)-2-[(4-메톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-[(4-에톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴, 및
4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-[(4-플루오로페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴, 및
이들의 염.
하기로부터 선택되는 화합물:
4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-[(4-메톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-브로모벤조일)-2-[(4-메톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-[(3,4-디메톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(2,4-디메톡시벤조일)-2-[(4-에톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-메톡시벤조일)-2-[(4-메톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르복스아미드,
4-아미노-5-[4-(디메틸아미노)벤조일]-2-[(3,4-메틸렌디옥시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-메톡시벤조일)-2-[(3,4-메틸렌디옥시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-[4-(디메틸아미노)벤조일]-2-[(3,4-디메톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-[(4-에톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르복스아미드,
4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-[(4-메틸페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(3,4-디메톡시벤조일)-2-[(3,4-메틸렌디옥시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-[(3,4-디메톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-메틸벤조일)-2-[(3,4-메틸렌디옥시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-시아노벤조일)-2-[(3,4-메틸렌디옥시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(2-메톡시벤조일)-2-[(3,4-메틸렌디옥시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(2,4-디메톡시벤조일)-2-[(2,4-디메톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-브로모벤조일)-2-[(3,4-메틸렌디옥시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-[(3,4-메틸렌디옥시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(3-메톡시벤조일)-2-[(3,4-메틸렌디옥시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-[4-(디메틸아미노)벤조일]-2-[(2,4-디메톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-메톡시벤조일)-2-[(3,4-디메톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-[(4-이소프로필페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-{[4-(메톡시카르보닐)페닐]아미노}티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-{[4-(트리플루오로메틸)페닐]아미노}티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-메톡시벤조일)-2-[(2,4-디메톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-플루오로벤조일)-2-[(3,4-메틸렌디옥시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(3-시아노벤조일)-2-[(3,4-메틸렌디옥시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(3-클로로벤조일)-2-[(3,4-메틸렌디옥시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-({4-[2-(디메틸아미노)에톡시]페닐}아미노)티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-[(4-니트로페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-{4-[2-(디메틸아미노)에톡시]벤조일}-2-[(4-메톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-[(4-시아노페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴, 및
4-아미노-5-(3-브로모벤조일)-2-[(3,4-메틸렌디옥시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴, 및
이들의 염.
제 3 항에 있어서, 하기로부터 선택되는 화합물:
4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-[(4-메톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-브로모벤조일)-2-[(4-메톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-[(3,4-디메톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(2,4-디메톡시벤조일)-2-[(4-에톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-메톡시벤조일)-2-[(4-메톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르복스아미드,
4-아미노-5-[4-(디메틸아미노)벤조일]-2-[(3,4-메틸렌디옥시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-메톡시벤조일)-2-[(3,4-메틸렌디옥시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-[4-(디메틸아미노)벤조일]-2-[(3,4-디메톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴,
4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-[(4-에톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르복스아미드,
4-아미노-5-(4-클로로벤조일)-2-[(4-메틸페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴, 및
4-아미노-5-(3,4-디메톡시벤조일)-2-[(3,4-메틸렌디옥시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴, 및
이들의 염.
제 4 항에 있어서, 4-아미노-5-(2,4-디메톡시벤조일)-2-[(4-에톡시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴 또는 이의 염인 화합물.
제 4 항에 있어서, 4-아미노-5-(4-메톡시벤조일)-2-[(3,4-메틸렌디옥시페닐)아미노]티오펜-3-카르보니트릴 또는 이의 염인 화합물.
제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는 약학 조성물.