KR20120005460A

KR20120005460A - Ｐｋｃ-세타 억제제를 사용하는 면역학적 장애의 생체외 치료

Info

Publication number: KR20120005460A
Application number: KR1020117023974A
Authority: KR
Inventors: 메리앤 브라운; 마이클 더스틴; 알렉산드라 자닌-조로브
Original assignee: 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하; 뉴욕 유니버시티
Priority date: 2009-04-28
Filing date: 2010-04-28
Publication date: 2012-01-16
Also published as: CN102421435A; US20120196919A1; AU2010241701A1; IL215939A0; CL2011002690A1; WO2010126967A1; NZ595331A; JP2012525403A; MX2011011290A; EP2445503A1; CA2760305A1; BRPI1014775A2; EA201101568A1

Abstract

본원에는 면역학적 장애 및 죽상경화증을 포함하는, PKC-세타의 활성을 통해 매개되거나 지속되는 각종 질병 및 장애를 치료하는 방법이 기재되어 있다. 상세하게는, 본 발명은 면역학적 장애 또는 죽상경화증을 가진 환자로부터의 혈액 또는 상기 혈액의 정의된 성분을 PKC-세타의 억제제로 생체외에서 처리한 다음, 처리된 혈액을 환자에게 재투여함을 포함하여, 상기 환자에서 면역학적 장애 또는 죽상경화증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

ＰＫＣ-세타 억제제를 사용하는 면역학적 장애의 생체외 치료{Ex-vivo treatment of immunological disorders with PKC-theta inhibitors}

본 발명은 면역학적 장애 및 죽상경화증을 포함하는, PKC-세타의 활성을 통해 매개되거나 지속되는 각종 질병 및 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.

단백질 키나제 C 계열은 12개의 관련된 동종효소(isoenzyme)로 구성된 세린/트레오닌 키나제의 그룹이다. 이들 키나제는 광범위한 조직 및 세포 유형에서 발현된다. 이의 구성원은 상이한 유전자에 의해 암호화되어 있으며 이들의 활성화 요건에 따라 하위-분류된다. 전형적인 PKC 효소(cPKC)는 활성화를 위해 디아실글리세롤(DAG), 포스파티딜세린(PS) 및 칼슘을 필요로 한다. 신규한 PKC(nPKC)는 DAG 및 PS를 필요로 하지만 칼슘 독립적이다. 이례적인 PKC(aPKC)는 칼슘 또는 DAG를 요구하지 않는다.

PKC-세타는 nPKC 하위-계열의 구성원이다. 이는 T 세포 및 골격근에서 주로 발견되는, 제한된 발현 패턴을 갖는다. T 세포 활성화시, 초분자 활성화 집단(SMAC)으로 구성된 면역학적 시냅스(IS)는 T 세포와 항원 제시 세포(antigen presenting cell: APC) 사이의 접촉 부위에서 형성된다. PKC-세타는 SMAC에 국재화되어(참조: C. Monks et al., Nature, 1997, 385, 83), 이를 T 세포 활성화 과정을 매개하는 다른 시그날링 효소와 근접하게 위치시키는 것으로 밝혀진 유일한 PKC 동형이다. 다른 연구(참조: G. Baier-Bitterlich et al., Mol. Cell. Biol., 1996, 16, 842)에서, IL-2 유전자의 활성화에 중요한 전사 인자인, AP-1의 활성화시 PKC-세타의 역할이 확인되었다. 자극받지 않은 T 세포에서, 구성적으로 활성인 PKC-세타는 AP-1 활성을 자극하였지만, 우성 음성 PKC-세타를 지닌 세포에서, AP-1 활성은 PMA에 의한 활성화시 유도되지 않았다. 다른 연구는, PKC-세타가 IκB 키나제 베타의 활성화를 통해 T 세포 수용체/CD28 공동-자극에 의해 유도된 NF-κB의 활성을 매개함을 나타내었다(참조: N. Coudronniere et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 3394; X. Lin et al., Moll. Cell. Biol, 2000, 20, 2933). T 세포 수용체(TCR)/CD28 자극에 대한 반응시 PKC-세타 녹아웃 마우스(knockout mouse)로부터의 말초 T 세포의 증식은 야생형 마우스로부터의 T 세포와 비교하여 크게 감소되었다. 또한, T 세포로부터 방출된 IL-2의 양 또한 크게 감소하였다(참조: Z. Sun et al., Nature, 2000, 404, 402). 그 외에, PKC-세타 녹아웃 마우스는 정상으로 보였고 생식력이 있었다.

위에서 인용한 연구 및 다른 연구들은 T 세포 활성화 및, IL-2와 같은 사이토킨의 후속적인 방출 및 T 세포 증식에 있어서 PKC-세타의 중요한 역할을 입증한다(참조: A. Altman et al., Immunology Today, 2000, 21, 567). 따라서, PKC-세타의 억제제는 T 세포의 부적절한 활성화에 의해 매개된 면역학적 장애 및 다른 질병을 치료하는데 있어서 치료학적으로 유리할 수 있다.

T 세포가 면역 반응을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 한다는 것은 익히 확립되어 있다(참조: Powrie and Coffman, Immunology Today, 1993, 14, 270). 실제로, T 세포의 활성화는 흔히 면역학적 장애에 있어서 개시 현상이다. TCR의 활성화 후, T 세포 활성화에 요구되는 칼슘의 유입이 존재한다. 활성화시, T 세포는, IL-2로서 포함하는, 사이토킨을 생산하여, T 세포 증식, 분화 및 효과기 기능을 가져온다. IL-2의 억제제를 사용한 임상 연구는, T 세포 활성화 및 증식을 사용한 간섭이 생체내에서 면역 반응을 효과적으로 억제함을 나타낸다(참조: Waldmann, Immunology Today, 1993, 14, 264). 따라서, T 림프구 활성화 및 후속적인 사이토킨 생산을 억제하는 제제는 이러한 면역억제를 필요로 하는 환자에서 면역 반응을 효과적으로 억제하는데 치료학적으로 유용하므로 자가면역 및 염증 질병과 같은 면역학적 장애를 치료하는데 유용하다.

본원에 참조로 인용된 미국 특허출원 공보 제US 2005/0124640호는 면역학적 질병을 포함하는 PKC-세타에 의해 매개된 각종 질병을 치료하는데 유용한, PKC-세타의 억제제인 화학식 I의 화합물을 기재하고 있다.

[화학식 I]

일반적인 양상에서, 본 발명은 환자로부터의 혈액을 생체외에서 PKC-세타의 억제제로 처리한 다음, 처리된 혈액을 환자에게 재투여함을 포함하여, 환자에서 면역학적 장애 또는 죽상경화증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 양상에서, 환자 혈액으로부터의 백혈구 분획을 분리하고 생체외에서 PKC-세타의 억제제로 처리한 다음, 환자에게 재투여한다.

본 발명의 다른 양상에서, 환자 혈액으로부터의 Treg 세포를 분리하여 생체외에서 PKC-세타의 억제제로 처리한 다음, 환자에게 재투여한다.

본 발명의 다른 양상에서, 환자 혈액으로부터의 Treg 세포를 분리하고, 성장하도록 유도하여 더 많은 수의 Treg 세포를 생성시키고 생체외에서 PKC-세타의 억제제로 처리한 후 환자에게 재투여한다.

본 발명의 다른 양상에서, PKC-세타 억제제는 화학식 I의 화합물이다:

[화학식 I]

상기 화학식 I에서,

R₁, R₂ 및 R₃는 본원에 정의한 바와 같다.

다른 양상에서, 면역학적 장애는 염증병, 자가면역병, 기관 및 골수 이식 거부 및, 급성 또는 만성 염증, 알레르기, 접촉성 피부염, 건선, 류마티스 관절염, 다발경화증, 제I형 당뇨병, 염증성 장 질환, 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염, 이식편 대 숙주병(및 기관 또는 골수 이식 거부의 다른 형태) 및 전신홍반루푸스를 포함하는, T 세포 매개된 면역 반응과 관련된 기타 장애 중에서 선택된다.

도 1 a 내지 c
특이적인 억제제, 화합물 (Ia)에 의한 PKC-세타의 억제는 시험관내에서 CD4⁺CD25⁺T_reg 세포의 억제 기능을 상향-조절한다.
Treg 세포 및 CD4⁺CD25^- Teff(비-Treg) 세포를 화합물 (Ia)와 0.001 내지 1μM(a-b)로 30분 동안 또는 1 μM(c)로 0 내지 60분 동안 처리하였다. 처리된 세포를 CD4⁺CD25^- T (Teff) 세포와 1:9 비로 혼합하고 고정화된 항-CD3 mAb 상에 플레이팅(plating)하였다. 상청액을 IFN-감마에 대해 24 내지 48 시간(a 및 c) 후에 분석하였다. 세포 증식을 96시간(b) 후에 측정하였다. 4개의 상이한 실험의 평균이 제시되어 있다.
도 2
PKC-세타의 억제제에 의한 억제 기능의 상향-조절은 이들의 IC₅₀과 상관관계가 있다.
Treg를 그래프에 나타낸 바와 같이 상이한 IC₅₀ 값을 갖는 1μM PKC-세타 억제제로 처리하였다. 처리된 세포를 CD4⁺CD25^- T (Teff) 세포와 1:9의 비로 혼합하고 고정된 항-CD3 mAb 상에 플레이팅한다. 상청액을 24 내지 48시간 후에 IFN-감마에 대해 분석하였다. 4개의 상이한 실험의 평균을 나타낸다. 그래프에 나타낸 바와 같이, IFN-감마 분비에 미치는 억제 효과의 향상은 일반적으로 억제제의 효능과 상관관계가 있다.
도 3
Treg를 사일런트(silent) RNA 표적화 PKC-세타, 또는 대조군 사일런트 RNA로 형질감염시키고 항-CD3 mAb 상에 플레이팅하였다. 48시간 후에, PKC-세타 발현을 웨스턴 블롯 분석으로 측정하였다.
도 4
siRNA에 의한 PKC-세타의 억제는 시험관내에서 CD4⁺CD25⁺ T_reg 세포의 억제 기능을 상향-조절한다.
처리된 Treg 및 비-Treg, 또는 siRNA-형질감염된 Treg를 CD4⁺CD25^- T(Teff) 세포와 1:9의 비로 혼합하고 고정화된 항-CD3 mAb 상에 플레이팅하였다. 상청액을 24 내지 48시간 후에 IFN-감마에 대해 분석하였다. 4개의 상이한 실험의 평균이 제시되어 있다.
도 5a 내지 5d
PKC-세타 억제제를 사용한 처리는 생체내에서 Treg 기능을 상향-조절한다.
대장염을 C57BL/10.PL TCR 알파^-/-베타^-/- 마우스에서 방법 요약에 기술된 바와 같이 유도하였다. 5a- 마우스의 수는 5마리(PBS), 8마리(Teff), 7마리(Teff/Treg 대조군), 7마리(Teff/Treg PKC-세타 억제제)였다. 5b- 상이한 그룹에 대한 원위 결장(distal colon)의 조직 슬라이드. 정상적인 조직학이 PKC-세타 처리된 마우스에서 관측된다. 5c, 5d- 건강한 공여자 및 RA 환자로부터의 새로이 정제된 Treg를 PKC-세타 억제제로 30분 동안 1μM에서 처리하거나 처리하지 않고, CD4⁺CD25^- T 세포와 1:3의 비로 혼합하고, 항-CD3 mAb 상에 플레이팅하였다. 상청액을 24 내지 48시간 후에 IFN-감마에 대해 분석하였다. 3개의 독립된 실험들의 합한 데이터가 제시되어 있다. Treg-매개된 억제 %를 다음과 같이 계산하였다: 1-(Treg의 존재하에서 IFN-감마의 수준/Treg의 부재하에서 IFN-감마의 수준) X 100%. P 값은 t-시험으로 계산하였다.

CD4⁺CD25⁺ 조절성 T 세포(Treg)는 CD4⁺ 및 CD8⁺ 효과기 세포(Teff)의 기능을 항원 수용체 및 세포 접촉 메카니즘을 통해 억제한다. 최근 연구는, TCR 활성화가 시험관내에서 반응인자 CD4⁺CD25^- T 세포의 증식을 억제하는 Treg 세포의 능력에 요구됨을 입증하였다(참조: A.M. Thornton et al., Eur. J. Immunol, 2004, 34, 366). 본 발명자들은, PKC-세타의 억제가 시험관내에서 사람 CD4⁺CD25⁺ Treg 세포의 억제 기능에 영향을 미칠 수 있는지를 시험하였다. 당해 목적을 위해, 본 발명자들은 CD4⁺CD25⁺ Treg 또는 CD4⁺CD25^- Teff 세포(도 1a 및 1b에서 각각 Treg 또는 비-Treg)를 특이적인 PKC-세타 억제제, 즉, 화합물(Ia)로 처리하고, 세척하며 세포를 처리되지 않은 Teff 세포와 함께 1:9의 비로 자극성 항-CD3 항체 상에서 배양하였다. IFN-감마 분비 및 세포 증식을 24시간 및 96시간 후 각각 측정하였다. 본 발명자들은, PKC-세타 억제제가 Treg 세포의 억제능을 상당히 상향-조절하였으나, 처리되지 않은 반응인자 Teff와 함께 가해진 Teff에서 억제 활성을 유도하지 않음을 발견하였다(도 1a 및 1b). 도 1a는 IFN-감마 생산에 미치는 억제 효과를 나타내며, 도 1b는 세포 증식에 미치는 효과를 나타낸다. 더욱이, Treg 기능에 미치는 PKC-세타 억제제의 효과는 시간 의존적이며; 향상된 억제 기능의 최대 수준은 화합물을 사용한 Treg 처리 30분 후 달성되었다(도 1c).

상이한 IC₅₀ 값을 갖는 PKC-세타 억제제의 유사체를 사용한 Treg 세포의 처리는, 억제 효과와 억제제 효능의 상관관계를 입증하였다. IC₅₀≤ 1 nM인 PKC-세타 억제제는 이들의 억제 기능을 상당히 상향-조절하는 반면(도 2), IC₅₀이 8 nM 이상인 억제제의 효과는 상당하지 않았다. 따라서, Treg 기능을 부스트(boost)하는 PKC-세타 억제제의 능력은 일반적으로 이들의 억제능과 관련되어 있다.

PKC-세타의 억제가 사람 Treg의 억제 활성을 상향-조절한다는 결론을 확인하기 위하여, 본 발명자들은, RNA 간섭을 사용하여 PKC-세타 유전자 발현을 특이적으로 사일런싱(silencing)하였다(참조: K.K. Srivastava et al., J. Biol. Chem., 2004, 279, 29911). 당해 처리는 Treg 세포에서 PKC-세타 발현을 80%까지 제거하였다(도 3). 또한, Teff 세포에서 IFN-감마 분비를 억제하는 Treg 세포의 능력은, PKC-세타 유전자를 특이적으로 사일런싱할 뿐만 아니라 Treg 세포를 PKC-세타 억제제 Ia로 처리함으로써 증가되었다(도 4). Teff 세포에서 PKC-세타 유전자의 사일런싱은 IFN-감마 분비의 상당한 하향-조절을 초래하였다. 요약하면, 본 발명자들은, 특이적 억제제 또는 siRNA에 의한 PKC-세타의 억제가 시험관내에서 사람 Treg 세포의 억제 기능을 상향-조절한다고 결론지었다.

다음에, 본 발명자들은 효과기 CD4⁺CD25^-CD45RB⁺ Teff 세포의 전달에 의해 유도된 TCR 알파^-/-베타^-/- 마우스에서 대장염 모델을 사용하여 생체내에서 Treg 기능을 상향-조절하는 PKC-세타 억제제의 능력을 측정하였다(참조: F. Powrie, et al., J. Exp. Med. 1996, 183, 2669). 1:4 비의 Treg/Teff에서, PKC-세타 억제제 처리된-CD4⁺CD25⁺ Treg 세포는 8마리의 마우스 중 7마리에서 원위 결장의 정상 조직 및 정상 체중 증가에 의해 입증된 바와 같이, 대장염으로부터 수용체 마우스를 거의 100% 보호하였다(도 5a 및 5b). 당해 보호는 동일한 Treg/Teff 비에서 훨씬 더 약한 PKC-세타 억제제로 처리하지 않고 남겨두거나 처리한 Treg에 의해 영향받은 것보다 훨씬 더 우수하였다. 따라서, 마우스 Treg에서 PKC-세타의 억제는 생체내에서 이들의 억제 기능을 상당히 상향-조절한다.

류마티스 관절염(RA)은 궁극적으로 관절 구조의 파괴를 초래하는 만성 자가면역 장애이다. RA 환자에서 최근 연구에서는, CD4⁺CD25⁺ Treg 세포의 기능이 손상되어 있음이 제안되어 왔다(참조: Ehrenstein, M.R., et al., J. Exp. Med., 2004, 200, 277). 질병의 상이한 중증도를 가진 25명의 RA 환자들의 말초 혈액으로부터 정제된, CD4⁺CD25⁺ Treg 세포를 사용함으로써, 본 발명자들은, 비록 Treg 수가 건강한 공여자와 유사하더라도, Treg 세포가 건강한 공여자와 비교하여 자가 Teff 세포로부터 IFN-감마의 생산을 억제하는 능력이 상당히 감소되었음을 입증하였다(도 5c). 또한, RA 환자에서 결핍성 Treg 기능은 질병 활성 점수(DAS 점수; 도 5d)와 역의 상관관계가 있다. 보다 진행성이고 활성인 질병(DAS>5)을 지닌 환자로부터의 Treg 세포는 Teff 세포로부터 IFN-감마의 Treg-매개된 억제에 있어 약 2 내지 4배 감소를 입증한 반면, 중간 또는 불활성인 질병(DAS<5)을 가진 RA 환자로부터의 Treg 세포는 보다 효과적이고, 건강한 공여자로부터의 Treg 세포와 유사한 수준으로 IFN-감마 분비를 억제하였다(1:3의 Treg/Teff에서 25 내지 40% 억제). 또한, PKC-세타 억제제 Ia를 사용한 처리는 모든 25명의 RA 환자로부터 정제된 Treg 세포의 억제 기능(도 5d)을 건강한 공여자-기원한 Treg 세포와 유사한 수준으로 상당히 증가시켰다. 이들 결과는, PKC-세타의 억제가 RA 환자로부터 분리된 Treg 세포의 결핍성 억제 기능을 역전시킴을 나타낸다.

자가면역병의 치료를 위한 Treg 기반 입양 면역치료요법(adoptive immunotherapy)의 적용은 최근에 시험관내에서 다수의 Treg를 성장시키는 개선된 방법으로 인하여 실현가능하게 되었다(참조: C.H. June and B. R. Blazar Seminars in immunology, 2006, 18, 78 및 또한 Hippen, et al., Blood 2008, 112: 2847). 가능한 적용은 이식편-대-숙주병, 기관 이식거부 및, 다발경화증, 전신홍반루후스, 궤양성 대장염, 크론병, 류마티스 관절염 및 제1형 당뇨병을 포함하는 자가면역병의 치료를 포함한다. 입양 면역치료요법에서 사용하기 위한 Treg 집단의 분리 및 생체외 증대는 문헌에 기록되어 있고 당해 분야에 공지되어 있다(참조: 또한 본원에 참조로 포함된 제US 2009/0010950 A1호). 상기 연구에서, 본 발명자들은, PKC-세타의 억제가 Treg 기반 입양 면역치료요법에서 가능성이 있음을 최초로 밝혔다.

Treg 세포는 또한 죽상경화증에 대해 억제 효과를 갖는 것으로 보고되었으며(참조: P. Aukrust et al., Curr. Atherosclerosis Reports, 2008, 10, 236) 죽상경화증의 마우스 모델에서 억제 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다(참조: H. Ait-Oufella et al., Nature Medicine, 2006, 12, 178). 따라서, 당해 세포 집단에서 억제 효과를 부스트하는 것으로 밝혀진 Treg 세포에서 PKC-세타의 억제는 죽상경화증에서 유리한 효과를 가질 것이다.

하나의 양태에서, 혈액은 면역학적 장애를 가진 환자로부터 분리되며, 당해 혈액은 생체외에서 PKC-세타의 억제제로 처리된 후 환자에게 다시 주입된다.

다른 양태에서, 혈액은 죽상경화증을 가진 환자로부터 분리되며, 당해 혈액을 생체외에서 PKC-세타의 억제제로 처리한 후 환자에게 다시 주입한다.

다른 양태에서, 혈액의 백혈구 분획을 면역학적 장애를 가진 환자로부터 분리하여, 백혈구 분획을 생체외에서 PKC-세타의 억제제로 처리한 후 환자에게 다시 주입한다.

다른 양태에서, 혈액을 면역학적 장애를 가진 환자로부터 분리하여, Treg 세포를 분리하고 생체외에서 증식시키고, PKC-세타의 억제제로 처리한 후 환자에게 다시 주입한다.

다른 양태에서, 혈액을 죽상경화증을 가진 환자로부터 분리하고, Treg 세포를 분리하여 생체외에서 증식시키고, PKC-세타의 억제제로 처리한 후 환자에게 다시 주입한다.

다른 양태에서, 말초 혈액 단핵 세포 및 T-세포를 면역학적 장애를 가진 환자로부터 분리한 혈액으로부터 혈장분리교환법에 의해 분리하고 PKC-세타의 억제제로 처리한 후 환자에게 다시 주입한다.

다른 양태에서, 말초 혈액 단핵 세포 및 T-세포를 죽상경화증을 가진 환자로부터 분리된 혈액으로부터 혈장분리교환법에 의해 분리하고 PKC-세타의 억제제로 처리한 후 환자에게 다시 주입한다.

다른 양태에서, PKC-세타 억제제는 화학식 I의 화합물, 또는 이의 호변이성체, 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물이다:

[화학식 I]

상기 화학식 I에서,

R₁은 아릴-C₁ _- ₄알킬 또는 헤테로아릴-C₁ _- ₄알킬이고,

여기서, 상기 C₁ _- ₄알킬 그룹들 각각에서 메틸렌 그룹은 -NHC(O)- 또는 -C(O)NH-에 의해 임의로 대체될 수 있으며,

여기서, 상기 C₁ _- ₄알킬 그룹들 각각은 옥소 그룹 또는 하나 이상의 C₁ _- ₃알킬 그룹에 의해 임의로 치환되고(여기서, C₁ _- ₄알킬 그룹의 동일한 탄소 원자 상의 2개의 알킬 치환체들은 임의로 결합되어 C₂ _-5 알킬렌 브릿지를 형성할 수 있다),

여기서, 상기 아릴 그룹은 인접한 탄소 원자들 상에서 C₃ _- ₆알킬렌 브릿지 그룹(여기서, 메틸렌 그룹은 산소, 황 또는 -N(R₆)-로 임의로 대체된다)에 의해 임의로 치환되며;

또는 R₁은 하기 구조를 가지고:

(여기서, x 및 y는 독립적으로 0, 1, 2 또는 3이며, 단, x+y는 2 내지 3이고, z는 0 또는 1이다);

"헤테로아릴"은 피리딜, 푸릴, 티에닐, 피롤릴, 이미다졸릴 또는 인돌릴로서 정의되고;

각각의 R₁ 그룹은 C₁ _- ₆알킬, Cl, Br, F, 니트로, 하이드록시, CF₃, -OCF₃, -OCF₂H, -SCF₃, C₁ _- ₄알킬옥시, C₁ _- ₄알킬티오, 페닐, 벤질, 페닐옥시, 페닐티오, 아미노설포닐, 또는 1개 또는 2개의 C₁ _- ₃알킬 그룹으로 임의로 치환된 아미노 중의 하나 이상으로 임의로 치환되며;

R₂는 다음 그룹들 중에서 선택되고:

(여기서,

n은 5 내지 7의 정수이고;

p는 1 내지 2의 정수이며;

q는 1 내지 2의 정수이고;

R₄ 및 R₅는 수소, C₁ _- ₆알킬, 아릴C₁ _- ₆알킬 또는 아미디노로부터 각각 독립적으로 선택되며;

R₆은 수소이다);

R₃은 Br, Cl, F, 시아노 또는 니트로이다.

다른 양태에서, PKC-세타 억제제는 미국 특허출원 공보 제US 2005/0124640호에 기재된 PKC-세타의 임의의 억제제이며, 이의 모든 일반 및 특정 양태는 본원에 참조로 포함되어 있다.

다른 양태에서, PKC-세타 억제는 PKC-세타의 siRNA 또는 shRNA 매개된 억제에 의해 달성되며, (a) siRNA 또는 shRNA를 생체외에서 Treg를 포함하는 세포에 대해 표적화한 후 처리된 세포를 환자내로 주입하거나 (b) siRNA 또는 shRNA를 환자에게 직접 투여한다. 특정 양태에서, 혈액은 환자로부터 분리되며, Treg 세포가 분리되고 생체외에서 증식되며, siRNA 또는 shRNA로 처리된 후 환자에게 다시 주입된다.

따라서, 특정 양태에서, PKC-세타 억제는 PKC-세타의 siRNA 또는 shRNA 매개된 억제에 의해 달성되며, 당해 방법은 환자로부터의 혈액을 siRNA 또는 shRNA로 생체외에서 처리한 후 처리된 혈액을 환자에게 재투여함을 포함한다. 보다 구체적인 양태에서, 환자 혈액으로부터의 Treg 세포는 분리되어 생체외에서 siRNA 또는 shRNA로 처리된 후 환자에게 재투여된다.

다른 양태에서, 면역학적 장애는 건선, 류마티스 관절염, 다발경화증, 제I형 당뇨병, 염증성 장 질환, 길랑-바레 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 이식편 대 숙주병(및 기관 또는 골수 이식 거부의 다른 형태), 전신 홍반 루후스 중에서 선택된다.

실험

CD4⁺CD25⁺ Treg 및 CD4⁺CD25^- Teff 세포를 건강한 사람 공여자 또는 상이한 병기[질병 활성 점수(DAS)에 따른]의 류마티스 관절염을 가진 25명의 환자로부터의 말초 혈액으로부터 문헌(참조: M. L. Prevoo, et al., Arthritis and rheumatism, 1995, 38, 44; A. Zanin-Zhorov, et al., J. Clin. Invest, 2006, 116, 2022)에 기술된 바와 같이 정제하였다. 공동-배양 실험에서, CD4⁺CD25⁺ Teff 세포를, CD4⁺CD25^- Teff 세포에 대해 상이한 비(1:9, 1:3 또는 1:1)로 처리하거나 처리하지 않고, 세척하고 가하였다. 세포를 항-CD3 mAb 예비-피복된 24-웰 플레이트 상에서 24 내지 48시간(사이토킨 분비), 또는 96시간(증식) 동안 공동-배양하였다. 사이토킨 분비를 문헌(참조: A. Zanin-Zhorov, et al., ibid., 2006)에 앞서 기술된 바와 같이 ELISA에 의해, 사람 IFN-감마 Cytoset^tm(제조원: 캘리포니아주 카마릴로 소재의 Biosource)을 사용하여 측정하였다. 증식을 Alamar Blue^tm 검정(제조원: Invitrogen)에 의해 앞서 기술된 바와 같이(참조: S.A. Ahmed, et al., J. immunological Methods, 1994, 170, 211-224) 평가하였다.

siRNA 듀플렉스(siRNA)는 문헌(참조: K.K. Srivastava, et al., J. Biol. Chem. 2004, 279, 29911)에 기술한 바와 같이 제조업자(Qiagen Inc)가 합성하고 정제하였다. PKC-세타 표적 서열은 다음과 같았다: siRNA1 (5'-AAACCACCGTGGAGCTCTACT-3') 및 siRNA2 (5'-AAGAGCCCGACCTTCTGTGAA-3); 대조군 siRNA는 제조업자(Qiagen)(1027281)로부터 구입하였다. 새로이 정제된 T 세포의 형질감염을 사람 T 세포 뉴클레오펙터 키트(Nucleofector kit)(제조원: Amaxa Biosystems)을 사용하여 수행하였다. 형질감염된 세포를 고정화된 항-CD3 항체 상에서 10% FCS를 함유하는 RPMI 속에서 48 내지 72시간 동안 배양하였다. 형질감염 효율은 웨스턴 블롯 검정을 사용하여 PKC-세타 수준을 평가함으로써 조절하였다.

대장염의 T 세포 전달 모델의 경우, 본 발명자들은 C57BL/10.PL TCR 알파^-/-베타^-/- 마우스에게 5 X 10⁵ 분류된 CD4⁺CD25^-CD45RB⁺ T 세포를 단독으로 또는 지시된 바와 같이 예비처리되거나 예비처리되지 않은 0.125 X 10⁵의 CD4⁺CD25⁺ T 세포와 함께 정맥내 주사하였다. 질병 진행을 앞서 기술한 바와 같이(참조: F. Powrie, et al., J. Exp. Med. 1996, 183, 2669) 체중 감소, 설사 및 조직 분석에 의해 모니터링하였다. P 값은 만-휘트니 시험(Mann-Whitney test) 또는 양측 t-시험(two-tailed t-test)에 의해 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어(캘리포니아 샌 디에고 소재)를 사용하여 측정하였다.

사용된 PKC-세타 억제제 및 이들의 IC₅₀ 값을 하기 표 1에 나타낸다. 이들 화합물의 제조 및 PKC-세타의 키나제 활성의 억제에 대한 IC₅₀을 측정하는데 사용된 루시퍼라제 검정은 미국 특허출원 공보 제2005/0124640호에 기술되어 있다. 상기 시험관내 및 생체외 검정의 경우, 화합물을 DMSO 중에 용해하였다. T 세포를 지시된 농도의 억제제 또는 DMSO 대조군으로 37℃에서 30분 동안 예비처리하고 3회 세척하였다.

<110> Boehringer Ingelheim International GmbH New York University <120> Ex-vivo treatment of immunological disorders with PKC-theta inhibitors <130> 09-0495-PCT <150> US 61/173,237 <151> 2009-04-28 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1 aaaccaccgt ggagctctac t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2 aagagcccga ccttctgtga a 21

Claims

환자에서 면역학적 장애 또는 죽상경화증을 치료하는 방법으로서, 상기 환자로부터의 혈액을 PKC-세타의 억제제로 생체외에서 처리한 다음, 상기 처리된 혈액을 상기 환자에게 재투여함을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 환자가 면역학적 장애를 가진, 방법.
제1항에 있어서, 상기 환자가 죽상경화증을 가진, 방법.
제1항에 있어서, 상기 환자 혈액으로부터의 백혈구 분획을 분리하고 PKC-세타의 억제제로 생체외에서 처리한 다음, 상기 환자에게 재투여하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 환자 혈액으로부터의 Treg 세포를 분리하고 PKC-세타의 억제제로 생체외에서 처리한 다음, 상기 환자에게 재투여하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 환자 혈액으로부터의 Treg 세포를 분리하고, 성장하도록 유도하여 더 많은 수의 Treg 세포를 생성시키고, PKC-세타의 억제제로 생체외에서 처리한 다음, 상기 환자에게 재투여하는, 방법.
제6항에 있어서, 상기 환자가 면역학적 장애를 가진, 방법.
제6항에 있어서, 상기 환자가 죽상경화증을 가진, 방법.
제1항에 있어서, 말초 혈액 단핵 세포 및 T-세포를 면역학적 장애를 가진 상기 환자로부터 분리된 혈액으로부터 혈장분리교환법에 의해 분리하고 PKC-세타의 억제제로 생체외에서 처리한 다음, 상기 환자에게 다시 주입하는, 방법.
제1항에 있어서, 말초 혈액 단핵 세포 및 T-세포를 죽상경화증을 가진 상기 환자로부터 분리된 혈액으로부터 혈장분리교환법에 의해 분리하고 PKC-세타의 억제제로 생체외에서 처리한 다음, 상기 환자에게 다시 주입하는, 방법.
제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 PKC-세타 억제제가 미국 특허 제7,550,473호에 기재된 PKC-세타 억제제 중 어느 하나인, 방법.
제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 PKC-세타 억제제가 화학식 I의 화합물, 또는 이의 호변이성체, 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물인 방법:
[화학식 I]

상기 화학식 I에서,
R₁은 아릴-C₁ _- ₄알킬 또는 헤테로아릴-C₁ _- ₄알킬이고,
여기서, 상기 C₁ _- ₄알킬 그룹들 각각에서 메틸렌 그룹은 -NHC(O)- 또는 -C(O)NH-에 의해 임의로 대체될 수 있으며,
여기서, 상기 C₁ _- ₄알킬 그룹들 각각은 옥소 그룹 또는 하나 이상의 C₁ _- ₃알킬 그룹에 의해 임의로 치환되고(여기서, C₁ _- ₄알킬 그룹의 동일한 탄소 원자 상의 2개의 알킬 치환체들은 임의로 결합되어 C₂ _-5 알킬렌 브릿지를 형성할 수 있다),
여기서, 상기 아릴 그룹은 인접한 탄소 원자들 상에서 C₃ _- ₆알킬렌 브릿지 그룹(여기서, 메틸렌 그룹은 산소, 황 또는 -N(R₆)-로 임의로 대체된다)에 의해 임의로 치환되며;
또는 R₁은 하기 구조를 가지고:

(여기서, x 및 y는 독립적으로 0, 1, 2 또는 3이며, 단, x+y는 2 내지 3이고, z는 0 또는 1이다);
"헤테로아릴"은 피리딜, 푸릴, 티에닐, 피롤릴, 이미다졸릴 또는 인돌릴로서 정의되고;
각각의 R₁ 그룹은 C₁ _- ₆알킬, Cl, Br, F, 니트로, 하이드록시, CF₃, -OCF₃, -OCF₂H, -SCF₃, C₁ _- ₄알킬옥시, C₁ _- ₄알킬티오, 페닐, 벤질, 페닐옥시, 페닐티오, 아미노설포닐, 또는 1개 또는 2개의 C₁ _- ₃알킬 그룹으로 임의로 치환된 아미노 중의 하나 이상으로 임의로 치환되며;
R₂는 다음 그룹들 중에서 선택되고:

(여기서,
n은 5 내지 7의 정수이고;
p는 1 내지 2의 정수이며;
q는 1 내지 2의 정수이고;
R₄ 및 R₅는 수소, C₁ _- ₆알킬, 아릴C₁ _- ₆알킬 또는 아미디노로부터 각각 독립적으로 선택되며;
R₆은 수소이다);
R₃은 Br, Cl, F, 시아노 또는 니트로이다.
제1항에 있어서, 상기 PKC-세타 억제가 PKC-세타의 siRNA 또는 shRNA 매개된 억제에 의해 달성되며, 상기 방법이 상기 환자로부터의 혈액을 siRNA 또는 shRNA로 생체외에서 처리한 다음, 상기 처리된 혈액을 상기 환자에게 재투여함을 포함하는, 방법.
제13항에 있어서, 상기 환자 혈액으로부터의 Treg 세포를 분리하고 siRNA 또는 shRNA로 생체외에서 처리한 다음, 상기 환자에게 재투여하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 면역학적 장애가 염증병, 자가면역병, 기관 및 골수 이식 거부 및, 급성 또는 만성 염증, 알레르기, 접촉성 피부염, 건선, 류마티스 관절염, 다발경화증, 제I형 당뇨병, 염증성 장 질환, 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염, 이식편 대 숙주병(및 기관 또는 골수 이식 거부의 다른 형태) 및 전신홍반루푸스를 포함하는, T 세포 매개된 면역 반응과 관련된 기타 장애로부터 선택되는, 방법.