KR20120000834A

KR20120000834A - 콩 단백질 가수분해물을 포함하는 무혈청 배지를 이용하여 생산된 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물 및 이의 생산 방법

Info

Publication number: KR20120000834A
Application number: KR1020100061313A
Authority: KR
Inventors: 황수한; 한승협; 한훈; 손은숙; 이창수
Original assignee: (주)히스토스템
Priority date: 2010-06-28
Filing date: 2010-06-28
Publication date: 2012-01-04
Also published as: KR101316887B1

Abstract

본 발명은 제대혈로부터 분리된 중간엽 줄기세포를 콩 단백질 가수분해물이 첨가된 무혈청 배지에서 배양하여 얻어지는 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 따르면 혈청 유래의 동물성 위해 인자로 인한 위험요소를 차단할 수 있고 생산비용 절감이 가능하며, 이로부터 얻어지는 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물은 세포독성이 전혀 없으면서 우수한 멜라닌 저해활성을 갖고, 지방세포로의 분화를 저해하고 세포내 지방축적 억제효과를 가지므로, 미백 및 항비만 관련 의약품 및 화장품 원료로서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

콩 단백질 가수분해물을 포함하는 무혈청 배지를 이용하여 생산된 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물 및 이의 생산 방법{PROTEIN COMPOSITION DERIVED FROM UMBILICAL CORD BLOOD MESENCHYMAL STEM CELL PRODUCED BY USING NON-SERUM CULTURE MEDIUM COMPRISING SOY HYDROLISATE}

본 발명은 제대혈로부터 분리된 중간엽 줄기세포를, 콩 단백질 가수분해물이 첨가된 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 통하여 얻어지며, 미백 효능 및 항비만 효과를 가져 화장품 원료 및 의료용 소재로서 사용 가능한 제대혈 줄기세포 유래 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법에 관한 것이다.

중간엽 줄기세포는 자가증식능력(self-renewal)이 있고 조골세포, 연골세포, 지방세포 등 다방면의 세포로 분화할 수 있는 다분화능을 가진다. 연골, 뼈, 근육, 심장근육 등의 손상된 조직을 재건하기 위해 중간엽 줄기세포를 이용한 동물 실험의 결과를 보면, 인간에게 적용할 수 있을 가능성이 상당히 높다는 것을 알 수 있다(Kato S, Nishihira H, Hara H. (2000) Cord Blood transplantation and cord blood banking in Japan. Bone Marrow Transplant 25 Suppl. 2: S68-70; Lee OK, Kuo TK, Chen WM. (2004) Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. Blood 103: 1669-1675). 또한, Kim 등의 논문에는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 인간 적용에 대한 성공적인 사례들이 발표되어 있다(Kim SW. (2006) Successful stem cell therapy using cord blood-derived multipotent stem cells for Buerger's disease and ischemic limb disease animal model. Stem Cells 24: 1620-1626).

골수는 중간엽 줄기세포의 가장 흔한 출처이며, 양수, 태아의 폐, 지방세포, 제대혈을 포함한 다양한 출처로부터 중간엽 줄기세포를 분리 배양할 수 있다. 그러나, 골수 및 지방세포 등은 조직적합성의 문제 때문에 타인을 위한 것보다는 자신의 세포를 자신이 이용하는 자가세포치료법에 주로 사용되고 있다. 제대혈 유래 줄기세포는 출생 후 탯줄에서 얻을 수 있다. 이 줄기세포는 흔히 신생아 줄기세포라고 언급되고, 성인이나 어린이의 골수에서 얻은 줄기세포보다 덜 성숙해 있다.

제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 사용한 단백질의 개발은, 성체의 지방이나 골수를 사용하는 것보다 조금 더 체계적인 관리가 진행되고 있어, 타 공급원에 비해 안전하고 산업적 개발이 더 용이하다. 또한, 줄기세포 공급원으로 제대혈을 사용하는 경우, 골수나 지방처럼 침습적이 아닌 비침습적 방법으로 공여자로부터 채취된다는 장점이 있으며, 많은 아기의 출생으로 인해 공급원의 확보가 용이하다.

한편, 세포배양에서 무혈청 배지의 사용은 지난 30여 년간 지속적으로 증가되고 있으며, 조성 성분도 기존의 동물성 성분에서 비동물성, 비단백질성 성분으로 바뀌고 있지만, 혈청 사용에 따른 장점으로 인해 아직도 혈청은 세포배양용 배지에 많이 사용되고 있다. 혈청은 생물의약품의 생산에서 원하지 않는 오염원이 되는 것은 물론 안전에 위험을 줄 수 있는 존재이기도 하므로, 배지에 혈청을 사용하는 것은 적지 않은 문제를 야기한다(Mizrahi, A. (1977) Primatone RL in mammalian cell culture media. Biotechnol . Bioeng 19: 1577-15). 혈청은 주요 구성성분인 알부민과 트랜스페린을 포함하고, 세포의 성장에 상당한 영향을 미치는 광범위한 미량 구성성분들을 포함한다. 이 구성성분들은 영양분, 펩타이드 성장 인자, 호르몬, 미네랄, 지방을 포함하는데, 그 농도와 효과는 정확히 알려지지 않았다. 혈청은 롯트마다 다르고, 각 롯트는 기껏해야 일 년간 보존되는데, 아마도 시간에 따라 구성성분들이 저하될 것이므로 대체되어야 한다. 그러나, 대체될 경우 다른 유사한 혈청 롯트가 선택된다 하더라도 처음의 롯트와 동일하지는 않을 것이다. 더욱이, 혈청은 균류, 세균, 바이러스, 프리온 같은 생물학적인 오염의 잠재적인 출처이기도 하다(Valk J, Mellor D, Brands R, Fischer R, Gruber F, Gstraunthaler G, Hellebrekers L, Hyllner J, Jonker F.H, Prieto P, Thalen M, Baumans V. (2004) The humane collection of fetal bovine serum and possibilities for serum-free cell and tissue culture. Toxicology in vitro 18: 1-1261).

단백질 가수분해물과 같은 저분자량 펩타이드(펩톤, 단백질 분체, 가수분해된 단백질)들은 혈청을 대신할 수 있는 실용적인 선택으로 고려되고 있다. 단백질 가수분해물은 일반적으로 혈청을 부분적으로 또는 대부분 대체할 수 있는 농축되고 균형 잡힌 영양 혼합물로서의 역할을 하는 것으로 보고된바 있다(Mizrahi, A. (1977) Primatone RL in mammalian cell culture media. Biotechnol . Bioeng 19: 1577-15; Schlaeger, E-J. (1996) The Protein Hydrolysate, Primatone RL, is a Cost-Effective Multiple Growth Promoter of Mammalian Cell Culture in Serum-Containig and Serum-Free Media and Displays Anti-Apoptotic Properties. J. Immunol. Methods 194: 191-199). 또한, 펩톤은 글루타민과 다른 아미노산의 안정된 공급처이기도 하다.

이상과 같은 점을 고려할 때, 다양한 생물학적인 오염원인 혈청을 제외시킨 무혈청 배지의 개발이 절실한 상황이다

한편, 근래 들어서는 피부에 많은 관심이 집중되고 있으며, 환경오염으로 피부의 자외선 노출이 증가하여 피부노화에 의한 피부색의 침착이 심해지고 있다. 또한, 미용적인 이유에서도 피부 착색에 대한 관심이 높아지고 있어, 보다 안정적이고 효과적인 미백 소재를 발견하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

인간의 피부색은 멜라닌의 양에 의해서 주로 결정되며 혈색소, 카로틴 같은 색소성분과 혈관분포, 각질층의 두께 등에 의해서도 영향을 받는다. 특히 표피에 분포하는 멜라닌 세포는 멜라닌을 합성하여 피부의 색소침착에 중요한 역할을 할 뿐 아니라, 생성된 멜라닌이 각질형성세포로 이동하여 과도한 자외선을 흡수하고 차단 보호하는 광보호작용을 한다. 그러나, 멜라닌의 과잉 색소침착은 기미, 주근깨, 검버섯을 형성하며 피부노화도 촉진시키는 것으로 알려져 있다.

멜라닌의 주된 생성과정에서는 아미노산의 일종인 타이로신(tyrosine)이 타이로시나제(tyrosinase)에 의해 산화되어 도파(dopa), 도파퀴논(dopaquinone)이 되고, 이것이 다시 5,6-디하이드록시인돌, 인돌-5,6-퀴논으로 자동 산화되고 최종적으로 중합에 의해 멜라닌 폴리머(melanin polymer)를 생성하는 것으로 되어 있다. 또한, 멜라닌 합성은 α-MSH, cAMP 유도물질인 콜레라 톡신(cholera toxin), 포스콜린(forskolin) 등과, 멜라닌형성 효소(melanogenic enzyme)인 TRP-1, TRP-2, pMel 17과 염증반응에 관여하는 각종 사이토카인(cytokine)류, 멜라닌세포 유전자 발현 인자(melananocyte gene expression factor)인 MITF, Pax-3 등에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다.

이와 관련된 연구를 살펴보면, 멜라닌 합성의 주효소인 타이로시나제 활성을 조절하기 위한 타이로시나제 활성 억제 소재 연구(알부틴, 코직산, 감초 추출물, 닥나무 추출물 등), 피부 각질층의 제거 효능을 가진 소재에 대한 연구(AHA, BHA, 아미노산, 살리실산 등), 자외선 차단 소재 연구(이산화티탄, 감마오리자놀, 옥시벤존 등), 멜라닌 생합성 장소인 멜라노사이트(melanocyte)의 기능을 저하시키기 위해 멜라노사이트에 독성을 나타내는 소재 연구(비타민 C 등), 활성산소 제거 소재에 대한 연구(비타민 E, 비타민 C) 등으로 이루어지고 있다.

그러나, 이들 대부분은 효과가 불충분하거나 제형상 불완전한 면이 있고, 피부에 대한 안정성 측면에서 그 사용이 제한되어 있으며, 원료에 대한 수입 의존도가 높다는 문제점으로 인해, 최근 보다 안전하고 효과적인 멜라닌 생성 억제 물질을 개발하기 위한 연구가 요망되고 있다.

또한, 비만 역시 세계 각국에서 증가추세에 있는 심각한 보건문제로 인식되고 있으며, 우리나라에서도 고도의 산업성장과 세계화의 영향으로 식생활의 패턴의 서구화 및 신체 활동량이 감소되면서 환경오염, 정신적 스트레스로 인한 불균형이 진행되어 비만화 현상이 더욱 가속화되고 있다.

비만(obesity)은 피하지방을 비롯한 체내 저장 지방이 비정상적으로 많아진 상태를 뜻한다. 즉 체내에 과잉 에너지가 지방으로 변환되어 지방조직에 과다하게 축적되어 체지방이 비정상적으로 많아지는 대사이상에 의해 유발되는 질병이다. 비만학회에 따르면, 현재 30대 이상 성인의 20∼30%가 비만과 관련된 질환을, 약 15∼25%가 당뇨병과 같은 대사 증후군을 갖는 것으로 조사되었다. 이러한 결과는 현대인에게 있어 가장 위험한 질병으로 인식되는 암과 마찬가지로 비만의 중요성도 높아지고 있으며, 비만은 개개인의 문제가 아니라 사회적으로도 큰 문제로 대두되었음을 의미한다. 더욱이 보건 복지부(2004)의 “한국 여성 건강통계”에 의하면 20세 이상 성인 여성의 44.1%와 45∼64세 여성의 61.4%가 복부비만으로 나타나, 우리나라 여성들에서 복부비만률의 증가 추세를 보여주고 있다.

비만을 치료하는 방법으로는 유산소운동, 식이요법, 마사지 요법 등이 흔히 제시되고 있으며, 비만을 치료하기 위한 표적연구는 지방대사, 지방세포분화, 지방흡수 및 에너지대사 조절을 중심으로 활발하게 진행되고 있다. 최근 각 화장품 업계에서는 비만으로 고민하는 여성들을 위해 다양한 바디 슬리밍 제품들을 출시하고 있지만, 비만과 셀룰라이트 관련 바디 슬리밍 화장품 효과에 대한 연구가 미미한 상황이다.

본 발명은 배양 배지의 구성 성분인 우태혈청을 제외시키는 대신 콩 단백질 가수분해물을 첨가한 배지에서, 제대혈로부터 분리된 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 통하여 제대혈 줄기세포 유래 단백질 조성물을 생산하는 방법, 그리고 이로부터 얻어지는 GRO-alpha, MCP-1을 다량으로 포함하는 제대혈 줄기세포 유래 단백질 조성물을 제공하고, 이들 조성물을 미백 및 항비만 효과를 위한 기능성 소재로서 화장품 및 의약품 원료로서 사용하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물의 생산 방법은, 콩 단백질 가수분해물을 포함하는 무혈청 배지에서, 제대혈로부터 분리된 중간엽 줄기세포를 배양하는 것을 특징으로 한다.

여기에서, 무혈청 배지 중 콩 단백질 가수분해물의 농도는 0.5 내지 3.0 g/L인 것이 바람직하고, 무혈청 배지는 α-MEM(alpha-minimum essential medium), 저포도당(low-glucose) DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media), 고포도당(high-glucose) DMEM, DMEM/Ham's F-12, 또는 MEM을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 콩 단백질 가수분해물을 포함하는 무혈청 배지에서, 제대혈으로부터 분리된 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법에 의해 얻어지는, 미백 및 항비만 효과를 갖는 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물을 제공한다.

여기에서, 상기 단백질 조성물은 GRO-alpha 및 MCP-1 단백질 중 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하고, 외용 또는 주사제 등 비경구 투여용으로 제형화할 수 있다.

본 발명은 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물을 인간에게 적용하여 의료용 및 화장품용으로 활용하기 위한 것으로, 제대혈 중간엽 줄기세포 배양시 우태혈청(fetal bovine serum)을 사용하지 않고 콩 단백질 가수분해물을 사용함으로써, 우태혈청 유래의 동물성 위해 인자로 인한 위험요소를 완벽히 차단할 수 있을 뿐 아니라, 산업적으로는 고가의 우태혈청을 사용하지 않는 데 따른 현격한 생산비용 절감이 가능하다는 장점이 따른다.

본 발명에서, 무혈청 배지 중 콩 단백질 가수분해물의 농도는 0.5 내지 3.0 g/L인 것이 바람직하고, 1.5 내지 2.5 g/L인 것이 더욱 바람직하다. 무혈청 배지 중 콩 단백질 가수분해물의 농도가 0.5 g/L 보다 낮거나 3.0 g/L 보다 높으면 줄기세포 성장과 단백질 분비가 저하되는 문제가 있지만, 본 발명의 목적 달성을 위한 콩 단백질 가수분해물의 농도가 0.5 내지 3.0 g/L만으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법에 따라 얻어지는 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물에는 GRO-alpha(growth-regulated protein alpha, CXCL1, melanoma growth stimulatory activity) 및 MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1)을 다량 함유할 수 있다. 특히 GRO-alpha는 흑색종(melanoma) 성장을 촉진 활성화시키는 것으로, 여러 가지 미백 활성에 적용 및 도움이 가능하다. MCP-1은 알려진 가장 강력하고 선택성이 큰 T-세포 및 단핵구 화학주성인자 및 활성화제 중 하나인 C-C 케모킨으로, 폐포염, 천식(Jones 등, 1992, J. Immunol ., 149, 2147) 및 다수의 염증성 장애질환(Grimm 등, 1996, J. Leukocyte Biol ., 59, 804-812)과 관련이 있으며. 아테롬성 경화증(Koch 등, 1992, J. Clin . Invest ., 90, 772-779), 건선(Deleuran 등, 1996, J. Dermatological Science, 13, 228-236), 피부의 지연형 과민반응, 다발성 경화증 및 뇌 외상(Berman 등, 1996, J. Immunol ., 156, 3017-3023)과 관련되어, 이들 질환의 치료 및 조절에 도움이 되는 단백질이다.

본 발명에 따라 얻어지는 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질은 세포독성이 전혀 없으며, B16F1 흑색종 세포 내 타이로시나제(tyrosinase) 저해활성이 높고, TRP-1 단백질 발현억제율이 높은 특이적 성질이 있으므로, 멜라닌 저해활성이 우수하다. 또한, 본 발명에 따라 얻어지는 단백질 조성물을 지방세포 분화 유도 초기단계부터 30% 농도로 첨가하였을 경우, 대조군에 비하여 Oil-Rad-O 시약에 의해 염색되는 작은 지방 방울(lipid droplet)이 거의 관찰되지 않은 것을 현미경 상으로 확인할 수 있다. 이는, 본 발명에 따른 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물 처리시 지방세포로의 분화를 저해하고 세포내 지방축적 억제효과를 나타내는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명에 따른 콩 단백질 가수분해물을 포함하는 무혈청 배지를 사용하여 제조되는 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질은 미백 및 항비만 관련 의약품 및 화장품 원료로서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따라 콩 단백질 가수분해물을 포함하는 무혈청 배지에서 제대혈 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법에 따르면, 혈청 유래의 동물성 위해 인자로 인한 위험요소를 완벽히 차단할 수 있을 뿐 아니라, 산업적으로는 고가의 우태혈청을 사용하지 않는 데 따른 현격한 생산비용 절감이 가능하다는 장점이 있다.

또한, 본 발명의 방법에 따라 얻어지는 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물은 세포독성이 전혀 없으면서 우수한 멜라닌 저해활성을 갖고, 지방세포로의 분화를 저해하고 세포내 지방축적 억제효과를 가지므로, 미백 및 항비만 관련 의약품 및 화장품 원료로서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 제대혈로부터 분리 배양된 중간엽 줄기세포의 사진(배율 200X)이다.
도 2는 본 발명에 따른 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물이 B16F1 세포의 세포 생존에 비치는 영향을 MTT 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물의 B16F1 세포 내의 멜라닌 생성 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물의 B16F1 세포 내의 타이로시나제 활성 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물이, 멜라닌 생성에 관여하는 효소인 타이로시나제(tyrosinase), TRP-1 및 TRP-2의 유전자 발현에 미치는 영향을 RT-PCR을 이용하여 분석한 결과를 보여주는 도면이다.
도 6은 본 발명에 따른 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물이 미백 활성에 관련된 단백질 발현에 미치는 영향을 Western blot을 이용하여 측정한 결과를 보여주는 도면이다.
도 7은 본 발명에 따른 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물이 지방세포 분화를 저해하는 것을 보여주는 사진(배율 200X)이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 제대혈 중간엽 줄기세포의 분리

영하 196 ℃에서 냉동 보관 중이던 제대혈은 37 ℃의 수욕에 넣어서 바로 해동하였고, 출산 후 24시간 이내에 이송되어 온 제대혈은 그대로 사용하였다.

제대혈로부터 단핵구를 분리하기 위해, αMEM(alpha-minimum essential medium, Jeil Biotech Services, Korea)이나 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)으로 제대혈을 2 배 용량으로 희석한 후 실온에서 10분간 300xg로 원심분리하였다. 분리된 buffy coat 층을 수확하여 다시 2배 용량의 αMEM 또는 DMEM으로 희석한 후 Ficoll-Hypaque에 중첩하고 실온에서 30분간 300xg로 원심분리를 시행하였다.

혈액으로부터 단핵구를 분리하는 데는 Ficoll(슈크로스의 중합체)과 Hypaque (디트리조에이트 나트륨; sodium ditrizoate)의 중합체인 Ficoll-Hypaque가 주로 이용된다. Ficoll-Hypaque의 비중은 1.077 g/㎖로, 단핵구는 이보다 가벼우나 적혈구는 이보다 무겁기 때문에 비중 차에 의한 분리가 가능하다. 즉, 혈액을 Ficoll-Hypaque 위에 올려서 원심분리하면 단핵구는 Ficoll-Hypaque 위에 모이게 된다

이와 같은 밀도구배 원심분리 방법으로 얻어진 단핵구를 다시 첨가물이 섞이지 않은 세척용 αMEM으로 2회 세척하였다. 얻어진 단핵구를 항생제(1000 U/㎖ 페니실린 G, 1000 ㎍/㎖ 황산 스트렙토마이신, Gibco-BRL)와 항진균제(0.25 ㎍/㎖ 암포테리신 B), 그리고 2 mM의 글루타민(Glutamine, Sigma)이 포함된 αMEM 배지에 10∼20% 우태혈청(FBS; fetal bovine serum, Jeil Biotech Services)과 함께 세포성장인자로서 Stem Cell Factor(50 ng/㎖), GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; 10 ng/㎖), G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor; 10 ng/㎖), IL-3(interleukin-3; 10 ng/㎖) 및 IL-6(interleukin-6; 10 ng/㎖)을 첨가하고, 세포수 1×10⁶/㎠의 농도로 부유시켰다. 선택된 세포들을 5일간 배양시킨 후 2주간 우태혈청이 포함된 DMEM 배양액에 2일간에 배양액을 교체시킨 후 다분화능 줄기세포를 수득하였다.

중간엽 줄기세포를 수득하는 방법은 상기의 방법을 사용하거나, 아래의 방법을 사용할 수 있다.

영하 196 ℃에 냉동 보관된 제대혈에서 단핵구를 분리하기 위하여, 저포도당 DMEM(Jeil Biotech Services, Korea)으로 제대혈을 2배 용량으로 희석 후 실온에서 10분간 300g로 원심분리하였다. 그 다음 Ficoll-Hypaque를 사용한 원심분리 방법으로 단핵구를 획득한 후, 다시 저포도당 DMEM으로 2회 세척하였다. 다음에 항생제(1000 U/ml 페니실린 G, 1000ug/ml 황산 스트렙토마이신, Gibco-BRL)와 항진균제(0.25 ug/ml 암포테리신 B), 그리고 2mM의 글루타민(Sigma)이 포함된 저포도당 DMEM에 20% 우태혈청(FBS; fetal bovine serum, Sigma)과 함께 세포수 1×10⁶/㎠의 농도로 부유시킨 후 5일간 배양한 세포 군집에서 부유세포를 제거하여 중간엽 줄기세포를 수득하였다.

도 1은 제대혈로부터 분리 배양된 중간엽 줄기세포의 사진(배율 200X)이다.

실시예 2: 콩 단백질 가수분해물 첨가 배지 제조 및 제대혈 줄기세포 유래 단백질 조성물 수득

수득된 중간엽 줄기세포를 콩 단백질을 포함하는 무혈청 배지 조성물로서 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media)(Welgene Inc., Deagu, Korea) 500 ㎖ 또는 α-MEM(alpha-minimum essential medium)(Jeil Biotech Services, Korea) 500 ㎖에 콩 단백질 가수분해물(Soytone, BD, New Jersey, USA) 1 g, 2% 50X MEM 아미노산 용액(Hyclone, USA), 1% NEAA(Non-essential amino acid)(Hyclone, USA), 1% 100X MEM 비타민(Hyclone, USA)으로 구성되는 배지 조성물과 함께 37 ℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하여 3일 마다 총 2주간 제대혈 줄기세포 유래 단백질을 수득하였다.

수득된 단백질은 Luminex^®100™(Luminex, Austin, Texas, USA) 장비를 이용하여 정량하였으며, MILLIPLEX™ Human Cytokine/Chemokine kit(Millipore Corp. Missouri, USA)을 이용하여 단백질을 정량하였다.

다음 표 1은 본 발명에 따라 콩 단백질 가수분해물을 포함하는 무혈청 배지에서 배양하여 얻어진 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물의 성분 및 함량을 예시한 것이다.

단백질	농도(pg/㎖)
Eotaxin	83.73±27.55
FGF-2	5.63±0.25
Flt-3 Ligand	3.61±0.14
Fractalkine	72.65±4.23
G-CSF	7.75±0.22
GM-CSF	20.15±8.58
GRO-alpha	2712.16±387.06
INFα2	13.82±2.61
IFNγ	13.30±0.63
IL-1α	0.56±0.09
IL-1β	2.00±0.03
IL-1ra	2.33±0.14
IL-2	0.49±0.05
IL-3	0.58±0.05
IL-4	6.88±2.39
IL-6	387.03±118.20
IL-7	5.60±1.54
IL-8	4790.71±1267.38
IL-9	1.12±0.19
IL-10	1.18±0.02
IL-12 (p40)	5.13±0.44
IL-12 (p70)	2.39±0.03
IL-13	0.97±0.19
IL-15	0.85±0.04
IL-17	0.15±0.02
IP-10	50.67±5.41
MCP-1	>10,000
MCP-3	128.49±20.65
MDC	10.17±0.34
MIP-1α	8.78±0.66
MIP-1β	1.64±0.30
PDGF-AA	31.57±3.73
PDGF-AB/BB	4.29±0.36
RANTES	85.66±9.02
sCD40L	5.62±0.00
sIL-2Rα	2.95±0.30
TGFα	0.67±0.21
TNFβ	1.73±0.05
VEGF	50.60±2.88

본 발명에 따른 무혈청 배지에는 저포도당(low-glucose) DMEM, 고포도당(high-glucose) DMEM, α-MEM 뿐만 아니라 DMEM/Ham's F-12, MEM 모두 사용이 가능하다. 다음 표 2 내지 표 6는 본 발명에 따른 무혈청 배지에 사용 가능한 각종 배지의 조성을 나타낸 것이다.

저포도당 DMEM(low-glucose DMEM) 조성(㎎/ℓ)

무기염
Calcium Chloride anhydrous	200.00
Ferric(III)-Nitrate·9H₂O	0.10
Potassium Chloride	400.00
Magnesium Sulphate anhydrous	97.70
Sodium Chloride	6400.00
Sodium Dihydrogen Phosphate·H₂O	125.00
Sodium Hydrogen Carbonate	3700.00

아미노산
L-Arginine·HCl	84.00
L-Cystine	48.00
L-Glutamine in E15-806 and E15-808	584.00
Glycine	30.00
L-Histidine·HCl·H₂O	42.00
L-Isoleucine	105.00
L-Leucine	105.00
L-Lysine·HCl	146.00
L-Methionine	30.00
L-Phenylalanine	66.00
L-Serine	42.00
L-Threonine	95.00
L-Tryptophan	16.00
L-Tyrosine	72.00
L-Valine	94.00

비타민
D-Calcium-Pantothenate	4.00
Choline Chloride	4.00
Folic Acid	4.00
Myo-Inositol	7.20
Nicotinamide	4.00
Pyridoxal·HCl	4.00
Riboflavin	0.40
Thiamine·HCl	4.00

기타 성분
D-Glucose anhydrous	1000.0
HEPES in E15-007 and E15-808	5958.00
Phenol Red	15.00
Sodium Pyruvate	110.00

고포도당 DMEM(high-glucose DMEM) 조성(㎎/ℓ)

무기염
Calcium Chloride anhydrous not in E15-078	200.00
Ferric(III)-Nitrate·9H₂O	0.10
Potassium Chloride	400.00
Magnesium Sulphate anhydrous	97.70
Sodium Chloride	6400.00
Sodium Dihydrogen Phosphate·H₂O	125.00
Sodium Hydrogen Carbonate	3700.00

아미노산
L-Alanyl-L-Glutamine in E15-883	876.00
L-Arginine·HCl	84.00
L-Cystine	48.00
L-Glutamine in E15-810, E15-843, E15-877	584.00
Glycine	30.00
L-Histidine·HCl·H₂O	42.00
L-Isoleucine	105.00
L-Leucine	105.00
L-Lysine·HCl	146.00
L-Methionine	30.00
L-Phenylalanine	66.00
L-Serine	42.00
L-Threonine	95.00
L-Tryptophan	16.00
L-Tyrosine	72.00
D-Valine in E15-055	94.00
L-Valine not in E15-055	94.00

비타민
D-Calcium-Pantothenate	4.00
Choline Chloride	4.00
Folic Acid	4.00
Myo-Inositol	7.20
Nicotinamide	4.00
Pyridoxal·HCl	4.00
Riboflavin	0.40
Thiamine·HCl	4.00

기타 성분
D-Glucose anhydrous not in E15-079	4500.00
Phenol Red not in E15-047, E15-877	15.00
Sodium Pyruvate in E15-011, E15-843	110.00

DMEM/Ham's F-12 조성(㎎/ℓ)

무기염
Calcium Chloride anhydrous	116.60
Ferric(III)-Nitrate·9H₂O	0.05
Ferric(II)-Sulphate·7H₂O	0.417
Potassium Chloride	311.80
Cupric(II)-Sulphate·5H₂O	0.0013
Magnesium Chloride·6H₂O	61.20
Magnesium Sulphate anhydrous	48.84
Sodium Chloride	6996.00
Sodium Dihydrogen Phosphate·H₂O	62.50
Di-Sodium Hydrogen Phosphate anhydrous	71.02
Zinc Sulphate·7H₂O	0.432
Sodium Hydrogen Carbonate	1200.00

아미노산
L-Alanyl-L-Glutamine in E15-889	547.5
L-Alanine	4.45
L-Arginine·HCl	147.50
L-Asparagine·H₂O	7.50
L-Aspartic Acid	6.65
L-Cystine·HCl·H₂O	31.29
L-Cysteine·2HCl	17.56
L-Glutamic Acid	7.35
L-Glutamine in E15-813	365.00
Glycine	18.75
L-Histidine·HCl·H₂O	31.48
L-Isoleucine	54.47
L-Leucine	59.05
L-Lysine·HCl	91.25
L-Methionine	17.24
L-Phenylalanine	35.48
L-Proline	17.25
L-Serine	26.25
L-Threonine	53.45
L-Tryptophan	9.02
L-Tyrosine	38.70
L-Valine	52.85

비타민
D(+)-Biotin	0.0035
D-Calcium Pantothenate	2.24
Choline Chloride	8.98
Folic Acid	2.65
Myo-Inositol	12.60
Nicotinamide	2.02
Pyridoxal·HCl	2.00
Pyridoxine·HCl	0.031
Riboflavin	0.219
Thiamine·HCl	2.17
Thymidine	0.365
Vitamin B12	0.68

기타 성분
D-Glucose anhydrous	3151.00
Hypoxanthine	2.10
DL-68-Lipoic Acid	0.105
Linoleic Acid	0.042
Phenol Red	8.10
Putrescine·2HCl	0.081
Sodium Pyruvate	55.00

α-MEM 조성(㎎/ℓ)

무기염
Calcium Chloride anhydrous	200.00
Potassium Chloride	400.00
Magnesium Sulphate	97.67
Sodium Chloride	6800.00
Sodium Dihydrogen Phosphate·H₂O	140.00
Sodium Hydrogen Carbonate in E15-832	2200.00
Sodium Hydrogen Carbonate in E15-862	850.00

아미노산
L-Alanine	25.00
L-Arginine·HCl	126.64
L-Asparagine·H₂O	50.00
L-Aspartic Acid	30.00
L-Cysteine·HCl·H₂O	100.00
L-Cystine	24.00
L-Glutamic Acid anhydrous	75.00
L-Glutamine	292.00
Glycine	50.00
L-Histidine·HCl·H₂O	42.00
L-Isoleucine	52.40
L-Leucine	52.40
L-Lysine·HCl	72.47
L-Methionine	15.00
L-Phenylalanine	32.00
L-Proline	40.00
L-Serine	25.00
L-Threonine	48.00
L-Tryptophan	10.00
L-Tyrosine	36.00
L-Valine	46.00

비타민
L-Ascorbic Acid	45.00
D(+)-Biotin	0.10
Cholin Chloride	1.00
Folic Acid	1.00
Myo-Inositol	2.00
Nicotinamide	1.00
D-Pantothenic Acid (hemicalcium)	1.00
Pyridoxine·HCl	1.00
Riboflavin	0.10
Thiamine·HCl	1.00
Vitamin B12	1.33

기타 성분
D-Glucose anhydrous	1000.00
HEPES in E15-862	5958.00
Lipoic Acid	0.20
Sodium Pyruvate	110.00
Phenol Red	10.00

리보뉴클레오사이드
Adenosin	10.00
Cytidine	10.00
Guanosine	10.00
Uridine	10.00

데옥시리보뉴클레오사이드
2'-Deoxyadenosine·H₂O	10.00
2'-Deoxycytidine·HCl	11.00
2'-Deoxyguanosine	10.00
2'-Deoxythymidine	10.00

MEM 조성(㎎/ℓ)

무기염
Calcium Chloride anhydrous	200.00
Potassium Chloride	400.00
Magnesium Sulphate anhydrous	97.70
Sodium Chloride	6800.00
Sodium Dihydrogen Phosphate·H₂O	140.00
Sodium Hydrogen Carbonate	2200.00

아미노산
L-Alanyl-L-Glutamine in E15-888	434.00
L-Arginine·HCl	126.00
L-Cystine	24.00
L-Glutamine in E15-825	292.00
L-Histidine·HCl·H₂O	42.00
L-Isoleucine	52.00
L-Leucine	52.00
L-Lysine·HCl	72.50
L-Methionine	15.00
L-Phenylalanine	32.00
L-Threonine	48.00
L-Tryptophan	10.00
L-Tyrosine	36.00
L-Valine	46.00

비타민
D-Calcium Pantothenate	1.00
Cholin Chloride	1.00
Folic Acid	1.00
Myo-Inositol	2.00
Nicotinamide	1.00
Pyridoxal·HCl	1.00
Riboflavin	0.10
Thiamine·HCl	1.00

기타 성분
D-Glucose anhydrous	1000.00
Phenol Red	11.00

실시예 3: B16 흑색종 세포주의 세포배양 및 세포생존에 미치는 영향

마우스 흑색종 세포주 B16F1 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, 6323)로부터 분양받아 사용하였다. 이 세포를 DMEM에 10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 혼합한 배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 실험과정의 모든 세포들은 80∼90%의 confluency에서 실험하였다.

실시예 2에서 수득한 제대혈 줄기세포 배양액(SCCS)의 세포독성 측정과 실험에 사용할 농도범위를 결정하기 위해 MTT 분석을 시행하였다. B16F1 흑색종 세포를 10% FBS가 함유된 DMEM으로 96 웰 플레이트에 3×10³ 세포/웰로 100 ㎕씩 넣고 37 ℃, 5% CO₂ 조건하에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 실험군(제대혈 줄기세포 배양액 0, 10, 20, 30, 40, 50%)을 준비하여 각 그룹 당 3회 처리한 후 37 ℃, 5% CO₂ 조건으로 72시간 배양하였다. 이때 대조군은 제대혈 줄기세포를 배양하지 않은 배지를 0, 10, 20, 30, 40, 50%로 처리한 것으로 하였다. 배양 후 시험액이 포함된 배지에 5 ㎎/㎖의 MTT 시약을 웰 당 10 ㎕씩 분주한 다음 96 웰 플레이트의 빛을 차단하여 37 ℃, 5% CO₂ 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 배양이 완료되면 MTT 시약이 포함된 배지를 제거하고, DMSO(dimethyl sulfoxide) 100 ㎕를 가하여 MTT-포르마잔 결정을 용해시키고 570 ㎚ 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 확인하였다.

도 2는 본 발명에 따른 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물이 B16F1 세포의 세포 생존에 비치는 영향을 MTT 분석한 결과를 보여주는 그래프이다. 도 2에서 보면, 각각의 시료를 농도별로 처리하여 확인한 결과, B16 세포주의 생존율은 제대혈 줄기세포 배양액에 농도 의존적으로 감소하기는 하지만, 모든 농도에서 80% 이상의 생존율을 나타내었다. 즉, 본 발명에 따른 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물은 세포 독성을 나타내지 않는 것이 확인되었다.

실시예 4: B16 흑색종 세포내 멜라닌 생성 억제 효과

B16F1 흑색종 세포를 10% FBS가 함유된 DMEM으로 6 웰 플레이트에 1×10⁵ 세포/웰의 농도로 분주하고 37 ℃, 5% CO₂ 조건하에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 실시예 3과 같은 실험군(제대혈 줄기세포 배양액 0, 10, 20, 30, 40, 50%)과 대조군(제대혈 줄기세포를 배양하지 않은 배지 0, 10, 20, 30, 40, 50%)을 10% FBS 함유 DMEM 배양액에 넣고, 여기에 성장인자로 α-MSH(100 nM)를 첨가하여 37 ℃, 5% CO₂ 조건으로 72시간 동안 배양하였다.

배양 후 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척하고 웰 당 PBS 1 ㎖를 분주하여 세포 펠렛을 회수하였다. 회수된 펠렛을 14,000 rpm으로 20분 동안 원심 분리한 다음 상등액을 제거하였다. 그리고, 이 세포 펠렛을 60 ℃에서 1시간 동안 건조한 후 10% DMSO가 함유된 1M NaOH 150 ㎕를 넣어 60 ℃ 항온조에서 1시간 처리하여 세포내의 멜라닌을 용해시켰다. 이 액 100 ㎕를 96 웰 플레이트에 넣고 ELISA 판독기로 405 ㎚에서 흡광도를 측정하고 멜라닌 표준액을 이용한 표준곡선(standard curve)과 비교하여 멜라닌 함량을 정량하였다.

도 3은 본 발명에 따른 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물의 B16F1 세포 내의 멜라닌 생성 억제 효과를 보여주는 그래프이다. 도 3에서 보듯이, 제대혈 줄기세포 배양액을 10∼50% 첨가할 경우 α-MSH에 의해 생성되는 세포내 멜라닌 생성량을 농도의존적으로 억제하는 것을 확인할 수 있으며, 배양액을 50% 농도로 처리한 실험군에서는 약 60% 정도의 멜라닌 생성 억제 효과를 보였다.

실시예 5: B16F1 세포내 타이로시나제 활성 억제 효과

타이로시나제 활성은 DOPA 옥시다제 활성을 측정한 것으로 나타내었다. 위 실시예 4에서와 같은 방법으로 세포를 배양한 후 배지를 제거하고, PBS로 2회 세척한 다음 웰 당 PBS 1 ㎖를 분주하여 세포 펠렛을 회수하였다. 회수된 펠렛을 14,000 rpm으로 20분 동안 원심분리한 다음 상등액을 제거하고, 용해 완충액(lysis buffer; 67 mM 인산나트륨, pH 6.8, 1% 트리톤-X100, 0.2 mM PMSF) 500 ㎕를 첨가하여 초음파 분쇄기로 세포를 분쇄하였다. 세포 분쇄액을 1시간 동안 얼음에 보관한 후 14,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상층액을 얻고, 이 상층액을 타이로시나제 활성 분석에 사용하기 위해 단백질을 정량하였다. 67 mM 인산나트륨(pH 6.8)에 40 ㎕의 4 mM L-DOPA와 40 ㎍의 각각의 상층액을 혼합하여 200 ㎕가 되도록 96 웰 플레이트에 첨가한 후 37 ℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 생성된 DOPA 크롬(chrome)을 475 ㎚에서 흡광도를 측정하여 상대적 타이로시나제 활성으로 나타내었다.

도 4는 본 발명에 따른 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물의 B16F1 세포 내의 타이로시나제 활성 억제 효과를 보여주는 그래프이다. 도 4에서 보듯이, 제대혈 줄기세포 배양액 10∼50%를 α-MSH와 함께 처리한 실험군은 대조군에 비하여 현저하게 세포내 타이로시나제 활성을 농도의존적으로 저해하는 것을 확인할 수 있으며, 배양액을 50% 농도로 처리한 시험군에서는 약 80% 정도의 타이로시나제 활성 억제 효과를 보였다.

실시예 6: RT - PCR 을 이용한 유전자 발현분석

RNA 추출

본 실시예에서는 실시예 2에서 수득한 제대혈 줄기세포 배양액이 멜라닌 생성(melanogenesis)에 관여하는 효소인 타이로시나제(tyrosinase), TRP-1, TRP-2 등의 유전자 발현에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

B16F1 흑색종 세포를 10% FBS가 함유된 DMEM으로 6 웰 플레이트에 1×10⁵ 세포/웰의 농도로 분주하고 37 ℃, 5% CO₂ 조건하에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 실시예 2에서 수득한 실험군(제대혈 줄기세포를 배양한 배양액 0, 30, 50%)을 10% FBS 함유 DMEM 배양액에 넣고, 여기에 성장인자로 α-MSH(100 nM)를 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 조건으로 72시간 동안 배양하였다. 그런 다음 배지를 제거하여 PBS로 1회 세척하고 배양된 세포로부터 유전자 발현 분석을 위하여 RNAzol B 시약을 이용 세포 내 총 RNA를 추출하였다. RNAzol B 시약을 1 ㎖ 첨가하여 세포를 녹여 조직을 변성시킨 후, 1.5 ㎖ 시험관에 각각 옮기고 클로로포름 200 ㎕를 첨가한 후 20초간 vortexing 하여 완전히 혼합되도록 하였다. 실온에서 15분간 반응 후 14,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 획득하고, 동량의 이소프로판올을 첨가하여 반전(inverting)시킨 후 10분간 실온에 정치하였다. 시료를 14,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 RNA 펠렛을 얻고, 70% RNA용 에탄올로 14,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 세척한 후, 아스피레이터를 이용해 5분간 건조하였다. 건조된 RNA 시료는 0.1% DEPC(diethyl pyrocarbonate)로 처리된 증류수 25 ㎕를 첨가하고 55 ℃에서 10분간 반응시켜 펠렛을 녹여 cDNA 합성을 위한 시료로 사용하였으며, 그 중 5 ㎕를 20배 희석하여 분광광도계(spectrophotometer)로 O.D. 260/280 ㎚에서 RNA의 농도 및 순도를 측정하였다.

cDNA 합성

단일 가닥 cDNA 합성을 위해, 추출한 총 RNA 1 ㎍에 oligo-d(T) 프라이머 (100 pmol) 1 ㎕를 혼합하여 65 ℃에서 10분간 반응시킨 후 급속 냉각시켰다. 이 주형(template)에 10 mM dNTP(TaKaRa Bio Inc., Japan), 0.1M DTT와 5X RT 완충액(10 mM Tris-Cl, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl₂) 각 2 ㎕를 첨가하고 M-MLV RTase(BioNeer, Korea) 100 유닛을 첨가한 후, DEPC로 처리된 증류수를 이용하여 전체 양이 20 ㎕가 되도록 보정하였다. 시료는 25 ℃에서 5분, 42 ℃에서 1시간 동안 합성반응 후 72 ℃에서 15분간 반응을 통해 역전사효소(reverse transcriptase)를 불활성화시켜 종결하였다.

RT - PCR

합성한 cDNA와 각 유전자의 프라이머(표 7)를 이용하여 RT-PCR 반응을 수행하였다. 반응조건은 주형 1 ㎕와 프라이머 각 0.5㎕(10 pmol), 2.5 mM dNTP 0.5 ㎕, 10X PCR 완충액[10mM Tris-Cl(pH 8.3), 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl₂] 2.5 ㎕, Taq polymerase 2 유닛/㎕을 첨가한 후 멸균증류수를 이용하여 전체 양을 25 ㎕로 보정하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응으로부터 획득한 증폭 산물은 1.5% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동을 수행하였고, 각 PCR 산물의 검출 강도는 이미지 분석 시스템(image analysis system)(Kodak EDAS290)를 이용하여 분석하였다. 밴드 검출 강도의 상대적 정량치는 하우스 키핑(house keeping) 유전자인 GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 검출강도를 기준으로 보정하였다.

멜라닌 생성(melanogenesis)에 관련된 유전자들의 프라이머

유전자	약어	유전자 Accession Number	전방 프라이머	산물 크기
			후방 프라이머
글리세르알데히드-3- 포스페이트 데하이드로게나제	GAPDH	NM_008084	aactttggcattgtggaagg	223
			acacattgggggtaggaaca
타이로시나제	TRY	NM_011661	cctcctggcagatcatttgt	236
			ggcaaatccttccagtgtgt
타이로시나제-관련 단백질 1	TRP1	NM_031202	cgttggaaaacgcacctatt	274
			tcagtgaggagaggctggtt
타이로시나제-관련 단백질 2	TRP2	X_63349	cttcctaaccgcagagcaac	237
			caggtaggagcatgctaggc

도 5는 본 발명에 따른 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물이, 멜라닌 생성에 관여하는 효소인 타이로시나제(tyrosinase), TRP-1 및 TRP-2의 유전자 발현에 미치는 영향을 RT-PCR을 이용하여 분석한 결과를 보여주는 도면이다. 도 5에서 보듯이, 본 발명에 따른 제대혈 줄기세포 배양액을 처리한 경우 농도 의존적으로 타이로시나제, TRP-1, TRP-2 유전자의 mRNA 발현량이 감소되는 것을 확인할 수 있다.

실시예 7: Western blot 을 이용한 단백질 측정

본 실시예에서는 실시예 2에서 수득한 제대혈 줄기세포 배양액의 멜라닌 생성 억제 효과와 세포내 타이로시나제 저해 효과가 타이로시나제, TRP-1, TRP-2와 같은 멜라닌 합성효소의 발현 억제와 관련된 영향인지 알아보고자 하였다.

B16F1 흑색종 세포에 실험군(제대혈 줄기세포 배양액 0, 30, 50%)을 72시간 동안 처리한 후 배지를 제거하고, 1 ㎖의 PBS를 첨가하여 스크래퍼(scraper)로 수거한 후 14,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 세척하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 500 ㎕ 용해 완충액(150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1% NP40, 0.1% SDS, 1 mM PMSF)을 첨가하여 초음파 분쇄기로 용해시켰으며, 14,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 배양 세포로부터 얻어진 단백질 시료는 Bradford 방법을 이용하여 정량하였고 20 ㎍의 용해물을 12% SDS-PAGE로 전기영동 분리하였으며, 전이용액을 사용하여 단백질을 PVDF 멤브레인에 90 V로 50분 동안 전이시켰다. 그리고, 멤브레인의 블로킹(blocking)은 5% 탈지 유유가 함유된 TBST(50 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.2% Tween 20) 용액 중 상온에서 1시간 동안 실시하였다.

타이로시나제 항체로는 염소 폴리클로날 항 타이로시나제(Santa-Curz), TRP-1의 항체로는 토끼 폴리클로날 항 TRP-1(Santa-Curz), TRP-2의 항체로는 토끼 폴리클로날 항 TRP-2(Santa-Curz), 액틴(actin)의 항체로는 염소 폴리클로날 항 액틴(Santa-Curz)을 5% 탈지 우유가 함유된 TBST 용액에 희석하여 상온에서 1시간 30분 동안 반응시켰다.

TBST 용액으로 3회 세척한 후, 2차 항체로는 HRP(Horse Radish Peroxidase)가 결합된 항-염소, 항-토끼 IgG을 5% 탈지 우유가 함유된 TBST 용액에 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 멤브레인을 TBST로 3회 세척한 후 Immobilon Western Kit(Millipore Cat. No. WBKLS0100)을 사용하여 1분간 반응시켜 LAS-3000 분석장비로 발색된 밴드의 강도를 확인하였다.

도 6은 본 발명에 따른 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물이 미백 활성에 관련된 단백질 발현에 미치는 영향을 Western blot을 이용하여 측정한 결과를 보여주는 도면이다. 도 6에서 보듯이, 제대혈 줄기세포 유래 단백질 조성물은 멜라닌 합성 경로 초기에 관여하는 타이로시나제와 TRP-1의 발현을 대조군에 비하여 농도 의존적으로 저해하는 것을 알 수 있다. 특히, 제대혈 줄기세포 유래 단백질 조성물을 50% 처리한 경우 타이로시나제에 대해서는 약 80%의 저해 효과를 보이고 있다.

실시예 8: 3 T3 - L1 지방전구세포주의 지방 축적 억제 효과

지방전구세포인 3T3-L1 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, CL-173)로부터 분양받아 사용하였다. 이 세포는 DMEM에 10% FBS, 100 유닛/㎖ 페니실린, 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 혼합한 배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

본 실시예는 실시예 2에서 수득한 제대혈 줄기세포 배양액(SCCS)이 세포내 형성되는 지방축적을 억제하는 효과를 확인하기 위한 것으로, Oil-Rad-O 염색법을 사용하였다.

3T3-L1 세포를 24 웰 플레이트에 1×10⁵ 세포/웰의 농도로 분주하고, post-confluent 상태가 될 때까지 2일 간격으로 배양액을 갈아주면서 37 ℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 배양 후 1일째 분화를 유도하기 위해 1M의 덱사메타손(dexamethasone), 0.5 mM의 IBMX(Isobutylmethylxantine) 및 10 ㎍/㎖의 인슐린 (insulin)을 첨가한 세포 분화 유도 배지를 48시간 동안 처리하고, 배양 후 3, 5, 7일째 되는 날에도 세포 분화 유도 배지를 공급하면서 지방세포분화를 유도하였다. 동시에 상기 실시예 2에서 수득한 실험군(제대혈 줄기세포를 배양한 배양액 30%)과 대조군(제대혈 줄기세포를 배양하지 않은 배지 30%)을 세포 분화 유도 배지에 첨가하여 배양 첫날부터 배지를 새로 교체할 때마다 처리하였다. 다음 3T3-L1 세포의 분화 정도를 보기 위하여 분화 마지막 날인 9일째에는 작은 지방 방울(lipid droplet)에 특이적으로 반응하는 Oil-Rad-O를 사용하였다. 분화가 진행된 세포들은 PBS로 2회 세척한 후, 4% 포름알데히드 용액으로 20분간 세포를 고정시켰다. 다음에, PBS로 3회 세척하고 0.2% Oil-Rad-O 용액에서 1시간 동안 세포를 염색한 후, 현미경으로 관찰하였다.

도 7은 본 발명에 따른 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물이 지방세포 분화를 저해하는 것을 보여주는 사진(배율 200X)이다. 도 7에서 보듯이, 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물을 초기단계부터 30% 농도로 첨가한 경우, 대조군에 비하여 Oil-Rad-O 시약에 의해 염색된 작은 지방 방울이 거의 관찰되지 않은 것을 현미경 상으로 확인할 수 있다. 이는, 본 발명의 단백질 조성물을 처리한 경우 지방세포로의 분화를 저해하여 세포내 지방축적 억제 효과가 있음을 의미한다.

Claims

콩 단백질 가수분해물을 포함하는 무혈청 배지에서, 제대혈로부터 분리된 중간엽 줄기세포를 배양하는 것을 특징으로 하는, 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물의 생산 방법.
제 1 항에 있어서, 무혈청 배지 중 콩 단백질 가수분해물의 농도는 0.5 내지 3.0 g/L인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 무혈청 배지 중 콩 단백질 가수분해물의 농도가 1.5 내지 2.5 g/L인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 무혈청 배지는 α-MEM(alpha-minimum essential medium), 저포도당(low-glucose) DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media), 고포도당(high-glucose) DMEM, DMEM/Ham's F-12, 또는 MEM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항의 방법에 따라 제조되는, 미백 효과를 갖는 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물.
제 1 항의 방법에 따라 제조되는, 항비만 효과를 갖는 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물.
제 5 항에 있어서, GRO-alpha를 포함하는 것을 특징으로 하는 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물.
제 1 항의 방법에 따라 제조되는, MCP-1을 포함하는 것을 특징으로 하는 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물.
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 하기 표에 기재된 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 제대혈 중간엽 줄기세포 유래 단백질 조성물. 단백질 농도(pg/㎖) Eotaxin 83.73±27.55 FGF-2 5.63±0.25 Flt-3 Ligand 3.61±0.14 Fractalkine 72.65±4.23 G-CSF 7.75±0.22 GM-CSF 20.15±8.58 GRO-alpha 2712.16±387.06 INFα2 13.82±2.61 IFNγ 13.30±0.63 IL-1α 0.56±0.09 IL-1β 2.00±0.03 IL-1ra 2.33±0.14 IL-2 0.49±0.05 IL-3 0.58±0.05 IL-4 6.88±2.39 IL-6 387.03±118.20 IL-7 5.60±1.54 IL-8 4790.71±1267.38 IL-9 1.12±0.19 IL-10 1.18±0.02 IL-12 (p40) 5.13±0.44 IL-12 (p70) 2.39±0.03 IL-13 0.97±0.19 IL-15 0.85±0.04 IL-17 0.15±0.02 IP-10 50.67±5.41 MCP-1 >10,000 MCP-3 128.49±20.65 MDC 10.17±0.34 MIP-1α 8.78±0.66 MIP-1β 1.64±0.30 PDGF-AA 31.57±3.73 PDGF-AB/BB 4.29±0.36 RANTES 85.66±9.02 sCD40L 5.62±0.00 sIL-2Rα 2.95±0.30 TGFα 0.67±0.21 TNFβ 1.73±0.05 VEGF 50.60±2.88