KR101927073B1 - 메트포민 전처리를 통한 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화율 및 신경돌기 성장을 촉진시키는 방법 - Google Patents

메트포민 전처리를 통한 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화율 및 신경돌기 성장을 촉진시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)에 메트포민(metformin)을 전처리하는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화를 촉진시키는 방법 및 메트포민을 유효성분으로 포함하는, 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진용 배지 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 방법은 추후 신경계 질환의 치료를 위한 세포 치료(cell therapy) 분야에 중간엽 줄기세포의 활용도를 보다 높일 수 있을 것으로 기대된다.

Description

메트포민 전처리를 통한 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화율 및 신경돌기 성장을 촉진시키는 방법{Method for promoting differentiation rate of mesenchymal stem cell into neuron and neurite outgrowth via pre-treatment of metformin}
본 발명은 메트포민 전처리를 통한 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화율 및 신경돌기 성장을 촉진시키는 방법에 관한 것이다.
인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(human bone marrow mesenchymal stem cell, hBM-MSC)는 다분화능이 있고, 신경세포-유사 세포로 분화가 가능하다. 중간엽 줄기세포(MSC)는 퇴행성 뇌질환, 뇌졸중, 외상에 의한 척수손상 또는 간질 등과 같은 신경질환을 포함하는 다양한 질환에 세포 치료제로 연구되고 있다. 이에, MSC는 다양한 신경질환을 위한 치료적 약물의 소재로 관심이 증가되고 있다.
메트포민(N,N-Dimethylimidodicarbonimidic diamide)은 AMPK(AMP-activated kinase)의 활성제로 알려진 물질로, 세포의 인슐린 감수성을 향상시키고 간에서 글루코스의 생합성을 억제시켜 제2형 당뇨병의 치료에 사용되어 왔다. 또한, 메트포민은 허혈성 손상으로부터 세포와 조직을 보호한다. 메트포민을 장기간 사용할 경우, 뇌졸중과 심혈관 질환을 예방할 수 있다. 그래서, 메트포민은 세포 보호 및 글루코스 에너지 대사에 유익한 효과가 있다.
AMPK는 구조적으로 세 개의 서브유닛으로 구성되어 있는데, 하나의 촉매 서브유닛 α, 두 개의 조절 서브유닛 β 및 γ로 이루어져 있다. 대사 스트레스가 존재할 때, AMPK는 적당하게(moderate) 활성화된다. 또한, AMPK는 세포 극성 및 이동과 같은 다양한 세포의 기능과 연관되어 있다. 최근의 연구에서, 조절 서브유닛 AMPKβ1이 신경발생(neurogenesis) 및 신경세포 분화에 중요한 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다. AMPK의 활성은 축삭 재생(axonal regeneration) 및 퇴행성 뇌질환에 요구되는 smad1의 인산화 및 sirt1의 활성을 유도한다.
AMPK 활성화가 신경발생 및 신경 질환에 유익한 효과를 유도하는 것으로 보고되었기 때문에, 본 발명자들은 메트포민의 처리로 인한 AMPK의 활성화가 hBM-MSCs의 신경 세포 분화 동안에 신경돌기 성장(neurite outgrowth)을 자극하는지를 조사하였다.
한편, 한국등록특허 제1659158호에는 '메트포민이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포 및 이를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1471785호에는 '발프로산 전처리를 통한 중간엽 중기세포의 신경세포로의 분화 촉진 방법'이 개시되어 있으나, 본원 발명의 메트포민 전처리를 통한 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화율 및 신경돌기 성장을 촉진시키는 방법에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)에 메트포민을 전처리함으로써, 메트포민 미처리구와 비교하여 신경세포로의 분화 유도 후에 증가된 신경세포 분화율 및 신경돌기(neurite)의 성장을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 인간 골수(bone marrow) 유래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)에 메트포민(metformin)을 전처리하는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화를 촉진시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 메트포민이 4~6mM의 농도로 포함된 배지에서 20~28시간 동안 전처리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 메트포민 전처리 중간엽 줄기세포를 전-유도 배지에서 20~28시간 동안 배양하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 배양된 전-유도된 중간엽 줄기세포를 신경세포 분화 유도 배지에서 2~6시간 배양하여 신경세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화를 촉진시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 메트포민을 유효성분으로 포함하는, 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 방법은 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화 유도 전에 메트포민을 전처리함으로써, 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 전환분화(trans-differentiation)능을 향상시켰으며, 메트포민 무처리구와 비교하여 신경돌기의 성장을 보다 촉진시킬 수 있어, 추후 신경계 질환의 치료를 위한 세포 치료 분야에 중간엽 줄기세포의 활용도를 보다 높일 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 메트포민(metformin) 처리에 따른 인간 골수 중간엽 줄기세포(hBM-MSCs)의 신경세포 분화 정도를 확인한 결과로, (A)는 메트포민 처리 농도별 신경세포로 분화된 hBM-MSCs(dMSCs)의 수준을 나타낸 결과이고, (B)는 메트포민 무처리 또는 처리한 hBM-MSCs를 유도 배지에서 다양한 시간별로 배양한 후 신경세포로 분화된 hBM-MSCs의 수를 나타낸 결과이며(dMSCs, 메트포민 무처리군에서 분화된 신경세포; Met-dMSCs, 메트포민 처리군에서 분화된 신경세포), (C)는 메트포민의 세포 독성을 확인한 결과이다.
도 2는 메트포민의 신경돌기(neurite) 성장 촉진능을 확인한 결과로, (A)는 메트포민 무처리 및 처리 후 신경세포로 분화 유도한 hBM-MSCs의 세포 사진이고, (B)는 신경세포로 분화 유도한 hBM-MSCs에서 메트포민 처리 유무에 따른 신경돌기의 길이를 비교한 결과이며, (C)는 신경돌기의 수를 측정한 결과이다. Ctrl-MSCs: 메트포민 무처리 및 미분화 hBM-MSCs, Met-MSCs: 메트포민 처리 후 미분화 hBM-MSCs, dMSCs: 메트포민 무처리 후 분화 유도 hBM-MSCs, Met-dMSCs: 메트포민 처리 후 분화 유도 hBM-MSCs.
도 3은 메트포민 처리에 따른 신경돌기 마커의 분자적 수준에서의 변화를 PCR 및 면역블롯팅을 이용하여 확인한 결과로, (A)는 신경세포 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이고, (B)는 신경돌기 마커 및 신경세포 마커 유전자의 발현수준을 메트포민 처리 유무에 따라 비교한 결과이고, (C)는 신경세포가 아닌 다른 계통(lineage) 특이적 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인한 것이며, (D)는 신경돌기 마커 단백질의 발현 수준을 면역블롯팅으로 확인한 결과이다.
도 4는 AMPK 활성화를 통한 신경돌기의 성장을 확인한 결과로, (A)는 메트포민 또는 AMPK 저해제인 compound C를 처리한 hBM-MSCs에서 인산화 AMPK(p-AMPK) 및 AMPK 단백질의 발현 수준을 확인한 결과이고, (B)는 신경세포 특이 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이고, (C)는 신경돌기 마커 단백질의 발현 수준을 확인한 결과이다. Ctrl-MSCs: hBM-MSCs, Met-MSCs: 메트포민 처리 hBM-MSCs, CC-MSCs: compound C 처리 hBM-MSCs, dMSCs: 메트포민 무처리군에서 분화된 신경세포; CC-dMSCs: compound C 처리군에서 분화된 신경세포.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 골수(bone marrow) 유래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)에 메트포민(metformin)을 전처리하는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화를 촉진시키는 방법을 제공한다.
용어 '중간엽 줄기세포'는 골수와 제대혈에서 채취되는 성체줄기세포의 하나로 체내에 대략 100만개가 존재하는 것으로 알려졌으며, 섬유모세포의 모양(방추형 모양)을 띄고 있으며, 부착되는 특징이 있고, 시험관에서는 무한정 증식이 가능하며, 혈액줄기세포(hematopoietic stem cell)와 달리 골세포, 연골세포, 지방세포, 근육세포 및 섬유아세포 계통에 속하는 분화된 기질 세포가 될 수 있는 특징이 있다.
메트포민은 비구아니드(biguanides)계 경구용 당뇨병 치료제로, 혈당개선효과와 심혈관질환을 예방하는 효과가 있다. 작용기전의 하나로 간에서 AMP-activated protein kinase(AMPK)를 활성화함으로써 포도당생합성을 막고, 세포에 포도당이 흡수되는 것을 촉진하고, 대사증후군을 억제한다. 이 약물은 2형 당뇨병 치료에 1차 약물로 사용되며, 특히 정상 신기능을 가지는 과체중 혹은 비만 환자에게 사용된다.
본 발명의 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화를 촉진시키는 방법에 있어서, 상기 신경세포는 메트포민 무처리 대비 신경돌기(neurite)의 성장이 촉진된 것일 수 있고, 바람직하게는 신경돌기의 길이(length)가 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 메트포민은 4~6mM의 농도로 20~28시간 동안 전처리되는 것일 수 있고, 바람직하게는 5mM의 농도로 24시간 동안 전처리되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한,
(a) 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 메트포민이 4~6mM의 농도로 포함된 배지에서 20~28시간 동안 전처리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 메트포민 전처리 중간엽 줄기세포를 전-유도 배지에서 20~28시간 동안 배양하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 배양된 전-유도된 중간엽 줄기세포를 신경세포 분화 유도 배지에서 2~6시간 배양하여 신경세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화를 촉진시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 (b) 단계의 전-유도 배지는 9~11 %(v/v) 소태아혈청, 8~12 ng/ml 섬유아세포 증식인자 및 400~600 μM β-머캅토에탄올을 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 10 %(v/v) 소태아혈청, 10 ng/ml 섬유아세포 증식인자 및 500 μM β-머캅토에탄올을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 상기 (c) 단계의 신경세포 분화 유도 배지는 80~120 μM 부틸 하이드록시아니솔 및 1~3 %(v/v) 디메틸설폭사이드를 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 100 μM 부틸 하이드록시아니솔 및 2 %(v/v) 디메틸설폭사이드를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화를 촉진시키는 방법은 가장 구체적으로는,
(a) 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 메트포민을 5mM의 농도로 포함한 배지에서 24시간 동안 전처리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 메트포민 전처리 중간엽 줄기세포를 10 %(v/v) 소태아혈청, 10 ng/ml 섬유아세포 증식인자 및 500 μM β-머캅토에탄올을 포함하는 전-유도 배지에서 24시간 동안 배양하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 배양된 전-유도된 중간엽 줄기세포를 100 μM 부틸 하이드록시아니솔 및 2 %(v/v) 디메틸설폭사이드를 포함하는 신경세포 분화 유도 배지에서 3시간 배양하여 신경세포로 분화시키는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화를 촉진시키는 방법은 분화된 세포가 목적하는 세포로 분화되었는지 여부를 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 상기 판정은 분화된 세포가 신경세포 특이적 유전자의 mRNA 또는 단백질을 발현하는지 여부를 확인함으로써 수행되는 것일 수 있다. 상기 mRNA 또는 단백질의 발현 여부는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 확인할 수 있다.
본 발명은 또한, 메트포민을 유효성분으로 포함하는, 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화 촉진용 배지 조성물을 제공한다. 본 발명의 상기 배지 조성물은 유효성분으로 메트포민을 4~6mM의 농도로 함유하고 있어, 메트포민의 작용에 의해 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화율 및 신경돌기(neurite) 성장을 촉진할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. primary hBM-MSCs의 특성화 및 세포 배양
인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(human bone marrow mesenchymal stem cells, 이하 hBM-MSCs)는 CEFO(Cell Engineering for Origin, 한국)에서 구매하였으며, 상기 중간엽 줄기세포는 다른 자극 보조제 또는 비타민의 공급 없이 성장 보충제, L-글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신이 포함된 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 배지(Gibco, 미국)에서 배양하였다. 상기 중간엽 줄기세포는 37℃, 5% CO2의 배양기에서 배양하면서, 7번 계대배양한 후 하기 실험에 사용하였다.
2. MTT 분석
메트포민(metformin)을 처리한 hBM-MSCs의 세포 독성은 MTT 분석을 통해 측정하였다. 간단하게, 2.5 x 103 hBM-MSCs 세포를 96-웰 플레이트에 준비하고, 하룻 밤 배양한 다음, 0~5mM의 메트포민을 세포에 처리하고 24시간 추가 배양 후, MTT 분석을 수행하였다.
3. 신경세포 분화
이전의 연구(H.T. Kim et al., Neurochem Int. 2016, 96:77-83; D. Woodbury et al., J Neurosci Res. 2000, 61:364-370)를 통해 확립된 신경세포 분화 방법을 사용하여, 메트포민 또는 compound C를 첨가 또는 무첨가하여 배양함으로써 hBM-MSCs의 신경세포로의 분화를 유도하였다. 세포 이미지는 Eclipse TS100 현미경(Nikon, 일본) 및 i-Solution IMTcam3 디지털 카메라(JENOPTIK, 독일)을 사용하여 관찰하였다. 분화된 세포는 60㎛ 이상의 길이를 가지는 수상돌기(dendrite)를 2개 이상 가지는 각 세포체(cell body)를 신경세포-유사 세포로 간주하였다. 신경돌기(neurite) 길이는 Image J 프로그램(NIH, 미국)을 사용하여 측정하였다.
4. 실시간 정량적 중합효소연쇄반응(Real time quantitative PCR)
hBM-MSCs, 메트포민 처리 hBM-MSCs(이하 Met-MSCs), compound C 처리 hBM-MSCs(이하 CC-MSCs) 및 신경세포로 분화한 hBM-MSCs(이하 dMSCs)의 총 RNA는 RNAiso 시약(Takara, 일본)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 추출하였다. cDNA는 Primescript Ⅱ 1st strand cDNA 합성 키트(Takara)를 사용하여 합성하였다. cDNA는 Power SYBR Green PCR master mix 시약(Applied Biosystems Inc., 미국)과 표적 유전자 특이적 프라이머 세트를 사용하여 합성하였다. PCR 프라이머는 GenoTech(미국) 및 IDT(미국)에서 합성하여 사용하였다.
PCR 프라이머 정보
유전자 프라이머 서열정보(5'→3')
NF-M 정방향 GTGAACCACGAGAAGGCTCA (서열번호 1)
역방향 AGGTAGTCTTTGCGCTCCAC (서열번호 2)
MAP-2 정방향 TTGGTGCCGAGTGAGAAGAA (서열번호 3)
역방향 GGTCTGGCAGTGGTTGGTTAA (서열번호 4)
Tuj-1 정방향 GGAGATCGTGCACATCCAGG (서열번호 5)
역방향 CGAGGCACGTACTTGTGAGA (서열번호 6)
KCNH1 정방향 TTGGAGATGTGTTCTGGAAGGAA (서열번호 7)
역방향 AGGGCATCCCGCTTGATC (서열번호 8)
KCNH5 정방향 GACGAAATTTGCCCGATTGA (서열번호 9)
역방향 TGAATGTTTATGGACCACCTCTGT (서열번호 10)
Adiponectin 정방향 ACATGCCCATTCGCTTTACC (서열번호 11)
역방향 AGAGGCTGACCTTCACATCC (서열번호 12)
MMP13 정방향 TTCCCAGTGGTGGTGATGAA (서열번호 13)
역방향 CAGGATTCCCGCGAGATTTG (서열번호 14)
FABP4 정방향 GGCATGGCCAAACCTAACAT (서열번호 15)
역방향 CCTGGCCCAGTATGAAGGAA (서열번호 16)
ALP 정방향 GCACCATGAAGGAAAAGCCA (서열번호 17)
역방향 TGTGAAGACGTGGGAATGGT (서열번호 18)
βactin 정방향 ATCCGCAAAGACCTGTACGC (서열번호 19)
역방향 TCTTCATTGTGCTGGGTGCC (서열번호 20)
5. 면역블롯팅 분석
프로테아제(protease) 및 디포스파타제 저해제(dephosphatase inhibitor)가 포함된 RIPA 버퍼(Santa Cruz Biotechnology, 미국) 40㎕를 hBM-MSCs, Met-MSCs, CC-MSCs 및 dMSCs에 처리하고 4℃에서 30분간 반응시킨 후, 16,000 xg에서 20분 동안 원심분리시켜 총 단백질을 추출하였다. 그 후, Tuj-1 (1:500; Santa Cruz Biotechnology), MAP-2 (1:500; Santa Cruz Biotechnology), NF-M (1:500; Santa Cruz Biotechnology), p-AMPK (1:1000; Cell Signaling, 미국), AMPK (1:1000; Cell Signaling) 및 β-actin (1:5000; Sigma, 미국) 특이 항체를 이용하여 단백질 추출물을 대상으로 면역블롯팅을 수행하였다. 발색된 블롯은 Image J 프로그램을 사용하여 정량하였다.
6. 통계 분석
모든 데이타는 평균±표준편차로 표시하였으며, 각 그룹간 통계학적 비교는 독립적 t-test를 사용하였다. 0.05 이하의 p 값을 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
실시예 1. 메트포민의 hBM-MSCs의 신경세포로의 분화 촉진능 분석
본 발명자들은 AMPK의 활성이 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(hBM-MSCs)의 신경세포-유사 세포로의 전환분화(trans-differentiation)를 향상시키는지 확인하고자, hBM-MSCs를 1~5mM 농도의 메트포민을 처리하여 24시간 동안 배양한 후, 10% 소태아혈청(FBS), 10ng/ml 섬유아세포 증식인자(bFGF) 및 500μM β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)를 함유하는 전-유도 배지에서 24시간 노출시킨 다음, 상기 배지를 100μM 농도의 부틸 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole) 및 2% DMSO가 함유된 FBS-free 분화 유도 배지로 교체하여 3시간 동안 배양하였다. 결과는 신경세포로 분화된 hBM-MSCs(이하 dMSCs)의 수를 세어 표현하였다.
실험 결과, dMSCs의 수는 메트포민 농도 의존적으로 증가되는 것으로 관찰되었으며(도 1A), 신경세포로의 분화 유도의 최적 시간을 결정하기 위해 메트포민 무처리 또는 5mM을 처리한 hBM-MSCs를 유도전 배지에서 24시간 배양한 후, 유도 배지로 1, 3 및 5시간 배양한 결과, 메트포민 무처리 및 처리 모두에서 dMSCs의 비율이 유도 배지로 3시간 배양할 때까지 꾸준히 증가하다가 그 이후에는 더 이상 증가하지 않는 것을 확인하였다(도 1B). 또한, 메트포민 무처리군과 비교하여 메트포민 처리 후 유도 배지로 배양한 군에서 dMSCs의 비율이 보다 높을 것을 확인할 수 있었다. 신경세포로의 분화를 위해 처리한 메트포민의 세포 독성을 확인한 결과, 모든 처리군에서 메트포민에 의한 세포 독성이 확인되지 않았다(도 1C).
실시예 2. 메트포민 처리에 따른 신경돌기(neurite) 성장 촉진능 분석
메트포민 무처리 또는 처리 후 유도 배지에서 배양한, 신경세포로 분화한 hBM-MSCs(각각 dMSCs 및 Met-dMSCs)에서 AMPK의 활성이 신경돌기 성장을 증진시킬 수 있는지 조사하였다. 모든 dMSCs 및 Met-dMSCs는 신경세포와 유사한 형태를 보여준 반면, 미분화된 hBM-MSCs(Ctrl-MSCs and Met-MSCs)는 hBM-MSCs의 전형적인 세포 모양인 방추형(spindle-shaped)의 형태를 보여주었다(도 2A). 흥미롭게도, 신경세포로 분화된 dMSCs의 신경돌기의 길이(105.3㎛)가 메트포민 처리 후 신경세포로 분화된 Met-dMSCs에서(152.1㎛) 현저하게 길어진 것을 확인할 수 있었다(도 2B). 반면, 각 세포체로부터 신경돌기의 수는 미비하게 증가되었고(도 2C), 이상의 결과를 통해 메트포민 전처리가 hBM-MSCs의 신경세포로의 분화 시 신경돌기 성장을 자극할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 메트포민 처리에 따른 신경돌기 특이 마커의 증가
분자 수준에서 메트포민에 의한 신경돌기의 성장을 확인하기 위해서, 신경세포 마커 유전자인 KCNH1, KCNH5, NF-M, Tuj-1 및 MAP-2에 특이적인 프라이머를 사용하여 정량적 PCR을 수행하였다. 그 결과, 상기 모든 유전자의 발현이 dMSCs 보다 Met-dMSCs에서 현저히 증가된 것을 관찰하였다. 특히, 신경돌기 마커 유전자인 Tuj-1 및 MAP-2는 Met-dMSCs에서 매우 증가되었다(도 3A). dMSCs에서 신경돌기 유전자의 평균 발현수준은 Met-dMSCs에서 크게 증가하였으나, 신경세포 유전자(KCNH1, KCNH5, NF-M)의 발현 수준은 미비하게 증가하였다(도 3B). 또한, 지방세포(adipogenic) 특이 유전자(Adiponectin 및 FABP4), 연골원성(chondrogenic) 특이 유전자(MMP13) 및 골원성(osteogenic) 특이 유전자(ALP)와 같은 다른 계통(lineage) 특이적 유전자의 발현은 미분화된 hBM-MSCs(Ctrl-MSCs) 대비 dMSCs 및 Met-dMSCs에서 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 3C). 신경돌기 마커 단백질인 Tuj-1 및 MAP-2에 대한 특이 항체를 사용한 면역블롯팅 결과에서도 Met-dMSCs에서 상기 단백질의 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다(도 3D).
실시예 4. 메트포민의 AMPK 신호전달을 통한 신경돌기 성장 유도 효과 분석
상기의 결과들을 통해, hBM-MSCs의 신경세포로의 분화에 있어서 메트포민이 신경돌기 성장을 자극한다는 사실을 확인할 수 있었다. 메트포민의 이러한 효과를 보다 더 정확하게 확인하기 위해서, AMPK 저해제인 compound C를 사용하였다. 그 결과, 메트포민을 처리한 hBM-MSCs(Met-MSCs)에서 증가되었던 인산화-AMPK(p-AMPK)의 수준은 compound C를 처리한 hBM-MSCs(CC-MSCs)에서 감소되는 것이 확인되었다(도 4A).
hBM-MSCs의 신경세포로의 분화 동안에 신경돌기 성장과 AMPK의 관계를 확인하기 위해 정량적 PCR을 수행한 결과, dMSCs에서 증가되었던 신경세포 마커 유전자의 발현이 CC-MSCs에서 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 4B). 신경돌기 유전자(MAP-2, Tuj-1)의 발현은 CC-MSCs에서 현저하게 감소되었으며, 신경세포 유전자(KCNH1, KCNH5, NF-M)는 덜 감소된 것으로 확인되었다. 신경돌기 마커 단백질인 Tuj-1 및 MAP-2에 대한 특이 항체를 사용한 면역블롯팅 결과에서도 CC-MSCs에서 상기 마커 단백질의 수준이 현저히 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 4C).
이상의 결과를 통해, 메트포민 처리에 의한 AMPK의 활성화는 인간 골수 중간엽 줄기세포(human bone marrow mesenchymal stem cell)의 신경세포로의 분화 과정 중 신경돌기의 성장을 촉진시킴을 재확인할 수 있었다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Chosun University <120> Method for promoting differentiation rate of mesenchymal stem cell into neuron and neurite outgrowth via pre-treatment of metformin <130> PN17144 <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gtgaaccacg agaaggctca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 aggtagtctt tgcgctccac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ttggtgccga gtgagaagaa 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggtctggcag tggttggtta a 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggagatcgtg cacatccagg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cgaggcacgt acttgtgaga 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ttggagatgt gttctggaag gaa 23 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 agggcatccc gcttgatc 18 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gacgaaattt gcccgattga 20 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tgaatgttta tggaccacct ctgt 24 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 acatgcccat tcgctttacc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 agaggctgac cttcacatcc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ttcccagtgg tggtgatgaa 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 caggattccc gcgagatttg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ggcatggcca aacctaacat 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cctggcccag tatgaaggaa 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gcaccatgaa ggaaaagcca 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 tgtgaagacg tgggaatggt 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 atccgcaaag acctgtacgc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 tcttcattgt gctgggtgcc 20

Claims (10)

  1. 골수(bone marrow) 유래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)에 4~6mM의 메트포민(metformin)을 20~28시간 동안 전처리하는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화를 촉진시키는 방법으로서,
    상기 신경세포는 메트포민 무처리 대비 신경돌기(neurite)의 길이가 증가된 것인 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 메트포민 전처리된 중간엽 줄기세포는 신경세포 분화 유도 배지에서 2~6시간 동안 추가로 배양되는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화를 촉진시키는 방법.
  5. (a) 골수 유래 중간엽 줄기세포를 메트포민이 4~6mM의 농도로 포함된 배지에서 20~28시간 동안 전처리하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 메트포민 전처리 중간엽 줄기세포를 9~11 %(v/v) 소태아혈청, 8~12 ng/ml 섬유아세포 증식인자 및 400~600μM β-머캅토에탄올을 포함하는 전-유도 배지에서 20~28시간 동안 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 배양된 전-유도된 중간엽 줄기세포를 80~120μM 부틸 하이드록시아니솔 및 1~3 %(v/v) 디메틸설폭사이드를 포함하는 신경세포 분화 유도 배지에서 2~6시간 배양하여 신경세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화를 촉진시키는 방법으로서,
    상기 신경세포는 메트포민 무처리 대비 신경돌기(neurite)의 길이가 증가된 것인 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항 또는 제5항에 있어서, 상기 방법은 분화된 세포가 목적하는 세포로 분화되었는지 여부를 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화를 촉진시키는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 판정은 분화된 세포가 신경세포 특이적 유전자의 mRNA 또는 단백질을 발현하는지 여부를 확인함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화를 촉진시키는 방법.
  10. 4~6mM의 농도의 메트포민(metformin)을 유효성분으로 포함하는, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)의 신경돌기(neurite)의 길이가 증가된 신경세포로의 분화 촉진용 배지 조성물.
KR1020170058661A 2017-05-11 2017-05-11 메트포민 전처리를 통한 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화율 및 신경돌기 성장을 촉진시키는 방법 KR101927073B1 (ko)

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