KR20110139734A

KR20110139734A - 관절류머티즘 치료제

Info

Publication number: KR20110139734A
Application number: KR1020117024354A
Authority: KR
Inventors: 도모유키 이가와; 신야 이시이; 아츠히코 마에다; 미카 사쿠라이; 데츠오 고지마; 다츠히코 다치바나; 히로타케 시라이와; 히로유키 츠노다; 요시노부 히구치
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2009-03-19
Filing date: 2010-03-19
Publication date: 2011-12-29
Also published as: WO2010107108A1; RU2524152C2; TWI457134B; KR101314880B1; JP4809930B2; JPWO2010107108A1; RU2011142183A; JP2011219478A; TW201034685A

Abstract

CDR영역 아미노산 서열의 개변, 가변영역 아미노산 서열의 개변, 정상영역 아미노산 서열의 개변을 적절히 조합함으로써 TOCILIZUMAB보다 우수한 항원중화능, 약물동태(혈장 중 체류성), 면역원성, 안전성, 물성이 개선된 항IL-6 수용체 항체를 유효성분으로 하는 관절류머티즘(류마티스 관절염), 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료제의 창제에 성공하였다.

Description

관절류머티즘 치료제{Rheumatoid arthritis treatment agent}

본 발명은, 항IL-6 수용체 항체를 유효성분으로서 함유하는 관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료제에 관한 것이다.

IL-6는 다양한 기능을 갖는 사이토카인으로, T세포, B세포, 단구, 섬유아세포, 골아세포, 케라티노사이트, 내피세포, 메산기움세포, 활막세포 등의 다양한 타입의 세포로부터 생산된다(비특허문헌 1, 2). IL-6는 IL-6 수용체와 결합하고, 또한 IL-6/IL-6 수용체 복합체가 gp130과 결합함으로써 세포 내에 시그날이 전달된다(비특허문헌 3). IL-6 수용체에는 막형과 가용형의 2종류가 존재하나, 가용형 IL-6 수용체도 IL-6/IL-6 수용체 복합체를 형성할 수 있어, gp130과 결합하여 시그날을 전달시키는 것이 가능하다.

관절류머티즘(RA)은, 다발하는 관절염과 진행성 관절파괴를 주증상으로 하고, 관절외 증상으로서 폐, 신장, 피하조직 등에도 병소가 퍼지는 원인불명의 전신성 염증질환이다. 다양한 전신 징후가 존재하나, RA의 본질은 지속적인 활막염으로, 연골파괴 및 골미란의 원인이 되는 활막염 및 속발하는 관절기능의 파괴가, 질환의 특징적 소견이다. RA의 경우는 관절의 혈관이 증가되어, 혈관 내로부터 관절 활막조직에 림프구, 마크로파지 등의 백혈구가 유주(遊走)한다. 관절 국소에서 면역응답이 일어나, 림프구나 마크로파지가 생산하는 사이토카인의 작용에 의해 염증반응이 유발되어, 연골·뼈의 파괴가 진행한다.

RA의 경우는, 혈침(血沈)의 항진, CRP의 상승, 혈소판 수의 증가, 다중클론 면역글로불린의 증가, 또는 류머티즘 인자가 확인되어, 이들에 IL-6의 관여가 시사되고 있다. RA 환자의 혈청 중 및 관절액 중의 IL-6 농도가 높은 값을 나타내, 이 IL-6 레벨과 RA의 질환 활동성이 상관하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 4-6). 또한, 활막조직으로부터의 IL-6의 생산도 항진되어 있는 것이 확인되어 있다(비특허문헌 7). 더욱이, IL-6는 가용성 IL-6 수용체의 공존하에서 파골 전구세포의 파골세포로의 분화를 촉진하여, 골흡수에도 관여하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 8). 이들은, 관절 파괴에 IL-6 및 가용성 IL-6 수용체가 관여하고 있는 것을 시사하고 있고, 실제로, RA 환자의 관절액 중에서는, 가용성 IL-6 수용체 농도도 높은 값을 나타내, IL-6를 포함하여, 그 농도는 인 비트로(in vitro)에서 파골세포를 유도하는데 충분한 양으로 되어 있다(비특허문헌 9). 이상과 같이 IL-6는, RA의 병태에 있어서, 항체 생산·림프구 침윤·판누스(pannus) 형성·관절 파괴·급성기 반응·빈혈 등 다양한 작용에 관여하고 있는 것으로 생각되고 있다(비특허문헌 10). 최근 들어, 세포 IL-6R과 가용형 IL-6 수용체 양쪽에 결합하여 IL-6 시그날을 저해할 수 있는 인간화 항IL-6R 항체 토실리즈맵(TOCILIZUMAB)의 RA에서의 우수한 임상시험 결과가 명확해져, IL-6 수용체를 저해하는 것이 RA의 치료에 매우 효과적인 수단인 것이 나타내어져 있다(비특허문헌 10).

또한, TOCILIZUMAB은 RA 이외에, 소아 만성 관절염, 캐슬만씨병의 치료에도 유효한 것이 알려져 있다.

또한, 본 출원의 발명에 관련된 선행기술문헌정보를 이하에 나타낸다.

Kishimoto T. The biology of interleukin-6. Blood 1989;74:1-10. Guerne PA, Zuraw BL, Vaughan JH, Carson DA, Lotz M. Synovium as a source of interleukin 6 in vitro. Contribution to local and systemic manifestations of arthritis. J Clin Invest 1989;83:585-92. Nishimoto N, Kishimoto T. Interleukin 6: from bench to bedside. Nature Clinical Practice Rheumatology 2006;11:19-26. Hirano T, Matsuda T, Turner M, Miyasaka N, Buchan G, Tang B, Sato K, Shimizu M, Maini R, Feldmann M, Kishimoto T: Excessive production of interleukin 6/B cell stimulatory factor-2 in rheumatoid arthritis. European Journal of Immunology 1988; 18: 1797-1801. Houssiau FA, Devogelaer JP, Van Damme J, De Deuxchaisnes CN, Van Snick J: Interleukin-6 in synovial fluid and serum of patients with rheumatoid arthritis and other inflammatory arthritides. Arthritis & Rheumatism. 1988; 31: 784-788. Madhok R, Crilly A, Watson J, Capell HA. Serum interleukin 6 levels in rheumatoid arthritis: correlations with clinical and laboratory indices of disease activity. Ann Rheum Dis 1993;52:232-4. Sack U, Kinne RW, Marx T, Heppt P, Bender S, Emmrich F: Interleukin-6 in synovial fluid is closely associated with chronic synovitis in rheumatoid arthritis. Rheumatolology International 1993;13:45-51. Tamura T, Udagawa N, Takahashi N, Miyaura C, Tanaka S, Yamada Y, Koishihara Y, Ohsugi Y, Kumaki K, Taga T, Kishimoto T, Suda T: Soluble interleukin-6 receptor triggers osteoclast formation by interleukin 6. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA 1993; 90: 11924-11928. Kotake S, Sato K, Kim KJ, Takahashi N, Udagawa N, Nakamura I, Yamaguchi A, Kishimoto T, Suda T, Kashiwazaki S: Interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptors in the synovial fluids from rheumatoid arthritis patients are responsible for osteoclast-like cell formation. Journal of Bone & Mineral Research 1996; 11: 88-95. Inhibiting interleukin-6 in rheumatoid arthritis. Choy E. Curr Rheumatol Rep. 2008 Oct;10(5):413-7.

본 발명은, 이러한 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은, 항IL-6 수용체 항체를 유효성분으로서 함유하는 관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료제를 제공하는 것이다. 보다 구체적으로는, 관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료제로서 사용되고 있는 Tocilizumab의 아미노산을 치환함으로써, 항원중화능, 약물동태(혈장 중 체류성), 면역원성, 안전성, 물성이 개선된 항IL-6 수용체 항체를 유효성분으로 하는 관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료제를 제공한다.

본 발명자들은, 관절류머티즘(류마티스 관절염), 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료제로서 사용되고 있는 Tocilizumab의 아미노산을 치환함으로써, 항원중화능, 약물동태(혈장 중 체류성), 면역원성, 안전성, 물성이 개선된 항IL-6 수용체 항체를 얻었다. 그리고 당해 항IL-6 수용체 항체를 유효성분으로서 함유하는 약제가, 관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료에 유용한 것을 발견하였다.

본 발명은, 보다 구체적으로는 이하의 〔1〕~〔3〕을 제공하는 것이다.

〔1〕 이하의 항체를 유효성분으로서 함유하는 관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료제;

(a) 서열번호:1(VH3-M73의 CDR1)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:2(VH3-M73의 CDR2)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:3(VH3-M73의 CDR3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체,

(b) 서열번호:4(VL3의 CDR1)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:5(VL3의 CDR2)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:6(VL3의 CDR3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체,

(c) 서열번호:1(VH3-M73의 CDR1)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:2(VH3-M73의 CDR2)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:3(VH3-M73의 CDR3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 중쇄, 및 서열번호:4(VL3의 CDR1)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:5(VL3의 CDR2)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:6(VL3의 CDR3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.

〔2〕 이하의 항체를 유효성분으로서 함유하는 관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료제;

(a) 서열번호:7(VH3-M73의 가변영역)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체,

(b) 서열번호:8(VL3의 가변영역)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체,

(c) 서열번호:7(VH3-M73의 가변영역)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 중쇄, 및 서열번호:8(VL3의 가변영역)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.

〔3〕 이하의 항체를 유효성분으로서 함유하는 관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료제;

(a) 서열번호:9(VH3-M73)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체,

(b) 서열번호:10(VL3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체,

(c) 서열번호:9(VH3-M73)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 서열번호:10(VL3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체.

더욱이 본 발명은, 이하를 제공한다.

〔4〕이하의 항체를 투여하는 공정을 포함하는, 관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료방법;

〔5〕이하의 항체를 투여하는 공정을 포함하는, 관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료방법;

〔6〕이하의 항체를 투여하는 공정을 포함하는, 관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료방법;

〔7〕이하의 항체의 관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료제의 제조에 있어서의 사용;

〔8〕이하의 항체의 관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료제의 제조에 있어서의 사용;

〔9〕이하의 항체의 관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료제의 제조에 있어서의 사용;

〔10〕관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료방법에 사용하기 위한, 이하의 항체;

〔11〕관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료방법에 사용하기 위한, 이하의 항체;

〔12〕관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료방법에 사용하기 위한, 이하의 항체;

본 발명에 의해 얻어진 항IL-6 수용체 항체를 유효성분으로서 함유하는 관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료제는, 항원중화능, 약물동태(혈장 중 체류성), 면역원성, 안전성, 물성이 개선됨으로써 투여빈도를 적게 할 수 있어, 지속적으로 치료효과를 발휘할 수 있다.

도 1은 TOCILIZUMAB과 Fv4-M73을 게잡이원숭이에 1 ㎎/㎏으로 투여했을 때의 항체의 혈장 중 농도추이를 나타내는 도면이다.
도 2는 TOCILIZUMAB과 Fv4-M73을 게잡이원숭이에 1 ㎎/㎏으로 투여했을 때의 CRP의 혈장 중 농도추이를 나타내는 도면이다.
도 3은 TOCILIZUMAB과 Fv4-M73을 게잡이원숭이에 1 ㎎/㎏으로 투여했을 때의 비결합형 가용형 IL-6 수용체율의 혈장 중 농도추이를 나타내는 도면이다.
도 4는 TOCILIZUMAB과 Fv4-M73에 의한 인간 RA 환자 유래 활막세포로부터의 MCP-1 생산억제작용을 나타내는 도면이다.
도 5는 TOCILIZUMAB과 Fv4-M73에 의한 인간 RA 환자 유래 활막세포로부터의 VEGF 생산억제작용을 나타내는 도면이다.

본 발명은, 이하의 항체를 유효성분으로서 함유하는 관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료제에 관한 것이다.

(a) 서열번호:1(VH3-M73의 CDR1)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1,

서열번호:2(VH3-M73의 CDR2)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2,

서열번호:3(VH3-M73의 CDR3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3

를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체,

(b) 서열번호:4(VL3의 CDR1)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1,

서열번호:5(VL3의 CDR2)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2,

서열번호:6(VL3의 CDR3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3

를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체, 또는

(c) 서열번호:1(VH3-M73의 CDR1)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1,

서열번호:3(VH3-M73의 CDR3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 중쇄, 및

서열번호:4(VL3의 CDR1)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1,

서열번호:5(VL3의 CDR2)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2,

서열번호:6(VL3의 CDR3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.

또한 본 발명은, 이하의 항체를 유효성분으로서 함유하는 관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료제에 관한 것이다.

(b)서열번호:8(VL3의 가변영역)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체, 또는

(b) 서열번호:10(VL3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체, 또는

또한 본 발명은, 전술한 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 항체에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산(통상, 30 아미노산 이내, 바람직하게는 10 아미노산 이내, 더욱 바람직하게는 5 아미노산 이내, 보다 바람직하게는 3 아미노산 이내)이 개변(치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등) 또는 수식된 아미노산 서열을 갖는 항체를 제공한다. 이러한 아미노산 서열이 개변 또는 수식된 항체는 바람직하게는 원래의 항체와 동등한 활성(항원결합활성, 항원중화활성 등)을 갖는다.

또한, 본 발명의 항체에서 사용되는 항체는, 이중 특이성 항체여도 된다. 이중 특이성 항체란, 상이한 에피토프를 인식하는 가변영역을 동일한 항체분자 내에 갖는 항체를 말한다. 본 발명에 있어서, 이중 특이성 항체는 IL-6 수용체 분자 상의 상이한 에피토프를 인식하는 이중 특이성 항체여도 되고, 한쪽의 항원결합부위가 IL-6 수용체를 인식하고, 다른 쪽의 항원결합부위가 다른 물질을 인식하는 이중 특이성 항체로 하는 것도 가능하다. IL-6 수용체를 인식하는 본 발명의 항체로 되는 이중 특이성 항체의 다른 쪽의 항원결합부위가 결합하는 항원으로서는, 예를 들면, IL-6, TNFα, TNFR1, TNFR2, CD80, CD86, CD28, CD20, CD19, IL-1α, IL-β, IL-1R, RANKL, RANK, IL-17, IL-17R, IL-23, IL-23R, IL-15, IL-15R, BlyS, lymphotoxinα, lymphotoxinβ, LIGHT ligand, LIGHT, VLA-4, CD25, IL-12, IL-12R, CD40, CD40L, BAFF, CD52, CD22, IL-32, IL-21, IL-21R, GM-CSF, GM-CSFR, M-CSF, M-CSFR, IFN-alpha, VEGF, VEGFR, EGF, EGFR, CCR5, APRIL, APRILR 등을 들 수 있다.

본 발명의 항체에 사용되는 FR은 특별히 한정되지 않고, 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하다. 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 인간 유래의 FR이 사용된다. FR은 천연의 서열로부터 아미노산이 개변되어 있어도 된다.

본 발명의 항체에 사용되는 정상영역은 특별히 한정되지 않고, 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하다. 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 인간 유래의 정상영역이 사용된다. 정상영역은 천연의 서열로부터 아미노산이 개변되어 있어도 된다.

전술한 본 발명의 항체는, 항원중화능, 약물동태(혈장 중 체류성), 면역원성, 안전성 및/또는 물성이 우수한 항IL-6 수용체 항체로, 관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료제로서 매우 유용하다.

본 발명의 항체는 당업자에게 공지의 방법으로 제조하는 것이 가능하다.

예를 들면, 본 발명의 항체를 코드하는 유전자를 제작하고, 그 유전자를 적당한 벡터에 삽입하여, 이것을 숙주에 도입하고, 유전자 재조합 기술을 사용하여 생산시키는 것이 가능하다(예를 들면, Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 참조).

따라서, 본 발명은, 본 발명의 항체를 코드하는 유전자가 도입된 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 공정을 포함하는, 본 발명의 항체를 제조하는 방법을 제공한다.

보다 구체적으로는, 이하의 공정을 포함하는 본 발명의 항체의 제조방법을 제공한다.

(a) 본 발명의 항체를 코드하는 유전자가 도입된 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 공정,

(b) 당해 유전자에 의해 코드되는 항체를 취득하는 공정.

구체적으로는, 포유류세포를 사용한 생산의 경우, 상용되는 유용한 프로모터, 발현되는 항체 유전자, 그의 3'측 하류에 폴리A 시그날을 기능적으로 결합시킨 DNA 또는 그것을 포함하는 벡터에 의해 발현시킬 수 있다. 예를 들면 프로모터/인핸서로서는, 인간 사이토메갈로바이러스 전기 프로모터/인핸서(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)를 들 수 있다.

또한, 그 밖에 본 발명에서 사용되는 항체 발현에 사용할 수 있는 프로모터/인핸서로서, 레트로바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 원숭이 바이러스 40(SV40) 등의 바이러스 프로모터/인핸서나 인간 연장인자 1α(HEF1α) 등의 포유류세포 유래의 프로모터/인핸서를 사용하는 것이 가능하다.

예를 들면, SV40 프로모터/인핸서를 사용하는 경우, 멀리간(Mulligan) 등의 방법(Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277, 108-114), 또한, HEF1α 프로모터/인핸서를 사용하는 경우, 미즈시마(Mizushima) 등의 방법(Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)에 따르면 용이하게 실시할 수 있다.

대장균을 사용한 생산의 경우, 상용되는 유용한 프로모터, 항체 분비를 위한 시그날 서열, 발현시키는 항체 유전자를 기능적으로 결합시켜서 발현시킬 수 있다. 예를 들면 프로모터로서는, lacZ 프로모터, araB 프로모터를 들 수 있다. lacZ 프로모터를 사용하는 경우, 워드(Ward) 등의 방법(Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341, 544-546;Ward, E. S. et al. FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB 프로모터를 사용하는 경우, 베터(Better) 등의 방법(Better, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043)에 따르면 된다.

항체 분비를 위한 시그날 서열로서는, 대장균의 페리플라즘으로 생산시키는 경우, pelB 시그날 서열(Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383)을 사용하면 된다. 페리플라즘으로 생산된 항체를 분리한 후, 항체의 구조를 적절히 리폴드(refold)하여 사용한다(예를 들면, WO96/30394를 참조).

복제 기원으로서는, SV40, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스(BPV) 등의 유래의 것을 사용할 수 있고, 또한, 숙주세포계에서 유전자 카피 수 증폭을 위해, 발현 벡터는 선택 마커로서, 아미노글리코시드 트랜스페라아제(APH) 유전자, 티미딘 키나아제(TK) 유전자, 대장균 크산틴구아닌 포스포리보실 트랜스페라아제(Ecogpt) 유전자, 디히드로엽산 환원효소(dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항체의 제조를 위해, 임의의 생산계를 사용할 수 있다.

항체 제조를 위한 생산계는, 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo)의 생산계가 있다. 인 비트로의 생산계로서는, 진핵세포를 사용하는 생산계나 원핵세포를 사용하는 생산계를 들 수 있다.

진핵세포를 사용하는 경우, 동물세포, 식물세포, 또는 진균세포를 사용하는 생산계가 있다. 동물세포로서는, (1) 포유류세포, 예를 들면, CHO, COS, 골수종, BHK(baby hamster kidney), HeLa, Vero 등, (2) 양서류세포, 예를 들면, 아프리카발톱개구리 난모세포, 또는 (3) 곤충세포, 예를 들면, sf9, sf21, Tn5 등이 알려져 있다. 식물세포로서는, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 유래의 세포가 알려져 있어, 이것을 캘러스 배양하면 된다. 진균세포로서는, 효모, 예를 들면, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 예를 들면 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사상균, 예를 들면 아스퍼질러스(Aspergillus)속, 예를 들면 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 등이 알려져 있다.

원핵세포를 사용하는 경우, 세균세포를 사용하는 생산계가 있다. 세균세포로서는, 대장균(E.coli), 고초균이 알려져 있다.

이들 세포에, 목적으로 하는 항체 유전자를 형질전환에 의해 도입하고, 형질전환된 세포를 인 비트로에서 배양함으로써 항체가 얻어진다. 배양은, 공지의 방법에 따라 행한다. 예를 들면, 배양액으로서, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM을 사용할 수 있고, 소 태아 혈청(FCS) 등의 혈청 보액을 병용하는 것도 가능하다. 또한, 항체 유전자를 도입한 세포를 동물의 복강 등으로 옮김으로써, 인 비보에서 항체를 생산해도 된다.

한편, 인 비보의 생산계로서는, 동물을 사용하는 생산계나 식물을 사용하는 생산계를 들 수 있다. 동물을 사용하는 경우, 포유류동물, 곤충을 사용하는 생산계 등이 있다.

포유류동물로서는, 염소, 돼지, 양, 마우스, 소 등을 사용할 수 있다(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). 또한, 곤충으로서는, 누에를 사용할 수 있다. 식물을 사용하는 경우, 예를 들면 담배를 사용할 수 있다.

이들 동물 또는 식물에 항체 유전자를 도입하고, 동물 또는 식물의 체내에서 항체를 생산시켜, 회수한다. 예를 들면, 항체 유전자를 염소 β 카제인과 같은 유즙 중에 고유하게 생산되는 단백질을 코드하는 유전자의 도중에 삽입하여 융합 유전자로서 조제한다. 항체 유전자가 삽입된 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편을 염소의 배(胚)로 주입하고, 이 배를 암컷의 염소에 도입한다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 형질전환 염소 또는 그의 자손이 생산하는 유즙으로부터 목적하는 항체를 얻는다. 형질전환 염소로부터 생산되는 목적하는 항체를 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해서, 적절히 호르몬을 형질전환 염소에 사용해도 된다(Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

또한, 누에를 사용하는 경우, 목적의 항체 유전자를 삽입한 베큘로바이러스를 누에에 감염시키고, 이 누에의 체액으로부터 목적하는 항체를 얻는다(Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594). 또한, 담배를 사용하는 경우, 목적의 항체 유전자를 식물 발현용 벡터, 예를 들면 pMON530에 삽입하고, 이 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 박테리아에 도입한다. 이 박테리아를 담배, 예를 들면 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)에 감염시키고, 본 담배의 잎으로부터 목적하는 항체를 얻는다(Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol.(1994)24, 131-138).

전술한 바와 같이 인 비트로 또는 인 비보의 생산계로 항체를 생산하는 경우, 항체 중쇄(H쇄) 또는 경쇄(L쇄)를 코드하는 DNA를 따로 따로 발현 벡터에 삽입하여 숙주를 동시 형질전환시켜도 되고, 또는 H쇄 및 L쇄를 코드하는 DNA를 단일 발현 벡터에 삽입하여, 숙주를 형질전환시켜도 된다(국제특허출원 공개번호 WO 94-11523 참조).

상기와 같이 생산, 발현된 항체는, 세포 내외, 숙주로부터 분리하여 균일하게까지 정제할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항체의 분리, 정제는 친화성 크로마토그래피에 의해 행할 수 있다. 친화성 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로서는, 예를 들면, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다. 프로테인 A 칼럼에 사용하는 담체로서, 예를 들면, HyperD, POROS, SepharoseF.F. 등을 들 수 있다. 기타, 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 되고, 조금도 한정되는 것은 아니다.

예를 들면, 상기 친화성 크로마토그래피 이외의 크로마토그래피, 필터, 한외여과, 염석, 투석 등을 적절히 선택, 조합하면, 본 발명에서 사용되는 항체를 분리, 정제할 수 있다. 크로마토그래피로서는, 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 겔 여과 등을 들 수 있다. 이들 크로마토그래피는 HPLC(High performance liquid chromatography)에 적용할 수 있다. 또한, 역상 HPLC(reverse phase HPLC)를 사용해도 된다.

상기에서 얻어진 항체의 농도 측정은, 흡광도의 측정 또는 ELISA 등에 의해 행할 수 있다. 즉, 흡광도의 측정에 의한 경우에는, PBS(-)로 적당히 희석한 후, 280 nm의 흡광도를 측정하여, 1 ㎎/㎖를 1.35 OD로서 산출한다. 또한, ELISA에 의한 경우는 이하와 같이 측정할 수 있다. 즉, 0.1 M 중탄산 완충액(pH 9.6)으로 1 ㎍/㎖로 희석한 염소 항인간 IgG(TAG 제조) 100 ㎕를 96웰 플레이트(Nunc 제조)에 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하여, 항체를 고상화한다. 블로킹 후, 적절히 희석한 본 발명에서 사용되는 항체 또는 항체를 포함하는 샘플, 또는 표품으로서 인간 IgG(CAPPEL 제조) 100 ㎕를 첨가하고, 실온에서 1시간 인큐베이션한다.

세정 후, 5000배 희석한 알칼리 포스파타아제 표지 항인간 IgG(BIO SOURCE 제조) 100 ㎕를 첨가하고, 실온에서 1시간 인큐베이트한다. 세정 후, 기질용액을 첨가하고 인큐베이션 후, MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad 제조)을 사용하여 405 nm에서의 흡광도를 측정해서, 목적 항체의 농도를 산출한다.

본 발명에서 사용되는 항체의 IL-6 시그날 전달 저해활성은, 통상 사용되는 당업자에게 공지의 방법으로 평가할 수 있다. 예를 들면, IL-6 의존성 인간 골수종주(S6B45, KPMM2), 인간 린네르트 T림프종 세포주 KT3, 또는 IL-6 의존성 세포MH60.BSF2를 배양하고, 이것에 IL-6를 첨가하는 동시에 IL-6 저해제를 공존시킴으로써 IL-6 의존성 세포의 ³H-티미딘 흡수를 측정하면 된다. 또한, IL-6 수용체 발현세포인 U266을 배양하고, ¹²⁵I 표지 IL-6를 첨가하는 동시에 IL-6 저해제를 첨가함으로써, IL-6 수용체 발현세포에 결합한 ¹²⁵I 표지 IL-6를 측정하는 방법이어도 된다. 상기 어세이계에 있어서, IL-6 저해제를 존재시키는 군에 더하여 IL-6 저해제를 포함하지 않는 음성 대조군을 두고, 양자에서 얻어진 결과를 비교하면 IL-6 저해제의 IL-6 저해활성을 평가할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항체는, 본 발명에 적합하게 사용될 수 있는 한, 항체의 단편이나 그의 수식물이어도 된다. 예를 들면, 항체의 단편으로서는, Fab, F(ab')2, Fv 또는 H쇄와 L쇄의 Fv를 적당한 링커로 연결시킨 싱글 체인 Fv(scFv), sc(Fv)2 등을 들 수 있다.

또한 본 발명에서 사용되는 항체는, 항체의 수식물로서, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 사용하는 것도 가능하다. 본 발명에서 말하는 「항체」에는 이들의 항체 수식물도 포함된다. 이러한 항체 수식물을 얻기 위해서는, 얻어진 항체에 화학적인 수식을 행함으로써 얻을 수 있다. 이들 방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다.

인간화 항인간 IL-6 수용체 항체인 Tocilizumab은, 관절류머티즘, 소아 만성 관절염(예를 들면, 다관절에 활동성을 갖는 약년성 돌발성 관절염, 전신성 약년성 돌발성 관절염), 캐슬만씨병의 치료약으로서 일본에서 승인되어 있다.

전술한 본 발명의 항체는, Tocilizumab의 아미노산을 개변함으로써, 항원중화능, 혈중동태, 면역원성, 안전성, 물성이 개선된 항체이다. 따라서, 전술한 본 발명의 항체는 당연히 Tocilizumab과 동일한 치료효과를 가지고 있어, 관절류머티즘, 소아 만성 관절염, 캐슬만씨병의 치료제로서 사용하는 것이 가능하다.

본 발명의 치료제는, 의약품의 형태로 투여하는 것이 가능하여, 경구적 또는 비경구적으로 전신 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 예를 들면, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하주사, 좌약, 주장(注腸), 경구성 장용제 등을 선택할 수 있고, 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 투여방법을 선택할 수 있다. 유효 투여량은, 통상, 1회 체중 1 ㎏당 0.01 ㎎~100 ㎎의 범위에서 선택된다. 또는, 통상, 환자당 1~1000 ㎎, 바람직하게는 50~250 ㎎의 투여량을 선택할 수 있다. 바람직한 투여량에 대해서도 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하다.

본 발명의 치료제에는, 보존제나 안정제 등의 제제상 허용 가능한 담체가 첨가되어 있어도 된다. 제제상 허용 가능한 담체란, 그 자체가 상기의 치료효과를 갖는 재료여도 되고, 당해 치료효과를 갖지 않는 재료여도 되며, 상기 치료제와 함께 투여 가능한 재료를 의미한다. 또한, 치료효과를 갖지 않는 재료이나, 항체와 병용함으로써 상승적 도는 상가적인 안정화 효과를 갖는 재료여도 된다.

제제상 허용되는 재료로서는, 예를 들면, 멸균수나 생리식염수, 안정제, 부형제, 완충제, 방부제, 계면활성제, 킬레이트제(EDTA 등), 결합제 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 계면활성제로서는 비이온 계면활성제를 들 수 있고, 예를 들면 소르비탄 모노카프릴레이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트 등의 소르비탄 지방산 에스테르; 글리세린 모노카프릴레이트, 글리세린 모노미리스테이트, 글리세린 모노스테아레이트 등의 글리세린 지방산 에스테르; 데카글리세릴 모노스테아레이트, 데카글리세릴 디스테아레이트, 데카글리세릴 모노리놀레이트 등의 폴리글리세린 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리올레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리스테아레이트 등의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 소르비트 테트라스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비트 테트라올레이트 등의 폴리옥시에틸렌 소르비트 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 글리세릴 모노스테아레이트 등의 폴리옥시에틸렌 글리세린 지방산 에스테르; 폴리에틸렌글리콜 디스테아레이트 등의 폴리에틸렌글리콜 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르 등의 폴리옥시에틸렌 알킬에테르; 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌프로필에테르, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌세틸에테르 등의 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌알킬에테르; 폴리옥시에틸렌 노닐페닐에테르 등의 폴리옥시에틸렌 알킬페닐에테르; 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유(폴리옥시에틸렌 수소 피마자유) 등의 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유; 폴리옥시에틸렌 소르비트 밀랍 등의 폴리옥시에틸렌 밀랍 유도체; 폴리옥시에틸렌 라놀린 등의 폴리옥시에틸렌 라놀린 유도체; 폴리옥시에틸렌 스테아르산 아미드 등의 폴리옥시에틸렌 지방산 아미드 등의 HLB6~18을 함유하는 것 등을 전형적인 예로서 들 수 있다.

또한, 계면활성제로서는 음이온 계면활성제도 들 수 있고, 예를 들면 세틸황산나트륨, 라우릴황산나트륨, 올레일황산나트륨 등의 탄소원자수 10~18의 알킬기를 갖는 알킬 황산염; 폴리옥시에틸렌 라우릴 황산나트륨 등의, 에틸렌옥시드의 평균 부가 몰수가 2~4이고, 알킬기의 탄소원자수가 10~18인 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 황산염; 라우릴설폰숙신산 에스테르나트륨 등의, 알킬기의 탄소원자수가 8~18인 알킬설포숙신산 에스테르염; 천연계의 계면활성제, 예를 들면 레시틴, 글리세로 인지질; 스핑고미엘린 등의 스핑고 인지질; 탄소원자수 12~18의 지방산의 수크로오스 지방산 에스테르 등을 전형적인 예로서 들 수 있다.

본 발명의 치료제에는, 이들 계면활성제의 1종 또는 2종 이상을 조합해서 첨가할 수 있다. 본 발명의 제제에서 사용하는 바람직한 계면활성제는, 폴리소르베이트 20, 40, 60 또는 80 등의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르이고, 폴리소르베이트 20 및 80이 특히 바람직하다. 또한, 폴록사머(플루로닉 F-68(등록상표) 등)로 대표되는 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌글리콜도 바람직하다.

계면활성제의 첨가량은 사용하는 계면활성제의 종류에 따라 상이하나, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80 또는 폴록사머 188의 경우에서는, 일반적으로는 0.0001~10%(w/v)이고, 바람직하게는 0.001~5%이며, 더욱 바람직하게는 0.005~3%이다.

본 발명에 있어서 완충제로서는, 인산, 구연산 완충액, 초산, 말산, 타르타르산, 숙신산, 락트산, 인산칼륨, 글루콘산, 카프릴산, 데옥시콜산, 살리실산, 트리에탄올아민, 푸마르산 등 다른 유기산 등, 또는, 탄산 완충액, 트리스 완충액, 히스티딘 완충액, 이미다졸 완충액 등을 들 수 있다.

또한 용액제제의 분야에서 공지인 수성 완충액에 용해함으로써 용액제제를 조제해도 된다. 완충액의 농도는 일반적으로는 1~500 mM이고, 바람직하게는 5~100 mM이며, 더욱 바람직하게는 10~20 mM이다.

또한, 본 발명의 치료제는, 기타 저분자량의 폴리펩티드, 혈청 알부민, 젤라틴이나 면역 글로불린 등의 단백질, 아미노산, 다당 및 단당 등의 당류나 탄수화물, 당알코올을 포함하고 있어도 된다.

본 발명에 있어서 아미노산으로서는, 염기성 아미노산, 예를 들면 아르기닌, 리신, 히스티딘, 오르니틴 등, 또는 이들 아미노산의 무기염(바람직하게는, 염산염, 인산염의 형태, 즉 인산 아미노산)을 들 수 있다. 유리(遊離) 아미노산이 사용되는 경우, 바람직한 pH값은, 적당한 생리적으로 허용되는 완충물질, 예를 들면 무기산, 특히 염산, 인산, 황산, 초산, 포름산 또는 이들 염의 첨가에 의해 조정된다. 이 경우, 인산염의 사용은, 특히 안정한 동결건조물이 얻어지는 점에서 특히 유리하다. 조제물이 유기산, 예를 들면 말산, 타르타르산, 구연산, 숙신산, 푸마르산 등을 실질적으로 함유하지 않는 경우 또는 대응하는 음이온(말산 이온, 타르타르산 이온, 구연산 이온, 숙신산 이온, 푸마르산 이온 등)이 존재하지 않는 경우에, 특히 유리하다. 바람직한 아미노산은 아르기닌, 리신, 히스티딘, 또는 오르니틴이다. 추가로, 산성 아미노산, 예를 들면 글루타민산 및 아스파라긴산, 및 그의 염의 형태(바람직하게는 나트륨염) 또는 중성 아미노산, 예를 들면 이소류신, 류신, 글리신, 세린, 트레오닌, 발린, 메티오닌, 시스테인, 또는 알라닌, 또는 방향족 아미노산, 예를 들면 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 또는 유도체의 N-아세틸트립토판을 사용하는 것도 가능하다.

본 발명에 있어서, 다당 및 단당 등의 당류나 탄수화물로서는, 예를 들면 덱스트란, 글루코오스, 푸룩토오스, 락토오스, 크실로오스, 만노오스, 말토오스, 수크로오스, 트레할로오스, 라피노오스 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 당알코올로서는, 예를 들면 만니톨, 소르비톨, 이노시톨 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제를 주사용 수용액으로 하는 경우에는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 기타 보조약(예를 들면, D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨)을 포함하는 등장액과 혼합할 수 있다. 또한 그 수용액은 적당한 용해 보조제(예를 들면 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌글리콜, PEG 등), 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트 80, HCO-50) 등)와 병용해도 된다.

목적하는 바에 따라 추가로 희석제, 용해 보조제, pH 조정제, 무통화제, 황 함유 환원제, 산화방지제 등을 함유해도 된다.

본 발명에 있어서, 황 함유 환원제로서는, 예를 들면, N-아세틸시스테인, N-아세틸호모시스테인, 티옥트산, 티오디글리콜, 티오에탄올아민, 티오글리세롤, 티오소르비톨, 티오글리콜산 및 그의 염, 티오황산나트륨, 글루타티온, 및 탄소원자수 1~7의 티오알칸산 등의 설푸히드릴기를 갖는 것 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서 산화방지제로서는, 예를 들면, 에리소르빈산, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, α-토코페롤, 초산 토코페롤, L-아스코르빈산 및 그의 염, L-아스코르빈산 팔미테이트, L-아스코르빈산 스테아레이트, 아황산수소나트륨, 아황산나트륨, 몰식자산트리아밀, 몰식자산프로필 또는 에틸렌디아민 사초산 이나트륨(EDTA), 피로인산나트륨, 메타인산나트륨 등의 킬레이트제를 들 수 있다.

또한, 필요에 따라, 마이크로캡슐(히드록시메틸셀룰로오스, 젤라틴, 폴리[메틸메타크릴산] 등의 마이크로캡슐)에 봉입하거나, 콜로이드 드러그 딜리버리 시스템(리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐 등)으로 하는 것도 가능하다("Remington's Pharmaceutical Science 16^th edition", Oslo Ed., 1980 등 참조). 또한, 약제를 서방성의 약제로 하는 방법도 공지이므로, 본 발명에 적용할 수 있다(Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105; 미국특허 제3,773,919호; 유럽특허 출원공개(EP) 제58,481호; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556; EP 제133,988호). 또한, 본 약제에 히알루로니다아제를 첨가 또는 혼합함으로써 피하에 투여하는 액량을 증가시키는 것도 가능하다(예를 들면, WO2004/078140 등).

사용되는 제제상 허용 가능한 담체는, 제형에 따라 상기 중에서 적절히 또는 조합하여 선택되나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은, 본 발명의 치료제를 대상에 투여하는 공정을 포함하는, 관절류머티즘, 소아 만성 관절염, 캐슬만씨병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 「대상」이란, 본 발명의 치료제를 투여하는 생물체, 그 생물체 체내의 일부분을 말한다. 생물체는, 특별히 한정되는 것은 아니나, 동물(예를 들면, 인간, 가축동물종, 야생동물)을 포함한다. 상기 「생물체 체내의 일부분」에 대해서는 특별히 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 「투여한다」는 것은, 경구적, 또는 비경구적으로 투여하는 것이 포함된다. 경구적인 투여로서는, 경구제라는 형태로의 투여를 들 수 있고, 경구제로서는, 과립제, 산제, 정제, 캡슐제, 용제, 유제, 또는 현탁제 등의 제형을 선택할 수 있다

비경구적인 투여로서는, 주사제라는 형태로의 투여를 들 수 있고, 주사제로서는, 정맥 주사제, 피하 주사제, 근육 주사제, 또는 복강내 주사제 등을 들 수 있다. 또한, 투여해야 하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 유전자 치료의 수법을 사용하여 생체에 도입함으로써, 본 발명의 방법의 효과를 달성할 수 있다. 또한, 본 발명의 약제를, 처치를 행하고자 하는 영역에 국소적으로 투여하는 것도 가능하다. 예를 들면, 수술 중의 국소 주입, 카테터의 사용, 또는 본 발명의 펩티드를 코드하는 DNA의 표적화 유전자 송달에 의해 투여하는 것도 가능하다.

본 발명의 치료제의 대상으로의 투여는, 질환의 증상이 나타난 후여도 되고, 증상이 나타나기 전에 예방적으로 투여되어도 된다.

또한 본 발명은, 본 발명의 항체의, 관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료제의 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다. 또한 관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료방법에 사용하기 위한본 발명의 항체에 관한 것이다.

또한, 본 발명에서 기재되어 있는 아미노산 서열에 포함되는 아미노산은 번역 후에 수식(예를 들면, N 말단의 글루타민의 피로글루타밀화에 의한 피로글루타민산으로의 수식은 당업자에게 잘 알려진 수식이다)을 받는 경우도 있으나, 그와 같이 아미노산이 번역 후 수식된 경우여도 당연히 본 발명에서 기재되어 있는 아미노산 서열에 포함된다.

또한 결합하는 당쇄의 구조는 어떠한 구조여도 된다. EU 넘버링의 297번째의 당쇄는 어떠한 당쇄 구조여도 되고(바람직하게는 푸코실화된 당쇄), 또한 당쇄가 결합되어 있지 않아도 된다(예를 들면 대장균에서 생산하는, 또는 EU 넘버링의 297번째에 당쇄가 결합하지 않도록 개변함으로써 가능).

또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은, 참조로써 본 명세서에 포함된다.

실시예

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.

〔실시예 1〕항인간 IL-6 수용체 항체의 원숭이 PK/PD 시험

TOCILIZUMAB(H쇄 WT-IgG1/서열번호:13, L쇄 WT-kappa/서열번호:14) 및, TOCILIZUMAB의 항원중화능, 혈중동태, 면역원성, 안전성 및 물성을 개선하는 것을 목적으로 TOCILIZUMAB에 아미노산 치환 등을 도입한 Fv4-M73(H쇄 VH3-M73/서열번호:9, L쇄 VL3-kappa/서열번호:10)을 당업자 공지의 방법으로 발현·정제를 행하여(방법은 참고예 참조), 그들의 관절류머티즘의 치료약으로서의 효과를 이하와 같이 검토하였다.

TOCILIZUMAB 및 Fv4-M73을 게잡이원숭이에 1 ㎎/㎏으로 정맥내에 단회 투여하고 혈장 중 농도추이를 평가하였다(방법은 참고예 참조). TOCILIZUMAB 및 Fv4-M73의 정맥내 투여 후의 혈장 중 농도추이를 도 1에 나타내었다. 그 결과, Fv4-M73은 TOCILIZUMAB과 비교하여 게잡이원숭이에 있어서 약물동태가 대폭으로 개선되었다.

게잡이원숭이 막형 IL-6 수용체가 어느 정도 중화되어 있는지의 약효를 평가하기 위해, 항체 투여 6일째부터 18일재(TOCILIZUMAB에 관해서는 3일째부터 10일째)까지 게잡이원숭이 IL-6 5 ㎍/㎏을 요배부(腰背部)에 연일 피하투여하고, 24시간 후의 각 개체의 CRP 농도를 측정하였다(방법은 참고예 참조). 각 항체 투여시의 CRP 농도추이를 도 2에 나타내었다. 게잡이원숭이 가용형 IL-6 수용체가 어느 정도 중화되어 있는지의 약효를 평가하기 위해, 게잡이원숭이 혈장 중의 비결합형 게잡이원숭이 가용형 IL-6 수용체 농도를 측정하여, 비결합형 가용형 IL-6 수용체율을 계산하였다(방법은 참고예 참조). 각 항체 투여시의 비결합형 가용형 IL-6 수용체율의 추이를 도 3에 나타내었다.

Fv4-M73은 TOCILIZUMAB과 비교하여 게잡이원숭이 막형 IL-6 수용체를 보다 지속적으로 중화하여, CRP의 증가를 장기간 억제하였다. 또한, Fv4-M73은 TOCILIZUMAB과 비교하여 게잡이원숭이 가용형 IL-6 수용체를 보다 지속적으로 중화하여, 비결합형 게잡이원숭이 가용형 IL-6 수용체의 증가를 장기간 억제하였다. 이로부터 막형 IL-6 수용체 및 가용형 IL-6 수용체의 중화 지속성에 관해서는, Fv4-M73은 TOCILIZUMAB보다도 우수한 것이 발견되었다.

〔실시예 2〕

Monocyte chemoattractant protein(MCP)-1은 단구·T세포·NK세포·basophil의 세포 침윤에 관여하는 것이 알려져 있다. MCP-1은 RA 환자의 활막조직·활액 중에서 고발현하고 있는 것이 보고되어 있어(J Clin Invest. 1992 Sep;90(3):772-9), RA의 병태에 관여하고 있는 것으로 생각되고 있다(Inflamm Allergy Drug Targets. 2008 Mar;7(1):53-66.).

또한, VEGF는 강력한 혈관신생인자로, RA 환자의 활막 중의 마크로파지·섬유아세포·활막세포 등으로부터 생산되는 것이 알려져 있다(J Rheumatol. 1995 Sep;22(9):1624-30.). 또한, RA 환자 혈청 중의 VEGF 레벨과 질환 활동성이나 radiographic progression이 상관하여(Arthritis Rheum. 2003 Jun;48(6):1521-9., Arthritis Rheum. 2001 Sep;44(9):2055-64.), RA 환자를 항IL-6R 항체 TOCILIZUMAB으로 치료함으로써, 혈청 중의 VEGF 레벨이 저하되는 것으로부터, VEGF도 RA의 병태에 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 생각되고 있다(Mod Rheumatol. 2009;19(1):12-9., Mediators Inflamm. 2008;2008:129873).

이에, TOCILIZUMAB 및 Fv4-M73은 sIL-6R 및 IL-6 자극에 의한 인간 RA 환자 유래 활막세포로부터의 MCP-1 및 VEGF 생산을 억제할 수 있는지 여부를 이하의 방법으로 검토하였다.

인간 RA 환자 유래 활막세포(TOYOBO)를 5% FCS 함유 IMDM 배지에서 96웰 플레이트에 2×10⁴/0.05 mL/well로 파종하고, CO₂ 인큐베이터(37℃, 5% CO₂) 중에서 90분 정치하였다. 적절히 희석한 농도의 TOCILIZUMAB 및 Fv4-M73을 0.05 mL 첨가하고, 15분 정치 후에 가용형 IL-6 수용체(SR344:참고예의 방법에 따라 조제)를 0.05 mL 첨가하여 추가적으로 30분 정치하고, 추가적으로 IL-6(TORAY)를 0.05 mL 첨가하였다(가용형 IL-6 수용체 및 IL-6의 종농도는 각 50 ng/mL). 2일 배양 후, 배양상청을 회수하고, 배양상청 중의 MCP-1 및 VEGF 농도를 ELISA kit(Biosource 및 Pierce Biotechnology)를 사용해서 측정하였다. 결과를 도 4와 도 5에 나타낸다. TOCILIZUMAB 및 Fv4-M73은, 가용형 IL-6 수용체 및 IL-6 자극에 의한 인간 RA 환자 유래 활막세포로부터의 MCP-1 및 VEGF 생산을 농도 의존적으로 억제하였다.

이들 사실로부터, Fv4-M73은 항IL-6 수용체 중화 항체로서 작용(IL-6 수용체에 결합하여 막형 IL-6 수용체 및 가용형 IL-6 수용체의 시그날을 차단)의 지속성이 TOCILIZUMAB과 비교하여 매우 우수하여, TOCILIZUMA과 비교하여 투여빈도 및 투여량을 대폭 저감시키는 것이 가능하고, 또한 Fv4-M73은 인간 RA 환자 유래 활막세포로부터의 MCP-1 및 VEGF 생산을 억제하는 것으로부터, Fv4-M73은 RA에 매우 유용한 치료약인 것이 나타내어졌다.

<참고예>

재조합 가용형 인간 IL-6 수용체의 조제

항원인 인간 IL-6 수용체의 제조합 가용형 인간 IL-6 수용체는 이하와 같이 조제하였다. J.Biochem. 108, 673-676 (1990)에서 보고되어 있는 N 말단측 1번째에서 344번째의 아미노산 서열로 되는 가용형 인간 IL-6 수용체(Yamasaki 등, Science 1988；241：825-828 (GenBank # X12830))의 CHO세포 정상(定常) 발현주를 제작하였다. SR344 발현 CHO세포로부터 얻어진 배양상청으로부터, Blue Sepharose 6 FF 칼럼 크로마토그래피, SR344에 대한 특이 항체를 고정한 칼럼에 의한 친화성 크로마토그래피, 겔 여과 칼럼 크로마토그래피의 3개의 칼럼 크로마토그래피에 의해, 가용형 인간 IL-6 수용체를 정제하였다. 메인 피크로서 용출된 분획을 최종 정제품으로 하였다.

재조합 가용형 게잡이원숭이 IL-6 수용체(cIL-6R)의 조제

공개되어 있는 붉은털 원숭이(Rhesus monkey) IL-6 수용체 유전자서열(Birney et al, Ensembl 2006, Nucleic Acids Res. 2006 Jan 1;34(Database issue):D556-61.)을 토대로 올리고 DNA 프라이머를 제작하고, 게잡이원숭이 췌장으로부터 조제된 cDNA를 주형으로 하여, 프라이머를 사용해, PCR법에 의해 게잡이원숭이 IL-6 수용체 유전자 전장을 코드하는 DNA 단편을 조제하였다. 얻어진 DNA 단편을 동물세포 발현 벡터로 삽입하고, 이를 사용하여 CHO 정상 발현주(cyno. sIL-6R 생산 CHO세포)를 제작하였다. cyno. sIL-6R 생산 CHO세포의 배양액을 HisTrap 칼럼(GE 헬스케어 바이오사이언스)으로 정제 후, Amicon Ultra-15 Ultracel-10k(Millipore)를 사용하여 농축하고, Superdex200pg16/60 겔 여과 칼럼(GE 헬스케어 바이오사이언스)으로 추가적으로 정제를 행하여, 가용형 게잡이원숭이 IL-6 수용체(이하, cIL-6R)의 최종 정제품으로 하였다.

재조합 게잡이원숭이 IL-6(cIL-6)의 조제

게잡이원숭이 IL-6는 이하와 같이 조제하였다. SWISSPROT Accession No.P79341에 등록되어 있는 212 아미노산을 코드하는 염기서열을 제작하고, 동물세포 발현 벡터로 클로닝하여, CHO세포에 도입함으로써 정상 발현 세포주를 제작하였다(cyno. IL-6 생산 CHO세포). cyno. IL-6 생산 CHO세포의 배양액을 SP-Sepharose/FF 칼럼(GE 헬스케어 바이오사이언스)으로 정제 후, Amicon Ultra-15 Ultracel-5k(Millipore)를 사용하여 농축하고, Superdex75pg26/60 겔 여과 칼럼(GE 헬스케어 바이오사이언스)으로 추가적으로 정제를 행하여, Amicon Ultra-15 Ultracel-5k(Millipore)를 사용해서 농축하여, 게잡이원숭이 IL-6(이하, cIL-6)의 최종 정제품으로 하였다.

TOCILIZUMAB의 변이체의 제작·발현·정제

목적의 항체 서열을 코드하는 플라스미드 단편을 동물세포 발현 벡터에 삽입하여, 목적의 H쇄 발현 벡터 및 L쇄 발현 벡터를 제작하였다. 얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정하였다. 항체의 발현은 이하의 방법을 사용해서 행하였다. 인간 태아 신장암 세포 유래 HEK293H주(Invitrogen)를 10% Fetal Bovine Serum(Invitrogen)을 포함하는 DMEM 배지(Invitrogen)로 현탁하고, 5~6×10⁵개/mL의 세포밀도로 접착세포용 디쉬(직경 10 ㎝, CORNING)의 각 디쉬로 10 mL씩 파종하고 CO₂ 인큐베이터(37℃, 5% CO₂) 내에서 하루 배양한 후에, 배지를 흡인 제거하고, CHO-S-SFM-II(Invitrogen) 배지 6.9 mL를 첨가하였다. 조제한 플라스미드를 리포펙션법(lipofection method)에 의해 세포로 도입하였다. 얻어진 배양상청을 회수한 후, 원심분리(약 2000 g, 5분간, 실온)하여 세포를 제거하고, 추가적으로 0.22 ㎛ 필터 MILLEX(R)-GV(Millipore)를 통과시켜 멸균하여 배양상청을 얻었다. 얻어진 배양상청으로부터 rProtein A Sepharose^TM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 항체를 정제하였다. 정제 항체농도는, 분광광도계를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 얻어진 값으로부터 PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 사용하여 항체농도를 산출하였다(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423).

원숭이 PK/PD 시험에 의한 항체 혈장 중 농도, CRP 농도, 비결합형 가용형 IL-6 수용체의 측정

게잡이원숭이 혈장 중 농도측정은 ELISA법으로 당업자 공지의 방법으로 측정하였다. CRP 농도는 사이어스 R CRP(간토 화학 주식회사)로, 자동분석장치(TBA-120FR, 도시바 메디컬시스템즈 주식회사)를 사용하여 측정하였다. 게잡이원숭이 혈장 중의 비결합형 가용형 게잡이원숭이 IL-6 수용체 농도를 이하와 같이 측정하였다. 게잡이원숭이의 혈장 30 μL를 0.22 ㎛의 필터컵(Millipore)에 있어서 건조시킨 적량의 rProtein A Sepharose Fast Flow(GE Healthcare) 수지에 첨가함으로써 혈장 중에 존재하는 모든 IgG형 항체(게잡이원숭이 IgG, 항인간 IL-6 수용체 항체 및 항인간 IL-6 수용체 항체-가용형 게잡이원숭이 IL-6 수용체 복합체)를 Protein A에 흡착시켰다. 그 후, 고속원심기로 스핀다운하고, 패스용액을 회수하였다. 패스용액에는 protein A에 결합한 항인간 IL-6 수용체 항체-가용형 게잡이원숭이 IL-6 수용체 복합체는 포함되지 않기 때문에, protein A 패스용액 중의 가용형 게잡이원숭이 IL-6 수용체 농도를 측정함으로써, 비결합형 가용형 IL-6 수용체 농도를 측정 가능하다. 가용형 게잡이원숭이 IL-6 수용체 농도는, 상기에서 제작한 가용형 게잡이원숭이 IL-6 수용체(cIL-6R)를 스탠다드로 사용하여, 인간 IL-6 수용체 농도를 측정하는 당업자 공지의 방법으로 측정하였다. 비결합형 가용형 IL-6 수용체율은 이하의 계산식에 의해 계산하였다.

SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> THERAPEUTIC AGENTS FOR RHEUMATOID ARTHRITIS <130> C1-A0903P <150> JP 2009-067358 <151> 2009-03-19 <160> 14 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized polypeptide sequence <400> 1 His Asp His Ala Trp Ser 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized polypeptide sequence <400> 2 Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Gln Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized polypeptide sequence <400> 3 Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized polypeptide sequence <400> 4 Gln Ala Ser Thr Asp Ile Ser Ser His Leu Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized polypeptide sequence <400> 5 Tyr Gly Ser His Leu Leu Ser 1 5 <210> 6 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Ser Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Thr Asp Ile Ser Ser His 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Gly Ser His Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly Asn Arg Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu 100 105 <210> 9 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized polypeptide sequence <400> 9 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp 20 25 30 His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr 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Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 <210> 10 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized polypeptide sequence <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Thr Asp Ile Ser Ser His 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Gly Ser His Leu Leu 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Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 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Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims

이하의 항체를 유효성분으로서 함유하는 관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료제;
(a) 서열번호:1(VH3-M73의 CDR1)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:2(VH3-M73의 CDR2)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:3(VH3-M73의 CDR3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체,
(b) 서열번호:4(VL3의 CDR1)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:5(VL3의 CDR2)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:6(VL3의 CDR3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체,
(c) 서열번호:1(VH3-M73의 CDR1)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:2(VH3-M73의 CDR2)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:3(VH3-M73의 CDR3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 중쇄, 및 서열번호:4(VL3의 CDR1)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호:5(VL3의 CDR2)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 서열번호:6(VL3의 CDR3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
이하의 항체를 유효성분으로서 함유하는 관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료제;
(a) 서열번호:7(VH3-M73의 가변영역)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체,
(b)서열번호:8(VL3의 가변영역)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체,
(c) 서열번호:7(VH3-M73의 가변영역)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 중쇄, 및 서열번호:8(VL3의 가변영역)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
이하의 항체를 유효성분으로서 함유하는 관절류머티즘, 소아 만성 관절염 또는 캐슬만씨병의 치료제;
(a) 서열번호:9(VH3-M73)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체,
(b) 서열번호:10(VL3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체,
(c) 서열번호:9(VH3-M73)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 서열번호:10(VL3)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체.