KR20110124305A

KR20110124305A - 미네랄로코르티코이드 수용체 길항제 및 사용 방법

Info

Publication number: KR20110124305A
Application number: KR1020117021231A
Authority: KR
Inventors: 데이빗 앤드류 코아트스; 콘스탄티노스 가바디나스; 프라바카 콘다지 자드하브
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2009-03-12
Filing date: 2010-03-04
Publication date: 2011-11-16
Also published as: AU2010222902B2; MX2011009506A; CN102333773B; CA2751901A1; US20110312954A1; CA2751901C; KR101312179B1; EA019179B1; EP2406252A1; BRPI1009257A2; ES2542001T3; CN102333773A; US8658638B2; JP2012520302A; EA201171125A1; JP5570536B2; EP2406252B1; AU2010222902A1; WO2010104721A1

Abstract

본 발명은 하기 화학식의 화합물 I:
<화학식 I>

또는 그의 제약상 허용되는 염; 적합한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 화합물 I을 포함하는 제약 조성물; 및 화합물 I 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는 생리학적 장애, 특히 울혈성 심부전, 고혈압, 당뇨병성 신장병증 또는 만성 신장 질환의 치료 방법을 제공한다.

Description

미네랄로코르티코이드 수용체 길항제 및 사용 방법 {MINERALOCORTICOID RECEPTOR ANTAGONIST AND METHODS OF USE}

본 발명은 치료제로서 유용한 트리시클릭 화합물, 상기 화합물을 포함하는 제약 조성물, 환자의 생리학적 장애를 치료하기 위해 상기 화합물을 이용하는 방법, 및 화합물의 합성에 유용한 중간체 및 방법에 관한 것이다.

중요한 내인성 미네랄로코르티코이드인 알도스테론은 미네랄로코르티코이드 수용체 (MR)와의 상호작용에 따라 나트륨 및 물 재흡수 및 칼륨 배출을 촉진한다. 전해질 및 물 균형을 유지하는데 있어서 알도스테론의 역할로 인해, MR 길항제는 고혈압, 저칼륨혈증, 심근 부정맥, 바터 증후군, 뿐만 아니라 원발성 또는 속발성 고알도스테론혈증, 예컨대 콘 증후군을 비롯한 다수의 생리학적 장애를 치료하는데 사용되어 왔다. 보다 최근에는, MR 길항제는 울혈성 심부전 및 급성 심근경색을 치료하는데 사용되었다. 또한 MR 길항제는 신장 질환의 전임상 모델에서, 그리고 신장 장애, 예컨대 당뇨병성 신장병증을 비롯한 만성 신장 질환을 겪고 있는 환자에서 단백뇨를 감소시키기 위한 표준 요법과 함께 조합되었을때 효과적인 것으로 입증되었다.

그러나, 현존하는 스테로이드성 MR 길항제는 그의 안전성 및/또는 유효성을 제한하는 수반 효과를 야기한다. 예를 들어, 스피로놀락톤은 비선택적이며, 다른 생리학적 과정을 매개하는 다른 핵 호르몬 수용체 (예를 들어, 안드로겐 수용체 (AR), 프로게스테론 수용체 (PR) 또는 글루코코르티코이드 수용체 (GR))와 교차 반응한다. 스피로놀락톤 요법은 또한 고칼륨혈증 뿐만 아니라 여성형유방, 발기부전, 성욕 감소, 불규칙한 월경, 뿐만 아니라 위 불쾌감과 관련이 있다. 에플레레논은 다른 핵 호르몬 수용체에 비해 MR에 대해 선택적이지만, 역시 고칼륨혈증과 관련이 있다. 따라서, 당업계에서는 현재의 MR 길항제 요법을 대신할 것에 대한 필요가 여전히 존재한다.

본 발명의 목적은 MR 길항제 활성을 보유한 비스테로이드성 MR 리간드를 제공하는 것이다. 보다 특히, AR, PR, 및 GR에 비해 더 큰 친화도로 MR에 결합하는 비스테로이드성 MR 길항제를 제공하는 것이 목적이다. 보다 특정한 실시양태로서, 본 발명의 목적은 AR, PR, 및 GR에 비해 더 큰 친화도로 MR에 결합하고, 강력한 신보호 또는 심장보호 활성을 보유한 비스테로이드성 MR 길항제를 제공하는 것이다. 보다 더 특정한 실시양태로서, AR, PR, 및 GR에 비해 더 큰 친화도로 MR에 결합하고, 강력한 신보호 또는 심장보호 활성을 보유하지만, 고칼륨혈증을 유발하는 정도 또는 가능성이 낮은 비스테로이드성 MR 길항제를 제공하는 것이 목적이다.

트리시클릭 MR 리간드가 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, WO 04/052847 및 WO 05/066161은 미네랄로코르티코이드 수용체 또는 글루코코르티코이드 수용체 조절에 영향을 받기 쉬운 장애를 치료하는데 유용한 트리시클릭 스테로이드 호르몬 수용체 조절제를 개시한다. 본 발명은 미네랄로코르티코이드 수용체 길항제 요법에 반응하는 장애를 치료 또는 예방하는데 있어서 유용성이 있음을 보여주는 시험관내 및 생체내 활성 프로파일을 갖는, 하기 화합물 I로 제시되는 특정 디벤조옥세핀에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물, (5-((E)-(3-플루오로디벤조[b,e]옥세핀-11(6H)-일리덴)메틸)-1-((7R,8aR)-헥사히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]옥사진-7-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2(3H)-온) 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다:

<화합물 I>

특정 실시양태로서, 본 발명은 결정질 형태의 화합물 I 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 화합물 I 또는 그의 제약상 허용되는 염의 유효량을 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 울혈성 심부전, 당뇨병성 신장병증, 만성 신장 질환, 고혈압, 저칼륨혈증, 심근 부정맥, 바터 증후군, 원발성 또는 속발성 고알도스테론혈증 또는 콘 증후군의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 보다 특정한 측면으로서, 본 발명은 화합물 I 또는 그의 제약상 허용되는 염의 유효량을 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 울혈성 심부전, 고혈압, 당뇨병성 신장병증 또는 만성 신장 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 요법에 사용하기 위한 화합물 I 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 추가로, 본 발명은 울혈성 심부전, 당뇨병성 신장병증, 만성 신장 질환, 고혈압, 저칼륨혈증, 심근 부정맥, 바터 증후군, 원발성 또는 속발성 고알도스테론혈증, 또는 콘 증후군을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 화합물 I 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 보다 특히, 본 발명은 울혈성 심부전, 고혈압, 당뇨병성 신장병증 또는 만성 신장 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 화합물 I 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 울혈성 심부전, 당뇨병성 신장병증, 만성 신장 질환, 고혈압, 저칼륨혈증, 심근 부정맥, 바터 증후군, 원발성 또는 속발성 고알도스테론혈증, 또는 콘 증후군의 치료 또는 예방용 의약을 제조하기 위한 화합물 I 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다. 보다 특히, 본 발명은 울혈성 심부전, 고혈압, 당뇨병성 신장병증 또는 만성 신장 질환의 치료 또는 예방용 의약을 제조하기 위한 화합물 I 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제와 함께 화합물 I 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 보다 특히, 본 발명은 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 화합물 I 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는, 울혈성 심부전, 고혈압, 당뇨병성 신장병증 또는 만성 신장 질환을 치료 또는 예방하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 화합물 I을 합성하는데 유용한 신규한 중간체 및 방법을 포함한다.

본 발명은 화합물 I의 제약상 허용되는 염 뿐만 아니라 화합물 I의 용매화물, 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다. 따라서, 본원에서 사용될 때, 용어 "화합물 I"은 그의 의미 내에 당해 화합물의 임의의 용매화물을 포함한다. 제약상 허용되는 염 및 그의 제조 방법의 예는 당업자의 지식 범위 내에 있다. 예를 들어, 문헌 [Stahl et al., "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use," VCHA/Wiley-VCH, (2002)]; [Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986)]; 및 [Bastin et al., "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities," Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000)]을 참조한다. 화합물 I의 토실레이트 염을 특별히 언급하지만, 화합물 I의 유리 염기가 바람직함을 이해해야 한다.

용어 "R" 및 "S"는 유기 화학에서 통상 사용되는 바와 같이 키랄 중심의 특정 배위를 표시하는 것으로 본원에서 사용된다. 용어 "(±)", "R/S" 또는 "RS"는 키랄 중심의 라세미 배위를 지칭한다. 우선순위의 일부 목록 및 입체화학에 대한 논의는 문헌 ["Nomenclature of Organic Compounds: Principles and Practice", (J.H. Fletcher, et al., eds., 1974)]에 기재되어 있다. 본원에서 사용된 바와 같은, 표시 "

"은 페이지 면 앞을 향해 돌출된 결합을 나타내고, 표시 "

"은 페이지 면 뒤를 향해 돌출된 결합을 나타낸다.

당업자에게 인식되어질 바와 같이, 탄소-탄소 또는 탄소-질소 이중 결합을 함유하는 분자는 기하 이성질체로서 존재할 수 있다. 이중 결합된 원자의 각각에 부착된 기가 동일한지 또는 상이한지에 따라 특정 이성질체를 지칭하는데 2 가지 방법, "시스-트랜스" 방법 및 "E 및 Z" 방법이 흔히 이용된다. 기하 이성질현상 및 특정 이성질체의 명명에 관한 논의는 문헌 [March, "Advanced Organic Chemistry", John Wiley & Sons, 1992, Chapter 4]에서 확인된다.

화합물 I은 제약 조성물의 일부로서 제제화될 수 있다. 따라서, 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 화합물 I 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물은 본 발명의 중요한 실시양태이다. 제약 조성물 및 그의 제조 방법의 예는 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro, et al., eds., 19^th ed., Mack Publishing (1995))]을 참조한다. 화합물 I을 포함하는 예시적 조성물로는, 예를 들어 0.5％ 카르복시 메틸셀룰로스, 0.25％ 폴리소르베이트 80 및 2.7％ NaCl을 함유하는 현탁액 중의 화합물 I; 또는 1％ 카르복시 메틸셀룰로스 및 0.25％ 폴리소르베이트 80을 함유하는 현탁액 중의 화합물 I; 정제수 중의 1％ 카르복시 메틸셀룰로스, 0.25％ 폴리소르베이트 80, 및 0.05％ 소포제 1510™을 함유하는 현탁액 중의 화합물 I; 정제수 중의 1％ 나트륨 카르복시 메틸셀룰로스, 0.25％ 폴리소르베이트 80, 및 0.05％ 소포제 1510™을 함유하는 현탁액 중의 화합물 I (제트 분쇄된 것); 정제수 중의 1％ 히드록시에틸셀룰로스, 10％ 비타민 E TPGS (d-알파-토코페릴 폴리에틸렌 글리콜 1000 숙시네이트), 및 0.05％ 소포제 1510™을 함유하는 현탁액 중의 화합물 I (제트 분쇄된 것); 정제수 중의 10％ 비타민 E TPGS 및 0.05％ 소포제 1510™을 함유하는 현탁액 중의 화합물 I (제트 분쇄된 것); 및 20％ 캅티솔®, 25 mM 포스페이트 완충제 (pH 약 2) 및 1 eq. HCl을 함유하는 용액 중의 화합물 I (15 mg/ml)이 포함된다. 그러나, 본 발명의 바람직한 조성물은 캡슐 또는 정제로 제제화된 화합물 I 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 것임을 이해할 것이다.

화합물 I 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 I 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 조성물은 화합물을 생체이용가능하게 하는 임의의 경로, 예컨대 경구 및 비경구 경로로 투여될 수 있다. 그러나, 경구 투여가 바람직함을 이해할 것이다.

당업자는 입자 크기가 제약 작용제의 생체내 용해에 영향을 미쳐, 작용제의 흡수에 영향을 미칠 수 있음을 인식할 것이다. 본원에서 사용된 "입자 크기"는 레이저 광 산란, 레이저 회절, 미 산란(Mie scattering), 침강장 흐름 분획법, 광자 상관 분광분석법 등과 같은 통상의 기술에 의해 결정된 제약 작용제 입자의 직경을 지칭한다. 제약 작용제의 용해도가 불량한 경우, 작거나 감소된 입자 크기가 용해에 도움이 되어, 작용제의 흡수를 증가시킬 수 있다. 문헌 [Amidon et al., Pharm.Research, 12; 413-420 (1995)]. 입자 크기를 감소시키거나 제어하는 방법 (마이크로화)은 통상적이며, 볼 밀링, 핀 밀링, 제트 밀링, 습식 분쇄 등이 포함된다. 입자 크기를 제어하는 또 다른 방법에는 제약 작용제를 나노현탁액으로 제조하는 것이 포함된다. 본 발명의 특정 실시양태는 화합물 I 또는 화합물 I의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 I 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물을 포함하며, 여기서 상기 화합물 또는 염은 약 10 ㎛ 미만의 d90 입자 크기를 갖는다 (즉, 입자의 90％의 크기가 이 보다 작거나 동일함).

당업자는 치료제가 특정 물리적 특성을 보유하는 것이 바람직함을 인식할 것이다. 특히, 안정한 결정질 고체인 작용제는 화학적 합성, 정제, 보관 및 제제화 또는 투여 형태 개발의 종래 패러다임에 특히 적합하므로 바람직하다. 본원에서 사용된 "결정질 형태" 또는 "결정 형태"는 화학 종의 결정질 제제를 지칭한다.

특정 결정 형태는 특성화될 수 있고, 따라서 X 선 분말 회절 (XRPD), 분광계법 (예를 들어 적외선 (IR) 또는 핵 자기 공명 (NMR) 분광분석법), 및 열 기술 (예를 들어 시차 주사 열량계 (DSC), 열 중력 분석 (TGA), 또는 시차 열 분석 (DTA))을 비롯한 종래의 기술에 의해 동일한 화학 종의 다른 고체 형태와 구분될 수 있다. XRPD는 화학 종의 결정 형태를 특성화하는데 특히 유용한 수단이지만, X 선 패턴에서의 실제 피크 강도는 분석 대상인 샘플 및 이용하는 기기, 용매 또는 절차에 따라서 동일한 결정 형태의 분석마다 다를 수 있음이 인식될 것이다. 또한, 주어진 결정 형태의 분석으로부터 수득한 정확한 피크 위치 (°2θ로 측정됨)는 분석마다 다를 수 있지만 (예를 들어 ±0.1°), 피크 위치의 상대적 패턴은 본질적으로 스펙트럼 사이에 동일하게 남을 것임이 이해될 것이다.

본 발명은 결정질 형태의 화합물 I을 제공한다. 보다 특히, 본 발명은 약 10.5, 13.0, 15.5, 및 19.7의 °2θ에서 특징적인 피크를 갖는 결정질 형태의 화합물 I의 유리 염기 (본원의 실시예에서의 유리 염기 형태 I)를 제공한다. 또한, 본 발명은 약 11.3, 12.1, 18.8, 및 21.0의 °2θ에서 특징적인 피크를 갖는 결정질 형태의 화합물 I의 유리 염기 (본원의 실시예에서의 유리 염기 형태 II)를 제공한다.

본원에서 사용된 용어 "환자"는 인간, 또는 개, 고양이, 소, 원숭이, 말 또는 양과 같은 비인간 포유동물을 지칭한다. 보다 특히, 용어 "환자"는 인간을 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "치료하는" (또는 "치료하다" 또는 "치료")은 기존 증상 또는 장애의 진행 또는 심각성을 저지, 예방, 방지, 지연, 중지 또는 역전시키는 것을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "예방하는" (또는 "예방하다" 또는 "예방")은 증상 또는 장애의 유발 또는 발생을 저지, 방지 또는 억제하는 것을 지칭한다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 생리학적 장애는 "만성" 상태로서 또는 "급성" 에피소드로서 나타날 수 있다. 따라서, 장애의 치료는 급성 사건 및 만성 상태 둘 다를 고려한다. 급성 사건에서는 증상의 발병시 화합물을 투여하고, 증상이 사라지면 중단하는 반면에, 만성 상태는 질환의 경과 내내 치료한다.

본원에서 사용된 용어 "유효량"은, 환자에게 단일 또는 다중 용량 투여시에 진단 또는 치료 중인 환자에서 목적하는 효과를 제공하는 화합물 I 또는 그의 제약상 허용되는 염의 양 또는 용량을 지칭한다. 유효량은 수많은 인자, 예컨대 포유동물의 종; 그의 크기, 연령 및 전반적인 건강; 구체적인 관련 질환; 질환의 정도 또는 심각성; 개별 환자의 반응; 투여되는 특정 화합물; 투여 방식; 투여되는 제제의 생체이용률 특성; 선택된 투여 섭생법; 및 임의의 부수적인 의약의 사용을 고려하여 당업자로서 진단자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 방법 및 용도와 함께 사용되는 경우, 본 발명의 화합물 및 조성물은 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 특정 장애 또는 상태를 치료하는데 사용되는 통상적인 치료제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 화합물 I, 또는 화합물 I을 포함하는 조성물은 고혈압, 당뇨병성 신장병증 또는 만성 신장 질환을 치료하기 위한 통상적인 작용제, 예컨대 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제 또는 안지오텐신 수용체 차단제 (ARB 약물)와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물 또는 조성물을 조합물의 일부로서 사용하는 경우, 화합물 I 또는 화합물 I을 포함하는 조성물은 개별적으로 투여될 수 있거나, 또는 조합되는 치료제를 포함하는 제제의 일부로서 투여될 수 있다.

생물학적 활성의 결정:

본원에 사용된 "K_d"는 리간드-수용체 복합체에 대한 평형 해리 상수를 지칭하고; "K_i"는 약물-수용체 복합체에 대한 평형 해리 상수를 지칭하며, 평형에서 결합 부위의 절반에 결합하는 약물 농도의 지표이고; "K_b"는 길항제-수용체 복합체에 대한 평형 해리 상수를 지칭하고; "IC50"은 작용제에 대해 가능한 최대 억제 반응의 50％를 제공하는 상기 작용제의 농도를 지칭하거나, 또는 대안적으로 수용체에 결합하는 리간드의 50％ 대체를 제공하는 작용제의 농도를 지칭하고; "EC50"은 작용제에 대해 가능한 최대 반응의 50％를 제공하는 상기 작용제의 농도를 지칭하고; "ED50"은 작용제에 대해 최대 반응의 50％를 제공하는 투여된 치료제의 용량을 지칭한다.

A. 스테로이드 핵 호르몬 수용체 결합 검정:

인간 MR (미네랄로코르티코이드 수용체), GR (글루코코르티코이드 수용체), AR (안드로겐 수용체), 또는 PR (프로게스테론 수용체)을 과다발현하는 인간 배아 신장 HEK293 세포로부터의 세포 용해물을 수용체-리간드 경쟁 결합 검정에 사용하여, K_i 값을 결정한다.

간략하게, 스테로이드 수용체 경쟁 결합 검정은 20 mM HEPES 완충제 (pH = 7.6), 0.2 mM EDTA, 75 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 20％ 글리세롤, 20 mM 몰리브덴산나트륨, 0.2 mM DTT (디티오트레이톨), 20 ㎍/mL 아프로티닌 및 20 ㎍/mL 류펩틴 (검정 완충제)을 함유하는 완충제 중에서 수행한다. 전형적으로, 스테로이드 수용체 결합 검정은 방사선-표지된 리간드, 예컨대 MR 결합의 경우 0.25 nM [³H]-알도스테론, GR 결합의 경우 0.7 nM [³H]-덱사메타손, AR 결합의 경우 0.36 nM [³H]-메틸트리에놀론, 및 PR 결합의 경우 0.29 nM [³H]-메틸트리에놀론, 및 웰 당 20 ㎍ 293-MR 용해물, 20 ㎍ 293-GR 용해물, 22 ㎍ 293-AR 용해물, 또는 40 ㎍ 293-PR 용해물을 포함한다. 검정은 전형적으로 96-웰 포맷으로 수행한다. 경쟁 시험 화합물을 약 0.01 nM 내지 10 μM 범위의 다양한 농도로 첨가한다. 비-특이적 결합은 MR 결합의 경우 500 nM 알도스테론, GR 결합의 경우 500 nM 덱사메타손, 또는 AR 및 PR 결합의 경우 500 nM 메틸트리에놀론의 존재하에서 결정한다. 결합 반응물 (140 ㎕)을 4℃에서 밤새 인큐베이션한 다음, 70 ㎕의 빙 차콜-덱스트란 완충제 (50 mL의 검정 완충제 당 0.75 g의 차콜 및 0.25 g의 덱스트란을 함유함)를 각각의 반응물에 첨가한다. 플레이트를 4℃에서 오비탈 진탕기 상에서 8 분 동안 혼합한다. 이어서, 상기 플레이트를 4℃에서 10 분 동안 3,000 rpm하에 원심분리한다. 이어서, 120 ㎕ 분취량의 결합 반응 혼합물을 또 다른 96-웰 플레이트로 옮기고, 175 ㎕의 왈락 옵티페이즈 하이세이프 3(Wallac Optiphase Hisafe 3)™ 섬광 유체를 각각의 웰에 첨가한다. 플레이트를 밀봉하고, 오비탈 진탕기 상에서 강하게 진탕한다. 2 시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 왈락 마이크로베타(Wallac Microbeta) 계수기에서 판독한다.

데이터를 이용하여 10 μM에서의 추정 IC50 및 백분율 억제를 계산한다. MR 결합의 경우 [³H]-알도스테론, GR 결합의 경우 [³H]-덱사메타손, AR 결합의 경우 [³H]-메틸트리에놀론, 또는 PR 결합의 경우 [³H]-메틸트리에놀론에 대한 K_d를 포화 결합에 의해 결정한다. 화합물에 대한 IC50 값을 쳉-프루소프(Cheng-Prusoff) 방정식을 이용하여 K_i로 전환시킨다.

본질적으로 상기에서 기재한 바와 같은 프로토콜에 따를 때, 화합물 I은 MR 결합 검정에서 약 0.40 nM의 K_i를 나타내어, 화합물 I이 강력한 인간 MR 리간드인 것으로 입증된다. 또한, 화합물 I은 AR, GR, 및 PR 결합 검정에서 각각 약 1170 nM, 669 nM, 및 478 nM의 K_i를 나타내어, 화합물 I이 MR에 대해 선택적인 리간드인 것으로 입증된다.

B. 스테로이드 핵 호르몬 수용체 조절의 기능적 검정:

알도스테론은 미네랄로코르티코이드 수용체와의 상호작용을 통해 그의 생리학적 효과를 발휘한다. 알도스테론이 MR에 세포질 결합한 후, 리간드 수용체 복합체는 세포 핵으로 전위되고, 여기서 DNA 상의 호르몬 반응 요소에 결합하여, 표적 유전자의 발현을 개시시킨다. 본 발명의 화합물이 스테로이드 호르몬 수용체의 활성을 조절하는 (즉, 효능화, 부분 효능화, 부분 길항화, 또는 길항화) 능력을 입증하기 위해, 핵 수용체 단백질 및 호르몬 반응 요소-리포터 유전자 구축물에 의해 일시적으로 형질감염된 세포에서 표적 유전자 발현의 기능적 조절을 검출하는 생물검정을 수행한다. 기능적 검정에 사용되는 용매, 시약, 및 리간드는 상업적인 공급원으로부터 용이하게 입수되거나, 또는 당업자에 의해 제조될 수 있다.

1. 핵 호르몬 수용체 패널 스크린

인간 배아 신장 HEK293 세포를 적합한 형질감염 시약, 예컨대 퓨진(Fugene)™을 이용하여 스테로이드 호르몬 수용체 및 리포터 유전자 플라스미드로 형질감염시킨다. 간략하게, 루시페라제 리포터 cDNA의 상류에 2 카피의 프로바신 ARE 및 TK (티미딘 키나제) 프로모터를 함유하는 리포터 플라스미드를, 바이러스성 CMV (시토메갈로바이러스) 프로모터를 이용하여 인간 안드로겐 수용체 (AR)를 구성적으로 발현하는 플라스미드와 함께 HEK293 세포에 형질감염시킨다. 루시페라제 리포터 cDNA의 상류에 2 카피의 GRE 및 TK 프로모터를 함유하는 리포터 플라스미드를, 바이러스성 CMV 프로모터를 이용하여 인간 글루코코르티코이드 수용체 (GR), 인간 미네랄로코르티코이드 수용체 (MR), 또는 인간 프로게스테론 수용체 (PR)를 구성적으로 발현하는 플라스미드와 함께 형질감염시킨다. 세포를 T150 cm 플라스크에서 5％ 차콜-스트립핑 태아 소 혈청 (FBS) 함유 DMEM 배지 중에 형질감염시킨다. 밤새 인큐베이션한 후, 형질감염된 세포를 트립신 처리하고, 96 웰 디쉬에서 5％ 차콜-스트립핑 FBS 함유 DMEM 배지 중에 플레이팅하고, 4 시간 동안 인큐베이션한 다음, 약 0.01 nM 내지 10 μM 범위의 다양한 농도의 시험 화합물에 노출시킨다. 검정을 위한 길항제 모드에서, 각각의 개별 수용체에 대한 저농도의 효능제를 배지에 첨가한다 (MR의 경우 0.08 nM 알도스테론, GR의 경우 0.25 nM 덱사메타손, AR의 경우 0.66 nM 메틸트리에놀론, 및 PR의 경우 0.08 nM 프로메게스톤). 시험 화합물과 함께 24 시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 용해시키고, 표준 기술을 이용하여 루시페라제 활성을 측정한다.

데이터를 4 파라미터-대입 로지스틱 곡선에 대입하여, EC50 값을 측정한다. 백분율 효능 (포화 최대 반응을 갖는 화합물) 또는 퍼센트 최대 자극 (포화되지 않은 최대 반응을 갖는 화합물)을 하기 참고 효능제로 수득한 최대 자극과 비교해서 결정한다: MR 검정의 경우 30 nM 알도스테론, AR 검정의 경우 100 nM 메틸트리에놀론, PR 검정의 경우 30 nM 프로메게스톤, 및 GR 검정의 경우 100 nM 덱사메타손. IC50 값은 길항제 모드 검정 데이터를 이용하여 유사하게 결정한다. 길항제 모드에서, 퍼센트 억제는 저농도의 효능제 (MR의 경우 0.08 nM 알도스테론, GR의 경우 0.25 nM 덱사메타손, AR의 경우 0.66 nM 메틸트리에놀론, 및 PR의 경우 0.08 nM 프로메게스톤)의 존재 하에서의 시험 화합물 활성을 시험 화합물의 부재하에서 동일한 저농도의 효능제에 의해 제공된 반응과 비교하여 측정한다.

본질적으로 상기에서 기재한 바와 같은 프로토콜에 따를 때, 화합물 I은 MR, PR, GR, 및 AR 검정 (길항제 모드)에서 각각 약 21 nM, 924 nM, 10000 nM 초과, 및 10000 nM 초과의 IC50 값을 나타내고, 효능제 모드에서 MR, PR, GR, 및 AR의 각각에 대해 10000 nM 초과의 EC50을 나타내었다. 따라서, 화합물 I은 hMR의 선택적인 기능적 길항제이다.

2. hMR 경쟁적 길항제 검정:

인간 배아 신장 HEK293 세포를 상기의 핵 호르몬 수용체 패널 스크린에서 기재한 것과 동일한 형질감염 시약, 플라스미드, 프로모터, 리포터 구축물, 완충제 및 절차를 이용하여 인간 MR로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 트립신처리하고, 96 웰 디쉬에서 5％ 차콜-스트립핑 FBS 함유 DMEM 배지 중에 플레이팅하고, 4 시간 동안 인큐베이션한 다음, 다양한 농도 (10 희석)의 알도스테론 (약 0.001 nM 내지 0.03 μM 범위)에 노출시킨다. 알도스테론이 hMR을 효능화하는 능력을 고정된 농도의 시험 화합물의 부재 또는 존재하에서 결정하고, 표준 기술을 이용하여 루시페라제 활성을 측정함으로써 모니터링한다. 이어서, 하기 방정식을 이용하는 길항제 농도의 로그값에 대한 쉴드 분석 플롯팅 로그(Schild analysis plotting log) (용량 비율 - 1)를 이용하여 시험 화합물 K_b를 결정할 수 있다: Log (DR-1) = Log [길항제] - Log K_b (여기서 용량 비율 (DR)은 시험 화합물의 부재하에서의 알도스테론 EC50에 대한 시험 화합물의 존재하에서의 알도스테론 EC50의 비율을 나타냄).

본질적으로 상기에서 기재한 바와 같은 프로토콜에 따를 때, 화합물 I은 MR 경쟁적 길항제 검정에서 약 5.1 nM의 K_b를 나타내었으므로, 화합물 I이 인간 MR의 강력한 길항제임이 입증된다.

C. 알도스테론 매개 신장 질환의 생체내 모델

수컷 일측-신장 절제된 스프라그 돌리 래트 (240-280 g)를 임의로 이용가능한 가정용수 및 설치류 5001 식이를 제공하며 1 주 동안 개별적으로 수용하였다. 순응된 후, 기준선 24 시간 뇨 샘플을 수집하고, 총 뇨 단백질 및 크레아티닌을 분석하였다. 동물을 체중 및 기준선 뇨 단백질에 따라 연구 그룹으로 무작위화하였다. 기준선 혈청을 꼬리 절단에 의해 채취하고, 혈액 우레아 질소 (BUN), 크레아티닌, 및 전해질을 분석하였다. 기준선 샘플을 채취한 후, 대조군 그룹을 제외한 모든 래트를 연구 기간 내내 6％ 염을 함유하는 식이 및 0.3％ KCl을 함유하는 음용수로 유지시켰다. 대조군 동물은 연구 기간 내내 5001 식이 및 가정용수로 유지시키고, 알도스테론은 제공하지 않았다. 0.01％ DMSO 중의 d-알도스테론을 0.75 ㎍/h로 2.5 ㎕/h x 28 일, s.c. 전달하기 위한 알자(Alza) 미니 펌프를 이소플루란 마취하에서 비 대조군 동물 (예를 들어 시험 화합물 그룹 및 비히클 단독 그룹)에 이식하였다. 이어서 1％ 카르복시 메틸셀룰로스 (CMC)/0.25％ 폴리소르베이트 80을 포함하는 비히클 중의 시험 화합물 또는 비히클 단독을, 알도스테론을 이식하고 다음날 부터 시작하여 경구 섭식으로 매일 1회 투여하였다 (10 mL/kg). 화합물 또는 비히클 단독을 투여하고 2 및 4 주 후에 뇨 샘플을 수집하고 총 뇨 단백질 및 크레아티닌을 분석하는 것을 반복하였다. 연구 말미에, 8 시점에서 약동학 샘플을 수득하였다 (0.5, 1, 2, 3, 6, 8, 12 및 24 시간). 또한, 심장 및 신장 조직에서의 구조적 손상을 검출하기 위해, 심장 및 신장을 떼어내고, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 및 매손(Masson)의 트리크롬 염색을 위해 10％ 완충된 포르말린에 고정시킬 수 있다. 또한 혈청 BUN, 크레아티닌, 및 전해질의 추가의 분석을 위해 연구 말미에 심장 천공하여 혈청을 채취할 수 있다.

본질적으로 상기에서 기재한 바와 같은 프로토콜에 따를 때, 화합물 I은 10 mg/kg/일 x 28 일 투여했을때 뇨 단백질 배설량을 비히클 처리한 동물에 비해 약 60％ 만큼 감소시켜, 화합물 I이 강력한 생체내 신보호 활성을 갖는 것으로 입증된다.

화합물이 항고혈압제 효과를 갖는다는 것을 입증하기 위해, 하기 모델을 이용할 수 있다.

D. 알도스테론 매개 고혈압의 생체내 모델

수컷 일측-신장 절제된 스프라그 돌리 래트 (240-280 g)를 임의로 이용가능한 가정용수 및 설치류 5001 식이를 제공하며 1 주 동안 개별적으로 수용하였다. 순응된 후, 0.25 ㎍/h의 알도스테론을 2.5 ㎕/h로 최대 28 일 동안 피하 전달하기 위한 알젯(Alzet) 펌프를 동물에 이식하고, 연구 기간 내내 6％ NaCl을 함유하는 식이 및 0.3％ KCl을 함유하는 음용수로 유지시켰다. 또한, 무선추적 장치를 이식하여 동맥 혈압을 모니터링하였다. 예를 들어, 각 동물로부터의 신호를 연구 내내 매 10 분마다 샘플링하였다. 24 시간의 기간에 걸쳐 수집한 모든 값의 평균 (± SEM)은 각 동물에 대한 평균 매일 동맥압을 나타낸다. 펌프 이식 다음날에, 1％ 중등 점도 나트륨 카르복시 메틸셀룰로스/0.25％ 폴리소르베이트 80/0.05％ 소포제 1510™을 포함하는 비히클 중의 시험 화합물, 또는 비히클 단독을 경구 섭식으로 매일 1회 투여하였다 (10 mL/kg).

본질적으로 상기에서 기재한 바와 같은 프로토콜에 따를 때, 화합물 I은 (1-30 mg/kg/일) x 14 일로 매일 1회 경구투여했을때, 비히클에 비해 염의 존재하에서 알도스테론의 고혈압 효과를 용량 의존적으로 감소시켜, 화합물 I이 항고혈압제 효과를 갖는 것으로 입증된다.

화합물이 고칼륨혈증의 발생 또는 발생 가능성을 감소시킨다는 것을 입증하기 위해, 하기 모델을 이용할 수 있다.

E. 전해질 조절의 생체내 검정

수컷 스프라그 돌리 래트 (240-280 g)의 부신을 적출한 다음, 수술 후 6 일 동안 5001 설치류 식이 및 1％ NaCl 음용 용액으로 유지시켰다. 이어서, 동물을 밤새 금식시키고, 1％ 염수 음용수를 임의로 이용가능한 가정용수로 대체하였다. 연구 당일 오전에, 금식시킨 동물을 금식시킨 상태의 체중에 기초하여 처리를 위해 무작위화하였다. 대조군 동물 (예를 들어, 알도스테론 또는 시험 화합물이 제공되지 않은 동물)에게 0.5％ CMC/0.25％ 폴리소르베이트 80/2.7％ NaCl을 포함하는 시험 화합물 비히클을 경구 섭식에 의해 10 mL/kg 제공하고, 1 mL/kg의 알도스테론 비히클 (0.01％ DMSO/물)을 피하 주사에 의해 제공하였다. 비히클 동물에게 동일한 시험 화합물 비히클을 경구 섭식에 의해 제공하고, 알도스테론 3 ㎍/kg을 s.c. 제공하였다. 시험 물질을 카르복시 메틸셀룰로스/NaCl 비히클에 현탁시켰다. 시험 화합물 처리 그룹에 카르복시 메틸셀룰로스/NaCl 비히클 중에 현탁된 시험 물질 및 알도스테론 3 ㎍/kg을 s.c. 수여하였다. 투약 직후에, 동물을 가정용수에 임의로 접근가능한 대사 랙에 넣어두었다. 뇨 샘플을 용량 투여 후 5 시간째에 수집하고, 전해질 배출을 검정하였다. 데이터는 부신적출 비히클 처리 동물에 대한 로그 Na/K 배출비 또는 Na/K 비의 ％로 나타낸다. 화합물 I을 다양한 용량으로 시험하여, 어느 정도 범위의 화합물이 뇨의 Na/K 비의 증가 (증가된 혈청 칼륨 농도의 지표)를 유도하는지를 결정할 수 있다.

본질적으로 상기에서 기재한 바와 같은 프로토콜에 따를 때, 화합물 I은 30 mg/kg으로 p.o.로 투여하였을때 뇨의 Na/K 배출비를 비히클 처리 동물에 비해 약 30％ 만큼만 증가시켜, 화합물 I이 고칼륨혈증의 발생 또는 발생 가능성을 감소시킬 수 있는 것으로 입증된다.

추가의 노력없이, 당업자는 본 발명을 그의 최대 범위로 수행하는데 상기한 설명을 이용할 수 있을 것으로 여겨진다. 이하의 제조예 및 실시예는 본 발명을 추가로 상술하기 위해 제공되며, 화합물 I의 전형적인 합성법을 대표한다. 시약 및 출발 물질은 당업자가 용이하게 이용할 수 있는 것이거나, 또는 용이하게 합성할 수 있다. 당업자는 실시예에서 기재하는 절차의 적절한 변형을 바로 인식할 것이다. 본 발명의 화합물의 명칭은 일반적으로 켐드로우 울트라(ChemDraw Ultra)® 버전 10.0에서 제공되는 바와 같다.

본원에서 이용되는 바와 같이, 하기 용어는 다음과 같이 나타낸 의미를 갖는다: "DMSO"는 디메틸 술폭시드를 지칭하고; "DMAC"은 N,N-디메틸아세트아미드를 지칭하며; "tBOC" 또는 "boc"은 tert-부톡시카르보닐을 지칭하고; "TLC"는 박층 크로마토그래피를 지칭한다.

제조예 1

1-브로모-4-플루오로-2-(2-요오도-벤질옥시)-벤젠

N,N-디메틸포름아미드 (750 mL) 중의 2-요오도벤질 브로마이드 (90 g, 0.29 mol), 2-브로모-5-플루오로페놀 (57.9 g, 0.29 mol), 및 탄산칼륨 (63 g, 0.46 mol) 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 물 (1 L)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 1 시간 동안 교반하고, 고체를 여과 제거하고, 물로 세정하고, 진공 오븐 (20 mm Hg/60℃) 내에서 건조시켜, 표제 화합물을 수득하였다 (121 g, 100％ 초과).

제조예 2

3-[2-(2-브로모-5-플루오로-페녹시메틸)-페닐]-아크릴산 에틸 에스테르

1-브로모-4-플루오로-2-(2-요오도-벤질옥시)-벤젠 (117.4 g, 0.29 mol), 아세트산나트륨 (36.1 g, 0.44 mol), 테트라-n-부틸암모늄 브로마이드 (90.3 g, 0.29 mol), 팔라듐 (II) 아세테이트 (1.8 g, 8 mmol, 3 mol ％), 및 N-메틸피롤리디논 (900 mL)의 혼합물에 55-60℃에서 N-메틸피롤리디논 (200 mL) 중의 에틸 아크릴레이트 (34.3 mL, 0.32 mol) 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물 (2 L) 및 메틸 tert-부틸 에테르 (2 L)로 처리하였다. 반응물을 규조토를 통과시키고, 에틸 아세테이트 (1 L)를 첨가하고, 층을 분리시키고, 물 (2 L)로 세척하였다. 유기 부분을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성된 고체를 헥산 (1 L) 중에 현탁시키고, 2 시간 동안 냉장보관하고, 여과하고, 냉 헥산 (500 mL)으로 세척하였다. 진공 오븐 (50℃/20 mm Hg) 내에서 건조시켜, 표제 화합물을 미황색 고체로서 수득하였다 (104.4 g, 95％).

대안적 절차:

투명하고 건조된 100 갤론 반응기에 질소하에서 교반하면서 새로운 N-메틸 피롤리디논 (72 L), 아세트산나트륨 (2721 g, 33.17 mol), 1-브로모-4-플루오로-2-(2-요오도-벤질옥시)-벤젠 (9000 g, 22.11 mol) 및 테트라부틸암모늄 브로마이드 (7128 g, 22.11 mol)를 첨가하였다. 교반을 개시하고, 반응 혼합물을 완벽한 진공하에서 30 분 동안 탈기시키고, 질소로 퍼징하였다. 반응기를 질소 하의 주위 압력으로 되돌리고, 탈기 절차를 반복하였다. 팔라듐 (II) 아세테이트 (180 g, 2％/중량)를 반응 혼합물에 첨가하고, 60℃로 가열하였다. 60℃에서, 에틸 아크릴레이트 (2258 g, 22.55 mol)를 N-메틸 피롤리디논 중의 용액 (18 L)으로서 적하 깔때기를 통해 반응 혼합물에 천천히 첨가하였다. 첨가가 완료되면, 반응 혼합물을 70℃로 가열하였다. 최소 2 시간 동안 70℃에서 계속 교반하였다. 반응 혼합물의 내부 온도를 5-10℃로 조정하였다. 분리된, 투명한 적절한 크기의 반응기에 물 (225 L)을 채우고, 강한 교반을 개시하고, 내부 온도를 5℃ 이하로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 최소 1 시간에 걸쳐 강하게 교반 중인 물로 옮겼다. 생성된 현탁액을 30 분 내지 1 시간 동안 주위 온도에서 교반하였다. 폴리프로필렌 필터 패드를 통해 여과하여 연보라색 고체를 수집하였다. 여과 케이크를 물 (25 L)로 세척하고, 고무 댐을 이용하여 여과물 위를 건조시켰다. 물 (45 L)이 담긴 반응기에 고체를 다시 채우고, 현탁액을 30 분 내지 1 시간 동안 교반하였다. 폴리프로필렌 필터 패드 상에서 고체를 다시 여과하고, 여과 케이크를 물 (25 L)로 세척하였다. 고무 댐을 이용하여 여과물 위를 건조시켰다. 연보라색 물질을 건조 트레이로 옮기고, 흄 후드 내에서 최소 24 시간 동안 공기 건조시켰다. 고체를 진공하에 50℃ 미만에서 오븐 건조시켜, 표제 화합물을 수득하였다 (8.4 kg, 100％).

제조예 3

(E)-(3-플루오로-6H-디벤조[b,e]옥세핀-11-일리덴)-아세트산 에틸 에스테르

N-메틸피롤리디논 (850 mL) 중의 3-[2-(2-브로모-5-플루오로-페녹시메틸)-페닐]-아크릴산 에틸 에스테르 (94 g, 0.25 mol), 아세트산나트륨 (30 g, 0.37 mol), 테트라-n-부틸암모늄 브로마이드 (81 g, 0.25 mol), 및 팔라듐 (II) 아세테이트 (1.7 g, 7 mmol, 3 mol ％) 혼합물을 100-110℃에서 6 시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시키고, 물 (1 L)로 희석하고, 규조토를 통해 여과하고, 에틸 아세테이트 (2 L)로 세척하였다. 여과물을 분리 깔때기로 옮기고, 물 (500 mL)을 첨가하고, 층을 분리시켰다. 유기층을 물로 세척하고 (2 x 1.5 L), 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 실리카 패드를 통해 여과하고, 에틸 아세테이트 (1.5 L)로 세척하고, 건고상태로 농축시켰다. 잔류 고체에 헥산 (1 L)을 첨가하고, 2 시간 동안 냉장보관하고, 여과하고, 헥산 (500 mL)으로 세정하고, 50℃/20 mm Hg에서 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다 (64.3 g, 87％).

대안적 절차:

투명하고 건조된 100 갤론 반응기에 질소하에서 교반하면서 N-메틸 피롤리디논 (83.4 L), 아세트산나트륨 (2.706 kg, 32.98 mol), 3-[2-(2-브로모-5-플루오로-페녹시메틸)-페닐]-아크릴산 에틸 에스테르 (9.256 kg, 21.99 mol) 및 테트라부틸암모늄 브로마이드 (7.088 kg, 21.99)를 첨가하였다. 교반을 개시하고, 반응 혼합물을 완벽한 진공하에서 30 분 동안 탈기시키고, 질소로 퍼징하였다. 반응기를 질소 하의 주위 압력으로 되돌리고, 탈기 절차를 반복하였다. 팔라듐 (II) 아세테이트 (167 g, 2 중량％)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 최소 3 내지 5 시간 동안 교반하면서 반응물을 100℃ 내지 125℃로 가열하였다. 에틸 아세테이트 (100 L)를 첨가하고, 30 분 동안 교반하였다. 물 (100 L)을 첨가하고, 30 분 동안 교반하였다. 교반을 중단하고, 최소 1 시간 동안 층이 분리되게 하였다. 유기층을 수집하고, 수성층을 에틸 아세테이트로 추출하였다 (50 L에 이어, 25 L). 유기 부분을 합하고, 각각 최소 30 분 동안 교반하고 적어도 30 분간 층이 분리되게 하면서, 물 (40 L), 20％ 수성 염화나트륨 용액 (2 x 20 L)으로 세척하였다. 유기 용액을 황산마그네슘 (8.0 kg)으로 건조시키고, 최소한 1 시간 동안 교반하면서 활성탄 (2.0 kg) 및 실리카겔 60 (2.0 kg)을 첨가하였다. 고체를 여과하여 제거하였다. 여과물을 진공하에 35℃ 미만에서 건고상태로 농축시켰다. 고체 잔류물에 메탄올 (20 L)을 첨가하고, 혼합물을 50-60℃에서 투명 용액으로 가열하였다. 헵탄 (40 L)을 첨가하고, 20℃ 내지 25℃로 냉각시켰다. 추가로 반응 혼합물을 최소 3 시간에 걸쳐 -10℃로 계속해서 냉각시켰다. -10℃에서 최소 12 시간 동안 교반하였다. 생성된 고체 생성물을 여과하여 수집하고, 헵탄:메탄올의 혼합물 (75:25)로 세척하였다 (2 x 20 L). 고체를 진공 하에 40℃ 미만에서 일정 중량으로 건조시켜, 표제 화합물을 수득하였다 (3.7 kg, 64％).

대안적 절차 2:

N-메틸 피롤리딘 (250 mL) 중의 1-브로모-4-플루오로-2-(2-요오도-벤질옥시)-벤젠 (50 g, 0.123 mol), 아세트산나트륨 (30.2 g, 0.369 mol), 테트라부틸암모늄 브로마이드 (39.6 g, 0.123 mol), 및 팔라듐 아세테이트 (1 g)를 60℃로 가열하였다. N-메틸 피롤리딘 (50 mL) 중의 에틸 아크릴레이트 (12.91 g, 0.129 mol)를 20 분에 걸쳐 적가하였다. 첨가가 완료된 후, 반응 혼합물을 145℃로 3 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 규조토를 통해 여과하고, 고체를 메틸 t-부틸 에테르로 세척하였다 (2 x 150 mL). 여과물을 메틸 t-부틸 에테르 (0.5 L)로 희석하고, 물 (0.5 L)로 세척하였다. 유기층을 분리시키고, 수성층을 메틸 t-부틸 에테르로 추출하였다 (2 x 300 mL). 합한 유기층을 물로 세척하였다 (2 x 200 mL). 유기 부분을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 차콜로 처리하고, 여과하고, 고체를 메틸 t-부틸 에테르 (100 mL)로 세척하고, 농축시켰다. 잔류물을 부치(Buchi) 플라스크 내에서 55℃에서 (진공 아님) 이소프로판올 (20 mL) 중에 슬러리화하였다. 교반하면서 헵탄 (100 mL)을 첨가하였다. 짙은색의 현탁액을 밤새 냉실에 두었다. 고체를 여과하고, 냉 헵탄/이소프로판올 (9:1, 2 x 100 mL)에 이어 헵탄 (50 mL)으로 세정하고, 진공 오븐 내에서 35℃에서 일정 중량으로 건조시켜, 표제 화합물을 황갈색 분말로서 수득하였다 (22.25 g, 61％).

제조예 4

(E)-11-브로모메틸렌-3-플루오로-6,11-디히드로-디벤조[b,e]옥세핀

이소프로판올 (725 mL) 중의 (3-플루오로-6H-디벤조[b,e]옥세핀-11-일리덴)-아세트산 에틸 에스테르 (69.5 g, 0.23 mol) 현탁액에 물 (125 mL) 중의 수산화리튬 (12.0 g, 0.53 mol) 용액을 첨가하고, 4 시간 동안 70℃로 가온하였다. 혼합물을 40℃로 냉각시킨 다음, 빙초산 (0.44 mol, 25 mL)으로 처리하였다. 15 분 동안 교반한 후, N-브로모숙신이미드 (0.25 mol, 44 g)를 첨가하였다. 거품이 일었고, 온도를 45℃로 상승시켰고, 수 분 후 고체가 형성되었다. 혼합물을 40-45℃에서 1 시간 동안 교반하고, 실온으로 냉각시켰다. 물 (150 mL) 중의 중아황산나트륨 (4.5 g), 포화 수성 중탄산나트륨 (150 mL), 및 물 (450 mL)을 첨가하였다. 생성된 현탁액을 여과하고, 냉 1:1 이소프로판올/물 (300 mL)로 세정하였다. 고체를 60℃/20 mm Hg에서 밤새 건조시켜, 표제 화합물을 수득하였다 (65.8 g, 93％).

대안적 절차:

투명하고 건조된 100 갤론 반응기에 질소하에서 교반하면서, 이소프로판올 (125 L), (E)-(3-플루오로-6H-디벤조[b,e]옥세핀-11-일리덴)-아세트산 에틸 에스테르 (13.857 kg, 46.42 mol), 및 물 (54 L) 중의 수산화리튬 (3.896 kg, 92.84 mol) 용액을 채웠다. 반응 혼합물을 80℃로 가열하고, 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 40℃로 냉각시키고, 40℃ 내지 45℃에서 20 분에 걸쳐 아세트산 (5.575 kg, 92.84 mol)을 첨가하였다. 45℃ 미만에서 N-브로모숙신이미드 (48.74 mol, 8.676 kg)를 30 분에 걸쳐 일부씩 나누어 첨가하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, 최소 12 시간 동안 교반하였다. 중아황산나트륨 수용액 (약 37.7 L)을 첨가하고, 15 분 동안 교반하였다. 중탄산나트륨 수용액 (약 37.7 L)을 첨가하고, 15 분 동안 교반하였다. 물 (129 L)을 첨가하고, 30 분 동안 교반하였다. 여과하여 생성된 고체를 수집하고, 이소프로판올:물 (1:1, 2 x 20 L)로 세척하였다. 고체를 진공 하에서 32℃에서 일정 중량으로 건조시켜, 표제 화합물을 수득하였다 (13.8 kg, 97％).

제조예 5

(E)-2-((3-플루오로디벤조[b,e]옥세핀-11(6H)-일리덴)메틸)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란

1,4-디옥산 (250 mL) 중의 (E)-11-(브로모메틸렌)-3-플루오로-6,11-디히드로디벤조[b,e]옥세핀 (15 g, 49 mmol) 및 비스(피나콜레이토)디보론 (16 g, 64 mmol)의 교반된 혼합물에 아세트산칼륨 (15 g, 150 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 질소로 플러싱하고, 디클로로[1,1'-비스(디페닐포스피노)-페로센] 팔라듐(II) 디클로로메탄 부가물 (1.80 g, 2.46 mmol)을 첨가하고, 65℃에서 밤새 가열하였다. 실온으로 냉각시키고, 규조토를 통해 여과하고, 에틸 아세테이트로 세척하고, 여과물을 진공하에 농축시켰다. 메탄올 (200 mL)을 첨가하고, 회전 증발기 상에서 혼합물을 1 시간 동안 회전시켜 (진공 아님), 갈색 고체가 형성되게 하였다. 암갈색 결정을 여과에 의해 수집하고, 진공 하에서 밤새 건조시켜, 표제 화합물을 수득하였다 (7.28 g, 42％). 여과물을 농축시키고, 헥산 중의 0％ 내지 16％ 에틸 아세테이트로 용출하면서 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 표제 화합물을 황색 고체로서 수득하였다 (3.46 g, 20％). 반응물의 총 수율은 10.7 g (62％)이었다.

대안적 절차:

50 L 3구 둥근 바닥 플라스크에 기계적 교반기, 열전대, 질소 유입구, 및 환류 응축기를 장착하였다. 이를 가열 맨틀에 두었다. 플라스크를 디옥산 (13.5 L), (E)-11-브로모메틸렌-3-플루오로-6,11-디히드로-디벤조[b,e]옥세핀 (1.600 kg, 5.24 mol), 비스(피나콜레이토)디보론 (1.731 kg, 6.82 mol), 아세트산칼륨 (823 g, 8.38 mol), 물 (20 mL), 트리시클로헥실 포스핀 (29.5 g, 0.105 mol), 및 트리스(디벤질리덴 아세톤)디-팔라듐 (48 g, 0.052 mol)으로 채웠다. 반응 혼합물을 80-85℃로 가열하였다. 반응물을 최소 6 시간 동안 85-90℃로 유지시켰다. 실온으로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 규조토 패드 (2-3 in)를 통해 여과하였다. 여과물을 에틸 아세테이트로 세척하였다 (2 x 3.5 L). 여과물을 회전 증발기 상에서 50-55℃에서 농축시켰다. 헵탄으로 동시 증발시켰고 (2 x 3.5 L), 현탁액이 형성되었다. 50℃에서 메탄올 (2.5 L)을 슬러리에 첨가하였다. 10-15 분 동안 교반하였다. 슬러리를 20-30 분 동안 -10 - 0℃로 냉각시켰다. 고체를 여과하였다. 수집된 고체를 냉 (-10℃) 메탄올 (2 x 1.5 L)에 이어, 헵탄 (2 x 1.5 L)으로 세척하였다. 고체를 진공 하에 주위 온도에서 건조시켜, 표제 화합물을 회백색 고체로서 수득하였다 (1.408 kg, 76％).

제조예 6

(2R, 4R)-4-히드록시-피롤리딘-2-카르복실산 히드로클로라이드

문헌 [Tetrahedron: Asymmetry, 14, (2003) 3141-3152]에 기재되어 있는 것과 본질적으로 동일한 절차에 따라, 아세트산 무수물 (1.437 kg, 5.65 eq) 및 아세트산 (4.225 L) 혼합물에 50℃에서 트랜스-4-히드록시-L-프롤린 (331 g, 2.49 mol)을 30 분에 걸쳐 나누어 첨가하였다. 반응 혼합물을 5.5 시간 동안 90℃에서 가열한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 반응물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 농축시켰다. 잔류물을 2 N 염산 (4.57 L)에 용해시키고, 3 시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 규조토를 통해 여과하고, 진공 하에 70℃에서 대략 700 mL로 농축시켰다. 물질을 실온으로 냉각시키고, 밤새 그대로 두었다. 생성된 슬러리를 에테르 (1 L)로 희석하고, 결정을 여과하고, 에테르로 세척하고, 진공 하에 건조시켜, 표제 화합물을 수득하였다 (340 g). 고체를 고온의 에탄올 (2.5 L)에 용해시키고, 냉각시키고, 35℃에서 천천히 교반하고, 에테르 (2.5 L)를 1 시간에 걸쳐 천천히 나누어 첨가하였다. 2 시간 동안 교반하고, 생성된 백색 고체를 여과하고, 진공 오븐 내에서 밤새 건조시켜, 표제 화합물을 수득하였다 (270.6 g, 65％). _[α]D20 + 12.0 (메탄올 중 c = 1.0).

제조예 7

(2R, 4R)-4-히드록시-피롤리딘-1,2-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르 2-메틸 에스테르

티오닐 클로라이드 (233 mL, 3.10 mol)를 무수 메탄올 (3.5 L) 중의 (2R, 4R)-4-히드록시-피롤리딘-2-카르복실산 히드로클로라이드 (355 g, 2.12 mol) 용액에 0℃에서 질소 분위기하에 적가하였다. 첨가가 완료되면, 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 6 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜, 상응하는 메틸 에스테르 히드로클로라이드를 왁스상 고체로서 수득하였다. 고체를 무수 디클로로메탄 (3.5 L) 중에 0℃에서 현탁시키고, 트리에틸아민 (640 mL, 4.66 mol)을 30 분에 걸쳐 조심스럽게 첨가하고, 추가로 30 분 동안 교반하였다. N,N-디메틸아미노피리딘 (39 g, 0.32 mol) 및 디-tert-부틸 디카르보네이트 (500 g, 2.25 mol)를 연속해서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고, 18 시간 동안 교반하였다. 용액을 물 (4 L), 포화 중탄산나트륨 (4 L), 및 염수 (4 L)로 추출하였다. 유기층을 에틸렌디아민 (8 mL)으로 처리하고, 15 분 동안 교반하고, 10％ 수성 시트르산 (4 L)으로 역추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켜, 황색 오일 (484 g)을 수득하였고, 이것을 밤새 고체화하였다. 메틸 t-부틸 에테르 (1 L) 중에 용해시키고, 저부피로 농축시켰다. 헥산 (2 L)을 첨가하고, 혼합물을 1 시간 동안 정치시켰다. 백색 고체를 여과하고, 헥산으로 세척하였다. 백색 고체를 밤새 건조시켜 (20 mm Hg/60℃), 표제 화합물을 수득하였다 (354 g, 68％). _[α]D20 + 56.3 (메탄올 중 c = 1.0).

제조예 8

(2R, 4S)-4-브로모-피롤리딘-1,2-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르 2-메틸 에스테르

디클로로메탄 (3.2 L) 중의 (2R, 4R)-4-히드록시-피롤리딘-1,2-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르 2-메틸 에스테르 (320 g, 1.30 mol) 및 사브롬화탄소 (540 g, 1.94 mol) 용액에 0-5℃ (건조 빙/디클로로메탄 욕조)에서 트리페닐포스핀 (1.95 mol, 514 g)을 30 분에 걸쳐 나누어 첨가하고, 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 에탄올 (3.2 L)을 첨가하고, 추가로 2 시간 동안 교반하였다. 반응물을 18 L 카보이로 옮기고, 침전이 생길 때까지 에테르 (8 L)를 첨가하였다. 혼합물을 밤새 교반하였다. 고체를 여과 제거하고, 에테르 층을 농축시켰다. 유성 잔류물을 디클로로메탄에 용해시키고, TLC에 의해 더 이상의 생성물이 검출되지 않을 때까지 디클로로메탄으로 용출하면서 실리카 플러그를 통해 여과하였다. 디클로로메탄 층을 농축시키고, 헥산 중의 5％ 에틸 아세테이트 (4 L)로 처리하여, 백색 고체가 형성되게 하였다. 혼합물을 헥산 중의 5％ 에틸 아세테이트로 용출하면서 실리카 플러그를 통과시키고, 목적하는 생성물을 함유하는 분획만을 수집하였다. 용액을 농축시키고, 헥산 중의 5％ 에틸 아세테이트 (2 L)에 용해시키고, 헥산 중의 5％ 에틸 아세테이트로 용출하면서 1 kg 실리카겔 패드를 통해 정제하여, 표제 화합물을 황색 오일로서 수득하였다 (372.4 g, 93％). _[α]D20 + 53.6 (메탄올 중 c = 1.0).

제조예 9

(2R, 4R)-4-아지도-피롤리딘-1,2-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르 2-메틸 에스테르

N,N-디메틸포름아미드 (2.5 L) 중의 (2R, 4S)-4-브로모-피롤리딘-1,2-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르 2-메틸 에스테르 (370 g, 1.20 mol)에 나트륨 아지드 (157 g, 2.39 mol)를 첨가하고, 70-75℃에서 16 시간 동안 질소 하에 가열하였다. 실온으로 냉각시키고, 물 (5 L)로 희석하고, 에틸 아세테이트 (3 L)로 추출하였다. 염수 (2 L)로 세척하였다. 염수 층을 에틸 아세테이트 (3 L)로 추출하고, 유기층을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜, 오일 (324.5 g)을 수득하였다. 물질을 에테르 (2 L)에 용해시키고, 물로 세척하고 (2 x 2 L), 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜, 261.2 g의 암황색 오일을 수득하였다. 수성층을 에테르로 역추출하고 (2 x 2 L), 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜, 추가의 7.3 g 생성물을 수득하였다. 총 수율 268.5 g (83％). _[α]D20 + 39.5 (메탄올 중 c = 1.0).

제조예 10

(2R, 4R)-4-아지도-2-히드록시메틸-피롤리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르

리튬 보로히드라이드 (8.50 g, 351 mmol)를 에테르 (1 L) 중의 (2R, 4R)-4-아지도-피롤리딘-1,2-디카르복실산 1-tert-부틸 에스테르 2-메틸 에스테르 (95 g, 351 mmol) 용액에 -30℃에서 질소 하에 첨가하였다. 1.5 시간에 걸쳐 온도를 0℃로 상승시키고, 추가로 2 시간 동안 교반하였다. -70℃로 냉각시키고, 포화 수성 중탄산나트륨 (1 L)을 적가하였다. 실온으로 가온하고, 층을 분리시키고, 수성층을 에테르 (1 L)로 추출하였다. 에테르 층을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성된 물질을 고 진공 하에 건조시켜, 황색 오일을 수득하였다 (82 g, 96％). _[α]D20 + 20.3 (메탄올 중 c = 1.0).

제조예 11

(2R, 4R)-4-아미노-2-히드록시메틸-피롤리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르

메탄올 (2.3 L) 중의 (2R, 4R)-4-아지도-2-히드록시메틸-피롤리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (225 g, 0.93 mol) 및 10％ 탄소상 팔라듐 (22.5 g, 톨루엔으로 사전 습윤화된 것) 혼합물을 15 psi의 수소에서 실온에서 16 시간 동안 수소화하였다. 촉매를 여과 제거하고, 여과물을 농축시켜, 표제 화합물을 오일로서 수득하였다 (198 g, 92％).

제조예 12

(2R, 4R)-4-(4-브로모-2-니트로-페닐아미노)-2-히드록시메틸-피롤리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르

에틸 아세테이트 (2 L) 중의 (2R, 4R)-4-아미노-2-히드록시메틸-피롤리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (198 g, 0.92 mol), 5-브로모-플루오로니트로벤젠 (224 g, 0.98 mol), 트리에틸아민 (273 mL, 1.96 mol) 혼합물을 강하게 교반하면서 16 시간 동안 질소 하에서 환류시켰다. 실온으로 냉각시키고, 염수로 세척하였다. 염수 층을 에틸 아세테이트 (1 L)로 역 추출하고, 유기층을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성된 고체를 가온된 에틸 아세테이트 (2 L)에 용해시키고, 대략 500 mL로 농축시켰고, 결정이 형성되기 시작하였다. 용액을 헥산 (2 L)으로 천천히 처리하고, 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 정치시켰다. 황색 고체를 여과에 의해 수집하고, 헥산으로 세척하고, 40℃/20 mm Hg에서 건조시켜, 227 g의 목적하는 생성물을 수득하였다. 여과물을 감압하에 농축시키고, 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (2:3:5 에틸 아세테이트 / 디클로로메탄 / 헵탄, 2:3 에틸 아세테이트 / 헵탄으로 점차적으로 증가시킴)에 의해 정제하여, 목적하는 생성물을 54 g의 더 수득하였다. 총 수율: 281 g (70％). _[α]D20 -81 (메탄올 중 c = 1.0).

제조예 13

(2R, 4R)-[4-(4-브로모-2-니트로-페닐아미노)-피롤리딘-2-일]-메탄올, 히드로클로라이드

디클로로메탄 (400 mL) 중의 (2R, 4R)-4-(4-브로모-2-니트로-페닐아미노)-2-히드록시메틸-피롤리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (125.5 g, 0.301 mol) 용액에 디옥산 중의 4 N 염산 (800 mL)을 첨가하고, 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 침전물을 여과에 의해 수집하고, 에테르로 세척하고, 20 mm Hg/60℃에서 건조시켜, 표제 화합물을 수득하였다 (105.2 g, 99％). _[α]D20 -89.6 (메탄올 중 c = 1.0).

제조예 14

(7R, 8aR)-7-(4-브로모-2-니트로-페닐아미노)-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]옥사진-4-온

테트라히드로푸란 (375 mL) 및 물 (376 mL) 중의 (2R, 4R)-[4-(4-브로모-2-니트로-페닐아미노)-피롤리딘-2-일]-메탄올, 히드로클로라이드 (54.5 g, 155 mmol)의 교반 용액에 pH가 10-12가 될 때까지 5 N 수산화나트륨을 적가하였다. 클로로아세틸 클로라이드 (27.3 mL, 337 mmol)를 적하 깔때기를 통해 30 분에 걸쳐 적가하였다. 또다른 적하 깔때기를 이용하여, 내부 pH를 8-12로 유지시키는 속도로 산 클로라이드를 첨가하면서 5 N 수산화나트륨을 첨가하였다. 6 시간 동안 교반하고, 형성된 고체를 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하였다. 여과물의 유기 성분을 감압하에 제거하고, 고체를 여과에 의해 수집하였다. 2 개의 고체 배치를 합하고, 60℃/20 mm Hg에서 건조시켜, 51.4 g을 수득하였다. 고체를 디클로로메탄 중의 2％ 메탄올 (1.5 L)에 현탁시키고, 회전 증발기 상에서 40℃에서 1 시간 동안 회전시켰다. 침전물을 여과에 의해 수집하고 (11 g), 폐기하였다. 여과물을 디클로로메탄으로 용출시키면서 실리카겔 플러그를 통과시키고, 용출액을 농축시켜, 표제 화합물을 황색 오렌지색 고체로서 수득하였다 (32.8 g, 60％).

제조예 15

(7R, 8aR)-(4-브로모-2-니트로-페닐)-(헥사히드로-피롤로[2,1-c][1,4]옥사진-7-일)-아민

(7R, 8aR)-7-(4-브로모-2-니트로-페닐아미노)-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]옥사진-4-온 (32.1 g, 90.1 mmol)을 무수 테트라히드로푸란 (450 mL)에 첨가하고, 0 내지 -5℃로 냉각시켰다. 보란-디메틸술파이드 복합체 (26 mL, 0.279 mol)를 10 분에 걸쳐 첨가하였다. 혼합물을 3 시간 동안 가열 환류시켰다. 반응 혼합물을 빙조에서 냉각시키고, 메탄올 (450 mL)을 조심스럽게 적가하였다. 4 N 염산 (450 mL)을 첨가하고, 2 시간 동안 환류시켰다. 대략 40℃로 냉각시키고, 5 N 수산화나트륨을 조심스럽게 적가하여 pH를 10-12로 조정하였다. 유기 용매를 감압하에 제거하였다. 수성층을 물 (1.2 L)로 희석시키고, 디클로로메탄 (1.2 L)으로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜, 오일을 수득하였다. 이 시점에, 오일을 앞서 동일한 제조예 (30.2 g의 아미드 출발 물질로 시작하는 것)로부터의 조 물질과 합하였다. 오일을 메틸렌 클로라이드로 용출시키면서 실리카겔 플러그를 통과시켜, 보다 높은 Rf 성분을 제거하였다. 디클로로메탄 중의 1％ 메탄올로 용출시키고 농축시켜 고체 (57.8 g)를 수득하였다. 고체를 에테르 (1 L)에 현탁시키고, 밤새 정치시켰다. 고체를 여과에 의해 수집하고, 소량의 에테르로 세척하여, 47.5 g을 수득하였다. 여과물을 농축시키고, 에테르 (100 mL)에 현탁시키고, 실온에서 2 시간 동안 정치시켰다. 추가의 목적하는 생성물 3.1 g을 여과에 의해 수집하였다. 여과물을 농축시키고, 잔류물을 실리카 플러그 여과에 의해 정제하여, 추가의 2.9 g의 오렌지색 고체를 수득하였다. 모든 고체를 합하여 표제 화합물을 수득하였다 (53.5 g, 89％). _[α]D20 -36 (DMSO 중 c = 1.0).

제조예 16

(E)-[4-(3-플루오로-6H-디벤조[b,e]옥세핀-11-일리덴메틸)-2-니트로-페닐]-((7R, 8aR)-헥사히드로-피롤로[2,1-c][1,4]옥사진-7-일)-아민

플라스크를 테트라히드로푸란 (1 L) 및 메탄올 (500 mL) 중의 (7R, 8aR)-(4-브로모-2-니트로-페닐)-(헥사히드로-피롤로[2,1-c][1,4]옥사진-7-일)-아민 (50.9 g, 0.149 mol), (E)-2-((3-플루오로디벤조[b,e]옥세핀-11(6H)-일리덴)메틸)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란 (57.5 g, 0.163 mol), 트리페닐포스핀 (10.1 g, 39 mmol) 및 나트륨 메톡시드 (19.7 g, 0.346 mol)로 채웠다. 혼합물을 통해 30 분 동안 질소 버블링하였다. 팔라듐 (II) 아세테이트 (3.00 g, 13 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 통해 추가로 30 분 동안 질소 버블링하였다. 질소 하에 16 시간 동안 가열 환류시켰다 (60℃). 실온으로 냉각시키고, 규조토를 통해 여과하고, 진공하에 농축시켜, 고체를 수득하였다. 1:1 에틸 아세테이트/염수 (2 L)에 용해시키고, 규조토 패드를 통과시켰다. 패드를 1:1 에틸 아세테이트/염수 (2 x 1 L)에 이어 디클로로메탄 중의 10％ 메탄올 (4 x 1 L)로 세척하였다. 층을 분리시키고, 유기상을 합하였다. 유기 부분을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜, 오일을 수득하였다. 오일을 디클로로메탄에 용해시키고, 실리카겔 패드를 통과시켰다. 보다 높은 Rf TLC 성분이 제거될 때까지 패드를 디클로로메탄으로 세정하였다. 디클로로메탄 중의 1％ 메탄올로 용출시키고, 진공하에 농축시켜, 발포체를 수득하였다. 에틸 아세테이트 (2 L)에 용해시키고, 대략 200 mL로 농축시켰다. 헥산 (1.5 L)을 첨가하고, 현탁액을 실온에서 1 시간 동안 정치시켰다. 오렌지색 고체를 여과에 의해 수집하고, 50℃/20 mm Hg에서 건조시켜, 표제 화합물을 수득하였다 (53 g, 73％). _[α]D20 -26 (DMSO 중 c = 1.0).

실시예 1

5-((E)-(3-플루오로디벤조[b,e]옥세핀-11(6H)-일리덴)메틸)-1-((7R,8aR)-헥사히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]옥사진-7-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2(3H)-온 (형태 I)

테트라히드로푸란 (450 mL) 중의 (E)-[4-(3-플루오로-6H-디벤조[b,e]옥세핀-11-일리덴메틸)-2-니트로-페닐]-((7R, 8aR)-헥사히드로-피롤로[2,1-c][1,4]옥사진-7-일)-아민 (52 g, 0.107 mol), 트리에틸아민 (33 mL, 0.237 mol) 및 5％ 탄소상 백금 (18 g) 혼합물을 실온에서 50 psi에서 2 시간 동안 수소화하였다. 촉매를 여과 제거하고, 테트라히드로푸란으로 세정하고, 농축시켜, 갈색 발포체를 수득하였다. 발포체를 무수 테트라히드로푸란 (500 mL)에 용해시키고, 빙조에서 냉각시켰다. 테트라히드로푸란 (450 mL) 중의 트리포스겐 (31.5 g, 0.106 mol)을 30 분에 걸쳐 적가하고, 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 용액을 농축시키고, 디클로로메탄 중의 5％ 메탄올에 용해시키고, 짧은 실리카겔 플러그를 통해 정제하였다. 이를 농축시켜 갈색 고체를 수득하였다. 고체를 포화 중탄산나트륨 (1.5 L)에 현탁시키고, 회전 증발기 상에서 1 시간 동안 교반하였다. 여과하고, 진공하에 건조시켰다. 가온된 1:1 메탄올/디클로로메탄 (대략 6 L)에 용해시키고, 폴리 (4-비닐피리딘) 2％ 가교된 수지 (170 g)로 처리하였다. 슬러리를 30 분 동안 교반하고, 규조토를 통해 여과하였다. 여과물을 대략 1.5 L 부피로 농축시키고, 생성된 고체를 여과에 의해 수집하였다. 80℃/20 mm Hg에서 밤새 건조시켜, 표제 화합물을 백색 고체로서 수득하였다 (38.1 g, 74％). _[α]D20 -20.5 (DMSO 중 c = 1.0).

실시예 1에서 기재한 바와 같이 제조한 물질을 이용하여 X 선 분말 회절 패턴을 수득하였고, 결정 형태 (형태 I)가 약 10.5, 13.0, 15.5, 및 19.7의 특징적인 피크 위치 (°2θ값)를 갖는 것으로 밝혀졌다. 물질의 융점 특성은 DSC로 결정하였다. 용융 개시점 = 298.9℃

실시예 1(a)

5-((E)-(3-플루오로디벤조[b,e]옥세핀-11(6H)-일리덴)메틸)-1-((7R,8aR)-헥사히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]옥사진-7-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2(3H)-온 (형태 II)

117.7 mg의 5-((E)-(3-플루오로디벤조[b,e]옥세핀-11(6H)-일리덴)메틸)-1-((7R,8aR)-헥사히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]옥사진-7-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2(3H)-온 (실시예 1에서 기재한 바와 같이 제조한 것)을 바이알에 첨가하고, 교반 플레이트 상에서 1000 rpm 및 70℃에서 2.5 mL의 DMAC와 용해될 때까지 혼합하였다. 샘플이 흐려질 때까지 물을 천천히 첨가한 다음, 열을 제거하였다. 용액으로부터 백색 고체가 침전될 때까지 30 분 동안 교반을 계속하였다. 고체를 여과에 의해 수집하고, 40℃에서 밤새 건조시켰다.

실시예 1(a)에 기재한 바와 같이 제조한 물질을 이용하여 X 선 분말 회절 패턴을 수득하였고, 결정 형태 (형태 II)가 약 11.3, 12.1, 18.8, 및 21.0의 특징적인 피크 위치 (°2θ값)를 갖는 것으로 밝혀졌다.

대안적 절차:

(i) 1 N NaOH (200 mL) 중의 5-((E)-(3-플루오로디벤조[b,e]옥세핀-11(6H)-일리덴)메틸)-1-((7R,8aR)-헥사히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]옥사진-7-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2(3H)-온.4-메틸벤젠술포네이트 (10.2 g, 15.55 mmoles) (본질적으로 이하의 실시예 2에서 기재한 바와 같이 제조한 것) 현탁액을 분리 깔때기 내에서 5％ MeOH/CHCl₃ 용액으로 추출하였다 (5 X 100 mL). 유기층을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 주름형 필터를 통해 여과하고, 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 50℃ 진공 오븐 내에서 밤새 건조시켜, 백색 고체를 수득하였다 (6.71 g, 90％ 회수).

(ii) 상기의 대안적 절차 (i)로부터의 0.1 g의 물질 샘플을 1 mL DMAc로 처리하고, 생성된 현탁을 80℃ 오일조 내에서 30 분 동안 가열하였다. 15 mL의 AcCN을 용액에 첨가하고, 80℃ 오일조 내에서 30 분 동안 가열한 다음, 교반하면서 실온으로 냉각시켰다. 고체를 여과에 의해 수집한 다음, 50℃ 진공 오븐 내에서 밤새 건조시켜, 74.5 mg의 생성물을 회수하였다.

(iii) 상기의 대안적 절차 (i)로부터의 0.1 g의 물질 샘플을 20 mL AcCN으로 처리하고, 생성된 현탁액을 80℃ 오일조 내에서 30 분 동안 가열한 다음, 교반하면서 실온으로 냉각시켰다. 고체를 여과에 의해 수집한 다음, 50℃ 진공 오븐 내에서 밤새 건조시켜, 81.8 mg의 생성물을 회수하였다.

(iv) 상기의 대안적 절차 (i)로부터의 0.1 g의 물질 샘플을 20 mL IPA로 처리하고, 생성된 현탁액을 80℃ 오일조 내에서 30 분 동안 가열한 다음, 교반하면서 실온으로 냉각시켰다. 고체를 여과에 의해 수집한 다음, 50℃ 진공 오븐 내에서 밤새 건조시켜, 92.8 mg의 생성물을 회수하였다.

상기의 대안적 절차 (i)에 기재한 바와 같이 제조한 물질을 이용한 경우, X 선 분말 회절은 결정 형태가 약 11.3, 12.1, 18.8, 및 21.0의 특징적인 피크 위치 (°2θ값)를 갖는 것 (형태 II)임을 밝혀내었다.

실시예 2

5-((E)-(3-플루오로디벤조[b,e]옥세핀-11(6H)-일리덴)메틸)-1-((7R,8aR)-헥사히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]옥사진-7-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2(3H)-온. 토실레이트 염

디메틸아세트아미드 (50 mL) 중의 p-톨루엔술폰산 1수화물 (51.70 mmol, 9.98 g) 용액을 40℃ 오일조 내에서 30 분 동안 가열하였다. 균질한 용액에 5-((E)-(3-플루오로디벤조[b,e]옥세핀-11(6H)-일리덴)메틸)-1-((7R,8aR)-헥사히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]옥사진-7-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2(3H)-온 (51.70 mmol, 25.00 g)을 강하게 교반하면서 5 g씩 나누어 첨가하였다. 분말 깔때기 및 용기 병을 디메틸아세트아미드 (25 mL)로 세척하고, 고체가 완전히 용해될 때까지 현탁액을 40℃에서 30 분 동안 교반하였다. 밝은 갈색의 균질한 용액을 질소 기체의 기류하에 밤새 30℃에 두었다. 잔류물을 아세토니트릴 (200 mL)로 희석하고, 수조 내에서 20 분 동안 초음파처리하였다. 백색 고체 현탁액을 60℃ 오일조 내에서 3 시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시키고, 고체를 여과에 의해 수집하였다. 진공 오븐 내에서 40℃에서 2 일 동안 건조시켜, 표제 화합물을 수득하였다 (32.88 g, 97％).

대안적 절차:

(a) 85.8 mg (0.177 mmol)의 5-((E)-(3-플루오로디벤조[b,e]옥세핀-11(6H)-일리덴)메틸)-1-((7R,8aR)-헥사히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]옥사진-7-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2(3H)-온 (본질적으로 실시예 1에서 기재한 바와 같이 제조한 것)을 디메틸 아세트아미드 (2 mL)에 용해시켰다. p-톨루엔술폰산 1수화물 (43 mg, 0.226 mmol)을 첨가하고, 혼합물이 투명 용액이 될 때까지 교반하였다. 아세토니트릴 (7 mL)을 첨가하고, 증발시켜, 투명한 오일을 수득하였다. 물 (2 mL)을 첨가하고, 샘플을 초음파처리하였다. 백색 고체가 침전된 후, 샘플을 10 분 동안 슬러리화하였다. 여과하고 건조시켜, 고체를 수득하였다.

(b) 98.0 mg의 5-((E)-(3-플루오로디벤조[b,e]옥세핀-11(6H)-일리덴)메틸)-1-((7R,8aR)-헥사히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]옥사진-7-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2(3H)-온 (본질적으로 실시예 1에서 기재한 바와 같이 제조한 것)을 2.5 mL의 DMAC에 용해시켰다. 1.2 eq.의 p-톨루엔술폰산 1수화물을 첨가하고, 용액이 투명하고 무색이 될 때까지 교반하였다. 2 mL의 88％ 아세톤에 이어 16 mL의 물을 첨가한 다음, 증발시켜, 용매를 제거하였다. 생성된 투명한 오일에 1 mL의 아세톤을 첨가하고, 초음파처리하였다. 생성된 겔을 건조시켜, 회백색 고체를 수득하였다. 고체를 다시 1:10 THF:H₂O에 용해시키고, 증발시켜, 투명한 오일을 수득한 다음, 5 mL의 아세토니트릴과 함께 초음파처리하였다. 백색 고체가 침전된 후, 샘플을 밤새 슬러리화하였다. 여과하고 건조시켜, 고체를 수득하였다.

Claims

5-((E)-(3-플루오로디벤조[b,e]옥세핀-11(6H)-일리덴)메틸)-1-((7R,8aR)-헥사히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]옥사진-7-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2(3H)-온인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항에 있어서, 5-((E)-(3-플루오로디벤조[b,e]옥세핀-11(6H)-일리덴)메틸)-1-((7R,8aR)-헥사히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]옥사진-7-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2(3H)-온인 화합물.
제2항에 있어서, 결정질 형태인 화합물.
제2항에 있어서, 약 11.3, 12.1, 18.8 및 21.0의 °2θ에서의 특징적인 피크를 갖는 결정질 형태인 화합물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 화합물 또는 염.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 울혈성 심부전, 고혈압, 당뇨병성 신장병증 또는 만성 신장 질환의 치료에 사용하기 위한 화합물 또는 염.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 염의 유효량을 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 울혈성 심부전, 고혈압, 당뇨병성 신장병증 또는 만성 신장 질환의 치료 방법.
제7항에 있어서, 5-((E)-(3-플루오로디벤조[b,e]옥세핀-11(6H)-일리덴)메틸)-1-((7R,8aR)-헥사히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]옥사진-7-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2(3H)-온의 유효량을 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 염을 포함하는 제약 조성물.
제9항에 있어서, 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 5-((E)-(3-플루오로디벤조[b,e]옥세핀-11(6H)-일리덴)메틸)-1-((7R,8aR)-헥사히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]옥사진-7-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2(3H)-온을 포함하는 제약 조성물.