CN102333773B - 盐皮质激素受体拮抗剂及使用方法 - Google Patents

盐皮质激素受体拮抗剂及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了下式的化合物或其可药用的盐，包含化合物(I)以及与之混合的适当的载体、稀释剂或赋形剂的药用组合物；以及治疗生理学疾病的方法，特别是充血性心衰、高血压、糖尿病性肾病或慢性肾病，所述方法包括给予化合物(I)或其可药用的盐。

Description

盐皮质激素受体拮抗剂及使用方法
本发明涉及用作治疗药物的三环化合物、含有它们的药用组合物、采用该化合物治疗患者的生理学疾病的方法以及在合成该化合物中使用的中间体和方法。
醛固酮是主要的内源性盐皮质激素，它可以与盐皮质激素受体(MR)相互作用，促进钠和水的再吸收以及钾的排泄。由于醛固酮在维持电解质和水的平衡中的作用，所以可以采用MR拮抗剂治疗多种生理学疾病，包括高血压，低钾血症，心肌性心律失常(myocardial arrhythmias)、Bartter氏综合征以及原发性或继发性高醛固酮症疾病，例如Conn氏综合征。最近，MR拮抗剂已经用于治疗充血性心衰和急性心肌梗塞。另外，MR拮抗剂在肾病临床前模型中也被证明是有效的，可以与标准疗法组合用于降低肾病患者的蛋白尿，例如慢性肾病，包括糖尿病性肾病。
然而，现有的甾体MR拮抗剂产生了限定其安全性和/或有效性的伴随作用。例如，螺内酯是非选择性的，能够与其它核激素受体(例如雄性激素受体(AR)、黄体酮受体(PR)或糖皮质激素受体(GR))产生交互作用，从而介导其它生理学过程。螺内酯疗法也可以用于治疗高钾血症以及男性乳房发育、性功能障碍、性欲减退、月经失调和胃痛。尽管相对于其它核激素受体而言，依普利酮对MR具有选择性，但是它也与高钾血症有关。因此，本领域中需要现有MR拮抗剂疗法的替代疗法。
本发明的目的是提供具有MR拮抗活性的非甾体类MR配体。更具体地讲，本发明的目的是提供非甾体类MR拮抗剂，相对于AR、PR和GR而言，它能够与MR以较高的亲和力结合。作为更具体的实施方案，本发明的目的是提供非甾体类MR拮抗剂，相对于AR、PR和GR而言，它能够与MR以较高的亲和力结合，并且它具有有效的肾脏或心脏保护性能。作为更具体的实施方案，本发明的目的是提供非甾体类MR拮抗剂，相对于AR、PR和GR而言，它能够与MR以较高的亲和力结合，它具有有效的肾脏或心脏保护性能，但是它能够降低产生高钾血症的发生率或可能性。
三环MR配体在本领域中是已知的。例如WO 04/052847和WO05/066161公开了三环甾体类激素受体调节剂，它们可以用于治疗对盐皮质激素受体或糖皮质激素受体调节敏感的疾病。本发明涉及特别的二苯并氧杂环庚烯，如下面化合物(I)所示，它在体外和体内均具有活性，这说明它可以用于治疗或预防对盐皮质激素受体拮抗剂的治疗有响应的疾病。
因此，本发明提供了下式化合物或其可药用的盐：
化合物(I)
(5-((E)-(3-氟二苯并[b，e]氧杂环庚烯-11(6H)-亚基)甲基)-1-((7R，8aR)-六氢-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]
Figure BDA0000085806380000022
嗪-7-基)-1H-苯并[d]咪唑-2(3H)-酮)。
作为具体的实施方案，本发明提供了结晶形式的化合物(I)或其可药用的盐。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗或预防下列疾病的方法：充血性心衰、糖尿病性肾病、慢性肾病、高血压、低钾血症、心肌性心律失常、Bartter氏综合征、原发性或继发性高醛甾酮症或Conn氏综合征，该方法包括给予需要的患者有效量的化合物(I)或其可药用的盐。作为更特别的方面，本发明提供了治疗或预防充血性心衰、高血压、糖尿病性肾病或慢性肾病的方法，该方法包括给予需要的患者有效量的化合物(I)或其可药用的盐。
本发明也提供了化合物(I)或其可药用的盐在治疗中的用途。另外，本发明提供了化合物(I)或其可药用的盐在治疗或预防下列疾病中的用途：充血性心衰、糖尿病性肾病、慢性肾病、高血压、低钾血症、心肌性心律失常、Bartter氏综合征、原发性或继发性高醛甾酮症或Conn氏综合征。更具体地讲，本发明提供了化合物(I)或其可药用的盐在治疗或预防充血性心衰、高血压、糖尿病性肾病或慢性肾病中的用途。
在另一个实施方案中，本发明提供了化合物(I)或其可药用的盐在生产用于治疗或预防下列疾病的药物中的用途：充血性心衰、糖尿病性肾病、慢性肾病、高血压、低钾血症、心肌性心律失常、Bartter氏综合征、原发性或继发性高醛甾酮症或Conn氏综合征。更具体地讲，本发明提供了化合物(I)或其可药用的盐在生产用于治疗或预防充血性心衰、高血压、糖尿病性肾病或慢性肾病的药物中的用途。
另外，本发明提供了药用组合物，该组合物含有化合物(I)或其可药用的盐以及与之组合的一或多种可药用的载体、稀释剂或赋形剂。更具体地讲，本发明提供了用于治疗或预防充血性心衰、高血压、糖尿病性肾病或慢性肾病的药用组合物，该组合物含有化合物(I)或其可药用的盐以及与之组合的一或多种可药用的载体、稀释剂或赋形剂。本发明也包括用于合成化合物(I)的新中间体和方法。
本发明涉及化合物(I)的可药用盐以及化合物(I)或其可药用盐的溶剂化物。因此，本文中使用的术语“化合物(I)”在其定义中包括化合物的任何溶剂合物。可药用盐及其制备方法的实例是本领域技术人员所熟知的。参见例如，Stahl等，“可药用盐手册：性能、选择和使用(Handbook ofPharmaceutical Salts：Properties，Selection and Use)”，VCHA/Wiley-VCH，(2002)；Gould，P.L.，“碱性药物的盐的选择(Salt selection for basic drugs)”，International Journal of Pharmaceutics，33：201-217(1986)；Bastin等“药用新化学实体的盐的选择及优化方法(Salt Selection and OptimizationProcedures for Pharmaceutical New Chemical Entities)”，Organic ProcessResearch and Development，4：427-435(2000)。特别提及的是化合物(I)甲苯磺酸盐，然而应当理解，优选化合物(I)的游离碱。
本文中使用的术语“R”和“S”如有机化学中常规定义，代表手性中心的具体构型。术语“(±)”、“R/S”或“RS”是指手性中心的外消旋构型。部分优先次序列表和立体化学讨论参见“有机化合物命名：原则和实践(Nomenclature of Organic compounds：Principles and Practice)”，(J.H.Fletcher等编辑，1974)。本文中使用的表述
Figure BDA0000085806380000031
是指向前突出纸平面外的键，而表述
Figure BDA0000085806380000041
是指向后突出纸平面外的键。
本领域技术人员应当理解，含有碳-碳或碳-氮双键的分子可以以几何异构体存在。通常采用两种方法表述具体的异构体，“反式-顺式”方法和“E和Z”方法，这取决于与每个双键原子连接的基团是相同的还是不同的。关于几何异构现象的讨论和具体异构体的命名可以参见March，“Advanced Organic Chemistry(高等有机化学)”，John Wiley & Sons，1992，第4章。
化合物(I)可以制成药用组合物的一部分。因此，包含化合物(I)或其可药用的盐以及与之组合的可药用的载体、稀释剂或赋形剂的药用组合物是本发明的重要的实施方案。药用组合物及其制备方法的实例在本领域中是众所周知的。参见，例如REMINGTON：THE SCIENCE AND PRACTICEOF PHARMACY(雷明顿：药学科学与实践)(A.Gennaro等编辑，第19版，Mack Publishing(1995))。包含化合物(I)的说明性组合物包括例如：化合物(I)的混悬液，含有0.5％的羧基甲基纤维素、0.25％的聚山梨醇酯80和2.7％的NaCl；或化合物(I)的混悬液，含有1％的羧基甲基纤维素和0.25％的聚山梨醇酯80；化合物(I)的混悬液，含有1％的羧基甲基纤维素、0.25％的聚山梨醇酯80和0.05％的消泡剂1510TM的纯化水溶液；化合物(I)(射流研磨)的混悬液，含有1％的羧基甲基纤维素钠、0.25％的聚山梨醇酯80和0.05％的消泡剂1510TM的纯化水溶液；化合物(I)(射流研磨)的混悬液，含有1％的羟乙基纤维素、10％的维生素E TPGS(d-α-维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯)和0.05％的消泡剂1510TM的纯化水溶液；化合物(I)(射流研磨)的混悬液，含有10％的维生素E TPGS和0.05％的消泡剂1510TM的纯化水溶液；化合物(I)的溶液(15mg/ml)，含有20％的
Figure BDA0000085806380000042
25mM的磷酸盐缓冲液(pH～2)和1eq.HCl。然而，应当理解，优选的本发明组合物含有化合物(I)或其可药用的盐，制成胶囊或片剂。
化合物(I)或其可药用的盐或者含有化合物(I)或其可药用的盐的组合物可以通过能够使得化合物可生物利用的任何途径给药，包括口服和肠胃外途径。然而，应当理解，优选口服给药。
本领域技术人员应当理解，颗粒大小能够影响药物成分的体内溶出，这又影响成分的吸收。本文中使用的“颗粒大小”是指药物成分颗粒的直径，可以通过常规技术确定，例如激光散射、激光衍射、米氏散射、沉降场流分离、光子相关光谱等。当药物成分具有较差的溶解度，较小或者减小的颗粒大小可能有助于溶出，因此能够增加成分的吸收。Amidon等，Pharm.Research，12；413-420(1995)。用于减小或控制颗粒大小的方法(微粉化)是常规方法，包括球磨研磨、针铣(pin milling)、射流研磨、湿法研磨等。用于控制颗粒大小的另一种方法包括在纳米混悬液中制备药物成分。本发明的特殊实施方案包括化合物(I)或化合物(I)可药用的盐或者含有化合物(I)或其可药用的盐的药用组合物，其中所述化合物或盐的颗粒大小为d90(即，90％的颗粒的大小小于或等于)小于约10μm。
本领域技术人员应当理解，只有具有某些物理特性的药物成分才是符合要求的。具体而言，稳定的、结晶固体成分是满足需要的，因为它们特别符合常规要求：化学合成、纯化、储存以及制剂或剂型开发。本文中使用的术语“晶形”或“结晶形式”是指化学物质的结晶制品。
特别的结晶形式可以被定性，因此采用常规技术可以与相同化学物质的其它固体形式区别开来，所述技术包括X-射线粉末衍射(XRPD)、光谱方法(例如红外(IR)或核磁共振(NMR)光谱)和热技术(例如差示扫描量热法(DSC)、热重分析(TGA)或差热分析(DTA))。尽管XRPD为鉴定化学物质结晶形式的特别有用的方法，但是应当理解，即使是相同的结晶形式，X-射线图谱中的实际峰强度也由于分析方法的不同而不同，这取决于分析的样品和设备、采用的溶剂或方法。另外，也应当理解，当自给定的结晶形式分析获得的准确峰位(以°2θ测定)在不同的分析之间有差别(例如±0.1°)时，光谱之间的峰位置的相对模式保持基本相同。
本发明提供了结晶形式的化合物(I)。更具体地讲，本发明提供了结晶形式的化合物(I)的游离碱，其在约10.5、13.0、15.5和19.7处有°2θ特征峰(本文实施例中的游离碱I型)。另外，本发明提供了结晶形式的化合物(I)的游离碱，其在约11.3、12.1、18.8和21.0处有°2θ的特征峰(本文实施例中的游离碱II型)。
本文中使用的术语“患者”是指人类或非人类哺乳动物，例如犬、猫、牛、猴、马或羊。更具体地讲，术语“患者”是指人类。本文中使用的术语“治疗”包括阻止、预防、控制、减缓、停止或逆转现有症状或疾病的进展或严重程度。本文中使得的术语“预防”是指阻止、控制或抑制症状或疾病的发生率或发生。本领域技术人员可以理解，生理学疾病可以为“慢性”状态或者为“急性”事件。因此，疾病的治疗既包括急性事件也包括慢性状态。在急性事件中，化合物在症状发作时立即给予，当症状消失时停止给予，而慢性状态应在疾病的整个过程中始终给予治疗。
本文中使用的术语“有效量”是指以单剂量或多剂量给予患者并能够在诊断或治疗中提供患者所需要的效果的化合物(I)或其可药用的盐的量或剂量。有效量可以由作为本领域技术人员的主治诊断医师根据下列多种因素容易地确定：例如哺乳动物的种类；动物体积、年龄和一般健康情况；所涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的响应；给予的特定化合物；给药的模式；给予的制剂的生物利用度特性；选择的剂量方案；任何伴随药物的使用。
当在本发明的方法或用途中使用时，本发明的化合物和组合物可以单独给药或者与用于治疗特定疾病或病症的常规治疗药物组合给药。例如，化合物(I)或含有化合物(I)的组合物可以与用于治疗高血压、糖尿病性肾病或慢性肾病的常规药物组合给药，例如血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂或血管紧张素受体阻断剂(ARB药物)。当本发明的化合物或组合物作为组合疗法的一部分时，化合物(I)或含有化合物(I)的组合物可以分别给药或者作为含有与之组合的治疗药物的制剂的一部分给药。
生物学活性测定：
本文中使用的“Kd”是指配体-受体复合物的平衡解离常数；“Ki”是指药物-受体复合物的平衡解离常数，它是处于平衡状态时与一半的结合位点结合的药物浓度的指示；“Kb”是指拮抗剂-受体复合物的平衡解离常数；“IC50”是指能够使得所述药物所可能产生的最大抑制响应的50％的药物浓度，或者能够使得与受体结合的配体产生50％置换的药物的浓度；“EC50”是指能够使得所述药物所可能产生的最大响应的50％的药物浓度；“ED50”是指能够使得所述药物所可能产生的最大响应的50％所给予的治疗药物的剂量。
A.类固醇核激素受体结合实验：
将获自过度表达人MR(盐皮质激素受体)、GR(糖皮质激素受体)、AR(雄激素受体)或PR(黄体酮受体)的人胚胎肾HEK293细胞的细胞裂解物用于受体-配体竞争结合实验以测定Ki值。
简而言之，类固醇受体竞争结合实验在缓冲液中进行，所述缓冲液含有20mM HEPES缓冲液(pH＝7.6)、0.2mM EDTA、75mM NaCl、1.5mMMgCl2、20％丙三醇、20mM钼酸钠、0.2mM DTT(二硫苏糖醇)、20μg/mL抑肽酶和20μg/mL亮抑肽酶(实验缓冲液)。通常，类固醇受体结合实验包括放射性标记的配体，例如用于MR结合的0.25nM[3H]-醛固酮、用于GR结合的0.7nM[3H]-地塞米松、用于AR结合的0.36nM[3H]-美曲勃龙(methyltrienolone)和用于PR结合的0.29nM[3H]-美曲勃龙，每孔还包括20μg 293-MR裂解物、20μg 293-GR裂解物、22μg 293-AR裂解物或40μg293-PR裂解物。实验通常以96孔模式进行。加入各种浓度的竞争性实验化合物，浓度范围在约0.01nM至10μM之间。在用于MR结合的500nM醛固酮、用于GR结合的500nM地塞米松或用于AR和PR结合的500nM美曲勃龙存在下，测定非特异性结合。将结合反应物(140μL)于4℃温育过夜，然后向各反应物中加入70μL冷活性炭-葡聚糖缓冲液(每50mL实验缓冲液中含有0.75g活性炭和0.25g葡聚糖)。将板于4℃在轨道振动器中混合8分钟。然后将板于4℃以3,000rpm离心10分钟。然后将等份的120μL结合反应混合物转移至另一个96孔板中，向每个孔中加入175μL的Wallac Optiphase Hisafe3TM闪烁液。将板密封并在轨道振动器中剧烈振摇。温育2小时后，在WallacMicrobeta计数器中读板。
采用获得的数据计算估算的IC50以及10μM的抑制百分率。MR结合的[3H]-醛固酮、GR结合的[3H]-地塞米松、AR结合的[3H]-美曲勃龙或PR结合的[3H]-美曲勃龙的Kd通过饱和结合测定。采用Cheng-Prusoff方程将化合物的IC50值转化为Ki。
基本上根据上述方案，在MR结合实验中化合物(I)的Ki约为0.40nM，由此证明化合物(I)为人MR的有效配体。另外，在AR、GR和PR结合实验中，化合物(I)的Ki分别约为1170nM、669nM和478nM，因此证明化合物(I)为MR的选择性配体。
B.类固醇核激素受体调节的功能性实验：
醛固酮通过与盐皮质激素受体的相互作用发挥其生理学作用。随着醛固酮与MR的细胞质的结合，配体受体复合物易位至细胞核，它在此处与DNA上的激素响应元素结合从而启动靶基因的表达。为了证实本发明化合物调节(即激动、部分激动、部分拮抗或拮抗)类固醇激素受体的能力，可以进行生物验，该生物实验能够检测采用核受体蛋白和激素响应元素报告基因构建物瞬时转染的细胞中的靶基因表达的功能性调节。在功能性实验中采用的溶剂、试剂和配体易于自商业获得，或者可以由本领域技术人员制备。
1.核激素受体组筛选(Panel Screen)
采用适当的转染试剂例如FugeneTM，将人胚胎肾HEK293细胞采用类固醇激素受体和报道子基因质粒转染。简而言之，采用能够组成性表达人类雄激素受体(AR)的质粒并采用病毒CMV(巨细胞病毒)启动子，将含有荧光素酶报道子cDNA的上游的两个拷贝的probasin ARE和TK(胸腺嘧啶激酶)启动子的报道子质粒转染到HEK293细胞中。采用能够组成性表达人糖皮质激素受体(GR)、人盐皮质激素受体(MR)或人黄体酮受体(PR)的质粒以及病毒CMV启动子，将含有荧光素酶报道子cDNA的上游的两个拷贝的GRE和TK启动子的报道子质粒转染。将细胞在T150cm烧瓶中、在含有5％活性炭处理的胎牛血清(FBS)的DMEM介质中进行转染。温育过夜后，将转染细胞进行胰蛋白酶化，将其涂布于含有5％活性炭处理的FBS的DMEM介质的96孔盘中，温育4小时后，将其暴露于各种浓度的实验化合物中，浓度范围在约0.01nM至10μM之间。在拮抗剂模式实验中，将用于各个不同受体的低浓度激动剂加至介质中(0.08nM醛固酮用于MR；0.25nM地塞米松用于GR；0.66nM美曲勃龙用于AR；0.08nM普美孕酮用于PR)。与实验化合物一起温育24小时后，将细胞裂解，采用标准技术测定荧光素酶活性。
将数据拟合到四参数拟合对数曲线以确定EC50值。确定效能百分率(饱和最大响应的化合物)或最大刺激百分率(未达饱和的最大响应的化合物)，所述百分率相对于下列对照激动剂所获得的最大刺激而言：30nM醛固酮用于MR实验；100nM美曲勃龙用于AR实验；30nM普美孕酮用于PR实验；100nM地塞米松用于GR实验。采用拮抗剂模式实验数据，可以同样确定IC50值。在拮抗剂模式中，通过将在低浓度激动剂(0.08nM醛固酮用于MR；0.25nM地塞米松用于GR；0.66nM美曲勃龙用于AR；0.08nM普美孕酮用于PR)存在下的实验化合物活性与实验化合物不存在下低浓度激动剂所产生的响应进行比较，确定抑制百分率。
基本上根据上述方案，化合物(I)在MR、PR、GR和AR实验中(拮抗模式)的IC50值分别约为21nM、924nM、＞10000nM和＞10000nM，在激动模式中对于MR、PR、GR和AR的EC50值均＞10000nM。因此，化合物(I)为hMR的选择性功能拮抗剂。
2.hMR竞争性拮抗分析：
采用上面核激素受体组筛选中所述相同的转染试剂、质粒、启动子、报道子构建物、缓冲液和方法，将人胚胎肾HEK293细胞用人MR转染。将转染的细胞胰蛋白酶化，将其涂布于含有5％活性炭处理的FBS的DMEM介质的96孔盘中，温育4小时后，将其暴露于各种浓度(10倍稀释)的醛固酮中(浓度范围在约0.001nM至0.03μM之间)。在固定浓度的实验化合物存在或者不存在下，确定醛固酮拮抗hMR的性能，采用标准技术通过测定荧光素酶活性进行监测。采用Schild分析，以log(剂量比-1)对log拮抗剂浓度绘图，通过下列方程确定实验化合物的Kb：Log(DR-1)＝Log[拮抗剂]-Log Kb，其中剂量比(DR)代表在实验化合物存在下醛固酮EC50与实验化合物不存在下醛固酮EC50的比值。
基本上根据上述方案，在MR竞争性拮抗实验中，化合物(I)的Kb约为5.1nM，因此证明了化合物(I)为人MR的有效拮抗剂。
C.醛固酮介导的肾病体内模型
雄性单侧肾切除Sprague Dawley大鼠(240-280g)单独饲养，随意给予饮水，每周给予啮齿类5001食物(rodent 5001diet)。适应环境后，收集24基准尿样，分析总尿蛋白和肌酐。根据体重和基准尿蛋白，将动物随即分成实验组。通过尾剪(tail-clip)收集基准血清，分析血尿氮(BUN)、肌酐和电解质。获得基准样品后，在整个研究期间，将除了对照组外的所有大鼠继续给予含有6％盐的食物，给予含有0.3％KCl的饮水。对照组动物在研究期间维持给予5001食物和饮用水，不给予醛固酮。在异氟烷(isoflourane)麻醉下，将能够以0.75μg/h，s.c.传递d-醛固酮的0.01％DMSO溶液(2.5μl/h×28天)的的Alza微型泵植入非对照动物(例如实验化合物组和载体组)。醛固酮植入后第二天，开始每天一次口服管饲(10mL/kg)给予实验化合物(在含有1％羧基甲基纤维素(CMC)/0.25％聚山梨醇酯80的载体中)或者只给予载体。化合物或载体单独给予2和4周后重复收集尿样，分析总尿蛋白和肌酐。在研究结束时，获得8个时间点的药代动力学样本(0.5、1、2、3、6、8、12和24h)。另外，将心脏和肾脏移出并在10％缓冲的福尔马林中固化，用于苏木精和曙红(H&E)以及Masson的三色染色以测定心脏和肾脏组织的结构性损伤。在研究结束时也可以通过心脏穿刺收集血清，进行血清BUN、肌酐和电解质分析。
基本上根据上述方案，当以10mg/kg/天×28天给予化合物(I)时，与载体治疗动物相比，它能够将尿蛋白排泄率减少约60％，因此证明化合物(I)具有有效的体内肾保护活性。
采用下列模型证实化合物具有抗高血压作用。
D.醛固酮调节的高血压的体内模型
将雄性单侧肾切除Sprague Dawley大鼠(240-280g)单独饲养，随意给予饮水，每周给予啮齿类5001食物。适应环境后，将Alzet泵植入动物皮下，以2.5μl/h的速度给予0.25μg/h的醛固酮，多达28天，在试验期间，持续给予含有6％NaCl的食物和含有0.3％KCl的饮用水。植入无线电遥测装置监测动脉血压。例如，在研究期间，每隔10分钟收集每个动物的信号。24小时采集的所有数值的平均值(±SEM)代表每个动物的平均日动脉压。
在泵植入的第二天，每天一次口服管饲(10mL/kg)给予在载体中的实验化合物(载体含有1％中等粘度的羧甲基纤维素钠/0.25％聚山梨醇酯80/0.05％消泡剂1510TM)或只给予载体。
基本上根据上述方案，当每天一次口服给予(1-30mg/kg/天)×14天时，在盐存在的情况下，与载体相比，化合物(I)能够剂量依赖性地降低醛固酮的高血压作用，这证明了化合物(I)具有抗高血压作用。
采用下列模型证实化合物能够降低高钾血症的发生率或可能性。
E.电解质调节的体内试验
将雄性Sprague Dawley大鼠(240-280g)切除肾上腺，手术后6天持续给予5001啮齿类食物和1％NaCl饮用溶液。然后动物禁食过夜，用随意给予的饮用水代替1％的盐饮用水。在实验开始的早上，将禁食动物根据禁食减少的体重随机分组。对照动物(例如没有给予醛固酮或实验化合物的那些动物)通过口服管饲给予10mL/kg实验化合物载体(含有0.5％CMC/0.25％聚山梨醇酯80/2.7％NaCl)并通过皮下注射给予1mL/kg醛固酮载体(0.01％DMSO/水)。载体动物通过口服管饲给予相同的实验化合物载体和醛固酮3μg/kg，s.c。将实验物悬浮于羧甲基纤维素/NaCl载体中。实验化合物治疗组给予悬浮于羧甲基纤维素/NaCl载体中的实验物和3μg/kg s.c的醛固酮。给药后立即将动物置于代谢笼中，可以随意饮水。收集给药后5小时的尿样，分析电解质排泄情况。数据表示为相对于肾上腺切除后载体处理动物的log Na/K排泄比或Na/K比的％。化合物I可以以各种剂量进行试验以确定该化合物诱导尿Na/K比(血清钾浓度增加的指标)增加的程度。
基本上根据上述方案，当给予30mg/kg p.o.，与载体处理动物相比，化合物(I)能够使得脲Na/K排泄比增加仅约30％，这证明化合物(I)能够降低高钾血症产生的发生率或可能性。
无需其它详细说明，相信本领域技术人员能够利用上述说明在最大程度上实施本发明。下面的制备和实施例更详细地阐明本发明并代表了化合物(I)的典型合成方法。对于本领域技术人员而言，试剂和原料易于获得或者易于合成。本领域技术人员可以迅速识别实施例中所述方法的适当的变化形式。本发明化合物的命名通常由ChemDraw
Figure BDA0000085806380000111
版本10.0提供。
本文中使用的下列术语具有指定的含义：“DMSO”代表二甲基亚砜；“DMAC”代表N，N-二甲基乙酰胺；“tBOC”或“boc”代表叔-丁氧基羰基；“TLC”代表薄层色谱。
制备1
1-溴-4-氟-2-(2-碘-苄基氧基)-苯
Figure BDA0000085806380000121
将2-碘苄基溴(90g，0.29mol)、2-溴-5-氟苯酚(57.9g，0.29mol)和碳酸钾(63g，0.46mol)在N，N-二甲基甲酰胺(750mL)中的混合物于室温下搅拌16h。加入水(1L)，将获得的混合物搅拌1小时，过滤固体，用水洗涤，在真空干燥箱中干燥(20mm Hg/60℃)，获得目标化合物(121g，＞100％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ5.11(s，2H)，6.81(t，1H)，7.13(t，1H)，7.19(dd，1H)，7.46(t，1H)，7.59(d，1H)，7.62(t，1H)，7.93(d，1H)。
制备2
3-[2-(2-溴-5-氟-苯氧基甲基)-苯基]-丙烯酸乙酯
Figure BDA0000085806380000122
于55-60℃，向1-溴-4-氟-2-(2-碘-苄基氧基)-苯(117.4g，0.29mol)、乙酸钠(36.1g，0.44mol)、四-正-丁基溴化铵(90.3g，0.29mol)、乙酸钯(II)(1.8g，8mmol，3mol％)和N-甲基吡咯烷酮(900mL)的混合物中滴加丙烯酸乙酯(34.3mL，0.32mol)的N-甲基吡咯烷酮(200mL)溶液。将反应混合物冷却至室温，用水(2L)和甲基叔-丁基醚(2L)处理。将反应物通过硅藻土，加入乙酸乙酯(1L)，分层，用水(2L)洗涤。有机部分经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将获得的固体悬浮于己烷(1L)中，冷藏2h，过滤，用冷的己烷(500mL)洗涤。在真空干燥箱中干燥(50℃/20mm Hg)，获得目标化合物，为浅黄色固体(104.4g，95％)。LC-MS m/z 381.0[M+H]+。
可替代方法：
在氮气环境中，于搅拌下，向清洁干燥的100-加仑反应器中加新鲜的N-甲基吡咯烷酮(72L)、乙酸钠(2721g，33.17mol)、1-溴-4-氟-2-(2-碘-苄基氧基)-苯(9000g，22.11mol)和四丁基溴化铵(7128g，22.11mol)。充入氮气将反应混合物在完全真空下搅拌并脱气30min。使得反应器在氮气下重归环境压力，重复脱气过程。向反应混合物中加入乙酸钯(II)(180g，2％/重量比)，加热至60℃。于60℃，通过加料漏斗向反应混合物中缓解加入丙烯酸乙酯(2258g，22.55mol)的N-甲基吡咯烷酮(18L)溶液。加入完成后，将反应混合物加热至70℃。于70℃继续搅拌最少2h。将反应混合物的内部温度调节至5-10℃。向另一份清洁的适当大小的反应器中加入水(225L)，剧烈搅拌并冷却至内部温度≤5℃。在最少1小时内将反应混合物转移至剧烈搅拌的水中。将获得的混悬液于室温下搅拌30分钟至1小时。通过聚丙烯滤垫过滤，收集浅紫色固体。用水(25L)洗涤滤饼，采用橡胶坝(rubber dam)在滤器上抽干。将固体再置于有水(45L)的反应器中，将混悬液再搅拌30min至1小时。在聚丙烯滤垫上再过滤固体，用水(25L)洗涤滤饼。采用橡胶坝在滤器上抽干。将所得浅紫色物转移至干燥盘中，在通风橱中空气干燥最少24h。将固体于＜50℃真空干燥箱中干燥，获得目标化合物(8.4kg，100％)。
制备3
(E)-(3-氟-6H-二苯并[b，e]氧杂环庚烯-11-亚基)-乙酸乙酯
Figure BDA0000085806380000131
将3-[2-(2-溴-5-氟-苯氧基甲基)-苯基]-丙烯酸乙酯(94g，0.25mol)、乙酸钠(30g，0.37mol)、四-正-丁基溴化铵(81g，0.25mol)和乙酸钯(II)(1.7g，7mmol，3mol％)在N-甲基吡咯烷酮(850mL)中的混合物于100-110℃加热6h。冷却至室温，用水(1L)稀释，通过硅藻土过滤，用乙酸乙酯(2L)洗涤。将其转移至分液漏斗中，加入水(500mL)，分层。用水洗涤(2×1.5L)有机层，经无水硫酸钠干燥，硅胶垫过滤，乙酸乙酯洗涤(1.5L)，浓缩至干。向残留的固体中加入己烷(1L)，冷藏2h，过滤，用己烷(500mL)洗涤，于50℃/20mm Hg干燥，获得目标化合物(64.3g，87％)。LC-MS m/z 299.0[M+H]+。
可替代方法：
在氮气环境中，在搅拌下，向清洁干燥的100-加仑反应器中加入N-甲基吡咯烷酮(83.4L)、乙酸钠(2.706kg，32.98mol)、3-[2-(2-溴-5-氟-苯氧基甲基)-苯基]-丙烯酸乙酯(9.256kg，21.99mol)和四丁基溴化铵(7.088kg，21.99)。将反应混合物充入氮气在完全真空下搅拌并脱气30min。使得反应器在氮气下重归环境压力，重复脱气过程。向反应混合物中加入乙酸钯(II)(167g，2％/重量比)。
将反应物于100℃至125℃加热，搅拌至少3-5h。加入乙酸乙酯(100L)，搅拌30min。加入水(100L)并搅拌30min。停止搅拌，静置最少1小时使其分层。收集有机层，水层用乙酸乙酯萃取(先用50L，然后用25L)。合并有机部分，用水(40L)、20％氯化钠水溶液(2×20L)洗涤，每次最少搅拌30min，静置至少30min分层。有机溶液采用硫酸镁(8.0kg)干燥，加入活性炭(2.0kg)和硅胶60(2.0kg)，搅拌最少1小时。过滤除去固体。滤液在真空下于＜35℃干燥至干。向固体残留物中加入甲醇(20L)。于50-60℃将混合物加热转变为澄清溶液。加入庚烷(40L)，在20℃-25℃冷却。在最少3h内将反应混合物进一步冷却至-10℃。于-10℃搅拌最少12h。过滤收集获得的固体产物，用庚烷∶甲醇混合物(75∶25)洗涤(2×20L)。将固体于＜40℃真空干燥至恒重，获得目标化合物(3.7kg，64％)。
可替代方法2：
将1-溴-4-氟-2-(2-碘-苄基氧基)-苯(50g，0.123mol)、乙酸钠(30.2g，0.369mol)、四丁基溴化铵(39.6g，0.123mol)和乙酸钯(1g)在N-甲基吡咯烷(250mL)中加热至60℃。20分钟内滴加丙烯酸乙酯(12.91g，0.129mol)的N-甲基吡咯烷(50mL)溶液。加入完成后，将混合物加热至145℃3h。将反应混合物冷却至室温，通过硅藻土过滤，采用甲基叔-丁基醚(2×150mL)洗涤固体。采用甲基叔-丁基醚(0.5L)稀释滤液，用水(0.5L)洗涤。分离有机层，用甲基叔-丁基醚萃取水层(2×300mL)。用水(2×200mL)洗涤合并的有机层。有机部分经硫酸镁干燥，活性炭处理，过滤，固体用甲基叔-丁基醚(100mL)处理，浓缩。将残留物在异丙醇(20mL)中、于55℃、无真空下、在Buchi烧瓶中制浆。搅拌下加入庚烷(100mL)。将黑色混悬液置于冷处过夜。过滤固体，用冷的庚烷/异丙醇洗涤(9∶1，2×100mL)，然后用庚烷(50mL)洗涤，于35℃真空干燥至恒重，获得目标化合物，为褐色粉末(22.25g，61％)。
制备4
(E)-11-溴亚甲基-3-氟-6，11-二氢-二苯并[b，e]氧杂环庚烯
Figure BDA0000085806380000151
向(3-氟-6H-二苯并[b，e]氧杂环庚烯-11-亚基)-乙酸乙基酯(69.5g，0.23mol)的异丙醇(725mL)悬浮液中加入氢氧化锂(12.0g，0.53mol)的水(125mL)溶液，将其加热至70℃4h。将混合物冷却至40℃，然后采用冰乙酸(0.44mol，25mL)处理。搅拌15min后，加入N-溴代琥珀酰亚胺(0.25mol，44g)。开始起泡，温度上升至45℃，数分钟后形成固体。于40-45℃将混合物搅拌1小时，冷却至室温。加入亚硫酸钠(4.5g)的水(150mL)溶液、饱和的碳酸氢钠水溶液(150mL)和水(450mL)。过滤获得的混悬液，采用冷的1∶1异丙醇/水(300mL)洗涤。于60℃/20mm Hg将固体干燥过夜，获得目标化合物(65.8g，93％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.9-5.4(br d，2H)，6.63(dd，1H)，6.77(dt，1H)，7.13(s，1H)，7.32-7.46(m，4H)，7.52(dd，1H)。
可替代方法：
在氮气环境中，在搅拌下向清洁干燥的100-加仑反应器中加入异丙醇(125L)、(E)-(3-氟-6H-二苯并[b，e]氧杂环庚烯-11-亚基)-乙酸乙酯(13.857kg，46.42mol)和氢氧化锂(3.896kg，92.84mol)的水(54L)溶液。将反应混合物加热至80℃并搅拌2h。将反应混合物冷却40℃，于40℃至45℃，用20分钟加入乙酸(5.575kg，92.84mol)。于＜45℃，用30分钟分次加入N-溴代琥珀酰亚胺(48.74mol，8.676kg)。将反应物冷却至室温并搅拌至少12h。加入亚硫酸钠水溶液(～37.7L)并搅拌15min。加入碳酸氢钠水溶液(～37.7L)并搅拌15min。加入水(129L)并搅拌30min。过滤收集获得的固体，采用异丙醇∶水洗涤(1∶1，2×20L)。于32℃真空干燥固体至恒重，获得目标化合物(13.8kg，97％)。
制备5
(E)-2-((3-氟二苯并[b，e]氧杂环庚烯-11(6H)-亚基)甲基)-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷
Figure BDA0000085806380000161
向搅拌的(E)-11-(溴亚甲基)-3-氟-6，11-二氢二苯并[b，e]氧杂环庚烯(15g，49mmol)和双戊酰二硼(16g，64mmol)的1，4-二氧六环(250mL)溶液中加入乙酸钾(15g，150mmol)。向混合物中充入氮，加入二氯代[1，1′-二(二苯基膦基)-二茂铁]钯(II)二氯甲烷加合物(1.80g，2.46mmol)，于65℃加热过夜。冷却至室温，通过硅藻土过滤，用乙酸乙酯洗涤，真空浓缩滤液。加入甲醇(200mL)，于非真空条件下在旋转蒸发仪上旋转混合物1小时，形成棕色固体。过滤收集黑棕色固体，将其真空干燥过夜，获得目标化合物(7.28g，42％)。浓缩滤液，经柱色谱纯化，采用0％-16％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱，获得为黄色固体的目标化合物(3.46g，20％)。该反应的总产量为10.7g(62％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.36(dd，J＝8.8，6.8Hz，1H)，7.32-7.27(m，4H)，6.64-6.57(m，1H)，6.48(dd，J＝10.3，2.6Hz，1H)，5.98(s，1H)，5.20(br s，1H)，1.15(s，12H)。
可替代方法：
将50L三颈圆底烧瓶配备机械搅拌器、热电偶、氮入口和回流冷凝器。将其置于加热套中。向烧瓶中加入二氧六环(13.5L)、(E)-11-溴代亚甲基-3-氟-6，11-二氢-二苯并[b，e]氧杂环庚烯(1.600kg，5.24mol)、双戊酰二硼(1.731kg，6.82mol)、乙酸钾(823g，8.38mol)、水(20mL)、三环己基膦(29.5g，0.105mol)和三(二苯亚甲基丙酮)二-钯(48g，0.052mol)。将反应混合物加热至80-85℃。于85-90℃维持反应最少6h。冷却至室温。将反应混合物通过硅藻土垫(2-3in)过滤。采用乙酸乙酯洗涤滤液(2×3.5L)。将滤液在旋转蒸发仪上于50-55℃浓缩。与庚烷一起共蒸发(2×3.5L)形成混悬液。于50℃向浆状物中加入甲醇(2.5L)。搅拌10-15min。将浆状物冷却至-10-0℃20-30min。过滤固体。采用冷(-10℃)的甲醇(2×1.5L)洗涤收集的固体，随后用庚烷洗涤(2×1.5L)。于室温下真空干燥固体，获得为灰白色固体的目标化合物(1.408kg，76％)。
制备6
(2R，4R)-4-羟基-吡咯烷-2-甲酸盐酸盐
Figure BDA0000085806380000171
根据Tetrahedron：Asymmetry，14，(2003)3141-3152中所述方法，在30分钟内，于50℃向乙酸酐(1.437kg，5.65eq)和乙酸(4.225L)的混合物中分次加入反式-4-羟基-L-脯氨酸(331g，2.49mol)。将反应混合物于90℃加热5.5h，然后将其冷却至室温。于室温下将反应物搅拌过夜，然后浓缩。将残留物溶于2N盐酸(4.57L)中，回流30h。将反应混合物冷却至室温，通过硅藻土过滤，于70℃真空浓缩至约700mL。将反应物冷却至室温并搅拌过夜。将获得的浆状物用(1L)稀释，过滤结晶，用乙醚洗涤，真空干燥，获得目标化合物(340g)。将固体溶于热乙醇(2.5L)，冷却，于35℃缓慢搅拌，在1小时内分次缓慢加入乙醚(2.5L)。搅拌2h，过滤获得的白色固体，于真空箱中干燥过夜，获得目标化合物(270.6g，65％)。[α]D20+12.0(c＝1.0在甲醇中)。1H NMR(400MHz，D2O)，δ2.34-2.39(m，1H)，2.45-2.53(m，1H)，3.38(dd，1H)，3.45(d，1H)，4.50(dd，1H)，4.58(br s，1H)。
制备7
(2R，4R)-4-羟基-吡咯烷-1，2-二甲酸1-叔-丁基酯2-甲酯
Figure BDA0000085806380000172
于0℃、氮气环境中，将亚硫酰氯(233mL，3.10mol)滴加至(2R，4R)-4-羟基-吡咯烷-2-甲酸盐酸盐(355g，2.12mol)的无水甲醇(3.5L)中。加入完成后，将反应混合物温热至室温并搅拌6h。减压浓缩反应混合物，获得相应的甲酯盐酸盐，为蜡状固体。将固体于0℃悬浮于无水二氯甲烷(3.5L)，30分钟内小心地加入三乙胺(640mL，4.66mol)，再搅拌30min。顺序加入N，N-二甲基氨基吡啶(39g，0.32mol)和二碳酸二-叔-丁基酯(500g，2.25mol)。将反应混合物温热至室温并搅拌18h。用水(4L)、饱和的碳酸氢钠(4L)和盐水(4L)萃取溶液。有机层用乙二胺(8mL)处理，搅拌15min，采用10％的柠檬酸水溶液(4L)再萃取。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，获得黄色油状物(484g)，将其固化过夜。溶于甲基叔-丁基醚(1L)，浓缩至较小体积。加入己烷(2L)，将混合物静置1小时。过滤白色固体，用己烷洗涤。将白色固体干燥(20mm Hg/60℃)过夜，获得目标化合物(354g，68％)。[α]D20+56.3(c＝1.0在甲醇中)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.43(s，9H)，1.46(s，9H)，2.05-2.10(m，2H)，2.26-2.35(m，2H)，3.48-3.56(m，2H)，3.58-3.61(m，1H)，3.64-3.70(m，2H)，3.77(s，3H)，3.79(s，3H)，4.27-4.29(m，1H)，4.34-4.38(m，2H)。
制备8
(2R，4S)-4-溴-吡咯烷-1，2-二甲酸1-叔-丁基酯2-甲酯
Figure BDA0000085806380000181
在30分钟内，于0-5℃(干冰/二氯甲烷浴)，向(2R，4R)-4-羟基-吡咯烷-1，2-二甲酸1-叔-丁基酯2-甲酯(320g，1.30mol)和四溴化碳(540g，1.94mol)的二氯甲烷(3.2L)溶液中分次加入三苯膦(1.95mol，514g)，于室温下搅拌4h。加入乙醇(3.2L)并再搅拌2h。将反应物转移至18L大玻璃瓶中，加入乙醚(8L)直到沉淀生成。将混合物搅拌过夜。过滤固体，浓缩醚层。将油状残留物溶于二氯甲烷，通过硅胶柱过滤，采用二氯甲烷洗脱直到薄层色谱检测没有产物为止。浓缩二氯甲烷层，采用5％的乙酸乙酯己烷溶液(4L)处理形成白色固体。将混合物通过硅胶柱过滤，采用5％的乙酸乙酯己烷溶液洗脱，只收集合有需要产物的部分。将溶液浓缩，溶于5％的乙酸乙酯己烷溶液(2L)，通过1kg硅胶柱纯化，采用5％的乙酸乙酯己烷溶液洗脱，获得为浅黄色油状物的目标化合物(372.4g，93％)。[α]D20+53.6(c＝1.0在甲醇中)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.33和1.39(two s，9H)，2.40(m，1H)，2.53(m，1H)，3.35(m，1H)，3.66(s，3H)，3.80(m，1H)，4.35(q，1H)，4.73(m，1H)。
制备9
(2R，4R)-4-叠氮基-吡咯烷-1，2-二甲酸1-叔-丁基酯2-甲酯
Figure BDA0000085806380000191
将叠氮化钠(157g，2.39mol)加至(2R，4S)-4-溴-吡咯烷-1，2-二甲酸1-叔-丁基酯2-甲酯(370g，1.20mol)的N，N-二甲基甲酰胺(2.5L)溶液中，于70-75℃、氮气环境中加热16h。冷却至室温，用水(5L)洗涤，用乙酸乙酯(3L)萃取。用盐水(2L)洗涤。用乙酸乙酯(3L)萃取盐水层，合并有机层，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩，获得油状物(324.5g)。将产物溶于乙醚(2L)，用水洗涤(2×2L)，硫酸钠干燥，过滤并浓缩，获得261.2g深黄色油状物。用乙醚(2×2L)再萃取水层，硫酸钠干燥，过滤并浓缩，又获得7.3g产物。总产量268.5g(83％)。[α]D20+39.5(c＝1.0在甲醇中)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.40-1.41(s，9H)，2.09-2.13(m，1H)，2.40-2.44(m，1H)，3.37-3.45(m，1H)，3.61-3.65(m，1H)，3.67-3.69(s，3H)，4.09-4.15(m，1H)，4.25-4.38(m，1H)。
制备10
(2R，4R)-4-叠氮基-2-羟基甲基-吡咯烷-1-甲酸叔-丁基酯
Figure BDA0000085806380000192
于-30℃、氮气环境中，将硼氢化锂(8.50g，351mmol)加至(2R，4R)-4-叠氮基-吡咯烷-1，2-二甲酸1-叔-丁基酯2-甲酯(95g，351mmol)的乙醚(1L)溶液中。1.5h内将温度升高至0℃并再搅拌2h。冷却至-70℃，滴加饱和的碳酸氢钠水溶液(1L)。将其温热至室温，分层，用乙醚(1L)萃取水层。合并醚层，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将获得的产物高真空下干燥，获得黄色油状物(82g，96％)。[α]D20+20.3(c＝1.0在甲醇中)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.38(s，9H)，1.99(br s，1H，OH)，2.20(m，1H)，3.34(m，1H)，3.50-3.78(m，1H)，4.29(m，1H)，4.78(m，1H)。
制备11
(2R，4R)-4-氨基-2-羟基甲基-吡咯烷-1-甲酸叔-丁基酯
将(2R，4R)-4-叠氮基-2-羟基甲基-吡咯烷-1-甲酸叔-丁基酯(225g，0.93mol)和10％披钯炭(22.5g，采用甲苯预先润湿)的甲醇(2.3L)混合物在15psi的氢中于室温下氢化16h。滤除催化剂，浓缩滤液，获得为油状物的目标化合物(198g，92％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.38(s，9H)，1.58(m，1H)，2.16(m，1H)，2.95(m，1H)，3.20-3.58(m，6H)，3.61(m，1H)，3.65(br s，1H)。
制备12
(2R，4R)-4-(4-溴-2-硝基-苯基氨基)-2-羟基甲基-吡咯烷-1-甲酸叔-丁基酯
Figure BDA0000085806380000202
将(2R，4R)-4-氨基-2-羟基甲基-吡咯烷-1-甲酸叔-丁基酯(198g，0.92mol)、5-溴-氟硝基苯(224g，0.98mol)、三乙胺(273mL，1.96mol)的乙酸乙酯(2L)混合物在氮气环境中剧烈搅拌回流16h。冷却至室温，用盐水洗涤。用乙酸乙酯(1L)再萃取盐水层，合并有机层，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将获得的固体溶于温热的乙酸乙酯(2L)，浓缩至约500mL，结晶开始形成。采用己烷(2L)缓慢处理溶液，将混合物于室温下静置2h。过滤收集黄色固体，用己烷洗涤，于40℃/20mm Hg干燥，获得227g需要的产物。减压浓缩滤液，残留物经硅胶柱色谱纯化(2∶3∶5乙酸乙酯/二氯甲烷/庚烷逐渐增加至2∶3乙酸乙酯/庚烷)，又获得54g需要的产物。总产量：281g(70％)。[α]D20-81(c＝1.0，在甲醇中)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.40(s，9H)，1.90(m，1H)，2.48(br s，1H)，3.14(m，1H)，3.45(m，1H)，3.63(m，1H)，3.81(m，2H)，4.29(m，1H)，5.12(m，1H)，7.08(d，1H)，7.65(dd，1H)，8.15(d，1H)，8.57(br d，1H，NH)。
制备13
(2R，4R)-[4-(4-溴-2-硝基-苯基氨基)-吡咯烷-2-基]-甲醇盐酸盐
Figure BDA0000085806380000211
向(2R，4R)-4-(4-溴-2-硝基-苯基氨基)-2-羟基甲基-吡咯烷-1-甲酸叔-丁基酯(125.5g，0.301mol)的二氯甲烷(400mL)溶液中加入4N盐酸的二氧六环溶液(800mL)，于室温下搅拌4h。过滤收集沉淀物，用乙醚洗涤，于20mm Hg/60℃干燥，获得目标化合物(105.2g，99％)。[α]D20-89.6(c＝1.0在甲醇中)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.80-1.85(m，1H)，2.54-2.59(m，1H)，3.43-3.51(m，3H)，3.56-3.63(m，1H)，3.69-3.72(m，2H)，4.50-4.51(m，1H)，5.60(br s，1H)，7.10(d，1H)，7.65(dd，1H)，8.14(d，1H)，8.95(br s，1H)，9.91(br s，1H)。
制备14
(7R，8aR)-7-(4-溴-2-硝基-苯基氨基)-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]
Figure BDA0000085806380000212
嗪-4-酮
Figure BDA0000085806380000213
向搅拌的(2R，4R)-[4-(4-溴-2-硝基-苯基氨基)-吡咯烷-2-基]-甲醇盐酸盐(54.5g，155mmol)的四氢呋喃(375mL)和水(376mL)的溶液中滴加5N氢氧化钠直到pH达到10-12。30分钟内通过分液漏斗加入氯代乙酰氯(27.3mL，337mmol)。在加入酰氯期间采用另一个分液漏斗加入5N氢氧化钠，加入的速度应使得内部pH保持在8-12。搅拌6h，通过过滤收集形成的固体，用水洗涤。减压除去滤液中的有机组分，过滤收集固体。合并两批固体，于60℃/20mm Hg干燥获得51.4g。将固体悬浮于2％甲醇二氯甲烷溶液(1.5L)中，在旋转蒸发仪上于40℃旋转蒸发1小时。过滤收集沉淀物(11g)并弃去。通过硅胶柱过滤，采用二氯甲烷洗脱，浓缩洗脱液，获得为黄橙色固体的目标化合物(32.8g，60％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.68(m，1H)，2.42(m，1H)，3.37(m，1H)，3.49(m，1H)，3.75-3.91(m，3H)，4.10(m，2H)，4.48(m，1H)，7.18(d，1H)，7.64(dd，1H)，7.93(d，1H)，8.19(s，1H)。
制备15
(7R，8aR)-(4-溴-2-硝基-苯基)-(六氢-吡咯并[2，1-c][1，4]
Figure BDA0000085806380000221
嗪-7-基)-胺
向无水四氢呋喃(450mL)中加入(7R，8aR)-7-(4-溴-2-硝基-苯基氨基)-四氢-吡咯并[2，1-c][1，4]
Figure BDA0000085806380000223
嗪-4-酮(32.1g，90.1mmol)，于0至-5℃冷却。用10分钟加入硼烷-二甲基硫化物复合物(26mL，0.279mol)。将混合物加热回流3h。在冰浴中冷却反应混合物，小心地滴加甲醇(450mL)。加入4N盐酸(450mL)并回流2h。冷却至约40℃，通过小心地滴加5N氢氧化钠将pH调节至10-12。减压除去有机溶剂。用水(1.2L)稀释水层，用二氯甲烷(1.2L)萃取。有机层经硫酸钠干燥，过滤并浓缩，获得油状物。此时将该油状物与前面相同制备所获得的产物(采用30.2g酰胺原料起始)合并。将油状物通过硅胶柱，采用二氯甲烷洗脱，除去较高Rf值的成分。采用1％甲醇二氯甲烷溶液洗脱，浓缩获得固体(57.8g)。将固体悬浮于乙醚(1L)中，将其静置过夜。过滤收集固体，采用小量的乙醚洗涤，获得47.5g。浓缩滤液，将其悬浮于乙醚(100mL)中，将其于室温下静置2h。过滤收集又获得3.1g需要的产物。浓缩滤液，残留物经硅胶柱过滤纯化，又获得2.9g橙色固体。合并所有的固体，获得目标化合物(53.5g，89％)。[α]D20-36(c＝1.0在DMSO中)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.21(m，1H)，2.06(m，1H)，2.18(m，1H)，2.42(m，2H)，2.87(d，1H)，2.95(d，1H)，3.18(t，1H)，3.42(t，1H)，3.73(d，1H)，3.85(d，1H)，4.19(m，1H)，7.03(d，1H)，7.66(dd，1H)，8.01(d，1H)，8.18(s，1H)。LC-MS m/z 342.0，344.0(1∶1异toperatio)[M+H]+。
制备16
(E)-[4-(3-氟-6H-二苯并[b，e]氧杂环庚烯-11-亚基甲基)-2-硝基-苯基]-((7R，8aR)-六氢-吡咯并[2，1-c][1，4]
Figure BDA0000085806380000231
嗪-7-基)-胺
Figure BDA0000085806380000232
向烧瓶中加入(7R，8aR)-(4-溴-2-硝基-苯基)-(六氢-吡咯并[2，1-c][1，4]
Figure BDA0000085806380000233
嗪-7-基)-胺(50.9g，0.149mol)、(E)-2-((3-氟二苯并[b，e]氧杂环庚烯-11(6H)-亚基)甲基)-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷(57.5g，0.163mol)、三苯膦(10.1g，39mmol)和甲醇钠(19.7g，0.346mol)的四氢呋喃(1L)和甲醇(500mL)的溶液。向混合物中充入氮气30min。加入乙酸钯(II)(3.00g，13mmol)，向混合物中再次充入氮气30min。在氮气环境中加热回流(60℃)16h。冷却至室温，通过硅藻土过滤并真空浓缩，获得固体。将其溶于1∶1乙酸乙酯/盐水(2L)中，通过硅藻土垫过滤。采用1∶1乙酸乙酯/盐水(2×1L)洗涤所述垫，然后用10％甲醇的二氯甲烷溶液(4×1L)洗涤。分层并合并有机相。有机部分经硫酸钠干燥，过滤并浓缩，获得油状物。将油状物溶于二氯甲烷，通过硅胶垫。采用二氯甲烷洗涤硅胶垫直到Rf值较高的薄层色谱成分除去。采用1％甲醇的二氯甲烷溶液洗脱，真空浓缩，获得泡沫状物。将其溶于乙酸乙酯(2L)，浓缩至约200mL。加入己烷(1.5L)，将混悬液于室温下静置1小时。过滤收集橙色固体，于50℃/20mmHg干燥，获得目标化合物(53g，73％)。[α]D20-26(c＝1.0在DMSO中)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.08(m，1H)，2.02(m，1H)，2.17(m，1H)，2.41(m，2H)，2.88(m，1H)，3.17(m，1H)，3.40(m，1H)，3.73(d，1H)，3.82(d，1H)，4.12(m，1H)，5.02(broad s，1H)，5.59(broad s，1H)，6.60(d，1H)，6.81(m，2H)，6.96(s，1H)，7.05(m，2H)，7.28(t，1H)，7.38(t，1H)，7.60(m，2H)，7.84(s，1H)，8.05(d，1H)。LC-MS m/z 458.3[M+H]+。
实施例1
5-((E)-(3-氟二苯并[b，e]氧杂环庚烯-11(6H)-亚基)甲基)-1-((7R，8aR)-六氢-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]
Figure BDA0000085806380000241
嗪-7-基)-1H-苯并[d]咪唑-2(3H)-酮
(式I)
Figure BDA0000085806380000242
将(E)-[4-(3-氟-6H-二苯并[b，e]氧杂环庚烯-11-亚基甲基)-2-硝基-苯基]-((7R，8aR)-六氢-吡咯并[2，1-c][1，4]嗪-7-基)-胺(52g，0.107mol)、三乙胺(33mL，0.237mol)和5％披铂炭(18g)的四氢呋喃(450mL)混合物于室温下、50psi氢化2h。滤除催化剂，用四氢呋喃洗涤，浓缩，获得褐色泡沫状物。将泡沫状物溶于无水四氢呋喃(500mL)，将其在冰浴中冷却。30分钟内滴加三光气(31.5g，0.106mol)的四氢呋喃(450mL)溶液，于室温下搅拌16h。将溶液浓缩，溶于5％的甲醇二氯甲烷溶液，经短硅胶柱纯化。浓缩获得褐色固体。将固体悬浮于饱和的碳酸氢钠(1.5L)中，在旋转蒸发仪上搅拌1小时。过滤并真空干燥。将其溶于温热的1∶1甲醇/二氯甲烷(约6L)，采用聚(4-乙烯基吡啶)2％交联树脂(170g)处理。搅拌浆状物30分钟，通过硅藻土过滤。将滤液浓缩至约1.5L，过滤收集获得的固体。于80℃/20mmHg干燥过夜，获得为白色固体的目标化合物(38.1g，74％)。[α]D20-20.5(c＝1.0在DMSO中)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.48(m，1H)，2.02(m，1H)，2.19(m，2H)，2.52(m，1H)，2.91(d，1H)，3.03(d，1H)，3.25(t，1H)，3.50(t，1H)，3.79(d，1H)，3.88(d，1H)，4.95(m，1H)，5.03(broad s，1H)，5.60(broad s，1H)，6.59(m，2H)，6.78(m，2H)，6.97(s，1H)，7.02(d，1H)，7.25(t，1H)，7.38(t，1H)，7.48-7.61(m，3H)，10.72(s，1H，NH)。LC-MS m/z 484.0[M+H]+。
采用实施例1中所述制备的材料，获得X-射线衍射图谱，显示其为特征峰位(°2θ值)在约10.5、13.0、15.5和19.7的晶型(I型)。产物的熔点特征通过DSC测定。熔融起始点＝298.9℃
实施例1(a)
5-((E)-(3-氟二苯并[b，e]氧杂环庚烯-11(6H)-亚基)甲基)-1-((7R，8aR)-六氢-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]
Figure BDA0000085806380000251
嗪-7-基)-1H-苯并[d]咪唑-2(3H)-酮
(II型)
将117.7mg的5-((E)-(3-氟二苯并[b，e]氧杂环庚烯-11(6H)-亚基)甲基)-1-((7R，8aR)-六氢-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]
Figure BDA0000085806380000252
嗪-7-基)-1H-苯并[d]咪唑-2(3H)-酮(如实施例1所述制备)加至小瓶中，将其在搅拌盘上以1000rpm的速度于70℃与2.5mL的DMAC混合直到溶解。向样品中缓慢加入水直到出现浑浊，然后散热。继续搅拌30分钟直到溶液中形成白色固体沉淀物。过滤收集固体，于40℃干燥过夜。
采用实施例1(a)中所述制备的材料，获得X-射线衍射图谱，显示其为特征峰位(°2θ值)在约11.3、12.1、18.8和21.0的晶型(II型)。
可替代方法：
(i)在分液漏斗中，采用5％MeOH/CHCl3溶液(5×100mL)萃取5-((E)-(3-氟二苯并[b，e]氧杂环庚烯-11(6H)-亚基)甲基)-1-((7R，8aR)-六氢-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]
Figure BDA0000085806380000253
嗪-7-基)-1H-苯并[d]咪唑-2(3H)-酮4-甲基苯磺酸盐(10.2g，15.55mmoles)(基本上根据下面实施例2中所述方法制备)在1NNaOH(200mL)中的悬浮液。用盐水洗涤有机层，经硫酸钠干燥，通过折叠(pleated)滤器过滤，真空浓缩。将残留物于50℃真空箱中干燥过夜，获得白色固体(6.71g，收率90％)。LC-MS(4min)：RT＝1.87min.，100％M+H＝484.2。
(ii)采用1mL DMAc处理0.1g获自上述可替代方法(i)的产物样品，将获得的悬浮液在80℃油浴中加热30min。向溶液中加入15mL AcCN，在80℃油浴中加热30min，然后于搅拌下冷却至室温。过滤收集固体，然后在50℃真空箱中干燥过夜，回收获得74.5mg产物。
(iii)采用20mL AcCN处理0.1g获自上述可替代方法(i)的产物样品，将获得的悬浮液在80℃油浴中加热30min，然后于搅拌下冷却至室温。过滤收集固体，然后在50℃真空箱中干燥过夜，回收获得81.8mg产物。
(iv)采用20mL IPA处理0.1g获自上述可替代方法(i)的产物样品，将获得的悬浮液在80℃油浴中加热30min，然后于搅拌下冷却至室温。过滤收集固体，然后在50℃真空箱中干燥过夜，回收获得92.8mg产物。
采用上述可替代方法(i)中所述制备的材料，获得X-射线衍射图谱，显示其为特征峰位(°2θ值)在约11.3、12.1、18.8和21.0的晶型(II型)。
实施例2
5-((E)-(3-氟二苯并[b，e]氧杂环庚烯-11(6H)-亚基)甲基)-1-((7R，8aR)-六氢-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]
Figure BDA0000085806380000261
嗪-7-基)-1H-苯并[d]咪唑-2(3H)-酮甲苯磺酸盐
Figure BDA0000085806380000262
将对-甲苯磺酸单水合物(51.70mmol，9.98g)的二甲基乙酰胺(50mL)溶液于40℃油浴中加热30分钟。在剧烈搅拌下，向该均匀的溶液中分次加入5-((E)-(3-氟二苯并[b，e]氧杂环庚烯-11(6H)-亚基)甲基)-1-((7R，8aR)-六氢-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]
Figure BDA0000085806380000263
嗪-7-基)-1H-苯并[d]咪唑-2(3H)-酮(51.70mmol，25.00g)，每次5g。采用二甲基乙酰胺(25mL)洗涤粉末漏斗和容器瓶，将悬浮液于40℃搅拌30分钟直到固体完全溶解。将浅棕色均匀溶液于30℃置于氮气流中过夜。残留物采用乙腈(200mL)稀释，在水浴中超声20分钟。将白色固体悬浮液于60℃油浴中加热3小时。冷却至室温，过滤收集固体。在真空箱中于40℃干燥2天，获得目标化合物(32.88g，97％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ2.00(m，0.5H)，2.29(m，0.5H)，2.44(s，3H)，2.48(m，0.5H)，3.1-4.2(m，7H)，5.10(broad m，2H)，5.55(broad s，1H)，6.60(dd，1H)，6.67(d，1H)，6.78(m，2H)，6.95(m，3H)，7.08(d，2H)，7.21(t，1H)，7.33(t，1H)，7.43(d，2H)，7.57(m，2H)，9.65(s，0.5H)，10.25(s，0.5H)，10.98(s，0.5H)，11.14(s，0.5H)。LC-MS m/z 484.2[M+H]+。
可替代方法：
(a)将85.8mg(0.177mmol)5-((E)-(3-氟二苯并[b，e]氧杂环庚烯-11(6H)-亚基)甲基)-1-((7R，8aR)-六氢-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]
Figure BDA0000085806380000264
嗪-7-基)-1H-苯并[d]咪唑-2(3H)-酮(基本上根据实施例1中所述方法制备)溶于二甲基乙酰胺(2mL)。加入对-甲苯磺酸单水合物(43mg，0.226mmol)并搅拌，直到混合物变为澄清的溶液。加入乙腈(7mL)，蒸发获得澄清的油状物。加入水(2mL)，将样品超声。白色固体沉淀出来后，将样品制浆10分钟。过滤并干燥，获得固体。
(b)将98.0mg的5-((E)-(3-氟二苯并[b，e]氧杂环庚烯-11(6H)-亚基)甲基)-1-((7R，8aR)-六氢-1H-吡咯并[2，1-c][1，4]嗪-7-基)-1H-苯并[d]咪唑-2(3H)-酮(基本上根据实施例1中所述方法制备)溶于2.5mL DMAC。加入1.2eq.的对-甲苯磺酸单水合物并搅拌，直到溶液澄清并无色。加入2mL的88％丙酮，然后加入16mL的水，然后蒸发除去溶剂。向获得的澄清油状物中加入1mL丙酮并超声。干燥获得的凝胶物，获得灰白色固体。将固体再次溶于1∶10THF∶H2O，蒸发获得澄清的油状物，然后与5mL乙腈一起超声。白色固体沉淀出来后，将样品制浆过夜。过滤并干燥获得固体。

Claims (6)

1.化合物，所述化合物为5-((E)-(3-氟二苯并[b,e]氧杂环庚烯-11(6H)-亚基)甲基)-1-((7R,8aR)-六氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]
Figure FDA0000441358150000011
嗪-7-基)-1H-苯并[d]咪唑-2(3H)-酮或其可药用的盐。
2.权利要求1的化合物，所述化合物为5-((E)-(3-氟二苯并[b,e]氧杂环庚烯-11(6H)-亚基)甲基)-1-((7R,8aR)-六氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]
Figure FDA0000441358150000012
嗪-7-基)-1H-苯并[d]咪唑-2(3H)-酮。
3.权利要求1或2化合物或盐在制备用于治疗高血压、糖尿病性肾病或慢性肾病的药物中的用途。
4.药用组合物，所述药用组合物包含权利要求1或2的化合物或盐以及与之混合的一或多种药学上可接受的载体。
5.权利要求4的药用组合物，其中所述载体为稀释剂。
6.权利要求4的药用组合物，所述组合物还包含另外的治疗组分。
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