KR20110120883A - 폐 조직 엔지니어링 - Google Patents

Abstract

본 발명은 탈세포화된 조직을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 천연 폐 조직의 특성을 나타내는 엔지니어링된 3차원 폐 조직을 제공한다. 엔지니어링된 조직은 약물 발견뿐만 아니라 폐 발생 생물학 및 병리학의 연구에도 유용하다.

Description

폐 조직 엔지니어링{TISSUE ENGINEERING OF LUNG}

매년 40만명의 미국인이 폐 질환으로 사망한다. 추가의 관심사 중 폐 질환으로 인한 사망률은 증가하고 있는 반면, 다른 주요 질환 카테고리에 있어서의 사망률은 감소하고 있다 (심장 질환, 암 및 졸중). 낭포성 섬유증, 폐기종/COPD, 및 특발성 폐 섬유증을 비롯한 몇몇 폐 질환에 있어서, 폐 이식이 유일한 최적 치료로 남아있다. 그러나, 폐 이식 후 환자 생존률은 단지 5년에 50%, 10년에 24%이다 (문헌[Mondrinos et al., 2008, Tissue Eng 14:361-8]. 따라서, 이식에 사용될 수 있는 엔지니어링된 폐 조직의 개발이 크게 요구된다. 엔지니어링된 폐 조직의 한 가지 이점은 이 조직을 환자 자신의 세포를 이용하여 성장시킴으로써 현재 폐 이식에서 필요한 강한 면역억제에 대한 필요성을 회피할 수 있다는 것이다. 면역억제는 이식된 장기의 거부를 방지하는 데 필요하지만, 감염, 악성 종양, 신장 손상, 심혈관 문제 및 신경 장애를 비롯한 광범위한 문제에 이르게 될 수 있다 (문헌[Pietra et al., 2000, J Clin Invest 106:1003-10]; [Christie et al., 2009, J Heart Lung Transplant 28:1031-49]).

조직 공학은 임플란트에 적합한 대체 조직을 생성하기 위하여 세포적 진보, 분자적 진보, 기술적 진보 및 의학적 진보의 조합을 추구하는 성장 중인 분야이다. 전도 유망한 연구가 혈관, 방광, 심장 판막 및 심장 조직을 비롯한 다양한 조직에서 행해졌다 (문헌[Nichols et al,. 2008, Proc Am Thor Soc 5:723-30]; [Satchell et al., 2004, J Am Soc Nephrol 15:566-74]; [Atala et al., 2006, Lancet 367:1241-6]; [Orfanos et al., 2004, Intensive Care Med 30:1702-14]). 그러나, 폐는 실험실에서 엔지니어링하기 어려운 조직이다. 폐는 통기의 기계적 압력을 견딜 수 있고, 내피, 상피 및 간엽 세포의 성장을 지지할 수 있고, 매우 상이하지만 친밀하게 병치된 2개의 구획들 사이에서의 가스 교환 수단을 제공하는 복합 매트릭스를 필요로 한다.

엔지니어링된 폐 조직은, 임상 현장에서의 잠재적인 환자의 이용 외에, 폐 생물학 및 생리학의 매우 다양한 중요한 측면을 연구하기 위하여 실험실에서 사용될 수 있다. 매우 적은 시험관내 3차원 폐 배양 모델이 있다 (문헌[Vandenbroucke et al., 2008, Ann N Y Acad Sci 1123:134-45]). 더욱이, 폐의 내피 및 상피 세포는 다수의 다른 세포 유형보다 실험실에서 배양하기가 더 어려우며 (문헌[Malda et al., 2004, Biomaterials 25:5773-80]; [Reichenspurner, 2005, J Heart Lung Transplant 24:119-30], 폐 조상 및 줄기 세포 생물학 분야는 상대적으로 느리게 진보하였다 (문헌[Blaisdell et al., 2009, Stem Cells 27:2263-70]; [Muratore et al., 2008, J Surg Res 155(2):225-30]). 따라서, 당업계에서 천연 폐 환경의 주요 특징이 복제된 시험관내 폐 조직의 개발이 필요하다. 본 발명은 당업계의 이러한 필요를 충족시킨다.

발명의 간단한 개요

본 발명은 세포 성장을 지지할 수 있는 탈세포화 조직을 제공한다. 바람직하게는, 탈세포화 조직은 탈세포화 전에는 상응하는 천연 조직의 특징을 나타낸다. 더욱 바람직하게는, 조직은 폐이다.

일 실시양태에서, 탈세포화 조직은 탈세포화 전에는 동일한 조직의 것과 실질적으로 유사한 형태를 나타낸다.

또 다른 실시양태에서, 청구항 1의 탈세포화 조직은 상기 상응하는 천연 조직의 세포외 매트릭스를 보유하고, 상기 세포외 매트릭스는 외부 표면을 포함하며, 상기 외부 표면은 실질적으로 온전하다.

또 다른 실시양태에서, 면역원성 마커는 탈세포화 조직으로부터 실질적으로 제거되었다.

일 실시양태에서, 탈세포화 조직은 상응하는 천연 조직의 기계적 특성과 실질적으로 유사한 기계적 특성을 나타낸다.

본 발명은 3차원 스캐폴드 (scaffold) 및 세포 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 본 조성물은 폐 세포의 분화 상태를 지지 및 유지할 수 있다.

일 실시양태에서, 3차원 스캐폴드는 탈세포화 조직이다.

또 다른 실시양태에서, 본 조성물은 온전한 기도 트리(airway tree) 및 혈관 네트워크를 나타낸다.

또 다른 실시양태에서, 세포의 집단은 줄기 세포를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 세포의 집단은 상피 및 내피 세포를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 세포는 유전자 변형된다. 일 실시양태에서, 세포는 CFTR 유전자를 발현하도록 유전자 변형된다.

일 실시양태에서, 본 조성물은 폐포 상피 세포의 분화 상태를 지지 및 유지할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 스캐폴드는 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 당단백질, 트롬보스폰딘, 엘라스틴, 피브릴린, 뮤코폴리사카라이드, 당지질, 헤파린 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 케라틴 술페이트, 글리코사미노글리칸, 히알루론산, 프로테오글리칸, 비트로넥틴, 폴리-D-리신, 폴리사카라이드 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 생체적합성 물질을 포함한다.

일 실시양태에서, 세포는 분지 형태형성의 유도와 관련된 유전자 발현을 나타낸다.

또 다른 실시양태에서, 본 조성물은 폐 조직의 특징을 포함한다. 일부 예에서, 상기 특징은 분지 형태형성, 원위 폐 상피 세포분화, 상피 성장, 혈관 발생 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명은 폐 세포를 분화 상태를 지지 및 유지할 수 있는 엔지니어링된 3차원 조직의 제조 방법을 제공한다. 본 방법은 탈세포화된 스캐폴드에 세포의 집단을 접종하여 접종된 스캐폴드를 생성하는 단계를 포함한다.

본 발명은 시험 작용제 (agent)가 폐 조직의 건강을 조정하는 능력에 대하여 시험 작용제를 스크리닝하는 시험관내 방법을 제공한다. 본 방법은 시험 작용제를 엔지니어링된 3차원 폐 조직 모델과 접촉시키는 단계 및 시험 작용제가 모델에 미치는 영향을 측정하는 단계를 포함한다. 모델에 대한 임의의 변경은 시험 작용제가 폐 조직의 건강을 조절할 수 있음을 나타내는 것이다.

일 실시양태에서, 시험 작용제는 화학적 작용제, 의약품, 펩티드, 핵산 및 방사선으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 시험 작용제는 치료제용 전달 비히클이다.

일 실시양태에서, 본 방법은 세포의 수, 면적, 부피, 형상, 형태, 마커 발현 또는 염색체 단편화에 대한 시험 작용제의 영향을 결정하는 단계를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 방법은 폐 조직 모델에 요망되는 영향을 미치는 작용제를 선별하는 단계를 포함한다.

본 발명은 포유류에서 폐 결손을 완화 또는 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 폐 세포의 분화 상태를 지지 및 유지할 수 있는 3차원 구축물을 포함하는 치료 유효량의 조성물을 포유류에게 투여함으로써 포유류에서 폐 결손을 완화 또는 치료하는 단계를 포함한다.

본 발명은 세포 성장을 지지할 수 있는 탈세포화 조직을 함유하는 임플란트가능한 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 탈세포화 조직은 탈세포화 전에 상응하는 천연 조직의 특징을 나타낸다.

일 실시양태에서, 임플란트가능한 조성물은 세포의 집단을 함유한다. 바람직하게는, 임플란트가능한 조성물은 폐 세포의 분화 상태를 지지 및 유지할 수 있다.

본 발명을 예시할 목적으로, 본 발명의 특정 실시양태가 도면에 예시되어 있다. 그러나, 본 발명은 도면에 예시된 실시양태의 정확한 배열 및 수단에 한정되는 것은 아니다.
도 1a 내지 도 1d를 포함하는 도 1은 천연 및 탈세포화 폐의 H&E 염색 및 정량적 DNA 분석을 예시하는 일련의 이미지이다. 도 1은 세포 물질이 제거되었지만 스캐폴드의 뼈대는 유지된 것을 보여준다. DNA는 천연 수준의 대략 1.2%로 제거되었다. *은 p<0.01을 나타낸다. 도 1d는 탈세포화 폐의 이미지이다.
도 2a 및 도 2b를 포함하는 도 2는 탈세포화 스캐폴드 중 잔여 DNA의 염색을 예시하는 일련의 이미지이다. DNA는 DAPI를 사용하여 염색된다. 이미지들은 비교를 가능하게 하기 위하여 동일한 시간 동안 노출되었다.
도 3은 MHC 클래스 I 및 II 항원의 웨스턴 블롯 (Western blot)이며, 이는 탈세포화 스캐폴드에서의 MHC 클래스 I 또는 II 항원의 결여를 입증한다.
도 4a 및 도 4b를 포함하는 도 4는 천연 및 탈세포화 폐에서의 콜라겐의 염색을 예시하는 일련의 이미지이다. 콜라겐 I은 녹색으로 염색되며, 콜라겐 IV는 적색으로 염색되며, 핵은 DAPI에 의해 청색으로 대조 염색된다. 콜라겐 I은 큰 혈관 근처에서 발견되는 반면, 콜라겐 IV는 실질 전체에 걸쳐 분포된다. 천연 폐에서는 실질 내의 적혈구 세포가 자동형광으로 인하여 녹색으로 나타남을 주목하라.
도 5a 및 도 5b를 포함하는 도 5는 천연 및 탈세포화 폐의 주사 EM을 예시한 일련의 이미지이다. 폐포 중격은 온전하다. 스케일바 (scale bar)는 좌측 패널에서 100 ㎛, 우측 패널에서 20 ㎛이다.
도 6a 내지 도 6c를 포함하는 도 6은 천연 및 탈세포화 폐의 투과 EM을 예시하는 일련의 이미지이다. 폐포 기저막은 탈세포화 관류 압력이 30 mmHg 미만으로 유지될 때 보유된다. C는 모세관을 나타내며, A는 폐포를 나타내며, S는 폐포 중격을 나타낸다. 스케일바는 모든 패널에서 2 ㎛이다.
도 7은 보존된 모세관을 보여주는 탈세포화 폐의 투과 EM을 예시하는 이미지이다. 탈세포화에 있어서의 관류 압력은 20 mmHg 미만이었다. C는 모세관을 나타내는 반면, A는 폐포를 나타낸다. 폐포 및 모세관의 치수는 탈세포화 매트릭스의 압축으로 인하여 생체내에서 나타나는 것보다 더 작게 보인다. 스케일바는 상부 패널에서 2 ㎛, 하부 좌측 패널에서 1 ㎛, 하부 우측 패널에서 500 nm이다.
도 8은 탈세포화 스캐폴드에 의한 5 ㎛ 미소구체의 보유를 예시하는 그래프이다. 미소구체 분석에 의하면 탈세포화 동안의 낮은 관류 압력 (<30 mmHg)이 기도 구획에서의 5 ㎛ 입자 중 95%의 보유를 가능하게 함이 입증된다. *는 천연과 비교하여 p<0.05임을 나타낸다.
도 9a 및 도 9b를 포함하는 도 9는 천연 및 탈세포화 폐의 혈관계의 마이크로 CT의 일련의 이미지이다. 전체 탈세포화 스캐폴드는 58 ㎛의 해상도로 이미지화될 때 천연과 유사하게 보인다.
도 10a 및 도 10b를 포함하는 도 10은 천연 및 탈세포화 폐의 고해상도 마이크로 CT를 예시하는 일련의 이미지이다. 이들 스캔의 해상도는 6.5 ㎛이다.
도 11은 기계적 시험 프로토콜을 예시한 개략도이다. 간략하게는, 폐 조직의 스트립을 상부 플레이트에 부착시키고, 그 후 이것을 하강시켜 조직을 하부 플레이트에 부착시킨다. 조직은 주기적으로 20% 변형률로 신장시키고 그 후 파괴될 때까지 신장시킨다.
도 12a 내지 도 12c를 포함하는 도 12는 천연 및 탈세포화 폐의 콜라겐 염색 및 함량을 예시하는 일련의 이미지이다. 마손 3색 염색 (Masson's trichrome stain)은 천연 및 탈세포화 폐 둘 모두에서 파형의 진한 청색 섬유를 보여준다. 정략적 분석에 의하면 천연 및 탈세포화 폐에서 콜라겐의 보존이 입증되지만, 소듐 도데실술페이트 (SDS)를 이용한 탈세포화 후에는 콜라겐이 손실됨이 입증된다. *는 p<0.01을 나타낸다.
도 13a 내지 도 13c를 포함하는 도 13은 천연 및 탈세포화 폐에 있어서 엘라스틴의 조직 화학 (베로프-반 게이슨 (Verhoff-van Geison))을 예시하는 일련의 이미지이다. 도 13은 천연 및 탈세포화 폐 둘 모두에 있어서 파형의 짙은 엘라스틴 섬유를 예시한다. 정량적 분석에 의하면 천연 폐와 비교하여 탈세포화 폐에서 약간의 엘라스틴의 보존이 입증된다. *는 p<0.01을 나타낸다.
도 14a 내지 도 14c를 포함하는 도 14는 천연 및 탈세포화 폐에 대한 GAG 조직화학 (알시안 블루 (Alcian blue))을 예시하는 일련의 이미지이다. 천연 폐에서는 청색 GAG 염색이 예시되어 있지만, 탈세포화 폐에서는 이것이 없다. 정량적 분석에 의하면 천연 폐와 비교하여 탈세포화 폐에서 술페이트화 GAG의 손실이 입증된다. *는 p<0.01을 나타낸다.
도 15는 천연 및 탈세포화 폐의 스트레스-변형률 곡선을 예시하는 이미지이다. SDS는 소듐 도데실술페이트로 처리된 폐를 나타낸다.
도 16은 천연, 탈세포화 및 SDS-탈세포화 폐의 극한 인장 강도를 예시하는 차트이다. SDS는 소듐 도데실술페이트를 사용하여 탈세포화한 폐를 나타낸다. *는 천연과 비교하여 p<0.01을 나타낸다.
도 17a 및 도 17b를 포함하는 도 17은 시험관내 폐 배양에 사용되는 생물반응기의 개략도를 예시하는 일련의 이미지이다.
도 18a 및 도 18b를 포함하는 도 18은 시험관내 폐 배양 동안 폐 동맥 및 기관 (tracheal) 압력을 예시하는 일련의 이미지이다. 관류 속도는 대략 5 ml/min이다.
도 19a 내지 도 19c를 포함하는 도 19는 폐 뼈대 및 기도 상피에 대한 공기 대 액체를 이용한 환기의 영향을 예시하는 일련의 이미지이다. 공기 환기는 3일의 배양 후 기도 상피의 파괴 및 기도 확장을 야기한다.
도 20a 및 도 20b를 포함하는 도 20은 천연 폐 배양 동안 세포수 및 세포 아폽토시스 (apoptosis)에 대한 혈관 관류 및 압력의 영향을 예시하는 일련의 이미지이다. 천연과 비교하여 *는 p<0.01을 나타내며, #는 p<0.05를 나타낸다.
도 21a 내지 도 21d를 포함하는 도 21은 천연 폐 및 관류되고 배양된 폐에서의 CCSP 및 SPC 발현의 비교를 예시하는 일련의 이미지이다. CCSP 및 SPC는 적색으로 염색되며, 이때 핵은 DAPI에 의해 청색으로 대조 염색된다.
도 22a 및 도 22b를 포함하는 도 22는 천연 폐 및 관류되고 배양된 폐에서의 PECAM 발현의 비교를 예시하는 일련의 이미지이다. PECAM 발현이 관류된 폐 배양물 (30 mmHg)에 대하여 여전히 나타내어진다. PECAM은 적색으로 염색되며, 이때 핵은 DAPI에 의해 청색으로 대조 염색된다.
도 23a 및 도 23b를 포함하는 도 23은 천연 폐 배양 동안 세포수 및 세포 아폽토시스에 대한 환기의 영향을 예시하는 일련의 이미지이다. 천연과 비교하여 *는 p<0.01을 나타내며, #는 p<0.05를 나타낸다.
도 24a 내지 도 24c를 포함하는 도 24는 천연 폐 및 환기되고 배양된 폐에서의 아폽토시스 핵을 예시하는 일련의 이미지이다. 단일 연결부를 이용한 환기는 기도 '루프'를 이용한 환기 또는 천연 폐와 비교할 때 훨씬 더 높은 비율의 아폽토시스 핵을 생성하였다. 아폽토시스 핵은 TUNEL을 통해서는 갈색으로 염색되며, 이때 정상 핵은 녹색으로 대조 염색된다.
도 25a 내지 도 25j를 포함하는 도 25는 천연 폐 및 7일간 배양된 폐에서 폐포 구조를 예시하는 일련의 이미지이다. 세포 형태, 폐포 구조 및 중격 뼈대는 천연 폐와 배양되고 환기된 폐 사이에서 유사하게 보인다. 도 25c 내지 도 25j는 시험관내 환기 폐 배양 7일 후 폐 세포 분화의 유지를 예시한다.
도 26은 환기가 폐 혈관계의 수동적 관류를 가능하게 함을 입증하는 이미지이다. 미소구체가 혈관 및 모세관에서 발견되며, 이는 시험관내 배양 동안 단지 폐의 환기 운동으로 인한 것이다.
도 27a 및 도 27b를 포함하는 도 27은 탈세포화 스캐폴드 상에서 배양된 불멸화 상피 세포주 MLE-12의 H&E 염색을 예시하는 일련의 이미지이다.
도 28a 내지 도 28f를 포함하는 도 28은 단리된 신생 폐 세포의 폐 마커의 패널의 유세포 분석 염색을 예시하는 일련의 이미지이다. 청색 또는 녹색 곡선은 이소타입 대조군의 염색이며, 적색은 지시된 항원이다.
도 29는 배양 8일에서의 엔지니어링된 폐의 H&E 염색을 예시하는 이미지이다. 여기에서의 조건은 상피 세포 성장에 대하여 최적화된다.
도 30a 및 도 30b를 포함하는 도 30은 배양 4일 및 8일에서의 엔지니어링된 폐의 PCNA 염색을 예시하는 일련의 이미지이다. 증식 중인 핵은 PCNA에 대하여 갈색으로 염색되며, 음성 핵은 헤마톡실린으로 대조 염색된다.
도 31a 및 도 31b를 포함하는 도 31은 배양 4일 및 8일에서의 엔지니어링된 폐의 TUNEL 염색을 예시하는 일련의 이미지이다. 양성 핵은 갈색인 반면, 음성 핵은 메틸 그린으로 대조 염색된다.
도 32a 및 도 32b를 포함하는 도 32는 4일에서의 천연 폐 및 엔지니어링된 폐의 클라라 세포 분비 단백질 (Clara Cell secretory protein, CCSP) 염색을 예시하는 일련의 이미지이다. CCSP는 적색으로 염색되는 반면, 핵은 DAPI에 의해 청색으로 대조 염색된다.
도 33a 내지 도 33c를 포함하는 도 33은 4일 및 8일에서의 천연 폐 및 엔지니어링된 폐의 계면활성 단백질 C 염색을 예시하는 일련의 이미지이다. SPC는 적색으로 염색되는 반면, 핵은 DAPI에 의해 청색으로 대조 염색된다.
도 34a 내지 도 34c를 포함하는 도 34는 4일에서의 천연 폐 및 엔지니어링된 폐의 아쿠아포린-5 염색을 예시하는 일련의 이미지이다. AQP는 적색으로 염색되는 반면, 핵은 DAPI에 의해 청색으로 대조 염색된다.
도 35a 및 도 35b를 포함하는 도 35는 엔지니어링된 폐 조직에서의 SPC 및 CCSP에 대한 이중 염색을 예시하는 일련의 이미지이다. SPC는 녹색으로 염색되며, CCSP는 적색으로 염색되며, 핵은 DAPI에 의해 청색으로 대조 염색된다. SPC-CCSP 이중 양성 세포는 황색으로 보인다.
도 36a 내지 도 36c를 포함하는 도 36은 천연 폐 및 엔지니어링된 폐의 기저 세포에 있어서 시토케라틴-14 염색을 예시하는 일련의 이미지이다. 시토케라틴은 적색으로 염색되는 반면, 핵은 DAPI에 의해 청색으로 대조 염색된다.
도 37은 엔지니어링된 폐에서의 시토케라틴-14 및 CCSP에 대한 이중 염색을 예시하는 이미지이다. 시토케라틴-14는 적색으로 염색되며, CCSP는 녹색으로 염색되며, 핵은 DAPI에 의해 청색으로 대조 염색된다.
도 38a 및 도 38b를 포함하는 도 38은 천연 폐 및 엔지니어링된 폐의 α-액틴 염색을 예시하는 일련의 이미지이다. α-액틴은 녹색으로 염색되는 반면, 핵은 DAPI에 의해 청색으로 대조 염색된다.
도 39a 내지 도 39f를 포함하는 도 39는 상피 발생에 대한 배지 조성의 영향을 예시하는 일련의 이미지이다. 상피 구조는, BGJb 배지에서 배양될 때 CCSP 발현이 손실되면서 SPC 과립의 정점의 발현쪽으로 인도된다. DMEM 배지에서, 세포는 SPC 및 CCSP 둘 모두의 발현을 보유하며, 이때 SPC는 세포질에서 확산적으로 발현된다.
도 40은 엔지니어링된 상피 조직에서의 계면활성자 발현을 예시하는 이미지이다. 'Lad'는 단백질 사다리이며, 지시된 밴드는 20 및 25 kDa이고; 'Nat'는 천연 폐 조직이며; 'Vent'는 DMEM 배지를 이용하여 환기된 엔지니어링된 폐 조직이고; 'Perf'는 DMEM 배지로 관류된 엔지니어링된 폐 조직이며; 'DMEM'은 DMEM 배지 중에서 정적으로 배양된 엔지니어링된 폐이고; 'BGJb'는 BGJb 배지에서 정적으로 배양된 엔지니어링된 폐이며; 'ALI'는 공기로 환기된 엔지니어링된 폐이고; 'Decell'은 탈세포화 스캐폴드이다.
도 41a 내지 도 41c를 포함하는 도 41은 엔지니어링된 폐 조직에서 상피 발생에 대한 공기에 의한 환기의 영향을 예시하는 일련의 이미지이다. SPC에 대하여 또한 양성인 실질 세포 (상부 좌측)에서 AQP 발현이 나타나며 (도 41b), 이 외에도 입방 상피 세포에서의 때때로 강한 발현이 나타난다 (상부 우측). 입방 상피의 CCSP 발현이 또한 나타난다 (도 41c).
도 42a 및 도 42b를 포함하는 도 42는 천연 폐 및 엔지니어링된 폐에서의 섬모형 상피를 예시하는 일련의 이미지이다. 섬모형 세포는 엔지니어링된 폐에 있어서 적색으로 강조된다.
도 43a 및 도 43b를 포함하는 도 43은 엔지니어링된 폐 배양에 대한 관류 및 환기의 영향을 예시하는 일련의 이미지이다.
도 44a 내지 도 44d를 포함하는 도 44는 엔지니어링된 폐 배양에서 세포 증식 및 아폽토시스에 대한 관류 및 환기의 영향을 예시하는 일련의 이미지이다.
도 45a 및 도 45b를 포함하는 도 45는 엔지니어링된 폐 조직에서 CCSP 발현에 대한 관류 및 환기의 영향을 예시하는 일련의 이미지이다. CCSP는 적색으로 염색되는 반면, 핵은 DAPI에 의해 청색으로 대조 염색된다.
도 46a 및 도 46b를 포함하는 도 46은 엔지니어링된 폐 조직에서 SPC 발현에 대한 관류 및 환기의 영향을 예시하는 일련의 이미지이다. SPC는 적색으로 염색되는 반면, 핵은 DAPI에 의해 청색으로 대조 염색된다.
도 47은 래트 폐 미세혈관 내피 세포를 접종한 피브로넥틴-코팅된 탈세포화 스캐폴드의 H&E 염색을 예시하는 이미지이다.
도 48a 및 도 48b를 포함하는 도 48은 환기된 엔지니어링 폐 내피에 대하여 관류된 것의 H&E 염색을 예시하는 일련의 이미지이다.
도 49a 및 도 49b를 포함하는 도 49는 환기된 엔지니어링된 폐 내피에 대하여 관류된 것의 TUNEL 염색을 예시하는 일련의 이미지이다. 단지 환기를 이용하여 배양된 EC는 관류된 폐보다 실질적으로 더 아폽토시스성이다. 아폽토시스성 핵은 TUNEL을 통하여 갈색으로 염색되는 반면, 음성 핵은 메틸 그린으로 대조 염색된다.
도 50은 엔지니어링된 폐 조직에서 내피 세포들 사이의 치밀 이음부 (tight junction) 형성을 입증하는 이미지이다. 내피 세포는 별표로 표시되어 있으며, 이는 연장된 세포-세포 이음부에 의해 분리된다. 스케일바는 500 nm이다.
도 51a 및 도 51b를 포함하는 도 51은 천연 폐 및 엔지니어링된 폐에서 VE-카드헤린의 발현을 예시하는 일련의 이미지이다. VE-카드헤린은 적색으로 염색되는 반면, 핵은 DAPI에 의해 청색으로 대조 염색된다.
도 52는 2 메가달톤의 FITC-표지된 덱스트란에 대한, 내피 세포 단독이 접종된 엔지니어링된 폐의 투과성을 예시하는 차트이다. *는 탈세포화 스캐폴드와 비교하여 p<0.05를 나타낸다.
도 53은 엔지니어링된 조직의 극한 인장 강도를 예시하는 차트이다. 천연 및 탈세포화 폐의 강도가 또한 예시되어 있다.
도 54a 내지 도 54c를 포함하는 도 54는 엔지니어링된 내피 조직의 성장에 영향을 주는 배지를 예시하는 일련의 이미지이다. 엔지니어링된 관류 내피는 지시된 배지 유형에서 배양되었다. H&E의 조직학적 분석이 좌측 패널에 예시되어 있는 반면, 우측 패널은 (TUNEL을 통하여) 갈색인 아폽토시스성 핵을 예시하는 한편, 정상 핵은 메틸 그린에 의해 대조 염색된다.
도 55는 CHAPS 완충액에서 4-8시간 동안 인큐베이션하여 제조한 탈세포화 기관이 콜라겐 매트릭스를 유지하였으며 조직으로부터의 대부분의 세포의 제거를 나타냄을 입증하는 일련의 이미지이다.
도 56은 탈세포화 기관이 천연 기관에서 보이는 모든 3가지 유형의 COL을 포함함을 입증하는 일련의 이미지이다.
도 57은 탈세포화 기관이 NHBE 유착 및 성장을 지지하였음을 입증하는 일련의 이미지이다.
도 58은 탈세포화 기관이 SAEC 유착 및 성장을 지지하였음을 입증하는 일련의 이미지이다.
도 59는 GFP 렌티바이러스로 감염된 NHBE가 6시간 후에 명백한 형태 변화를 나타내지 않았음을 입증하는 일련의 이미지이다.
도 60은 기도 내로의 점적 주입에 의한 전달 후 상당한 수의 미소구체가 모든 마우스 폐엽에 존재하였음을 입증하는 일련의 이미지이다.
도 61은 폐 내로의 세포의 성공적인 주입, 및 트랜스진으로 형질도입된 인간 상피 세포 (GFP)가 폐 상피에 유착하였음을 입증하는 일련의 이미지이다.
도 62는 트립신 처리 전에 보이는, 주입에 사용한 GFP 세포를 예시하는 일련의 이미지이다.
도 63a 내지 도 63c를 포함하는 도 63은 GFP 양성 인간 기도 상피 세포 (NHBE 및 SAEC 둘 모두)가 기도 내로의 점적 주입 후 수일 동안 마우스 폐에서 발견되었음을 입증하는 일련의 이미지이다.
도 64a 및 도 64b를 포함하는 도 64는 환기 사이클 동안 팽창 및 수축에서의 임플란트 엔지니어링 폐를 보여주는 일련의 이미지이다.

본 발명은 엔지니어링된 폐 조직을 제공한다. 본 발명은 부분적으로는 3차원 폐 조직이 천연 폐 조직의 특징을 나타내도록 생성될 수 있다는 발견을 기반으로 한다.

일 실시양태에서, 엔지니어링된 폐 조직은 탈세포화 천연 폐 조직으로부터 유래된다. 탈세포화 조직에는 실질적으로 세포 및 DNA가 없다. 바람직하게는, 탈세포화 조직에는 면역원성 분자가 또한 없다. 더욱 바람직하게는, 탈세포화 조직은 세포 부착 및 증식에 중요한 몇몇 주요 세포외 매트릭스 분자를 보유한다.

본 발명은 조직을 탈세포화하는 방법을 포함한다. 탈세포화 방법은 폐의 세포외 매트릭스에 대한 모든 손상을 최소화하고 그의 주요 측면은 보유하면서 조직으로부터 세포 및 핵 물질을 제거하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 탈세포화 방법은 조직으로부터 항원성 분자를 제거함으로써 조직이 비-면역원성으로 되게 하는 단계를 또한 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 탈세포화 방법은 세포 배양과 완전히 양립가능하고, 그와 동시에 장벽 기능을 제공하는 탈세포화 스캐폴드를 생성하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 탈세포화 스캐폴드는 온전한 기도 트리 및 혈관 네트워크를 갖는 폐 스캐폴드이다.

또한, 본 발명은 생물반응기를 포함한다. 바람직하게는, 생물반응기는 임의의 3차원 조직의 시험관내 배양을 지지할 수 있다. 일 실시양태에서, 생물반응기는 음압을 통하여 폐를 환기시킬 수 있으며, 이 외에도 생리학적 속도 및 압력에서 혈관 관류 및 환기를 제공할 수 있다. 생물반응기는 특히 혈관계를 통한 배지의 관류, 기도 안으로의 그리고 기도 밖으로의 배지 또는 공기의 이동, 및 (양압뿐만 아니라) 음압을 통한 폐의 환기를 가능하게 한다.

본 발명의 폐 조직의 시험관내 3차원 모델은 폐 발생 생물학의 연구에 유용하다. 게다가, 상기 모델은 특히 약물 발견, 독성 시험, 질환 병리학 등에 유용하다.

또한, 본 발명은 폐 조직이 시험관내에서 생성될 수 있다는 발견에 관한 것이다. 본 시험관내 모델은 폐포를 연상케 하는 구조의 형성을 반복하여 숙주 순환계와 단단히 조화된 선관 상피로 이루어진 단위체를 형성한다. 따라서, 본 발명은 재생성 의약의 형태로서의 혈관 형성 폐 조직의 생성을 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 포유류, 바람직하게는 인간에서 폐 결손을 완화 또는 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 그를 필요로 하는 포유류에게 본 발명의 3차원 구축물을 포함하는 치료 유효량의 조성물을 투여함으로써 포유류에서 폐 결손을 완화 또는 치료하는 단계를 포함한다.

정의

달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 일반적으로 본 발명이 속하는 분야의 숙련자에 의해 보통 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 명명법 및 세포 배양, 분자 유전학, 유기 화학 및 핵산 화학과 혼성화에서의 실험실 절차는 당업계에서 잘 알려져 있고 일반적으로 이용되는 것이다.

표준 기술이 핵산 및 펩티드 합성에 사용된다. 일반적으로 상기 기술 및 절차는 당업계 및 본 문서 전체에 걸쳐 제공된 다양한 일반적인 참고 문헌 (예를 들어, 문헌[Sambrook and Russell, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY], 및 [Ausubel et al., 2002, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY])의 통상적인 방법에 따라 수행된다.

본원에서 부정관사 ("a" 및 "an")는 이 부정관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과 (즉, 적어도 하나)를 나타내기 위하여 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.

"약"이라는 용어는 그가 사용되는 맥락에 기초하여 어느 정도까지 변할 것이며 당업계의 숙련자에 의해 이해될 것이다.

"전구 세포", "조상 세포" 및 "줄기 세포"라는 용어는 당업계에서 상호교환가능하게 사용되며, 본원에서 사용될 때 만능 또는 계통-미결정 (lineage-uncommitted) 조상 세포 중 어느 하나를 나타내는데, 이는 무제한의 수의 유사 분열을 잠재적으로 할 수 있어서 그 자신을 새로 교체하거나 요망되는 세포 유형으로 분화될 자손 세포를 생성한다. 만능 줄기 세포와는 대조적으로, 계통-결정 조상 세포는 일반적으로 표현형이 서로와 상이한 다수의 세포 유형을 초래할 수 없는 것으로 간주된다. 대신, 조상 세포는 하나 또는 아마도 2가지의 계통-결정 세포 유형을 초래한다.

본원에서 사용될 때, "탈분화"라는 용어는 세포가 덜 특수한 상태로 되돌아가는 것을 나타낸다. 탈분화 후, 그러한 세포는 재-프로그래밍 전에 가능한 것보다 더 많은 또는 그와 상이한 세포 유형으로 분화되는 역량을 가질 것이다. 역의 분화 과정 (즉, 탈분화)은 분화보다 더 복잡할 가능성이 있으며, 세포가 더욱 원시적으로 되도록 세포를 "재프로그래밍"하는 것을 필요로 한다.

본원에서 사용될 때, "스캐폴드"는 세포의 유착 및 증식에 적합한 표면을 제공하는, 생체적합성 재료를 포함하는 구조체를 나타낸다. 스캐폴드는 기계적 안정성 및 지지성을 추가로 제공할 수 있다. 스캐폴드는 증식 중인 세포의 집단이 지니는 3차원 형상 또는 형태에 영향을 주거나 그의 한계가 정해지도록 특정한 형상 또는 형태로 존재할 수 있다. 그러한 형상 또는 형태는 필름 (예를 들어, 실질적으로 제3 치수보다 큰 2개 치수를 갖는 형태), 리본, 코드, 시트, 평평한 디스크, 원통, 구체, 3차원 무정형 형상 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본원에서 사용될 때, "생체적합성"은 포유류 내에 임플란트될 때 포유류에서 유해 반응 (adverse response)을 일으키지 않는 임의의 재료를 나타낸다. 생체적합성 재료는 개체 내에 도입될 때 그 개체에 유독하지 않거나 해롭지 않고, 또한 이것은 포유류에서 그 재료의 면역 거부를 유발하지 않는다.

본원에서 사용될 때, "자가 이식"은 생물 재료가 이후에 재도입되는 동일 개체로부터 유래되는 것을 나타낸다.

본원에서 사용될 때, "동종 이식"은 생물 재료가 도입되는 개체와 동일한 종의 유전적으로 상이한 개체로부터 유래되는 것을 나타낸다.

본원에서 사용될 때, "이식편"은 개체 내로 임플란트되어 전형적으로 결손을 대체하거나, 그를 보정하거나 또는 다르게는 그를 극복하는 세포, 조직 또는 장기를 나타낸다. 이식편은 스캐폴드를 추가로 포함할 수 있다. 조직 또는 장기는 동일한 개체로부터 발원하는 세포로 이루어질 수 있으며, 이 이식편은 본원에서 하기의 상호교환가능한 용어로 나타내어진다: "자가이식편", "자가 이식 트랜스플란트 (transplant)", "자가 이식 임플란트" 및 "자가 이식 이식편". 동일한 종의 유전적으로 상이한 개체 유래의 세포를 포함하는 이식편은 본원에서 하기의 상호교환가능한 용어로 나타내어진다: "동종이식편", "동종 이식 트랜스플란트", "동종 이식 임플란트" 및 "동종 이식 이식편". 소정 개체로부터 그의 일란성 쌍둥이로의 이식편은 본원에서 "동계이식편", "동형 이식 트랜스플란트", "동형 이식 임플란트" 또는 "동형 이식 이식편"으로 나타내어진다. "이종이식편", "이종 이식 트랜스플란트" 또는 "이종 이식 임플란트"는 하나의 개체로부터 상이한 종의 또 다른 것으로의 이식편을 나타낸다.

본원에서 사용될 때, "조직 그래프팅" 및 "조직 재건"이라는 용어 둘 모두는 조직 결손, 예컨대 폐 결손 또는 연조직 결손을 치료 또는 완화하기 위하여 개체 내로 이식편을 임플란트하는 것을 나타낸다.

본원에서 사용될 때, 질환, 결손, 장애 또는 상태의 "완화"는 그 질환, 결손, 장애 또는 상태의 하나 이상의 증상의 중증도의 감소를 의미한다.

본원에서 사용될 때, "치료"는 질환, 결손, 장애, 또는 유해한 상태 등의 증상을 환자가 경험하는 빈도를 감소시킴을 의미한다.

본원에서 사용될 때, "치료 유효량"은 조성물이 투여되는 개체에게 유익한 효과를 제공하기에 충분한 본 발명의 조성물의 양이다.

본원에서 사용될 때, "성장 배지"라는 용어는 세포의 성장을 촉진하는 배양 배지를 나타내려는 것이다. 성장 배지는 일반적으로 동물 혈청을 함유한다. 일부 예에서, 성장 배지는 동물 혈청을 함유하지 않을 수도 있다.

본원에서 "분화 배지"는 충분히 분화되지 않은 줄기 세포, 태아 폐 세포 또는 기타 그러한 조상 세포가 배지 중에서 인큐베이션될 때 분화된 세포의 특징들 중 일부 또는 상기 특징 모두를 갖는 세포로 발달하도록 하는, 첨가제를 포함하거나 첨가제가 결여된 세포 성장 배지를 나타내도록 사용된다.

본원에서 사용될 때, "성장 인자 생성물"이라는 용어는 세포에 대하여 성장, 증식, 분화 또는 영양적 영향을 미치는 단백질, 펩티드, 미토겐 또는 기타 분자를 나타낸다. 성장 인자는 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 산성 섬유모세포 성장 인자 (aFGF), 표피 성장 인자 (EGF), 인슐린-유사 성장 인자-I (IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자-II (IGF-II), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), 액티빈-A, 골형성 단백질 (BMP), 인슐린, 성장 호르몬, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 인터루킨 3 (IL-3), 인터루킨 6 (IL-6), 인터루킨 7 (IL-7), 대식세포 콜로니 자극 인자, c-kit 리간드/줄기 세포 인자, 오스테오프로테게린 리간드, 인슐린, 신경 성장 인자, 섬모체 신경영양 인자, 시토카인, 케모카인, 모르포겐, 중화 항체, 기타 단백질, 및 소분자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, FGF는 FGF2, FGF7, FGF10 및 임의의 그의 조합으로부터 선택된 군으로부터 선택된다.

"단리된 세포"는 다른 성분 및/또는 세포로부터 분리된 세포를 나타내는데, 상기 다른 성분 및/또는 세포는 조직 또는 포유류에서 상기 단리된 세포를 자연적으로 동반한다.

본원에서 사용될 때, "태아 폐 세포 (FPC)"는 배의 폐 조직으로부터 단리된 세포를 나타낸다. 혼합된 FPC의 집단은 상피, 간엽 및 내피 세포를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본원에서 사용될 때, "상피 세포"는 신체의 외부 표면을 형성하며 장기, 공동 및 점막 표면을 라이닝하는 세포를 의미한다.

본원에서 사용될 때, "내피 세포"는 혈관 및 림프관과 다양한 다른 신체 공동을 라이닝하는 세포를 의미한다.

본원에서 사용될 때, "실질적으로 정제된" 세포는 다른 세포 유형이 본질적으로 없는 세포이다. 따라서, 실질적으로 정제된 세포는 다른 세포 유형으로부터 정제된 세포를 나타내는데, 상기 실질적으로 정제된 세포는 그의 자연 발생 상태에서 상기 다른 세포 유형과 보통 결부되어 있다.

본원에서 "확장성"은 세포가 증식하는 역량, 예를 들어 수적인 면에서 확장하거나 세포 집단의 경우 집단 배가를 겪는 역량을 나타내기 위하여 사용된다.

"폐 특이적"이라는 용어는 신체 내의 다른 조직과 비교할 때 폐에서 주로 발현되는 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, "폐 특이적" 핵산 분자 또는 폴리펩티드는 신체 내의 임의의 다른 조직보다 5배 더 높은 수준으로 발현된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, "폐 특이적" 핵산 분자 또는 폴리펩티드는 신체 내의 임의의 다른 조직보다 10배 더 높은 수준으로, 더욱 바람직하게는 신체 내의 임의의 다른 조직보다 적어도 15배, 20배, 25배, 50배 또는 100배 더 높은 수준으로 발현된다. 핵산 분자 수준은 핵산 혼성화, 예컨대 노던 블롯 (Northern blot) 혼성화, 또는 정량적 PCR에 의해 측정될 수 있다. 폴리펩티드 수준은 웨스턴 블롯 (Western blot) 분석과 같이, 단백질 수준을 정확하게 측정하기 위한 임의의 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다.

본원에서 "증식"은 유사한 형태의, 특히 세포의 번식 또는 증가를 나타내기 위하여 사용된다. 즉, 증식은 더 많은 수의 세포의 생성을 포함하며, 특히 단순히 세포수를 계수하는 것, ³H-티미딘의 세포 내로의 혼입을 측정하는 것 등에 의해 측정될 수 있다.

본원에서 사용될 때, "조직 엔지니어링"은 조직 대체 또는 재건에서 사용하기 위하여 생체외에서 조직을 생성하는 공정을 나타낸다. 조직 엔지니어링은 "재생성 의약"의 일례이며, 이는 바이오엔지니어링 재료 및 기술과 함께 세포, 유전자 또는 기타 생물학적 빌딩 블록 (building block)의 혼입에 의한 조직 및 장기의 복구 또는 대체에 대한 접근법을 포함한다.

본원에서 사용될 때, "내인성"은 유기체, 세포 또는 시스템 유래의 또는 그 내부에서 생성되는 임의의 물질을 나타낸다.

"외인성"은 유기체, 세포 또는 시스템 내로 도입되거나 그 외부에서 생성되는 임의의 물질을 나타낸다.

"코딩하는"은 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서의 역할을 하여 규정된 뉴클레오티드 서열 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 규정된 아미노산 서열 및 그로부터 생성된 생물학적 특성을 갖게 되는, 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드의 특정 서열의 내재적 특성을 나타낸다. 따라서, 유전자는 그 유전자 생성물에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 기타 생물학적 시스템에서 단백질을 생성할 경우 단백질을 코딩한다. 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 일반적으로 서열 목록에 제공된 코딩 가닥과, 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비-코딩 가닥 둘 모두는 그 유전자 또는 cDNA의 기타 생성물 또는 그 단백질을 코딩하는 것으로 나타내어질 수 있다.

달리 특정되지 않으면, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴성 버전이고 동일 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. RNA 및 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.

"단리된 핵산"은 자연 발생적 상태에서 측면에 위치하는 서열로부터 분리된 핵산 절편 또는 단편, 즉, 보통 DNA 단편에 인접한 서열, 즉, 게놈 내의 상기 단편에 인접한 서열 - 게놈 내에서 상기 단편이 자연적으로 발생함 - 로부터 제거된 DNA 단편을 나타낸다. 상기 용어는 또한 핵산, 즉, RNA 또는 DNA 또는 단백질을 자연적으로 동반하는 다른 성분으로부터 실질적으로 정제된 핵산에 적용되는데, 상기 핵산 또는 단백질은 세포 내에서 상기 다른 성분을 자연적으로 동반한다. 따라서, 상기 용어는 예를 들어 벡터 내로, 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스 내로, 또는 원핵 또는 진핵 생물의 게놈 DNA 내로 혼입된, 또는 다른 서열과는 관계없이 별도의 분자로서 (즉, cDNA 또는 게놈 단편 또는 PCR에 의해 생성된 cDNA 또는 제한 효소 절단물로서) 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 또한 상기 용어는 추가의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.

본 발명의 맥락에서, 공통으로 나타나는 핵산 염기에 대한 하기 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 나타내고, "C"는 시토신을 나타내고, "G"는 구아노신을 나타내고, "T"는 티미딘을 나타내고, "U"는 우리딘을 나타낸다.

본원에서 사용될 때, "전사 제어 하에서" 또는 "작동적으로 연결된"이라는 어구는 프로모터가 RNA 폴리머라제 개시 및 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하기 위하여 폴리뉴클레오티드와 관련하여 올바른 위치 및 배향으로 있음을 의미한다.

본원에서 사용될 때, "프로모터/조절 서열"이라는 용어는 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 연결된 유전자 생성물의 발현에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 일부 예에서, 이 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있으며, 다른 예에서 이 서열은 유전자 생성물의 발현에 필요한 다른 조절 요소 및 인핸서 서열을 또한 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은 예를 들어 조직 특이적 방식으로 유전자 생성물을 발현하는 것일 수 있다.

"구성적" 프로모터는 유전자 생성물을 코딩하거나 그를 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결될 때 세포의 대부분의 또는 모든 생리학적 조건 하에서 세포에서 유전자 생성물이 생성되게 하는 뉴클레오티드 서열이다.

"유도성" 프로모터는 유전자 생성물을 코딩하거나 그를 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결될 때, 실질적으로 프로모터에 상응하는 유도자가 세포에 존재할 때만 세포에서 유전자 생성물이 생성되게 하는 뉴클레오티드 서열이다.

본원에서 사용될 때, "조직"이라는 용어는 뼈, 신경 조직, 건 및 인대를 포함하는 섬유성 결합 조직, 연골, 경뇌막, 심낭, 근육, 폐, 심장 판막, 정맥 및 동맥과, 기타 혈관계, 진피, 지방 조직 또는 선조직을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

"조직-특이적" 프로모터는, 유전자 생성물을 코딩하거나 그를 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결될 때, 실질적으로 세포가 프로모터에 상응하는 조직 유형의 세포일 경우에만 유전자 생성물이 세포에서 생성되게 하는 뉴클레오티드 서열이다.

"벡터"는 단리된 핵산을 포함하고, 세포의 내부에 단리된 핵산을 전달하는 데 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 다수의 벡터가 당업계에 공지되어 있으며, 이는 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 결부된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서 "벡터"라는 용어는 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 또한 상기 용어는 예를 들어 폴리리신 화합물, 리포좀 등과 같이 세포 내로 핵산을 이전시키는 것을 용이하게 하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물을 포함하는 것으로 파악되어야 한다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

"발현 벡터"는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 나타낸다. 발현 벡터는 발현에 충분한 시스-작용 (cis-acting) 요소를 포함하며, 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 당업계에 공지된 모든 것, 예컨대 코스미드, 플라스미드 (즉, 네이키드 (naked) 플라스미드 또는 리포좀 내에 포함된 플라스미드) 및 바이러스 - 이는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함함 - 를 포함한다.

본원에서 사용될 때, "대상체" 및 "환자"라는 용어는 상호교환가능하게 사용된다. 본원에서 사용될 때, 대상체는 바람직하게는 포유류, 예컨대 비-영장류 (예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등) 및 영장류 (예를 들어, 원숭이 및 인간), 가장 바람직하게는 인간이다.

설명

본 발명은 엔지니어링된 3차원 폐 조직 및 3차원 폐 조직의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게는, 폐 조직은 허파 조직이다. 일 실시양태에서, 엔지니어링된 폐 조직은 천연 폐 조직에 의해 예시되는 분지 형태형성을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 천연 폐 조직을 모방하는 시험관내 모델을 제공한다. 시험관내 3차원 폐 조직 모델은 특히 약물 발견, 독성 시험, 질환 병리학 등에 유용하다.

본 발명은 세포 물질은 제거하지만 세포외 매트릭스의 주요 성분들은 보유하는 기술을 이용하여 폐 조직을 탈세포화하는 데 유용한 절차의 발견을 기반으로 한다. 탈세포화 폐 매트릭스의 개발은 조직 엔지니어링 응용을 위한 스캐폴드로서 중요하다. 따라서, 본 발명은 조직 또는 장기를 실질적으로 탈세포화하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, 본 방법은 조직 또는 장기의 면역원성을 유의하게 감소시키거나 제거하여, 이식시에 조직 또는 장기가 수용자의 면역계에 의해 거부되지 않도록 한다. 본 방법은 조직을 공여자로부터 제거하는 단계 및 조직을 프로세싱하여 조직 또는 장기의 실질적으로 모든 세포를 제거하는 단계를 포함한다. 본 방법은 수용자 내로의 임플란트를 위하여 줄기 세포, 태아 세포 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 세포의 접종을 통하여 탈세포화 스캐폴드를 재증식시키는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 탈세포화 스캐폴드에 비-면역원성 세포를 접종한다. 일 실시양태에서, 의도된 수용자에 대하여 자가 이식성인 세포를 탈세포화 스캐폴드에 접종한다. 처리되는 그리고 대체될 조직의 유형에 따라, 접종된 임플란트의 수용자 내로의 임플란트시에 적절한 조직이 형성되도록 당업계에 공지된 또는 이하에서 공지되게 될 상이한 줄기 세포가 선택된다.

일부 예에서, 엔지니어링된 3차원 폐 조직은 조직 상에서 배양된 세포를 포함한다. 임의의 적합한 세포가 본 발명의 탈세포화 조직 상에서의 배양에 사용될 수 있다. 일부 예에서, 줄기 세포는 폐 조직의 재생을 위하여 탈세포화 조직 상에서 배양된다. 일부 예에서, 태아 또는 신생체 폐 세포 (NPC)가 탈세포화 조직 상에서 배양된다. 일부 예에서, 혼합된 NPC 집단이 사용되며, 여기서, NPC 집단은 상피 세포, 간엽 세포 및 내피 세포를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

접종 후, 스캐폴드 상의 세포는 임의로 확장 배지 또는 분화 배지에 처해지거나 조직-특이적 성장 인자의 존재 하에 배양된다. 그 후 본 조성물은 그를 필요로 하는 대상체 내로 임플란트된다. 대상체는 포유류일 수 있지만, 바람직하게는 인간이며 성장 및 임플란트용 세포 공급원은 임의의 포유류, 바람직하게는 인간이다. 임플란트된 조성물은 생체내에서 추가의 세포 성장을 지지하며, 그에 따라 조직 재건을 제공하게 된다. 따라서, 본 발명은 조직 그래프팅 요법에 있어서의 엔지니어링된 3차원 폐 조직의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 생체내에서의 폐 조직의 생성을 포함한다. 바람직하게는, 혈관 형성된 폐 조직이 생체내에서 생성된다. 일 측면에서, 태아 폐 세포는 탈세포화 조직 맥락에서 포유류에게 투여되어 생체내 폐 조직 형성을 용이하게 한다.

본 발명에서, 탈세포화 조직에 신생체 또는 성체 폐 세포와 같은 적합한 세포를 접종할 수 있고 생성된 조성물은 시험관내에서의 전임상적인 약리학적, 생리학적 및 과학적 시험을 위한 혈관 형성된 3차원 폐 조직 모델로서 사용될 수 있음이 입증된다. 게다가, 탈세포화 조직에 신생체 폐 세포 또는 자가 이식 폐 세포와 같은 적합한 세포를 접종할 수 있으며, 생성된 조성물은 생체내에서 조직 재건에 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물 및 방법은 무수하고 유용한 응용을 갖는다. 본 조성물은 개체에서 조직 결손을 완화 또는 치료하는 치료적 방법에서 사용될 수 있다. 또한 본 조성물은 시험관내 또는 생체내에서 치료 화합물을 확인하기 위하여 사용될 수 있으며 따라서 치료적 잠재력을 가질 수 있다.

탈세포화

본 발명은 당업계에 공지된 조직 엔지니어링 기술에 비하여 진보성을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 출발 공급원으로서 탈세포화 조직, 바람직하게는 포유류로부터 유래된 탈세포화 천연 조직을 이용하여 엔지니어링 조직 스캐폴드를 제조하는 방법을 제공한다.

탈세포화 공정은 화학적 방법에 의존한다. 일 측면에서, 화학적 용액, 또는 다르게는 탈세포화 용액으로 지칭되는 것 - 탈세포화에 사용됨 - 은 일반적으로 적어도 고장성 용액, 세제 및 킬레이팅제를 포함한다. 바람직하게는, 고장성 용액은 고장성 염화나트륨 용액이다. 바람직하게는, 세제는 쯔비터이온성 세제, 예컨대 CHAPS이다. 바람직하게는, 킬레이팅제는 EDTA이다.

일 실시양태에서, 탈세포화 용액은 세포와의 삼투압적 양립가능성을 위하여 완충액 (예를 들어, PBS)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 탈세포화 용액은 제한 없이 하나 이상의 콜라게나제, 하나 이상의 디스파제, 하나 이상의 DNase, 또는 프로테아제, 예컨대 트립신과 같은 효소를 또한 포함할 수 있다. 일부 예에서, 탈세포화 용액은 하나 이상의 효소의 저해제 (예를 들어, 프로테아제 저해제, 뉴클레아제 저해제 및/또는 콜라게나제 저해제)를 또한 포함하거나 대안적으로 포함할 수 있다.

일 실시양태에서, 본 발명의 조직 탈세포화 방법은 조직을 탈세포화 용액으로 관류하는 단계를 포함한다. 탈세포화 용액을 조직을 통하여 관류하는 압력은 요망되는 압력으로 조정될 수 있다. 바람직하게는, 탈세포화 용액은 약 30 mmHg 미만의 관류 압력에서 조직을 통하여 관류된다. 더욱 바람직하게는, 탈세포화 용액은 약 20 mmHg 미만의 압력에서 조직을 통하여 관류된다.

일 실시양태에서, 탈세포화 용액은 세포 제거를 행하기 위하여 폐 조직의 기도 내로 도입될 수 있다.

일 실시양태에서, 본 발명의 탈세포화 조직은 혈관 트리 (vascular tree)의 세포외 매트릭스 (ECM) 성분을 포함하여, 상기 조직의 모든 영역 또는 대부분의 영역의 ECM 성분으로 본질적으로 이루어진다. ECM 성분은 하기 중 임의의 것 또는 하기 모두를 포함할 수 있다: 피브로넥틴, 피브릴린, 라미닌, 엘라스틴, 콜라겐 패밀리의 구성원 (예를 들어, 콜라겐 I, III 및 IV), 글리코사미노글리칸, 기저 물질, 망상 섬유 및 트롬보스폰딘 - 이는 기저판과 같은 규정된 구조로 조직화된 채 남아있을 수 있음 - . 성공적인 탈세포화는 조직학적 표준 염색 절차를 이용하면 조직학적 섹션에서 검출가능한 근필라멘트, 내피 세포, 평활근 세포, 상피 세포 및 핵이 없는 것으로서 정의된다. 바람직하게는 - 그러나 반드시 그럴 필요는 없음 - , 잔류 세포 잔사가 탈세포화 조직으로부터 또한 제거되었다.

일 실시양태에서, 천연 조직의 탈세포화 공정은 그 조직의 천연 3차원 구조를 보존한다. 즉, ECM 성분을 포함하여 조직의 형태 및 뼈대가 탈세포화 공정 동안 그리고 상기 공정 후에 유지되어야 한다. ECM의 형태 및 뼈대는 시각적으로 및/또는 조직학적으로 조사될 수 있다. 예를 들어, 실질 장기의 외부 표면 상의 또는 장기 또는 조직의 혈관계 내의 기저판은 탈세포화로 인하여 제거되지 않아야 하거나 유의하게 손상되지 않아야 한다. 게다가, ECM의 피브릴은 탈세포화되지 않은 장기 또는 조직의 것과 유사하거나, 또는 그로부터 유의하게 변화되지 않아야 한다.

일 실시양태에서, 하나 이상의 화합물이 예를 들어 탈세포화 조직의 보존, 또는 재세포화를 위한 탈세포화 조직의 제조 및/또는 재세포화 공정 동안 세포의 보조 또는 자극을 위하여 탈세포화 조직 내에 또는 탈세포화 조직 상에 적용될 수 있다. 그러한 화합물은 하나 이상의 성장 인자 (예를 들어, VEGF, DKK-1, FGF, BMP-1, BMP-4, SDF-1, IGF, 및 HGF), 면역 조절제 (예를 들어, 시토카인, 글루코코르티코이드, IL2R 길항제, 류코트리엔 길항제), 및/또는 응고 캐스케이드 (cascade)를 변형시키는 인자 (예를 들어, 아스피린, 헤파린-결합 단백질 및 헤파린)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 게다가, 탈세포화 장기 또는 조직은 예를 들어 조사 (예를 들어, UV, 감마)를 이용하여 추가로 처리되어 탈세포화 조직 상에 또는 그 내에 남아있는 임의의 유형의 미생물의 존재를 감소시키거나 제거할 수 있다.

본 발명의 탈세포화 용액을 사용하여 탈세포화 조직을 생성하는 것은 혈관 형성을 포함하여 하부 ECM 및 원래 조직의 기타 총체적인 형태적 특징을 온전하게 두면서 조직의 세포를 파괴하는 제어된 정확한 방법을 제공한다. 그러면 탈세포화 스캐폴드는 적절한 세포의 접종에 적합해지게 된다. 상기 공정이 시험관내에서 수행될 경우, 접종된 조직은 대체 조직으로서의 수용자 내로의 임플란트에 적합하다. 탈세포화 조직 그 자신에 더하여, 본 발명은 그러한 스캐폴드로부터 생성된 엔지니어링된 조직의 제작 방법을 포함한다.

본 발명은 조직 엔지니어링에서 사용하기 위한 조직 스캐폴드의 생성에 적합한 방법을 제공한다. 조직 공급원은 한정되는 것은 아니지만, 예시적인 실시양태에서 조직은 돼지, 소, 말, 원숭이 또는 유인원과 같이 (관심있는 조직과 관련하여) 인간과 유사한 해부적 구조를 갖는 것으로 인식된 동물 또는 상대적으로 큰 동물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 조직 공급원은 인간이며, 그의 사용은 스캐폴드를 기반으로 한 엔지니어링된 조직의 거부 가능성을 감소시킬 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 방법은 조직의 온전한 혈관 구조, 예컨대 폐포 뼈대를 남기고, 이때 폐포 중격은 보존한다. 본원에서 사용될 때, "온전한"이라는 용어는 요소가 그의 원래 기능을 상당한 정도까지 수행할 수 있는 상태를 나타낸다.

일 실시양태에서, 탈세포화 폐는 정상 폐 매트릭스의 몇몇 주요 특징을 보유한다. 예를 들어, 탈세포화 폐는 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴 및 프로테오글리칸 중 적어도 하나 이상을 포함한다.

탈세포화 조직은 주요 조직적합성 복합체 (major histocompatibility complex, MHC) 클래스 I 또는 II 항원을 보유하지 않으며, 따라서 조직은 수용자에게 투여될 때 해로운 면역 반응을 이끌어내지 않는다.

탈세포화 조직은 정상적인 천연 폐의 기계적 특성을 보유한다. 탈세포화 조직은 정상적인 천연 폐의 장벽 기능의 일부를 또한 보유한다.

생물반응기

본 발명은 조직의 탈세포화 및/또는 재세포화를 위한 시스템 (예를 들어, 생물반응기)을 제공한다. 생물반응기는 세포 생육성, 세포 분화 상태 및 폐 형태의 유지를 가능하게 한다. 탈세포화 스캐폴드는, 적합한 세포 공급원과 함께 생물반응기에서 배양될 때, 폐 내피, 상피 및 간엽 세포를 포함하는 광범위한 세포 유형의 유착 및 증식을 지지할 수 있다. 본 발명의 생물반응기는 생체내 환경의 주요 특징을 포함한다. 생물반응기는 탈세포화 및/또는 재세포화 공정의 최적화를 위한 변형을 허용하도록 디자인되었다. 일 실시양태에서, 생물반응기는 사용자에 의해 특정된 속도로 그리고 포유류의 생리학적 유동 및 압력 수준 내에서 혈관계를 통하여 배지를 관류시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 생물반응기는 기관을 통하여 공기 또는 배지를 이용하여 조직 (예를 들어, 폐)을 환기시킬 수 있다. 바람직하게는, 양압을 이용한 환기가 또한 행해질 수 있지만, 보통의 생리학적 조건과 일치시키기 위하여 음압 환기가 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 생물반응기는 상이한 배지 유형들이 조직의 혈관 및 기도 구획을 베이딩 (bathe)할 수 있게 한다. 또 다른 실시양태에서, 생물반응기는 배양 배지 내로의 가스 교환을 허용하며, 이와 동시에 환기에 있어서 요망되는 요건을 충족시킨다. 또 다른 실시양태에서, 생물반응기는 압력 측정, 예를 들어 폐동맥 및 기관 압력의 측정을 허용하는 포트 (port)를 갖는다. 바람직하게는, 압력은 정상적인 생리학적 값 이내이다. 또 다른 실시양태에서, 생물반응기는 주기적으로 배지가 교환되게 하는 수단을 갖는다.

일반적으로 본 발명의 생물반응기는 조직의 캐뉼러 삽입을 위한 적어도 하나의 캐뉼러 삽입 기구, 캐뉼러(들)를 통한 배지의 관류를 위한 관류 장치, 및 장기 또는 조직을 위한 살균 환경을 유지하는 수단 (예를 들어, 격납 시스템)을 포함한다. 일반적으로 캐뉼러 삽입 기구는 조직의 공동, 도관 및/또는 혈관 내로 도입하기 위한, 크기가 적절한 중공 튜빙을 포함한다. 전형적으로, 하나 이상의 혈관, 도관 및/또는 공동이 조직에서 캐뉼러 삽입된다. 관류 장치는 액체 (예를 들어, 세포 파열용 배지)를 위한 지지 용기 (holding container) 및 하나 이상의 캐뉼러를 통하여 액체를 장기를 관통하여 이동시키기 위한 메카니즘 (예를 들어, 펌프, 공기 압력, 중력)을 포함할 수 있다. 탈세포화 및/또는 재세포화 동안의 조직의 살균성은 본원의 다른 곳에 논의된 방법을 이용하여 유지될 수 있다.

생물반응기는 본원에 기술된 바와 같이 조직의 탈세포화 및 재세포화를 위하여 사용될 수 있다. 본 방법은 특정한 관류 특징 (예를 들어, 압력, 부피, 유동 패턴, 온도, 가스, pH), 기계적 힘 (예를 들어, 심실벽 운동 및 응력), 및 전기 자극 (예를 들어, 페이싱 (pacing))에 대하여 모니터링될 수 있다. 관류의 유효성은 유출물 및 조직 섹션에서 평가될 수 있다. 관류 부피, 유동 패턴, 온도, O₂ 및 CO₂ 분압 및 pH는 표준 방법을 이용하여 모니터링될 수 있다.

센서를 이용하여 생물반응기 및/또는 조직을 모니터링할 수 있다. 소노마이크로미터법, 마이크로마노미터법 및/또는 전도성 측정을 이용하여 압력-부피를 획득할 수 있다. 예를 들어, 센서를 이용하여 캐뉼러 삽입된 장기 또는 조직을 관통하여 이동하는 액체의 압력; 장기 또는 조직의 온도 및/또는 당해 시스템에서의 주위 온도; 캐뉼러 삽입된 장기 또는 조직을 통하여 이동하는 액체의 유동 속도 및/또는 pH; 및/또는 재세포화 조직의 생물학적 활성을 모니터링할 수 있다. 그러한 특징을 모니터링하기 위한 센서를 갖는 것에 더하여, 조직의 탈세포화 및/또는 재세포화를 위한 시스템은 그러한 특징을 유지 또는 조정하는 수단을 또한 포함할 수 있다. 그러한 특징을 유지 또는 조정하는 수단은 온도계, 서모스탯, 전극, 압력 센서, 오버플로우 밸브, 액체의 유동 속도를 변화시키는 밸브, 용액의 pH를 변화시키는 데 사용되는, 유체 연결부를 용액에 대하여 개폐하는 밸브, 벌룬, 외부 페이스메이커 및/또는 컴플라이언스 챔버와 같은 구성요소를 포함할 수 있다. 안정한 조건 (예를 들어, 온도)의 보장을 돕기 위하여, 챔버, 저장부 및 튜빙이 워터자켓화될 (water-jacketed) 수 있다.

생물반응기는 세포 생존 및 분화를 지지하기 위하여 폐 조직에 충분한 영양제 공급 및 기계적 자극을 제공할 수 있다. 생물반응기는 시험관내 폐 조직 배양에 그리고 엔지니어링된 폐 조직 배양물에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 생물반응기는 본 발명의 탈세포화 폐 스캐폴드를 사용하여 엔지니어링 폐 조직을 배양하는 데 사용된다.

폐 조직의 실제 3차원 절편의 시험관내 배양이 가능한 생물반응기의 개발은 임상적으로 유용한 엔지니어링된 폐 조직의 개발에 있어서 중요한 단계이다. 예를 들어, 엔지니어링된 폐 조직의 성장 및 성숙은 엔지니어링된 폐의 수용자 내로의 임플란트 이전에 생물반응기에서 일어남으로써 생체내에서 최종 임플란트된 폐 조직의 기능성을 향상시킬 수 있다. 게다가, 시험관내 폐 배양용 생물반응기를 사용하여 폐 생물학, 생리학 및 발생의 연구를 보조할 수 있다. 즉, 폐포-모세관 장벽을 형성하는 폐 내피 세포 및 상피 세포의 상호작용이 본 발명의 엔지니어링된 폐 조직 및 생물반응기를 이용하여 연구될 수 있다. 당업자라면 현재 사용되는 다양한 동물 모델보다 더 제어된 환경에서 폐 거동을 연구할 수 있다. 엔지니어링된 폐 조직 및 생물반응기는 많은 시간을 요하는 그리고 비용이 많이 드는 인간 또는 동물 실험에 착수하기 전에 인간 또는 동물 조직에서의 약리학적 시험 및 조사에 또한 사용될 수 있다.

조성물

본 발명의 조성물은 엔지니어링된 폐 조직을 포함한다. 바람직하게는, 엔지니어링된 폐 조직은 하기 특성들 중 임의의 하나 이상을 나타낸다: 1) 혈관계 및 기도 - 여기서, 환기될 수 있는 개방된 기도 트리 및 개방된 관류 혈관계가 있음 - ; 2) 가스 교환 - 여기서, 엔지니어링된 폐는 기도 구획과 혈관 구획 사이에서 충분한 가스의 교환을 하여서 수용자의 생리학적 필요성을 지지할 수 있으며; 가장 바람직하게는 폐정맥에서의 산소의 분압이 50 mmHg 이상임 - ; 3) 기계적 특성 - 여기서, 엔지니어링된 조직은 모든 필요한 움직임, 특히 호흡 운동 및 혈관 관류와, 외과적 임플란트 동안의 조작을 견디기에 충분히 강함 - ; 4) 면역원성 - 여기서, 엔지니어링된 폐 조직은 수용자 내로 임플란트될 때 면역 반응을 일으키지 않음 - .

본 발명의 조성물 및 방법은 임의의 적합한 세포를 이용하여 실시될 수 있다. 바람직하게는, 적합한 세포 또는 세포들은 재생성이며, 본 발명의 탈세포화 조직의 재세포화에 사용될 수 있다. 재생성 세포의 예는 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 제대혈 세포, 조직-유래된 줄기 또는 조상 세포, 골수-유래된 스텝 또는 조상 세포, 혈액-유래된 줄기 또는 조상 세포, 간엽 줄기 세포 (MSC), 골격근-유래된 세포, 다능성 성체 조상 세포 (MAPC), 태아 폐 세포, 분화된 폐 상피 세포, 폐 조상 세포, 혈관 조상 세포, 분화된 혈관 세포 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 추가의 재생성 세포는 골수-유래된 줄기 세포, 예컨대 골수 단핵 세포 (BM-MNC), 내피 또는 혈관 줄기 또는 조상 세포, 및 말초 혈액-유래된 줄기 세포, 예컨대 내피 조상 세포 (EPC)를 포함한다.

바람직하게는, 적합한 세포는 포유류, 더욱 바람직하게는 영장류, 더욱 더 바람직하게는 인간으로부터 단리된다. 본 발명의 방법에서 유용한 세포는 본원에서, 예를 들어 실시예 섹션에서 논의된 방법을 사용하여, 또는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 단리된다. 단리 후, 적합한 세포는 배양 배지에서 배양된다.

비제한적 예로서, 신생체 폐 세포 (NPC)가 세포 배양과 관련하여 더욱 상세하게 기술된다. 그러나, 당업자라면 배양 조건이 적합한 세포에 대해 변경될 수 있음을 인식할 것이다. 폐 세포의 성장을 지지하는 배지 제형은 최소 필수 배지 이글 (Minimum Essential Medium Eagle), ADC-1, LPM (소 혈청 알부민 없음), F10 (HAM), F12 (HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ 배지 (피톤-잭슨 변형 (Fitton-Jackson Modification)이 있거나 없음), 기본 배지 이글 (Basal Medium Eagle) (얼 염 (Earle's salt) 베이스가 첨가된 BME), 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (혈청을 포함하지 않는 DMEM), 야만 (Yamane), IMEM-20, 글래스고 변형 이글 배지 (Glasgow Modification Eagle Medium, GMEM), 레이보비츠 (Leibovitz) L-15 배지, 맥코이 5A 배지 (McCoy's 5A Medium), 배지 M199 (얼 염 베이스를 포함하는 M199E), 배지 M199 (행크 염 (Hank's salt) 베이스를 포함하는 M199H), 최소 필수 배지 이글 (얼 염 베이스를 포함하는 MEM-E), 최소 필수 배지 이글 (행크 염 베이스를 포함하는 MEM-H) 및 최소 필수 배지 이글 (비필수 아미노산을 포함하는 MEM-NAA) 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법에서 유용한 배지의 추가의 비제한적인 예는 적어도 1% 내지 약 30%, 바람직하게는 적어도 약 5% 내지 15%, 가장 바람직하게는 약 10%의 농도의 소 또는 기타 종의 태아 혈청을 포함할 수 있다. 소 또는 기타 종의 배아 추출물은 약 1% 내지 30%, 바람직하게는 적어도 약 5% 내지 15%, 가장 바람직하게는 약 10%의 농도로 존재할 수 있다.

전형적으로, NPC 배양 배지는 베이스 배지, 혈청 및 항생제/항곰팡이제를 포함한다. 한 가지 바람직한 배이스 배지는 DMEM/F12 (1:1)이다. 바람직한 혈청은 소 태아 혈청 (FBS)이지만, 말 혈청 또는 인간 혈청을 포함하는 다른 혈청이 사용될 수도 있다. 바람직하게는 최대 20%의 FBS가 NPC의 성장을 지지하기 위하여 상기 배지에 첨가된다. 그러나, NPC 성장에 있어서 FBS 중 필요한 성장 인자, 시토카인 및 호르몬이 확인되고 성장 배지 중에 적절한 농도로 제공될 경우 규정 배지가 사용될 수 있다. 추가의 성분이 배양 배지에 첨가될 수 있음이 추가로 인식된다. 그러한 성분은 항생제, 항곰팡이제, 알부민, 성장 인자, 아미노산 및 세포의 배양을 위한 당업계에 공지된 기타 성분들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 배지 내에 첨가될 수 있는 항생제는 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 배양 배지 중 페니실린의 농도는 1 ml 당 약 10 내지 약 200 단위이다. 배양 배지 중 스트렙토마이신의 농도는 약 10 내지 약 200 ㎍/ml이다. 그러나, 본 발명은 NPC의 배양을 위한 임의의 하나의 배지에 한정되는 것으로 파악되어서는 결코 안된다. 오히려, 조직 배양에서 폐 세포를 지지할 수 있는 임의의 배지가 사용될 수 있다.

게다가, NPC 배양 배지는 적어도 하나의 성장 배지가 보충될 수 있다. 바람직하게는, 성장 배지는 섬유모세포 성장 인자 (FGF)이다. 예를 들어, FGF10, FGF7, FGF2의 임의의 조합이 NPC 배양 배지에 보충될 수 있다. FGF7의 바람직한 농도는 약 0.1-100 ng/ml (및 그 사이의 임의의 정수)이며, 더욱 바람직하게는 상기 농도는 약 10 ng/ml이다. FGF10의 바람직한 농도는 약 1-200 ng/ml (및 그 사이의 임의의 정수)이며, 더욱 바람직하게는 상기 농도는 약 25 ng/ml이다. FGF2의 바람직한 농도는 약 1-200 ng/ml (및 그 사이의 임의의 정수)이며, 더욱 바람직하게는 상기 농도는 약 25 ng/ml이다.

단리 후에, NPC는 세포가 또 다른 배양 장치로 전해지기 전에 세포가 융합성에 도달될 때까지 또는 소정 기간의 시간 동안 배양 장치에서 배양 배지 중에서 인큐베이션될 수 있다. 처음 도말 후, 세포를 약 6일의 기간 동안 배양물 형태로 유지하여 계대 0 (P0)의 집단을 생성할 수 있다. 세포는 무한 횟수 동안 계대될 수 있으며, 각각의 계대는 세포를 약 6-7일 동안 배양하는 것을 포함하는데, 그 시간 동안 세포 배가 시간은 약 3 내지 약 5일의 범위일 수 있다. 배양 장치는 시험관내에서 세포를 배양하는 데 보통 사용되는 임의의 배양 장치의 것일 수 있다.

NPC는 소정 기간의 시간 동안 또는 세포가 특정한 융합 수준에 도달될 때까지 FGF로 보충된 배양 배지에서 배양될 수 있다. 바람직하게는, 융합 수준은 70% 초과이다. 더욱 바람직하게는, 융합 수준은 90% 초과이다. 소정 기간의 시간은 시험관내에서의 세포의 배양에 적합한 임의의 시간일 수 있다. NPC 배양 배지는 임의의 시점에서 NPC의 배양 동안 교체될 수 있다. 바람직하게는, 배양 배지는 매 3일 내지 4일마다 교체된다. 그 후 NPC는 배양 장치로부터 수확되며, 그 때 NPC는 즉각적으로 사용되거나 냉동보존되어 이후의 시점에서의 사용을 위하여 보관될 수 있다. NPC는 트립신 처리, EDTA 처리, 또는 배양 장치로부터 세포를 수확하는 데 사용되는 임의의 기타 절차에 의해 수확될 수 있다.

본원에 기술된 NPC는 통상적인 절차에 따라 냉동보존될 수 있다. 바람직하게는, 약 백만개 내지 천만개의 세포가 액체 N₂의 증기상에서 10% DMSO를 함유하는 배양 배지 중에 냉동보존된다. 냉동된 세포는 37℃ 조에서 선회시킴으로써 해동시키고, 신선한 성장 배지에 재현탁시키고, 상기에 기술된 바와 같이 확장시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 스캐폴드에 "접종되는" 세포를 제공한다. NPC는 스캐폴드 상에서 배양될 수 있다. 세포는 또한 세포를 분화 배지에서 배양함으로써 시험관내에서 분화될 수 있다. 대안적으로, 세포는 세포가 포유류 내에서 조직과의 접촉을 확립할 때 또는 세포가 조직으로부터 방출되는 물질 (예를 들어, 성장 인자, 효소 또는 호르몬)에 의해 영향을 받도록 조직에 충분히 가깝게 있을 때 생체내에서 분화될 수 있다. 환언하면, 매트릭스의 NPC는 조직으로부터 시그널을 받음에 의해 폐와 같은 조직과의 접촉을 확립할 수 있다. 그러한 시그널링은 예를 들어 NPC의 표면 상의 또는 NPC의 계통을 잇는 세포의 표면 상의 수용체가 포유류 내에서 조직에 의해 방출된 성장 인자, 효소 또는 호르몬과 같은 분자에 결합하여 그로부터의 시그널을 변환시킬 때 일어난다. 이들 작용제는 분화를 인도하여 NPC가 분화된 세포가 내부에 위치한 조직에서 분화된 세포에 의해 통상적으로 발현되는 상기 단백질 중 일부, 및 (전부는 아니라도) 아마도 대부분을 발현하게 된다.

대안적으로, 또는 부가적으로, 매트릭스의 NPC는 세포의 환경에 물질 (예를 들어, 성장 인자, 효소, 호르몬 또는 기타 시그널링 분자)을 첨가함으로써 분화되도록 유도될 수 있다. 예를 들어, 물질은 본 발명의 생물학적 스캐폴딩에 첨가될 수 있다.

NPC 및 결부된 세포 매트릭스는 결국 완전히 분화되는 한편, 및 이것은 몇몇 환경에서 (예를 들어, 세포를 사용하여 조직학적으로 성숙하고 완전한 조직을 재생성하는 경우) 바람직한 한편, 투여된 세포 모두가 성공적인 치료를 달성하기 위하여 완전히 분화될 필요는 없으며, 세포 매트릭스의 NPC는 포유류를 치료하기에 충분한 지점까지만 분화될 필요가 있다. 그 지점은 매트릭스가 환자에게 투여되기 전 또는 그 후에 도달될 수 있다.

분화는 매트릭스의 세포가 임플란트 부위에서 성숙 세포와 본질적으로 동일한 표현형을 발현할 때 일어난다. 예를 들어, 본 발명을 규정할 목적에 있어서, 폐 내로 임플란트된 세포 매트릭스의 NPC는 이것이 폐, 예를 들어 폐포 상피 세포에 의해 발현되는 본질적으로 동일한 단백질을 발현할 때 분화된다. 폐 마커에 대한 항체는 구매가능하거나 다르게는 쉽게 획득가능하다.

분화된 세포는 그의 총체적인 형태에 의해 및 그가 다른 세포와 함께 형성하는 연결부에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 폐 세포로 분화되는 세포는 세기관지와 비슷한 복잡한 형태를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 3차원 스캐폴드 상에서 NPC를 배양하면 성숙 폐 세포의 특징을 나타낼 수 있다는 신규한 발견에 기초한다.

장기 또는 조직을 생성하기 위하여 탈세포화 장기 내에 또는 상기 탈세포화 장기 상에 도입되는 세포의 수는 장기 (예를 들어, 장기의 종류, 장기의 크기 및 중량) 또는 조직과, 재생성 세포의 유형 및 발달 상태 둘 모두에 의존적이다. 상이한 유형의 세포는 그 세포가 도달할 집단의 밀도에 관하여 상이한 경향을 가질 수 있다. 이와 유사하게, 상이한 장기 또는 조직은 상이한 밀도로 세포화될 수 있다. 예로서, 탈세포화 장기 또는 조직에 적어도 약 1,000개 (예를 들어, 적어도 10,000개, 100,000개, 1,000,000개, 10,000,000개 또는 100,000,000개)의 재생성 세포를 접종할 수 있거나, 이는 조직에 부착된, 조직 1 mg (습윤 중량, 즉, 탈세포화 이전의 중량) 당 약 1,000개의 세포 내지 조직 1 mg (습윤 중량) 당 약 10,000,000개의 세포를 가질 수 있다.

세포는 하나 이상의 위치 내로의 주입에 의해 탈세포화 장기 또는 조직에 도입될 수 있다. 게다가, 한 가지 초과의 유형의 세포 (즉, 세포의 칵테일 (cocktail))이 탈세포화 장기 또는 조직 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 세포의 칵테일은 탈세포화 장기 또는 조직 내의 다수의 위치에서 주입될 수 있거나, 상이한 세포 유형들은 탈세포화 장기 또는 조직의 상이한 부분들 내로 주입될 수 있다. 주입에 대하여 대안적으로, 또는 그 외에, 재생성 세포 또는 세포의 칵테일은 캐뉼러 삽입된 탈세포화 장기 또는 조직 내로 관류에 의해 도입될 수 있다. 예를 들어, 세포는 관류 배지를 사용하여 탈세포화 장기 내로 관류될 수 있으며, 그 후 상기 관류 배지는 재생성 세포의 성장 및/또는 분화를 유도하기 위하여 확장 및/또는 분화 배지로 교환될 수 있다. 폐 조직의 경우, 세포는 기관을 통하여 기도 구획 내로 또는 폐 동맥 또는 정맥을 통하여 혈관 구획 내로 또는 이들 둘 모두의 내부로 도입될 수 있다.

재세포화 동안, 장기 또는 조직은 재생성 세포 중 적어도 일부가 탈세포화 장기 또는 조직 내에서 그리고 탈세포화 장기 또는 조직 상에서 번식 및/또는 분화될 수 있는 조건 하에 유지된다. 상기 조건은 제한 없이 적절한 온도 및/또는 압력, 전기적 및/또는 기계적 활동, 힘, 적절한 양의 O₂ 및/또는 CO₂, 적절한 양의 습도, 및 살균 조건 또는 살균과 가까운 조건을 포함한다. 재세포화 동안, 탈세포화 장기 또는 조직 및 그에 부착된 세포는 적합한 환경에서 유지된다. 예를 들어, 세포는 영양 공급 (예를 들어, 영양제 및/또는 탄소원, 예컨대 글루코스), 외인성 호르몬 또는 성장 인자 및/또는 특정 pH를 필요로 할 수 있다.

세포는 탈세포화 장기 또는 조직에 대하여 동종 이식성일 수 있거나 (예를 들어, 인간 세포가 접종된 인간 탈세포화 장기 또는 조직), 또는 재생성 세포는 탈세포화 장기 또는 조직에 대하여 이종이식성일 수 있다 (예를 들어, 인간 세포가 접종된 돼지 탈세포화 장기 또는 조직).

일부 예에서, 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 장기 또는 조직은 환자 내로 이식되어야 한다. 이 경우, 탈세포화 장기 또는 조직의 재세포화에 사용되는 세포는 재생성 세포가 환자에게 자가 이식성이도록 환자로부터 얻어질 수 있다. 환자 유래의 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 일생의 상이한 단계에서 (예를 들어, 출생 전, 신생 또는 주산기, 청소년기 동안 또는 성체로서) 예를 들어 혈액, 골수, 조직 또는 장기로부터 얻어질 수 있다. 대안적으로, 탈세포화 장기 또는 조직의 재세포화에 사용되는 세포는 환자에 대하여 동계일 수 있거나 (즉, 일란성 쌍둥이로부터 유래), 세포는 예를 들어 환자의 친척 또는 환자와 관련없는 인간 림프구 항원 (HLA)-매칭 개체 유래의 HLA-매칭 세포일 수 있거나, 세포는 환자에 대하여 동종 이식성일 수 있으며, 즉 예를 들어 HLA-비-매칭 공여체 유래의 것일 수 있다.

세포 공급원에 관계 없이 (예를 들어, 자가 이식성이거나 그렇지 않음), 탈세포화 실질 장기는 환자에 대하여 자가 이식성, 동종 이식성 또는 이종 이식성일 수 있다.

특정한 예에서, 탈세포화 조직은 생체내에서 (예를 들어, 조직이 개체 내로 이식된 후) 세포로 재세포화될 수 있다. 생체내 재세포화는 예를 들어 본원에 기술된 세포 중 임의의 것을 이용하여 상기에 기술된 바와 같이 (예를 들어, 주입 및/또는 관류) 수행될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 내인성 세포를 탈세포화 장기 또는 조직에 생체내에서 접종하는 것은 자연적으로 일어날 수 있거나 재세포화 조직에 전달된 인자에 의해 매개될 수 있다.

유전자 변형

본 발명은 본 발명의 탈세포화 조직을 이용하여 포유류에서 폐 세포 요법을 용이하게 할 수 있다는 발견에 관한 것이다.

또 다른 실시양태에서, 탈세포화 폐 조직을 이용하여 요망되는 폐 세포, 예컨대 폐 상피 세포를 배양할 수 있다. 유전자 변형되든 그렇지 않든 간에, 세포는 폐기종, 폐쇄성 세기관지염, 및 낭포성 섬유증을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 폐 질환의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 탈세포화 조직은 인간 폐기도 상피 세포의 배양을 위한 기재로서 사용될 수 있다. 그 후 배양된 인간 기도 상피 세포는 다른 방법들 중에서도 기관 점적 주입, 흡입 또는 주입을 통하여 수용자에게 전달될 수 있다. 배양에서 확장된 그러한 세포를 이용하여 수용자에게 요법을 행할 수 있다. 탈세포화 폐 조직 (예를 들어, 기관)은 폐 상피 세포의 배양 및 확장을 위한 탁월한 플랫폼을 제공하며, 상기 폐 상피 세포는 조직 배양 플라스틱과 같은 전형적인 세포 배양 환경에서 성장시키는 것이 보통은 매우 어렵다.

유전자 요법의 맥락에서, 탈세포화 조직 상에서 배양된 세포는 수용자의 폐 내로 세포를 전달하기 전에 관심있는 유전자로 처리될 수 있다. 일부 경우, 그러한 세포-기반 유전자 전달은 아데노바이러스 유전자 전달 벡터의 흡입과 같이 폐에 유전자를 전달하는 다른 수단의 상당한 이점을 보일 수 있다. 세포-기반 유전자의 숙주로의 전달의 이러한 탁월성은 흡입된 유전자 전달 벡터가 점막층 및 숙주 면역계에 의해 가해지는 장벽으로 인하여 세포 신호전달의 효율성이 전형적으로 불량해지게 된다. 세포 내로 사전 삽입된 치료 유전자의 전달은 수용 폐 세포 내로의 유전자 요법 벡터의 투과와 결부된 문제를 회피한다.

본 발명의 탈세포화 폐 조직은 폐 세포, 예컨대 상피 세포를 표준 조직 배양 플라스틱 상에서의 배양과 비교할 때 고도로 생육가능하고 분화된 상태로 성장시키는 편리하고 효율적인 수단을 제공한다. 다음에는, 탈세포화 매트릭스 상에서의 폐 세포, 예컨대 폐 상피 세포의 확장은 세포 요법에 유효할 만큼 충분히 많은 수의 세포를 제공한다. 게다가, 탈세포화 매트릭스 상에서의 폐 상피 세포의 확장은 배양된 세포가 시험관내에서 유전자 요법 벡터로 처리되는 플랫폼을 제공한다. 그 후, 시험관 내에서 선택된 유전자로 형질감염된 세포는 관심있는 트랜스진을 발현하는 세포에 대해서만 선별되도록 임의로 정제되고, 그 후 그러한 세포 요법을 필요로 하는 수용자 내로 도입될 수 있다. 그러한 접근법은 유전성 폐 질환, 예컨대 낭포성 섬유증의 치료에 있어서 특히 가치 있을 수 있다.

일 실시양태에서, 본 발명은 낭포성 섬유증의 치료 방법을 제공한다. 본 방법은 관심있는 세포, 예컨대 상피 세포를 정상적인 버전의 CFTR 유전자로 형질감염시키는 단계를 포함하는데, CFTR 유전자의 돌연변이 버전은 낭포성 섬유증에 책임이 있는 유전자이다. 기관 내로의 점적 주입, 흡입, 또는 기타 도입 수단에 의해 그러한 형질감염된 세포를 환자 내로 전달하는 것은 이들 환자 내로 유전자 벡터를 전달하는 것과 결부된 상당한 어려움을 완화시킨다. 이러한 방식으로, 낭포성 섬유증에 있어서 유효한 세포 요법 및 유전자 전달이 실현될 수 있다. 그러나, 본 발명은 CFTR 유전자로 형질감염된 세포로 낭포성 섬유증을 치료하는 것에만 한정되어서는 안된다. 오히려, 본 발명은 폐 세포와 결부된 임의의 질환 또는 장애의 치료를 포함한다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 탈세포화 조직 상에서 배양된 유전자 변형 세포, 예컨대 폐 세포의 용도를 제공한다. 유전자 변형은 예를 들어 외인성 유전자 ("트랜스진")를 발현시키거나 내인성 유전자의 발현을 변화시킬 수 있다. 그러한 유전자 변형은 치료 이득을 가질 수 있다. 대안적으로, 유전자 변형은 그렇게 변형된 세포를, 예를 들어 개체 내로의 본 발명의 조성물의 임플란트 후 추적 또는 확인하는 수단을 제공할 수 있다. 세포의 추적은 이식된 유전자-변형 세포의 이동, 융화 (assimilation) 및 생존을 추적하는 것을 포함할 수 있다. 또한 유전자 변형은 적어도 하나의 제2 유전자를 포함할 수 있다. 제2 유전자는 예를 들어 선별가능한 항생제-내성 유전자 또는 또 다른 선별가능한 마커를 코딩할 수 있다.

세포 추적에 유용한 단백질은 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein, GFP), 임의의 다른 형광 단백질 (예를 들어, 향상된 녹색, 시안, 황색, 청색 및 적색 형광 단백질; 클론테크 (Clontech), 미국 캘리포니아주 팔로 알토) 또는 기타 태그 단백질 (예를 들어, LacZ, FLAG-태그, Myc, His₆ 등)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

세포의 유전자 변형 목적이 생물학적 활성 물질의 제조를 위한 것일 때, 상기 물질은 일반적으로 주어진 장애의 치료에 유용한 것이다. 예를 들어, 세포가 뼈 또는 연조직 형성과 결부된 특정한 성장 인자 생성물을 분비하도록 세포를 유전자 변형시키는 것이 요망될 수 있다. 조직 복구에 관련된 기타 내인성 세포 유형의 성장을 유도하는 성장 인자 생성물이 또한 유용하다. 예를 들어, 내인성 모세관 및/또는 미세 혈관 내피 세포를 자극하는 성장 인자가 연조직 결손의 복구에서, 특히 보다 큰 부피의 결손에 유용할 수 있다.

본 발명의 세포는 세포 내로 도입된 외인성 유전 물질을 가짐으로써 유전자 변형되어 영양 인자, 성장 인자, 시토카인 등과 같은 분자를 생성할 수 있으며, 상기 분자는 세포의 배양에 유익하다. 게다가, 그러한 분자를 생성하도록 유전자 변형된 세포를 가짐으로써 상기 세포는 그를 필요로 하는 포유류 내로 이식될 때 포유류에게 추가의 치료 효과를 제공할 수 있다. 예를 들어, 유전자 변형된 세포는 포유류에서의 이식 부위에 이웃하는 세포에 유익한 분자를 분비할 수 있다.

폐 세포는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 유전자 변형될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York], 및 [Ausubel et al,. Eds, 1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY]을 참조하라. 예를 들어, 트랜스진을 포함하는 핵산이 세포 내에서 트랜스진이 발현되기에 적절한 조건 하에 세포 내로 도입되도록, 트랜스진을 포함하는 핵산을 포함하는 발현 벡터에 폐 세포를 노출시킬 수 있다. 일반적으로 트랜스진은 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트이다. 폴리뉴클레오티드는 단백질을 코딩할 수 있거나, 이것은 생물학적 활성 RNA (예를 들어, 안티센스 RNA 또는 리보자임)를 코딩할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 독소에 대한 내성을 부여하는 유전자, 호르몬 (예컨대 펩티드 성장 호르몬, 호르몬 방출 인자, 성 호르몬, 부신피질 자극 호르몬, 시토카인 (예를 들어, 인터페린, 인터루킨, 림포카인) 등), 세포-표면-결합 세포내 시그널링 모이어티 (예를 들어, 세포 유착 분자, 호르몬 수용체 등), 주어진 분화 계통을 촉진하는 인자 (예를 들어, 골형성 단백질 (BMP)) 등을 코딩할 수 있다.

발현 카세트 내에서, 코딩 폴리뉴클레오티드는 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 적합한 프로모터의 예는 원핵 프로모터 및 바이러스 프로모터 (예를 들어, 레트로바이러스 ITR, LTR, 극초기 바이러스 프로모터 (IEp), 예컨대 헤르페스바이러스 IEp (예를 들어, ICP4-IEp 및 ICP0-IEEp), 시토메갈로바이러스 (CMV) IEp 및 기타 바이러스 프로모터, 예컨대 라우스 사코마 바이러스 (Rous Sarcoma Virus, RSV) 프로모터, 및 쥐과 백혈병 바이러스 (Murine Leukemia Virus, MLV) 프로모터)를 포함한다. 기타 적합한 프로모터로는 진핵 프로모터, 예컨대 인핸서 (예를 들어, 토끼 .베타.-글로빈 조절 요소), 항시적 활성 프로모터 (예를 들어, .베타.-액틴 프로모터 등), 시그널 특이적 프로모터 (예를 들어, 유도성 프로모터, 예컨대 RU486에 반응성인 프로모터 등) 및 조직-특이적 프로모터가 있다. 사전 정의된 세포적 맥락에서 유전자 발현을 유도하기에 적합한 프로모터를 선택하는 것은 충분히 당업계의 기술 이내이다. 요망될 경우 발현 카세트는 하나 초과의 코딩 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 이것은 다른 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 서열, 막-삽입 시그널 또는 분비 리더를 코딩하는 서열, 리보좀 진입 서열, 전사 조절 요소 (예를 들어, 인핸서, 사일런서 등) 등)를 포함할 수 있다.

트랜스진을 포함하는 발현 카세트는 트랜스진을 세포에 전달하기에 적합한 유전적 벡터 내로 혼입되어야 한다. 요망되는 최종 응용에 따라, 임의의 그러한 벡터가 세포를 유전자 변형시키기 위해 그렇게 이용될 수 있다 (예를 들어, 플라스미드, 네이키드 DNA, 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스바이러스, 렌티바이러스, 파필로마바이러스, 레트로바이러스 등). 그러한 벡터 내의 요망되는 발현 카세트를 작제하는 임의의 방법이 이용될 수 있으며, 이들 중 다수는 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, 직접적인 클로닝, 상동 재조합 등). 벡터의 선택은 벡터를 세포 내로 도입하기 위하여 사용되는 방법 (예를 들어, 원형질 융합, 인산칼슘 침전법, 유전자 건 (gene gun), 전기천공법, DEAE 덱스트란 또는 지질 캐리어 매개 형질감염, 바이러스 벡터를 이용한 감염 등에 의해)을 주로 결정하며, 이들은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.

폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 및 기타 DNA 또는 RNA 폴리머라제-매개 기술을 포함하여 시험관내 증폭 방법을 통하여 당업자를 인도하기에 충분한 기술의 예가 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volumes 1-3 (3^rd ed., Cold Spring Harbor Press, NY 2001)]에서 발견된다.

일단 단백질을 위한 핵산이 클로닝되면, 당업자는 다양한 폐 세포에서 재조합 유전자(들)를 발현시킬 수 있다. 당업계의 숙련자라면 요망되는 트랜스진을 발현하는 데 이용가능한 다수의 발현 시스템 방면에 지식이 있으리라 기대된다.

본 발명은 천연 폐 조직을 모방하는 엔지니어링된 3차원 조직을 제공한다. 천연 폐 조직을 모방하는 스캐폴드 및 복합체를 생성하는 역량은 조직 및 조직들의 콜렉션의 복구 및 재생을 종래 기술의 방법보다 더 큰 정도로 가능하게 하며, 종래 기술의 방법을 이용하여 달성될 수 있는 것보다 더 정확한 조직학적 구조 및 기능을 나타낸다. 예를 들어, 엔지니어링된 폐 조직은 버딩 (budding) 구조 및 연장 관상 조직을 나타내는 세포를 포함한다. 더욱이, 상기 세포는 형태형성 및 폐 상피 분화에 연루된 유전자를 발현한다. 형태형성 및 폐 상피 분화에 연루된 비제한적인 유전자는 원위 상피 마커 유전자인 SpC 및 SpB, 간엽-유래 모르포겐인 FGF10, FGFr2, 및 혈관 내피 성장 인자 A (VEGF)를 포함한다.

투여

본 발명은 시험관내 세팅 및 생체내 세팅 둘 모두에서 엔지니어링 조직의 사용을 고려한다. 따라서, 본 발명은 연구 목적 및 치료 또는 의료/수의학적 목적에 있어서의 엔지니어링된 조직의 용도를 제공한다. 연구 세팅에 있어서, 다수의 실제적인 응용이 상기 기술에 있어서 존재한다. 그러한 응용의 일례로는 생체외 암 모델에 있어서의 엔지니어링 조직의 용도, 예컨대 실험실에서 다양한 어블레이션 (ablation) 기술 (예를 들어, 방사선 치료, 화학요법적 치료, 또는 조합을 포함함)의 유효성을 시험하고 그에 따라 아픈 환자의 이용을 회피하여 치료 방법을 최적화하는 것이 있다. 예를 들어, 최근에 제거한 폐를 생물반응기에 부착시키고 폐를 처리하여 조직을 어블레이션할 수 있다. 생체내 용도의 또 다른 예는 조직 엔지니어링에 대한 것이다.

본 발명의 엔지니어링된 조직은 생체내에서의 용도를 갖는다. 다양한 용도 중, 대상체 (본원에서 "환자"와 상호교환가능하게 사용되며, 인간 및 동물 둘 모두를 포함하고자 함)의 생체내 치료 방법이 언급될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서 일반적으로, 대상체의 치료 방법은 본 발명에 따른 엔지니어링된 조직을 대상체의 표면 상에 또는 그 내로 임플란트하는 단계를 포함하며, 여기서, 조직의 임플란팅은 대상체에서 탐지가능한 변화를 생성한다. 탐지가능한 변화는 자연적인 감각을 사용하여 또는 인공 기구를 사용하여 탐지될 수 있는 임의의 변화일 수 있다. 임의의 유형의 치료가 본 발명에 의해 구상되지만 (예를 들어, 질환 또는 장애의 치료적 치료, 피부 결점 (skin blemish)의 미용적 처리 등), 많은 실시양태에서 상기 처리는 대상체의 질환, 장애 또는 기타 고통의 치료적 처리이다. 이와 같이, 탐지가능한 변화는 대상체에 영향을 주는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 임상적 증상에 있어서 변화, 바람직하게는 개선의 탐지일 수 있다. 예시적인 생체내 치료 방법은 종양 치료 후 장기의 재생, 의료 기구의 임플란트를 위한 수술 부위의 준비, 피부 그래프팅, 및 조직 또는 장기, 예컨대 질환 또는 장애에 의해 손상되거나 파괴된 것의 일부 또는 그 전부의 대체를 포함한다. 예시적인 장기 또는 조직의 예는 심장, 폐, 간, 신장, 방광, 뇌, 귀, 눈 또는 피부를 포함한다. 대상체가 인간 또는 동물일 수 있다는 사실을 고려하면, 본 발명은 의료적 응용 및 수의학적 응용 둘 모두를 갖는다.

일 실시양태에서, 본 방법은 조직을 본 발명의 탈세포화 방법에 노출시켜 처리된 조직의 세포를 사멸시키고 조직 스캐폴드를 생성하는 단계를 포함한다. 본 방법은 조직 스캐폴드에 세포를 접종하는 단계, 및 접종된 세포를 조직 스캐폴드 내에서 그리고 조직 스캐폴드 상에서 증식시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 증식에 의해 건강하고 기능적인 세포를 포함하는 재생된 조직이 생성된다.

또한, 본 발명은 엔지니어링된 폐 조직을 그를 필요로 하는 포유류 내에 임플란팅함으로써 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 예에서, 엔지니어링된 폐 조직은 적합한 세포, 예를 들어 NPC를 포함한다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정한 유형의 세포에 한정되는 것은 아니어야 한다. 임플란트 후, 그래프팅된 세포는 환경적 암시에 반응할 수 있는데, 상기 암시는 상기 세포가 내인성 조직의 특징을 나타내게 한다. 바람직하게는, 상기 세포는 조직구 폐포-유사 구조를 형성하며, 상기 구조는 분화된 원위 상피 세포 (proSpC 발현)로 이루어져서 관 구조를 형성한다. 따라서, 임플란트된 세포는 상기 세포가 주위 조직과 닮도록 하는 특징을 나타낸다. 이들 방법을 이용하면, 생물학적 스캐폴딩은 조직을 증대시킬 수 있으며, 본 발명의 생물학적 스캐폴딩은 조직 엔지니어링에 그리고 임의의 통상적인 조직 엔지니어링 세팅에서 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 조직 재생 응용을 포함한다. 조직 재생 요법 접근법의 목적은 고밀도의 복구-적격성 (repair-competent) 세포 (또는 국소적 환경에 의해 영향을 받을 때 적격성으로 될 수 있는 세포)를 초기 창상 역학 및 궁극적인 신조직 (neotissue) 생성 둘 모두를 최적화하는 포맷으로 결손 부위에 전달하는 것이다. 본 발명의 조성물은 개체에 있어서 폐 조직 결손을 완화 또는 치료하는 방법에서 특히 유용하다. 유리하게는, 본 발명의 조성물은 향상된 폐 조직 재생을 제공한다. 구체적으로, 조직 재생은 본 발명의 조성물의 결과로서 더욱 신속하게 달성된다.

유리하게는, 본 발명의 조성물 및 방법은 종래 기술의 방법에 비하여 개선을 나타낸다. 바람직하게는 폐 조직 결손을 치료하는 데 사용하기 위한 조성물은 NPC, 더욱 바람직하게는 스캐폴드 상에 접종되어 시험관내에서 배양되어 3차원 배양물을 생성하는 NPC를 포함하며, 이는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같다.

약물 발견 모델

본 발명은 폐 질환 또는 장애와 관련하여 시험 화합물을 치료적 활성에 대하여 평가하는 것을 허용하기에 적합한 시험관내 방법을 제공한다. 바람직하게는 본 방법은 엔지니어링된 3차원 폐 조직의 사용을 포함한다.

본 발명은 탈세포화 조직을 이용하여 개발된 모델을 기반으로 한다. 일부 예에서, 적합한 세포를 탈세포화 조직에 접종할 수 있다. 일부 예에서, 상피, 간엽, 및 내피 세포를 포함하는 NPC의 혼합된 집단을 이용하여 3차원 엔지니어링 폐 조직을 생성한다. 예를 들어, NPC는 3차원 탈세포화 폐 조직 내에 두어진다. 따라서, 본 모델은 이웃하는 세포와의 세포-세포 통신 및 성장에 대한 NPC의 영향을 포함한다. 3차원 폐 조직은 천연 폐 조직을 모방하며, 예를 들어 엔지니어링된 폐 조직은 천연 폐 조직에 의해 예시되는 분지 형태형성을 나타낸다.

본 모델은 폐 조직의 병상에 대한 약물의 시험에 유용하다. 게다가, 본 모델을 사용하여 폐 조직의 병상에 대한 치료제의 특정한 전달 비히클의 영향을 조사하거나, 예를 들어 상이한 전달 시스템을 통하여 투여된 동일 작용제의 영향을 비교하거나, 전달 비히클 그 자체 (예를 들어, 바이러스 벡터)가 폐 병상에 영향을 줄 수 있는지를 단순히 평가할 수 있다.

일 실시양태에서, 본 발명은 폐 조직의 건강을 조정하는 시험 작용제의 능력에 대하여 시험 작용제를 스크리닝하는 시험관내 방법을 제공한다. 본 방법은 시험 작용제를 엔지니어링된 3차원 폐 조직 모델과 접촉시키는 단계 및 시험 작용제가 폐 조직 모델에 미치는 영향을 측정하는 단계를 포함한다. 시험 작용제의 존재 하에서의 모델에 대한 임의의 변경은 시험 작용제가 폐 조직의 건강을 조절할 수 있음을 나타내는 것이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 시험 작용제가 폐 조직에 미치는 영향을 관찰하는 시험관내 방법을 제공하며, 이는 a) 정상 폐 조직을 모델링하도록 의도된 적어도 하나의 3차원 폐 조직 모델을 제공하는 단계; b) 시험 작용제를 폐 조직 모델과 접촉시키는 단계; 및 c) 시험 작용제가 폐 조직 모델에 미치는 영향을 관찰하는 단계를 포함한다.

폐 조직 모델은 스캐폴드, 예를 들어 콜라겐 매트릭스 상의 세포의 3차원 어레이 (array)와, 적어도 하나의 시험 세포를 포함하는 구축물이다. 본 방법은 시험 작용제가 폐 조직의 병상에 미치는 영향을 관찰하는 단계를 포함한다. 그러나, 본 방법은 폐 조직의 개개의 세포 유형에 대한 시험 작용제의 영향을 관찰하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

시험 작용제는 화학적 작용제 (예컨대 독소), 의약품, 펩티드, 단백질 (예컨대 항체, 시토카인, 효소 등), 및 단백질, 안티센스 작용제 (즉, 표적 세포 유형에서 발현되는 표적 RNA에 상보적인 서열을 포함하는 핵산, 예컨대 RNAi 또는 siRNA), 리보자임 등과 같은 치료적 작용제를 코딩할 수 있는, 유전자 의약 및 도입된 유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 임의의 작용제일 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 시험 작용제는 물리적 작용제, 예컨대 방사선 (예를 들어, 이온화 방사선, UV광 또는 열)일 수 있으며, 이들은 단독으로 또는 화학적 작용제 및 기타 작용제와 조합되어 시험될 수 있다.

또한 본 모델을 사용하여 전달 비히클을 시험할 수 있다. 이들은 통상적인 의약품 제형으로부터 유전자 전달 비히클까지의 임의의 형태의 것일 수 있다. 예를 들어, 본 모델을 이용하여 2가지 이상의 상이한 전달 시스템 (예를 들어, 데포 (depot) 제형 및 방출 제어형 제형)에 의해 투여되는 동일 작용제의 치료적 효과에 대한 영향을 비교할 수 있다. 또한 본 모델을 사용하여 특정 비히클이 폐 조직에 대하여 그 자신의 영향을 미칠 수 있는지를 조사할 수 있다. 유전자-기반 치료제의 사용이 증가함에 따라, 다양한 가능한 전달 시스템과 결부된 안전성에 대한 쟁점이 점점 더 중요해진다. 따라서, 본 발명의 모델을 사용하여 핵산 치료제, 예컨대 네이키드 DNA 또는 RNA, 바이러스 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스 벡터), 리포좀 등을 위한 전달 시스템의 특성을 조사할 수 있다. 따라서, 시험 작용제는 임의의 결부된 치료제를 포함하거나 포함하지 않는 임의의 적절한 유형의 전달 비히클일 수 있다.

시험 작용제는 임의의 적합한 수단을 이용하여 시험할 모델에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 시험 작용제는 본 모델의 표면 상에 적가되어 본 모델 내로 확산되게 할 수 있거나 다르게는 본 모델에 진입하게 할 수 있거나, 또는 시험 작용제는 영양 배지에 첨가되어 콜라겐 겔을 통하여 확산되게 할 수 있다. 본 모델은 또한 단독의 또는 화학적 작용제 (예를 들어, 광역학적 요법에서)와 조합된 이온화 방사선, UV광 또는 열과 같은 물리적 작용제의 영향을 시험하는 데 적합하다.

시험 작용제가 본 모델에 미치는 영향은 다양한 방법을 이용하여 관찰될 수 있다. 예를 들어, 특정 작용제는 세포가 아폽토시스에 진입하는 것을 유도할 수 있다. 세포에서의 탐지가능한 변화는 세포 면적, 부피, 형상, 형태, 마커 발현 (예를 들어, 세포 표면 마커 발현) 또는 기타 적합한 특징, 예컨대 염색체 단편화에서의 변화를 포함할 수 있다. 또한 세포수가 세포 증식에 대한 시험 작용제의 영향의 관찰을 위하여 모니터링될 수 있으며, 이는 직접적으로, 예를 들어 존재하는 특정 세포 유형의 수의 계수에 의해, 또는 간접적으로, 예를 들어, 특정 세포 덩어리의 크기의 측정에 의해 분석될 수 있다. 이들은 예를 들어 적합한 형광 세포 염색을 이용하여 온전한 모델에서 직접적으로 또는 간접적으로 관찰될 수 있다. 이는 살아있는 모델의 연속 분석을 위하여 생염료를 이용하거나 유전자 도입된 형광 마커 (예를 들어 녹색 형광 단백질)를 이용한 세포의 사전 표지에 의한 것 또는 고정 및 요오드화프로피듐 또는 형광 표지된 항체와 같은 형광 물질을 이용한 사후-표지에 의한 것일 수 있다. 대안적으로, 모델은 적합한 세포 표적에 대하여 유도된 항체를 사용하여 면역조직 화학과 같은 보통의 조직학적 방법에 의해, 또는 원위치 혼성화에 의해 프로세싱되어 특정 mRNA 종의 발현에 대하여 시험할 수 있다. 게다가, 이것은 예를 들어 세포의 밀도, 위치 및/또는 형태에서의 임의의 변화를 탐지하고 다양한 시점에서 세포를 이미지화하기 위하여 컴퓨터 시스템 및 소프트웨어를 이용하여 자동화/로봇 또는 반자동화 방식으로 실시될 수 있다. 특히 공초점 레이저 주사 현미경법은 온전한 모델의 3차원적 분석을 가능케 한다. 따라서, 온전한 3차원 폐 조직 모델에 세포 거동의 정량적 분석을 직접적으로 적용하는 것이 가능한데, 이는 보통은 단지 통상적인 2차원 배양물 형태의 세포에 있어서 가능하 다. 이러한 수단에 의해 특히 세포의 증식, 아폽토시스, 괴사, 이동 및 매트릭스 침윤의 정량적인 연속 분석이 3차원 폐 조직 모델에서 얻어지며, 이는 통상적인 2차원 세포 배양물과 살아있는 동물 모델 사이의 갭을 메운다.

실험 실시예

본 발명을 하기 실험 실시예를 참고로 하여 상세히 추가로 설명한다. 이들 예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 달리 특정되지 않으면 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 본 발명은 어떤 방식으로도 하기 실시예로 제한되는 것으로 이해되어서는 안되며, 오히려, 본원에서 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 임의의 변형 및 모든 변형을 포함하는 것으로 파악되어야 한다.

실시예 1: 래트 폐의 탈세포화 및 탈세포화된 스캐폴드의 형태적 특성화

탈세포화된 장기는 조직 엔지니어링 스캐폴드로서 사용하기 위한 몇몇 잇점을 제공하였다. 일 측면에서, 탈세포화된 스캐폴드는 폐의 경우에는 혈관계 및 기도 네트워크를 비롯한, 조직 기능에 필요한 적절한 3차원 구성을 포함하였다. 게다가, 세포외 매트릭스 (ECM) 성분은 종에 걸쳐 널리 보존되며, 따라서 탈세포화된 스캐폴드가 이종 이식적 임플란트시에 면역 반응을 유도할 가능성을 감소시켰다 (문헌[Bernard et al., 1983, Biochemistry 1983;22:5213-23]). 또 다른 측면에서, 천연 ECM은 세포 부착, 유포(spreading), 성장 및 분화를 위한 최적 기재를 제공하였다.

본 발명의 탈세포화 방법의 목표는 폐의 ECM의 주요 측면을 보유하고 상기 ECM에 대한 임의의 손상을 최소화하면서 세포 및 핵 물질을 제거하는 것이었다. 본원에 제시된 결과는 천연 폐 조직을 탈세포화하여 세포 성분과 항원성 분자를 제거하지만, 주요 세포외 매트릭스 분자를 보유할 수 있음을 입증하였다. 일 측면에서, 본 발명의 탈세포화 방법의 목표는 세포 배양과 완전히 양립가능하며 이와 동시에 장벽 기능을 제공하는 탈세포화된 폐 스캐폴드를 생성하는 것이었다. 게다가, 탈세포화된 폐 스캐폴드는 온전한 기도 트리 및 혈관 네트워크를 갖는 것이 바람직하다.

화학적 탈세포화 방법을 본 발명의 연구에서 사용하였다. 이 연구에서 사용한 화학물질은 염화나트륨, CHAPS, 및 EDTA를 포함하였다. 고장성 염화나트륨 용액은 세포를 효율적으로 용해시킬 수 있지만, 이것은 조직으로부터 세포 성분을 제거하는 것을 돕지 못하였다. CHAPS는 쯔비터이온성 세제로서, 효율적인 가용화 및 그에 따른 세포 물질의 제거를 허용하였다. EDTA는 ECM에의 세포 부착을 파괴하는 것을 돕는 주요 2가 이온 (즉, Ca^{2 +})에 결합하는 킬레이팅제이다. 게다가, 그 용액은 고도로 알칼리성이어서, 세포질 세포 성분, 및 매트릭스를 막는 GAG를 가용화시키는 것을 도왔다 (문헌[Gilbert et al., 2008 J Surg Res 152(1):135-9]).

이제 이들 실험에 이용한 재료 및 방법을 설명한다.

재료 및 방법

장기 수확

폐는 젊은 성체(3개월령) 수컷 피셔(Fischer) 344 래트로부터 수확하였다. 모든 동물 실험 연구는 예일대 장기 실험 동물 운영 위원회 (Yale University Institutional Animal Care and Use Committee)로부터 승인을 받고 수행하였다. 동물은 소듐 펜토바르비탈 (시그마 (Sigma), 40 mg/kg)을 복강내 주사하여 마취시켰다. 마취를 유도한 후, 전연 바로 아래를 횡절개하여 복부에 들어갔다. 횡경막을 천공하고, 흉곽을 절개하여 폐를 드러냈다. 50 U/ml 헤파린 (시그마)을 함유한 PBS를 이용하여 우심실을 통해 폐를 관류시켰다. 관류를 완료한 후, 심장, 폐 및 기관을 해부하여 자유롭게 되도록 하고 일괄적으로 꺼냈다.

생물반응기 구성요소

생물반응기 구성요소들을 콜-파머 (Cole-Parmer) (미국 일리노이주 베르논 힐스)로부터 획득하였다. 실리콘 마개 및 500 ml 유리 병이 생물반응기의 기본을 형성하였다. 크기가 L/S 14 및 L/S 16인 파메드 (PharMed) 튜빙 (미국 오하이오주 웨스트레이크)을 실리콘 마개를 통하여 삽입하여 폐에 대한 필요한 연결을 가능하게 하였으며, 이는 관류 루프 및 공기 환기를 포함하였다. 폐동맥에 대한 연결부와 관류 펌프 사이에 트루웨이브 (TruWave) 변압기 (에드워즈 라이프사이언시즈 (Edwards Lifesciences), 미국 캘리포니아주 어바인)를 사용하여 압력을 모니터링하였다. 마스터플렉스 (Masterflex) L/S 가변 속도 롤러 펌프 (마스터플렉스, 미국 일리노이주 버논 힐스)를 사용하여 관류시켰다.

탈세포화 방법

탈세포화에 사용한 유체는 PBS 중의 8 mM CHAPS, 1 M NaCl, 25 mM EDTA였다. 모든 화학물질은 시그마로부터 획득하였으며, PBS는 깁코(Gibco)로부터 입수하였다. 생물반응기를 탈세포화 유체로 충전시키고, 생물반응기를 37℃에서 유지된 인큐베이터로 옮겼다. 관류 압력은 폐동맥간으로의 유입부에서 모니터링하여 30 또는 20 mmHg 미만으로 유지하였다. 탈세포화 유체를 하기 시점에서 신선한 유체로 교체하였다: 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간. 대부분의 조건의 경우, 탈세포화를 4시간 또는 6시간 후에 중단하였다.

DNA 분석

조직의 DNA 함량을 제조업자의 설명서에 따라, 퀀트-아이티 피코그린(Quant-iT PicoGreen) dsDNA 분석 키트 (인비트로겐 (Invitrogen), 미국 오레곤주 유진)를 이용하여 정량화하였다. 간략하게는, 조직 샘플을 칭량하여 동결건조시키고, TE 완충액 중에 희석하고 퀀트-아이티 피코그린 시약과 혼합하였다. 형광을 485 nm에서의 여기로 535 nm에서 측정하였으며, DNA 함량은 표준 곡선을 이용하여 정량화하였다. 4개 이상의 샘플을 천연 및 탈세포화된 샘플 둘 모두에 대해 측정하였다.

웨스턴 블롯

웨스턴 블로팅을 위한 조직을 프로테아제 억제제 (시그마)가 첨가된 냉 RIPA 완충액 (보스턴 바이오프로덕츠 (Boston Bioproducts))에서 소화시키고 30초 동안 15,000 rpm에서 균질화하였다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 25분 동안 14,000 g에서의 원심분리에 의해 불용성 입자를 제거하였다. 단백질 농도를 브래드포드(Bradford) 분석을 통해 정량화한 후 (문헌[Bradford, 1976, Anal Biochem 72:248-54]), 65℃에서 25분 동안 램리 환원 완충액(Laemmli's reducing buffer) (보스톤 바이오프로덕츠)에서 끓였다. 분석할 때까지 샘플을 -80℃에서 보관하였다. 25-30 ㎍의 단백질을 이용하여, 샘플을 다양한 퍼센트의 폴리아크릴아미드 겔에서 진행시켰다. 전기영동 후, 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막을 TBS에서 헹군 후, 1시간 동안 0.05% 트윈-20을 포함하는 TBS(TBS-T) 중의 5% 탈지분유 (non-fat dry milk, NFDM) 또는 3% 소 혈청 알부민에서 차단시켰다. 일차 항체를 TBS-T 중의 2% NFDM 또는 3% BSA에서 하룻밤 적용하였다. 이차 항체는 산타 크루즈(Santa Cruz)로부터 입수하였으며, 이는 당나귀 또는 염소에서 생성한 것으로서 1:2000으로 희석시켜 실온에서 1시간 동안 적용하였다. 단백질은 수퍼시그널 웨스트 피코 (Supersignal West Pico)로부터의 기질을 이용하여 검출하였으며, 기질을 필름 현상 전에 5분 동안 적용하였다.

면역형광

조직 블록을 4시간 동안 3.7% 포름알데히드 (시그마)에서 고정한 후, 70% 에탄올로 옮기고 파라핀에 매립시켰다. 얇은 (5 ㎛) 섹션은 예일대 조직학 중심 시설에 의해 준비하였다. 조직 섹션을 자일렌에서 탈파라핀화하고, 에탄올 구배를 통해 재수화시키고, 15분 동안 완충액 (PBS + 0.2% 트리톤-X)에서 헹구었다. 항원 회수는 20분 동안 70℃에서 0.01 M 시트르산(pH 6.0)에서 수행하였다. 실온으로 냉각 후, 섹션을 완충액에서 헹군 후, 실온에서 1시간 동안 5% 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.75% 글리신을 포함하는 PBS에서 차단시켰다. 차단 완충액 중 적절한 농도의 일차 항체를 4℃에서 하룻밤 적용하였다. 슬라이드를 완충액에서 3회 헹군 후 이차 항체를 실온에서 1시간 동안 차단 완충액에서 1:500으로 희석시켜 적용하였다. 이차 항체는 인비트로겐으로부터 입수한 알렉스플루오르(AlexFluor) 555 당나귀 항-염소 또는 염소 항-토끼 항체 및 알렉사플루오르 488 닭 항-토끼 항체였다. DAPI-함유 적재 매체 (벡터 랩스(Vector Labs))를 이용하여 슬라이드를 적재하였으며, 이미지는 자이스 악시오베르트(Zeiss Axiovert) 200M 도립 형광 현미경을 이용하여 얻었다.

주사 전자 현미경법

샘플은 0.1 M 카코딜레이트 완충액 (이엠디 바이오사이언시즈 (EMD Biosciences), 미국 뉴저지주 깁스타운) 중의 2% 글루타르알데히드 및 2.5% 파라포름알데히드를 이용하여 실온에서 2시간 동안 고정한 후, 카코딜레이트 완충액에서 헹구고, 슬라이스하고, 에탄올 구배를 통해 탈수하였다. 샘플을 10분 동안 헥사메틸다이실리잔에서 추가로 탈수시키고 하룻밤 건조시킨 후, 금으로 스퍼터 코팅하고 예일대 지질학 및 지구물리학 시설에서 조엘(JOEL) JXA-8600을 이용하여 분석하였다.

투과 전자 현미경법

샘플을 PBS 중의 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정한 후 실온에서 2시간 동안 0.1 M 소듐 카코딜레이트 완충된 고정제 (pH 7.4) 중의 2% 글루타르알데히드 및 2.5% 파라포름알데히드에 두었다. 샘플을 0.1 M 소듐 카코딜레이트 완충액에서 3회 헹구고 1시간 동안 1% 사산화오스뮴에서 사후 고정한 후, 추가 시간 동안 말레에이트 완충액 (pH 5.2) 중의 2% 우라닐 아세테이트에서 일괄적으로 염색하였다. 그 후, 샘플을 헹구고, 구배된 에탄올 시리즈를 통해 탈수하고 에폰 수지로 침윤시키고 60 ℃에서 하룻밤 베이킹하였다. 경화된 블록을 레이카 울트라컷 (Leica UltraCut) UCT를 이용하여 절단하고 60 nm 섹션을 니켈 그리드 상에 수집하여 2% 우라닐 아세테이트 및 시트르산납을 이용하여 염색하였다. 샘플을 80 kV에서 FEI 텐카이 바이오트윈 (Tencai Biotwin) TEM에서 관찰하였다. 이미지는 iTEM (올림푸스 (Olympus)) 소프트웨어를 이용하여 모라다 (Morada) CCD 디지털 카메라를 이용하여 찍었다.

미소구체 보유

탈세포화된 폐 또는 천연 폐를 본원의 다른 곳에서 설명한 바와 같이 캐뉼러에 부착시키고, 폐를 5 ㎛ 미소구체를 함유한 PBS로 기관을 통해 팽창시켰다. 그 후 혈관계를 10 ml PBS의 3회 헹굼에 의해 플러싱하였다. 미소구체를 dH₂O에서 2회 세척하여 잔사를 제거하고 천연 폐 판독값에 영향을 줄 모든 세포를 용해시켰다. 4.9 ㎛와 5.1 ㎛ 사이의 입자를 측정하도록 설정된 코울터 (Coulter) 계수기를 이용하여, 각각의 샘플 내의 미소구체 농도를 정량화하여 미소구체 주입 전에 취한 기저선 판독값과 비교하였다.

마이크로 CT 이미지화

천연 또는 탈세포화 폐를 10% 중성 완충 포르말린 (시그마)에서 고정시키고 기도 또는 혈관계를 통해 조영제를 주사하였다. 조영제는 PBS 중의 20% 비스무스 및 5% 젤라틴 (시그마)이었다. 조영제의 주사 후, 폐를 빙조에서 냉각시켜 젤라틴을 중합시켰다.

전체 폐의 경우, 폐 혈관계를 0.029 mm 유효 검출기 픽셀 크기로 설정된 마이크로-CT 이미지화 시스템 (지이 엑스플로러 로커스 (GE eXplore Locus) SP, 지이 헬스케어 (GE Healthcare))을 이용하여 이미지화하였다. 마이크로-CT는 60 kV 피크 x-선 튜브 전압, 80 mA 튜브 전류, 1600 밀리초/프레임, 22 검출기 비닝 모델 (detector binning model), 720 뷰 및 0.5° 증분/뷰에서 작동시켰다. 하나의 폐엽 (우측 상부엽)의 고해상도 이미지화를 위해, 샘플을 컴퓨터-제어된 회전 스테이지에 위치시키고 0.4°의 회전 스텝으로 수직축 주위로 360 스캐닝을 하였다. 튜브를 80 kV 피크 및 80 mA에서 작동시켰다. 각 뷰를 위한 노출 시간은 전형적으로 3000 밀리초였으며, 검출기 비닝 모델은 1 X 1로 설정하고 해상도는 0.0065mm였다. 둘 모두의 획득값은 폐 또는 하나의 폐엽을 통한 인접 축 VFF-포맷화 이미지 세트를 생성하였다.

마이크로뷰 소프트웨어 (지이 헬스케어)의 사용으로, 미가공 데이터를 보정하여 치수 58 ㎛ x 58 ㎛ x 58 ㎛의 복셀로 재구성하여 폐에서 전체 혈관 트리를 가시화하였다. 혈관 트리 (하나의 폐엽)의 고 품질을 위해, 복셀의 치수를 6.5 ㎛ x 6.5 ㎛ x 6.5 ㎛로 설정하였다. 이 소프트웨어를 또한 사용하여 미가공 데이터로부터 최대 강도의 투영 이미지를 재구성하였다.

다면상 재형성, 공간 필터링, 및 볼륨 렌더링 기술은 데이터 세트가 가로, 시상면, 관상면, 하이브리드 평면, 및 3D 포맷으로 보여지도록 하였다. 이진화된 이미지를 대상 추출 및 관심 영역 측정에 사용하였다. 3차원 볼륨 이미지는 변경된 펠드캠프(Feldkamp) 필터링 배면 투영 알고리즘을 이용하여 각 뷰 (angular view)로부터 재구성하였다. 그러나, 이 시스템에서는, 전체 래트 폐 (시야, 대략 3.0 cm)를 연구할 수 있으며, 이때 이미지는 58 ㎛만큼 작은 전형적인 입방형 복셀 치수를 갖는다. 각 복셀의 불투명도는 16-비트 그레이스케일 값으로 나타내었다.

이제 실험의 결과를 설명한다.

탈세포화 방법

본원에 나타낸 결과는 온전한 설치류 폐의 완전한 폐엽으로부터 세포 물질을 제거하는 탈세포화 방법을 보여주었다. 1 M NaCl, 8 mM CHAPS 및 25 mM EDTA를 이용한 탈세포화가 세포 물질을 제거하기에 적절하지만 이는 콜라겐 또는 엘라스틴 섬유를 제거하지 않거나 (조직학에 기초하여) 매트릭스의 구조적 완전성을 손상시키지 않음 (기계적 시험에 기초)이 나타났다. 비교로서, SDS를 함유한 용액을 이용한 탈세포화는 매트릭스의 기계적 강도를 손상시키는 것으로 밝혀졌다. 다른 조건은 세포 물질을 효율적으로 제거하지 않거나 매트릭스 완전성의 상당한 감소를 야기하지 않는 것으로 밝혀졌다.

조직학적 분석

조직학을 이용하여 많은 탈세포화된 폐 스캐폴드를 특성화하였다. H&E 염색 및 핵과 DNA를 위한 DAPI-염색에 기초하면, 탈세포화된 폐는 하나의 온전한 세포도 나타내지 않았다. 때로는, 풀린 DNA 또는 세포 항원이 관찰되었으나, 온전한 세포는 관찰되지 않았다. 도 1은 천연 폐 및 탈세포화된 폐의 H&E 염색을 입증하는 한편, 도 2는 잔여 DNA를 위한 DAPI-염색을 예시하였다. 더욱 큰 기도 및 혈관이 그런 것과 같이, 폐포 중격이 표준 조직학 섹션에서 온전하게 보인다는 사실에 기초하여 폐 구조의 보존이 또한 관찰되었다.

DNA 함량

세포 물질의 완전한 제거는 몇몇 이유로 중요하였다. 첫째, 만일 스캐폴드를 조직 엔지니어링 응용에 사용하려고 한다면, 스캐폴드로부터의 모든 세포는 새로운 세포 공급원을 스캐폴드에 접종하기 전에 제거하는 것을 확실히 해야 한다. 재접종된 스캐폴드의 평가를 복잡하게 하는 것에 더하여, 임의의 남아있는 세포 물질은 만일 엔지니어링된 조직이 생체내 응용에 사용되면 면역 합병증을 야기할 것이다 (문헌[Conconi et al., 2005, Transpl Int 18:727-34]; [Macchiarini et al, 2008, Lancet 372(9655):2023-30]; [Alexander et al., 2009, Cell Transplant 18:255-9]). 그 결과, 본 발명의 스캐폴드는 MHC 클래스 I 및 II 항원 둘 모두가 탈세포화된 스캐폴드에 존재하지 않음이 확인되었다. 둘째, 폐 역학에 대한 세포외 매트릭스의 기여를 별도로 평가하기 위하여, 모든 세포 성분을 제거하여야 한다. 주위 폐 역학에 기여할 수 있는 두 가지 성분 부류는 세포 물질 및 세포외 매트릭스이다. 세포외 매트릭스는 추가로 주로 콜라겐, 엘라스틴, 및 프로테오글리칸으로 나뉘어질 수 있다 (문헌[Cavalcante et al., 2005, J Appl Physiol 98:672-9]; [Dunsmore et al., 1996, Am J Physiol 270:L3-27]; [Ito et al., 2005, J Appl Physiol 98:503-11]; [Suki et al., 2005, J Appl Physiol 98:1892-9]). 탈세포화된 스캐폴드로부터의 세포 성분의 제거를 확실히 함으로써, 스캐폴드의 기계적 특성을 평가할 수 있었다.

세포 물질의 제거를 기록하기 위하여, 정량적 DNA 분석을 실시하였다. 천연 폐와 비교하여 탈세포화된 스캐폴드에서 DNA 함량의 극적인 감소가 관찰되었다 (도 1c). 탈세포화된 스캐폴드는 천연 폐에서 발견된 DNA의 대략 1.2%를 함유하였으며, 이것은 1.83±0.29 ng DNA/mg 건조 중량에 상응하였다. 이것은 천연 폐에 있어서의 38.7±5.8 ng/mg에 비교된다. 스캐폴드의 강한 헹굼을 일반적으로 잔여 DNA를 최소화하기 위해 사용할 수 있는 한편, 모든 DNA의 완전한 제거는 어려웠으며, 도 2에서 풀린 DNA의 작은 클러스터를 보여주는 DAPI 염색에 의해 입증된 바와 같이, 소량의 DNA가 남아있었다. DNA 함량의 극적인 감소는 세포 제거를 나타냈으며, 조직학적 발견과 함께 모든 생존가능한 세포 물질이 스캐폴드에 없음을 확인하였다.

탈세포화된 스캐폴드에서는, 거의 99%의 DNA가 제거된 것으로 입증되었다. 소량의 DNA가 매트릭스에 남아 있지만, 도 2에 예시한 바와 같이 DNA의 신장된 가닥으로 존재하였다. DAPI 염색에 기초하면, 핵 구조 내의 이 잔여 DNA의 조직화는 관찰되지 않았다.

천연 폐에 비교하여 98.8%의 DNA가 제거되었으며, 나머지 DNA 농도는 조직 1 mg 당 1.83 ng의 DNA (건조 중량)인 것으로 관찰되었다. 특히 수준이 이 연구 및 다른 연구에서와 같이 건조 중량이 아닌 습윤 중량에 대해 표준화됨을 고려하면 (문헌[Gilbert et al., 2008 J Surg Res 152(1):135-9]), 이것은 탈세포화된 심장 조직에 대해 다른 연구에 의해 나타내어진 16.6 ng/mg 잔여 DNA 수준에 유리하게 비교된다 (문헌[Ott et al., 2008, Nat Med 14:213-21]). 그러나, 관찰된 잔여 DNA의 수준은, 피부 그래프트에 사용되는 구매가능하며 실험실 생산된 ECM 스캐폴드에 대해 관찰된 것보다 높으며, 여기서, 대부분의 스캐폴드는 1 mg의 건조 중량 당 0.2 ng 미만의 DNA를 나타내지만, 일부 스캐폴드는 1.13 ng/mg만큼 많은 잔여 DNA를 보유하였다 (문헌[Gilbert et al., 2008 J Surg Res 152(1):135-9]).

면역원성

탈세포화된 스캐폴드의 면역원성은 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 및 II 항원에 대한 염색에 의해 특성화하였다. MHC 클래스 I 및 II 단백질은 항원-특이적 면역 반응에서 중요한 막 당단백질이다. MHC 클래스 I 항원은 모든 핵화 세포에서 발현되는 한편, MHC 클래스 II 항원은 면역계의 특수 세포에서 발견되었다. MHC 클래스 I 항원은 유기체가 '비자기'로부터 '자기'를 인식하도록 하며, 따라서 동물 모델 내로 엔지니어링된 폐 조직을 미래에 임플란트할 때 면역 문제를 회피하기 위하여 탈세포화된 스캐폴드로부터 제거하는 것이 중요하였다. 도 3은 MHC 클래스 I 및 II 항원 및 β-액틴에 대한 웨스턴 블로팅 결과를 예시한다. 면역블로팅에 의하면 MHC 클래스 I 및 II 항원의 완전한 손실이 관찰되었으며, 이는 탈세포화된 스캐폴드가 조직 엔지니어링 응용에 사용되면 큰 면역 반응을 야기하지 않을 것임을 확인하는 것이었다. 세포 물질의 부재와 일치하여, β-액틴이 또한 손실되었다. 스캐폴드는 숙주 내로 임플란트되면 면역 반응을 야기할 가능성이 없는 것으로 여겨졌다.

세포외 매트릭스 특성화

콜라겐: 콜라겐은 폐의 가장 중요한 구조적 성분이며, 조직의 전체적인 기계적 강도에 주로 책임이 있다. 도 4에 예시된 바와 같이, 면역형광을 이용하여 천연 및 탈세포화 폐에서 콜라겐 I 및 IV의 분포를 특성화하였다. 콜라겐 I 및 IV 둘 모두는 탈세포화된 매트릭스에 의해 보유되며, 콜라겐 I은 주로 큰 기도와 혈관계 주위에서 나타났으며, 콜라겐 IV는 실질 전체에 걸쳐 나타났다. 유사한 염색 패턴이 천연 및 탈세포화 폐에 있어서 나타났다. 그들의 해부학적으로 적절한 위치에서 이들 콜라겐 아형의 보존은 엔지니어링된 폐 조직의 발달 동안 세포 유형의 선택적 침적을 가능하게 할 수 있었다.

탈세포화된 스캐폴드의 주사 EM 평가

주사 전자 현미경법 (SEM)을 이용하여 탈세포화된 폐 스캐폴드의 미세구조를 평가하였다. 도 5는 샘플 이미지를 예시하며, 이는 세포는 제거되지만 폐포 뼈대는 전체적으로 유지됨을 입증하였다. 탈세포화된 폐에서 폐포는 약간 수축된 것으로 보였으며, 이는 고정의 인공 산물이었다. 천연 폐를 고정제로 폐를 팽창시켜 고정시켰지만, 탈세포화된 폐는 가압될 때 폐포 구획 내에 고정제액을 함유할 수 있으며, 따라서 폐에 수축된 외관을 제공하였다. 그러나, 폐포 중격이 보존된 폐포 뼈대 면에서 일반적인 유사성이 있었다. 이들 결과는, 조직학 연구로부터의 발견과 함께, 전체적인 폐 기도 뼈대와 폐포 중격을 비롯한 폐포 구조가 탈세포화된 스캐폴드에서 온전하였음을 나타내었다.

스캐폴드 초미세구조에 대한 관류 압력의 영향

주사 EM 연구에 더하여, 투과 EM(TEM)을 이용하여 모세관-폐포 기저막을 연구하였다. 이것은 탈세포화된 스캐폴드의 중요한 특징이며 그 이유는 온전한 모세관 네트워크의 존재가 탈세포화된 스캐폴드가 폐포 공간 내로의 거대분자 통과에 저항하도록 하며 또한 엔지니어링된 폐 조직에서 모세관 내피의 성장을 위한 기재를 제공하기 때문이다.

도 7a 및 도 7b는 천연 폐 및 혈관 관류 압력의 제어 없이 탈세포화한 폐의 TEM 이미지를 예시한다. 그러한 조건 하에서, 폐포 기저막은 때로는 확인불가능하였으며 모세관을 찾을 수 없었다. 임의의 특정 이론에 구애되고자 함이 없이, 기저막 및 초미세구조에의 손상은 탈세포화 과정 동안 관류 압력을 최소화시키고 탈세포화를 시작하기 전에 혈관계를 최대로 확장시킴으로써 감소시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 탈세포화 유체를 생리학적 유속 미만에서 혈관계를 통해 관류하였지만, 혈관 관류 압력은 대량 세포 용해와, 세포 단백질 및 DNA의 혈관계 내에서의 축적으로 인해 탈세포화 동안 생리학적으로 초과가 될 수 있다. 따라서, 폐동맥 압력을 주의 깊게 모니터링하였으며 탈세포화 생물반응기 및 관류 속도는 이 압력을 대략 20-30 mmHg 미만에서 엄격하게 유지하도록 변경하였다. 혈관확장제 소듐 니트로프루시드를 이용하여 초기 관류 압력을 최소화하였다.

도 6c는 탈세포화된 스캐폴드의 TEM 이미지를 예시하며, 이때 압력은 대략 30 mmHg 미만으로 유지하였다. 이들 조건 하에서, 온전한 연속적인 폐포 기저막이 관찰되었다. 콜라겐 섬유와 다른 매트릭스 성분은 폐포 중격 내에 보유되었다. 그러나, 본 발명자들은 폐포 주위에 풍부하게 존재해야 하는 임의의 투명한 모세관 구조의 존재를 알아차리지 못했다.

탈세포화된 스캐폴드에서 모세관 구조의 보유

설치류의 폐 혈관계에서의 전형적인 압력은 15 mmHg 미만이며 (문헌[Lee et al, 1999, Cell 99:301-12]), 이는 상기 연구에서 사용한 30 mmHg보다 상당히 더 낮았다. 관류 유속을 감소시키고 관류 압력을 낮추기 위하여 혈관확장제를 사용하였지만, 탈세포화 관류 압력을 30 mmHg 미만으로 유지하기는 어려웠다. 그러나, 탈세포화 프로토콜에서의 약간의 변경이 대략 20 mmHg 미만의 압력에서의 탈세포화 동안 관류를 가능하게 하는 것으로 밝혀졌다. 중요하게도, 이것은 모세관 구조의 보유를 가능하게 하였다. 이 변경은 혈관계를 통해 탈세포화 유체의 관류를 시작하기 전에 탈세포화 유체로 기도 구획을 세척하는 것을 포함하였다. 그 결과, 특히 탈세포화 과정의 시작에서, 혈관 관류 압력이 상당히 저하되었다. 도 8에 예시된 바와 같이, 이 기술은 탈세포화된 스캐폴드에서 모세관 구조의 보유를 가능하게 하였다. 모세관의 보유는 탈세포화된 폐 스캐폴드의 생성에서 상당한 발전인 것으로 여겨진다.

스캐폴드는 온전한 기도 트리와 혈관 네트워크를 보유해야 한다. 마이크로-CT 이미지화에 더하여 주사 및 투과 전자 현미경법을 이용하여, 전체적으로 스캐폴드가 탈세포화 과정 후에 주목할만하게 잘 보존됨을 입증하였다. 일상적인 조직학적 기술뿐만 아니라, 주사 EM도 스캐폴드가 큰 결손 없이 총체적으로 온전함 (즉, 폐포 및 폐포 중격이 온전하게 보임)을 입증하였다. 투과 EM은 폐포 기저막이 잘 보존되었으며 적어도 일부 모세관이 보유되었음을 입증하였다. 마이크로-CT 이미지화는 혈관계가 100 ㎛ 직경의 혈관으로 온전하게 작아졌음을 입증하였다.

투과성 평가

폐가 생체내에서 기능하기 위하여, 폐는 폐포 및 간질 공간 내로 대량의 혈액이 손실되는 것을 회피하기 위하여 연속적이고 명백하며 비누출성인 혈관계를 보유해야 한다. 탈세포화된 폐 스캐폴드가 5 ㎛ 미소구체를 이들 거대분자가 혈관계 내로 수송되게 하지 않으면서 기도 구획 내에 보유하는 능력을 평가하였다. 5 ㎛ 입자를 사용하여, 혈관계에 보유되어야 하는 혈액의 주성분인 적혈구 세포의 크기를 모방하였다. 따라서, 기도로부터 그리고 혈관계 내로의 5 ㎛ 입자의 누출을 평가하였으며, 이때 탈세포화된 막을 가로질러 그러한 입자의 이동에 큰 방향성이 없는 것으로 가정하였다.

천연 폐, 비제어 관류 압력 (일정한 관류 유속)으로 탈세포화된 폐, 및 혈관확장 후 그리고 제어된 관류 압력(30 mmHg 미만)으로 탈세포화된 폐의 투과성을 결정하였다. 결과는 도 8에 예시되어 있으며, 더욱 큰 스케일에서 TEM 발견을 확인하였다. 높은 (비제어) 관류 압력을 이용한 탈세포화는, 저압 탈세포화의 경우의 5.7% 및 천연 폐의 경우의 2.1%에 비하여, 39% 누출을 야기하는 것으로 관찰되었다.

마이크로- CT 이미지화

마이크로-CT 이미지화를 이용하여 탈세포화된 폐 스캐폴드의 기도 및 혈관 구획의 개방성을 평가하였다. 이 기술은 폐 스캐폴드의 3차원 이미지를 얻도록 하며, 기도와 혈관 구획의 개방도의 확인을 촉진하였다.

도 9는 58 ㎛의 해상도에서, 혈관계의 이미지를 예시한다. 이 해상도에서는, 큰 혈관은 온전한 것으로 나타나며 (도 9의 상부 패널), 하부 및 중간 패널에 예시된 바와 같이 천연 및 탈세포화 샘플은 일반적으로 유사하였다. 혈관계의 더 높은 해상도 이미지 (6.8 ㎛)는 도 10에 예시되어 있으며, 여기서 혈관은 3차원 투영 (최대 강도 투영)으로서 나타내어졌다. 이들 이미지에서는, 약간의 혈관 누출을 탈세포화된 스캐폴드의 일부 영역에서 나타난 탁도로서 확인하였다.

탈세포화된 매트릭스의 중요한 특징은 천연 3차원 구조의 보존이었다. 탈세포화된 스캐폴드의 구조가 보존된 정도를 평가하기 위하여, 주사 및 투과 EM, 마이크로-CT, 및 미소구체 투과성 분석의 조합을 이용하였다. 탈세포화된 폐의 초미세구조 특징은 SEM을 이용하여 검사하였으며, 이는 폐포 뼈대와 폐포 중격의 유지를 입증하였다. 투과 EM은 완전히 온전한 폐포 기저막과 콜라겐 및 엘라스틴 섬유를 입증하였다. 이들 EM 발견은 그러한 구조가 보유된 탈세포화 폐 매트릭스에서의 다른 작업과 일치하였다 (문헌[Lwebuga-Mukasa et al., 1986, Exp Cell Res 162:423-35]). 탈세포화 동안 혈관 관류 압력의 엄격한 제어에 의하면, 본원에 제시된 결과는 모세관의 보유를 입증하였다. 마이크로-CT 이미지화는 보수적 추정치에 기초하면, 100 ㎛ 직경의 혈관으로 작아진 혈관 네트워크의 보유가 입증되었으며, 이때 더 작은 혈관의 상당수가 또한 온전하였다.

실시예 2: 탈세포화된 폐 조직의 기계적 완전성에의 세포외 매트릭스 성분의 기여

스캐폴드의 기계적 특성에 촛점을 맞추어 탈세포화 스캐폴드의 조성을 보다 상세히 평가하기 위하여 하기 실험을 디자인하였다. 임의의 특정 이론에 구애되고자 함이 없이, 탈세포화된 폐 스캐폴드는 주로 콜라겐과 엘라스틴으로부터의 기여로 인하여, 천연 폐의 두드러진 기계적 특징을 보유하는 것으로 여겨진다. 본원에 제시된 결과는 세포 기여와 독립적인 폐 역학을 연구하기 위한 플랫폼으로서 탈세포화된 폐 조직의 유용성을 입증하였다.

본원에 제시된 결과는 콜라겐 내용물이 보유되며, 엘라스틴 내용물이 천연 수준의 대략 40%에서 보유되는 한편, 글리코사미노글리칸은 탈세포화된 스캐폴드로부터 대부분 상실됨을 입증하였다.

이제 이들 실험에 이용한 재료 및 방법을 설명한다.

재료 및 방법

장기 수확 및 탈세포화

폐 조직을 본원의 다른 곳에서 개시한 바와 같이 수확하여 탈세포화하였다.

조직학적 분석

조직학적 분석을 이용하여 많은 탈세포화된 폐 스캐폴드를 특성화하고, 세포 물질의 제거를 확인하였다. 조직을 고정하고, 파라핀-매립하고 박편화하였다. 분석은 표준 헤마톡실린 및 에오신 염색 (H&E), 콜라겐의 경우 메이슨 3색 염색 (Masson's trichrome), 엘라스틴의 경우 베르호프 반 기에슨 (Verhoff van Gieson), 및 프로테오글리칸의 경우 알시안 블루 (Alcian blue), 및 DNA의 경우 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)을 이용한 염색으로 수행하였다.

콜라겐 분석

콜라겐은 변경된 그랜츠법(Grants method) (문헌[Grant, 1964, 1964, J Clin Pathol 17:685-6])을 이용하여 OH-프롤린을 검출하기 위하여 비색 분석으로 정량화하였다. 폐 샘플을 동결건조하고 칭량한 후, 60℃에서 하룻밤 파파인 (140 ㎍/ml)에서 인큐베이션하였다 (시그마). 파파인-소화된 샘플을 18시간 동안 115℃에서 6 N HCl에서 인큐베이션하고, 중화시키고, 클로라민-T로 산화시키고, p-디메틸아미노벤즈알데히드와 반응시켰다. 흡광도를 550 nm의 파장에서 측정하고 히드록시프롤린 대 콜라겐의 1:10 (w/w) 비를 이용하여 조직의 콜라겐 함량을 계산하였다. 천연 및 탈세포화 샘플에 대해 적어도 4개 샘플을 측정하였다.

엘라스틴 분석

패스틴 (Fastin) 엘라스틴 분석 키트 (바이오컬러 (Biocolor), 북아일랜드 벨패스트)를 이용하여 엘라스틴을 정량화하였다. 폐 샘플을 먼저 동결건조하고 칭량 한 후, 엘라스틴을 포론지 (Foronjy) 등의 문헌[Foronjy et al., 2008, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 294:L1149-57]에 개시된 방법에 따라 추출하였다. 샘플을 100℃에서 0.25 M 옥살산과 함께 인큐베이션한 후, 10,000 g에서 원심분리하고 상청액을 얻었다. 5회 추출에 의해 상청액을 모으고, 여섯 번째 추출로부터의 상청액을 또한 측정하여 조직에 더 이상 엘라스틴이 남아있지 않음을 확실히 하였다. 10,000 분자량 컷오프 필터 (밀리포어 (Millipore))를 이용하여 옥살산을 제거한 후, dH₂O에 재현탁시키고 제조업자의 설명서에 따라 패스틴 엘라스틴 키트를 이용하여 분석하였다. 4개 이상의 샘플을 천연 및 탈세포화 샘플에 대해 측정하였다.

술페이트화 글리코사미노글리칸 분석

콘드로이틴, 더마탄, 헤파란 및 케라탄 술페이트를 비롯한 술페이트화 글리코사미노글리칸 (sGAG)을 블리스캔 (Blyscan) GAG 분석 키트를 이용하여 정량화하였다. 파파인-소화된 샘플 (상기의 콜라겐 분석에 대해 설명한 바와 같이 제조)을 제조업자의 설명서에 따라 분석하였다. 간략하게는, 술페이트화 GAG를 1,9-디메틸-메틸렌 블루 염료로 표지하고 650 nm에서 흡광도를 측정하였다.

기계적 시험

천연 및 탈세포화 폐 샘플을 10N 로드 셀을 구비한 인스트론 (Instron) 5848을 이용하여 분석하였다. 공지 치수의 조직 슬라이스를 탄성 특성을 조사하기 위하여 20% 변형률까지 10 사이클 동안 주기적으로 사전신장시킨 후 극한 인장 강도 (UTS)를 평가하기 위해 파괴될 때까지 신장시켰다. 시험 프로토콜의 도식에 대해서는 도 11을 참조한다. 조직 치수를 이용하여, 엔지니어링 응력 및 조작 변형률을 힘 및 거리로부터 계산하였다.

이제 실험의 결과를 설명한다.

콜라겐 및 엘라스틴 함량

도 12c에 예시된 바와 같이, 탈세포화된 스캐폴드에서의 콜라겐 함량은 천연 폐와 구별할 수 없었다. 콜라겐의 이러한 보존은 콜라겐이 폐의 기계적 강도에서 중요한 역할을 하기 때문에 중요하다. 콜라겐 함량은 또한 도 12에 예시된 바와 같이 메이슨 3색 염색을 통한 조직화학적 염색에서도 유지되었다. 도 12c에 예시된 바와 같이, 콜라겐 함량은, 적합한 것으로 밝혀지지 않은 탈세포화 방법 중 하나인 SDS로 탈세포화된 스캐폴드에서는 감소하였다. 콜라겐의 이러한 손실은 SDS 탈세포화된 스캐폴드에서 기계적 완전성의 감소와 상관되는 것으로 여겨진다.

엘라스틴 함량은 또한 정량 분석 및 조직학적 염색에 의해 입증되는 바와 같이, 탈세포화된 스캐폴드에서 감소되기는 하지만 보존된다 (도 13). 엘라스틴 섬유는 흡기 후 폐의 이완 및 그에 따른 호기에서 중요한 역할을 하는 조직의 천연 반동에 중요한, 폐의 탄성을 허용한다. 탈세포화 과정 동안 이들 섬유의 보유는 중요하며, 그 이유는 이것이 폐 세포 집단을 스캐폴드에 재접종할 때 시도 동안 폐 스캐폴드가 적절히 환기되도록 하기 때문이다. 스캐폴드가 천연 엘라스틴 함량의 60%를 상실하지만, 나머지 엘라스틴은 본원의 다른 곳에서 토의된 시험 결과로부터 알 수 있듯이, 폐의 탄성 기능을 허용하기에 충분하였다.

전체적으로, 이들 주요 ECM 성분의 보유는 스캐폴드가 기계적 응력의 생리학적 수준을 받도록 하며, 이것은 다양한 발생 및 세포 분화 과정이 기계적 자극에 의존하기 때문에 중요하다. 또한, ECM은 매트릭스에의 세포 부착을 돕는데 있어서 중요하며, 이들 천연 ECM 성분의 보유는 세포 부착 및 유포와, 그에 따라 바이오엔지니어링된 폐 조직의 발달을 용이하게 한다.

프로테오글리칸 함량

프로테오글리칸은 하나 이상의 글리코사미노글리칸 (GAG) 사슬에 연결된 코어 단백질로 이루어진다. 대부분의 GAG는 술페이트화되어, 그들을 정량 분석을 통해 검출할 수 있도록 하며, 그 결과는 도 14에 예시되어 있다. 탈세포화된 스캐폴드의 GAG 함량은 천연 폐보다 상당히 낮은 것으로 나타났다 (천연 폐 수준의 대략 6%). 프로테오글리칸은 세포 표면에서 또는 세포외 매트릭스 내에서 발견되며 (문헌[Ferdous et al., 2007, Tissue Engineering 13:1893-904]), 그의 제거는 부분적으로 세포-결합된 GAG의 제거에 기인한다. 그러나, ECM 내에서 발견된 GAG는 또한 탈세포화 용액을 통해 가용화될 수 있다. 도 14는 프로테오글리칸의 경우의 알시안 블루 조직 염색이며, 이것은 탈세포화된 폐 스캐폴드에 남아있는 GAG의 양이 천연 폐에 비하여 감소되었음을 보여주어, 정량 분석 결과를 확인해 주었다.

기계적 특성화

주위 폐 스트립의 기계적 시험을 이용하여 천연 및 탈세포화 폐 샘플 둘 모두의 준정적 역학을 평가하였다. 응력-변형률 곡선의 탄성 영역은 천연 및 탈세포화 샘플 둘 모두가 이력 거동을 보였음을 나타낸다. 이력 현상은 폐가 점탄성 재료임을 입증하며, 팽창 및 이완 곡선 사이의 차이는 이완 동안 회복되지 않는 에너지를 나타낸다. 또한, 샘플은 도 15에 예시된 바와 같이, 크리핑(creep)되지 않았다. 만일 폐 조직이 크리핑되었다면, 조직은 팽창 후 그의 원래 위치로 수축하지 않으며, 따라서, 폐는 절대 완전히 수축하지 않아서 기체 교환이 손상된다. 이러한 적절한 탄성 폐 거동의 보존은 폐 스캐폴드에 있어서 중요하며, 그 이유는 폐 탄성의 손실이 몇몇 질환 상태, 주목할만하게는 폐기종에서 보여지기 때문이다 (문헌[Gelb et al., 2002, Chest 121 :715-21]).

극한 인장 강도(UTS)는 파괴시의 샘플에서의 응력이며, 물질의 강도의 척도이다. 도 16에서 입증되는 바와 같이, 탈세포화된 샘플의 UTS는 천연 샘플의 UTS와 구별할 수 없었다. 하지만, 만일 샘플이 소듐 도데실 술페이트(SDS)를 함유한 완충액에서 탈세포화되면, UTS의 감소에 의해 입증되는 바와 같이 기계적 완전성이 손상되었다. SDS는 콜라겐을 분해하여, 조직의 단편화 및 팽윤을 야기할 수 있으며(문헌[Bodnar et al., 1986, Thorac Cardiovasc Surg. 34(2):82-5]; [Gilbert et al., 2006, Biomaterials 27:3675-83]), 또한 조직 신장성을 증가시키는 것으로 나타났다 (문헌[Mirsadraee et al., 2006, Tissue Eng 12:763-73]). SDS는 매우 이온성이며, 양쪽성인 세제이며, 그 소수성 영역은 단백질과 상호작용할 수 있는 한편 친수성 부분은 특히 음으로 하전될 경우, 물에 결합하여 조직 팽윤을 야기한다 (문헌[Bodnar et al., 1986, Thorac Cardiovasc Surg. 34(2):82-5]). 다른 연구들에 의해 SDS 처리로 UTS가 감소되는 것이 항상 관찰된 것은 아니지만 (문헌[Mirsadraee et al., 2006, Tissue Eng 12:763-73]), 이것은 조직 차이에 기인할 수 있다. 미르사드래(Mirsadraee) 등은 심막 조직을 연구하였으며, 이 조직은 폐보다 훨씬 더 조밀하게 패킹된 콜라겐을 함유한다. 폐에서는, 조직의 기하학적 형태로 인하여, 콜라겐 섬유가 고도로 분포되며, 정량적 콜라겐 분석에서 볼 수 있는 바와 같이, SDS-유도 팽윤은 훨씬 쉽게 콜라겐 제거를 유도할 수 있다.

본원에 제시된 결과는 관련된 생체내 생리학적 힘을 탈세포화된 스캐폴드가 견딜 수 있음을 입증하였다.

본원에 제시된 결과는 콜라겐과 엘라스틴 둘 모두가 기능적 수준에서 보존되었음을 확인하였다. 이들 발견은 폐 역학에의 주요 기여자가 콜라겐과 엘라스틴으로부터 오며, 세포 성분 또는 프로테오글리칸으로부터 오지 않음을 확인하였다. 본원에 제시된 결과는 천연 폐의 특징을 나타내는 탈세포화된 폐 스캐폴드의 생성을 입증하며, 이것은 본 스캐폴드가 조직 엔지니어링 응용을 위한 전도유망한 기재가 되도록 하며, 이 외에 상세한 매트릭스 역학 및 폐 생물학, 발생 및 생리학의 연구를 위한 플랫폼이 되게 하기도 한다.

실시예 3: 3차원 폐 조직 의 시험관내 배양을 위한 생물반응기의 디자인 및 검증

생물반응기를 사용하여 시험관내에서 3차원 폐 조직을 배양할 수 있다. 그러한 생물반응기의 개발은 엔지니어링된 폐 조직의 성장에 대한 연구뿐만 아니라, 폐 생물학의 연구에도 유익할 것이다. 성인 폐 조직의 장기 시험관내 배양을 허용하는 이용가능한 시스템이 현재는 없다.

하기 실험은 전체 폐 조직의 시험관내 배양을 위한 생물반응기의 디자인을 위해 행하였다. 생물반응기는 세포 생존 및 분화를 지지하기 위하여 폐 조직에 충분한 영양제 공급 및 기계적 자극을 제공하는 능력을 목표로 하는 일련의 디자인 제한을 충족하도록 디자인하였다. 실험은 세포 생존성 및 분화 상태의 유지에 의해 입증되는 바와 같이, 생물반응기가 폐 조직의 전체 폐엽의 시험관내 배양을 지지할 수 있는지를 평가하도록 디자인하였다. 생물반응기를 평가하는 과정에서는, 생물반응기에서의 폐 생존에 대한 관류 및 환기의 영향을 평가하였다. 본원에 제시된 결과는 생물반응기가 시험관내 폐 조직 배양에 사용될 수 있으며 따라서 폐 조직의 엔지니어링에 적용가능함을 입증하였다.

이제 이들 실험에 사용한 재료 및 방법을 설명한다.

재료 및 방법

전체 폐 배양

폐는 젊은 성체(3개월령) 수컷 피셔 344 래트로부터 수확하였다. 모든 동물 실험 연구는 예일대 장기 실험 동물 운영 위원회로부터 승인을 받고 수행하였다. 동물은 소듐 펜토바르비탈 (시그마, 40 mg/kg)을 복강내 주사하여 마취시켰다. 마취를 유도한 후, 가슴과 복부에 에탄올을 분무하고 전연 바로 아래에 횡절개를 만들어, 복강으로 들어갔다. 횡경막을 천공하고, 폐를 건드리지 않도록 조심하면서 늑골을 집어넣었다. 하대정맥을 손상시키고 50 U/ml 헤파린(시그마) 및 1 ㎍/ml 소듐 니트로프루시드 (시그마)를 함유한 PBS 20 - 30 ml을 이용하여 우심실을 통해 폐를 관류시켰다. 그 후 기관을 해부하고 가능한 높게 절개하였다. 심장과 폐에의 남아있는 모든 연결부를 잘라내어, 심장, 폐 및 기관을 일괄적으로 동물로부터 꺼내었다.

캐뉼러 부착

장기의 제거 후, 심장의 우측을 통하여 캐뉼러를 폐동맥간에 그리고 기관에 연결하였다. 심첨을 메스로 절단해 내고, 직각 캐뉼러를 우심실을 통하여 및 폐동맥간 내로 삽입하였다. 시린지를 이 캐뉼러에 부착하고, 헤파린 처리한 염수 5-10 ml를 주입하여 누출 없이 폐의 적당한 관류 및 적당한 캐뉼러 배치를 보장하였다. 그 후 이 캐뉼러를 봉합사로 심장에 고정하였다. 별도의 직선형 갈고리-말단형 캐뉼러를 기관 내로 삽입하고 봉합사로 고정하였다. 그 후 폐를 생물반응기에 연결하고, 본원의 다른 곳에 기술한 프로토콜에 따라 탈세포화하였다.

캐뉼러를 우심실을 통하여 폐동맥에 그리고 기관에 부착하고, 폐를 생물반응기에 연결하였다. 기도를 PBS 중 2%의 암포테리신, 페니실린 및 스트렙토마이신으로 세척하고, 이어서 PBS로 2회 세척하고, 그 후 생물 반응기를 배지로 충전하고 배양을 시작하였다. 혈관 관류 및 환기를 실험 조건에 의해 진술되는 바와 같이 수행하였다.

생물반응기 구성요소 및 어셈블리

달리 나타내지 않으면 생물반응기 구성요소를 콜-파머 (미국 일리노이주 버논 힐스)로부터 획득하였다. 실리콘 마개 및 500 ml 유리병이 생물반응기의 기본을 형성하였다. 크기가 L/S 14 및 L/S 16인 파메드 (PharMed) 튜빙 (미국 오하이오주 웨스트레이크)을 실리콘 마개를 통하여 삽입하여 폐에 대한 필요한 연결을 가능하게 하였으며, 이는 관류 루프, 기관 연결부, 공기 환기 및 배지 교체 포트를 포함하였다. 폐동맥에 대한 연결부와 관류 펌프 사이에 트루웨이브 변압기 (에드워즈 라이프사이언시즈, 미국 캘리포니아주 어바인)를 사용하여 압력을 모니터링하였다. 마스터플렉스 L/S 가변 속도 롤러 펌프 (마스터플렉스, 미국 일리노이주 버논 힐스)를 사용하여 관류시켰다. 환기는 다채널형의 프로그래밍가능한 시린지 펌프 (콜-파머)를 사용하여 수행하였으며, 이때 흡기 및 호기 각각을 10 ml의 부피를 이용하여 30초에 걸쳐 수행하였다. 생물반응기의 다이아그램을 도 17에 예시하였다.

조직학 및 면역형광

요망되는 배양 기간 후, 폐를 고정하고, 파라핀-매립하고, 박편화하였다. 일상적인 조직학적 염색 (H&E)을 수행하고, 이 외에 아쿠아포린-5 (제I형 상피), 계면활성 단백질 C (제II형 상피), CCSP (클라라 세포), 및 PECAM-1 (내피)에 대한 면역형광도 수행하였다. 섹션들을 자일렌 중에서 탈파라핀화하고, 재수화하고, 0.2% 트리톤-X (완충제)를 포함하는 PBS를 이용하여 15분 동안 인큐베이션하였다. PBS 중 0.02 M 시트르산을 이용하여 75-85℃에서 20분 동안 항원 수집을 수행하고, 그 후 섹션을 완충액에서 헹구었다. PBS + 1% 소 혈청 알부민 및 0.75% 글리신을 이용하여 실온에서 1시간 동안 차단을 수행하였다. 일차 항체를 완충액으로 헹구어 내고, 이차 항체를 실온에서 1시간 동안 1:500으로 희석시켜 적용하였다. 이차 항체는 인비트로젠 (알렉사플루오르 555 또는 알렉사플루오르 488x)으로부터 획득하였다. 이미지를 자이스 악시오베르트 200M 도립 형광 현미경을 이용하여 얻었다.

세포 증식을 증식 중인 세포의 핵 항원 (PCNA) (자이메드 (Zymed), 미국 캘리포니아주 샌프란시스코)의 염색을 통하여 평가하고, 아폽토시스성 핵을 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 dUTP 닉 (nick) 말단 표지 (TUNEL) 염색 (칼바이오켐 (Calbiochem), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)을 이용하여 검출하였다. 상기 둘 모두의 분석은 제조업자의 설명서를 따른 것이었다.

미소구체 환기 분석

생물반응기에서의 폐의 환기가 혈관계를 관류하도록 배지의 이동을 유도하기에 충분한지를 결정하기 위하여, 단순한 분석을 개발하였으며, 이는 5 ㎛ 폴리스티렌 미소구체 (에스피아이 서플라이즈 (SPI Supplies, 미국 펜실베이니아주 웨스트 체스터)를 이용하였다. 본원의 다른 곳에 기술한 바와 같이 폐를 생물반응기에 연결하고, 환기시켰지만 관류는 하지 않았다. 생물반응기 챔버를 1000만개의 미소구체를 포함하는 배지 100 ml (배지 1 ml 당 100000개의 미소구체)로 충전시켰다. 단지 환기만 하면서 배양을 3시간 동안 진행시켰다. 그 후 폐를 고정하고, 파라핀-매립하고, 박편화하고, 일상적인 조직학적 염색 (H&E)을 이용하여 분석하였다.

이제 실험 결과를 설명한다.

생물반응기 디자인의 요건

생물반응기는 설치류 생체내 환경의 주요 특징을 포함하지만, 또한 요망되는 조건에 따라 몇몇 주요 파라미터를 사용자가 변경하도록 디자인하였다. 디자인의 목적은 하기와 같았다:

● 시스템은 사용자에 의해 특정된 속도로 그리고 생리학적 수준 내에서 혈관계를 통하여 배지를 관류시킬 수 있어야 한다.

● 시스템은 기관을 통하여 배지 또는 공기로 폐를 환기시킬 수 있어야 한다. 보통의 생리학적 조건과 일치하도록 하기 위하여, 음압 환기 및 폐를 끊임없이 환기시키는 능력이 바람직하다.

● 생물반응기는 바람직하게는 상이한 배지 유형이 폐의 혈관 및 기도 구획을 베이딩하게 하여야 한다.

● 생물반응기는 배양 배지 내로의 가스 교환을 허용하고 이와 동시에 상기 환기 요건을 만족시켜야 한다.

● 생물 반응기는 폐 동맥 및 기관 압력의 압력 측정을 허용하기 위하여 포트를 가져야 한다. 압력은 이상적으로는 보통의 생리학적 값 내에 있어야 하며, 이때 폐동맥 압력은 15-30 mmHg 미만이다 (문헌[Li et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101:11488-93]).

● 생물반응기는 주기적으로 배지가 교환되게 하는 수단을 가져야 한다.

● 생물반응기는 이것이 표준 조직 배양 인큐베이터의 물리적 경계부 내에 맞을 수 있도록 소형이고 자립적이어야 한다.

● 모든 생물반응기 구성요소는 저렴하고 용이하게 입수가능하여야 한다.

● 생물반응기 및 모든 구성요소는 바람직하게는 오토클레이브를 통하여 살균될 수 있어야 한다.

상기 기준을 충족시키는 생물반응기를 디자인하여 제작하였다. 생물반응기의 개략도를 도 17에 예시하였다.

생물반응기 관류 시스템

폐에의 관류는 주 생물반응기로부터 폐동맥 내로 배지를 순환시키는 롤러 펌프를 통하여 제공하였다. 관류 속도를 사용자가 특정할 수 있다. 래트 심장을 폐에 계속 부착시켜 심장의 우심실을 통하여 캐뉼러를 폐동맥간에 연결하는 것을 용이하게 하였다. 그러나, 폐정맥은 관류 루프에 직접적으로 연결하지 않았다. 오히려, 폐정맥은 심장의 좌측을 통하여 주 생물반응기 저장부 내로 직접적으로 배출시켰다. 폐정맥 배출물은 주 생물반응기 내로 직접적으로 유출되었다.

폐를 통한 관류 속도는 사용자가 특정한 속도로 설정할 수 있었다. 성체 래트에서의 생리학적 유속은 40-80 ml/min이었지만, 엔지니어링된 조직 배양물의 유속은 전형적으로 이 값보다 훨씬 더 작았다. 성체 래트에서, 전혈 볼륨은 폐를 통과하여 산소화되어야 하며, 반면, 엔지니어링된 조직의 배양 동안에는 단지 폐 세포의 성장을 지지하기에 충분한 배지를 관류하여야 하였다. 따라서, 엔지니어링된 배양 동안의 관류 속도는 태아 래트에서의 것과 더욱 가까우며, 여기서 폐로의 혈액의 유동은 정상적인 생리학적 측로로 인하여 심박출량의 단지 8-10%였다 (문헌[Hislop et al., 2000, Ped Resp Rev 1:321-7]). 폐 혈관 압력을 감소시키기 위하여 사용될 수 있는 나트륨 니트로프루시드와 같은 혈관확장제를 이용하여 압력 프로파일을 제한된 정도로 제어할 수 있었다. 전형적으로, 관류 압력을 대략 30 mmHg 미만으로 유지하였으며, 최대 값은 전형적으로 폐 동맥 시스템에서 보였다 (문헌[Li et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101:11488-93]).

생물반응기 환기 시스템

생물반응기는 양압 및 음압 환기 둘 모두가 가능하였다. 생체내에서, 호흡은 보통 음압 환기를 통하여 성취되었다. 횡경막은 수축하며, 흉곽은 확장하여 흉강 내에서 음압을 생성하며, 이는 공기가 폐 내로 유동하여 이 압력 불균형이 경감되게 하였다. 흡기 후, 호흡 근육은 이완하며 폐는 수동적으로 수축하였다.

음압 환기는 생물반응기에서 일차적인 환기 양식이었다. 폐를 둘러싼 음압을 초래하기 위하여, 생물반응기의 주 챔버는 완전히 기밀되게 하여야 하였다. 이는 모든 공기 및 압력-모니터링 통풍구를 막음으로써 성취하였다. 그 후 시린지 펌프를 사용하여 주 생물반응기로부터 설정 부피의 공기를 흡인하여 음압을 생성하였다. 이 압력을 경감시키는 유일한 경로는 배지 (또는 공기)가 기관을 통하여 폐 내로 유동되게 하는 것이었는데, 상기 기관은 별도의 저장부에 연결되어 있었다. 그 후 시린지 펌프의 방향을 역전시켜 공기를 주 생물반응기 내로 되돌려 밀어넣었다. 이는 챔버 내부의 음압의 증강을 역전시키며, 배지 (또는 공기)는 기관 저장부 내로 다시 유동하였다. 폐는 이 시간 동안 수동적으로 수축하였다.

기관 캐뉼러는 일방 밸브를 이용한다:

도 17에 예시된 바와 같이, 기관에의 연결부는 Y자형 커넥터 및 주 생물반응기 쪽으로 열리는 일방 밸브를 포함하였다. 이러한 유형의 연결부는 기도 구획으로부터의 유체의 누출로 인하여 필요하였다. 흡기 동안, 많은 배지가 폐에 들어갔다. 그러나, 이 배지 중 일부는 폐포막을 가로질러 간질 공간 또는 혈관계 내로 누출되었다. 따라서, 흡기 동안 폐에 들어간 배지 모두가 호기 동안 기관 저장부로 되돌아갈 수 있는 것은 아니었다. 도 17에 예시된 디자인은 모든 배지가 흡기 동안 폐에 들어가는 것을 허용하는 특징부를 포함하였다. 그러나, 호기 동안 배지는 폐로부터 또는 일방 밸브를 통하여 주 생물반응기로부터 기관 저장부로 되돌아갈 수 있었다.

또한 생물반응기는 시린지 펌프를 기관 캐뉼러 또는 기관 저장부에 직접적으로 연결함으로써 양압 환기를 이용할 수 있었다.

기관 개시부 변형:

생물반응기 맥락에서, 환기 동안 폐 기도 구획에 충분한 신선 배지가 공급되지 않았음이 관찰되었다. 임의의 특정 이론에 구애되고자 함이 없이, 이는 주로 상기 배지가 기관과, 별도의 기관 저장부 사이에 튜빙에 포함된 배지의 부피로 인하여 기관 내부에서 그리고 기관 외부에서 환기되고 있기 때문이라고 여겨지며, 이때 불충분한 신선 배지가 기관에 들어갔다. 기도의 배지 유동 루프 내의 "사강"은 신선 배지가 호흡 동안 폐 조직에 도달하지 못하도록 하였다. 그 결과, 생물반응기는 배지가 환기 동안 폐 내부 및 폐 외부로의 상이한 경로를 따르도록 변형시켰으며, 이는 도 17에 개략적으로 도시된 바와 같다. 이러한 변형으로 인하여, 각각의 호흡에서 기관에 들어가는 배지 대부분은 기관 저장부로부터 직접적으로 공급되었다 (그리고 그에 따라 기관을 떠나고 있는 배지와 비교하여 '신선함').

생물반응기 배양 동안의 산소 공급:

폐 배양 동안 생물반응기 중의 조직 배양 배지의 산소 함량을 측정하여 충분한 산소 함량이 있는지를 보장하였다. 특히, 음압 환기 동안 충분한 산소 전달이 있는지를 보장하는 것이 필요하였으며, 상기 음압 환기 동안 주 생물반응기는 기밀하고, 산소 진입을 위한 유일한 입구는 기관 저장부를 통한 것이었다. 산소 장력은 배양 코스에 걸쳐 유의하게 강하되지 않고, 보통의 조직 배양 배지에서의 수준과 동일한 6.0-7.0 mg/L에서 남아있음이 밝혀졌다. 이들 수준은 80-100 mmHg의 보통의 생리학적 수준을 초과하였다 (6-7 mg/L는 137-159 mmHg의 분압에 상응함).

생물반응기 압력 프로파일

생물반응기에서 배양된 엔지니어링된 폐 조직의 기관 및 폐동맥에서의 압력 프로파일을 측정하여 압력이 기대되는 한계치 또는 생리학적 한계치 이내임을 보장하였다. 도 18에는 대표적인 프로파일이 예시되었다. 관류 압력은 전형적으로 약 2 내지 30 mmHg 사이에서 유지하였다. 주어진 예에서, 기저선 관류 압력은 10-17 mmHg 사이에서 변하였다. 그러나, 음압 환기의 영향이 이 프로파일에 부가되었고, 그에 따라 음압 '호흡' 동안 관류 압력이 0-7 mmHg로 저하되었다. 이러한 영향은 생리학적으로 보이며, 여기서 상기 압력은 흡기에서 폐 혈관계에서 강하되었다. 생물반응기에서, 폐정맥을 '흉부'로서의 역할을 또한 하는 주 챔버 내에 직접적으로 배출시켰는데, 상기 흉부는 폐를 환기시키기 위하여 음압이 생성되는 곳이다. 이는 생물반응기로부터 관류된 혈관계까지 음압의 전송을 증가시키는 역할을 하였다.

관류 압력 프로파일로부터, 최대 '흉부' 음압은 대략 -12 mmHg이며, 이는 생리학적 값과 대략적으로 일치하였다. 따라서, 흡기 동안, 이러한 음압이 기도에 가해져서 유체 (또는 공기)를 기관 저장부로부터 폐 내로 유도하게 되었다. 이러한 압력은 점진적으로 기도 트리 위에서 감소하며, 기관 개시부에서는 -3 mmHg였다. 중요하게는, 본질적으로 기관 개시부에서의 상기 압력은 생리학적으로 0이었으며, 그 이유는 이것이 대기압에 묶여 있기 때문이다. 그러나, 생물반응기에서, 이러한 압력은 기관과 기관 저장부 사이의 튜빙 - 여기서, 압력은 0에 도달함 - 의 길이로 인하여 흡기 동안 약간 음으로 남아있다.

배지 및 산소 요건

하기 결과는 생물반응기에서 배양되는 설치류 폐에 필요한 공기 및 배지의 부피의 결정을 돕도록 의도되는 일련의 계산치를 예시하는 것이었다.

조직 배양 비교:

시험관내 조직 배양 동안, 500만개의 세포에 매 3일마다 12 ml의 배지를 공급하는 것이 일반적이었다. 성체 설치류 폐가 1억개의 세포를 포함한다고 가정하면, 이는 매 3일마다 많아야 240 ml의 배지를 필요로 하는 것에 상응한다. 그러나, 이는 조직 배양물 중 세포가 일반적으로 활발하게 복제되고 있을 때 과대 평가되는 것인 한편, 온전한 설치류 폐에서의 많은 세포는 휴면성이고 따라서 더욱 적은 배지를 필요로 하였다.

글루코스 소비 요건

관류된 래트 폐의 글루코스 소비량은 시간 당 1 g의 건조 중량 당 43 μmol임이 입증되었다 (문헌[Kerr et al., 1979, Am J Physiol 236:E229-33]). 성체 래트의 폐는 대략 150-250 mg의 건조 중량을 갖는 반면 (문헌[Inokawa et al., 2006, Ann Thorac Surg 82:1219-25]), 조직 배양 배지는 전형적으로 5.5 mmol/L의 글루코스를 함유하였다. 따라서, 성체 래트의 폐는 그의 글루코스 소비 요건을 충족시키기 위하여 일일 28-47 ml의 조직 배양 배지를 필요로 하였다.

산소 요건

폐동맥 내피 세포는 분 당 100만개의 세포 당 6 nmol의 산소를 소비하는 반면 (문헌[Xu et al., 2007, Proc Natl Acad Sci USA 104:1342-7], 래트 제II형 상피 세포는 분 당 1.25 nmol을 소비하였다 (문헌[Dobbs et al., 1980, Biochim Biophys Acta 618:510-23]). 성체 래트 폐에 1억개의 세포가 있다고 가정하고 폐의 모든 세포가 산소를 더욱 높은 속도로 소비한다고 가정하면, 래트 폐는 많아야 일일 26 mg의 산소를 필요로 하였다. 조직 배양 배지는 리터 당 대략 6 mg의 산소를 포함하며, 생물반응기는 대략 300 ml의 배지를 포함하였다. 따라서, 배지는 (매 3일마다) 신선 배지를 각각 교환해 주면 1.8 mg의 산소를 제공할 수 있었다. 게다가, 산소는 생물반응기 내의 공기에 포함되어 있으며, 주 생물반응기 내에는 대략 200 ml의 공기가 있었다. 인큐베이터 중 공기는 대략 20%의 O₂를 포함하며,이는 해수면에서 그리고 37℃에서 공기 1리터 당 대략 260 mg의 산소에 상응한다. 따라서, 생물반응기 내의 공기는 대략 52 mg의 산소를 포함한다.

본 발명의 생물반응기는 상기 계산치를 기준으로 하면 배양된 설치류 폐의 배지 및 산소 필요량을 제공할 수 있었다. 일상적으로, 총 240 ml의 배지를 생물반응기 내에 공급할 수 있으며 (주 생물반응기 내에 180 ml, 및 기관 저장부 내에 60 ml), 생물반응기 내의 공기는 매일 교환할 수 있었다. 이들 조건은 배양된 폐에 충분한 것보다 더 많은 영양제 및 산소를 제공하기에 충분한 것으로 여겨졌다.

전체 폐 배양

폐 생물반응기의 디자인을 검증하고 최적화하기 위하여, 전체 천연 설치류 폐의 시험관내 배양을 이용하였다. 폐를 생물반응기에서 최대 7일 동안 배양하였다. 생물반응기는 충분한 영양제 공급 및 기계적 자극을 제공하여 폐 형태뿐만 아니라 세포의 생존 및 분화도 유지하였음이 입증되었다.

또한 천연 폐의 배양물을 생물반응기에서 사용하여 세포 생존성, 폐 형태, 및 세포 분화 상태의 유지에 대한 생물반응기 조건의 영향을 조사하였다. 처음에 폐 형태에 대한 공기 대 액체 (배지) 환기의 영향을 비교하였다. 그 후 세포 생존성에 대한 환기 기술 및 영양제 전달의 영향을 평가하였다. 세포 생존성 및 분화에 대한 혈관 관류 압력의 영향도 평가하였다. 생물반응기가 7일간의 배양 동안 세포 분화를 유지하는 능력도 평가하였다.

전체 폐 형태에 대한 공기에 의한 환기 대 배지에 의한 환기의 영향:

배지 또는 실 공기 (대략 20%의 O₂)를 이용하여 생물반응기에서 배양한 폐를 환기시키는 것의 영향을 평가하였다. 배지를 이용한 환기는, 이것이 향상된 영양제 전달을 제공하기 때문에 향상된 세포 생존성을 제공하는 것으로 여겨지는데, 이는 큰 기도에 공급되는 관류된 기관지 순환이 전혀 없기 때문에 생물반응기에서 더욱 중요할 수 있다. 그러나, 공기에 의한 환기는 성체 폐를 컨디셔닝하는 조건이며, 폐 상피는 빈번하게는 공기-액체 계면의 존재 하에 배양되는데, 이는 태아 래트 폐에서 적절한 폐 발생을 가능하게 하는 것으로 밝혀졌다 (문헌[Funkhouser et al., 1976, Biochem Biophys Res Comm 70:630-7]). 따라서, 공기-액체 계면의 결여로 인하여 배지에 의한 환기가 상피 분화 상태의 손실로 이어지는지를 조사하기 위하여 실험을 또한 디자인하였다.

배양 3일 후, 공기에 대하여 배지로 환기시킨 폐들 사이에서 상당한 차이가 나타났다. 도 19에 예시된 바와 같이, 배지 환기는 천연 폐와 유사한 것으로 보였지만, 공기-환기된 폐는 크게 확장된 기도를 보여주었으며, 이때 세포 잔사가 기도에서 명확하였다 (도 19c). 더욱이, 도 19c의 중앙 패널은 공기-환기된 폐의 기관지 및 세기관지 상피가 완전히 없음을 예시하며, 이러한 발견은 전체 폐를 가로질러 일치하였다. 게다가, 확장된 주위 기적 (airspace)이 명백하였으며, 이는 도 19c의 우측 패널에 예시된 바와 같다.

또한 기도 상피는 (공기를 이용한 환기에 더하여) 배지를 혈관계를 통하여 관류하는 경우 벗겨지고, 환기 없이 배지를 혈관계를 통하여 관류하는 경우 기도 상피는 온전함이 또한 관찰되었다. 이는 기도 상피의 손실이 충분한 배지의 결여로 인한 것이 아니고, 공기 환기의 영향에 관련됨을 시사한다. 기관지 순환계는 임의의 배양물에 있어서 관류되지 않는 것으로 관찰되었다.

상피 세포는 흔히 공기-액체 계면에서 배양되며 이는 그의 생리학적 위치와 일치한다. 흔히 공기-액체 계면 (ALI)을 이용하여 상피 분화를 유도하며 (문헌[Gruenert et al., 1995, Am J Physiol 268:L347-60]; [Wong et al., 2009, J Clin Invest 119:336-48]; [Hosokawa et al., 2007, Connect Tissue Res 48:9-18], 공기-액체 계면의 결여는 섬모형성을 감소시킬 수 있다 (문헌[Ostrowski et al., 1995, Exp Lung Res 21:957-70]; [Yeh et al., 2007, Laryngoscope 117:1439-44]). 게다가, 공기-액체 계면은 시험관내에서 배양될 때 제II형 상피에 의해 계면활성자 분비 유지를 가능하게 한다 (문헌[Mason et al., 2002, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 282:L249-58]). 따라서, ALI의 부재 하에서의 세포 분화 상태의 차이가 나타날 것으로 기대되었다. 그러나, 도 25에서 7일까지 수행된 배양에 대하여 예시된 바와 같이 배지로 환기시킨 폐에서 클라라 세포 분비 단백질 (CCSP), 계면활성 단백질 C (SPC), 또는 아쿠아포린 (AQP)의 발현 패턴의 상당한 변화는 관찰되지 않았다.

세포 생존에 대한 관류의 영향:

생물반응기에서 배양 천연 폐에서 세포 생존 및 세포 분화에 대한 혈관 관류의 영향을 조사하였으며, 이때 관류 단독이 시험관내 폐 배양을 지지할 수 있는지, 또한 만일 그렇다면 어떠한 관류 압력이 최적인지를 결정하는 것이 목표였다. 이들 실험을 복잡하게 하는 것은, 폐의 외식 (explantation) 후 혈관 투과성이 빠르게 증가한다는 사실이었다. 10 mmHg의 압력을 이용한 단리 폐 관류는 10분 내에 폐부종을 야기할 수 있다 (문헌[Wierup et al., 2005, J Heart Lung Transplant 24:379-85]. 혈관 누출은 외식한지 5-10분 이내에 관찰되었으며, 이때 작은 입자 (28 nm의 반경) 중 3-4%는 폐포-모세관 막을 가로질러 누출되었다. 광범위한 폐 미세혈관 누출은 원위 모세관 및 정맥 구조로 배지가 덜 전달되게 하거나 심지어 배지가 전혀 전달되지 않게 할 수 있었다. 따라서, 대략 1-10 mmHg의 생리학적 수준보다 더 높은 혈관 관류 압력이 유동물을 원위에 전달하여 원위 모세관이 계속하여 개방되어 있게 하기 위하여 필요하다 (문헌[Li et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101:11488-93]).

생물반응기에서 3일간 천연 폐를 배양하는 동안 세포 생존에 대한 혈관 관류 압력의 영향을 조사하였다. 도 20에서 입증되는 바와 같이, 10 또는 20 mmHg의 압력과 비교하여 최대 30 mmHg의 더욱 높은 관류 압력에 의해 아폽토시스성 세포가 더욱 적어졌고, 이 외에도 세포 밀도가 더욱 높아졌다. 그러나, 관류 압력에 관계없이, 세포 분화의 유지는 혈관 관류에서는 불량하였다. 실질적으로 더욱 낮은 CCSP 및 SPC 수준이 관찰된 반면 (도 21), 아쿠아포린 발현은 거의 완전히 없었다. PECAM 발현은 혈관계의 더욱 큰 혈관에서 관찰되었지만, 발현 감소가 모세관에서 관찰되었으며, 이는 도 22에 예시된 바와 같다. 이들 실험은 관류 단독은 충분한 세포 생존 또는 세포 분화의 유지에 충분하지 않았음을 입증하였다.

세포 생존에 대한 기도 구획 내 배지 유동 경로의 영향

배지를 이용한 환기가 폐 형태 및 세포 분화의 유지를 가능케 하였지만, 천연 폐와 비교하여 환기된 배양 폐에서 유의하게 더 높은 비율의 아폽토시스 세포가 관찰되었다 (도 23 및 도 28 참조). 이는 불충분한 신선 배지 전달로 인한 것이라 여겨지며, 따라서 환기 동안 기도 구획으로의 신선 배지 전달을 증가시키기 위하여 실험을 생물반응기가 변형되도록 디자인하였다. 도 17에 예시된 바와 같이 그리고 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 기관 저장부에 주 생물반응기를 연결하는 단일 라인이 있다. 이 튜빙 길이는 대략 40-45 cm이고, 3-3.5 ml의 배지를 포함한다. 환기 동안, 대략 2.5-3.0 ml의 배지를 음압 흡기 동안 폐 내로 흡인시키고, 동일 부피의 배지를 튜빙을 통하여 기관 병에 되돌아가게 하였다. 따라서, 각각의 '호흡' 동안 폐에 들어간 대략 2.5-3.0 ml의 배지 중, 이 배지는 신선하지는 않지만 단순히 튜빙으로부터 폐 내로 되돌아갔다. 따라서, 폐로의 실제 배지 전달량은 신선 배지에 의한 환기에 의해 전달되는 것보다 훨씬 더 적다.

생물반응기 디자인은 주 생물반응기 내의 폐와 기관 저장부 사이에 제2 연결부를 부가하도록 변형시켰다. 일방 체크 밸브를 이용하여, 흡기 동안의 배지 전달에 하나의 연결부를 이용하고 호기 동안의 배지의 되돌아감에 다른 하나의 연결부를 이용하였다. 이러한 변형은 '재순환되는' 배지를 각각의 환기 사이클에서 대략 2.5-3.0 ml로부터 단지 대략 0.75 ml로 감소시켰으며, 따라서 신선 배지의 전달을 크게 증가시켰다.

이러한 생물반응기 변형의 영향은 도 24에 예시되어 있으며, 여기서 추가의 호흡 라인은 세포 생존성을 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 단일 라인을 이용한 환기의 경우 '루프식' 환기의 경우의 21.5%로부터 3.9%로 아폽토시스성 세포의 퍼센트가 감소되었다 (도 27에서 '단지 환기'). 이는 천연 폐의 경우의 0.5%로의 감소와 비교되었다.

'루프식' 환기는 '재순환' 배지의 양을 감소시킴으로써 폐로의 배지의 전달을 증가시키는 한편, 배지 전달은 혈관 관류의 부가에 의해 또한 증가시킬 수 있었다. 환기와 함께 관류하면 단일 라인 환기 단독의 경우의 21.5%로부터 7.9%로 세포 아폽토시스가 감소되었다 (도 23). '루프식' 환기의 변형은 단일 라인 환기와 비교하여 전체 세포수를 약간 증가시켰지만 (도 23b), 이는 유의한 차이는 아니었다. 단일 라인 환기 및 '루프식' 환기 둘 모두에 있어서, 세포수는 천연과 비교하여 감소하였지만, 이는 통계적으로 유의한 것은 아니었다.

본원에 제시된 결과는, '루프식' 환기의 변형 또는 보충적 혈관 관류를 이용하여 충분한 신선 배지를 폐에 전달할 경우 환기 단독이 3일간의 배양 동안 생물반응기에서의 천연 폐 조직의 생존을 가능하게 함을 입증하였다. 루프 환기는 배양된 폐 조직에서 세포수를 최대화하면서 세포 아폽토시스는 최소화하는, 최상의 전체 결과를 입증하였다.

세포 형태, 세포 분화 및 폐포 구조:

생물반응기 디자인을 더욱 충분히 검증하기 위하여, 7일간의 천연 폐 배양을 수행하였다. 이들 배양은 본원의 다른 곳에 기술된 '루프식' 변형을 이용하여 배지로 환기하는 것을 이용하였지만, 임의의 혈관 관류는 없었다. 혈관 관류를 이용하지 않았지만, 미래의 연구는 '루프식' 환기를 이용하여 장기간 환기된 배양물에 관류를 부가하는 것을 탐구할 수 있다.

아쿠아포린-5 (제I형 상피), 계면활성 단백질 C (제II형 상피), 클라라 세포 분비 단백질 (클라라 세포) 및 PECAM-1 (내피)에 대한 염색을 통하여 세포 분화의 유지, 아폽토시스 및 세포 증식에 대하여 조직학적 분석을 통하여 폐를 평가하였다. 도 29a 및 도 29b에 예시된 바와 같이, 폐포 구조를 포함하는 전체 폐 뼈대가 보존되었다. 더욱 낮은 배율의 이미지는 배지 호흡의 경우 도 19에 예시된 것으로부터 구별할 수 없었다. 게다가, 도 29c 내지 도 29j에 예시된 바와 같이, 세포 마커의 발현 패턴은 천연 폐와 실질적으로 상이하지 않았다.

환기 단독은 폐의 혈관계의 수동적 관류를 가능하게 한다:

환기 단독은 내피를 포함하는 몇몇 주요 폐 세포 유형의 세포 표현형의 유지 및 세포 생존을 최대 7일 동안 가능하게 할 수 있음이 입증되었다. 그러나, 이는 혈관계를 통한 배지의 능동적 관류의 부재 하에 그러하였으며, 이는 처음에 놀라운 것이었다. 관류의 결여가 내피 생존 또는 분화에 영향을 주지 않는 이유를 조사하기 위하여, 유체가 혈관계 내로 이동하는 것에 대한 관류의 영향을 조사하기 위하여 5 ㎛ 미소구체를 사용한 실험을 수행하였다. 환기에 의해 유도되는 물리적 이동은 혈관계의 내부 및 외부로의 배지의 수동적 이동을 야기하기에 충분한 것으로 여겨지는데, 상기 혈관계는 생물반응기에서 배지에 대하여 개방되어 있다. 이 실험에서, 5 ㎛ 미소구체를 포함하는 배지로 충전된 생물반응기에서 3시간 동안 폐를 환기시켰다. 미소구체가 폐의 혈관계에서 관찰되는 경우, 이는 수동적 관류가 환기에 의해 유도되었음을 나타낸다. 도 26에서 입증된 바와 같이, 미소구체는 큰 혈관 및 몇몇 모세관 둘 모두에서 발견되었다. 이들 결과는 환기 단독이 혈관계에서 배지 이동을 유도하기에 충분하고 따라서 관류의 결여에도 불구하고 내피가 유지되게 함을 나타낸다.

혈관계에서의 배지의 이러한 이동은 환기로 인한 폐의 물리적 운동의 결과였다. 확산 단독은 그러한 큰 입자가 혈관계 내로 이동하게 하기에 불충분하였다. 픽 제2 법칙 (Fick's second law)을 이용하여 확산으로 인한 혈관계 내로의 기대되는 미소구체의 이동을 근사치로 구할 수 있었다.

세포 생존 및 분화의 지지

본원에 제시된 결과는 혈관 관류 단독이 제II형 상피에 의한 계면활성자 생성을 포함하여 세포 생존 및 세포 분화의 지지에 불충분함을 입증하였다. 그러나, 배지에 의한 음압 환기는 광범위한 세포 생존을 지지하기에 충분하였으며 (천연 수준의 95.1%까지), 이 외에도 상피 및 내피의 분화를 유지하기에 충분하였다.

본 예의 실험의 전체적인 목적은 장시간 동안 시험관 내에서 전체 설치류 폐를 배양할 수 있는 생물반응기의 유효한 디자인을 보여주는 것이었으며, 이때 엔지니어링된 폐 조직의 미래의 배양에 이 생물반응기를 사용하는 것이 목적이었다. 그 결과에 의하면 엔지니어링된 폐 배양에서 사용하기에 적합한 성공적인 디자인이 입증되었다.

실시예 4: 엔지니어링된 폐 조직에서의 상피의 발달

본원에 제시된 결과는 탈세포화 스캐폴드가 세포독성이 아니며, 상피, 내피 및 간엽 세포를 포함하는 넓은 범위의 폐 세포 유형의 유착 및 증식을 지지함을 입증하였다. 일부 예에서, 줄기 세포를 사용하여 폐 조직을 엔지니어링할 수 있었다. 엔지니어링된 폐 조직이 유용해지도록 하기 위해서는, 이것이 혈관계 및 기도에 연결될 수 있어야 한다. 기도는 폐포와 연속성이어야 하는 반면, 혈관 연결은 폐포를 둘러싸고 있는 조밀한 모세관 네트워크를 생성하여야 한다.

본원에 제시된 결과는 배지 유형, 관류, 환기, 및 공기-액체 계면의 존재를 포함하는 생물반응기 주요 조건에 의해 엔지니어링 폐 조직의 발달이 영향을 받음을 입증하였다. 일부 예에서, 배양 배지에 의한 환기 (즉, "액체 환기")는 기도 구조 및 상피 세포의 분화를 돕는다. 게다가, 엔지니어링된 조직의 작은 조각을 공기-액체 계면에서 정적으로 배양하면 조직 성장에 대하여 상당한 영향을 나타내었으며, 생물반응기에서 공기에 의한 환기는 상피 구조의 발달 및 세포 분화에 영향을 주었다.

이제 이들 실험에서 이용한 재료 및 방법을 설명한다.

재료 및 방법

스캐폴드 제조

성체 피셔 344 래트의 폐를 수확하고, 탈세포화하였으며, 이는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같다. 탈세포화 절차 후에, 스캐폴드를 살균수를 10회 교환하여 헹구고, 이어서 PBS 중 10% 페니실린/스트렙토마이신에서 12시간 이상 동안 헹구었다. 이후의 배양에서, 세포를 10% FBS에서 또한 헹구어서 DNA 잔여물의 제거를 도왔다. 그 후, 완전한 관류 및 호흡 시스템이 부착된 새로운 살균 생물반응기에 폐를 옮겼다. 그 후, 폐를 PBS에서 2회, 및 배양에 사용되는 배지에서 1회 헹구었다.

신생체 세포 단리

본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이 폐를 신생체 (대략 7일령) 래트로부터 단리하였다. 그 후 폐를 70% 에탄올에서 10 sec 동안 헹구고, 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM, 깁코)에서 2회 헹구고, 그 후 살균 건조 페트리 디쉬로 옮겼다. 폐를 메스로 5분 동안 잘게 썰고, 그 후 엘라스타제 소화를 위하여 코니칼 튜브로 옮겼다. DNase, 콜라게나제 및 엘라스타제를 워팅톤 바이오케미칼 (Worthington Biochemical) (미국 뉴저지주 레이크우드)로부터 획득하였다. 엘라스타제 소화를 100 U/ml의 DNase를 포함하는 DMEM 중 4 U/ml의 엘라스타제를 이용하여 실온에서 교반하면서 20분 동안 수행하였다. 그 후 조직 덩어리를 70 ㎛ 나일론 필터를 통하여 여과하고 DMEM으로 헹구었다. 소화되지 않은 덩어리를 청결한 튜브로 옮기고, 1:1의 DMEM:PBS - Ca^{2 +} 및 Mg^{2 +}를 포함함 - 중 1 mg/ml의 콜라게나제의 용액에서 실온에서 1시간 동안 교반시키면서 콜라게나제로 소화시켰다. 콜라게나제-소화된 조직을 70 ㎛ 필터를 통하여 다시 여과하고, 소화되지 않은 조각을 시린지 플런저를 이용하여 물리적으로 파쇄하였다. 남아있는 조직을 DMEM으로 헹구고, 70 ㎛ 필터를 통하여 여과하였다. 콜라게나제 및 엘라스타제 소화로부터의 세포를 합하고, 그 후 DMEM에서 3회 세척하고, 배양에 사용되는 배지에서 1회 세척하였다. 세포 생육성은 트립판 블루 염료 배제를 이용하여 평가하였으며, 그 후 세포를 탈세포화 스캐폴드 내에 접종하였는데, 이는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같다.

신생체 세포 접종

폐 세포 단리 및 탈세포화 스캐폴드의 제조 후, 단리된 세포를 배양에 사용되는 배지 중에 현탁시켰다. 기도 구획의 접종에 있어서, 생물반응기 당 15 ml의 세포 현탁물을 기관 저장부 내로 주입하고, 세포를 음압 환기에 의해 접종하여 세포를 폐의 기도 구획 내로 이전시켰다. 혈관계의 접종에 있어서, 생물반응기 당 3 ml의 세포 현탁물을 폐동맥 내로 주입하였다. 관류 또는 환기 없이 세포를 하룻밤 유착시키고, 그 후 관류 및/또는 환기를 실험 조건에 따라 시작하였다.

엔지니어링된 조직의 배양

접종 후, 폐를 하룻밤 정적으로 배양하였으며, 그 후 관류 또는 환기를 시작하였다. 관류 및 환기는 실험 조건에 따라 달라졌다. 배양 배지를 매주 2회 교체하였다. 환기 조건에 있어서,생물반응기에서 공기를 수동으로 교환하기 위하여 매일 잠깐 중지하는 것을 제외하고는 폐를 계속하여 환기시켰다. 엔지니어링된 조직의 조각의 배양에 있어서, 하룻밤 접종 후 스캐폴드를 생물반응기로부터 꺼내고, 살균 가위를 이용하여 작은 (1-3 mm) 조각으로 절단하였다. 상기 조각을 배양용 페트리 디쉬로 옮기고, 지시될 경우, 공기-액체 계면 배양을 위하여 0.4 ㎛ 필터를 포함하는 페트리 디쉬로 이후에 옮겼다.

유세포 분석법

세포 단리 후, 세포를 완충액 (2 mM EDTA 및 0.5% 소 혈청 알부민을 포함하는 PBS)에서 헹구었다. 세포내 항원의 염색에 있어서, 세포를 실온에서 15분 동안 1% 포름알데히드로 고정하고, 그 후 PBS 중 0.2% 트리톤-X가 투과되게 하였다. 일차 항체를 완충액 중에서 실온에서 30분 동안 1:100으로 희석시켜 적용하였다. 완충액에서의 3회 헹굼 후, 이차 항체를 실온에서 20분 동안 1:100으로 희석시켜 적용하였다. 세포를 예일 의학대학원 세포 분류 기관 (Yale School of Medicine Cell Sorting Facility)에서 벡톤-디킨슨 (Becton-Dickinson) FACSCalibur 기계에서 분석하였다.

이제 실험 결과를 설명한다.

스캐폴드는 세포독성이 아니다

처음에, 종양-유래된 폐 상피 세포주인 MLE-12를 탈세포화 폐 스캐폴드에서의 예비 배양 실험에 사용하였다. 이들 실험을 수행하였더니 스캐폴드가 세포독성이 아님이 입증되었으며, 이 외에도 탈세포화 스캐폴드를 이용하는 배양을 위한 생물반응기 시스템의 1차적 유효성이 입증되었다. MLE-12 세포주는 생물반응기에서 탈세포화 스캐폴드 상에서의 최대 10일의 배양 기간 동안 강한 세포 성장을 나타냈으며, 이때 혈관계를 통하여 배지를 관류시켰다. 조직학적 특성이 도 27에서 입증되었다. 세포는 3일에는 매우 원시적인 폐포 구조를 형성하는 것으로 보였지만, 그 후 광범위하게 증식하였으며, 제어되지 않은 세포 성장이 7일까지 나타났고, 이는 상기 세포주가 종양-유래된 세포주이기 때문에 기대되는 결과였다. 이들 실험은 탈세포화 폐 스캐폴드 및 생물반응기의 확인에서 예비단계였으며, 신선하게 단리된 신생체 폐 세포를 이용한 후속 실험을 정당화하였다.

신생체 폐 세포 의 수확

폐 세포 유형들의 이질적 믹스를 대표하는 다수의 세포를 단리하는 능력을 포함하여 몇몇 이유로 신생체 폐 세포를 선택하였으며, 그 이유는 설치류 폐 상피가 시험관내에서 배양하기 어렵기 때문이고, 신생체 래트의 폐 세포는 젊은 세포이고 상대적으로 조직 형성적이기 때문이다 (문헌[Massaro et al., 1985, J Clin Invest 76:1297-305]; [Meyrick et al., 1982, Am Rev Respir Dis 125:468-73]).

세포 단리를 위한 조건을 유세포 분석법을 기반으로 한 세포의 수, 생육성, 및 세포 유형의 분포를 기초로 하여 최적화하였다. 사용한 일차 마커는 계면활성 단백질 C (SPC; 제II형 허파세포), 아쿠아포린-5 (AQP; 제I형 허파세포), 클라라 세포 분비 단백질 (CCSP; 클라라 세포), 및 혈소판 내피 세포 유착 분자-1 (PECAM-1; 내피 세포)였다. 세포 단리를 위한 조건은 전체 세포의 수 및 생육성을 최적화하는 반복된 실험의 결과로서 선택하였다. 인큐베이션 조건 및 효소의 선택을 세포 수율 및 생육성을 기반으로 하여 최적화하였으며, 이는 총 세포수, 트립판 블루 염료 배제, 및 유세포 분석법에 의해 평가한 바와 같다.

'최적화' 단리 방법 하에 얻어진 샘플 폐 단리물에 대한 유세포 분석법 데이터가 도 28에 예시되어 있다. 전형적인 단리에서, 5-10%의 세포가 CCSP-양성이며, 40-60%의 세포가 SPC-양성이며, 2-8%의 세포가 AQP-양성이며, 1-2%의 세포가 시토케라틴-14-양성이며, 10-30%의 세포가 PECAM-1 양성이며, 5-10%의 세포가 α-액틴-양성이었다. 시토스핀 제제를 이용하여, CCSP 및 SPC의 염색을 확인하였다. 이들 백분율 중 대부분이 기대되는 범위 이내이지만, 더 높은 수율의 제I형 허파세포 (AQP-양성)가 기대되었으며, 이는 단지 천연 폐에서의 그의 유행을 기반으로 한 것이었다. 그러나, 제I형 허파세포는 매우 약하며, 이들 중 다수는 세포 수확 과정을 이겨낼 가능성이 없다. 한 배의 새끼 (7-12마리의 새끼)로부터의 총 세포 수율은 대략 1억개의 세포였으며, 이때 생육성은 75-85%였다.

엔지니어링된 폐의 배양에 있어서의 생물반응기 조건의 예비 확인

단백질 발현의 일부 평가뿐만 아니라 조직학을 통한 세포 밀도, 생육성 및 형태에주로 기반하는 적합한 조건 및 다양한 변수들을 탐구하도록 실험을 디자인하였다. 평가하는 조건들을 하기에 간략하게 기술하였다.

배지 선택: 기본 배지 및 혈청 농도 둘 모두가 다양한 몇몇 배지 조성물을 평가하였다. BGJb (무혈청), 10% FBS를 포함하는 DMEM, 15% FBS를 포함하는 EGM-2, 및 3부 대 1부의 EGM-2+15%FBS와 BGJb의 믹스를 포함하는 몇몇 배지 조건을 이용하여 주로 제II형 상피인 상피의 재증식을 관찰하였다. BGJb 및 DMEM+10% FBS의 배지 유형은 조직학 및 면역형광 염색에 기반하면 전체 상피 성장에 있어서 탁월한 조건을 제공하였다. 그 결과, 이들 배지를 후속 실험에 사용하였다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 배지에 한정되어서는 안된다. 이는 요망되는 증식 및 분화를 촉진하는 임의의 배지가 사용될 수 있기 때문이다.

관류 및 환기: 관류 및 환기 둘 모두를 예비 실험 동안 사용하였다. 예를 들어, 배양물을 2-5 ml/min으로 관류하여 영양제를 공급하였다. 단일 호흡에서 매일 1회의 환기의 영향을 또한 평가하였다. 그러나, 생성된 엔지니어링된 폐 배양물에서의 유의한 차이는 탐지되지 않았다. 매일 1회의 환기로부터의 명백한 이득이 관찰되지 않음에도 불구하고, 이러한 최소 수준의 환기가 더욱 생리학적인 배양 환경을 제공함이 결정되었다. 따라서, 대다수의 후속 실험에 있어서, 배양물을 단일 호흡에서 매일 1회 관류 및 환기시켰다.

탈세포화 스캐폴드는 상피, 내피 및 간엽 세포의 성장을 지지한다

하기 실험은 엔지니어링된 폐 조직의 개발을 위한 단리된 신생체 폐 세포 집단, 폐용 생물반응기, 및 탈세포화 스캐폴드의 유효성을 입증하기 위하여 디자인하였다. 이들 엔지니어링된 조직의 배양에 사용한 정확한 조건이 표 1에 확인되어 있다. 또한, 상기 표에는 엔지니어링된 조직의 성장에 대한 상기 조건들의 영향을 평가하기 위하여 특정적으로 프로빙된 조건들이 기술되어 있다. 그러나, 본 발명은 이들 조건에 한정되는 것은 아니다. 오히려, 임의의 응용가능한 조건이 생물반응기 맥락에서 엔지니어링 폐의 생성을 촉진하는 한 본 발명 내에 포함된다.

상피 세포 재증식의 입증

본원에 제시한 결과는 탈세포화 폐 스캐폴드 상에서의 상피 세포의 유착 및 증식을 입증하였다. 이들 실험에 있어서, DMEM+10% FBS 배지, 2 ml/min에서의 혈관계의 관류, 매일 1회 환기, 비코팅된 탈세포화 스캐폴드, 및 분류되지 않은 신생체 폐 세포 집단 (본원의 다른 곳에 기술된 '최적화' 조건)을 이용하였다.

도 29는 엔지니어링된 폐 조직의 H&E 염색을 예시한다. 4일에서, 상당한 수의 조직화된 입방 상피-라이닝된 발달 중인 상피 구조가 관찰된 반면, 8일에는 더 적은 수의 그러한 구조가 관찰되었고, 많은 세포는 더욱 성숙한 표현형을 채용하였다. 4일에는 많은 세포가 증식 중인 반면, 8일에는 더 적은 증식 중인 세포가 관찰되었다 (도 30). 4일 및 8일 둘 모두에서, 유의한 수의 아폽토시스성 세포는 관찰되지 않았다 (도 31).

제I형 허파세포의 경우 아쿠아포린-5, 제II형 허파세포의 경우 계면활성 단백질 C, 및 클라라 세포의 경우 클라라 세포 분비 단백질을 이용하여 주요 상피 세포 마커의 발현을 점검하기 위하여 면역형광을 이용하였다. 일반적으로 제II형 상피 세포는 도 33에 예시된 바와 같이 특히 이후의 시점에서 배양물 중에서 우세하였다. 클라라 세포는 4일에는 고밀도로 관찰되었으며, 8일에는 세포가 더 적었다 (도 32). 4일에서 아쿠아포린의 염색이 또한 관찰되었지만, 이후의 시점에서는 유의하게 더 적은 아쿠아포린 염색이 관찰되었다 (도 34).

제I형 상피에 있어서의 아쿠아포린 염색은 배양 4일에 입방형인 세포를 예시하는 것으로 관찰되었으며, 이는 기능성 폐에서 폐포를 라이닝하는 세포로서 그의 평평한 형상과는 대조적이었다. 게다가, 이들 입방 세포는 또한 SPC 또는 CCSP에 대하여 빈번하게 양성으로 염색되며, 이는 도 36 및 도 37에서 보는 바와 같다. 따라서, 4일에 아쿠아포린을 발현하는 세포는 성숙한 제I형 상피일 가능성이 없으며, 이는 다른 마커 없이 아쿠아포린의 발현 및 평평한 형태에 의해 시사되는 바와 같았다.

제I형 허파세포는 생체내에서 제II형 상피 세포로부터 유래되며, 이는 폐포 상피에 있어서 국소적으로 내재하는 전구 세포이다. 발생 동안의 천연 폐에서, 제I형 허파세포는 태아 호흡 운동의 부재 하에서는 최종 분화 상태를 달성하지 못하며 (문헌[Inanlou et al., 2005, Dev Dyn 233:772-82], 조직학 및 TEM에서 입방형으로 남아있지 못하였다 (문헌[Inanlou et al., 2005, Histol Histopathol 20:1261-6]).

제I형 허파세포 분화의 결여는 규칙적으로 환기되지 않은 이들 배양에서 놀라운 것이 아니었다. 아쿠아포린을 발현하는 세포는 제I형 상피로 완전히 분화되지 않은 국소적 전구 세포로부터 생겼을 가능성이 가장 크다. 따라서, 탈세포화 스캐폴드는 폐 상피의 부착 및 증식을 지지할 수 있다. 제II형 상피와, 전구체가 제I형 상피 세포로 완전히 분화될 가능성이 있는 세포 및 클라라 세포의 강한 성장이 관찰되었다. 본 발명자들은 혈관계를 통한 배지 관류의 조건 하에서의 이들 발견을 관찰하였으며, 이때 호흡 운동은 단지 가끔 있었다.

상피 조상 세포 재증식

탈세포화 스캐폴드 상에서의 2가지 유형의 폐 상피 조상 세포의 성장이 관찰되었다. CCSP 및 SPC에 대하여 이중 양성인 세포는 국소적 조상 세포로 보고된 것으로서, 이는 폐포 줄기 세포로 지칭되며, 클라라 세포 및 제II형 허파세포 둘 모두로 분화될 수 있고, 폐포관 이음부에서 발견되었다 (문헌[Lane et al., 2007, Regenerative Medicine 2:407-15]; [Kim et al., 2005, Cell 121:823-35]). 도 35는 말단 세기관지의 외관과 일치하는 구조에서 발견되는 그러한 이중 양성 세포를 예시하는데, 상기 말단 세기관지는 이들 세포의 기대되는 생리학적 위치이다.

기저 세포는 폐 기도에 있어서의 국소적 줄기 세포이며, 이는 원주 상피 아래에 있고 근위 기도의 상피의 재생성 세포 공급원으로서의 역할을 한다. 도 36은 기저 세포 마커인 시토케라틴-14에 대하여 양성인 세포를 보여준다. 비교를 위하여, 천연 폐가 도 36a에 예시되어 있다. 게다가, 시토케라틴-14 및 CCSP에 대한 이중 염색이 도 37에 예시되어 있으며, 이는 클라라 세포가 기도를 라이닝하고 있고 기저 세포가 클라라 세포 아래에 놓여 있음을 또한 입증하는데, 이는 상기 세포의 정상적인 해부학적 위치와 일치한다. 이들 세포는 때로 더욱 큰 기도 구조 아래에서 발견되며, 이는 천연 폐에서의 그의 위치와 일치하지만 (도 36b), 큰 기도와 결부되지 않은 것으로 보이는 클러스터에서 또한 발견된다 (도 36c).

상피 및 내피 세포의 성장에 더하여, 간엽 세포를 탈세포화 폐 스캐폴드에서 재증식시킬 수 있다. 도 38은 α-액틴의 면역형광 염색을 예시하며, 이는 평활근 및 근섬유모세포를 염색한다. 이들 엔지니어링된 조직을 상피 성장에 유리한 것으로 밝혀진 상기 조건 하에 배양하였다. 간엽 세포는 발달 중인 상피 구조 아래에 그리고 그 사이에 위치하는 것으로 발견되었으며 이는 천연 폐에서의 그의 위치와 일치함이 또한 관찰되었다. 따라서, 본원에 제시한 결과는 탈세포화 스캐폴드가 간엽 세포의 성장에 또한 적합한 기재이며 생육성 간엽 세포는 신생체 폐 세포의 집단 내에 포함됨을 입증하였다.

상피 분화에 대한 배지 조성의 영향

배지 유형은 세포 성장 및 분화에, 및 그에 따라 엔지니어링 폐 조직의 발달에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 이들 차이들 중 몇몇을 더욱 상세하게 조사하기 위하여, 상피 분화시에 무혈청 배지 (BGJb) 대 혈청 함유 배지 (DMEM+10% FBS)를 사용한 엔지니어링 폐 배양물의 성장을 비교하였다. 이들 실험에서, 먼저 세포를 DMEM+10% FBS 중의 스캐폴드 상에 접종하고, 이 배지에서 2일 동안 배양하고, 그 후 BGJb (무혈청) 배지로의 점진적인 4일간의 전환이 일어났고, 이때 마지막 2일간은 순수 BGJb 배지에서 배양하였다. 무혈청 배지로의 전환은 계면활성자의 발현에 대하여 상당한 효과를 야기하였다. 무혈청 배지는 DMEM+10% FBS와 비교하여 계면활성자 (SPC)가 더욱 정점으로 발현되게 함을 관찰하였다 (도 39c 및 도 39d). 이는 무혈청 배지 (BGJb)를 이용한 웨스턴 블롯에서의 계면활성자의 발현의 유의한 증가에 상응하였다 (도 40; 'DMEM' 및 'BGJb'로 표지된 레인을 비교). 게다가, 계면활성자의 형태는 천연 폐와 더욱 더 일치하였다 (대부분의 계면활성자는 BGJb 배지 중 21 kDa 프로 (pro)-SPC 형태로 나타냄).

게다가, 무혈청 배지로의 전환에 의해 CCSP 발현이 감소하였으며, 이는 도 43f 및 도 43e에서 면역형광을 통하여 나타내어져 있다. 둘 모두의 배지 유형에서, 확산적 CCSP 발현이 발달 중인 상피 구조의 내강 (lumen)에서 관찰되었다. 이러한 표현형은 관류 또는 환기의 결여로 인한 것으로 여겨지며, 그 이유는 이들 배양을 작은 조직 슬라이스에서 수행하였기 때문이다.

생물반응기에서의 폐 발달에 대한 공기-액체 계면의 영향

공기-액체 계면을 생성하기 위하여, 엔지니어링된 폐를 먼저 배지를 이용한 환기 하에서 4일 동안 배양하여 세포가 부착되고 증식되게 하였다. 마지막 4일간의 배양 동안, 환기를 배지에 의한 것으로부터 여과된 실 공기에 의한 것으로 바꾸었다.

공기에 의한 환기는 기도 상피에 심각한 손상을 야기하였으며, 이 외에도 몇몇 폐포 벽에 대한 파괴적 변화를 야기하였다 (도 19). 따라서, 공기 환기에 사용한 호흡 용적은, 공기 환기에 의해 천연 폐에 야기된 손상을 감소시키려는 노력으로 액체 또는 공기 호흡에 있어서 대략 2.0-2.5 ml의 이전의 값으로부터 대략 50%만큼 감소시켰다.

생물반응기에서의 공기 환기의 존재로 인한 세포 부착 또는 형태의 변화는 관찰되지 않았다. 그러나, 생물반응기에서 배양한 엔지니어링된 폐에서의 공기에 의한 환기가 제I형 상피에 있어서의 분화 마커인 아쿠아포린의 발현을 유도함이 관찰되었다. 이는, 전형적으로 계면활성 단백질 C에 대해서만 염색되고 (제II형 상피를 지시함) 이 외에도 발달 중인 상피 구조에서 입방 세포가 가끔 염색되는 실질 내의 세포에서 둘 모두가 나타났다. 관찰된 염색 패턴은 아쿠아포린-발현 세포들 중 대부분이 SPC를 또한 발현할 가능성이 고도로 높음을 나타낸다. 도 42b로부터 알 수 있는 바와 같이, 실질 내의 실질적으로 모든 세포가 SPC를 발현하는 반면, 실질 세포의 하위세트는 AQP를 발현한다 (도 41a).

이들 발견은 공기-액체 계면이 제II형 상피의 제I형 상피로의 분화를 유도하고 있음을 고도로 시사하는 것이다. 제II형 상피는 제I형 상피에 있어서 공지된 국소적 조상 세포이며, 따라서 이 분화는 놀라운 것이 아니다 (문헌[Adamson et al., 1974, Lab Invest 30:35-42]; [Fehrenbach, 2001, Respir Res 2:33-46]). 더욱이, 공기-환기된 엔지니어링된 폐에서의 계면활성 단백질 C의 발현 감소가 관찰되었으며, 이는 도 40에 예시된 바와 같다 ('ALI' 레인을 배지로 환기된 ('Vent') 그리고 관류된 ('Perf') 폐와 비교하라). 이는 또한 제II형 상피의 제I형 상피로의 분화와 일치하였다. 게다가, 도 42에 예시된 바와 같이 다수의 섬모형 상피 세포의 성장이 관찰되었다. 이는 공기 계면의 도입의 결과일 가능성이 있다. 기도 상피를 시험관내에서 배양할 때, 액체로부터 공기 계면으로의 세포의 천이가 섬모 발현을 유도하였다 (문헌[You et al., 2002, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 283:L1315-21]; [Davidson et al., 2004, J Cyst Fibros 3 Suppl 2:59-62]). 더욱이, 공기-액체 계면의 결여에 의해 섬모 형성이 감소될 수 있다 (문헌[Ostrowski et al., 1995, Exp Lung Res 21:957-70]; [Yeh et al., 2007, Laryngoscope 117:1439-44]). 따라서, 일부 예에서, 공기 계면은 시험관내에서의 폐 조직의 재생에 대하여 중요한 영향을 미친다.

엔지니어링된 폐 조직에서의 상피 구조의 발달에 대한 관류 및 환기의 영향

관류 및 환기는 생물반응기에서의 폐 조직의 배양에 대하여 상당한 영향을 미칠 수 있다. 또한 환기는 제I형 및 제II형 허파세포의 분화를 포함하여 폐 상피 발달에 상당한 영향을 미친다 (문헌[Inanlou et al., 2005, Histol Histopathol 20:1261-6]; [Inanlou et al., 2005, Dev Dyn 233:772-82]; [Inanlou et al., 2005, Dev Dyn 232:43-54]). 그 결과, 생물반응기에서의 8일간의 배양 동안 엔지니어링 폐 발달에 대한 관류 및 환기의 영향을 비교하였다. 이들 실험에 있어서, 조건은 다른 곳에 논의된 검증 실험 동안 이용한 것과 동일하였으며, DMEM+10% FBS 배양 배지, 비코팅된 스캐폴드, 및 분류되지 않은 신생체 폐 세포 집단을 이용하였다. 그러나, 배양물은 2 ml/min으로 혈관계를 통하여 관류시키거나, 1회 호흡/min으로 배지로 계속적으로 환기시켰다.

도 50에 예시된 바와 같이, 상피 구조를 형성하는 세포 중 다수가 CCSP에 대하여 양성으로 염색되었다. 환기된 배양물에 있어서 CCSP에 대한 염색이 관찰되었지만, 세포는 더욱 평평한 형태를 달성하였다. 이는 CCSP-발현 세포가 폐포 상피 (제I형 또는 제II형 허파세포) 쪽으로 분화되는 것을 환기가 유도하고 있음을 나타낼 수 있다.

환기의 부재 하에서는, 발달 중인 상피 구조의 내강이 호산성이고, 그에 따라 단백질성일 가능성이 있는 물질로 충전되었으며, 상기 물질은 도 43에서 H&E 염색에서 보였다. 도 45에서 보는 바와 같이, 이 물질은 또한 CCSP에 대하여 양성으로 염색되었다. CCSP의 이러한 증가는 이들 상피 구조를 라이닝하는 클라라 세포가 CCSP를 생성하고 있음을 나타낸다. 게다가, 환기에 의한 이 물질의 제거는 기도 트리가 여전히 온전하며 유체를 운반할 수 있음을 나타내며, 더욱이 이는 이들 발달 중인 상피 구조가 기도 트리의 일부분이며 매트릭스 내에서 랜덤하게 증식하는 것은 아님을 시사한다.

관류 대 환기는 도 46에 예시된 바와 같이 SPC의 발현에 대하여 상당한 영향을 미치는 것은 아니었다. 대다수의 세포는 환기 조건 및 관류 조건 둘 모두 하에서 SPC에 대하여 양성이었다.

실시예 5: 엔지니어링된 폐 조직에서의 내피의 발달

하기 실험은 탈세포화 스캐폴드가 엔지니어링된 폐 내피의 성장을 지지할 수 있는지를 결정하기 위하여 그리고 엔지니어링된 내피의 발달에 대한 몇몇 특정 인자의 영향을 평가하기 위하여 디자인하였으며, 이때 혈관 구획과 기도 구획 사이의 기능성 내피 장벽의 형성에 영향을 주는 이들 인자의 능력에 초점을 맞추었다.

이제 이들 실험에서 이용한 재료 및 방법을 설명한다.

재료 및 방법

스캐폴드 제조

탈세포화 스캐폴드를 본원의 다른 곳에 기술한 바와 같이 제조하였다.

신생체 세포 단리 및 접종

신생 래트 폐 세포를 본원의 다른 곳에 기술한 바와 같이 단리하였다. 본원의 다른 곳에 기술한 바와 같이 세포를 스캐폴드 내로 접종하였다.

내피 세포 배양

래트 폐 미세혈관 내피 세포를 브이이씨 테크놀로지즈 (VEC Technologies, 미국 뉴욕주 렌슬리어)로부터 획득하고, 10% FBS 및 보충 성장 인자를 포함하는 MCDB-131 완전 배지 (브이이씨 테크놀로지즈)에서 피브로넥틴-코팅 (대략 1 ㎍/cm², 깁코) 조직 배양 용기에서 성장시켰다.

엔지니어링된 내피의 배양에 있어서의 최적화 조건

스캐폴드를 1 mg의 피브로넥틴 (깁코)으로 코팅하고, 37℃에서 60 ml의 PBS에서 혈관계를 통하여 관류시키고, 그 후 PBS 및 배지로 헹구었다. 각각의 스캐폴드를 각각의 시점에서 800만-1000만개의 래트 폐 미세혈관 EC를 이용하여 배양 0일 및 2일 또는 3일에 2회 접종하였다 (두 접종 각각에 있어서 폐 당 2개의 T150 배양 플라스크를 사용함). 세포를 0.25% 트립신 (깁코)을 이용하여 조직 배양 플레이트로부터 트립신 처리하고, 40 ㎛ 필터를 통하여 여과하여 세포 응집물을 제거하고, 대략 3 ml의 배지 중 단회 볼루스 주입물로서 폐동맥 내에 주입하였다. 1시간 동안 세포를 유착시킨 후, 혈관계를 통하여 대략 1.5 ml/min으로 관류를 시작하였다. 1-2시간 후, 관류 속도를 7-10일의 배양 기간의 나머지 동안 3 ml/min으로 증가시켰다. 배지를 매 3-4일마다 교환하였다.

면역형광

본원의 다른 곳에 기술한 바와 같이 조직 샘플을 제조하고 염색하였다.

투과 전자 현미경법 ( TEM )

본원의 다른 곳에 기술한 바와 같이 샘플을 제조하고 분석하였다.

미립자 보유

큰 거대분자와 유사한 크기를 갖는 더욱 작은 입자에 대한 전체 래트 폐의 투과성을 평가하기 위하여 분석법을 개발하였다. 이 분석법에서, 기도-혈관 장벽을 가로질러 FITC-표지 덱스트란 용액이 누출되는 것을 정량화하였다. 분자량이 2,000,000 Da인 FITC-표지 덱스트란을 시그마 (미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 획득하였다. 분석 검증은 천연 폐, 및 0.025% 트립신으로 2 min 동안 처리한 천연 폐의 투과성을 측정함으로써 수행하였다. 폐를 헤파린 처리 PBS로 관류시키고, 일반적인 생물반응기 캐뉼러에 연결시켰다. 기저선 세척 샘플을 얻고, 그 후 트립신-처리 폐를 PBS 중 0.025% 트립신 10 ml로 관류시키고, 실온에서 2 min 동안 두고, 그 후 10 ml의 PBS로 헹구었다. FITC-표지 덱스트란 용액 (1 mg/ml)을 폐동맥 내로 주입하고, 그 후 20 ml의 PBS로 플러싱하였다. 그 후 두 세척 샘플을 기관으로부터 연속적으로 즉시 취하였다. 형광 플레이트 판독기를 사용하여 형광을 측정하고 데이터를 표준 곡선에 맞추었다. 탈세포화 또는 엔지니어링 폐에서 수행할 때, 이 분석은 미소구체 분석 (섹션 3.2.9 참조)에서와 같이 기도를 통하여 수행하였다. 따라서, FITC-덱스트란을 기도 내로 주입하고, 혈관계를 PBS로 플러싱하였다.

이제 실험 결과를 설명한다.

세포 공급원: 구매한 래트 폐 미세혈관 EC 공급원을 이용하였다. 이들 세포를 피브로넥틴-코팅된 스캐폴드 내에 접종하고 EC-특이적 배지의 존재 하에 배양할 때, 내피 세포의 상당한 성장이 관찰되었으며, 이는 도 47에 예시된 바와 같다.

내피 스크리닝 실험의 개요: 본원의 다른 곳에 논의된 스크리닝 실험에 의해 엔지니어링 내피 배양물과 양립가능한 조건 세트를 확인하였다. 결과는 주로 세포 생육성 및 PECAM의 발현에 있어서 조직학적 분석을 통하여 면역형광에 대하여 평가하였다. 이들 시험 연구 (pilot study)의 결과는, 엔지니어링된 폐 내피에 대한 별개의 조건들의 영향을 조직적으로 평가할 수 있도록, 스캐폴드 내부에서의 내피 세포 성장을 가능하게 하는 조건의 세트였다.

엔지니어링된 내피의 배양에 적합한 것으로 확인된 조건은 EC-특이적 배지 (10% FBS 및 보충 성장 인자를 포함하는 MCDB-131)를 사용하는 것; 피브로넥틴-코팅된 스캐폴드; 및 래트 폐 미세혈관 EC의 정제되고 시험관내에서 확장된 집단을 사용하는 것이었다.

FITC - 덱스트란 투과성 분석의 검증

큰 거대분자와 유사한 크기를 갖는 작은 입자에 대한 전체 래트 폐의 투과성을 평가하는 분석법을 개발하였다. 이 분석법에서, 기도-혈관 장벽을 가로질러 FITC-표지 덱스트란 용액이 누출되는 것을 정량화하였다. 이 분석법은 배양 코스에 걸쳐 반복적으로 사용할 수 있으며, 세포 배양에 친화적인 재료를 포함하고, 전체 폐의 투과성의 측정을 제공한다. 게다가, 이 분석을 고정 직전에 수행할 경우, FITC-덱스트란은 항-FITC 항체를 이용하여 조직 섹션에서 확인할 수 있다.

FITC-표지 덱스트란의 분자량은 2,000,000 Da이다. 단일 분산 덱스트란에 있어서, 스톡스-아인슈타인 (Stokes-Einstein) 반경 (nm)은 rs = 0.0488(MW)0.437에 의해 분자량에 관련된다 (문헌[Venturoli et al., 2005, Am J Physiol Renal Physiol 288:F605-13]; [Oliver et al., 1992, J Am Soc Nephrol 3:214-28]). 2 MDa의 덱스트란에 있어서, 이는 27.7 nm의 반경을 생성한다. 천연 폐, 및 묽은 트립신으로 혈관계를 단시간 관류시킴으로써 '누출성'으로 만든 천연 폐의 투과성을 평가함으로써 이 분석을 검증하였다. FITC-표지 덱스트란 용액을 폐동맥 내에 주입하고, 그 후 염수로 플러싱하였다. 그 후 두 세척 샘플을 기관으로부터 연속적으로 즉각적으로 취하였다. 도 48에 예시된 바와 같이, 기저막에의 내피 부착의 파괴로 인하여 기대되는 바와 같이 트립신 처리에 의해 폐 투과성이 증가하였다. 그러나, 이 분석을 통해서는 심지어 천연 폐도 측정가능한 누출을 제공하였다. 혈관 투과성의 이러한 열화는 폐 조직의 취급뿐만 아니라 덱스트란 주입과 동물 희생 사이의 지연의 결과이다.

탈세포화 또는 엔지니어링 폐에서 수행할 때, 이 분석은 미소구체 분석에서와 같이 기도를 통하여 수행하였다. 따라서, FITC-덱스트란을 기도 내로 주입하고, 혈관계를 염수로 플러싱하였다. 혈관 구획 내로 전좌된 덱스트란을 누출로서 측정하였다. 이 분석은 탈세포화 또는 엔지니어링 폐에서 조직이 유체에 대하여 고도로 투과성이고 리턴 (return) 샘플은 기도 세척 후 얻어질 수 없기 때문에 이러한 방식으로 수행하였다. 그와 같이, 덱스트란을 단회 볼루스 세척물로서 기도 내로 주입하였으며, 혈관계를 플러싱하여 기도-혈관 장벽을 가로지르는 FITC-덱스트란 누출을 측정하였다.

엔지니어링된 폐 내피에 대한 관류의 영향 대 환기의 영향

엔지니어링된 내피 조직의 발달에 대한 특정 조건의 영향을 평가하기 위하여 하기 실험을 디자인하였으며, 이때 기능성 내피 장벽의 형성에 초점을 맞추었다. 관류 대 환기에 의한 엔지니어링 폐 내피의 배양의 영향을 비교하였다. 내피 세포 생존 및 증식과 세포-세포 이음부의 형성과 관련하여 환기 및 관류 둘 모두를 투과 EM을 이용하여 평가하였다.

도 48에서 조직학적 분석에서 예시된 바와 같이 관류는 엔지니어링된 폐 내피의 성장을 실질적으로 향상시킴이 관찰되었다. 게다가, 도 49에 예시된 바와 같이 그리고 H&E 조직학적 분석에서의 그의 불량한 출현과 일치하여, 더욱 많은 아폽토시스성 세포가 환기에 의해 관찰되었다.

게다가, 관류된 배양물 및 환기된 배양물을 투과 EM 및 VE-카드헤린 염색을 이용하여 세포 이음부의 존재에 대하여 분석하였다. 내피 세포들 사이의 치밀 이음부는 중요한 장벽 기능 수단이며, 그 이유는 상기 치밀 이음부가 인접 세포들을 함께 치밀하게 연결하고 따라서 이들 세포주위 공간들 사이에서의 유체의 이동을 저해하기 때문이다 (문헌[Majno et al., 1961, J Biophys Biochem Cytol. 11:571-605]). 이들 세포 이음부가 약하거나 없을 경우, 유체 누출이 혈관계 밖으로 일어나서 폐부종을 야기할 수 있다 (문헌[Orfanos et al., 2004, Intensive Care Med 30:1702-14]; [Maniatis et al., 2008, Vascular Pharmacology 49:119-33]).

TEM을 이용하면, 관류된 엔지니어링 조직 내의 세포-세포 이음부가 관찰되었으며, 이는 도 50에 예시된 바와 같다. 모든 세포가 치밀 이음부 형성을 보인 것은 아니었다.

세포 이음부 형성은 VE-카드헤린에 대한 면역형광을 이용하여 평가하였다. 도 51에 예시된 바와 같이, VE-카드헤린에 대한 강한 염색이 관류된 엔지니어링 폐 내피에서 발견되었다. 환기된 조직은 조직학적 분석 및 TEM에서 그의 불량한 출현으로 인하여 VE-카드헤린에 대하여 염색되지 않았다.

엔지니어링된 폐 내피의 장벽 기능의 평가

혈관상 (vascular bed)과 기적 사이의 기능성 장벽을 형성하는 엔지니어링된 폐 내피의 능력을 평가하기 위하여 하기 실험을 디자인하였다. 이는 폐포 내로의 유체 누출을 감소시키고 그에 따라 가스 교환을 가능하게 하는 데 중요하며, 이는 엔지니어링된 폐 조직을 위한 물체의 주요 구성요소이다. 폐 내피에 의해 제공되는 장벽 기능을 평가하기 위하여, 투과성 분석법을 이용하여 기적으로부터의 혈관계 내로의 작은 (55 nm) FITC-덱스트란 입자의 전좌를 측정하였다. 이 분석법을 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 개발 및 검증하였다.

이 분석법에 있어서, FITC-덱스트란을 기도 구획 내에 주입하고, 폐포-혈관 장백을 가로질러 누출된 양을 염수를 이용한 혈관계의 플러싱에 의해 측정하였다. 탈세포화 스캐폴드에 있어서, 그러한 작은 입자에 대한 장벽 기능이 본질적으로 없었으며, 이때 실질적으로 모든 (98.4%) 덱스트란이 폐포에서 혈관계 내로 전좌하였으며 혈관 헹굼에 의해 회수되었다. 이를 천연 폐와 비교하였으며, 상기 천연 폐는 유사하게 처리될 때 12.9%의 누출을 나타내었다 (도 52).

관류한 엔지니어링된 폐 내피 조직에서, 기도 구획에서의 최대 30%의 덱스트란의 보유가 7-10일의 배양 기간 후 입증되었다. 환기된 내피 조직은 87%의 투과성을 보여주었다.

관류된 엔지니어링된 폐 내피에 대한 이들 발견은, 특히 면역형광을 통한 강한 VE-카드헤린 발현 (도 51) 및 TEM을 통한 세포-세포 이음부 형성의 발견과 커플링될 때, 엔지니어링된 내피 조직에서 기능성 내피 장벽의 형성이 일어났음을 나타낸다.

도 63은 엔지니어링된 조직의 극한 인장 강도를 예시하는 차트이다. 천연 폐 및 탈세포화 폐의 강도가 또한 예시되어 있다. 이 도면은 엔지니어링된 조직의 극한 인장 응력이 천연 폐 및 탈세포화 매트릭스 둘 모두에 비견됨을 예시한다. 따라서, 조직 엔지니어링된 폐의 기계적 특성은 재세포화 과정 후 유지된다.

실시예 6: 폐 세포 요법

본원에 제시한 결과는 탈세포화 폐 조직을 이용하여 포유류에서 폐 세포 요법을 행하는 것을 입증한다. 일반적으로, 본 단계는 기관의 탈세포화, 탈세포화 기관 조직 내에서의 세포외 매트릭스 성분의 검출, 탈세포화 기관 매트릭스 상에서의 인간 기관지 (큰 기도) 및 작은 기도 폐 상피 세포의 배양, 요망되는 유전자를 포함하는 인간 폐 상피 세포의 유전자 요법, 및 점적 주입을 통한 폐 내로의 인간 폐 상피 세포의 점적 주입을 포함하며, 이때 수용자 폐에서 세포 부착 및 생존을 검증하였다.

기관의 탈세포화

돼지 기관을 수확하고, PBS에서 헹구어 혈액을 제거하였다. 조각을 절단하고, 10% 중성-완충 포르말린으로 고정하고, 파라핀 내에 매립하고, 5 mm 섹션으로 절단하였다. 나머지를 5개의 링으로 절단하고, 교반하면서 2-24시간 동안 CHAPS 완충액 (pH 13.5) 중에서 인큐베이션하였으며, 이때 CHAPS 완충액은 2시간, 4시간 및 8시간 시점에 교환하였다. 나타낸 시점에서, 조직을 CHAPS 완충액으로부터 꺼내고, PBS로 헹구었다. 조각을 절단하고, 10% 포르말린으로 고정하고, 조직학적 분석을 위하여 프로세싱하여 탈세포화를 확인하였다.

CHAPS 완충액 중에서 4-8시간 동안 인큐베이션하여 제조한 탈세포화 기관은 콜라겐 매트릭스를 유지하였으며 (연골층을 제외하고는) 조직으로부터 제거한 세포들 중 대부분을 가졌음이 관찰되었다. 도 55를 참조하라. 하기 실험은 탈세포화 기관의 제조에 있어서 교반하면서 6시간 동안 CHAPS에서 인큐베이션하는 것을 기반으로 하였다.

이들 실험은 탈세포화 전 및 후 기관에서 세포외 매트릭스를 검출하기 위하여 디자인하였다. 간략하게는, 조직 조각을 천연 및 탈세포화 기관으로부터 절단하고, 10% 포르말린으로 고정하였다. 5 ㎛ 파라핀-매립 섹션을 H&E 및 메이슨 3색 염색법으로 염색하였다. 또한 파라핀-매립된 섹션을 콜라겐 (COL), 파이브로넥틴 (FN) 및 라미닌 (LN)을 포함하여 세포외 매트릭스 단백질에 대하여 면역염색하였다. 섹션들을 탈파라핀화하고, 재수화하고, 항원을 회수하고 (프로테이나제 K를 사용), 차단시켰다. 자체적으로 유도한 토끼 항-인간 FN, COL I, COL III, COL IV, COL V 또는 LN 항체를 섹션에 적용하고, 이어서 알렉사 플루오르 546-콘쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG를 적용하였다. 슬라이드를 DAPI로 대조염색하였다. 천연 기관은 COL I, COL III, COL V에 대해서는 양성으로 염색되었지만, 다른 ECM 단백질에 대해서는 그렇지 않음이 관찰되었다. 탈세포화 기관은 천연 기관에서 보이는 모든 3가지 유형의 COL을 포함하였다. 도 56을 참조하라. 이들 결과는 탈세포화 기관 조직이 시험관내에서 기도 상피 세포의 유착, 성장 및 분화를 지지함을 시사한다.

탈세포화 기관 조직 상에서의 기도 상피 세포의 성장

다음 실험 세트는 탈세포화 조직 상에서 세포를 성장시키기 위하여 디자인하였다. 간략하게는, 인간 기관지/기관 상피 세포 (NHBE)를 기관지 상피 성장 배지 (bronchial epithelial growth medium, BEGM)에서 배양하였다. 탈세포화 기관 (6시간 동안의 CHAPS 완충액에서의 인큐베이션)을 살균 PBS로 광범위하게 (24시간 이상) 헹구었다. 연골층 (이 외에도, 외막층)을 벗겨내어 기관 점막 및 점막하 층을 후속 세포 접종을 위하여 남겨두었다. 조직을 약 5 x 5 cm²의 크기로 절단하고, 상피 표면이 위로 향하도록 하여 6웰 플레이트 내의 트렌스웰 인서트 (transwell insert) (0.4 ㎛의 기공 크기) 위에 두었다.

세포를 하기와 같이 탈세포화 기관 조직 상에 접종하였다. 50 ㎕의 세포 (3.5 x 10⁶개의 세포/ml)를 탈세포화 기관 조직의 상피 표면에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후 신선한 배양 배지를 트랜스웰 인서트의 상부 면 및 하부 면 둘 모두에 첨가하고, 세포를 추가의 시간 동안 인큐베이션하였다. 나타낸 시점에서, 조직을 트랜스웰로부터 꺼내고, 10% 포르말린으로 고정하였다. 파라핀-매립된 5 ㎛ 섹션을 H&E로 염색하였다. 탈세포화 기관은 NHBE 유착 및 성장을 지지함이 관찰되었다. 도 57을 참조하라.

다음 실험 세트는 탈세포화 조직 상에서, 트랜스진으로 형질감염된 인간의 작은 기도 상피 세포 (small airway epithelial cell, SAEC)를 성장시키기 위하여 디자인하였다. 간략하게는, 인간 SAEC를 GFP 레트로바이러스로 6시간 동안 형질감염시켰다. 세포를 하기와 같이 6웰 플레이트 내의 탈세포화 기관 조직 상에 접종하였다. 50 ㎕의 세포 (5 x 10⁶개의 세포/ml)를 탈세포화 기관 조직 (약 0.5 x 1.0 cm²)의 상피 표면에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후 신선한 배양 배지를 첨가하고, 세포를 추가의 시간 동안 인큐베이션하였다. 탈세포화 기관은 SAEC 유착 및 성장을 또한 지지함이 관찰되었다. 도 58을 참조하라. 게다가, 탈세포화 기관은 관심있는 유전자로 형질감염된 인간 폐 상피 세포의 배양의 원리 증명으로서, GFP로 형질감염된 SAEC의 유착 및 성장을 지지하였다.

기도 상피 세포의 유전자 요법

다음 실험 세트는 폐 세포에 있어서 유전자 요법용 탈세포화 조직 이용의 실현 가능성을 결정하기 위하여 디자인하였다. 유전자 변형을 하기와 같이 수행하였다. EGFP (증강된 GFP) 레트로바이러스 상청액을 피닉스 (Phoenix) 패키징 세포주를 사용하여 제조하였다. EGFP DNA를 LZRSpBMN 벡터 내에 삽입하였다. NHBE 및 SAEC를 80% 초과의 융합도가 될 때까지 성장시켰다. 감염일에 세포를 수회 헹구고, 바이러스 상청액 (8 ㎍/ml의 폴리브렌을 포함함)을 37℃에서 6시간 동안 접종하였다. 세포를 수회 헹구고, 신선한 배지에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 그 후 세포를 유세포 분석법을 이용하여 GFP에 대하여 분석하였다. 감염된 세포는 GFP에 대하여 양성으로 염색됨이 관찰되었다. 예를 들어, NHBE 세포는 비-감염 세포와 비교하여 GFP에 대하여 18.5%의 양성 염색을 나타냈다. SAEC 세포는 비-감염 세포와 비교하여 GFP에 대하여 16%의 양성 염색을 나타냈다. 본원에 제시한 결과는 레트로바이러스를 사용하여, 이 배양 시스템에서 관심있는 유전자로 인간 폐 상피 세포를 감염시키는 능력을 입증하였다. 그러나 트랜스진의 다른 전달 방법이 본 발명에 또한 포함된다. 예를 들어, 다음 실험 세트는 렌티바이러스 시스템 사용의 실현 가능성을 시험하기 위하여 디자인하였다.

GFP 렌티바이러스에 의한 감염을 하기와 같이 수행하였다. EGFP 렌티바이러스 상청액을 무혈청 배지에서 293T 세포에서 제조하였다. GFP DNA를 CMV 프로모터를 포함하는 pSicoR 벡터 내에 삽입하였다. NHBE를 6웰 플레이트 상에 1 x 10⁵개의 세포/웰로 접종하고, 37℃에서 1일 동안 인큐베이션하였다 (80-90%의 융합도). 감염일에, 세포를 수회 헹구고, 그 후 37℃에서 6시간 동안 바이러스 상청액 (신선한 BEGM으로 1:3으로 희석) (8 ㎍/ml의 폴리브렌을 포함함)을 접종하였다. 세포를 수회 헹구고, 그 후 추가로 2일 동안 신선한 배지를 이용하여 인큐베이션하였다. 세포를 4% 파라포름알데히드로 30분 동안 고정하고, 현미경에 의해 조사하였다. 도 59를 참조하라. 그 결과가 표 2에 요약되어 있다.

본원에 제시한 결과는 GFP 렌티바이러스로 감염시킨 NHBE가 6시간 후 명백한 형태 변화를 나타내지 않음을 입증하였다. 6시간 동안의 1회 감염은 유세포 분석법에 의해 평가할 때 50% 초과의 GFP 양성 세포를 생성하였다. SAEC에 있어서의 감염 효율도 50% 초과인 것으로 보였다. 본원에 제시한 결과는 임의의 요망되는 유전자를 사용하여 유전자 변형된 폐 세포를 생성할 수 있음을 입증하였다.

마우스 폐 내로의 기도 상피 세포의 주입

다음 실험은 포유류 폐 내로의 기도 상피 세포의 주입의 실현 가능성을 결정하기 위하여 디자인하였다. 간략하게는, 5 ㎛ 미소구체와 PBS의 1:1 혼합물 100 ㎕를 대략 10주령의 암컷 C57BL/6J 마우스 (잭슨 랩 (Jackson Lab)) 내로 기관을 통하여 주입하였다. 마우스는 주입 후 수분 동안 생존하였다. 폐를 즉각적으로 수확하고, 포르말린으로 고정시켰다. 5 ㎛ 파라핀-매립 섹션을 H&E로 염색하였다. 이 연구는 기도 내로 점적 주입에 의해 전달된 세포 크기의 입자가 포유류 폐 내에서 검출되는지를 결정하기 위하여 초기 실현가능성 연구로서 행하였다. 미소구체를 주입한 마우스 폐의 H&E 이미지로부터의 결과는 상당한 수의 미소구체가 마우스 폐의 모든 폐엽에 존재함을 입증하였다. 도 60을 참조하라. 그 결과는 기관 접근법을 사용한 주입이 세포 점적 주입에 있어서 작용함을 입증하였다.

다음 실험 세트는 외식된 마우스 폐 내로 GFP 표지 세포를 주입하는 것을 포함하였다. 간략하게는, 세포를 GFP 레트로바이러스로 6시간 동안 감염시켰다. C57BL/6J 마우스를 안락사시키고, 기관을 노출시키고, 근위 말단을 봉합사로 묶었다. 100 ㎕의 GFP 레트로바이러스-감염 SAEC를 기관을 통하여 (이어서 200 ㎕의 공기를 세포 내로 밀어넣음) 마우스의 폐 내로 주입하였다. 기관의 원위 말단을 묶었다. 폐를 외식하고, 10% 포르말린으로 즉각적으로 고정하였다. 5 ㎛ 파라핀-매립 섹션을 탈파라핀화하고, 재수화하고, 항원을 회수하고 (pH 6의 10 mM 시트르산 완충액을 사용), (트리톤 X를) 투과시키고, 차단하였다. 토끼 다클론 항-GFP 항체 (아브캄 (Abcam)제)를 섹션에 적용하고, 이어서 알렉사 플루오르 555-콘쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG를 적용하였다. 슬라이드를 DAPI로 대조염색하였다. GFP 양성 세포가 외식된 폐에서 발견됨이 관찰되었다. 도 61을 참조하라. 본원에 제시한 결과는 폐 내로의 세포의 성공적인 주입을 입증하며, 트랜스진 (GFP)을 형질도입한 인간 상피 세포가 폐 상피에 유착되었음을 입증하였다.

다음 실험 세트는 GFP-표지 세포를 마우스 폐 내로 주입하는 것의 실현 가능성을 결정하기 위하여 디자인하였다. 간략하게는, 마우스 (C57BL/6J, 암컷, 대략 10주령)를 마취시키고, 기관을 노출시켰다. 100 ㎕의 GFP 레트로바이러스 감염 인간 기도 상피 세포를 기관을 통하여 폐 내로 주입하였다 (이어서 200 ㎕ 공기). 도 62를 참조하라. 마우스를 6시간 내지 3일 동안 회복시켰다. 수확일에, 폐를 폐동맥을 통하여 PBS로 관류하여 혈액을 제거하고, 그 후 기관을 통하여 10% 포르말린으로 관류하고, 해부하였다. 수확한 폐를 추가로 4시간 동안 포르말린에서 고정하였다. 본원의 다른 곳에 논의된 바와 같이 5 ㎛ 파라핀-매립 섹션을 GFP에 대하여 염색하였다. GFP 양성 인간 기도 상피 세포 (NHBE 및 SAEC 둘 모두)는 기도 내로의 점적 주입 후 수일 동안 마우스 폐에서 발견됨이 관찰되었다. 도 63을 참조하라. 이는 배양물 형태로 성장시키고 관심있는 트랜스진을 형질도입한 인간 상피 세포가 수용 포유류의 폐 내로 전달되고 수용 폐에 유착하여 생존 및 증식할 수 있음을 보여준다.

실시예 7: 탈세포화 엔지니어링 폐의 임플란트

이 실험은 탈세포화 엔지니어링 폐를 살아있는 래트 수용자 내로 임플란트하는 것의 실현 가능성을 보여주기 위하여 디자인하였다. 탈세포화 엔지니어링 래트 폐를 이전의 실시예에 따라 제조하였다. 성체 수컷 실험실 래트를 케타민 및 자일라진의 복강내 주사에 의해 마취시켰다. 그 후 래트의 기관에 삽관 처리를 하고, 이를 포란과 혼합된 100% 산소를 이용하여 환기시켜 마취를 유지하였다. 살균 조건 하에서, 정중 흉골 절개술을 통하여 흉부를 개방시켰다. 늑골을 양방향으로 집어넣어, 정상적으로 팽창된 폐 및 박동성 심장이 보이게 하였다. 전체적 헤파린 처리 후, 천연 좌측 폐를 전부 절개했다. 그 후, 탈세포화 엔지니어링 폐를 수술용 현미경 하에서 10-0 봉합사를 이용하여 수용자의 폐동맥, 폐정맥, 및 좌측 주기관지에 문합시켰다.

폐동맥 및 폐정맥 상의 혈관 클램프의 제거 후, 혈액이 정상적인 방식으로 엔지니어링 폐를 관류하는 것으로 보였다. 게다가, 임플란트된 엔지니어링 폐는 존재하는 천연 우측 폐와 유사하게 팽창 및 수축을 통하여 용이하게 환기되고 사이클링되었다. 도 64는 환기 사이클 동안 팽창 및 수축에서의 임플란트된 엔지니어링 폐의 사진을 예시한다. 따라서, 본 발명의 기술을 이용하여 생성한 엔지니어링된 폐는 포유류 내로 임플란트가능하며, 기도의 용이한 환기 및 전체 장기를 통한 관류를 가능하게 한다는 견지에서 기능성이다. 전체 임플란트 기간 동안, 임플란트된 엔지니어링 폐로부터의 출혈 또는 공기 누출의 증거는 없었다.

본원에 인용된 각각의 및 모든 특허, 특허 출원 및 간행물의 개시 내용은 그의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.

본 발명을 특정 실시양태를 참고로 하여 개시하였지만, 본 발명의 다른 실시양태 및 변화가 본 발명의 실제 사상 및 범주로부터 벗어나지 않고서 당업계의 숙련자에 의해 고안될 수 있음이 명백하다. 첨부된 특허청구범위는 모든 그러한 실시양태 및 등가의 변화를 포함하는 것으로 파악하고자 한다.

Claims (39)

1. 탈세포화 전의 상응하는 천연 조직의 특징을 나타내는, 세포 성장을 지지하할 수 있는 탈세포화 (decellularized) 조직.
2. 제1항에 있어서, 폐인 탈세포화 조직.
3. 제1항에 있어서, 탈세포화 전의 동일 조직의 것과 실질적으로 유사한 형태를 나타내는 탈세포화 조직.
4. 제1항에 있어서, 상기 상응하는 천연 조직의 세포외 매트릭스를 보유하며, 여기서 상기 세포외 매트릭스가 실질적으로 온전한 외부 표면을 포함하는 것인 탈세포화 조직.
5. 제1항에 있어서, 면역원성 마커가 실질적으로 제거된 탈세포화 조직.
6. 제1항에 있어서, 상기 상응하는 천연 조직의 기계적 특성과 실질적으로 유사한 기계적 특성을 나타내는 탈세포화 조직.
7. 폐 세포의 분화 상태를 지지 및 유지할 수 있는, 3차원 스캐폴드 (scaffold) 및 세포의 집단을 함유하는 조성물.
8. 제7항에 있어서, 상기 3차원 스캐폴드가 탈세포화 조직인 조성물.
9. 제7항에 있어서, 온전한 기도 트리 (tree) 및 혈관 네트워크를 나타내는 조성물.
10. 제7항에 있어서, 상기 집단이 줄기 세포를 포함하는 것인 조성물.
11. 제7항에 있어서, 상기 집단이 상피 세포 및 내피 세포를 포함하는 것인 조성물.
12. 제7항에 있어서, 상기 세포가 유전자 변형된 것인 조성물.
13. 제7항에 있어서, 폐포 상피 세포의 분화 상태를 지지 및 유지할 수 있는 조성물.
14. 제7항에 있어서, 상기 스캐폴드가 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 당단백질, 트롬보스폰딘, 엘라스틴, 피브릴린, 뮤코폴리사카라이드, 당지질, 헤파린 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 케라틴 술페이트, 글리코사미노글리칸, 히알루론산, 프로테오글리칸, 비트로넥틴, 폴리-D-리신, 폴리사카라이드 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 생체적합성 물질을 포함하는 것인 조성물.
15. 제7항에 있어서, 분지 형태형성의 유도와 관련된 유전자 발현을 나타내는 세포를 함유하는 조성물.
16. 제7항에 있어서, 상기 유전자가 CFTR인 조성물.
17. 제7항에 있어서, 분지 형태형성, 원위 폐 상피 세포분화, 상피 성장, 혈관 발생 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 폐 조직의 특징을 포함하는 조성물.
18. 탈세포화 스캐폴드에 세포 집단을 접종하여 접종된 스캐폴드를 생성하는 단계를 포함하는, 폐 세포의 분화 상태를 지지 및 유지할 수 있는 엔지니어링된 3차원 조직을 제조하는 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 탈세포화 스캐폴드가 온전한 기도 트리 및 혈관 네트워크를 나타내는 것인 방법.
20. 제18항에 있어서, 상기 집단이 줄기 세포를 포함하는 것인 방법.
21. 제18항에 있어서, 상기 집단이 상피 세포 및 내피 세포를 포함하는 것인 방법.
22. 제18항에 있어서, 상기 세포가 유전자 변형된 것인 방법.
23. 제18항에 있어서, 상기 탈세포화 스캐폴드가 폐포 상피 세포의 분화 상태를 지지 및 유지할 수 있는 것인 방법.
24. 제18항에 있어서, 상기 스캐폴드가 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 당단백질, 트롬보스폰딘, 엘라스틴, 피브릴린, 뮤코폴리사카라이드, 당지질, 헤파린 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 케라틴 술페이트, 글리코사미노글리칸, 히알루론산, 프로테오글리칸, 비트로넥틴, 폴리-D-리신, 폴리사카라이드 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 생체적합성 물질을 포함하는 것인 방법.
25. 제18항에 있어서, 분지 형태형성의 유도와 관련된 유전자 발현을 나타내는 세포를 포함하는 방법.
26. 제18항에 있어서, 상기 유전자가 CFTR인 방법.
27. 제18항에 있어서, 상기 엔지니어링된 3차원 조직이 분지 형태형성, 원위 폐 상피 세포분화, 상피 성장, 혈관 발생 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 폐 조직의 특징을 나타내는 것인 방법.
28. 시험 작용제 (agent)를 엔지니어링된 3차원 폐 조직 모델과 접촉시키는 단계 및 상기 시험 작용제가 상기 모델에 미치는 영향을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 모델에 대한 임의의 변경은 상기 시험 작용제가 폐 조직의 건강을 조정할 수 있음을 나타내는 것인, 시험 작용제가 폐 조직의 건강을 조정하는 능력에 대하여 상기 시험 작용제를 스크리닝하는 시험관내 방법.
29. 제28항에 있어서, 상기 엔지니어링된 3차원 조직이 탈세포화 스캐폴드로부터 유래된 것인 방법.
30. 제28항에 있어서, 시험 작용제가 화학적 작용제, 의약품, 펩티드, 핵산 및 방사선으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
31. 제28항에 있어서, 시험 작용제가 치료제용 전달 비히클인 방법.
32. 제28항에 있어서, 세포의 수, 면적, 부피, 형상, 형태, 마커 발현 또는 염색체 단편화에 대한 시험 작용제의 영향을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
33. 제28항에 있어서, 폐 조직 모델에 요망되는 영향을 미치는 작용제를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
34. 포유류에게 폐 세포의 분화 상태를 지지 및 유지할 수 있는 3차원 구축물을 포함하는 치료 유효량의 조성물을 투여함으로써 상기 포유류에서 폐 결손을 완화 또는 치료하는 단계를 포함하는, 포유류에서 폐 결손을 완화 또는 치료하는 방법.
35. 세포 성장을 지지할 수 있고 탈세포화 전의 상응하는 천연 조직의 특징을 나타내는 탈세포화 조직을 포함하는 임플란트가능한 조성물.
36. 제35항에 있어서, 세포 집단을 포함하며 폐 세포의 분화 상태를 지지 및 유지할 수 있는 조성물.
37. 제36항에 있어서, 상기 집단이 줄기 세포를 포함하는 것인 조성물.
38. 제36항에 있어서, 상기 집단이 상피 세포 및 내피 세포를 포함하는 것인 조성물.
39. 제36항에 있어서, 상기 세포가 유전자 변형된 것인 조성물.

Images