KR20110111712A

KR20110111712A - 메갈린을 표적으로 하는 체중 조절 장애 관련 질환의 진단, 예방 또는 치료 방법

Info

Publication number: KR20110111712A
Application number: KR1020100030934A
Authority: KR
Inventors: 김민선
Original assignee: 울산대학교 산학협력단
Priority date: 2010-04-05
Filing date: 2010-04-05
Publication date: 2011-10-12
Also published as: KR101441163B1

Abstract

메갈린은 시상하부 식욕 억제 신호 전달에 깊이 관여하므로, 메갈린 활성화제 또는 메갈린 발현 조절제를 함유한 약학조성물은 비만 또는 비만 관련 질환을 치료하거나 방지하는 데에 유용하게 사용될 수 있고, 메갈린 활성화제 또는 메갈린 발현 조절제를 렙틴 또는 클러스터린과 함께 투여함으로써 렙틴 또는 클러스터린의 식욕억제 효과를 증강시킬 수 있다. 반대로 메갈린 발현을 억제하는 화합물을 식욕감퇴 예방 및 치료에 사용할 수 있다.

Description

메갈린을 표적으로 하는 체중 조절 장애 관련 질환의 진단, 예방 또는 치료 방법{METHOD TARGETING MEGALIN FOR DIAGNOSIS, PREVENTION OR TREATMENT OF BODY WEIGHT DISORDERS}

본 발명은 메갈린 활성화제 또는 메갈린 발현 조절제 중 어느 하나의 약제와 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 비만 또는 비만 관련 질환 치료 또는 예방용 약학조성물; 및 메갈린 발현을 하향 조절하는 조절제와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 식욕부전증 및 악액질을 동반한 개체의 식욕감퇴 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

비만은 장기간에 걸쳐 에너지 섭취량이 에너지 소비량을 초과하여 잉여 에너지는 지방에 저장될 때 발생한다.

정상 상태에서 식욕은 말초에서 유래한 인자들에 의하여 조절을 받는데, 그 중 대표적인 것이 렙틴과 인슐린이다 (Schwartz 등, Nature, 404:661-671, 2000). 체중이 증가하면 혈중의 렙틴과 인슐린 농도가 증가하며, 섭식 중추인 시상하부에 작용하여 식욕을 억제하고, 에너지 소모를 촉진함으로써 증가한 체중을 원상 복귀하도록 한다.

에너지 균형을 조절하는 이러한 정상적인 피드백 시스템은 체중 증가를 예방하는 일종의 보호 기전이나, 비만증에서는 피드백 시스템이 적절하게 작용하지 않기 때문에 비만증이 악화되고 동반 질환을 야기하게 된다 (Kopelman 등, Nature, 404:635-643, 2000).

렙틴은 지방세포에 의해 분비되며, 시상하부에 작용하여 음식 섭식을 줄이고, 에너지 소비를 자극함으로써 체지방량을 감소시키는 작용을 가지는 가장 대표적인 호르몬이다 (Halaas 등, Science, 269:543-546, 1995). 렙틴 또는 렙틴 수용체의 결핍이 인간과 동물에서 심한 비만증과 과식증을 초래하므로 렙틴이 정상적인 식욕 및 체중 유지에 중요한 인자임이 입증되었다 (Montague 등, Nature, 387:903-908, 1997; Clement 등, Nature, 392:398-401, 1998).

그러나, 대부분 비만증을 가진 사람의 혈액에서 렙틴 농도가 증가되어 있어 렙틴의 부족 보다는 렙틴에 대한 저항성이 비만을 야기하는 원인 기전으로 제시되었다 (Maffei 등, Nat., Med., 1:1155-1161, 1995; Fredrich 등, Nat., Med., 1:1311-1314, 1995). 비만증에서 렙틴 감수성이 저하되는 기전으로, 섭식 중추인 시상하부 신경세포에서 렙틴의 신호 전달이 약해지거나, 중추신경계 내로 렙틴 수송의 감소가 제안되었으나, 자세한 분자 생물학적 기전은 아직 잘 밝혀져 있지 않다 (Halaas 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:8878-8883, 1997; Banks, Curr. Pharm. Des., 7:125-133, 2001).

메갈린은 저밀도 지단백-수용체(LRP) 패밀리에 속하는 수용체로서, 한 개의 세포막을 관통하는 부분과, 17개의 EGF 유사 도메인, 36개의 LDL 수용체 A형 타입 도메인, 37개의 LDL 수용체 B형 도메인 및 YWTD 도메인으로 구성된 세포외 부분, 그리고 3개의 NPxY modif를 가지는 세포내 부분으로 구성되어 있다. 메갈린의 발현은 유선 상피, 갑상샘의 소포세포, 눈 모양체, 소장 미세융모, 남성 생식로, 자궁, 수란관, 담낭, 폐, 신장(사구체, 근위세뇨관), 뇌실의 맥락총, 뇌 및 난황낭을 포함한 매우 다양한 성인 조직에서 발견된다.

본 발명자들은 일련의 연구를 통하여 메갈린이 섭식 조절 중추인 시상하부에서 발현이 되며, 대표적인 식욕 억제 호르몬인 렙틴의 세포 내 신호 전달을 매개하고, 렙틴의 식욕 감소 및 체중 감소 작용에 중요함을 알게 되었다. 이러한 연구 결과를 근거로 메갈린을 표적으로 하는 치료법을 체중 조절 장애 질환의 진단, 예방 및 치료에 이용하고자 한다.

따라서, 본 발명의 목적은 중추신경계의 메갈린 발현을 양적으로 증가시키는 메갈린 발현 조절제, 또는 메갈린에 결합하여 메갈린을 통한 신호전달을 강화시키는 메갈린 활성화제 중에서 선택된 어느 하나 이상의 약제와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 개체의 비만 또는 비만 관련 질환 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 치료적 유효량의 메갈린 활성화제 또는 메갈린 발현 조절제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 비만 또는 비만 관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법이 제공된다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 메갈린-인코딩 유전자와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 개체의 비만 또는 비만 관련 질환 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 메갈린 발현을 하향 조절하는 조절제와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 식욕 부전증 및 악액질을 동반한 개체의 식욕감퇴 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 메갈린 발현을 하향 조절하는 조절제를 치료적 유효량으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 식욕 부전증 및 악액질을 동반한 개체의 식욕부진을 예방하거나 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 비만 또는 비만 관련 질환을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에 임의의 화합물을 처리하는 단계; 및 메갈린의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 비만 또는 비만 관련 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비만 또는 비만 관련 질환을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 메갈린의 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및 상기 발현 프로파일을 정상대조군에서 메갈린의 발현 프로파일과 비교하여 비만 또는 비만 관련 질환 여부를 판정하는 단계를 포함하여 이루어지는 비만 또는 비만 관련 질환의 진단 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서는, LRP 패밀리 단백질 특히, 메갈린(LRP2)이 시상하부 렙틴 신호 전달에 관여한다는 사실을 최초로 증명하였다. 일차 배양한 사람의 신경세포에 렙틴을 처리하면 전통적인 렙틴수용체(Ob-Rb)와 메갈린이 세포막 표면에서 국재화(colocalization)되었다. 또한 LRP 패밀리 단백질과 리간드의 결합을 차단하는 작용을 가지는 수용체 관련 단백질(receptor associated protein:이하 RAP)를 렙틴 과 함께 투여할 경우 렙틴에 의하여 유도되는 섭식 및 체중 감소 작용과 시상하부 STAT3 활성화 작용이 차단되었다. 한편 마우스 메갈린의 발현을 특이적으로 차단하는 siRNA(small inhibitory RNA)를 섭식 중추인 시상하부에 주입하여 시상하부 메갈린 발현을 억제시키면 렙틴 및 클러스터린에 의하여 유도된 식욕 억제 작용과 STAT3 활성화가 차단되었다. 이러한 연구 결과는 메갈린이 시상하부에서 렙틴의 신호 전달과 섭식 조절 작용에 있어서 중요한 역할을 수행함을 시사한다. 따라서, 메갈린을 활성화하는 화합물을 투여함으로써 시상하부의 렙틴 신호전달 경로를 활성화시킴으로써 중추신경계의 렙틴저항성을 개선할 수 있다.

이하에서는 본 발명의 다양한 구현 예를 설명하기로 한다. 본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점들은 하기의 상세한 설명, 도면 및 특허청구 범위에 명료하게 제시된다. 본 명세서에 거론되는 모든 공보, 특허출원, 특허 및 기타 참조문헌은 본 발명에 전적으로 편입된다.

하기에 별도의 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 과학기술적 용어들은 통상의 당업자에게 자명한 것과 동일한 의미로 이해하기로 하며, 본 발명에 사용되는 기술들의 참조는 당업자에게 자명한 기술 또는 균등 기술의 치환에 관한 다양한 변형을 포함하는 것으로 이해하기로 한다. 다음 용어들이 통상의 당업자에게 이해될 수 있다면, 하기의 정의들을 사용하여 본 발명의 이해를 돕도록 사용하기로 한다.

본 발명은 비만과 식욕감퇴를 포함하는 체중 관련 질환을 치료 또는 예방하기 위하여 메갈린(LRP2)을 표적으로 하는 새로운 치료제 개발에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 “체중 관련 질환”은 비정상적인 체중, 예를 들어 체중이 정상 체중 보다 심하게 초과하거나 미달하는 질환을 의미한다. 즉, 체질량지수(BMI)가 18 미만 또는 25를 초과하는 개체는 비정상적인 체중을 지닌 것으로 판정할 수 있다. 체중 관련 질환의 예로는 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어 비만, 식욕감퇴, 악액질, 식욕 이상 항진증, 다낭성 난소 질환, 시상하부 증후군, 프래더 윌리 증후군, 프롤리히 증후군, 성장호르몬 결핍 환자, 터너 증후군 및 다른 비만 관련 질환을 들 수 있다.

본 발명에서 사용된 “비만(obesity)”은 골격 및 신체적인 요구 조건을 뛰어 넘는 체중 증가를 의미하며, 이는 신체에서 지방 조직의 과도한 축적의 결과이다. “비만(obesity)” 또는 “살찐(obese)”의 정량적 정의는 이상적인 체중보다 적어도 약 5% 초과한 개체이며, 이는 이상적인 체중의 적어도 약 10%, 15%, 20%, 30% 또는 그 이상 초과한 개체도 포함하는 것으로 이에 한정되지 않는다. 이때, 초과 체중의 적어도 일부는 과도한 지방조직이다. "비만(obesity)” 또는 “살찐(obese)”의 또 다른 정량적 정의는 25 kg/m² 또는 그 이상의 체질량지수(BMI) (National Institutes of Health, Clinical Guidelines on the Identification, Evaluation, and Treatment of Overweight and Obesity in Adults, 1998)를 나타낸 개체로 정의될 수 있으며, 비만은 다양한 다른 질환들의 발병과 관련이 있다 (Nishina, PM et al., Metab., 43:554-558, 1994; Grundy, SM & Barnett, JP, Dis. Mon., 36:641-731, 1990).

본 발명에서 사용된 "비만 관련 질환"은 개체에서 과도한 지방조직과 관련된 질환을 의미하며, 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 비만 관련 질환으로는 과식증, 내분비이상, 중성지방 축적증, 내당능장애, 심장질환, 뇌졸중, 다낭성 난소 증후군, 제2형 당뇨병, 인슐린 저항성, 고혈압, 관상동맥질환, 고지혈증, 관절염, 담낭질환, 골관절염, 수면무호흡증, 비알코올성 지방간 및 암(대장암, 유방암 등)일 수 있지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 비만 관련 질환으로 고통 받고 있으면 충분하며, 반드시 임상적으로 비만일 필요는 없다.

본 발명에서 사용된 “치료”이라는 용어는 질환, 상태 또는 이상에 대처할 목적으로 환자를 처치하고 돌보는 것을 의미한다. 치료는 활성약물을 투여하여 증상 또는 합병증 발생을 예방하거나, 증상 또는 합병증을 약화시키거나, 질환, 상태 또는 이상을 없애는 것을 포함한다.

본 발명에서 사용된 “예방”이라는 용어는 치료약이 비만 상태 발생 이전에 투여되어 비만 또는 비만 관련 질환의 발생을 예방하는 것을 의미한다. 비만 또는 비만 관련 질환을 겪고 있거나 증상을 나타낸 환자에게 투여된다면, 그러한 치료는 비만 또는 비만 관련 질환의 진행을 예방하는 효과가 있을 것으로 기대된다.

본 발명에서 사용된 “약제학적으로 허용 가능한 담체”는 사용한 용량 및 농도에서 세포 또는 포유동물에게 무독한 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 흔히 수용성 pH 완충액일 수 있으며, 담체의 예로는 인산, 구연산 및 다른 유기산; 아스코르빈산을 포함한 항산화제; 저분자량(약 10 잔기 이하) 폴리펩타이드; 혈장 알부민, 젤라틴 또는 면역글로블린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트란을 포함한 단당류, 다당류 및 다른 탄화수소; EDTA와 같은 킬레이트화제; 만니톨 또는 솔비톨과 같은 당알코올류; 소듐과 같은 염 형성 반대이온; 및/또는 TWEEN20, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 소듐 타우로디하이드로퓨시데이트(STDHF) 및 PLURONICS과 같은 비이온성 계면활성제를 들 수 있다.

본 발명은 메갈린이 시상하부에서 식욕 및 체중 조절에 있어 중요한 역할을 수행함을 최초로 제시하였다.

본 발명은 메갈린 활성화제 또는 메갈린 발현 조절제를 이용하여 개체에서 비만을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일 구현 예로서, 본 발명에 따른 방법은 개체에 메갈린 활성화제 또는 메갈린 발현 조절제를 투여함으로써 개체의 비만을 치료하거나 예방할 수 있다. 또한, 그러한 치료를 필요로 하는 개체에서 비만 관련 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 상기 구현 예에서, 메갈린에 결합하여 활성화시키는 메갈린 활성화제 또는 메갈린 발현을 조절하는 메갈린 발현 조절제는 약제학적으로 허용 가능한 염과 함께 투여될 수 있다. 그러한 약제학적으로 허용 가능한 염은 글루콘산염, 유산염, 초산염, 주석산염, 구연산염, 인산염, 말레인산염, 붕산염, 질산염, 황산염 및 염산염을 포함한다.

일 구현예로서, 비만 관련 질환은 과식증, 내분비계 이상, 중성지방 축적증, 심장병, 고혈압, 뇌졸중, 제2형 당뇨병, 내당능장애, 생식기 질환(다낭성 난소증후군), 관절염, 인슐린저항성, 죽상동맥경화증, 관상동맥질환, 고지혈증, 담낭질환, 골관절염, 수면 무호흡증, 비알코올성 지방간염 및 암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 하나 이상의 추가적인 활성 작용제 예를 들어, 렙틴 또는 클러스터린을 적절한 비율로 메갈린 활성화제 또는 메갈린 발현 조절제와 함께 투여함으로써 포유동물에서 비만 또는 비만 관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 한 개 이상의 추가적인 활성 작용제와 함께 사용될 경우, 이러한 조합은 상승적인 조합이 바람직하다. 하나의 약물로서 투여될 경우 각 화합물들의 효과를 합한 효과 보다 이들을 조합으로 투여한 경우 화합물들의 효과가 더 좋을 경우에 상승 효과가 발생한다. 일반적으로, 상승 효과는 화합물들의 최적 이하 농도에서 거의 명확하게 증명된다. 이러한 추가적인 활성 작용제는 항비만제, 항당뇨제, 항고지혈증제, 항고혈압제와 비만에서 유발되거나 비만과 관련된 합병증 치료용 약으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 추가적인 활성 작용제는 렙틴 또는 클러스터린을 포함할 수 있다. 또, 일 구현예에서, 메갈린 활성화제 또는 메갈린 발현 조절제와 추가적인 활성 작용제를 0.01:1 내지 1:0.01의 중량비로, 바람직하게는 0.05:1 내지 1:0.05의 중량비로 투여할 수 있다.

치료방법과 관련하여, 개체는 비만 및/또는 비만 관련 질환을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체이면 누구나 가능하다. 예를 들어, 비만 개체에서 과도한 지방량을 감소시켜 체중을 감소시키거나, 혹은 향후 비만증 발생이 기대되는 상황에서 지방조직 축적을 예방하기 위해 사용될 수 있다. 또, 예를 들어 환자가 비만에 걸리기 쉬운 유전적 소인을 가지고 있거나, 과거에 비만으로 고통을 받은 적이 있어 향후 비만증 발생 위험이 높은 경우에, 비만 또는 비만 관련 질환에 걸리기 쉬운 개체로 인식될 수 있다.

환자는 척추동물 종일 수 있다. 본 발명의 방법은 주로 온혈 척추동물의 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 포유동물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 인간을 포함한 영장류를 포함하여, 위험도로 인해 중요한 포유동물(예를 들어, 시베리아 호랑이), 경제적 중요도가 높은 포유동물(인간에 의해 소비되는 농장에서 길러지는 동물), 예를 들어 인간 이외의 육식동물(예를 들어, 고양이 및 개), 돼지류(돼지, 사육돼지, 숫퇘지), 반추동물(예를 들어, 소, 황소, 양, 기린, 사슴, 양, 들소 및 낙타) 및 말을 포함한 포유동물의 치료 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 돼지, 반추동물, 말, 가금류 등과 같은 가축의 질병 치료방법을 제공하지만, 이러한 가축에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 메갈린 활성화제 또는 메갈린 발현 조절제와 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 비만 또는 비만 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다. 약학조성물 중 메갈린 활성화제 또는 메갈린 발현 조절제의 함량은 0.1∼99.5 (중량%) 일 수 있고, 0.5∼90 (중량%)이 바람직하다. 추가적인 제형 및 투여 제법 기술은 당해 기술 분야에 개시되어 있다 (미국 특허 제 5,326,902호, 미국 특허 제 5,234,933호, 및 PCT 공개 WO 1993/25521호 참조).

치료를 위해서, 본 발명에 따른 치료적 유효량의 약학조성물을 개체에 투여한다. 치료적 유효량 또는 유효량은 예컨대 체중 또는 음식섭취량의 감소, 또는 에너지 소비의 증가와 같이 측정 가능한 생물학적 반응을 나타내기에 충분한 치료용 조성물의 양을 의미한다.

나아가, 본 발명에 따른 약학조성물은 단독으로 또는 다른 처방(예를 들면, 식이요법 및 운동) 및/또는 치료법과 조합하여 투여될 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 약학조성물은 메갈린 활성화제 또는 메갈린 발현 조절제를 1종 이상의 추가적인 활성 작용제와 적합한 비율로 조합하여 포함할 수 있다. 이러한 추가적인 활성 작용제는 항비만제, 항당뇨제, 고지혈증치료제, 고혈압치료제, 및 비만으로부터 유래되거나 비만과 관련된 합병증의 치료제로부터 선택될 수 있다. 이러한 추가의 활성 작용제로는 렙틴 또는 클러스터린이 포함될 수 있다. 일부 구현 예에 있어서, 메갈린 활성화제 또는 메갈린 발현 조절제와 추가적인 활성 작용제는 중량비 0.01:1 ∼1:0.01, 바람직하게는 0.05:1∼1:0.05 범위로 투여할 수 있다.

전술한 바와 같은 목적으로, 메갈린 활성화제 또는 메갈린 발현 조절제, 또는 이를 포함하는 약학조성물은 일반적으로 비강 내 또는 비경구 투여에 의해 전신적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 투여 경로는 경구, 경피, 정맥내, 구강내, 비강내, 시상하부내(intrahypothalamic), 뇌실내(intracerebroventricular), 경막내(intrathecal), 소장내, 직장내, 결장내, 혹은 안구내(intraocular) 투여가 가능하지만, 이에 국한되지는 않는다.

본 발명에 따른 약학조성물은 허용되는 약전을 기초로 투여경로에 따라 제형화될 수 있다(Fingi 등, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch.1, p.1, 1975; Lemington's Pharmaceutical Sciences, 18 ed., Mack Publishing Co, Easton, PA, 1990). 따라서, 제형은 정제, 환약, 분말, 향낭, 엘릭실제, 현탁제, 유화제, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 및 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사용액, 멸균 포장 분말 등의 형태가 가능하다. 본 발명에 따른 약학조성물은 환자에게 투여된 후에 활성 성분의 즉효성, 지속성 및 서방성을 달성할 수 있도록 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법들을 사용하여 제형화될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 조성물은 입, 비강 점막으로 흡수가 용이한 적절한 담체를 이용한 비강제제(예를 들어, 비강내 분무)의 형태이거나 경피 패치를 이용한 경피 경로를 통해 뇌척수액(CSF)으로 투여할 수 있다. 또한 경피전달계의 형태로 투여될 경우, 물론 약물 투여가 연속적으로 이루어질 수 있다.

다양한 조성물 및 투여 형태를 이용할 수 있으며, 이는 당업계에 널리 알려진 것이다. 투여를 위한 다른 조성물로는 활성성분을 하나 이상 포함하는 내용제용 액제 및 피부내 리니먼트(연고 등), 좌제 및 질좌제를 포함하며, 이는 널리 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 약학조성물은 표준적으로 잘 알려진 무독성 생리학적으로 허용가능한 담체, 보조제 및 비히클을 함유한 용량 단위 제형으로, 일반적으로 비경구로 투여된다. 본 발명에서 사용한 “비경구”는 정맥내, 근육내, 동맥내 주사 또는 주입 기술을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 주사 가능한 제제, 예를 들어 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁제는 적절한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 이용하여 당업계에 알려진 방법에 따라 제형화할 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성 비경구적으로 허용 가능한 희석제 또는 용매, 예를 들어 1,3-부탄디올 중 멸균 주사용 용제 또는 현탁제일 수 있다.

사용가능한 허용 가능한 담체 및 용매는 물, 링거액 및 등장 염화나트륨 용액일 수 있다. 게다가, 멸균, 고정유는 용매 또는 현탁매로서 일반적으로 사용된다. 이러한 목적으로, 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함한 자극이 적은 어떤 고정유를 사용할 수 있다. 게다가, 올레산과 같은 지방산을 주사용 용제 또는 현탁제의 제제에서 사용할 수 있다.

대표적인 담체로는 인산염, 유산염, 트리스 등으로 완충된 중성 생리식염수를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 물론, 담체 및 치료적 조성물을 공급받는 개체에서 어떠한 부적절한 반응을 유발하지 않도록 바람직하지 않은 오염원을 필수적으로 제거할 수 있을 만큼 담체를 충분히 정제하여 사용한다.

또한, 본 발명의 약학조성물은 표준적으로 잘 알려진 무독성 생리학적으로 허용가능한 담체, 보조제 및 비히클을 함유한 용량 단위 제형으로, 경구로 투여될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.

또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

메갈린 활성화제 또는 메갈린 발현 조절제를 포함하는 약학조성물에 있어서 이러한 화합물의 실제 투여 수준은 특정 개체에 대한 바람직한 치료반응을 얻기에 효과적인 활성 화합물의 양을 투여하도록 다양화될 수 있다. 선택된 투여 수준은 다양한 인자, 예를 들어 약학조성물의 활성, 제형, 투여경로, 다른 약 또는 치료와의 병용 및 치료받는 환자의 신체적 조건 및 이전 의학적 이력을 근거로 하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 구현예에서, 최소 복용량이 투여되며, 이러한 복용량은 용량 제한 독성이 없을 시에는 단계적으로 증가된다. 치료적으로 유효한 투여량의 결정 및 조정과 이러한 조정을 언제 어떻게 할지에 관한 평가는 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려져 있다.

일반적인 지침에 따라, 지시된 효과를 얻기 위해 사용될 활성성분의 일일 경구투여량은 체중 1 kg 당 대략 0.001∼1,000 mg, 바람직하게는 대략 0.01∼100 mg이다.

정맥내 투여시 일일 투여량은 일정한 속도로 주입시 체중 1kg 당 0.001 내지 100.0 ng일 수 있다. 이렇게 일정한 정맥내 주입은 바람직하게는 체중 1kg 당 0.01∼50 ng, 보다 바람직하게는 0.1∼10.0 ng으로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 단회 일일 투여량으로 투여되거나, 또는 총 일일 투여량을 하루 2회, 3회 또는 4회의 분량으로 나누어 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 원하는 몇일, 몇주, 몇 개월의 시간 동안 약물을 서서히 방출할 수 있는 데포(depot) 제형으로 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 메갈린-인코딩 유전자와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 개체의 비만 또는 비만 관련 질환 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 한 측면은 개체에 메갈린을 인코딩하는 유전자를 포함한 바이러스 벡터를 전달하는 단계를 포함하는, 개체에서 비만 또는 비만 관련 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

이종 메갈린 유전자는 벡터 또는 다른 전달 비히클을 이용하여 개체에 전달될 수 있다. DNA 전달 비히클로는 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스, 헬퍼-의존형 아데노바이러스 및 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함할 수 있다(Chu 등., Gene Ther., 1:292-299, 1994; Couture 등, Hum. Gene Ther., 5:667-277, 1994; Eiverhand 등, Gene Ther., 2:36-343, 1995). 또한 적절한 비바이러스성 벡터로는 DNA-지질 복합체 예를 들어, 아시아로글리코-단백질-매개 전달 시스템과 같은 리포좀-매개 또는 리간드/폴리-L-라이신 접합체를 포함한다(Felgner 등, J. Biol. Chem. 269:2550-2561, 1994; Derossi 등, Restor. Neurol. Neuros., 8:7-10, 1995; Abcallah 등, Biol. Cell 85:1-7, 1995).

전달 비히클로 바이러스성 벡터가 선정되면, 유전자가 영구적으로 발현될 수 있도록 숙주 게놈으로 삽입될 수 있는 벡터일 수 있지만, 이는 필수 요건은 아니다. 벡터가 숙주 게놈으로 삽입되지 않는 경우라면 유전자 발현은 영구적이기 보다는 일시적일 것이다.

벡터는 일반적으로 시상하부내, 뇌실내 또는 척수강내 주입에 의해 숙주에 투여될 수 있지만, 이외에도 정맥내, 근육내, 복강내, 경구, 피하 또는 다른 전달 경로로도 투여될 수 있다. 적절한 역가는 선정된 특정 벡터, 숙주, 사용된 프로모터의 강도 및 치료받는 질환의 중증도와 같은 수많은 요인들에 따라 달라질 것이다. 마우스의 경우, 아데노바이러스 벡터는 바람직하게 체중 g 당 대략 1.0 x 10⁶ 내지 1.0 x 10¹⁰용균 형성 단위(plaque forming unit, p.f.u.)의 용량으로 투여될 수 있다. 또한, 더 많은 양이 사용될 수 있고, 10¹² 입자까지 사용될 수 있다.

원하는 효과가 일시적인 것이 아닌 영속적인 것이라면, 헬퍼 의존성 바이러스 벡터가 사용되는 것이 바람직하다. 이러한 벡터를 이용하기에 적절한 프로모터로는 Moloney 레트로바이러스 LTR, CMV 프로모터 및 생쥐 알부민 프로모터를 포함한다. 복제 효능 없는 바이러스가 생산되고 ex vivo로 자가 유래 세포의 형질도입 후 in vivo 주입에 의해 동물 또는 인간에게 직접 투입될 수 있다 (Zatloukal 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:5148-5152, 1994).

메갈린 코딩 서열은 또한 in vivo 또는 ex vivo로 메갈린 발현용 플라스미드에 삽입될 수 있다. in vivo 치료를 위해, 코딩 서열을 조직에 직접 주입하거나 정맥내 주입하여 전달할 수 있다. 이러한 방법에 사용할 수 있는 프로모터로는 CMV와 같은 내인성 및 이종 프로모터를 포함한다. 코딩 서열은 코딩 서열을 안정화하고 세포에 코딩 서열을 형질전환하는 것을 촉진하고/하거나 표적을 제공할 수 있는 완충액을 포함한 제형으로 주입될 수 있다(Zhu et al., Science, 261: 209-211, 1993).

유전자 치료 목적으로 바이러스 또는 비바이러스 벡터 중 어느 하나에 의한 전달을 위한 메갈린 코딩 서열의 in vivo 발현은 이미 알려진 조절된 유전자 발현 프로모터를 이용함으로써 최대 효능 및 안정성을 조절할 수 있다(Gossen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551, 1992). 예를 들어, 메갈린 코딩 서열은 테트라사이클린 반응성 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 이러한 프로모터는 조절분자와 처리함으로써 양 또는 음의 방향으로 조절될 수 있다.

메갈린 코딩 서열의 비바이러스성 전달을 위하여, 고발현용 일반적인 대조군 서열을 포함한 일반적인 벡터에 이러한 서열을 삽입한 후, 폴리라이신, 프로타민 및 알부민과 같은 폴리머 DNA-결합 양이온과 같은 합성 유전자 전달 분자와 반응시킬 수 있다. 이러한 합성 유전자 전달 분자는 아시알로오로소뮤코이드(Wu & Wu, J. Biol. Chem., 262: 4429-4432, 1987), 인슐린(Hucked 등, Biochem.Pharmacol., 40: 253-263, 1990), 갈락토오스(Plank 등., Bioconjugate Chem., 3: 533-539, 1992), 락토오스(Midoux 등., Nucleic Acids Res., 21: 871-878, 1993) 또는 트랜스페린(Wagner 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414, 1990)과 같은 세포 표적 리간드와 연결될 수 있다.

다른 전달 시스템은 다양한 조직-특이적 또는 보편적인 활성 프로모터의 조절 하에서 메갈린 유전자를 포함한 DNA를 캡슐화하는 리포좀의 사용을 포함한다 (Nabel 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11307-11311, 1993; Philip 등, Mol. Cell Biol., 14:2411-2418, 1994). 또한, 사용가능한 비바이러스성 전달로는 유전자주입 접근과 같은 기계적 전달시스템을 포함한다(Woffendin 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 11581-11585, 1994). 또한 메갈린 코딩 서열은 광중합 하이드로겔 재료의 침착을 통해 전달될 수도 있다. 메갈린 유전자의 전달을 위해서 유전자 전달에 위한 사용되는 일반적인 방법, 예를 들면 휴대용 유전자 전달 입자총의 사용(USP No. 5,149,655)과 전달된 유전자 활성화용 이온화 방사선의 사용(USP No.5,206,152, PCT 공개 WO 92/11033)을 포함한다.

또한, 본 발명은 메갈린 발현을 하향 조절하는 조절제와 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 식욕 부전증 및 악액질을 동반한 개체의 식욕감퇴 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 메갈린 발현을 효과적으로 하향 조절할 수 있는 조절제를 치료적 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함한, 식욕감소증을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.

식욕감퇴는 암 관련 식욕감퇴, 신경성 식욕감퇴, 가성 식욕감퇴 등을 포함할 수 있다.

대표적인 조절제의 예로는 메갈린 유전자 발현을 매개할 수 있는 안티센스 RNA, 간섭 RNA, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 짧은 간섭 RNA(siRNA)과 mRNA 수준에서 메갈린 발현을 하향 조절할 수 있는 이의 발현벡터; 메갈린 전사 억제제; 전사된 메갈린 mRNA의 번역 억제제; 및 메갈린 국재화 억제제를 포함한다. 이들 중에서, siRNA 또는 shRNA와 이의 발현벡터는 적은 양으로 적용될지라도 특이적이면서 유효하게 메갈린 유전자 발현을 하향 조절할 수 있기 때문에 바람직하게 사용될 수 있다. 보다 바람직하게는, 이러한 조절제는 서열번호 1의 핵산서열을 갖는 siRNA 및 이의 발현벡터일 수 있다.

siRNA는 앞서 기술된 개체에 이종 메갈린 유전자 전달방법과 같이 바이러스 또는 비바이러스 벡터 또는 다른 전달 비히클을 이용하여 개체에게 전달될 수 있다.

게다가, 메갈린 발현의 조절제는 약학조성물 또는 제법으로 제형화될 수 있다. 또한, 메갈린 활성화제와 관련하여 앞서 기술한 바와 같이 다양한 경로를 통해 개체에 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 한 측면에 따르면, 비만 또는 비만 관련 질환을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에 임의의 화합물을 처리하는 단계; 및 메갈린의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 비만 또는 비만 관련 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 측면에 따르면, 비만 또는 비만 관련 질환을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 메갈린의 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및 상기 발현 프로파일을 정상대조군에서 메갈린의 발현 프로파일과 비교하여 비만 또는 비만 관련 질환 여부를 판정하는 단계를 포함하여 이루어지는 비만 또는 비만 관련 질환의 진단방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 메갈린은 시상하부에서 식욕 억제 인자 예를들어 렙틴 및 클러스테린의 신호 전달 경로에서 중요한 역할을 수행하므로, 메갈린 활성화제 또는 메갈린 발현 조절제를 함유한 약학조성물은 비만 또는 비만 관련 질환을 치료하거나 방지하는 데에 유용하게 사용될 수 있고, 임상 수준 이하 용량의 메갈린 활성화제 또는 메갈린 발현 조절제를 렙틴 또는 클러스터린과 함께 투여함으로써 렙틴 또는 클러스터린의 식욕억제 효과를 증강시킬 수 있다. 한편, 메갈린 활성 및 발현을 억제하는 화합물을 식욕 감퇴 예방 및 치료에 사용할 수 있다.

전술한 바와 같은 본 발명의 제반 목적 및 특징들은 이하에서 첨부된 도면과 관련하여 보다 상세하게 설명하기로 한다.:
도 1은 마우스 시상하부와 사람 신경세포주 (SH-SY5Y 세포)에서 LRP 패밀리 단백질의 mRNA 발현을 나타낸 그래프에 관한 것으로, (a) C57BL6 마우스의 시상하부에서 메갈린, 초저밀도 지단백 수용체(VLDL-R), 아포지단백-E-수용체-2(ApoER2)와 같은 LRP 패밀리 단백질의 mRNA 발현을 나타낸 것이고, (b) SH-SY5Y 신경세포에서 렙틴 수용체(Ob-Rb) 및 메갈린, VLDL-R 및 ApoER2와 같은 LRP 패밀리 단백질의 mRNA 발현을 나타낸 것이다.
도 2는 일차 배양한 인간 신경세포에서 렙틴 및 클러스터린 투여시 메갈린(LRP2) 및 Ob-Rb의 공동 국재화(colocalization)이 일어남을 나타낸 그래프로서, (a) PLA(Proximity ligation assay)를 이용하여 일차 배양한 인간 신경세포에서 렙틴 및 클러서터린 처리 1분 후에 메갈린(LRP2) 및 Ob-Rb 간의 물리적 상호작용(빨간점, 작은방울)을 나타낸 것이고, (b) 살아있는 인간 신경세포에서 렙틴 및 클러스터린 처리 후 메갈린(LRP2) 및 Ob-Rb 간의 상호작용 역학관계를 나타낸 교차-상관 분광기(fluorescence cross-correlation spectroscopy)의 결과로서, X축은 측정이 이루어진 지연 시간, Y축은 자동 상관 계수 및 교차상관 계수[G(τ)], 이때 교차상관 계수는 메갈린(LRP2) 및 Ob-Rb 간의 물리적 상호작용 강도를 의미하며, 각 데이터는 10회 측정한 값의 평균을 나타낸 것이다.
도 3은 시상하부에 메갈린과 리간드의 결합을 저해하는 물질인 RAP (receptor-associated protein)을 투여한 효과를 보여 주는 것으로 (a,b) RAP의 전처리가 렙틴 및 클러스터린의 식욕 억제 작용과 와 STAT3 신호전달계 활성화를 차단하였으며(n = 6-7; ^* P < 0.01, ^** P < 0.05 vs. 생리식염수 투여 대조군, ^† P < 0.05 vs. 렙틴 또는 클러스터린 단독 투여군), (c) RAP 처리가 SH-SY5Y 세포에서 렙틴 및 클러스터린에 의한 STAT3 활성화를 억제시켰다(^* P < 0.01, ^** P < 0.05 vs. 대조군, ^† P < 0.05 vs. 렙틴 또는 클러스터린 단독군).
도 4는 정상 마우스에서 시상하부 메갈린 발현 억제 효과를 나타내는 실험 결과로서, (a) 마우스 메갈린에 특이적인 작용하여 메갈린 mRNA 발현을 억제하는 small inhibitory RNA (RNAi)를 마우스의 시상하부에 정위적 수술법을 통하여 주입할 경우 메갈린의 mRNA 발현이 비표적 control RNAi를 투여한 대조군에 비하여 약 80% 감소함을 보여 주며, (b) 메갈린 RNAi를 주입한 마우스에서 렙틴의 식욕 억제 작용이 약화되었으며, (c) 렙틴 및 클러스터린의 투여 후 시상하부 STAT3 활성화가 메갈린 RNAi를 주입한 마우스에서 약화되었다.

다음 실시 예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 하는 것이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

또한, 고체 혼합물에서 고체, 액체 중에서 액체 및 액체 중에서 고체에 관하여 하기 주어진 %는 각각 중량/중량, 부피/부피 및 중량/부피를 근거로 한 것이고, 모든 반응은 다른 특별한 기술이 없는 한, 실온에서 수행되었다.

참고예

<동물>

6-8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스는 일본 SLC사(Shizuoka Ken, 일본)로부터 구입하였다. 특별한 언급이 없는 한, 동물들은 표준식이(삼양사, 서울, 한국)를 자유롭게 섭취하였으며, 일정한 온도(24℃)와 12시간 명암 주기(오전 6시부터 오후 6시까지 명조건) 하에서 사육되었다. 모든 실험은 아산생명과학연구소 동물실험윤리위원회에 승인을 받아 진행되었다.

<세포배양>

SH-SY5Y 신경세포는 10% fetal calf serum, penicillin, streptomycin (100 units/ml 각각)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에서 배양하였다. 인간 신경세포 일차 배양을 위한 사람 뇌신경 조직은 서울대학교병원 뇌은행으로부터 얻어 졌고, 기존에 알려진 방법(Bockaert 등, J. Physiol., 81: 219-227, 1986)에 따라 배양되었다.

<통계 분석>

데이터는 평균±표준오차평균으로 표시하였다. 통계 분석은 SPSS-PC12(시카고, 일리노이즈)를 사용하여 수행하였다. 그룹 간의 통계적 유의성은 일원배치 분산분석(ANOVA) 후 사후검정(Post-hoc test) 혹은 독립 표본 t-검정(unpaired Student's t test)을 사용하여 분석하였다. RAP 또는 메갈린 siRNA의 섭식 실험 결과는 반복 일원배치분산분석을 사용하여 분석하였다. 메갈린-siRNA 발현 마우스에서 STAT3 활성화 실험 결과는 이원분산분석을 사용하여 분석하였다. 유의성은 P값이 0.05 이하 일 경우로 정의하였다.

실시예 1: 마우스 시상하부 및 신경세포주에서의 메갈린 및 다른 LRP 패밀리 단백질의 발현

1) 마우스 시상하부에서 메갈린 발현 확인

마우스 시상하부에서 LRP 패밀리 단백질의 mRNA 발현을 조사하기 위하여, 5시간 절식시킨 8 내지 10주령의 C57BL/6J 마우스로부터 시상하부 중저기저부(MBH)를 채취하여 액체 질소에서 급동시킨 뒤 RNA 추출 때까지 -70℃에 보관하였다. Trizol(Invitrogen, Calsbad, CA)를 이용하여 총 RNA를 추출한 뒤 메갈린, VLDL-R 및 ApoER2의 mRNA 발현 여부를 표 1에 제시한 프라이머(primer)를 사용하여 RT-PCR로 측정하였다.

유전자	프라이머
ApoER2 (인간)	Forward 5'-TTCACCAACCGGCACGAGGT-3'(서열번호 1) Reverse 5-GGGTGATTCCGTTGGGCCAT-3'(서열번호 2)
ApoER2 (마우스)	Forward 5'-GGAGATGCGATGAGGACAAC-3'(서열번호 3) Reverse 5'-CCACCCTCACAGTCCTTCTC-3'(서열번호 4)
메갈린 (인간)	Forward 5'-TTCACCAACCGGCACGAGGT-3' (서열번호 5) Inner 5'-TCGCATGTCAAGTGATTGGA-3' (서열번호 6) Reverse 5'-GGGTGATTCCGTTGGGCCAT-3' (서열번호 7)
메갈린 (마우스)	Forward 5'-CCTTGCCAAACCCTCTGAAAAT-3'(서열번호 8) Reverse 5'-CACAAGGTTTGCGGTGTCTTTA-3'(서열번호 9)
Ob-Rb (인간)	Forward 5'-ATG ATG CAG TGT ACT GCT GC-3'(서열번호 10) Reverse 5-GTG GAG AGT CAA GTG AAC CT-3'(서열번호 11)
VLDL-R (인간)	Forward 5'-TGG CGC CCA TGA GTT CCA GT-3'(서열번호 12) Reverse 5-TTC CAG GGC CCA AGC ACT GA-3'(서열번호 13)
VLDL-R (마우스)	Forward 5'-CTCCCAGTTTCAGTGCACAA-3'(서열번호 14) Reverse 5'-ATCAGAACCGTC TTCGCAAT-3'(서열번호 15)

그 결과, 마우스의 시상하부에 메갈린, VLDL-R 및 ApoER2의 mRNA가 발현됨을 확인하였다 (도 1a).

2) 사람 신경세포주에서의 메갈린 발현 확인

SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포에서의 LRP 패밀리 단백질의 mRNA 발현을 조사하기 위하여, 총 RNA를 Trizol 시약(Invitrogen)을 이용하여 추출하였고, 렙틴 수용체(Ob-Rb) 및 메갈린, VLDL-R 및 ApoER2의 mRNA 발현 수준을 표 1에 제시한 프라이머를 사용한 반정량 RT-PCR을 통해 측정하였다.

그 결과, 사람의 신경세포에도 렙틴의 수용체 뿐만 아니라 메갈린을 포함한 LRP 패밀리 단백들이 발현됨을 확인하였다 (도 1b).

실시예 2: 렙틴 및 클러스터린 처리 후 렙틴수용체 Ob-Rb와 메갈린 간의 물리적 상호 작용

1) Proximity ligation assay

렙틴 및 클러스터린 처리가 렙틴수용체와 메갈린의 물리적인 상호작용을 유도하는지 PLA 실험을 통하여 확인하였다. 즉, 일차 배양한 인간 신경세포를 렙틴(100 nM) 및 클러스터린(1 nM)을 각각 1분 동안 처리한 후, 100% 메탄올을 이용하여 실온에서 20분 동안 고정시켰다. 고정 후 신경세포를 OB-Rb 특이 항체(희석 배수 1:100, 항마우스 항체, Alpha Diagnostics Cat #OBR130A, San Antonio, TX)와 메갈린 특이 항체(희석배수 1:200, 항토끼 항체, Santa Cruz)로 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후 Duolink insitu PLA kit(Olink Bioscience,Uppsala, Sweden)를 이용하여 OB-Rb와 메갈린의 물리적 상호작용을 분석하였다. 즉 PLA kit에는 항토끼 혈청과 항마우스 혈청에 대한 PLA 플러스 및 마이너스 탐침이 포함되어 있어 두 수용체가 공간적으로 충분히 접근할 경우 두 탐침의 끝이 O-link에 의하여 연결되어 붉은 색깔로 나타난다. 세포의 위치를 표시하기 위하여 세포의 핵을 Hoechst 33342 염료 (Olink Bioscience)를 이용하여 염색하였다. 사료를 염색 후 Vecta-shield 도말 배지(Vector Laboratories)를 사용하여 도말한 뒤 공초점 현미경(Carl Zeiss Inc., Jena, Germany)을 사용하여 관찰하였다. 세포당 in situ PLA 시그날의 수는 BlobFinder 소프트웨어 프로그램 (Olink Bioscience)을 이용한 반자동 이미지 분석에 의해 카운팅하였다.

그 결과, 렙틴과 클러스터린 처리 1분 뒤에 OB-Rb와 메갈린 간의 물리적 상호작용이 saline을 처리한 대조군에 비하여 유의하게 증가하였다 (도 2a).

2) Fluorescence cross-correlation spectroscopy를 이용한 실험

상업적으로 판매되고 있는 렙틴수용체 Ob-Rb 항체에 특이성의 논란이 있으므로, Ob-Rb 및 메갈린의 상호작용을 살아있는 신경세포에서 FCCS 실험(Bacia, K., Nat. Methods. 3, 83-89, 2006)을 이용하여 수행하였다.

즉, 일차 배양 인간 신경세포에 리포펙타민을 사용하여 극소량(0.005 ㎍)의 Ob-Rb-EGFP 및/또는 LRP2-tagRFP로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후에 2시간 동안 혈청없는 배지에서 세포 배양한 뒤 렙틴(100 nM) 및 클러스터린(1 nM)을 1분 동안 처리하였다. FCCS 실험은 도립 공초점 레이저-주사 현미경(inverted Confocal laser-scanning microscopy; LSM710-ConfoCor3, Carl Zeiss)을 이용하여 25℃에서 수행하였다. 양성 대조군으로, EGFP-tagRFP 융합 단백질-발현 세포를, 음성 대조군으로 EGFP 또는 tagRFP 단독 발현 세포를 사용하였다. EGFP 또는 tagRFP 단독 발현 세포에서는 교차-상관 시그날이 발견되지 않았는데, 이는 백그라운드 교차-상관 시그날이 없음을 의미한다. 측정은 100 kcp 이하 형광강도의 카운트 속도와 2 kcp보다 큰 분자 당 카운트를 지닌 세포 수에서 수행되었다. 15-20초 동안 10회 측정되었다. 데이터는 ConfoCor3 소프트웨어를 이용하여 분석하였고, 평균값을 나타내었다.

사람의 신경세포에서 클러스터린 처리는 Ob-Rb와 메갈린 간의 상호 작용력을 ~3.1배까지, 렙ㅌ친 처리는 Ob-Rb과 메갈린의 상호작용력을 ~1.5배까지 증가시켰다 (도 2b).

실시예 3: 메갈린과 리간드 결합을 억제하는 RAP 투여시 렙틴과 클러스터린의 식욕 억제 작용과 신호전달계 활성화가 차단되었다.

시상하부에 메갈린이 식욕 억제 인자인 렙틴 및 클러스터린의 식욕감소 효과를 매개하는지를 조사하기 위하여, 밤새 절식한 마우스(n=6-7)에 오전 9-11시 사이에 렙틴(0.5 ㎍) 또는 클러스터린(0.2 ㎍) 주입 전에 메갈린과 리간드의 결합을 방해하는 것으로 알려진 (Morales 등., Biol. Reprod. 55: 676-683, 1996) RAP(Molecular Innovations, 2㎍)를 양쪽 시상하부 배내측 부위로 30분 전에 투여하였다. 투여 후 24시간 동안 먹이섭취 및 체중 변화를 측정하였을 때, RAP 단독 투여는 유의한 섭식 변화를 일으키지 않았지만, 렙틴 및 클러스터린의 식욕감소 효과는 억제하였다 (도3 a,b).

또한 메갈린이 렙틴 및 클러스터린에 의한 STAT3 활성화에 관여하는지 확인하고자 상기 기술한 방법과 동일하게 렙틴(0.5 ㎍) 또는 클러스터린(0.2 ㎍) 투여 전에 RAP(5 mg/ml)를 투여하고, 렙틴 및 클로스터린 투여 후30분 뒤에 시상하부를 채취하여 단백질을 추출하여 인산화된 STAT3과 총 STAT3에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 그 결과, RAP 투여시 렙틴과 클러스터린에 의한 STAT3 인산화가 감소함을 알 수 있었다. 이러한 연구 결과는 메갈린이 렙틴과 클러스터린에 의한 식욕 억제 작용과 시상하부 STAT3 신호전달계의 활성화에 중요함을 시사한다.

실시예 4: 시상하부 메갈린(LRP2)의 억제가 렙틴 및 클러스터린에 의한 식욕감소 활성 및 STAT3 활성화를 차단하였다.

시상하부 렙틴과 클러스터린의 식욕 억제 작용에 대한 시상하부 메갈린의 작용을 재확인하고자 C57BL6 마우스의 양측 시상하부 배내측 부위에 정위수술법을 이용하여 메갈린(LRP2)에 특이적인 RNAi를 주입한 뒤 시상하부 메갈린 mRNA 발현 수준을 측정하였다. 즉, 마우스 메갈린 서열(뉴클레오타이드 8854-8873)을 RNA 간섭의 표적으로 이용하였다. 즉, 메갈린 RNAi를 RNase 없는 물에서 녹여서 리포펙타민(Invitrogen)과 혼합(9:1 vol/vol)하여 1 mM의 최종농도로 하였다. 메갈린 siRNAi (0.5μl each side, Samcheolli, Seoul, Korea)를 이전에 알려진 정위방법 (Kim, M.S., Nat. Neurosci. 9, 901-906, 2006)의 수술 시 5분 동안 양측 배내측 시상하부에 주입하였다. 동량의 비표적 대조-RNAi(Dharmacon, Chicago, IL)를 대조군에 투여하였다. RNAi를 주입하고 24시간 후에 마우스의 배내측 시상하부를 채취하여 RNA를 추출하였다. 메갈린 mRNA 발현을 real time-PCR을 이용하여 측정하였고, GAPDH의 값으로 보정하였다. 그 결과, 도 4a와 같이 마우스 메갈린에 특이적인 RNAi의 처리가 시상하부 메갈린 mRNA 발현을 효과적으로 감소시켰다.

그 다음 단계로 시상하부의 중저기저부(MBH)에 메갈린 RNAi로 발현시킨 마우스에서 렙틴 및 클러스터린의 식욕 감소 효과이 억제되는지를 측정하였다. 메갈린 RNAi 투여 2일 뒤에 밤새 절식 후 렙틴 및 클러스터린 (각각 1㎍)을 ICV 캐뉼라를 통해 주입하고, 24시간 동안 섭식을 모니터링 하였다. 실험의 마지막에 중저기저부 시상하부를 모았고, 시상하부 메갈린 발현을 실시간 PCR을 이용하여 측정하였다. 메갈린 mRNA 수준이 대조군 평균의 30% 미만이면 유전자 넉다운이 성공적인 것으로 판단하였다. 성공적인 유전자 넉다운을 나타낸 동물을 데이터 분석용으로 이용하였다.

그 결과, 도 4a 및 도 4b에서 보여 주는 바와 같이 대조 siRNA 를 투여한 마우스에서는 렙틴과 클러스터린 투여 후 먹이섭취 감소가 관찰되었으나, 이러한 효과가 시상하부에 메갈린 RNAi를 투여한 마우스에서 렙틴과 클러스터린의 식욕 억제 작용이 차단되었다 (*P<0.01 vs. 대조-RNAi과 생리식염수 주입 대조군. ^† P<0.05 vs. 대조군 RNAi와 렙틴 또는 클러스터린-주입 실험군).

또한, 렙틴 및 클러스터린 투여에 의한 시상하부 STAT3 인산화가 시상하부에 메갈린 siRNA를 투여한 마우스에서 억제되는지를 확인하고자, 앞서 기술한 바와 같이 대조군 siRNA 또는 메갈린 siRNA 중 어느 하나를 마우스에 주입하였다. siRNA 주입 이틀 후, 생리식염수, 렙틴 및 클러스터린(각각 1 ㎍)을 밤새 절식한 마우스에 ICV 캐뉼라를 통해 주입하였다. 생리식염수, 렙틴 또는 클러스터린 투여 30분 후, 시상하부 배내측 부위를 채취하였다. 인산화된 STAT3(Y705)과 총 STAT3(Cell Signaling Inc.)에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 통해 STAT3 인산화를 분석하였다.

그 결과, 도 4c와 같이 대조 RNAi (cont-RNAi)를 투여한 마우스에서 렙틴 및 클러스터린 투여는 유의한 시상하부 STAT3 인산화 증가를 초래하였는데, 메갈린 RNAi를 주입한 마우스에서 이러한 효과가 현저하게 차단되었다(n=5-6, *P<0.01 vs. 대조군 RNAi 및 생리식염수 주입 대조군. ^† P<0.05 vs. 대조군 RNAi 및 렙틴 또는 클러스터린-주입 실험군).

본 발명은 상기 특정 구현예에 관해서 기술할지라도, 첨부된 청구항에 의해 정의된 범위 내에서 본 발명의 다양한 변형은 당해 기술 분야에서 숙련된 자들에 의해 얼마든지 가능하다.

<110> UNIVERSITY OF ULSAN FOUNDATION FOR INDUSTRY COOPERATION <120> METHOD OF DIAGNOSING, PREVENTING OR TREATING BODY WEIGHT DISORDERS BY EMPLOYING MEGALIN <130> DP-2010-0041 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for ApoER2 (human) <400> 1 ttcaccaacc ggcacgaggt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for ApoER2 (human) <400> 2 gggtgattcc gttgggccat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for ApoER2 (mouse) <400> 3 ggagatgcga tgaggacaac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for ApoER2 (mouse) <400> 4 ccaccctcac agtccttctc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for megalin (human) <400> 5 ttcaccaacc ggcacgaggt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Inner primer for megalin (human) <400> 6 tcgcatgtca agtgattgga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for megalin (human) <400> 7 gggtgattcc gttgggccat 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for megalin (mouse) <400> 8 ccttgccaaa ccctctgaaa at 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for megalin (mouse) <400> 9 cacaaggttt gcggtgtctt ta 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Ob-Rb (human) <400> 10 atgatgcagt gtactgctgc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Ob-Rb (human) <400> 11 gtggagagtc aagtgaacct 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for VLDL-R (human) <400> 12 tggcgcccat gagttccagt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for VLDL-R (human) <400> 13 ttccagggcc caagcactga 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for VLDL-R (mouse) <400> 14 ctcccagttt cagtgcacaa 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for VLDL-R (mouse) <400> 15 atcagaaccg tcttcgcaat 20

Claims

메갈린 활성화제 또는 메갈린 발현 조절제 중에서 선택된 하나 이상의 약제와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 개체의 비만 또는 비만 관련 질환 치료 또는 예방용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 비만 관련 질환이 과식증, 비만증을 수반한 내분비계 이상, 고지혈증, 심장병, 고혈압, 뇌졸중, 제2형 당뇨병, 내당능장애, 다낭성 난소증후군, 관절염, 인슐린저항성, 죽상동맥경화증, 관상동맥질환, 담낭질환, 골관절염, 수면 무호흡증, 비알코올성 지방간염 및 암으로 이루어지는 군에서 선택된 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 개체가 포유류인 약학조성물.
청구항 3에 있어서, 상기 포유류가 설치류, 돼지, 반추동물 및 영장류로 이루어진 군으로부터 선택된 약학조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 영장류가 인간인 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약학조성물이 약제학적 제형인 약학조성물.
청구항 6에 있어서, 상기 약제학적 제형이 정제, 캡슐제, 주사액, 주사용 현탁제, 비강내 스프레이, 또는 경피용 패치인 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약학조성물이 0.1 내지 99.5 중량%의 메갈린 활성화제를 포함한 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 추가로 렙틴 또는 클러스터린 중에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 화합물을 포함한 약학조성물.
청구항 9에 있어서, 상기 약학조성물이 메갈린 활성화제 또는 메갈린 발현 조절제 중에서 선택된 어느 하나의 약제와 렙틴 또는 클러스터린 중 어느 하나의 화합물을 0.01:1 내지 1:0.01의 중량비로 포함한 약학조성물.
메갈린-인코딩 유전자와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 개체의 비만 또는 비만 관련 질환 치료 또는 예방용 약학조성물.
청구항 11에 있어서, 상기 유전자가 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터를 사용한 약학조성물.
청구항 12에 있어서, 상기 바이러스성 벡터가 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스, 헬퍼-의존형 아데노바이러스 및 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군에서 선택된 약학조성물.
청구항 11에 있어서, 상기 메갈린-인코딩 유전자가 개체의 정맥내, 시상하부내, 뇌실내 또는 경막내로 주입된 약학조성물.
메갈린 발현을 하향조절하는 조절제와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 식욕 부전증 및 악액질을 동반한 개체의 식욕감퇴 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 15에 있어서, 상기 식욕감퇴가 암-관련 식욕감퇴, 신경성 식욕감퇴 또는 가성 식욕감퇴인 약학조성물.
청구항 15에 있어서, 상기 조절제가 메갈린 유전자 발현에 대한 RNA 간섭을 중개하는 RNA, 메갈린 전사억제제, 전사된 메갈린 mRNA의 번역억제제 및 메갈린 국재화 억제제로 이루어지는 군에서 선택된 약학조성물.
청구항 17에 있어서, 상기 RNA 간섭을 중개하는 RNA가 안티센스 RNA, 간섭 RNA, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 짧은 간섭 RNA(siRNA)인 약학조성물.
청구항 18에 있어서, 상기 짧은 간섭 RNA(siRNA)가 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 지닌 약학조성물.
비만 또는 비만 관련 질환을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에 임의의 화합물을 처리하는 단계; 및 메갈린의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 비만 또는 비만 관련 질환 치료제의 스크리닝 방법.
비만 또는 비만 관련 질환을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 메갈린의 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및 상기 발현 프로파일을 정상대조군에서 메갈린의 발현 프로파일과 비교하여 비만 또는 비만 관련 질환 여부를 판정하는 단계를 포함하여 이루어지는 비만 또는 비만 관련 질환의 진단방법.