KR20110102519A - 신규한 단백질 배합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 치료적, 예방적 및/또는 화장품학적 제제로서 사용하고자 하는 활성 에나멜 물질, 예컨대 에나멜 매트릭스, 에나멜 매트릭스 유도체 및/또는 에나멜 매트릭스 단백질의 신규하고 개선된 저 농도 배합물에 관한 것이다. 본 발명에서, 상기 활성 에나멜 물질은 세포성 내성장 또는 세포-폐색성에 적절한 중합체 매트릭스에 혼입한다. 활성 에나멜 물질은 중합체 매트릭스의 분해에 의하여, 효소 작용에 의하여 및/또는 확산에 의하여 방출되도록 하기 위하여 중합체 매트릭스에 혼입될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 특히 배합물내 보다 낮은 총 농도로 존재하는 활성 에나멜 물질의 신규한 약학적 및/또는 화장품학적 배합물을 포함하며, 여기서 상기 활성 에나멜 물질 방출의 공간적 및/또는 선택적 조절은 활성 에나멜 물질의 보다 큰 백분율이 적절한 세포성 활성의 시기에 방출될 수 있도록 한다.

Description

신규한 단백질 배합물{NEW PROTEIN FORMULATION}
본 발명은 치료적, 예방적 및/또는 화장품학적 제제로서 사용하고자 하는 활성 에나멜 물질, 예컨대 에나멜 매트릭스, 에나멜 매트릭스 유도체 및/또는 에나멜 매트릭스 단백질의 신규하고 개선된 저 농도 배합물에 관한 것이다. 본 발명에서, 상기 활성 에나멜 물질은 특히 조직 복구, 재생 및/또는 리모델링에 사용하기 위하여, 생 무기질화된 조직(living mineralised tissue) 부분 사이의 결합을 유도하기 위하여, 다른 생 조직의 조각에서의 접합 부위에 생 무기질화된 조직의 조각을 접합시키기 위하여, 피부 또는 점막에서의 상처의 치유를 개선시키기 위하여, 감염 또는 염증 상태를 예방 또는 치료하기 위하여, 상아질의 형성 또는 재생을 위하여, 이식편의 획득을 촉진하기 위하여, 상피 유도된 양성, 반-악성 또는 악성 신생물의 치료를 위하여, 세포소멸의 유도를 위하여 또는 시술 및/또는 외상, 예컨대 세포감소 수술후 창강(wound cavity) 및/또는 조직 결함을 채우기 위하여 중합체 매트릭스에 혼입시킨다.
본 발명에서, 활성 에나멜 물질은 중합체 매트릭스의 분해, 효소 작용 및/또는 확산에 의하여 방출되도록 중합체 매트릭스에 혼입될 수 있다. 상기 중합체 매트릭스는 세포성 내성장(cellular ingrowth) 또는 세포-폐색성(cell-occlusive)에 적절하다.
그래서, 본 발명은 특히 배합물내 보다 낮은 총 농도로 존재하는 활성 에나멜 물질의 신규한 약학적 및/또는 화장품학적 배합물을 포함하며, 여기서 상기 활성 에나멜 물질 방출의 공간적 및/또는 선택적 조절은 활성 에나멜 물질의 보다 큰 백분율이 적절한 세포성 활성의 시기에 방출될 수 있도록 한다.
본 발명의 활성 에나멜 물질(용어 "활성 에나멜 물질(active enamel substance)"은 본 명세서에서 에나멜 매트릭스, 에나멜 매트릭스 유도체 및/또는 에나멜 매트릭스 단백질에 대하여 사용함)은 에나멜 매트릭스에 이웃한 발육중인 조직에서 자연적으로 발견되는, 인자뿐 아니라 이의 조정된 다단계의 인자를 유도시킬 수 있다. 상기 물질은 발육중인 조직의 천연 환경을 모방하며, 그리하여 조직 재생, 세포 분화 및/또는 성숙을 위한 천연 자극을 모방하게 된다.
에나멜 매트릭스에 존재하는 에나멜 매트릭스 단백질은 에나멜에 대한 전구체로서 가장 잘 알려져 있다. 백악질(시멘트질)(cementum) 형성 이전에, 에나멜 매트릭스 단백질은 발육중인 치근의 첨단부에서 뿌리면에 부착된다. 이와 같이 부착된 에나멜 매트릭스가 백악질의 형성을 위한 개시 인자가 된다는 증거가 존재하고 있다. 다시, 백악질의 형성 그 자체는 치주 인대 및 치조골의 발육과 관련되어 있다. 본 발명 이전에 본 발명자들에 의하여 입증된 바와 같이, 에나멜 매트릭스 단백질은 치아에서의 천연 부착 형성을 모방하여 치주 재생을 촉진하게 된다(Gestrelius S, Lyngstadaas SP, Hammarstrom L. Emdogain - periodontal regeneration based on biomimicry. Clin Oral Invest 4:120-125 (2000)).
에나멜 매트릭스는 다수의 단백질, 예컨대 아멜로게닌, 에나멜린, 터프트 단백질, 프로테아제 및 알부민으로 이루어진다. 에나멜 매트릭스의 주성분인 아멜로게닌은 교호 스플라이싱(alternative splicing) 및 조절된 후 분비 과정(post secretory processing)에 의하여 단일 유전자로부터 유도된 소수성 단백질 부류이다. 이들은 척추동물 진화를 통하여 고도로 보존되며, 조사한 모든 고등 척추동물중에서 전체 서열 상동성 정도가 높은(약 80%) 것으로 나타났다. 사실상, 돼지 및 사람 아멜로게닌 유전자 전사의 서열은 염기의 4%만이 상이하다. 그래서, 돼지 기원임에도 불구하고, 에나멜 매트릭스 단백질은 사람 신체에 시술될 경우 "자가"로 간주되어 알러지 반응 또는 기타의 부적절한 반응을 유발시키지 않으면서 인체에서의 치아 재생을 촉진시킬 수 있다.
돼지 에나멜 매트릭스로부터 단백질의 정제된 산 추출물의 형태인 에나멜 매트릭스 유도체(예, EMD: enamel matrix derivatives)는 심각한 치아 부착 손실을 갖는 환자에게서 기능성 치주 인대, 백악질 및 치조골을 복원하기 위하여 이미 성공적으로 사용되어 왔다(Hammarstroem et al., 1997, Journal of Clinical Periodontology 24, 658-668).
또한, 배양된 치주 인대 세포(PDL: periodontal ligament cells)에 대한 실험에서, 이들 세포의 부착 속도, 성장 및 대사는 EMD가 배양물중에 존재할 경우 유의적으로 증가되는 것으로 나타났다. 또한, EMD에 노출된 세포는 대조군에 비하여 성장 인자의 세포내 CAMP 신호(signalling) 및 자가분비 생성이 증가된 것으로 나타난다. 반대로, 상피 세포는 EMD이 존재할 경우 CAMP 신호 및 성장 인자 분비가 증가됨에도 불구하고, 증식 및 성장 모두에서 억제된다(Lyngstadaas et al., 2001, Journal of Clinical Periodontology 28, 181-188).
에나멜 매트릭스 단백질 및 에나멜 매트릭스 유도체(EMD)는 경조직 형성을 유발하고(예, 에나멜 형성, 미국 특허 4,672,032 (Slavkin)), 경조직간의 결합을 입증하며(EP-B-0 337 967 및 EP-B-0 263 086), 예컨대 피부 및 점막의 개방창 치유를 촉진하고, 감염 및 염증 질환의 치료에 대한 이로운 효과를 지니며(EPO 1, 1059934 및 EPO II, 01201915.4), 상아질의 재생을 유도하며(WO 01/97834), 이식편의 획득을 촉진하며(WO 00/53197), 신생물의 치료에서의 세포소멸을 유도하며(WO 00/53196), 시술 및/또는 외상, 예컨대 세포감소 수술 후의 창강 및/또는 조직 결함의 충전을 촉진(WO 02/080994)할 수 있는 것으로 특허 문헌에 이미 기재되어 있다.
조직 복구 또는 재생의 경우, 전술한 EMD에 대한 의학적 징후에서 예시된 바와 같이, 세포는 상처층으로 이동하여 증식, 분화되고 최종 조직 형상을 형성하여야만 한다. 복수의 세포 모집단은 종종 이와 같은 형태형성 반응에 참여하여야만 한다.
그럼에도 불구하고, 활성 에나멜 물질, 예컨대 에나멜 매트릭스, 에나멜 매트릭스 유도체 및/또는 에나멜 매트릭스 단백질의 전술한 효과 및 용도 중 임의의 것은 비교적 높은 농도에서의 활성 에나멜 물질의 배합물에 대하여 문헌에 보고되어 있다. 통상적인 농도는 10 내지 30 ㎎/㎖이다. 지금까지는 활성 에나멜 물질의 배합물을 저 농도로 사용하여서는 어떠한 효과도 관찰될 수가 없었다. 본 발명을 특정의 이론으로 한정하고자 하는 의도는 아니나, 이는 잠재적으로 사용한 모든 약학적 및/또는 화장품학적 배합물이 현재까지는 활성 에나멜 물질을 비제어된 방식으로 방출되도록 하였다는 사실에 기인한다.
투여한 기본 섬유모세포 성장 인자의 투여량을 감소시킬 수 있는 유사성에서, 조절 전달 장치는 성장 인자를 격리시키기 위하여 고정된 헤파린의 사용에 기초하여 설계된다. 예를 들면 문헌[Edelman et al., Biomaterials 1991 September; 12(7):619-26]에서는 알기네이트내에서 헤파린-공액 SEPHAROSETM 비이드를 사용한다. 비이드는 헤파린을 사용한 bFGF의 결합 및 분해에 기초하여 기본 섬유모세포 성장 인자("bFGF")를 느리게 방출하는 저장소로서 작용한다.
또한, 인자 XIIIa 기질 서열 및 생활성 펩티드 서열을 포함하는 이중-도메인 펩티드는 피브린 겔로 가교될 수 있으며, 생활성 펩티드는 이의 시험관내 세포성 활성을 보유하는 것으로 입증되었다(Schense, J.C., et al. (1999) Bioconj. Chem. 10:75-81).
또한, 미국 특허 출원 제2003/0187232호 및 미국 특허 출원 제2003/0166833호에서, 전체 성장 인자 단백질을 단백질 또는 다당류 매트릭스에 투입하는 것은 헤파린-매트릭스를 형성하기 위하여 공유 또는 비공유 방법에 의하여 매트릭스에 헤파린을 결합시키는 것에 기초한 것으로 나타났다. 그후, 헤파린은 헤파린-결합 성장 인자를 단백질 매트릭스에 비공유 결합시킨다. 또한, 융합 단백질은 가교 영역, 예컨대 인자 XIIIa 기질 및 자연 단백질 서열을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 매트릭스 및 생활성 인자 사이에서의 분해성 결합의 투입은 장시간 약물 전달에 특히 유용한 것으로 주장되었다.
본 출원은 전술한 의학적, 치료적 및 화장품학적 용도로 적용 가능한 활성 에나멜 물질의 신규하고 개선된 배합물의 이로운 효능에 관한 것으로, 여기서 상기 활성 에나멜 물질은, 그 활성 에나멜 물질이 매트릭스의 분해에 의하여 및/또는 효소 작용 및/또는 확산에 의하여 방출됨으로써, 효과적으로 배합물내에서의 필수 총 투여량을 감소시키며 그리고 방출의 공간적 조절을 촉진하며, 이것이 세포성 활성의 적절한 시기에 활성 에나멜 물질의 보다 큰 백분율을 방출시킬 수 있도록 하기 위하여, 2 이상의 상기 매트릭스의 조합을 비롯하여, 미국 특허 출원 제2003/0187232호 및 미국 특허 출원 제2003/0166833호에 제시된 매트릭스와 유사한 단백질 매트릭스, 합성 매트릭스 및/또는 다당류 매트릭스에 혼입된다.
발명의 개시
본 발명은 세포성 성장 또는 내성장에 적절할 수 있거나 또는 세포-폐색성일 수 있는 중합체 매트릭스 및 1 이상의 활성 에나멜 물질을 포함하는, 활성 에나멜 물질을 투여하기 위한 저 농도 약학적, 치료적 및/또는 화장품학적 배합물(formulation)을 개시하며, 여기서 상기 배합물중의 상기 활성 에나멜 물질의 농도는 5 ㎎/㎖ 이하, 예컨대 약 5 ㎎ 또는 5 ㎎/㎖ 미만, 예컨대 4.9 ㎎/㎖, 4.5 ㎎/㎖, 4 ㎎/㎖, 3.5 ㎎/㎖, 3 ㎎/㎖, 2.5 ㎎/㎖, 2 ㎎/㎖, 1.5 ㎎/㎖, 1 ㎎/㎖, 750 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 250 ㎍/㎖, 150 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖ 또는 1 ㎍/㎖ 미만이다.
본 발명은 활성 에나멜 물질이 박리 가능하게 혼입되거나 또는 둘러싸인 천연 및/또는 합성 중합체 매트릭스를 사용하여 특히 골 및 치아 성장을 위한 경조직 및 연조직의 복구, 재생 또는 리모델링 방법 및 이를 위한 생성물을 제공한다. 중합체 매트릭스는 생적합성 및/또는 생분해성이다. 이들은 이식시 시험관내에서 또는 생체내에서 형성될 수 있다. 통상의 중합체 매트릭스는 매트릭스 공극의 크기에 따라 세포성 성장 또는 내성장 또는 세포-폐색성에 적절하다. 활성 에나멜 물질은 이의 완전 생활성을 보유하면서 중합체 매트릭스에 혼입, 부착 및/또는 둘러싸일 수 있다. 또한, 활성 에나멜 물질은 활성 에나멜 물질의 방출 시점 및/또는 방출되는 정도에 대한 조절을 제공하는 기법을 사용하여 박리 가능하게 혼입, 부착 및/또는 둘러싸일 수 있다. 상기 배합물은 예를 들면 조절된 방출 비이클로서 중합체 매트릭스를 사용하여 조직 복구를 위하여 직접 또는 간접적으로 사용할 수 있다.
본 발명 이전에 기재된 활성 에나멜 물질을 포함하는 배합물은 예컨대 30 ㎎/㎖ 이상 농도의 상기 활성 에나멜 물질과 같이, 본 명세서에서 계획중인 농도보다 실질적으로 더 높은 농도에서 가장 통상적으로 투여된다. 또한, 5 ㎎ 단백질/㎖ 이하를 포함하는 배합물은 실질적으로 통상의 PGA 겔에 배합되는 EMD에 대하여 실시예 1에서 보고한 바와 같이 업계에서는 불충분한 것으로 설정되어 왔다.
실시예에서 설득력 있게 입증된 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 중합체 매트릭스 및 활성 에나멜 물질을 포함하는 신규한 저 농도 배합물이 활성 에나멜 물질의 필수 농도를 1 ㎍/㎖ 내지 5 ㎎/㎖, 예컨대 100 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 내지 250 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 내지 150 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 내지 200 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖ 내지 50 ㎍/㎖ 또는 심지어는 그 미만으로 감소시킬 수 있다는 것을 입증할 수 있다.
본 발명에서 관련된 중합체 매트릭스는 전구체 분자를 중합체 망상구조(polymer network)에 이온, 공유 또는 이의 조합으로 가교시키거나 또는, 1 이상의 중합체 물질(들)의 팽윤에 의하여 또는 물리적 가교에 의하여, 예를 들면 상 또는 용해도 차이에 의한 엔드블록의 집합을 통하여 형성된 지점을 가교시켜 형성된다. 본 발명의 제1의 구체예에서, 상기 매트릭스는 매트릭스로의 세포의 성장, 내성장 및/또는 이동을 가능케 하기 위하여 충분한 중합체간 이격을 갖는 중합체를 형성한다. 통상적으로, 이와 같은 특정의 구체예에서, 가교된 중합체 매트릭스는 겔을 형성한다. 본 발명의 제2의 구체예에서, 상기 매트릭스는 매트릭스로의 세포의 내성장 및/또는 이동을 차단하며, 그리고 매트릭스의 내부로 활성 에나멜 물질을 제한하기에 충분히 좁은, 공극 크기가 좁은 중합체 망상구조를 형성한다. 또한, 또다른 구체예에서, 상기 제2의 구체예는 시간이 경과함에 따라 분해되어 매트릭스로의 세포의 성장, 내성장 및/또는 이동을 가능케 하기에 충분한 중합체간 이격을 포함할 수 있다.
본 발명의 전술한 2 가지의 특정 구체예는 활성 에나멜 물질의 저 농도 배합물의 의도한 용도에 따라, 상이한 특정의 목적으로 작용하며 그리하여 바람직하게 된다. 예를 들면, 의도한 용도가 상처의 감염을 방지하는, 보호하고자 하는 부위와의 상호작용으로부터 주위 연조직을 보호하는 생분해성 차단체를 제공하고자 하는 것일 경우 바람직할 수 있다. 또다른 예에서, 이와 같은 형태는 차단 기능이 예컨대 임플란트 베드 결함에서의 효과적인 골 재생을 위한 완전한 치유 시간 동안 추구될 경우 매우 바람직하다. 이와 같은 구체예는 막의 형태를 취할 수 있다. 또한, 이와 같은 바람직한 매트릭스는 예를 들면 효소 또는 가수분해성 분해를 위한 소정의 부위를 포함하도록 설계되어 결국 적시에 세포 침입성을 띠게 된다. 반대로, 예를 들면 세포감소 수술로부터 생성된 연조직 상처 또는 창강이 활성 에나멜 물질을 포함하는 저 농도 배합물로 채워질 경우, 세포성 내성장 및/또는 이동은 상기 상처의 치유에 이로우며, 그리하여 통상적으로 겔 배합물은 세포성 내성장 및/또는 이동을 가능케 하기에 충분히 큰 공극 크기를 갖는 것이 바람직하다. 다시, 통상의 PEG 겔은 항상 세포성 내성장 및/또는 이동을 가능케 하기에 충분히 큰 공극 크기로 출발하지는 않으나, 적시에, 예를 들면 세포성 내성장 및/또는 이동을 가능케 하기에 충분히 큰 공극 크기를 포함하도록 침입 또는 이웃한 세포에 의하여 또는 가수분해성 또는 기계적 분해에 의하여 방출된 효소의 효소 분해후 설계될 수 있다. 또한, 특정의 적용예에서, 상기 2 가지의 특정 형태는 서로 번갈아 사용하거나 또는 함께 사용할 수 있다.
한 구체예에서, 중합체 매트릭스는 단백질, 바람직하게는 중합체 매트릭스를 이에 이식하고자 하는 환자에게서 천연으로 존재하는 단백질로 이루어진다. 기타의 단백질, 예컨대 콜라겐 및 젤라틴으로 생성된 중합체 매트릭스를 사용할 수도 있으나, 특히 바람직한 천연 중합체 매트릭스 단백질은 피브린이다, 또한, 다당류 및 당단백질을 사용하여 중합체 매트릭스를 형성할 수 있다.
또다른 바람직한 구체예에서, 합성 중합체는 이온 또는 공유 또는 물리적 결합에 의하여 가교되는 중합체 매트릭스를 형성하는데 사용된다.
중합체 매트릭스 물질은 천연으로 존재하는 효소에 의하여 또는 가수분해에 의하여 생분해성인 것이 바람직하다. 또한, 분해 속도는 중합체 매트릭스중에서의 프로테아제 억제제의 함유 및 가교 정도에 의하여 조절될 수 있다. 분해성 부위는 매트릭스로부터의 활성 에나멜 물질의 더욱 특이적인 방출을 가능케 한다. 예를 들면, 효소 활성에 기초한 분해는 겔을 통한 활성 에나멜 물질의 확산에 의하여서보다는 활성 에나멜 물질의 방출이 세포성 과정, 예컨대 국소 단백분해에 의하여 조절되도록 한다. 분해성 부위 또는 결합은 중합체 매트릭스를 침입하는 또는 이를 둘러싸는 세포로부터 방출된 효소에 의하여 분해된다. 이는 활성 에나멜 물질이 물질의 내부에서/이웃한 세포의 위치에 따라 동일한 물질내에서 상이한 속도로 방출되도록 한다.
세포 특이성 단백분해성 활성은 예를 들면 장시간에 걸쳐서 발생하는 상기와 같은 적용에서 중요하다. 본 명세서에서 설명한 바와 같이 활성 에나멜 물질의 조절된 방출은 필요한 총 활성 에나멜 물질의 함량을 효과적으로 감소시키는데, 이는 방출이 세포성 과정에 의하여 조절되기 때문이다. 활성 에나멜 물질 및 이의 생체이용율의 보존은 초기의 파열 방출에서 상당량의 활성 에나멜 물질의 손실을 초래하는 것을 특징으로 하는 확산 조절된 방출 장치를 사용하는 것에 비하여 세포 특이성 단백분해성 활성을 나타내는 뚜렷한 잇점을 갖는다.
상세한 개시
활성 에나멜 물질
에나멜 매트릭스는 에나멜의 전구체로서, 임의의 관련 천연 공급원, 예컨대 치아가 발육중인 포유동물로부터 얻을 수 있다. 적절한 공급원은 도살된 동물, 예컨대 송아지, 돼지 또는 양으로부터의 발육중인 치아이다. 또다른 공급원의 예로는 물고기 피부가 있다. 본 명세서에서, 용어 "활성 에나멜 물질"은 공급원을 구별하지 않고 에나멜 매트릭스, 에나멜 매트릭스 유도체 및/또는 에나멜 매트릭스 단백질을 포괄하여 의미하는 것으로 사용된다.
에나멜 매트릭스는 이전에 기재된 바와 같이(EP-B-0 337 967 및 EP-B-0 263 086) 발육중인 치아로부터 생성될 수 있다. 에나멜 매트릭스를 긁어내고, 수용액, 예컨대 완충액, 묽은 산 또는 염기 또는 물/용매 혼합물로 추출한 후, 크기 배제, 탈염 또는 기타의 정제 단계를 실시하고, 대안으로 동결 건조를 실시하여 에나멜 메트릭스 유도체를 제조한다. 또한, 효소는 열 또는 용매로 처리하여 탈활성화시킬 수 있으며, 이 경우 유도체는 동결 건조 없이 액체 형태로 보관할 수 있다.
에나멜 매트릭스 유도체 또는 단백질의 또다른 공급원으로서, 당업자에게 공지된 일반적으로 적용 가능한 합성 경로를 사용할 수 있거나 또는, DNA 기법에 의하여 변형된 배양한 진핵 및/또는 원핵 세포를 사용할 수 있다. 에나멜 매트릭스 단백질은 재조합 및/또는 합성 기원의 것이 될 수 있다(예를 들면, Sambrook, J. et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 참조).
그래서, 본 발명의 한 구체예는 화학적으로 변형 가능한 활성 에나멜 물질의 군으로부터 선택된 1 이상의 재조합 또는 합성 단백질 및 중합체 매트릭스를 포함하는, 활성 에나멜 물질의 투여를 위한 약학적 및/또는 치료적 배합물에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 단백질은 상기 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 위치하는 1 이상의 시스테인 잔기를 포함한다.
본 명세서에서, 에나멜 매트릭스 유도체는 교호 스플라이싱 또는 처리에 의하여 또는, 천연 길이 단백질의 효소 또는 화학적 분해에 의하여 또는 시험관내 또는 생체내 폴리펩티드의 합성에 의하여(예를 들면 재조합 DNA 방법 및/또는 이배수체 세포의 배양) 천연 생성되는 하나의 또는 다수의 에나멜 매트릭스 단백질 또는, 상기 단백질의 일부분 또는 분절을 포함하는 에나멜 매트릭스의 유도체이다. 또한, 에나멜 매트릭스 단백질 유도체는 에나멜 매트릭스 관련 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 폴리펩티드 또는 단백질은 적절한 생분해성 담체 분자, 예컨대 폴리아민 산 또는 다당류 또는 이의 조합에 결합될 수 있다. 또한, 용어 에나멜 매트릭스 유도체는 합성 유사 물질도 포함한다.
단백질은 펩티드 결합에 의하여 함께 결합된 아미노산 잔기로 이루어진 생물학적 거대분자이다. 또한 아미노산의 직쇄형 중합체로서의 단백질은 폴리펩티드로 지칭된다. 통상적으로, 단백질은 50 내지 800 개의 아미노산 잔기를 지녀서, 분자량이 약 6,000 내지 약 수십만 달톤 이상의 범위가 될 수 있다. 작은 단백질은 펩티드 또는 올리고펩티드로 지칭한다.
에나멜 매트릭스 단백질은 에나멜 매트릭스에 통상적으로 존재하는 단백질, 즉 에나멜에 대한 전구체(Ten Cate: Oral Histology, 1994; Robinson: Eur. J. Oral Science, Jan. 1998, 106 Suppl. 1:282-91) 또는, 단백질, 상기 단백질의 분해에 의하여 얻을 수 있는 상기 단백질의 펩티드 또는 분절이다. 일반적으로, 상기의 단백질은 분자량이 120,000 달톤 이하이며, 아멜로게닌, 비-아멜로게닌, 프롤린-풍부 비-아멜로게닌 및 터프텔린(tuftelin)을 포함한다.
본 발명에 의하여 사용하기 위한 단백질의 예로는 아멜로게닌, 프롤린-풍부 비-아멜로게닌, 터프텔린, 터프트 단백질, 혈청 단백질, 타액 단백질, 아멜로블라스틴, 씨슬린(seathlin), 이의 분절 및 유도체 및 이의 혼합물 등이 있다. 또한, 본 발명에 의하여 사용하기 위한 활성 에나멜 물질을 포함하는 제제는 전술한 단백질성 물질 중 2 이상을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 사용하기 위한 기타의 단백질은 시판품 EMDOGAIN(등록상표)(스웨덴에 소재하는 바이오라 아베(BIORA AB))에 존재한다.
당업계에서 공지된 에나멜 매트릭스 유도체인 EMDOGAIN(등록상표)(스웨덴 에스-205 12 말뫼에 소재하는 바이오라 아베)은 단백질 및 비이클을 별도로 테스트하지 않을 경우, 적용 이전에 혼합하는, 비이클 용액(프로필렌 글리콜 알기네이트) 1 ㎖당 잔류 프로테아제를 불활성화시키기 위하여 3 시간 동안 약 80℃에서 가열한 30 ㎎의 에나멜 매트릭스 단백질을 포함한다. 각각 20, 14 및 5 kDa에서의 주요 단백질 피이크 사이에서의 중량비는 약 80/8/12이다.
일반적으로, 에나멜 매트릭스의 주요 단백질은 아멜로게닌으로서 공지되어 있다. 이들은 약 90% w/w의 매트릭스 단백질로 이루어져 있다. 나머지 10% w/w는 프롤린-풍부 비-아멜로게닌, 터프텔린, 터프트 단백질, 혈청 단백질 및 1 이상의 타액 단백질을 포함하나, 기타의 단백질, 예컨대 에나멜 매트릭스와 결합된 것으로 밝혀진 아멜린(아멜로블라스틴, 씨슬린)이 존재할 수 있다. 또한, 다양한 단백질은 여러 가지 상이한 크기(즉, 상이한 분자량)으로 합성 및/또는 처리될 수 있다. 그래서, 에나멜 매트릭스에서의 주된 단백질인 아멜로게닌은 함께 초분자 응집체를 형성하는 여러 개의 상이한 크기로 존재하는 것으로 밝혀졌다. 이들은 특히 생리적 조건하에서 응집체를 형성하는 소수성 물질이다. 이들은 기타의 단백질 또는 펩티드를 지닐 수 있거나 또는 담체가 될 수 있다. 응집체의 크기는 약 10 ㎚ 내지 100 ㎛, 100 ㎚ 내지 10 ㎛ 또는 50 ㎚ 내지 1 ㎛, 종종 이보다 더 크며, 예컨대 100 ㎚ 내지 100 ㎛, 20 ㎚ 내지 100 ㎛, 25 ㎚ 내지 100 ㎛, 50 ㎚ 내지 100 ㎛, 10 내지 100 ㎚, 10 내지 25 ㎚, 100 내지 50 ㎚, 20 내지 30 ㎚, 20 내지 50 ㎚, 20 내지 60 ㎚, 25 내지 45 ㎚, 25 ㎚ 내지 50 ㎚, 25 ㎚ 내지 75 ㎚, 50 ㎚ 내지 75 ㎚ 등의 평균 크기를 포함하여 다양할 수 있다. 일반적으로, 응집체의 크기는 소정의 용액/매트릭스중의 단백질, 펩티드 및/또는 분절의 농도 및, 매트릭스중의 기타의 물질의 존재에 따라 다양할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 바람직한 구체예는 아멜로게닌 및/또는 적어도 아멜로게닌의 분절 및/또는 서브분절을 포함하는 약학적, 화장품학적 및/또는 치료적 배합물에 관한 것이다.
또다른 바람직한 구체예는 전전구 아멜로게닌을 포함하는 약학적 및/또는 치료적 배합물에 관한 것이다.
또한, 기타의 단백질/폴리펩티드 물질은 본 발명에 의하여 사용하기에 적절한 것으로 간주한다. 이의 예로는 단백질 또는 단백질의 분절, 예컨대 프롤린-풍부 단백질 및 폴리프롤린 등이 있다.
본 발명에 의하여 사용하기에 적절한 것으로 간주하는 물질의 기타의 예로는 상기 단백질, 에나멜 매트릭스 유도체 및/또는 에나멜 매트릭스 단백질의 응집체뿐 아니라, 에나멜 매트릭스, 에나멜 매트릭스 유도체 및 에나멜 매트릭스 단백질의 대사산물 등이 있다. 상기 대사산물은 단백질의 크기로부터 짧은 펩티드의 크기까지 임의의 크기를 지닐 수 있다.
본 발명과 관련된 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 및/또는 이의 서브분절은 실질적으로 분리되거나 또는 정제된 형태가 될 수 있다. 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 및/또는 이의 서브분절은 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 및/또는 이의 서브분절의 의도한 목적을 방해하지 않으며 실질적으로 분리된 것으로 간주하는 담체 또는 희석제와 혼합될 수 있는 것으로 이해하여야 한다. 이와 같은 실질적으로 정제된 형태는 일반적으로 제제중의 단백질의 90% 초과, 예를 들면 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 본 발명의 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 및/또는 분절인, 제제중의 단백질, 펩티드 및/또는 이의 분절을 포함한다.
또한, 본 발명에 의한 활성 에나멜 물질의 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 및/또는 서브분절의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한, 예컨대 적어도 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 임의의 아미노산 서열은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 간주한다.
기준 아미노산 서열에 대하여 적어도, 예를 들면 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 및/또는 이의 분절은, 아미노산 서열이 기준 아미노산 서열의 아미노산 100 개당 5 개의 이하의 점 돌연변이(point mutations)를 포함할 수 있는 것을 제외하고, 예를 들면 폴리펩티드의 아미노산 서열이 기준 서열에 대하여 동일하다는 것을 의미하고자 한다. 환언하면, 기준 아미노산 서열에 대하여 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 얻기 위하여, 기준 서열에서의 5% 이하의 아미노산은 결실되어 있거나 또는 또다른 아미노산으로 치환될 수 있으며, 기준 서열에서의 전체 아미노산의 5% 이하의 다수의 아미노산은 기준 서열로 삽입될 수 있다. 이들 기준 서열의 돌연변이는 기준 서열에서 1 이상의 근접한 기 또는 기준 서열에서의 아미노산에서 개별적으로 산재된 말단 위치 사이의 어느 것에서나 또는 기준 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복시 말단 위치에서 발생할 수 있다.
본 발명에서, 동일성을 결정하는데는 국소 알고리즘 프로그램이 가장 적합하다. 국소 알고리즘 프로그램(예컨대, Smith-Waterman)은 하나의 서열에서의 서브서열을 제2의 서열에서의 서브서열과 비교하고, 이들 서브서열의 조합 및 서브서열의 정렬을 찾아 가장 높은 전체 유사성 등급을 산출한다. 내부 갭은, 허용될 경우, 벌점을 가한다. 국소 알고리즘은 단일의 도메인 또는 단지 공통의 결합 부위를 갖는 2 개의 멀티도메인 단백질을 비교하기 위하여 잘 작동한다.
동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공공연하게 입수 가능한 프로그램으로 코드화되어 있다. 2 개의 서열 사이의 동일성 및 유사성을 결정하는데 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법의 예로는 GCG 프로그램 팩키지[Devereux, J. et al (1994)) BLASTP, BLASTN 및 FASTA (Altschul, S. F. et al (1990)] 등이 있으나, 이에 한정되지는 않는다. BLASTX 프로그램은 NCBI 및 기타의 자료[BLAST Manual, Altschul, S. F. et al, Altschul, S. F. et al (1990)]로부터 공공연하게 입수 가능하다. 각각의 서열 분석 프로그램은 디폴트 스코어 매트릭스 및 디폴트 갭 벌점을 갖는다. 일반적으로, 분자생물학자들은 사용한 소프트웨어 프로그램에 의하여 설정되는 디폴트 설정을 사용할 것으로 예상된다.
에나멜 매트릭스의 단백질은 고 분자량 부분 및 저 분자량 부분으로 나뉠 수 있으며, 에나멜 매트릭스 단백질의 잘 정의된 일부는 치주 결함(periodontal defect)(즉, 치주 상처)의 치료에 대한 중요한 성질을 지니는 것으로 밝혀졌다. 이러한 부분은 일반적으로 아멜로게닌으로 지칭되는 아세트산 추출성 단백질을 포함하며, 에나멜 매트릭스의 저 분자량 부분을 이룬다(참조 EP-B-0 337 967 및 EP-B-0 263 086).
에나멜 매트릭스의 저 분자량 부분은 치주 결함에서의 경조직 사이의 결합을 유도하기에 적절한 활성을 갖는다. 그러나, 본 명세서에서, 활성 단백질을 에나멜 매트릭스의 저 분자량 부분으로 한정하지는 않는다. 현재, 바람직한 단백질의 예로는 에나멜 매트릭스 단백질, 예컨대 아멜로게닌, 터프텔린 등이 있으며, 이의 분자량(SDS-PAGE를 사용하여 시험관내에서 측정함)은 약 60,000 달톤 이하이지만, 분자량이 60,000 달톤 이상인 단백질은 예를 들면 결합 조직 성장을 돕기 위한 대안으로서 유망한 성질을 갖는다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 의하여 사용하기 위한 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드는 통상적으로 분자량이 SDS PAGE 전기영동법에 의하여 측정시 기껏해야 약 120 kDa, 예컨대 기껏해야 100 kDa, 90 kDa, 80 kDa, 70 kDa 또는 60 kDa이다.
또한, 본 발명에 의하여 사용하기 위한 활성 에나멜 물질의 제제는 상이한 분자량을 갖는 활성 에나멜 물질의 혼합물을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명에 의하여 사용하기 위한 활성 에나멜 물질은 분자량이 약 40,000 이하, 예컨대 약 5,000 내지 약 25,000인 것으로 간주한다.
단백질을 예를 들면 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 정제용 전기영동법, 겔 투과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피에 의하여 분리하여 상이한 분자량을 갖는 아멜로게닌을 정제할 수 있다.
분자량 아멜로게닌의 조합은 주요한 20 kDa 화합물 내지는 40 내지 5 kDa의 다수의 상이한 분자량을 갖는 아멜로게닌의 응집체 그리고 주요한 5 kDa 화합물에 이르기까지 다양하다. 에나멜 매트릭스에서 통상적으로 존재하는 기타의 에나멜 매트릭스 단백질, 예컨대 터프텔린 또는 단백분해성 효소를 첨가하고, 아멜로게닌 응집체에 의하여 담지될 수 있다.
일반적으로, 에나멜 매트릭스, 에나멜 매트릭스 유도체 및 에나멜 매트릭스 단백질은 특히 증가된 온도에서, 즉 물중에서 덜 가용성인 소수성 물질이다. 통상적으로, 이들 단백질은 비-생리적 pH 수치에서 그리고 저온, 예컨대 4℃ 내지 20℃에서 가용성이면서 이들은 체온(35℃ 내지 37℃) 및 중성 pH에서 응집 및 침전된다.
특히 바람직한 구체예에서, 본 발명에 의하여 사용하기 위한 활성 에나멜 물질의 저 농도 배합물은 적어도 부분적으로 응집되며 및/또는 생체내 적용후 응집체를 형성할 수 있는 활성 에나멜 물질을 포함한다. 상기 응집체의 입자 크기는 약 200 ㎛ 내지 약 10 ㎚, 예컨대 100 ㎛ 내지 10 ㎚, 10 ㎛ 내지 100 ㎚, 1 ㎛ 내지 20 ㎚, 1 ㎛ 내지 10 ㎚, 5 ㎛ 내지 10 ㎚, 10 ㎛ 내지 1 ㎚, 100 ㎛ 내지 10 ㎚, 100 ㎛ 내지 1 ㎚, 1 ㎛ 내지 1 ㎚, 1 ㎛ 내지 5 ㎚, 1 ㎛ 내지 15 ㎚이다.
본 발명에 관한 중합체 매트릭스는 중합체 망상구조로 전구체 분자를 가교시켜 형성되기 때문에, 상기 매트릭스는 매트릭스의 내부에서 활성 에나멜 물질의 응집체를 가두기에 충분히 좁은 중합체간 이격을 갖는 중합체 망상구조를 형성할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 충분히 좁은 공극 크기를 갖는 상기 중합체 망상구조는 중성의 pH에서 및/또는 환자의 체내에서 전구체 분자의 적용후 동일계내에서(in-situ) 형성되도록 하여 활성 에나멜 물질의 응집 및/또는 침전을 자동적으로 일으키게 된다.
본 발명에 의하면, 활성 에나멜 물질은 기타의 활성 약물 물질, 예컨대, 항균제, 소염제, 항바이러스제, 항진균 물질 또는 국부 화학요법제와 함께 또는 세포소멸의 유도물질, 성장 인자, 예컨대, TGFβ, PDGF, IGF, FGF, EGF, 각질세포 성장 인자 또는 이의 펩티드 유사체와 조합하여 사용될 수 있다. 에나멜 매트릭스 또는 이의 제제중에 고유하게 존재하거나 또는 첨가한 효소는 에나멜 매트릭스, 에나멜 매트릭스 유도체 및/또는 에나멜 매트릭스 단백질, 특히 프로테아제와 조합하여 사용할 수 있다.
활성 에나멜 물질의 사용에 따라서, 조성물은 약학적 및/또는 치료적 또는 화장품학적 조성물이 될 수 있다. 하기의 용어 "약학적 및/또는 치료적 조성물"은 화장품학적 조성물뿐 아니라, 약학과 화장품학의 경계 영역인 코스메슈티컬에 속하는 조성물도 포함하고자 한다.
활성 에나멜 물질을 포함하는 약학적 및/또는 치료적 조성물은 약물 전달 시스템으로서 작용한다. 본 명세서에서, 용어 "약물 전달 시스템(drug delivery system)"은 투여시 사람 또는 동물의 신체에 활성 물질을 제공하는 약학적 및/또는 치료적 조성물(약학적 및/또는 치료적 배합물 또는 제형)을 지칭한다.
활성 에나멜 물질 및 중합체 매트릭스와 달리, 본 발명에 의하여 사용하기 위한 약학적 및/또는 치료적 조성물은 약학적 또는 화장품학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함한다.
약학적 또는 화장품학적으로 허용 가능한 부형제는 현재 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 실질적으로 유해하지 않은 물질로서 정의한다. 이러한 부형제는 국립 보건 당국에서 제시하는 요건을 정상적으로 수행한다. 공식 약전, 예컨대 영국 약전, 미국 약전 및 유럽 약전은 약학적으로 허용 가능한 부형제에 대한 기준을 정하고 있다.
본 발명에 의하여 사용하기 위한 조성물중의 약학적으로 허용 가능한 부형제(들) 및 이의 최적의 농도의 선택은 일반적으로 예상되지는 않으며, 최종 조성물의 실험 평가에 기초하여 결정하여야 한다. 그러나, 약학적 및/또는 치료적 배합 분야의 당업자는 예를 들어 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences", 18th Edition, Mack Publishing Company, Easton, 1990]에서 그 안내를 찾을 수 있을 것이다.
피브린 매트릭스
피브린은 여러 가지의 생물의학적 적용에 대하여 보고되어 온 천연 물질이다. 피브린은 미국 특허 제6,331,422호(Hubbell et al.)에서 세포 내성장 매트릭스에 대한 물질로서 설명되어 있다. 피브린 겔은 다수의 조직에 결합되는 능력 및 상처 치유에서의 천연의 역할로 인하여 실란트로서 사용되어 왔다. 특정의 적용예는 혈관 이식편 부착, 심장 판막 부착, 골절에서의 골 위치 결정 및 힘줄 복구를 위한 실란트로서의 용도를 포함한다(Sierra, D. H., Journal of Biomaterials Applications, 7:309-352 (1993)). 추가로, 이러한 겔은 약물 전달 장치로서 그리고 신경세포 재생을 위하여 사용되어 왔다(Williams, et al., Journal of Comparative Neurobiology, 264:284-290 (1987)).
피브리노겐을 피브린으로 중합시키는 과정도 특징으로 한다. 초기에, 프로테아제는 2 개의 대칭 부위에서 이량체 피브리노겐 분자를 분할시킨다. 트롬빈, 렙틸라제 및 프로테아제 III를 비롯한 피브리노겐을 분해시킬 수 있는 가능한 프로테아제가 여러 가지 존재하며, 이들 각각은 상이한 위치에서 단백질을 절단한다(Francis, et al., Blood Cells, 19:291-307, 1993). 일단 피브리노겐이 분해되면, 피브리노겐 단량체가 모여서 비공유 가교된 중합체 겔을 형성하는 자가 중합 단계가 발생한다(Sierra, 1993). 이와 같은 자가-어셈블리는 프로테아제 분해가 발생한 후 결합 부위가 노출되기 때문에 발생한다. 일단, 이들이 노출되면, 분자의 중심에서의 상기 결합 부위는 펩티드 쇄의 단부에 존재하는 피브리노겐 쇄에서 기타의 부위에 결합될 수 있다(Stryer, L. In Biochemistry, W. H. Freeman & Company, NY, 1975). 이와 같은 방식으로, 중합체 망상구조가 형성된다. 트롬빈 단백분해에 의하여 인자 XIII로부터 활성화된 인자 XIIIa, 트랜스글루타미나제는 중합체 망상구조를 공유 가교시킬 수 있다. 기타의 트랜스글루타미나제가 존재하며, 또한 피브린 망상구조로의 공유 가교 및 그래프팅에 포함될 수 있다.
일단 가교된 피브린 겔이 형성되면, 그 이후의 분해는 엄격하게 조절된다. 피브린의 분해를 조절하는데 있어서의 핵심 분자 중 하나는 α2-플라스민 억제제이다(Aoki, N., Progress in Cardiovascular Disease, 21:267-286, 1979). 이러한 분자는 인자 XIIIa의 작용을 통하여 피브린의 쇄에 가교되어 작용한다(Sakata, et al., Journal of Clinical Investigation, 65:290-297, 1980). 겔에 그 자체가 부착됨으로써, 고 농도의 억제제는 겔에 편재될 수 있다. 그후, 억제제는 플라스미노겐이 피브린에 결합되는 것을 방해하며(Aoki, et al., Thrombosis and Haemostasis, 39:22-31, 1978), 플라스민을 불활성화시켜(Aoki, 1979) 작용하게 된다. α2-플라스민 억제제는 글루타민 기질을 포함한다. 정확한 서열은 NQEQVSPL(서열 번호: 12)로 확인되었으며, 첫번째 글루타민은 가교를 위한 활성 아미노산이 된다.
인자 XIIIa 기질 서열 및 생활성 펩티드 서열을 포함하는 이중-도메인 펩티드는 피브린 겔로 가교될 수 있으며, 이러한 생활성 펩티드는 이의 시험관내 세포성 활성을 보유하는 것으로 입증되었다(Schense, J. C., et al. (1999) Bioconj. Chem. 10:75-81).
그래서, 본 발명의 바람직한 약학적 및/또는 치료적 배합물은 세포성 성장 또는 내성장에 적절하거나 또는 세포-폐색성인 중합체 매트릭스 및, 활성 에나멜 물질의 군으로부터 선택된 1 이상의 단백질을 포함하며, 상기 활성 에나멜 물질의 농도는 5 ㎎/㎖ 배합물 이하이며, 중합체 매트릭스는 피브린을 포함한다. 상기 약학적 및/또는 치료적 배합물에서, 본 발명에 의한 활성 에나멜 물질은 트랜스글루타미나제 기질 도메인, 예컨대 인자 XIIIa 기질 서열에 커플링될 수 있다.
이러한 인자 XIIIa 기질 서열은 예를 들면 GAKDV, KKKK 또는 NQEQVSPL을 포함한다. 활성 에나멜 물질 및 트랜스글루타미나제 기질 도메인 사이의 커플링은 화학적 합성에 의하여 실시될 수 있다.
또는, 트랜스글루타미나제 기질 도메인은 인자 XIIIa를 제외한 트랜스글루타미나제에 대한 기질이 될 수 있다. 가장 바람직한 인자 XIIIa 기질 도메인은 NQEQVSPL의 아미노산 서열을 갖지만, 트랜스글루타미나제가 인지하는 기타의 단백질, 예컨대 피브로넥틴은 트랜스글루타미나제 기질 펩티드에 커플링될 수 있다.
트랜스글루타미나제 기질 도메인
YRGDTIGEGQQHHLGG 피브리노겐 쇄에서 트랜스글루타미나제 커플링 부위에
글루타민을 갖는 펩티드
GAKDV 피브리노겐 쇄에서 리신 커플링 부위를 모방한 펩티드
KKKK 랜덤 커플링 부위에서 폴리리신을 갖는 펩티드
NQEQVSPL α2-플라스민 억제제(약어 TG)에서 가교 부위를
모방한 펩티드
합성 매트릭스
신체에 적용하기 위한 합성 매트릭스를 형성하기 위한 가교 반응은 (i) 문헌[Hem et al., J. Biomed. Mater. Res. 39:266-276 (1998)]에 기재된 바와 같이 불포화 이중 결합을 포함하는 2 이상의 전구체 사이에서의 자유 라디칼 중합, (ii) 미국 특허 제5,874,500호(Rhee et al.)에 개시된 바와 같이 아민 기를 포함하는 전구체와 숙신이미딜 기를 포함하는 전구체 사이의 친핵성 치환 반응, (iii) 축합 및 첨가 반응 및 (iv) 강한 친핵체와 공액 불포화 기 또는 결합(강한 친전자체로서) 사이의 마이클(Michael) 유형 첨가 반응을 포함한다. 친핵성 기로서 티올 또는 아민 기를 갖는 전구체 분자와 친전자성 기로서 아크릴레이트 또는 비닐 설폰 기를 포함하는 전구체 분자 사이의 반응이 특히 바람직하다. 친핵성 기로서 티올 기가 가장 바람직하다. 마이클 유형 첨가 반응은 WO 00/44808호(Hubbell et al.)에 기재되어 있다. 마이클 유형 첨가 반응은, 민감한 생물학적 물질의 존재하에서조차도, 자가-선택적 방법으로 생리적 조건하에서 적어도 제1의 및 제2의 전구체 성분의 동일계내 가교를 가능케 한다. 전구체 성분 중 하나가 2 이상의 작용기를 갖고, 다른 전구체 성분 중 1 이상이 2 초과의 작용기를 갖는 경우, 시스템은 자가-선택적으로 반응하여 가교된 3차원 생체물질을 형성하게 된다.
결론적으로, 본 발명의 한 구체예는 세포성 성장, 내성장 및/또는 이동에 적절하거나 또는 세포-폐색성인 중합체 매트릭스 및 활성 에나멜 물질을 포함하는, 활성 에나멜 물질의 투여를 위한 약학적 및/또는 치료적 배합물에 관한 것이며, 상기 매트릭스는 강한 친핵체와 공액 불포화 결합 또는 공액 불포화 기 사이의 친핵성 첨가 반응에 의하여 형성된다.
공액 불포화 기 또는 공액 불포화 결합은 아크릴레이트, 비닐설폰, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 아크릴로니트릴, 비닐설폰, 2- 또는 4-비닐피리디늄, 말레이미드 또는 퀴논인 것이 바람직하다.
친핵성 기는 티올 기, 아미노 기 또는 히드록실 기가 바람직하다. 티올 기는 실질적으로 비보호 아민 기보다 활성이 더 크다. pH는 탈양성자화 티올이 실질적으로 양성자화 티올보다 반응성이 더 크다는 점에서 중요하다. 2 개의 전구체 성분을 중합체 매트릭스로 전환시키기 위하여 티올을 사용한 공액 불포화, 예컨대 아크릴레이트 또는 퀴논을 포함한 첨가 반응은 종종 약 8의 pH에서 가장 신속하게 자가-선택적으로 수행된다. 약 8의 pH에서, 유의적인 수의 해당 티올은 탈양성자화되며(그리하여 반응성이 더욱 커짐), 대부분의 해당 아민은 여전히 양성자화된다(그리하여 반응성이 더 적어짐). 티올을 제1의 전구체 분자로서 사용할 경우, 아민에 대하여 반응성을 갖는 티올에 대한 이의 반응성에서 선택적인 공액 구조체가 매우 바람직하다.
적절한 제1의 및 제2의 전구체 분자의 예로는 단백질, 펩티드, 폴리옥시알킬렌, 폴리(비닐 알콜), 폴리(에틸렌-코-비닐 알콜), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-아크릴산), 폴리(에틸옥사졸린), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(에틸렌-코-비닐 피롤리돈), 폴리(말레산), 폴리(에틸렌-코-말레산), 폴리(아크릴아미드) 및 폴리(에틸렌 옥시드)-코-d(프로필렌 옥시드) 블록 공중합체 등이 있다. 특히 바람직한 전구체 분자는 폴리에틸렌 글리콜이다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 편리한 빌딩 블록을 제공한다. 이는 구입이 용이하거나 또는, 직쇄형(말단이 2 개임을 의미함) 또는 분지쇄형(말단이 2 개 초과임을 의미함) PEG를 합성하고, PEG 말단 기를 작용화시켜 강한 친핵체, 예컨대 티올 또는 공액 구조체, 예컨대 아크릴레이트 또는 비닐설폰을 도입한다. 이들 성분을 서로 혼합하거나 또는 약간 염기성인 환경에서 해당 성분과 혼합할 경우, 매트릭스는 제1의 및 제2의 전구체 성분 사이의 반응에 의하여 형성된다. PEG 성분은 비-PEG 성분과 반응할 수 있으며, 이들 성분의 분자량 또는 친수성을 조절하여 생성된 생체물질의 물성, 투과성 및 수분 함량을 조절할 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예는 세포성 내성장 및/또는 이동에 적절할 수 있거나 또는 세포-폐색성일 수 있는 중합체 매트릭스 및 활성 에나멜 물질을 포함하며, 상기 활성 에나멜 물질의 농도는 5 ㎎/㎖ 배합물 미만이며, 상기 매트릭스는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는, 활성 에나멜 물질을 투입하기 위한 약학적 및/또는 치료적 배합물에 관한 것이다.
예로서, 2 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 펩티드를 직접 합성하며, 이러한 성분은 친핵성 기를 갖는 제1의 전구체 성분으로서 용이하게 작용할 수 있다. 예를 들면, 생리학적 또는 약간 높은 pH (예, 8 내지 9)에서 PEG 트리-비닐설폰(각각의 아암에 비닐설폰을 갖는 3 개의 아암을 갖는 PEG)와 혼합할 경우, 2 개의 유리 시스테인 잔기를 갖는 펩티드는 용이하게 매트릭스를 형성한다. 또한, 겔화는 훨씬 더 높은 pH에서 잘 진행되지만, 잠재적으로 자가-선택성을 희생하게 된다. 2 개의 액체 전구체 성분, 즉 용해된 전구체 성분을 함께 혼합할 경우, 이들은 망상구조의 노드를 포함하는 PEG 쇄의 망상구조로 이루어진 탄성 겔을 형성하기 위하여 수 초 내지는 수 분간 결합 링크로서 펩티드와 반응한다. 펩티드는, 단백질계 망상구조, 예컨대 피브린 매트릭스에서 실시되기 때문에 세포에 의하여 침윤 및 분해될 수 있는 망상구조를 생성하도록, 프로테아제 기질로서 선택될 수 있다. 적절한 도메인이 이들 서열에 한정되지는 않을지라도, 도메인에서의 서열은 세포 이동에 관여하는 효소에 대한 기질(예, 효소, 예컨대 콜라게나제, 플라스민, 금속단백분해효소(MMP) 또는 엘라스타제에 대한 기질로서)인 것이 바람직하다. 특히 유용한 서열은 효소 플라스민에 대한 기질이다. 겔의 분해 특성은 가교 노드로서 작용하는 펩티드의 세부 사항을 변경하여 조절할 수 있다. 플라스민이 아닌 콜라게나제에 의하여 또는, 콜라게나제가 아닌 플라스민에 의하여 분해 가능한 겔을 생성할 수 있다. 또한, 효소 반응의 Km 또는 kcat 또는 모두를 변경시키도록 아미노산 서열을 단순히 변경시켜 상기 겔이 상기의 효소에 반응하여 더 빠르게 또는 더 느리게 겔을 분해시킬 수 있다. 그러므로, 세포의 정상적인 리모델링에 의하여 리모델링이 가능한, 즉 중요한 프로테아제 플라스민에 대한 기질 부위를 나타내는 생물학적 모방성을 갖는 생체물질을 생성할 수 있다. 펩티드를 사용한 PEG의 겔화는 자가-선택성이다.
임의로, 생체작용성 제제는 매트릭스에 혼입되어 기타의 종(예, 조직 표면)에 화학적 결합을 제공할 수 있다. 매트릭스를 PEG 비닐설폰으로부터 형성할 경우 프로테아제 기질이 매트릭스에 도입되는 것이 중요하다. PEG 아크릴레이트 및 PEG 티올의 반응으로부터 형성된 매트릭스를 제외하고, PEG 비닐설폰 및 PEG 티올로부터 형성된 매트릭스는 가수분해성 분해성 결합을 포함하지 않는다. 그러므로, 프로테아제 기질의 도입은 매트릭스가 체내에서 분해되도록 한다.
합성 매트릭스는 조작상 형성하는 것이 단순하다. 2 개의 액체 전구체를 혼합하고, 하나의 전구체는 친핵성기를 갖는 전구체 분자를 포함하며, 다른 전구체 분자는 친전자성 기를 포함한다. 생리학적 염수는 용매로서 작용할 수 있다. 반응에 의하여 최소의 열이 발생한다. 그러므로, 겔화는 바람직하지 못한 독성 없이 조직과의 직접 접촉시 생체내 또는 시험관내에서 실시될 수 있다. 그래서, 텔레켈리컬 방식으로(telechelically) 변형되거나 또는 이의 측쇄 기에서 변형된 PEG를 제외한 중합체를 사용할 수 있다.
결과적으로, 본 발명은 중합체 매트릭스 및 활성 에나멜 물질을 포함하는, 활성 에나멜 물질의 투여를 위한 약학적 및/또는 치료적 배합물에 관한 것이며, 상기 활성 에나멜 물질의 농도는 5 ㎎/㎖ 배합물 미만이며, 상기 매트릭스는 예비형성되거나 또는 상기 매트릭스는 동일계내 형성된다.
본 발명의 한 특정의 구체예서, PEG 매트릭스의 외부 셸 및, 응집된 활성 에나멜 물질을 포함하는 내부 코어를 갖는 마이크로캡슐이 형성된다. PEG 및 활성 에나멜 물질을 포함하는 혼합물중의 PEG의 중합중에 pH 5 내지 pH 9.5 범위내의 pH를 사용할 경우 마이크로캡슐이 형성된다. 마이크로캡슐 셸은 활성 에나멜 물질의 응집체를 둘러싸는 중합된 PEG로 이루어진다. 활성 에나멜 물질의 응집체는 중합에 사용된 pH 5 내지 pH 9.5 범위내의 pH에 의하여 형성된다. 활성 에나멜 물질의 응집체는 너무 커서 PEG 매트릭스의 셸의 공극을 통과하지 못한다. 그리하여, 활성 에나멜 물질은 PEG 매트릭스 셸이 파손될 때까지 마이크로캡슐로부터 방출되지 않는다.
최대의 치유 표시의 경우, 매트릭스의 적절한 분해 속도와 조합된, 매트릭스로의 세포의 세포 내성장 또는 이동 속도는 전체 치유 반응에 대하여 중요하다. 세포에 의하여 침입되도록 하는 가수분해성 비-분해성 매트릭스의 가능성은 주로 망상구조 밀도에 따라 결정된다. 분지점 또는 노드 사이에 존재하는 공간이 세포의 크기에 대하여 너무 작은 경우 또는, 매트릭스의 분해 속도가 너무 느려서 매트릭스내의 더 많은 공간을 생성하게 되는 경우, 매우 제한된 치유 반응이 관찰된다. 체내에서 손상에 대한 반응으로서 형성되는 피브린 매트릭스와 같이 천연에 존재하는 치유 매트릭스는 세포에 의하여 매우 용이하게 침입될 수 있는 매우 느슨한 망상구조로 이루어지는 것으로 알려져 있다. 침윤은 피브린 망상구조의 통합된 부분인 세포 부착을 위한 리간드에 의하여 촉진된다.
폴리에텐 글리콜과 같이 합성 친수성 전구체 분자로부터 생성된 매트릭스는 중합체 망상구조의 형성후 수성 환경에서 팽윤된다. 충분히 짧은 겔화 시간(7 내지 8 사이의 pH 및 36℃ 내지 38℃의 온도에서 3 내지 10 분간) 및 체내에서의 매트릭스의 동일계내 형성중의 정량적 반응을 달성하기 위하여, 전구체 분자의 출발 농도는 충분히 높아야만 한다. 이러한 조건하에서, 필수 출발 농도는, 매트릭스가 수성 환경에서 분해성이 아닌 경우 세포 침윤에 대하여 너무 조밀한 매트릭스를 생성하게 된다. 그리하여, 중합체 망상구조의 팽윤은 분지점 사이의 공간을 증대 및 확대시키는데 중요하다.
전구체 분자의 출발 농도와는 무관하게, 동일한 합성 전구체 분자, 예컨대 4 개의 아암 PEG 비닐설폰 및, SH 기를 갖는 펩티드로부터 생성된 히드로겔은 평형 상태에서 동일한 수분 함량으로 팽윤된다. 이는 평형 상태에 도달하였을 경우, 전구체 분자의 출발 농도가 높을수록, 히드로겔의 최종 부피가 더 커지게 된다는 것을 의미한다. 체내에서의 이용 가능한 공간이 너무 작아서 충분한 팽윤이 불가능할 경우, 특히 전구체 성분으로부터 형성된 결합이 가수분해성 분해성을 갖지 않는 경우, 세포 침윤 및 치유 반응의 속도는 감소하게 된다. 그 결과로서, 체내에서의 적용을 위한 2 가지의 상반된 요건 사이의 최적의 조건을 찾아야만 한다. 우수한 세포 침윤 및 그 이후의 치유 반응은 실질적으로 분자량이 유사한 3 개 이상의 아암을 갖는 3작용성 분지 중합체 및, 적어도 2작용성 분자인 제2의 전구체 분자의 반응으로부터 형성된 3차원 중합체 망상구조를 사용하여 관찰된다. 제1의 및 제2의 전구체 분자의 작용성 기의 당량의 비는 0.9 내지 1.1이다. 제1의 전구체 분자의 아암의 분자량, 제2의 전구체 분자의 분자량 및 분지점의 작용성은, 생성된 중합체 망상구조의 수분 함량이 평형 중량% 내지, 수분 흡수 완료후 중합체 망상구조의 총 중량의 92 중량% 사이가 되도록 선택한다. 수분 함량은 수분 흡수 완료후 중합체 망상구조 및 물의 총 중량의 93 내지 95 중량%인 것이 바람직하다. 수분 흡수의 완료는 평형 농도가 도달될 때 또는 생체물질내의 이용 가능한 공간이 추가의 부피 증가가 가능하지 않은 경우 달성될 수 있다. 그러므로, 전구체 성분의 출발 농도는 가능한 한 낮게 선택하는 것이 바람직하다. 이는 모든 팽윤성 매트릭스, 특히 세포 매개 분해 처리되고 중합체 망상구조내에서 가수분해성 분해성 결합을 포함하지 않는 매트릭스의 경우에 해당한다.
특히 가수분해성 비-분해성 겔의 경우 겔화 시간 및 낮은 출발 농도 사이의 균형은 전구체 분자의 구조에 기초하여 최적화되어야만 한다. 특히, 제1의 전구체 분자의 아암의 분자량, 제2의 전구체 분자의 분자량 및 분지도, 즉 분지점의 작용가는 이에 따라 조절되어야만 한다. 실제의 반응 기전은 이와 같은 상호작용에 최소의 영향을 미친다.
제1의 전구체 분자가 각각의 아암의 말단에서 작용기를 갖는 3 또는 4 개의 아암 중합체이며, 제2의 전구체 분자가 직쇄형 2작용성 분자, 바람직하게는 2 이상의 시스테인 기를 포함하는 펩티드인 경우, 제1의 전구체 분자의 아암의 분자량 및 제2의 전구체 분자의 분자량은 망상구조의 형성후 분지점 사이의 결합의 분자량이 10 내지 13 kDa(결합이 분지형이 아닌 직쇄형인 조건하에서), 바람직하게는 11 내지 12 kDa 범위내가 되도록 선택하는 것이 바람직하다. 이는 제1의 및 제2의 전구체 분자의 합의 출발 농도가 (망상구조 형성 이전에) 용액중의 제1의 및 제2의 전구체 분자의 총 중량의 8 내지 12 중량%, 바람직하게는 9 내지 10 중량% 범위내가 되도록 한다. 제1의 전구체 성분의 분지도가 8로 증가되고, 제2의 전구체 분자가 여전히 직쇄형 2작용성 분자인 경우, 가교점 사이의 결합의 분자량은 18 내지 24 kDa의 분자량으로 증가되는 것이 바람직하다. 제2의 전구체 분자의 분지도가 직쇄형으로부터 3 또는 4 개의 아암 전구체 성분으로 증가되는 경우, 분자량, 즉 결합의 길이는 이에 따라 증가된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 제1의 전구체 분자로서 3작용성 3 개의 아암 15 kDa 중합체, 즉 각각의 아암의 분자량이 5 kDa이고, 제2의 전구체 분자로서 2작용성 직쇄형 분자의 분자량이 0.5 내지 1.5 kDa, 더욱 바람직하게는 약 1 kDa인 조성물을 선택한다. 제1의 및 제2의 전구체 성분은 폴리에틸렌 글리콜인 것이 바람직하다.
또다른 바람직한 구체예에서, 제1의 전구체 성분은 작용성 기로서 공액 불포화 기 또는 결합, 가장 바람직하게는 아크릴레이트 또는 비닐설폰 기를 포함하며, 제2의 전구체 분자의 작용기로서 친핵성 기, 바람직하게는 티올 또는 아미노 기를 포함한다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예에서, 제1의 전구체 분자는 각각의 아암의 말단에서 작용성 기를 갖는 4 개의 아암 20 kDa(각각의 아암의 분자량 5 kDa) 중합체이며, 제2의 전구체 분자는 분자량이 1 내지 3 kDa, 바람직하게는 1.5 내지 2 kDa인 2작용성 직쇄형 분자이다. 바람직하게는 제1의 전구체 분자는 비닐설폰 기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜이고, 제2의 전구체 분자는 시스테인 기를 갖는 펩티드이다. 바람직한 구체예 모두에서, 제1의 및 제2의 전구체 분자의 합의 출발 농도는 10 분 이하의 겔화 시간을 도달하기 위하여 (중합체 망상구조의 형성 이전에) 제1의 및 제2의 전구체 분자 및 물의 총 중량의 8 내지 11 중량%, 바람직하게는 9 내지 10 중량%, 바람직하게는 5 내지 8 중량%이다. 이러한 조성물은 pH 8.0 및 37℃에서의 겔화 시간이 혼합후 약 1 내지 10 분, 예컨대 2 내지 10 분 또는 3 내지 10 분이다.
적절한 합성 겔의 예는 WO 03/052091에 기재되어 있다. 이의 한 예로는 서열 Gly-Cys-Arg-Asp-(Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Trp-Gly-Gln)-Asp-Arg-Cys-Gly의 4 개의 비닐설폰 말단 기 및 디티올 펩티드로 작용화된 4 개의 아암 분지 PEG로 형성된 효소 분해성 겔이다. WO 03/052091로부터의 또다른 예로는 아크릴레이트화 4 개의 아암 폴리에틸렌 글리콜(MW 15,000)을 직쇄형 폴리에틸렌 글리콜 디티올(MW 3400)과 혼합하여 Michael 타입 반응을 통하여 서로 공유 결합되어 형성된 가수분해성 분해성 겔이다.
매트릭스가 예를 들어 아크릴레이트 및 티올 사이의 바람직한 반응에 의하여 형성된 가수분해성 분해성 결합을 포함할 경우, 세포 침윤에 대한 망상구조 밀도는 특히 개시에서 중요하나, 수성 환경에서, 결합은 가수분해되며, 망상구조는 느슨하게 되어 세포 침윤이 가능케 된다. 중합체 망상구조의 총 분지도가 증가하면, 인터링크의 분자량, 즉 링크의 길이는 증가되어야만 한다.
본 발명의 특정의 구체예에서, 활성 에나멜 물질 및, 세포-폐색성인 중합체 매트릭스를 포함하는 저 농도 배합물은 물의 존재하에서 2 이상의 전구체의 반응에 의하여 얻는다. 상기 배합물은 예를 들면 "골 유도 재생술(GBR: Guided Bone Regeneration)"으로서 당업계에서 공지된 처치에서 이식 부위에서의 골 형성을 촉진시키는 것이 특히 바람직하다. 여기서, 비-골원성 연조직 세포가 부위로 들어가는 것을 방지하여 골수로부터의 세포가 채워지도록 하는 차단체에 의하여 주변 조직으로부터, 골 형성이 필요한 부위를 분리한다. 상기 막을 형성하는 본 발명에 의한 중합체 매트릭스는 2 이상의 전구체의 반응에 의하여 얻을 수 있으며, 여기서 전구체의 쇄의 이웃한 교차점은 10,000 개 미만의 원자, 예컨대 5,000, 1,000, 900, 800, 750 개 미만의 원자, 더욱 바람직하게는 670 개 미만의 원자, 예를 들면 250 내지 350 개의 원자, 예를 들면 300 개의 원자를 갖는 쇄에 의하여 결합된다.
상세하게는, 제1의 전구체는 공액 불포화 말단 기 또는 공액 불포화 말단 결합을 갖는 2 이상의 쇄를 갖는 코어를 포함한다. 상기 코어는 단일의 원자, 예컨대 탄소 또는 질소 원자 또는 소분자, 예컨대 에틸렌 옥시드 단위, 당, 다작용성 알콜, 예컨대 펜타에리트리톨, 글리세린 또는 올리고글리세린, 예컨대 헥사글리세린이 될 수 있다. 이들 쇄는 임의로 이종원자, 아미드 기 또는 에스테르 기를 포함하는 직쇄형 중합체 또는 직쇄형 또는 분지쇄형 알킬 쇄이다. 상기 쇄 이외에, 코어는 말단 공액 불포화 기 또는 결합을 갖지 않는 직쇄형 또는 분지쇄형 알킬 잔기 또는 중합체로 추가로 치환될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제1의 전구체는 2 내지 10 개의 쇄, 가장 바람직하게는, 2 내지 6 또는 4 내지 8 개의 쇄를 갖는다. 말단 공액 불포화 결합은 말레이미드, 아크릴레이트, 아크릴아미드, 퀴닌 및 2- 또는 4-비닐피리디늄인 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에서, 제1의 전구체는 2 내지 10 개의 쇄, 가장 바람직하게는 3 내지 8 개의 쇄, 예컨대 3 내지 6 개의 쇄를 갖는다.
제2의 전구체는 쇄의 말단에서 마지막 20 개의 탄소 원자중 임의의 것에 결합된 티올 기를 각각 갖는 2 이상의 쇄를 지니는 코어를 포함한다. 예를 들면, 시스테인 잔기를 쇄에 투입할 수 있다. 티올기는 말단에 위치하는 것이 바람직하다. 코어는 단일 원자, 예컨대 탄소 또는 질소 원자 또는 소분자, 예컨대 에틸렌 옥시드 단위, 당, 다작용성 알콜, 예컨대 펜타에리트리톨, 글리세린 또는 올리고글리세린, 예컨대 헥사글리세린이 될 수 있다. 쇄는 이종원자, 아미드 기 또는 에스테르 기를 임의로 포함하는 직쇄형 중합체 또는 직쇄형 또는 분지쇄형 알킬 쇄이다. 상기 쇄 이외에, 코어는 말단 공액 불포화 기 또는 결합을 갖지 않는 직쇄형 또는 분지쇄형 알킬 잔기 또는 중합체로 추가로 치환될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제2의 전구체는 2 내지 10 개의 쇄, 가장 바람직하게는 2 내지 6 개 또는 4 내지 8 개의 쇄를 갖는다. 바람직한 구체예에서, 제2의 전구체는 2 내지 10 개의 쇄, 가장 바람직하게는 3 내지 8 개의 쇄, 예컨대 3 내지 6 개의 쇄를 갖는다.
제1의 및 제2의 전구체의 쇄의 총합은 조밀한 3차원 망상구조를 얻기 위하여 5 이상, 예컨대 6 이상, 바람직하게는 8 이상이다.
전구체의 각각의 코어는 교차점을 형성한다. 이웃하는 교차점은 10,000 개 미만의 원자, 예컨대 5,000, 1,000, 900, 800, 750 개 미만의 원자 또는 더욱 바람직하게는 670 개 미만의 원자, 예를 들면 250 내지 350 개의 원자, 예를 들면 300 개의 원자를 갖는 쇄에 의하여 연결되며, 상기 원자는 쇄의 주쇄에 위치하는 원자만이 되며, 이는 치환체 또는 H 원자는 계수하지 않는다는 것을 의미한다. 2 개의 이웃한 교차점 사이의 원자의 수는 바람직하게는 약 330 개 미만의 원자, 가장 바람직하게는 30 내지 120 개의 원자이다. 즉, 생성된 3차원 망상구조의 메쉬는 세포의 치수(1 내지 100 ㎛)보다 더 작으며, 또한 중성의 pH에서 10 ㎚ 내지 100 ㎛가 될 수 있으며 이를 유지하는 활성 에나멜 물질에 의하여 형성된 응집체보다 수십배 정도 더 작다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 망상구조의 메쉬는 10 ㎚ 내지 10 ㎛이고, 즉 공극은 평균 1 ㎛ 이하, 예컨대 500 ㎚, 400 ㎚, 300 ㎚, 250 ㎚, 200 ㎚, 100 ㎚, 75 ㎚, 50 ㎚, 10 ㎚보다 작다. 공극의 바람직한 크기는 10 ㎛ 내지 10 ㎚, 예컨대 10 ㎛ 내지 100 ㎚, 1 ㎛ 내지 10 ㎚, 1 ㎛ 내지 100 ㎚, 500 ㎚ 내지 10 ㎚, 500 ㎚ 내지 250 ㎚, 50 ㎚ 내지 10 ㎚ 등이 되도록 선택한다.
중합체 매트릭스로의 활성 에나멜 물질의 혼입
본 발명의 또다른 바람직한 구체예는 중합체 매트릭스 및, 상기 매트릭스에 공유 또는 비공유 결합에 의하여 결합된 활성 에나멜 물질을 포함하는, 활성 에나멜 물질을 투여하기 위한 저 농도 약학적 및/또는 치료적 배합물에 관한 것이다. 특히, 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 서브분절이 될 수 있는, 상기 활성 에나멜 물질중의 1 이상의 시스테인 잔기를 매트릭스의 성분중 1 이상의 공액 불포화 기로의 친핵성 첨가 반응으로 인하여 상기 활성 에나멜 물질은 상기 매트릭스에 결합될 수 있으며, 상기 1 이상의 시스테인 잔기는 상기 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 서브분절의 C-말단 또는 N-말단에 위치한다. 이러한 구체예는 상기 중합체 매트릭스가 매트릭스로의 세포의 성장, 내성장 및/또는 이동이 가능하도록 하기에 충분한 중합체간 이격을 갖는 중합체 망상구조를 형성하는 경우 특히 바람직하다. 통상적으로, 이와 같은 특정의 구체예에서, 가교된 중합체 매트릭스는 겔을 형성한다.
그래서, 합성 전구체 성분로부터 형성된 매트릭스에 활성 에나멜 물질을 혼입하기 위하여, 혼입하고자 하는 활성 에나멜 물질 융합 펩티드 또는 임의의 기타의 펩티드는 합성될 수 있거나 또는 화학적으로 변형되어 가교 가능한 기질 도메인으로서 1 이상의 추가의 시스테인 기(-SH)를 포함할 수 있다. 그후, 유리 시스테인 기는 Michael 타입 첨가 반응에서 전구체 성분의 공액 불포화 기와 반응하게 된다. 시스테인의 티올 기는 합성 중합체상의 공액 불포화 결합과 반응하여 공유 결합을 형성한다.
한 구체예에서, 상기 활성 에나멜 물질은 화학적으로 변형되어 1 이상의 추가의 시스테인 기(-SH)를 포함한다.
시스테인은 활성 에나멜 물질에 직접 결합될 수 있거나 또는, 에스테르 결합과 같이 비-특이성 가수분해에 의하여 분해 가능한 서열 또는 플라스민 분해성 서열 및/또는 다당류 분해를 위한 기질 또는, 단백분해성 분해를 위한 서열과 같은 효소 분해성 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있는 링커 서열을 통하여 결합되어 활성 에나멜 물질은 예를 들면 실질적으로 천연 형태인 효소에 의하여 매트릭스로부터 분해될 수 있다.
분해성 결합
일반적으로, 본 발명의 약학적 및/또는 치료적 배합물로부터의 활성 에나멜 물질의 조절된 방출은 필요한 활성 에나멜 물질의 총량을 감소시킨다. 특히, 이러한 효과는 이의 방출이 세포성 과정에 의하여 조절되는 경우 최적화된다. 활성 에나멜 물질 및 이의 생체이용율의 보존은 초기 파열 방출에서의 활성 에나멜 물질의 상당량의 손실을 초래하는 것을 특징으로 하는 확산 조절 방출 장치의 사용에 비하여 세포 특이성 단백분해성 활성을 이용하는 뚜렷한 잇점을 갖는다. 매트릭스에 공유 결합된 활성 에나멜 물질을 사용한 골 결함의 강력한 치유에 대한 가능한 설명에서, 활성 에나멜 물질은 장시간에 걸쳐(즉, 단일의 간헐 투여) 그러나 연속적인 방식으로 국부적으로 투여되는 것이 중요한 것으로 보인다. 이는 매트릭스의 효소 절단 또는 가수분해성 절단을 통하여 느린 분해에 의하여 달성된다. 이와 같은 방법으로, 분자는 지속된 시간에 걸쳐 발생하는 의사-간헐 효과에 의하여 전달된다. 예를 들면, 선조 세포가 매트릭스를 팽윤시킬 경우, 활성 에나멜 물질 분자와 접하게 되며, 이때 전조골세포(preosteoblast)로 분화할 수 있다. 그러나, 특정의 세포가 매트릭스로부터 결합된 활성 에나멜 물질의 방출을 지속하지 못할 경우, 조골세포(osteoblast)로 효과적으로 전환되며, 골 매트릭스를 생성하기 시작한다. 마지막으로, 활성 에나멜 물질의 치료적 효과는 결함 부위에 편재되어 차후에 확대된다.
매트릭스를 형성하는 단량체, 중합체, 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 서브분절 중 임의의 것은 분해성 결합의 포함에 의하여 개질될 수 있다. 통상적으로, 이들은 효소 절단 부위, 예컨대 트롬빈에 의한 절단을 위한 부위가 된다.
또한, 매트릭스에 가교되는 활성 에나멜 물질의 융합 단백질 또는 펩티드 키메라는 제1의 도메인에서의 생활성 단백질과 제2의 도메인(예, 시스테인, 인자 XIIIa 기질 또는 헤파린-결합 도메인)에서의 부착 부위 사이에 분해성 부위를 포함할 수 있다. 이들 분해성 부위는 비-특이성 가수분해(에스테르 결합)에 의하여 분해될 수 있거나 또는 이들은 특이성 효소 분해(단백분해성 또는 다당류 분해)에 대한 기질이 될 수 있다.
분해 부위는 1차 단백질 서열에 대한 개질이 거의 없거나 또는 전혀 없이 활성 에나멜 물질이 방출되도록 하여 더 높은 활성을 갖는 활성 에나멜 물질을 산출할 수 있다. 또한, 분해성 부위는 매트릭스, 예컨대 피브린 겔로부터 활성 에나멜 물질의 보다 특이적인 방출을 가능케 한다. 예를 들면, 효소 활성에 기초한 분해는 활성 에나멜 물질의 방출이 특정의 다공성 물질로부터의 활성 에나멜 물질의 활성에 의한 것이 아니라 세포성 과정, 예컨대 국소화된 단백분해에 의하여 조절되도록 한다. 분해성 부위 또는 결합은 매트릭스를 침입하는 세포로부터 방출된 효소에 의하여 분해된다. 이는 활성 에나멜 물질이 물질내의 세포의 위치에 따라 동일한 물질내에서 상이한 속도로 방출되도록 한다. 세포 특이성 단백분해성 활성은 장시간에 걸쳐 발생하는 이들 적용예에서는 중요하게 된다.
단백분해성 분해에 사용할 수 있는 효소에는 다수가 있다. 단백분해성 분해성 부위의 예로는 콜라게나제, 플라스민, 엘라스타제, 스트로멜리신 또는 플라스미노겐 활성제에 대한 기질 등이 있다. 기질의 예로는 하기 표 2에 제시된 것이 있다. P1 내지 P5는 단백질분해가 발생하는 부위로부터 단백질의 아미노 말단을 향한 아미노산 1 내지 5 위치를 나타낸다. P1'-P4'는 단백질분해가 발생하는 부위로부터 단백질의 카르복시 말단을 향한 아미노산 1 내지 4 위치를 나타낸다.
프로테아제에 대한 샘플 기질 서열
프로테아제 P5 P4 P3 P2 P1 P1' P2' P3' P4' 문헌
플라스민 L I K M K P Takagi and Doolittle (1975) Biochem. 14: 5149-5156
플라스민 N F K S Q L Takai and Dolittle, 1975
스트로멜리신 Ac G P L A L T A L Smith et al., (1995). J. Biol. Chem. 270: 6440-6449
스트로멜리신 Ac P F E L R A NH2 Smith et al., 1995
엘라스타제 Z-(?) A A F A NH2 Besson et al., (1996) Anal. Biochem. 237: 216-223
콜라게나제 G P L G I A G P Netzel-Amett et at., (1991) J. Biol. Chem., 266: 6747-6755
t-PA P H Y G R S G G Coombs et al., (1998) J. Biol. Chem. 273-4323-4328
u-PA P G S G R S A S G Coombs et al., 1998
또다른 바람직한 구체예에서, 올리고-에스테르 도메인은 제1의 및 제2의 도메인 사이에 삽입될 수 있다. 이는 올리고-에스테르, 예컨대 락트산의 올리고머를 사용하여 달성될 수 있다.
비-효소 분해 기질은 산 또는 염기 촉매화된 기전에 의하여 가수분해를 실시한 임의의 결합으로 이루어질 수 있다. 이들 기질의 예로는 올리고-에스테르, 예컨대 락트산 또는 글리콜산의 올리고머 등이 있다. 이들 물질의 분해 속도는 올리고머의 선택에 의하여 조절될 수 있다.
다당류 기질
효소 분해는 효소, 예컨대 헤파리나제, 헤파리티나제 및 콘드로이티나제 ABC에 대한 다당류 기질을 사용하여 발생할 수 있다. 이들 각각의 효소는 다당류 기질을 갖는다. 헤파린-결합 시스템의 전부에서의 헤파린의 존재에 의하여 헤파리나제에 대한 기질은 이미 이들 시스템에서 형성되어 있다.
그래서, 중합체 매트릭스 및 활성 에나멜 물질을 포함하며, 상기 활성 에나멜 물질의 농도가 5 ㎎/㎖ 배합물 이하이며, 상기 활성 에나멜 물질은 1 이상의 헤파린 결합 분절을 통하여 상기 매트릭스에 공유 또는 비공유 결합되는, 활성 에나멜 물질의 투여를 위한 약학적 및/또는 치료적 배합물을 마찬가지로 고려한다.
단백분해성 기질은 활성 에나멜 물질 키메라 또는 헤파린-활성 에나멜 물질 키메라의 펩티드 합성중에 첨가할 수 있다. 헤파린-결합 활성 에나멜 물질 키메라는 인자 XIIIa 기질 및 헤파린-결합 도메인 사이의 프로테아제 기질, 예컨대 플라스민에 대한 서열(예를 들면 표 2 참조)을 삽입하여 단백분해성 분해 서열을 포함하도록 변형시킬 수 있다. Km이 높고, kcat이 낮은 기질은, 프로테아제의 활성 부위를 차지하면서 절단을 지연시키는데 사용할 수 있다. 플라스민에 대한 것을 제외한 절단 기질은 활성 에나멜 물질의 방출이 매트릭스 분해와는 무관하도록 하기 위하여 사용할 수 있다.
부수적으로, 올리고-에스테르 도메인은 예컨대 인자 XIIIa 기질과 같은 제2의 도메인 및, 활성 에나멜 물질 또는 헤파린-결합 도메인이거나 또는 마찬가지로 펩티드 합성 단계중에 키메라의 헤파린 도메인이 되는 제1의 도메인 사이에 삽입될 수 있다. 이는 올리고-에스테르, 예컨대 락트산의 올리고머를 사용하여 달성될 수 있다.
비-효소 분해 기질은 산 또는 염기 촉매화된 기전에 의하여 가수분해를 실시하는 임의의 결합으로 이루어질 수 있다. 이러한 기질의 예로는 올리고-에스테르, 예컨대 락트산 또는 글리콜산의 올리고머 등이 있다. 이들 물질의 분해 속도는 올리고머의 선택에 의하여 조절될 수 있다.
헤파린; 헤파린 결합 펩티드
또한, 본 발명에 의한 중합체 매트릭스는 헤파린에 결합되는 단백질에 직접 또는 간접적으로 결합되는 헤파린 및/또는 헤파린 결합 분절을 포함하여 변형될 수 있다. 후자의 경우에서, 단백질은 헤파린에 결합되며, 그후 헤파린 결합 부위를 포함하는 활성 에나멜 물질로의 결합에 이용될 수 있거나 또는, 활성 에나멜 물질은 그 자체가 특정의 헤파린-결합 활성 에나멜 물질에 의하여 결합된 헤파린 부분을 포함할 수 있다. 이는 하기에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이 표준의 기법을 사용하여 매트릭스 물질에 부착될 수 있다.
본 출원의 가능한 구체예는 세포성 성장 또는 내성장 또는 세포-폐색성에 적절한 중합체 매트릭스 및 활성 에나멜 물질을 포함하며, 상기 활성 에나멜 물질의 농도는 5 ㎎/㎖ 배합물 미만이며, 상기 매트릭스는 1 이상의 헤파린 및/또는 1 이상의 헤파린 결합 분절의 함유(inclusion)에 의하여 변형되는, 활성 에나멜 물질을 투여하기 위한 저 농도 약학적 및/또는 치료적 배합물에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서, 헤파린은 펩티드 키메라 및 헤파린 자체로 이루어진 2 성분 시스템을 사용하여 피브린 겔에 비공유 결합된다. 펩티드 키메라는 2 개의 도메인, 즉 인자 XIIIa 기질 및 다당류-결합 도메인으로 이루어진다. 일단 펩티드 키메라가 피브린 겔에 가교되면, 이는 비공유 상호작용에 의하여 헤파린(또는 기타의 다당류)을 부착시킨다.
각종 단백질이 헤파린 결합 친화성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 그 예를 하기 표 2에 제시한다.
헤파린 결합 서열
단백질 헤파린-결합 도메인 문헌
항-트롬빈 III K(βA)FAKLAARLYRKA Tyler-Cross, R., et. Protein Science. 3: 620-627
혈소판 인자 4 YKKIIKKL Zucker 및 Katz, (1991). Exper. Biol. Med.: 693-702
신경 세포 KHKGRDVILKKDVR Kallapur, et al, Adhesion Molecule (1992) J. Neurosci. Res. 33: 538-548
피브로넥틴 YEKPGSPPREVVPRPRPCV
KNNQKSEPLIGRKKT		 Haugen, et al., (1992). J. Neurosci. 12: 2034-2042
bFGF(염기성 섬유아세포
성장 인자)		 KDPKRL
YRSRKY		 SwissPROT: P09038
aFGF(산성 섬유아세포
성장 인자)		 YKKPKL SwissPROT: P05230
LPL(지질단백질 리파제) AKRSSKM
CRKRCN		 Hata, et al., J. Biol. Chem. 268: 8447-8457
또다른 구체예에서, 활성 에나멜 물질 그 자체는 상기 표 3에 예시된 물질과 같이 헤파린-결합 친화성을 갖는 기질을 결합시키는 것에 대한 친화성을 나타낸다. 이와 같은 구체예에서, 활성 에나멜 물질은 전술한 바와 같이 중합체 매트릭스에 공유 또는 비공유 결합되어 헤파린-결합 친화성을 갖는 임의의 기타 물질과의 비공유 상호작용에 대하여 헤파린-유사 도메인을 제공한다.
세포 부착 부위
세포는 세포 표면에서 단백질-단백질, 단백질-올리고당류 및 단백질-다당류 상호작용에 의하여 이의 환경과 상호작용한다. 세포외성 매트릭스 단백질은 생활성 시그날의 숙주를 세포에 제공한다. 이와 같이 조밀한 망상구조는 세포를 지지하는데 필요하며, 매트릭스내에서의 다수의 단백질은 세포 유착, 확산, 이동 및 분화를 조절하는 것을 나타났다(Carey, Annual Review of Physiology, 53:161-177, 1991). 특히 활성을 갖는 것으로 나타난 특정의 특이성 단백질의 예로는 라미닌, 비트로넥틴, 피브로넥틴, 피브린, 피브리노겐 및 콜라겐 등이 있다(Lander, Journal of Trends in Neurological Science, 12:189-195, 1989). 라미닌의 다수의 연구를 실시하였으며, 라미닌은 생체내 신경 그리고 시험관내 신경 세포의 발육 및 재생(Williams, Neurochemical Research, 12:851-869, 1987)뿐 아니라, 혈관형성에 중대한 역할을 하는 것으로 나타났다.
세포성 수용체와 직접 상호작용하고 유착, 확산 또는 신호 전달을 야기하는 일부의 특이성 서열이 확인되었다.
커다란 멀티도메인 단백질인 라미닌(Martin, Annual Review of Cellular Biology, 3:57-85, 1987)은 여러 가지의 수용체-결합 도메인을 갖는 3 개의 쇄로 이루어지는 것으로 밝혀졌다. 이들 수용체-결합 도메인의 예로는 라미닌 B1 쇄의 YIGSR 서열(Graf, et al., Cell, 48:989-996, 1987; Kleinman, et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, 272:39-45, 1989; 및 Massia, et al., J. of Biol. Chem., 268:8053-8059, 1993), 라미닌 A 쇄의 LRGDN(Ignatius, et al., J. of Cell Biology, 111:709-720, 1990) 및 라미닌 B1 쇄의 PDGSR(Kleinman, et al, 1989) 등이 있다. 세포에 대한 다수의 기타 인지 서열이 밝혀져 있다. 이의 예로는 라미닌 A 쇄의 IKVAV(Tashiro, et al., J. of Biol. Chem., 264:16174-16182, 1989) 및 라미닌 B2 쇄의 서열 RNIAEIIKDI(Liesi, et al., FEBS Letters, 244:141-148, 1989) 등이 있다.
추가의 바람직한 구체예에서, 세포 유착에 대한 펩티드 부위를 매트릭스에 투입하고, 이른바 세포의 표면상의 유착 촉진 수용체에 결합하는 펩티드를 본 발명의 생체물질에 투입한다. 이와 같은 유착 촉진 펩티드는 전술한 바와 같은 군으로부터 선택될 수 있다. 피브로넥틴으로부터의 RGD 서열 및 라미닌으로부터의 YIGSR 서열이 특히 바람직하다. 합성 매트릭스를 사용한 세포 부착 부위의 투입이 특히 바람직한 구체예가 되지만, 일부의 천연 매트릭스를 사용하는 것도 포함할 수 있다. 투입은 예를 들면 친핵성 기를 포함하는 전구체 성분, 예컨대 티올 함유 전구체 성분의 나머지와 혼합하기 수 분 전에 예를 들면 시스테인-함유 세포 부착 펩티드를, 공액 불포화 기를 포함하는 전구체 분자, 예컨대 PEG 아크릴레이트, PEG 아크릴아미드 또는 PEG 비닐설폰와 단순히 혼합하여 실시할 수 있다. 세포 부착 부위가 시스테인을 포함하지 않을 경우, 이를 포함하도록 화학적으로 합성할 수 있다. 이와 같은 제1의 단계중에, 유착-촉진 펩티드는 공액 불포화로 배가 작용화된 전구체의 한 단부에 투입되며; 나머지 다중티올을 시스템에 첨가할 경우, 가교된 망상구조가 형성된다. 본 명세서에서 망상구조를 생성하는 방법의 또다른 중요한 의미는 측쇄 생활성 리간드, 예컨대 유착 신호의 투입의 효율이다. 이러한 단계는 예를 들면 미결합 리간드(즉, 유착 부위)가 매트릭스와 세포의 상호작용을 억제할 수 있기 때문에 정량적이어야만 한다. 이와 같은 측쇄 올리고펩티드를 사용한 전구체의 유도체화는 티올에 대하여 화학량론적 과량(최소: 40 배)의 복수아암의 친전자체 전구체로 제1의 단계에서 실시하며, 그리하여 정량적이 된다. 원치 않는 억제를 방지하기 위하여, 이와 같은 달성은 생물학적으로 훨씬 더 유의적이며, 세포 양상은 리간드 밀도에서의 작은 변화에 매우 민감하게 되며, 투입된 리간드의 정확한 지식은 세포-매트릭스 상호작용을 설계 및 이해하는 것을 돕는다. 요컨대, 매트릭스에 공유 결합된 유착 부위의 농도는 세포 침윤 비율에 유의적으로 영향을 미친다. 예를 들면 소정의 히드로겔의 경우, RGD 농도 범위는 최적의 방식으로 세포 내성장 및 세포 이동을 지지하는 매트릭스에 혼입될 수 있다.
그러므로, 바람직한 구체예는 세포성 성장 또는 내성장에 적절한 중합체 매트릭스 및 활성 에나멜 물질을 포함하며, 상기 활성 에나멜 물질의 농도가 5 ㎎/㎖ 배합물 미만이며, 상기 매트릭스는 RGD의 포함으로 변형되는, 활성 에나멜 물질을 투여하기 위한 저 농도 약학적 및/또는 치료적 배합물에 관한 것이다. 예를 들면 실험 부분의 실시예 2 및 4를 참조한다.
사용 방법
본 발명은 박리 가능하게 투입 및/또는 이에 둘러싸인 활성 에나멜 물질을 갖는 천연 및/또는 합성 매트릭스를 사용하여 경조직 및 연조직 복구, 재생 또는 리모델링을 위한, 특히 골 및 치아 성장을 위한 활성 에나멜 물질의 저 농도 배합물을 제공한다. 매트릭스는 생적합성 및/또는 생분해성이며, 이식시에 시험관내 또는 생체내에서 형성될 수 있다. 활성 에나멜 물질은 매트릭스에 혼입 및/또는 둘러싸일 수 있으며, 이의 완전 생활성을 보유한다. 게다가, 전술한 바와 같이, 매트릭스가 조절된 방출 비이클로서 매트릭스를 사용하여 직접 또는 간접적으로 조직 복구에 사용될 수 있도록, 활성 에나멜 물질이 방출되는 방법 및 시기 및 방출되는 정도에 대한 조절을 제공하는 기법을 사용하여 박리 가능하게 투입될 수 있다.
본 명세서에 기재된 신규한 저 농도 약학적, 화장품학적 및/또는 치료적 배합물은 이식 이전에 또는 이식시에 조직의 복구, 재생 및/또는 리모델링 및/또는 활성 에나멜 물질의 방출에 사용될 수 있다. 특정의 구체예에서, 매트릭스가 이식 부위에서 조직에 부합되도록 투여 부위에서의 가교를 유도하는 것이 바람직하다. 기타의 구체예에서, 이식 이전에 매트릭스를 생성하는 것이 편리하다.
또한, 세포는 이식 이전에 또는 이식시 또는 이식 이후조차도, 중합체의 가교시 또는 가교 이후에 약학적 및/또는 치료적 배합물에 첨가하여 매트릭스를 형성할 수 있다. 이는 세포 증식 또는 내성장을 촉진하도록 설계된 간극 이격을 생성하기 위하여 매트릭스를 가교시키는 것 이외에 또는 그 대신에 실시될 수 있다.
대부분의 경우에서 세포 성장 또는 증식을 촉진하기 위하여 약학적 및/또는 치료적 배합물을 투입하는 것이 바람직하기는 하나, 특정의 잠재적 시나리오에서, 활성 에나멜 물질은 세포 증식의 속도를 억제하는데 사용된다. 특정의 적용예는 수술후 유착의 형성을 방지하고, 임플란트의 배치후 상처층으로 섬유아세포의 내성장을 억제하기 위한 것이다.
한 특정의 구체예에서, 본 명세서에 기재된 에나멜 매트릭스, 에나멜 매트릭스 유도체 및/또는 에나멜 매트릭스 단백질의 신규하고 개선된 저 농도 배합물은 특히 조직 복구, 재생 및/또는 모델링에 사용하기 위한, 생 무기질화된 조직 부분 사이의 결합을 유도하기 위한, 생 무기질화된 조직의 조각을 기타의 생 조직의 조작에서의 접합 부위에 접합시키기 위한, 피부 또는 점막에서의 상처의 치유를 개선시키기 위한, 감염 또는 염증 상태의 예방 또는 치료를 위한, 상아질의 형성 또는 재생을 위한, 이식편의 수용을 촉진하기 위한, 상피 유도된 양성, 반-악성 또는 악성 신생물을 치료하기 위한, 세포소멸을 유도하기 위한 또는 시술 및/또는 외상, 예컨대 세포감소 수술후 창강 및/또는 조직 결함을 채우기 위한 약제, 예컨대 치료적, 예방적 약제 및/또는 화장품학적 제제로서 사용하고자 한다.
제2의 구체예에서, 상기 약학적 및/또는 치료적 배합물은 무기질화된 조직, 예컨대 골, 연골 및 치아를 복구하기 위한, 비-무기질화된 조직, 예컨대 연조직 및 점막의 조직 복구를 위한, 염증 및/또는 감염을 비롯한 상태의 치료를 위한, 상아질의 형성 또는 재생을 위한, 이식편의 수용을 촉진하기 위한, 상피 유도된 양성, 반-악성 또는 악성 신생물의 치료를 위한, 세포소멸의 유도를 위한 또는 시술 및/또는 외상, 예컨대 세포감소 수술후 창강 및/또는 조직 결함을 채우기 위한 약제의 제조에 사용된다.
치주 조직의 치유 및 재생을 위하여, 특히 무기질화된 조직의 재성장을 위하여 돼지에서의 치주 열개 모델(periodontal dehiscence model)에서 설명한 에나멜 매트릭스, 에나멜 매트릭스 유도체 및/또는 에나멜 매트릭스 단백질의 신규하고 개선된 저 농도 배합물을 적용하여(실험 부분의 실시예 5 참조), 재생된 골 구조의 형태가 통상적으로 고농도인 배합물(PGA중의 30 ㎎/㎖)에서 에나멜 매트릭스 유도체를 사용할 경우 재생된 구조와는 상이하다는 것을 발견하였다. 그래서, 신규한 배합물이 최초로 포유동물 체내에서 무기질화된 조직의 유도된 신생(neogenesis), 예컨대 유도된 골 성장 또는 골 재성장을 가능케 하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명을 특정의 과학적 이론으로 한정하고자 하는 의도는 아니나, 새로이 형성된 골 구조는, 세포성 내성장 및/또는 이동에 적절한 중합체 매트릭스 및 활성 에나멜 물질을 포함하는, 활성 에나멜 물질의 투여를 위한 약학적 및/또는 치료적 배합물의 내부에서 형성되는 것으로 간주한다. 그래서, 이와 같은 신규한 매트릭스의 부피, 형상 및 위치를 사용하여 상기 배합물중의 활성 에나멜 물질의 실제 농도와는 상관 없이, 상기 매트릭스의 신규하고 복잡한 적용을 가능케 하는 해당 골 생성의 부피, 형상 및 위치를 설계한다. 당업자는 상기 농도의 에나멜 매트릭스가 각각의 특정의 수요에 최선으로 부합되도록 조절할 수 있다는 것을 숙지할 것이다.
세포성 내성장 및/또는 이동에 적절한 중합체 매트릭스 및 활성 에나멜 물질을 포함하는 본 발명의 활성 에나멜 물질의 투여를 위한 약학적 및/또는 치료적 배합물을 위한 가능한 신규의 의약 및/또는 치과용 적용예는 예를 들면 치아에서의 크거나 또는 복합적인 결함, 예컨대 포유동물 신체의 골격 또는 관절에서의 손실된 골 구조의 치근분기 결함(furcation defect) 또는 재성장이다. 상기 배합물은 포유동물 신체의 생체내에서, 동일계내에서 또는 외부에서 특이적 형상으로 유도된 골 신생 또는 재성장에 사용될 수 있을 뿐 아니라, 포유동물 신체의 비-말단 위치에 사용될 수 있으며, 이때 상기 새로운 골 구조는 포유동물 신체로 이식하기 위하여 용이하게 사용할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 전술한 새로운 의약 표시에 사용하고자 하는 활성 에나멜 물질의 배합물은 폴리에틸렌 글리콜 및 5 ㎎/㎖ 배합물 미만 농도의 상기 활성 에나멜 물질을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 상기 신규한 의약 표시는 물론 세포성 내성장 및/또는 이동에 적절한 폴리에틸렌 글리콜 또는, 임의의 기타 중합체 매트릭스를 포함하는 활성 에나멜 물질의 배합물의 용도를 포함하며, 상기 활성 에나멜 물질의 농도는 5 ㎎/㎖ 초과, 예컨대 10, 20 또는 30 ㎎/㎖ 이상이다.
추가로, 본 발명은 배합물 모두의 동시 적용을 위한 EMDOGAIN(등록상표) 및 본 발명에 의한 약학적 및/또는 치료적 배합물을 포함하는 키트 및, 약제로서의 조합 키트의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 서방형(sustained release) 배합물의 잇점
중합체 매트릭스 및 활성 에나멜 물질을 포함하는 본 발명의 약학적 및/또는 치료적 배합물은 서방형 배합물로서 사용될 수 있다. 단백질/폴리펩티드의 생물학적 반감기는 종종 짧으며, 그리하여 신체에 투여시 이의 생물학적 활성은 신속하게 손실된다. 또한, 본 명세서에 기재된 서방형 배합물과 반대로 통상의 배합물을 사용하면, 투여후 초기에 방출된 다량의 물질로 인하여 물질 활성의 초기 파열이 존재하며, 그후 생물학적 활성은 시간이 경과함에 따라 감소된다. 반대로, 본 발명의 약학적 및/또는 치료적 배합물을 사용함으로써, 활성 에나멜 물질의 방출은 방출의 시간 및 방출된 농도와 관련하여 모두 조절될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 및/또는 치료적 배합물을 사용하여 활성 에나멜 물질을 방출하는 것은 소정의 신체 부위에서 제어된 방식으로 발생하는 편재된 방출이다. 또한, 본 발명의 배합물은 필요할 경우 수 일 및 수 주 동안조차 장시간에 걸쳐 동등한 함량의 활성 에나멜 물질이 방출되도록 한다. 그리하여, 상처 치유 과정이 개선된다.
활성 에나멜 물질이 방출되는 동안의 시간 및, 단위 시간당 방출된 함량은 본 명세서의 다른 곳에서 설명된 바와 같이 중합체 망상구조의 분해 속도에 영향을 미치는 중합체의 농도, 중합체 및 활성 에나멜 물질의 가교 정도, 배합물중에서의 활성 에나멜 물질의 농도, 효소 절단 부위의 투입 및 기타의 생물학적 활성 물질에 관하여 약학적 및/또는 치료적 배합물의 조성을 변경시켜 조절할 수 있다. 그리하여, 방출 프로파일은 필요한 정도로 각각의 특이성 적용을 위하여 조절될 수 있다.
게다가, 본 명세서에 기재된 특정의 신규한 배합물은 예를 들면 PGA 겔에서의 에나멜 매트릭스 유도체의 통상의 배합물보다 형태 안정성이 더 크며, 세포성 내성장에 적절한 것으로 설계될 경우, 이들은 최초로 특이성 형상, 부피 및/또는 국소화로 무기질화된 조직의 특정의 재성장을 안내하기 위하여 사용될 수 있다.
적용 방법
한 구체예에서, 약학적 및/또는 치료적 배합물은 신체내에서 또는 신체상에서 동일계내 겔화된다. 또다른 구체예에서, 약학적 및/또는 치료적 배합물은 신체의 외부에서 예비형성된 후, 상기 예비형성된 형상으로 적용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 매트릭스 물질은 합성 또는 천연 전구체 성분으로부터 생성될 수 있다. 사용된 전구체 성분의 유형과는 무관하게, 전구체 성분은 성분의 중합 또는 겔화되도록 하는 조건하에서 조합 또는 서로 접촉되는 것을 방지하기 위하여 신체에 혼합물을 적용하기 이전에 분리하여야만 한다. 투여 이전의 접촉을 방지하기 위하여, 서로에 대하여 조성물을 분리한 키트를 사용할 수 있다. 중합을 가능케 하는 조건하에서의 혼합시, 조성물은 3차원 망상구조가 보충된 활성 에나멜 물질을 형성한다. 전구체 성분 및 이의 농도에 따라서, 겔화는 혼합후 준-동시에 발생할 수 있다.
한 구체예에서, 매트릭스는 피브리노겐으로부터 형성된다. 적절한 온도 및 pH에서 트롬빈 및 칼슘 공급원과 접촉시 각종 반응의 다단계를 통하여 피브리노겐은 겔화되어 매트릭스를 형성한다. 3 가지 성분, 즉 피브리노겐, 트롬빈 및 칼슘 공급원은 별도로 보관되어야만 한다. 그러나, 3 가지 성분 중 1 이상이 분리된 상태를 유지하는 한, 나머지 2 종의 성분은 투여 이전에 혼합될 수 있다. 피브리노겐은 생리학적 pH에서 (pH 6.5 내지 8.0, 바람직하게는 pH 7.0 내지 7.5 범위내에서) 완충 용액에 용해시키고(안정성을 증가시키기 위하여 추가로 아프로티닌을 포함할 수 있음), 염화칼슘 완충액중의 트롬빈의 용액(예, 40 내지 50 mM의 농도 범위)으로부터 별도로 보관할 수 있다. 피브리노겐을 위한 완충 용액은 150 mM 또는 TRIS 완충 염수의 바람직한 농도에서 (바람직하게는 33 mM의 농도에서) NaCl을 추가로 포함하는 50 mM의 바람직한 농도에서 히스티딘 완충 용액이 될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 활성 에나멜 물질, 피브리노겐, 트롬빈 및 칼슘 공급원을 포함하는 키트가 제공된다. 임의로, 키트는 가교 효소, 예컨대 인자 XIIIa를 포함할 수 있다. 활성 에나멜 물질은 활성 에나멜 물질의 생활성 도메인, 가교 효소에 대한 기질 도메인 및, 기질 도메인과 생활성 도메인 사이의 분해 부위를 포함하는 융합 단백질이 될 수 있다. 융합 단백질은 피브리노겐 또는 트롬빈 용액 중에 존재할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 피브리노겐 용액은 융합 단백질을 포함한다.
용액은 2 방향 주사기 장치에 의하여 혼합되는 것이 바람직한데, 여기서 혼합은 혼합 챔버 및/또는 니들 및/또는 정적 혼합기를 통하여 2 개의 주사기 모두의 내용물을 쥐어짜서 실시한다. 기타의 바람직한 추가 사항은 2 가지의 용액을 용기에 첨가하고, 여기서 이들을 혼합하고, 예를 들면 주사기에 전달한 후 적용한다. 최적으로는, 용액 모두를 주사기 1내의 약간 산성인 완충액에 용해시킨 후, 암 Luer 함유 베이스(그리고 대안으로는 점도 조절제)를 갖는 주사기에 부착시키고, 주사기-주사기 혼합으로 혼합할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 피브리노겐 및 트롬빈 모두를 동결건조된 형태로 별도로 저장한다. 이들 중 어느 것이든 융합 단백질을 포함할 수 있다. 사용전, 트리스 또는 히스티딘 완충액을 피브리노겐에 첨가하고, 완충액은 추가로 아프로티닌을 포함할 수 있다. 동결건조된 트롬빈을 염화칼슘 용액에 용해시킨다. 그후, 피브리노겐 및 트롬빈 용액을 별도의 용기/바이알/주사기 바디에 넣고, 2 방향 연결 장치, 예컨대 2 방향 주사기에 의하여 혼합한다. 임의로, 용기/바이알/주사기 바디는 주사기 바디 벽에 대하여 수직인 조절 가능한 파티션에 의하여 분리된 2 개의 챔버를 갖는 이분형이다. 챔버 중 하나는 동결건조된 피브리노겐 또는 트롬빈을 포함하며, 나머지 챔버는 적절한 완충 용액을 포함한다. 피스톤을 아래로 누르면, 파티션이 이동하여 완충액을 피브리노겐 챔버에 방출하게 되어 피브리노겐을 용해시킨다. 피브리노겐및 트롬빈 모두가 용해되면, 이분 주사기 바디 모두는 2 방향 연결 장치에 부착되며, 그 내용물들은 연결 장치에 부착된 주사 니들을 통하여 쥐어짜서 혼합한다. 임의로, 연결 장치는 내용물의 혼합을 개선시키기 위하여 정적 혼합기를 포함한다.
또다른 바람직한 구체예에서, 혼합 전에 피브리노겐을 8 배로 희석하고, 트롬빈을 20 배로 희석한다. 이러한 비율은 약 1 분간의 겔화 시간을 초래하게 된다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 저 농도 배합물에 포함된 중합체 매트릭스는 마이클 첨가 반응을 실시할 수 있는 합성 전구체 성분으로부터 형성된다. 친핵성 전구체 성분(멀티티올)만이 염기성 pH에서 다중수용체(multiacceptor) 성분(공액 불포화 기)과 반응하며, 이들 3 가지 성분인 베이스, 친핵성 성분 및 다중수용체 성분은 혼합 이전에 별도로 보관하여야만 한다. 다중수용체 및 멀티티올 성분 모두는 완충액중에서 또는 산중의 용액으로서 보관할 수 있다. PEG-아크릴레이트는 일반적으로 건조 보관한다. 그리하여, PEG 모두를 건조 보관하고, 사용 전에 염기성 완충액에 용해시키거나(실시예 2에서 설명한 바와 같이) 또는 PEG-티올을 산성 완충액중에서 보관한 후, 사용 전에 PEG-아크릴레이트와 혼합한 후, 베이스와 혼합한다(실시예 3 참조). 조성물 모두는 세포 부착 부위 및 추가로 활성 에나멜 물질을 포함할 수 있다. 그리하여, 시스템의 제1의 조성물은 예를 들면 친핵성 성분의 용액을 포함할 수 있으며, 시스템의 제2의 조성물은 다중수용체 성분의 용액을 포함할 수 있다. 이들 2 개의 조성물 중 임의의 것 또는 모두는 베이스를 포함할 수 있다. 또다른 구체예에서, 다중수용체 및 멀티티올은 제1의 조성물중의 용액으로서 포함될 수 있으며, 제2의 조성물은 베이스를 포함할 수 있다. 연결 및 혼합은 피브리노겐에 대하여 상기에서 설명한 것과 동일한 방법으로 실시한다. 이분 주사기 바디는 합성 전구체 성분에 대하여 동등하게 적절하다. 피브리노겐 및 트롬빈 대신에, 다중수용체 및 멀티티올 성분은 챔버 중 하나에서 분쇄된 형태로 보관되며, 다른 챔버는 염기성 완충액을 포함한다. 기타의 바람직한 추가 사항은 2 개의 용액을 용기에 첨가하고, 이들을 혼합하고, 예를 들면 주사기에 전달하고, 그 후 이를 적용하는 것이다. 최적으로는, PEG 모두를 주사기 1에서 약간 산성인 완충액에 용해시킨 후, 암 Luer 포함 베이스(그리고 대안으로는 점도 조절제)를 갖는 주사기에 부착하고, 주사기-주사기 혼합에 의하여 혼합할 수 있다.
정의
본 명세서에서 일반적으로 사용된 바와 같이, "생체물질(biomaterial)"이라는 것은 물질에 따라서 신체의 임의의 조직, 기관 또는 기능을 영구적으로 또는 일시적으로 평가, 치료, 증대 또는 대체하기 위한 생물학적 시스템과 연결시키고자 하는 물질을 지칭한다. 용어 "생체물질" 및 "매트릭스"는 본 명세서에서 동의어로 사용하며, 이는 매트릭스의 성질에 따라서 물에 용해되는 것이 아니라 물로 팽윤되는, 즉 외상을 입은 또는 결함 연조직 및/또는 경조직에 대한 특정의 지지 기능을 수행하는 소정의 시간 동안 체내에서 머무르게 되는 히드로겔을 형성할 수 있는 가교된 중합체 망상구조를 의미한다.
용어 "단백질 매트릭스(protein matrix)"는 단백질 전구체 분자를 중합체 망상구조에 이온, 공유 또는 이들의 조합으로 가교시키거나 또는, 1 이상의 중합체 물질(들), 즉 매트릭스를 팽윤시켜 중합체 망상구조를 형성하여 생성된 매트릭스를 의미한다.
"다당류 매트릭스(polysaccharide matrix)"는 다당류 전구체 분자를 중합체 망상구조에 이온, 공유 또는 이의 조합으로 가교시키거나 또는 1 이상의 중합체 물질(들), 즉 매트릭스를 팽윤시켜 중합체 망상구조를 형성시켜 생성된 매트릭스를 설명하는데 사용된다.
"합성 매트릭스(synthetic matrix)"에서, 합성 전구체 분자를 중합체 망상구조에 이온, 공유 또는 이의 조합으로 가교시키거나 또는 1 이상의 중합체 물질(들), 즉 매트릭스를 팽윤시켜 중합체 망상구조를 형성하여 생성된 매트릭스를 의미한다.
용어 "중합체 매트릭스(polymeric matrix)"는 본 명세서에서 설명한 단백질, 다당류 및 합성 매트릭스 중 임의의 것을 포함하여 의미하는 것으로 사용된다. 중합체 그 자체는 5 개 이상의 단량체의 결합에 의하여 형성된 커다란 분자이다.
본 명세서에서 사용한 바와 같이, "에나멜 매트릭스(enamel matrix)"는 임의의 관련 천연 공급원, 즉 치아가 발육중인 포유동물로부터 얻을 수 있는 에나멜의 전구체를 의미한다. 적절한 공급원은 도살 동물, 예컨대 송아지, 돼지 또는 양으로부터의 발육중인 치아이다. 또다른 공급원은 예를 들면 물고기 피부이다. 본 발명의 명세서에서, 용어 "활성 에나멜 물질(active enamel material)"은 이의 공급원의 구별 없이 에나멜 매트릭스 유도체 및/또는 에나멜 매트릭스 단백질을 포괄하는데 사용한다. 용어 "에나멜 매트릭스(enamel matrix)", "에나멜 매트릭스 유도체"(EMD: enamel matrix derivative), "에나멜 매트릭스 단백질(enamel matrix protein)" 등은 본 명세서에서 설명한 중합체 매트릭스와 혼동하여서는 아니된다.
본 명세서에서 일반적으로 사용된 바와 같은 "강한 친핵체"라는 것은 극성 결합 형성 반응중의 친전자체에 전자쌍을 제공할 수 있는 분자를 지칭한다. 강한 친핵체는 생리학적 pH에서 물보다 친핵성이 더 큰 것이 바람직하다. 강한 친핵체의 예로는 티올 및 아민 등이 있다.
본 명세서에서 일반적으로 사용된 바와 같은 "공액 불포화 결합(conjugated unsaturated bond)"은 단일 결합을 갖는 탄소-탄소, 탄소-이종원자 또는 이종원자-이종원자 다중 결합의 변형 또는, 거대분자, 예컨대 합성 중합체 또는 단백질로의 작용기의 결합을 지칭한다. 이러한 결합은 첨가 반응을 실시할 수 있다.
본 명세서에서 일반적으로 사용된 바와 같은 "공액 불포화 기"는 첨가 반응을 실시할 수 있는 다중 결합을 포함하는, 단일 결합을 갖는 탄소-탄소, 탄소-이종원자 또는 이종원자-이종원자 다중 결합의 변형을 포함하는 분자 또는 분자 부위를 지칭한다. 공액 불포화 기의 예로는 비닐 설폰, 아크릴레이트, 아크릴아미드, 퀴논 및 비닐피리디늄, 예를 들면, 2- 또는 4-비닐피리디늄 및 이타코네이트 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 일반적으로 사용된 바와 같은 "합성 전구체 분자"는 천연으로는 존재하지 않는 분자를 지칭한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용된 바와 같은 "천연 발생하는 전구체 성분 또는 중합체"는 천연으로 존재할 수 잇는 분자를 지칭한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용된 바와 같은 "작용화되다"라는 것은 작용성 기 또는 부분의 부착을 산출하는 방식으로 분자를 변형시키는 것을 지칭한다. 예를 들면, 분자를 강한 친핵체 또는 공액 불포화가 되도록 하는 분자의 도입에 의하여 분자를 작용화시킬 수 있다. 분자, 예를 들면 PEG는 작용화되어 티올, 아민, 아크릴레이트 또는 퀴논이 되는 것이 바람직하다. 또한, 단백질은 특히 유리 티올을 생성하기 위하여 이황화물 결합의 부분 또는 완전 환원에 의하여 효과적으로 작용화될 수 있다.
본 명세서에서 일반적으로 사용된 바와 같은 "작용가(functionality)"라는 것은 분자상의 반응성 부위의 수를 지칭한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용된 바와 같은 "분지점의 작용가"라는 것은 분자에서의 한 지점으로부터 연장된 아암의 수를 지칭한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용된 바와 같은 "유착 부위(adhesion site) 또는 세포 부착 부위(cell attachment site)"는 세포의 표면에서 분자, 예를 들면 유착-촉진 수용체가 결합되는 펩티드 서열을 지칭한다. 유착 부위의 예로는 피브로넥틴으로부터의 RGD 서열 및 라미닌으로부터 YIGSR 서열 등이 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 유착 부위는 매트릭스에 가교 가능한 기질 도메인을 포함하여 생체물질에 투입되는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 일반적으로 사용된 바와 같은 "생물학적 활성"이라는 것은 해당 단백질에 의하여 매개되는 작용성 사례를 지칭한다. 특정의 구체예에서, 이는 폴리펩티드와 또다른 폴리펩티드의 상호작용을 측정하여 분석한 사례를 포함한다. 또한, 해당 단백질은 세포 성장, 분화, 사망, 이동, 유착, 기타의 단백질과의 상호작용, 효소 활성, 단백질 인산화 또는 탈인산화, 전사 또는 번역에 미치는 효과를 평가하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용된 바와 같은 "재생시키다"라는 것은 특정 물질, 예컨대 경조직 또는 연조직, 특히 골 또는 치아 조직의 일부 또는 전부를 다시 성장시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용된 바와 같은 "다작용성(multifunctional)"은 분자(즉, 단량체 올리고- 및 중합체)당 1 초과의 친전자성 및/또는 친핵성 작용기를 지칭한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용된 바와 같은 "자가 선택적 반응(self-selective reaction)"은 조성물의 제1의 전구체 성분이 반응 부위에서 또는 혼합물중에 존재하는 다른 화합물보다 조성물의 제2의 전구체 성분과 훨씬 더 빠르게 반응하거나 또는 그 반대인 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용한 바와 같이, 친핵체는 기타의 생물학적 화합물보다 친전자체에 선택적으로 결합되며, 친전자체는 강한 친핵체에 선택적으로 결합된다.
본 명세서에서 일반적으로 사용된 바와 같은 "가교시키다"라는 것은 공유 결합의 형성을 의미한다. 그러나, 비공유 결합, 예컨대 이온 결합 또는, 공유 및 비공유 결합의 조합의 형성을 지칭한다.
"겔"은 가교된 중합체 망상구조가 수용액의 연속상에 의하여 유한의 정도로 팽윤되는 물질이다.
본 명세서에서 일반적으로 사용된 바와 같은 "중합체 망상구조(polymer matrix)"라는 것은 단량체, 올리고- 또는 중합체의 실질적으로 전부가 이의 가용 작용성 기를 통하여 분자내 공유 결합에 의하여 결합되어 하나의 거대 분자를 산출하는 과정의 생성물을 의미한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용된 바와 같은 "생리학적"이라는 것은 살아있는 척추동물에서 발견될 수 있는 상태를 의미한다. 특히, 생리학적 상태는 사람 신체에서의 조건, 예컨대 온도, pH 등을 지칭한다. 생리학적 온도라는 것은 특히 35℃ 내지 42℃ 범위내의 온도, 바람직하게는 약 37℃를 의미한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용된 바와 같은 "가교 밀도(crosslink density)"라는 것은 각각의 분자의 2 개의 가교 사이의 평균 분자량(Mc)을 지칭한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용된 바와 같은 "당량(equivalent weigtht)"이라는 것은 물질 1 g당 작용기의 mmol을 지칭한다.
본 명세서에서 일반적으로 사용된 바와 같은 "팽윤"이라는 것은 생체물질에 의해 물을 흡수하여 부피 및 중량이 증가된 것을 지칭한다. 용어 "물 흡수" 및 "팽윤"은 본 명세서에서 동의어로 사용하였다.
본 명세서에서 일반적으로 사용된 바와 같은 "평형 상태"라는 것은 히드로겔이 물 또는 완충액중에서 일정한 상태로 보관될 경우 중량 증가 또는 손실이 없는 상태를 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "세포-폐색성"은 세포가 상기 구획으로 또는 구획으로부터 실질적으로 교차될 수 없도록, 상기 매트릭스에 의하여 형성된 구획으로부터의 세포를 고립 또는 차단시킬 수 있는 중합체 매트릭스의 특징을 설명하는데 사용한다. 예를 들면, 이와 같은 차단체형 작용은 막으로서 실질적으로 형성되고 그리고 상기 구획으로 유입되거나 또는 이로부터 배출되는 것을 방지하고자 하는 세포보다 더 작은 공극 크기를 갖는 중합체 매트릭스에 의하여 촉진될 수 있다. 공극의 정확한 치수는 차단시키고자 하는 세포의 크기에 따라 달라지는 것이 명백하다.
도 1
이 도면은 변연 골 및 백악질의 회복(증가)(regain) 대 겔내 EMD의 농도를 도시한 것이다.
도 2
이 도면은 삽입된 겔내 EMD 농도의 함수로서 래트 두개골내 임계 크기 골 결함의 치유(n=4-5)를 도시한 것이다.
도 3
이 도면은 결함의 CEJ로부터 첨단부까지 측정한 포켓 깊이(㎜)를 도시한 것이다. * P<0.05 (본페로니 수정(Bonferroni adjustment)을 이용한 1 방향 ANOVA 테스트).
도 4
이 도면은 시험관내에서 그리고 시험관의 벽을 따른 골 밀도는 표준의 조직형태학적 측정 기법을 적용하여 정량 평가한 것이다.
도 5
이 도면은 시험관내에서 그리고 시험관의 벽을 따른 골밀도는 표준의 조직형태학적 측정 기법을 적용하여 정량 평가한 것이다. *** P<0.001 (본페로니 수정을 이용한 1 방향 ANOVA 테스트)
도 6
이 도면은 수술 준비된 미니 돼지에서의 치주 열개 모델(periodontal dehiscence model)을 도시한 것이다.
도 7
이 도면은 우수하게 조직화된 치주 인대에 의하여 새로운 백악질로부터 분리된 성숙한 층상 골 재생의 조직학적 입증을 도시한 것이다. 7A Emdogain, 7B PEG/Ec.
도 8
이 도면은 성숙한 층상 골 PEG/Ec 재생의 조직학적 입증을 도시한 것이다.
도 9
이 도면은 PEG-Ec(CMC)로 처리한 후 치주 인대 존재의 조직학적 고찰을 도시한 것이다.
도 10
이 도면은 PEG-Ec(CMC)로 처리한 후 치주 인대 존재의 조직학적 고찰을 도시한 것이다.
도 11
이 도면은 골 회복(증가)의 정량적 측정을 위한 마이크로X선을 도시한 것이다. Emdogain(등록상표)은 PEG-Ec 또는 PEG-Ek (p<0.005)에 비하여 통계적 유의성을 갖는 최고의 성능(약 4 ㎜)에 도달하였다.
도 12
이 도면은 PEG-Ec 또는 PEG-Ek 및 Emdogain(등록상표)의 2 가지 유형 사이의 상이한 재생된 골 구조의 형태학의 조직학적 입증을 도시한 것이다.
도 13
이 도면은 개에서의 3급 치근분기 결함의 치료를 위한 수술 준비를 도시한 것이다. 도면에서 각각의 화살표는 약 5 ㎜에 해당한다.
[실시예]
실시예 1
원숭이에서의 치아 지지 조직 재생(Tooth Supporting Tissue Regeneration)
본 실험의 목적은 치아 지지 조직의 재생에 대한 비이클 프로필렌 글리콜 알기네이트와 혼합된 각종 농도의 에나멜 매트릭스 유도체의 효과뿐 아니라, 이의 생물학적 안전성을 평가하고자 하는 것이다. 본 발명에서 사용된 에나멜 매트릭스 유도체는 표준 에나멜 매트릭스 제제의 저 분자량 단백질 분획으로 이루어진다.
물질 및 방법
테스트 물질: 에나멜 매트릭스 유도체, 배취(batch) PEU 801.
공급원: 에나멜 매트릭스는 돼지 치배로부터 분리하고, 균질화시키고, 저 분자량 단백질 분획을 추출하였다.
비이클: 프로필렌 글리콜 알기네이트 용액 2.5% w/v, 배취 PGA 803.
테스트 물질 및 비이클의 보관: 테스트 물질 및 비이클을 -18℃에서 보관하였다. 물질 및 비이클을 포함하는 병을 사용전 실온으로 평형화시켰다.
테스트 제제의 투여: 물질을 층류 유동 후드하에 무균으로 비이클로 용해시키고, 각각을 원숭이에 대하여 사용하였다. 실험전 테스트 물질의 최종 농도를 측정하고, 이를 ㎎ 단백질/㎖ 재구성 용액 단위로 나타내었다(표 4).
동물: 3 내지 4 세의 긴꼬리 원숭이(Macaca fascicularis) 7 마리를 스웨덴 솔나에 소재하는 내셔날 박테리올로지칼 래버러토리의 영장류 연구 센터로부터 구입하고, 동물을 실험 동안 가두었다. 각각의 동물에게 각각의 식별 코드를 부여하였다. 이들을 온도 18℃ 내지 22℃, 상대 습도 40 내지 70%, 오전 6 시 내지 오후 6 시까지의 광인 조절된 환경에서 우리에 각각 넣었다.
원숭이에게는 표준 원숭이 사료(R3, 스웨덴 소더탈제에 소재하는 Ewos AB) 및 수도물을 자유롭게 먹게 하였다. 신선한 과일로 식단을 매일 보충하였다.
실험 설계: 각각의 원숭이의 치아를 실험군 또는 대조군으로 할당하였다. 변형된 Widman 기법에 의하여 치주 시술을 실시하였다. 피부판을 재배치 및 봉합하기 이전에 테스트 치아의 뿌리면에 테스트 제제를 적용하였다. 대조군 치아는 어떠한 테스트 제제도 부여하지 않은 채 겉보기(sham) 수술하였다. 하기의 절차를 단계적으로 실시하였다:
1. 수술 30 분전, 테스트 물질을 포함하는 바이알을 준비하였다. 테스트 물질의 한 바이알을 2 개의 치아의 각각의 군에 사용하였다. 20 분간 테스트 물질이 용해되도록 하였다. 용액을 3 ㎖ 주사기로 빼내고, 피스톤에 침전되도록 하였다. 피스톤을 눌러 주사기로부터 공기를 주의하여 제거하였다.
2. 동물을 나트륨 판토바르비탈로 마취시키고, 수술하기 위하여 선택한 부위를 국부 마취하고, 소독하였다. 전체 두께의 피부판(점막골막피판)을 구강 및 치아의 안면쪽에서 들어올렸다.
3. 살균 염수로 일정하게 세정하면서 크고 둥근 천공기로 협측 골 판을 제거하였다. 이 부위를 살균 염수로 철저하게 세정하고, 노출된 치근을 30 초간 37% 오르토인산 또는 구연산(pH 1)으로 에칭시켰다. 살균 염수로 최종 세정하였다. 과량의 유체는 면봉으로 닦아내었다.
4. 골 결함의 치근 첨단부로부터 시작하여 테스트 제제를 즉시 적용하고, 노출된 전체 치근면을 피복하였다.
5. 피부판을 재배치하고, 이를 함께 봉합하였다. 치주 드레싱은 사용하지 않았다.
6. 대조군 치아 및 실험군 치아 주위의 국소 임상적 외관 및 원숭이의 일반적인 행동을 매일 보고하였다.
종말 실험: 56 일(8 주) 경과후, 나트륨 판토바르비탈을 과량으로 투여하여 원숭이를 죽이고, 대조군 및 나머지 치아를 조직학적으로 평가하였다.
조직학적 제제: 실험군 및 대조군 치아를 치조골 및 연조직 주위와 함께 해부하고, 이를 광 현미경 조사에 사용하였다. 검체를 저온의 10% 완충 포르말린에서 48 시간 동안 고정시키고, 5% 포름산중에서 탈무기질화시키고, 파라핀에 매립시키고, 협설측 방향으로 치아의 장축에 평행하게 절단하였다. 잘라낸 부분을 20 ㎛ 정도로 단계적 일련으로 절단하고, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 그후, 이를 투과된 정상의 광 및 편광으로 조사하였다.
평가: 노출된 치근면의 조직 반응을 기록하고, 새로운 치조골 및 새로운 백악질로 피복된 치근 노출면의 비율로 나타낸 거리를 측정하였다(도 1 참조).
통계적 방법: 비모수에 의한 통계적 방법, 즉, 윌콕슨 순위합 검정법 및 맨-휘트니 U 검정법을 사용하여 실험군 및 대조군 부위 사이의 차이의 유의성을 평가하였다. 유의성 정도는 하기와 같다:
1. NS 유의성 없음
2. * p<0.05
3. ** p<0.01
4. *** p<0.001
데이타 및 검체의 저장: 상기 실험으로부터의 모든 생 데이타, 검체, 프로토콜 및 최종 보고서를 스웨덴 리딘고 181 31 크로쿠스바겐 12에 소재하는 바이오라 아베의 아카이브에 저장하였다. 관련 문헌: BIORA Scientific Report 9/88.
결과
임상적 고찰: 모든 동물은 테스트 기간 동안 건강한 상태를 유지하였으며, 유해한 부작용은 보고되지 않았다. 시험군 및 대조군 치아 모두에서의 치유는 순조로웠다.
일반적인 행동: 모든 동물은 개개의 동물 사이의 뚜렷한 차이 없이 정상적으로 행동하였다.
식품 섭취: 사료 및 물 소비는 개개의 동물 사이의 뚜렷한 차이 없이 정상인 것으로 나타났다.
종말 실험:
육안 검사: 육안으로 본 외관은 뚜렷한 치은 염증 없이 모든 시험군 치아 주위에서 건강한 치은을 갖는 것으로 나타났다. 유해한 부작용은 보고되지 않았다. 모든 대조군 치아의 협측 치은은 치은 변연이 있는 중간 정도의 염증이 나타났다.
현미경 검사: 현미경 및 형태 계측 검사에 의하면, 시험군 및 대조군 치아 사이에는 유의적인 차이가 존재하는 것으로 밝혀졌다(표 4 및 5). 기기를 설치한 치근면에 강하게 부착된 새로운 백악질은 실험군 치아에서 다양한 정도로 형성되었다. 백악질 층은 편광 현미경에 의하여 밝혀진 바와 같이 치주막과 관련된 작용적으로 배향된 치주 섬유를 포함한다. 또한, 치주 막에 부착된 치조골은 노출된 실험 치근면에서 다양한 정도로 존재한다(표 4 및 5). 연접 상피는 새로이 형성된 백악질 층보다 더 분화되지는 않았으며, 치은 염증은 거의 존재하지 않는다. 새로운 치조골 또는 임의의 유의적인 새로운 백악질 어느 것도 대조군 치아에서는 형성되지 않았다. 초기에 노출된 치근면은 치근의 아래쪽으로 약 반정도 수축된 긴 연접 상피로 피복되었다. 적당한 치은 염증이 협측 구강 점막에 존재하였다. 시험군 및 대조군 치아 사이의 통계적 분석 차는 각종 수준에서 유의적인 것으로 밝혀졌다(표 4 및 5).
토의
본 실험의 목적은 치아 지지 조직의 재생에 대하여 비이클 프로필렌 글리콜 알기네이트와 혼합된 에나멜 매트릭스 유도체의 각종 농도의 효과뿐 아니라 생물학적 안전성을 평가하기 위한 것이다. 본 실험에 사용한 모델은 에나멜 매트릭스 유도체의 임상적 용도에서 의도한 임상적 설정과 거의 동일하다. 통상의 치주 시술중에 외과 보조로서 테스트 제제를 투여하였다. 투여량은 체중을 기준으로 하여 등가의 크기의 단일 적용시 7.5 ㎎ 단백질인 사람에게 사용하는 투여량보다 더 낮은 것 및 더 높은 것이다. 대조군에는 겉보기 수술을 사용하였다.
치아 지지 조직(백악질, 치주 막 및 치조골)은 변연 치주염의 치료후 정상적으로 재생되지 않았다. 그 대신, 노출된 치근면은 치근에 작용적 부착을 제공하지 않는 상피 세포 층으로 피복된다. 그리하여, 치주 질환으로 손실된 치아 지지 조직은 통상의 방법으로는 재생될 수 없다. 이는 대조군 치아에 대하여 보고된 결과에 의하여 확인하였다. 그러나, 5.3, 10.7 및 26.7 ㎎ 단백질 /㎖의 테스트 제제를 사용하여 상태조절한 치근면은 외관상으로 새로운 치주 부착 장치를 형성하였다. 치근면의 형성에 대한 최근의 실험에 의하면, 이는 백악질로 피복될 뿐 아니라, 에니멜-유사 조직의 박층으로도 피복되는 것으로 나타났다. 이러한 에나멜-유사 조직은 백악질 형성 이전에 치근의 발육중에 형성된다. 백악질을 형성하는 세포가 성장할 수 있는 적절한 표면을 제공하는 것으로 보인다. 따라서, 백악질은 에나멜-유사 조직에 부착되며, 적절한 부착 장치가 형성될 것이다.
본 실험은, 10 ㎎을 초과하는 에나멜 매트릭스 유도체의 투여량으로 스크레이프 처리한(기기 장착한) 치근면을 상태조절하여, 백악질 및 관련 치주 막(작용적 치주)의 정상적인 부착이 형성된 것으로 나타났다. 치주 막과 관련된 치조골이 형성되었다. 이들 구조는 통상의 치주 시술후 정상적으로 형성되지 않는다. 그 대신, 치은으로부터의 상피는 노출된 치근면을 피복하며, 변연 골 높이는 기껏해야 동일하게 유지된다. 이는 본 실험의 결과에 기초하여 성공적인 치주 재생의 새로운 정의에 대한 필요성을 강조한다.
성공적인 치주 재생은 기기가 장착된 치근면에 강하게 부착된 새로운 백악질의 형성을 포함하여야 한다. 백악질 층은 치주 막과 관련하여 작용적으로 배향된 치주 섬유를 포함하여야만 한다. 게다가, 치주막에 부착된 새로이 형성된 치조골도 존재하여야만 한다.
새로운 부착 및 관련 치조골의 회복은 재배치된 구강 연조직에 의하여 피복된 치근의 높이로만 형성되는 것이 명백하다. 치근면이 피복된 치관 방향으로 높이가 높을수록, 더 높은 변연 골 증가가 가능하다. 또한, 상기의 결과로부터 5 ㎎ 단백질/㎖ 이하인 PGA에 용해된 에나멜 매트릭스 유도체의 농도가 성공적인 치주 재생을 유도하는데는 충분하지 않다는 결론을 내릴 수 있다. 그러나, 상기의 농도 이상에서는 치근면의 충분한 피복이 가능한 것으로 나타났다.
Figure pat00001
표 5
대조군 및 실험군 사이의 통계적 비교
테스트군
테스트 부위 갯수: 20
[표 5a]
Figure pat00002
[표 5b]
Figure pat00003

대조군
대조군 부위 갯수: 8
변연 골의 평균 증가: 0.0%
백악질의 평균 증가: 1.1%
통계적 유의성 테스트
비모수에 의한 통계적 방법, 맨-휘트니 U 검정법을 사용하여 실험군 및 대조군 부위 사이의 차이의 유의성을 평가하였다. 백악질 및 변연 골 모두의 회복에 대한 실험군 및 대조군을 비교하면 유의성 정도는 하기와 같다:
[표 5c]
Figure pat00004

실시예 2
래트 임계 크기 두개 결함(cranial defect)
래트 두개 시술
본 동물 실험 프로토콜은 스위스 연방법(Nr. 152/1997)에 의하여 취리히 칸톤의 수의청에 의하여 평가 및 허용되었다. 스프라그-돌리 알비노 래트를 사용하였다(84 내지 92 일령, 모두 암컷). 래트를 4 마리 이하의 군으로 가두고, 표준 식이로 유지하였다.
27 마리의 동물을 할로탄/O2를 사용한 유도 및 유지에 의하여 마취시켰다. 수술 부위를 클립으로 집고, 무균 시술을 위하여 베타딘을 준비하였다. 코뼈로부터 정중시상까지 직선 절개를 실시하였다. 연조직을 반전시키고, 골막을 부위(후두골, 전두골 및 두정골)로부터 절개하였다. 8 ㎜ 개두술 결함은 치과용 핸드피스로 천공기를 사용하여 생성하였으며, 경질막의 천공은 주의하여 발생하지 않도록 한다. 그후, 수술 부위를 염수로 세정하여 골 부스러기를 제거하고, 예비형성된 겔을 결함내에 두었다. 그후, 연조직을 피부 봉합기로 닫았다. 수술후, 진통제는 부프레노르핀(0.1 ㎎/kg)의 피하 주사로 제공하였다. 래트를 이식후 적절한 시간에서 CO2 질식으로 죽였다. 5 ㎜ 근접한 골을 갖는 개두술 부위를 두개골로부터 복구하고, 40% 에탄에 넣거나 또는 고정 매체(파라포름알데히드 4%)에 넣었다. 모든 단계에서 시술의사는 결함의 치료에 대하여서는 모르는 것으로 한다.
겔의 제조
EMD를 0.10% 아세트산에 용해시켜 최종 겔의 소정의 EMD 함량에 따라 각종 농도의 스톡 용액을 생성하였다. 시스테인-RGD, PEG-디티올 3.4k 및 4-아암 PEG-아크릴레이트 15k를 0.30 M 트리에탄올아민/HCl 완충액 pH 8.5에 용해시켰다. PEG-EMD 겔은 약 15 중량% PEG를 포함하는 20 ㎕ 용액을 산출하는 모든 용액을 등몰수의 아크릴레이트 및 티올 기, 8 ㎍ 시스테인-RGD 및 0-250 ㎍ EMD와 혼합하여 주조하였다. 용액은 1 시간 동안 37℃에서 겔화시키고, 겔을 PBS, pH 7.4로 옮겼다. 수 시간 경과후, 이들을 부피 100 ㎕ 및 직경 8 ㎜로 팽윤시켰다.
방사선촬영술
동물을 죽이고, 5 ㎜ 근접한 골 주위를 갖는 결함 부위를 제거하여 얻은 검체를 치과 방사선촬영술 유닛을 사용하여 초고속 치과용 필름(미국 뉴욕주에 소재하는 이스트만 코닥 컴파니)으로 화상을 얻었다. 그후, 방사선사진을 스캐닝하고, 디지탈 화상을 화상 분석 프로그램(Leica(등록상표) Q-Win)으로 처리하였다. 결함의 내부 및 외부에 형성된 새로운 골의 면적을 초기 결함 부위의 비율로 계산하여 각종 배합물의 치유 속도를 비교하였다(도 2 참조).
실시예 3
돼지에서의 치아 지지 조직 재생
목적:
겉보기 대조군 치아와 비교하여 하악에서의 치유 및 재생 과정에 대하여 그리고 에나멜 매트릭스 유도체 및/또는 이식편 물질, PEG 겔을 사용한 치료의 국부 효과의 임상적, 정량적 및 조직학적 비교를 위하여 결함 모델을 사용하기 위함이다.
동물:
미니피그, 멧돼지, 성체(18 개월령 이상), 암컷. 수술전, 동물을 길들이고, 국부 동물 사육 시설내에서 관찰하였다.
실험 설명:
1. 동물을 마취(근육내 카탈라 + 정맥내 판토탈 및 도르미쿰) 상태를 유지하였다. 자일로카인-아드레날린(치과용)을 사용한 국부 마취.
2. 동물을 검사하였다.
3. 필요할 경우, 돼지의 입 주위를 면도하고, 피부를 Chlorhexidin(등록상표)(60% EtOH중의 5 ㎎/㎖)으로 세정하였다. 수술 부위의 사진을 촬영하였다.
4. Q1에서의 출발: 침윤 마취를 은협이행부에 적용하였다. 치간 유두 및 변연 치은 부위로의 주사는 피하도록 하였다.
5. 염증의 정도를 평가하고, 치태 및 치석을 제거하였다
6. 제1의 작은어금니로부터 제1의 큰어금니까지 각 단부에서 수직 방출 절개로 변연 절개를 실시하였다. 점막골막피판을 들어올려 치조골을 노출시켰다.
7. 협측 골은 천공기 및 수동 기기를 사용하여 각각의 치근으로부터 조심스럽게 제거하여 약 6 ㎜ 깊이 및 2 ㎜ 폭의 열개 결함(dehiscence defect)을 생성하였다. 치주 인대 및 백악질의 노출된 치근면으로부터 살균 염수로 일정하게 세정하면서 CEJ로부터 6 ㎜의 거리로 제2의 작은어금니로부터 제4의 작은어금니까지 제거하였다. 결함의 첨단부(AED: apical end of defect)는 패임으로 표시하였다. 총 6 개의 결함이 각각의 사분체에서 생성되도록 하였다(즉, 동물 1 마리당 각각의 하악에서 12 개).
8. 인대 및 백악질의 제거후, 치아면을 앰플량의 살균 염수로 세정하기 이전에 PrefGel(등록상표)(스웨덴의 바이오라)로 2 분간 처리하였다.
9. CEJ로부터 AED까지의 거리를 측정하고, 기록하고, 사진을 촬영하였다.
10. 테스트 물질(치료 리스트 참조, 겉보기=없음)을 결함에 적용하고 사진을 촬영하였다.
11. 피부판을 즉시 재배치하고, Vicryl 봉합사로 닫았다. 피부판은 골 결함을 완전히 피복되고, 피부판을 완전 재배치하고, 고정시키고, 다시 사진 촬영하였다.
12. 문항 4-14에 의하여 , Q2에 대한 절차를 반복하였다.
후 처리
수술후 1 주일간 동물에게 유동식을 주었다. 항생제(스트렙토실린 5 mill u/일을 수술후 2 일간 투여하였다. 진통제(Voltaren, 수술후 25 ㎎).
고찰
4, 6 및 8 주에, 동물에게 진정제를 투여하고, 실험 결함의 치유를 검사하였다. 결함의 깊이는 표준 포켓 탐침(인체 임상용)을 사용하여 탐침하고, "포켓 탐침 깊이"는 치은 퇴축의 정도(필요할 경우)와 함께 각각의 결함에 대하여 밀리미터 단위로 기록하였다. 치유는 사진 촬영으로 입증하였다. 모든 불리한 사례는 보고하였다.
종료:
실험을 종료하고, 고찰 8 주후 동물을 죽였다.
1. 1 ㎖ Spiritus 포트중의 100 ㎎ 펜토바르비탈 나트륨 40 ㎖. 290 g/1,000 ㎖를 테스트 계획에 의하여 수술후 8 주에서 동물에게 i.c. 투여하였다.
2. 완전한 치근을 포함한 모든 실험 치아를 포함한 분절을 각각의 실험 하악으로부터 절단하였다.
3. 새로 만들고 냉장(4℃)시킨 다량(200 ㎖)의 인산염 완충 포르말린 pH 7.4에 별도의 분절을 즉시 담갔다. 용기에 동물 번호, 사분체 번호, 시술의 및 일자를 조심스럽게 기록하여야만 한다. 포르말린은 잘 고정되도록 하기 위하여 4 시간 후 1회 교체하였다.
4. 샘플을 에폭시에 매립시키고, 가능한 한 빨리 분쇄하여 절단하여 처리하였다. 처리가 가능할 때까지 포르말린 고정시킨 샘플을 냉장고에 보관하였다.
키트 제조
모든 물질은 무균 상태에서 처리하였다.
PEG-티올/EMD 용액:
1.20 g의 4-아암 PEG-티올 2k(Nektar)를 20 ㎖의 0.05% 살균 아세트산 수용액에 용해시켰다. 이 용액을 여과로 살균하였다. 0.520 g의 살균 EMD를 10 ㎖의 0.05% 살균 아세트산 수용액에 용해시켰다. 용액 모두를 합하고, 살균 유리 주사기에 각각 300 ㎕의 PEG-티올/EMD 용액을 채웠다. (주사기 1 개당 12 ㎎의 4-아암 PEG-티올 2k 및 5.2 ㎎의 EMD)
활성제 용액:
1.865 g의 트리에탄올아민(Merck, PhEur)을 250 ㎖의 WFI(0.050 M)에 용해시키고, 용액의 pH를 HCl을 사용하여 pH 8.6으로 조절하였다. 5.0 g의 Keltone HVCR(ISP)을 격렬히 교반하면서 95 ㎖의 트리에탄올아민/HCl 용액에 용해시켰다. 생성된 용액을 암 Luer(678 ㎎)를 갖는 플라스틱 주사기에 넣었다. 3.0 g Cekol 10'000(Noviant; S1408)을 격렬히 교반하면서 80 ㎖의 트리에탄올아민/HCl 용액에 용해시켰다. 생성된 용액을 암 Luer(678 ㎎)를 갖는 플라스틱 주사기에 넣었다. 활성제 주사기를 각각 필 백(peel bag)에 넣고, 증기 소독(121℃/15 분)하였다.
PEG-아크릴레이트 바이알:
3.6 g의 4-아암 PEG-아크릴레이트 15k(Nektar)를 35 ㎖의 WFI에 용해시켰다. 클린룸에서, 상기 용액 바이알의 0.70 ㎖ 분액을 바이알에 채우고, 동결건조시켰다. 동결건조후, 바이알에 질소를 채우고 닫았다. (바이알 1 개당 72 ㎎의 4-아암 PEG-아크릴레이트 15k)
PEG/EMD 겔의 제조 (겔 1 g당 4.9 ㎎ EMD):
적용 적전에, 동결건조시킨 PEG-아크릴레이트를 PEG-티올/EMD 용액에서 재구성하고, 생성된 용액을 다시 유리 주사기로 옮기고, 그후, 이를 활성제 주사기에 연결시켰다. 피스톤을 앞뒤로 약 15 회 이동시켜 주사기 모두의 내용물을 혼합하였다. 혼합후, 겔이 완전히 형성되기 이전에, 생성물을 약 2 분간 적용하였다.
미니피그 수술의 실험 세트
실험 번호 돼지 ID 계획한 처리 실시한 처리
1 62307 Q1: 겉보기 수술
Q2: 겉보기 수술		 Q1: 겉보기
Q2: 겉보기
2 65867 Q1: Emdogain 30 ㎎/㎖
Q2: Emdogain 30 ㎎/㎖		 Q1: Emdogain 30 ㎎/㎖
Q2: Emdogain 30 ㎎/㎖
3 64447 Q1: Emdogain 30 ㎎/㎖
Q2: Emdogain 30 ㎎/㎖		 Q1: Emdogain 30 ㎎/㎖
Q2: Emdogain 30 ㎎/㎖
13 66770 Q1: EMD 5 ㎎/㎖
+ EMD 2 세대 ALG
Q2: EMD 5 ㎎/㎖
+ EMD 2 세대 ALG		 Q1: Keltone-완충액, GLP 41/46
+ Emdogain 5 ㎎/㎖, GLP 41/47
Q2: Keltone-완충액, GLP 41/46
+ Emdogain 5 ㎎/㎖, GLP 41/47
14 82118 Q1: EMD 5 ㎎/㎖
+ EMD 2 세대 CMC
Q2: EMD 5 ㎎/㎖
+ EMD 2 세대 CMC		 Q1: Cekol-완충액, GLP 41/45
+ Emdogain 5 ㎎/㎖ GLP 41/47
Q2: Cekol-완충액, GLP 41/45
+ Emdogain 5 ㎎/㎖ GLP 41/47
모든 결함은, 테스트 물품의 적용 이전에, 1 분간 PrefGel(등록상표)로 처리한 후, 염수로 앰플 세정하였다.
사용한 물품 리스트:
PrefGel 로트 1008
Emdogain 30 ㎎/㎖ 로트 ETP 3102
PGA 1.5 ㎖ 바이알중의 로트 FoU 2113
EMD 9.5 ㎎/바이알 로트 9102
골 세라믹 로트 LK 040109
결과
표 7에서 명백하게 알 수 있는 바와 같이, GLP 41/47중의 4.9 ㎎/㎖ 농도의 활성 에나멜 물질 유도체(EMD)는 실험 결함의 치유에 대하여 Emdogain 30 ㎎/㎖와유사하거나 또는 이보다 더욱 현저한 효과를 지닌다. 결과는 도 3에 요약하였다. 또한, 도 3에서 유추할 수 있는 바와 같이, Keltone 또는 Celco 겔중의 4.9 ㎎/㎖ 농도의 공시험, Emdogain 및 EMD를 비교하면, 4 주후 Emdogain은 Keltone 또는 Celco 겔중의 4.9 ㎎/㎖의 농도에서 EMD보다 다소 더 우수하게 작용하였으며, 6 주후 대락 동일하게 작용하였으며, 8 주후 Keltone 또는 Celco 겔중의 4.9 ㎎/㎖ 농도의 EMD는 더 잘 작용하였다. 이는 이와 같은 유형의 겔에 대하여 시험관내에서(37℃, pH 7.4) 발견된 4 주의 분해 시간에 해당한다. PEG 겔이 존재하는 한, 결함이 특정 정도로 골로 채워지는 것을 방지하는 것을 예상할 수 있다.
Figure pat00005
실시예 4
토끼 두개 원통형 천공 결함(Rabbit Cranial Cylindrical Drill Defect)
본 실험의 결과는 골 유도 재생에 미치는 신규한 생활성 골 대체물의 효과에 관한 정보를 제공한다.
가설:
최적화된 세포 내성장 능력을 갖는 새로이 생성된 매트릭스에 대한 활성 에나멜 물질의 결합 효과는 표준 이식편 시술(양성 대조군) 및 자발적 치유(음성 대조군)에 비하여 골 조직 재생이 개선되었다.
물질 및 방법:
동물
체중이 3 내지 4 ㎏인 뉴질랜드 백색 토끼 성체 24 마리를 본 실험에 사용하였다. 동물은 실험 동물용 목적 설계된 방에 두고, 표준 실험실 사료를 먹였다.
수술 절차 및 물질:
뉴질랜드 백색 토끼 24 마리의 이마(두개관)에 직선 절개를 실시하고, 2 개의 피부 피부판을 들어올리고, 측면에서 반전시켰다. 유사하게, 골막을 절단하고, 반전시켜 두개 골의 상부를 노출시켰다. 우측 및 좌측 두정골 및 전두골의 부위에서, 1 ㎜ 드릴 깊이만을 허용하는 슬리이브를 갖는 트레핀 드릴을 사용하여 원형 홈을 만들었다. 상기 원의 내부의 외부 피질이 제거되지 않도록 주의를 기울인다. 5 개의 작은 둥근 드릴 결함을 원의 내부의 상부 피질판에 생성하여 챔버내의 골수에 접근이 더 잘 되도록 하였다. 그후, 1 ㎜ 깊이의 나선형 패임이 있는 티타늄으로 생성된 원통형 튜브를 주요 안정성을 위한 홈 각각에 배치하였다. 4 개의 튜브는 이의 내부에서 기계가공한 표면을 나타낸다. 튜브는 높이가 6 ㎜이고, 외경이 6 ㎜이었다.
물질의 분포는 각각의 개별 실험에 따른다. 그러나, 각각의 실험에서, 튜브중 하나는 음성 대조군으로 작용하며, 비어 두었다. 그 다음 3 개의 물질은 테스트 물질뿐 아니라 필요할 경우 양성 대조군을 포함한다. 양성 대조군을 사용할 경우, 표준 이식편 물질을 비워두었다. 오늘날 표준 사람 이식편 절차(Bio-Oss(등록상표), 스위스 볼후젠에 소재하는 가이스트리히 아게)에 사용되는 소 유래 골 미네랄을 사용하는 것은 선택으로 한다. 각각의 동물의 앞쪽 및 뒤쪽 실린더의 수가 동일하고, 좌측 및 우측의 수가 동일하도록 물질을 각 동물에서의 실린더에 분포시켰다. 마지막으로, 전신 효과에 대한 조절을 위하여, 일련의 투여를 실시할 경우, 상이한 투여량의 활성 인자를 갖는 2 개의 물질을 동일한 동물에 배치하지는 않았으며, 특정의 대조 샘플은 활성 에나멜 물질 치료를 받지 않은 동물에게 고의로 배치하였다. 앞 및 뒤에서 동일한 물질이 한 세트가 되도록 각각의 동물에서 각각의 샘플을 쌍으로 만들었다.
시험관은 골쪽을 향하여 개방되어 있으나, 피복 피부-골막 피부판을 향하여 티타늄 뚜껑으로 폐쇄시켰다. 골막 및 피부 피부판을 적응시키고 봉합하였다. 4, 8 및 16 주후, 8 마리 동물이 죽었다. 각각의 처리에 대한 각각의 시점에서의 샘플의 수는 8 개이었다.
매트릭스 및 성장 인자
기본적으로 2 개의 상이한 매트릭스를 본 실험에 사용하였다. 사람 피브리노겐 및 합성계 PEG 겔로부터 유래한 피브린 매트릭스는 모두 높은 세포 내성장 능력에 대하여 특이적으로 변형되었다. 겔은 특이성 활성 에나멜 물질을 포함하여 활성 에나멜 물질이 이의 전달 매트릭스(공유 결합)와 상호반응하여 이식후 특이적 방출 프로파일을 달성하였다. 또는, 겔을 합성 인산칼슘 과립과 혼합하였다. 사용한 과립은 인체 수술에 가장 널리 사용되는 다공성 인산삼칼슘/히드록시아파타이트(비 40:60)의 혼합물로 이루어져서 이식편 시술을 위한 퍼티형 재구성 물질을 만들었다.
EMD는 2 가지 농도 및 2 가지 유형의 겔, 즉 PEG + 100 ㎍/㎖ EMD 및 PEG + 500 ㎍/㎖ EMD 데이타 및 PEG/RGD + 500 ㎍/㎖ EMD로 제조하였다.
조직학적 제제 및 조직형태학적 측정
탈석회작용 없이 분쇄한 절편에 대하여 표준 기법에 의하여 검체를 처리하였다. 튜브내에서 그리고 튜브의 벽면을 따른 골 밀도는 표준 조직형태학적 측정 기법을 적용하여 정량 분석하였다.
통계
본페로니 수정을 이용한 1 방향 ANOVA 테스트를 사용하여 실험군 및 대조군 사이의 차이뿐 아니라, 실험군 또는 대조군에 대한 시간 경과에 대하여 검출하였다. 모든 통계적 테스트에서의 유의성 수준은 α=0.05에서 선택하였다.
결과
도 4 및 도 5는 PEG/RGD + 500 ㎍/㎖ EMD가 골 재성장에 대하여 최선의 효과를 지닌다는 것을 명백히 입증한다. 그리하여, 활성 에나멜 물질을 최적화된 세포 내성장 능력을 갖는 새로이 생성된 매트릭스에 결합시키는 것은 골 조직 재생을 개선시킨다.
실시예 5
미니피그에서의 치주 열개 모델(periodontal dehiscence model)
1. 서문 및 타당성
2 가지의 새로운 담체(알기네이트 또는 카르복시메틸셀룰로스를 포함하는 PEG)를 사용하여 생성된 에나멜 매트릭스 유도체(EMD)를 본 조사에서 테스트하였다. 미니피그 결함 모델은 치주 조직의 치유 및 재생 과정에 대하여 에나멜 매트릭스 유도체(EMD)를 사용한 치료의 국부 효과의 임상적, 정량적 및 조직학적 비교시 이력 기준이 된다.
3. 목적
수행하고자 하는 주요 목적은 2 가지의 새로운 담체(알기네이트 또는 카르복시메틸셀룰로스를 포함하는 PEG)를 사용하여 생성된 에나멜 매트릭스 유도체(EMD) 및 Emdogain(등록상표) 사이의 치주 재생의 비교 평가로 이루어진다.
4. 조사시 변수
4.1. 1차 변수
·1차 변수는 치주 포켓 탐침 깊이에서의 감소의 임상적 평가로 이루어진다.
4.2. 2차 변수
·조직학 및 조직형태학적 측정에 대한 설명은 골 결함 깊이의 감소, 백악질 높이, 치주 인대 존재, 2차 변수의 제1의 군으로 형성된 골 면적의 평가를 기준으로 한다. 무기질화된 조직의 정량적 평가의 경우, 무기질화된 조직만이 절편에 나타나기 때문에, 마이크로X선으로의 골 측정은 조직형태학적 측정 접근의 질을 크게 개선시킨다. 이와 같은 실험에서 조직형태학적 측정이 조직학적 절편으로부터 얻은 마이크로X선에서 실시하는 이유가 된다.
·염증 등급(없음, 가벼운, 중등도, 심함), 퇴축의 길이 및 폭(백악질-에나멜 경계로부터 치은의 상부까지 ㎜ 단위로 측정함)은 2차 변수의 제2의 군에 속한다.
5. 물질 및 방법
5.1. 동물
미니피그, 멧돼지, 성체(18 개월령 이상), 암컷. 수술전, 동물을 길들이고, 국부 동물 사육 시설내에서 관찰하였다.
5.2. 수술 및 수술후
5.2.1. 수술
동물을 일반적인 마취(근육내 카탈라 + 정맥내 도르미쿰)하에 유지하였다. 또한, 자일로카인-아드레날린을 사용하여 국부 마취를 국부적으로 실시하였다.
시술의 여러 단계는 하기와 같다:
- 동물의 검사 및 기록부의 제1면에 기록
- 돼지의 입 주위를 면도하고, 피부를 Chlorhexidin(등록상표)(60% EtOH중의 5 ㎎/㎖)으로 세정하였다.
- Q1에서의 출발: 치간 유두 및 변연 치은 부위로의 주사는 피하도록 하여 은협이행부에 침윤 마취를 실시하였다. 염증 정도를 평가하고, 치태 및 치석을 제거하였다.
- 제1의 작은어금니로부터 제1의 큰어금니까지 각 단부에서 수직 방출 절개로 변연 전개를 실시한 후, 점막골막피판을 들어올려 상악에서의 치조골을 노출시켰다.
- 치주 인대 및 백악질뿐 아니라, 협측 골 판의 천공기 및 수동 기기 "윈도우"를 사용하여 살균 염수로 일정하게 세정하면서 제2의 작은어금니로부터 제4의 작은어금니까지 제거하였다. CEJ로부터 5 내지 6 ㎜ 거리로 각각의 치근의 주축에서 수직 결함이 생성되었다. 결함의 첨단부(AED)는 패임으로 표시하였다. 결함의 평균 최종 크기는 높이=6 ㎜, 폭=2 ㎜, 깊이=3 ㎜이다.
- 인대 및 백악질의 제거후, 치아면을 앰플량의 살균 염수로 세정하기 이전에 PrefGel로 2 분간 처리하였다.
- CEJ로부터 AED까지의 거리를 측정하고 기록하였다.
- 테스트 물질(겉보기=없음)을 결함에 적용하였다.
- 피부판을 재배치한 후, 수술 부위를 Vicryl 봉합사로 닫았다. 피부판은 골 결함을 완전히 피복하고, 피부판을 완전 재배치하고, 고정시키는 것에 유의한다.
- 동일한 절차를 제2의 사분체에 대하여 반복하였다.
도 6은 통상의 수술 상처를 도시한다.
5.2.2. 수술후
수술후 1 주일간 동물에게 유동식을 먹였다. 항생제(스트렙토실린 5 mill u/일을 수술후 2 일간 투여하고, 수술후 진통제(Voltaren, 25 ㎎)를 투여하였다.
5.3. 실험군 및 대조군
총 10 마리의 동물을 실험에 사용하였으나, 그중 한 마리가 테스트한 물질중 하나의 이식과는 상관 없는 이유로 죽었다.
2 개의 결함이 각각의 상악골 치아에서 생성되었으며, 6 개의 치아가 각각의 동물에 사용되었으며, 각각의 동물에서의 결함의 총수는 12이었다.
관련성이 큰 군(하기 참조)에서, 총 48 개의 결함을 각각의 유형의 치료에 대하여 평가하였다.
하기의 군을 조사하였다.
5.3.1. 실험군
PEG-Ec=PEG(CMC 포함) + EMD(4.9 ㎎/㎖의 농도): 4 마리 동물
PEG-Ek=PEG(Alg 포함) + EMD(4.9 ㎎/㎖의 농도): 3 마리 동물
5.3.2. 양성 대조군
Emdogain(등록상표)(시판중임, 30 ㎎/㎖ 농도의 EMD): 1 마리 동물
5.3.3. 음성 대조군
Figure pat00006
5.4. 치유 시간
Straumann-Biora(말뫼)로부터 입수 가능한 이전의 데이타에 의하면, 임상적 상황을 평가하고, 4, 6 및 8 주후 치주 측정을 실시하는 것을 예견한다. 또한, 조직학적 평가(정성적 및 정량적)는 8 주의 치유 기간후 실시하였다.
5.5. 종료
1 ㎖ Spiritus 포트중의 100 ㎎ 펜토바르비탈 나트륨 40 ㎖의 주사. 290 g/1,000 ㎖를 테스트 계획에 의하여 수술후 8 주간 동물에게 i.c. 투여하였다.
완전한 치근을 포함한 모든 실험 치아를 포함한 분절을 각각의 실험 상악으로부터 절단하였다.
5.6. 분석 방법
5.6.1. 치주 탐침
탐침을 사용하여 실시한 치주 탐침은 수술 당일 및 4, 6 및 8 주후 포켓 깊이를 평가하고자 한다. 이러한 측정은 "맹검법"의 통상의 규칙에 의하여 실시하였다. 조사자는 조사 대상인 동물이 어느 군에 속하는지를 모른다.
5.6.2. 조직학
새로 만들고 냉장(4℃)시킨 다량(200 ㎖)의 인산염 완충 포르말린 pH 7.4에 별도의 절편을 담갔다. 포르말린은 잘 고정되도록 하기 위하여 4 시간 후 1회 교체하였다.
샘플을 에폭시에 매립시키고, 분쇄로 (약 25 ㎛의 두께로) 절단하여 처리하였다.
샘플을 통상의 비-탈무기질화된 제조 방법에 이어서 메틸 메타크릴레이트에 매립시키고, 절편으로 만들고(Polycut-S, Reichert-Jung, 스위스에 소재하는 라이카 마이크로시스템즈), 톨루이딘 블루로 염색시켜 처리하였다.
조직학 절편은 이식편 부위에서 치주 인대의 존재를 정의하고자 정성적 및 반-정량적 분석에 사용하였다.
5.6.3. 마이크로-방사선촬영술
X선 발생기를 사용한 마이크로-방사선사진 촬영은 최종 분쇄를 (두께 50 ㎛) 실시하기 이전에 조직학적 절편에 실시하였으며, 광 현미경하에서 정량적으로 분석하여 골의 높이 및 면적을 평가하였다.
6. 결과
6.1. 임상적 치주 탐침 및 퇴축 측정
포켓 깊이 측정과 관련된 결과만을 요약하고자 한다.
6.1.1. 임상적 치주 탐침
임상적 측정에 의하면, 각각의 치료로는 포켓 깊이 감소면에서 이로운 것으로 입증되었다. 수술 당일로부터 6 주 및 4 주를 통하여 8 주까지 각 군에는 포켓 깊이의 점진적인 감소가 존재한다. 차이는 이들 상이한 시점 사이에서의 각각의 군에서의 통계적 유의성이 있다. 유일한 예외는 Emdogain 군의 경우 주 4로부터 주 8까지 평탄부 단계가 존재한다는 점이다. 특정의 경우에서, 차이는 한 군으로부터 다른 군까지의 각각의 시점을 비교할 경우 통계적으로 유의성이 있다는 점이다.
[표 8a]
Figure pat00007

6.2. 조직학(정성적 및 반-정량적 분석)
정성적으로 Emdogain(등록상표) 군은 잘 기질화된 치주 인대에 의하여 새로운 백악질로부터 분리된 성숙 및 층판골의 재생을 나타낸다. 일반적으로, PEG-Ek 및 PEG-Ec 기는 2 개의 PEG 매트릭스가 수술중에 배치된 위치를 유지하는 것으로 보이는 비-성숙 및 조밀하게 혈관화된 새로운 골의 존재를 입증한다(도 7 및 도 8 참조). PEG-Ec(CMC)의 경우에서, 치주 인대 존재는 Emdogain(등록상표) 군에서 발견되는 것에 상응하는 것으로 관찰되었다(도 9 및 도 10 참조). 의심스러운 사례는 하기의 표에서 참고하지 않았다.
Figure pat00008
치주 인대 존재 비율에 대한 의심스로운 사례의 양:
겉보기 = 5 PEG-Ek = 9
Emdogain = 4 PEG-Ec = 10
6.3. 마이크로X선(정량적 분석)
골 높이
모든 군은 2 ㎜ 이상의 유의적인 골 증가를 나타냈다. Emdogain(등록상표)은 2 개의 Emdogain Generation 2 군(p <0.005)에 비하여 통계적 유의성을 갖는 최고 성능(약 4 ㎜)에 도달하였다. 겉보기 군은 Emdogain(등록상표)보다는 덜 실시되나, PEG-Ec 또는 PEG-Ek 군보다는 더 우수하다. 도 11 참고.
골 면적
4 개의 군에서, 상당량의 골이 4 개의 상태 사이에서의 어떠한 통계적 차이도 없이 재생되었다(약 3 ㎟).
Figure pat00009
7. 토의
골 높이에 대하여, Emdogain(등록상표)은 기존의 결과 및 이미 발행된 문헌에 따라 실시하였다. 겉보기 군은 Emdogain Generation 2보다 더 우수한 결과를 나타냈다.
PEG-Ec는 Emdogain(등록상표)에 상응하는 치주 인대 존재를 나타내나, 대략 약 2 ㎜로 평가될 수 있는 길이에 대하여 나타난다.
재생된 골 구조체의 형태학이 PEG-Ec 또는 PEG-Ek인 2 개의 사이에서 상이하기는 하나(예를 들면 도 12 참조), PEG-Ec 및 PEG-Ek의 사용은 재생된 Emdogain(등록상표)과 유사한 골 함량이 생성된 것으로 나타났다. 상기 새로이 형성된 골의 재생은 실질적으로 EMD가 보충된 2 개의 PEG 매트릭스의 내부에서 실시되는 것으로 가정한다. 그후, 이식 당일의 이러한 매트릭스의 부피 및 위치는 해당 골 재생의 부피 및 높이에 작용한다.
실시예 6
치주 재생을 위한 신규한 활성 에나멜 유도체 배합물(PEG-EMD)의 평가. 개의 3급 치근분기 결함(class 3 furcation defect)의 실험 연구
1. 최신 기술 및 타당성
본 실험은 하기와 같이 보고된 파일럿 실험("Emdogain(등록상표) Generation 2의 평가: 미니피그의 치주 열개 모델에서의 파일럿 실험")을 수행하고자 한다.
"재생된 골 구조체의 형태학이 Emdogain(등록상표) Generation 2 및 Emdogain(등록상표)의 2 가지 유형 사이에서 상이하기는 하나, PEG-Ec 및 PEG-Ek(모두 PEG-EMD로 지칭함)의 사용에 의하여 Emdogain(등록상표)에 의하여 재생된 것과 유사한 골 함량이 형성되는 것으로 나타났다. 이와 같이 새로이 형성된 골의 재생은 실제로 EMD가 보충된 2 개의 PEG 매트릭스의 내부에서 실시된다고 가정한다. 그후, 이식 당일의 이들 매트릭스의 부피 및 위치는 해당 골 재생의 부피 및 높이에 작용할 수 있다".
2. 가설
PEG-EMD는 분기(3급 Hamp) 결함의 치료에 적용시 Emdogain(등록상표)의 사용에 의하여 얻은 치주 재생보다 뒤떨어지지 않는 치주 재생(골, 인대)을 유도한다.
3. 목적
3.1. 주요 목적
본 실험의 주요 목적은 개 모델에서, 3급 치근분기 결함의 치료에 사용할 경우 PEG-EMD가 Emdogain(등록상표)보다 정량적으로 더 높은 골 재생을 유도한다는 것을 입증하고자 한다.
3.2. 보충 목적
제2의 목적으로서, PEG-EMD의 적용후 치주 인대의 재생은 전술한 모델에서 Emdogain(등록상표)을 사용하여 얻은 것보다 뒤떨어지지 않는 것으로 입증되어야 한다.
4. 변수
4.1. 1차 변수
새로운 골 높이에서의 차이는 기준선과 종말점 사이에서 그리고 테스트(PEG-EMD) 및 양성 대조군(Emdogain(등록상표)) 사이에서 증강되었다.
4.2. 2차 변수
분기의 주위에서 1 이상의 치근의 표면을 라이닝 처리하는 치주 인대의 존재.
4.3. 3차 변수
골, 치주 인대, 백악질 및 연조직 구조의 완전한 설명을 함께 할 경우 제시되는 정성적 데이타
5. 동물 모델 및 관리
5.1. 동물 모델
약 16 개월령으로 체중 약 25 ㎏인 사냥개
P1 및 M1, P2 및 P3의 발치는 적소에서 유지한다.
3 개월 후: P2 및 P3에서의 5 ㎜ 높이의 치근분기 결함의 생성(Koo et al., 2004). (통상의 수술 설비의 경우 도 13을 참조한다. 도면에서, 각각의 화살표는 5 ㎜에 해당한다).
5.2. 동물 관리
동물 하우징, 수술 절차 및 사후처리는 프랑스 리용 샤스 쉬르 론느에 소재하는 BiomatechNAMSA의 실험 수술 장비로 GLP 규칙에 의하여 실시하였다.
6. 예상된 결과 및 파워 계산
문헌에는 기준선에서의 3급 치근분기의 내부 결함의 평균 높이가 4.7 ㎜(±0.2)인 것으로 보고되어 있다. 4 주후 자발적 치유는 1.8 ㎜(±0.3)의 골 높이 증가를 초래하는 것으로 예상된다.(Koo et al., 2004) → 음성 대조군: 공시험 및 PEG.
대조군(Emdogain(등록상표))으로부터 4 주후 유사한 결과가 예상되었다. 2 개월 및 4 개월 후, 증가는 약 1.5 ㎜(±0.5)로 제한된 상태를 유지하여야 한다.
실험군(PEG-EMD)은 골 증가가 4 주후 2.0 ㎜(±0.5), 2 개월후 2.5 ㎜(±0.5) 그리고 4 개월 후 3.0 ㎜(±1.0)로 나타나야만 한다.
7. 물질 및 방법
7.1. 물질
7.1.1. 테스트 물질
PEG-EMD:
72 ㎎의 동결건조된 4-아암 PEG-아크릴레이트 15k를 포함하는 바이알
0.05 중량% 수성 아세트산중의 12 ㎎ 4-아암 PEG-티올 2k 및 5.2 ㎎ EMD의 300 ㎕ 용액을 포함하는 주사기
680±10 ㎎의 0.05 M 수성 트리에탄올아민/HCl을 포함하는 주사기,
3.6 중량%의 Cekol 10'000을 포함하는 pH 8.5±0.1
PEG중의 EMD의 최종 농도: 4.9 ㎎/㎖
7.1.2. 양성 대조군
Emdogain(등록상표)
PGA중의 EMD의 농도: 30 ㎎/㎖
7.1.3. 음성 대조군
공시험
PEG
7.1.4. 보충 물질
보충 물질 없음
7.2. 방법
7.2.1. 실험 설계 및 계획
t 0: P1 및 M1의 발치
t 3 개월: 치조골 능선의 분쇄, P2 및 P3에서 3급 치근분기 결함의 생성
t 4 개월: 1 개월 고찰 기간후 죽임
t 5 개월: 2 개월 고찰 기간후 죽임
t 7 개월: 4 개월 고찰 기간후 죽임
7.2.2. 수술전 단계
치아의 발치,
치유 시간: 3 개월
7.2.3. 수술 단계
동물 1 마리당 각각의 하악측에서 2 개의 3급 치근분기 결함을 생성함.
치근분기 결함을 실험 물질 또는 대조 물질로 채움.
봉합이 중요하다.
7.2.4. 수술후 단계
치유 14 일후 봉합사를 제거한다.
수술후 6 주, 수술후 치태 제어
7.2.5. 고찰 및 분석
마이크로전산화 단층촬영술, 조직학 및 조직형태학적 측정
8. 종말점 및 종료 절차
수술후 1, 2 및 4 개월에서 동물을 죽인다.
문헌 리스트
Figure pat00010
Figure pat00011

Claims (25)

  1. 중합체 매트릭스 및 활성 에나멜 물질을 포함하는, 활성 에나멜 물질의 투여를 위한 약학적 및/또는 치료적 배합물로서, 상기 활성 에나멜 물질의 농도가 배합물 ml 당 5 mg 미만인 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 활성 에나멜 물질의 농도가 배합물 ml 당 1 mg 미만인 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 활성 에나멜 물질의 농도가 배합물 ml 당 250 ㎍ 미만인 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 활성 에나멜 물질의 농도가 배합물 ml 당 100 ㎍ 미만인 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 활성 에나멜 물질의 농도가 배합물 ml 당 50 ㎍ 미만인 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 활성 에나멜 물질의 농도가 배합물 ml 당 1 ㎍ 내지 1 mg인 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 활성 에나멜 물질의 농도가 배합물 ml 당 10 ㎍ 내지 250 ㎍인 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 활성 에나멜 물질의 농도가 배합물 ml 당 100 ㎍ 내지 500 ㎍인 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 에나멜 매트릭스 단백질의 중량비가 각각 20, 14 및 5 kDa에서의 주요 단백질 피이크 사이에서 약 80/8/12인 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  10. 제1항에 있어서, 중합체 매트릭스 및 이 매트릭스에 공유 또는 비공유 결합에 의해 결합된 활성 에나멜 물질을 포함하는 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스는 세포성 내성장 또는 이동에 적합한 것인 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스는 예비형성되는 것인 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스는 동일계(in situ)에서 형성되는 것인 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 활성 에나멜 물질은 아멜로게닌을 포함하는 것인 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 활성 에나멜 물질은 아멜로게닌 90% w/w 이상을 포함하는 것인 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 활성 에나멜 물질이 아멜로게닌인 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 활성 에나멜 물질은 화학적으로 변형되는 것인 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  18. 제1항에 있어서, 상기 중합체 매트릭스는 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 것인 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  19. 제1항에 있어서, 상기 중합체 매트릭스는 피브린을 포함하는 것인 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 골, 연골 및 치아와 같은 무기질화 조직을 복원하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  22. 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 연조직 및 점막과 같은 비-무기질화된 조직을 조직 복원하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  23. 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 염증을 수반하는 상태의 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  24. 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 감염을 수반하는 상태의 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 약학적 및/또는 치료적 배합물.
  25. 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 따른 약학적 및/또는 치료적 배합물을 포함하고, 30 ㎎의 에나멜 매트릭스 단백질 및 1 ㎖의 프로필렌 글리콜 알기네이트를 포함하는 약학적 및/또는 치료적 조성물을 더 포함하며, 각각 20, 14 및 5 kDa에서의 주요 단백질 피이크 사이의 중량비는 약 80/8/12인 것인 약학적 및/또는 치료적 조성물.
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