KR20110097092A

KR20110097092A - 신규한 코마린 유도체, 이의 제조방법 및 상기 코마린 유도체를 포함하는 형광 면역측정용 키트

Info

Publication number: KR20110097092A
Application number: KR1020100016738A
Authority: KR
Inventors: 박현; 정점규; 김학성; 김성연; 조표연; 전은성
Original assignee: 원광대학교산학협력단; 주식회사 바이오랜드
Priority date: 2010-02-24
Filing date: 2010-02-24
Publication date: 2011-08-31
Also published as: KR101133246B1

Abstract

본 발명은 신규한 코마린 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 형광 면역측정용 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 코마린 유도체와 이를 포함한 형광 면역측정용 키트는 높은 특이성과 민감도를 가지므로 다양한 질병의 진단이 가능하며 특히 정량적 분석이 가능하므로 인플루엔자 바이러스 A형 진단은 물론 수치적 분석이 중요한 심혈관 질환 및 암과 같은 질환의 진단에 유용하게 사용될 수 있고 이와 같이 수치화가 가능하므로 U-health 시스템과 연계되어서 중앙 모니터링 시스템으로 활용할 수도 있다.

Description

신규한 코마린 유도체, 이의 제조방법 및 상기 코마린 유도체를 포함하는 형광 면역측정용 키트{Novel coumarin derivatives, process for the preparation thereof, and kits comprising the coumarin derivatives for fluorescent immunosorbant assay}

본 발명은 신규한 코마린 유도체, 이의 제조방법 및 상기 코마린 유도체를 포함하는 형광 면역측정용 키트에 관한 것이다.

현재까지 알려진 인플루엔자 바이러스 감염 여부에 대한 진단 방법으로는 신속 면역크로마토그래피 법(일명, 간이검사법), 실시간(real-time) PCR/conventional PCR, 바이러스 배양법이 있다. 신속 면역크로마토그래피법은 사용 방법이 간편하고, 현장에서 10분 이내에 신속하게 사용할 수 있다는 장점이 있지만, 확진 검사법으로 사용되는 유전자 검사법에 비해 민감도가 낮다는 문제점이 있다. 그리고 실시간(real-time) PCR 방법은 검사 소요시간이 6~7 시간 걸리며, 검사비용이 무척 비싸며, 고가의 장비를 사용하여야 하므로 현장에서 검사를 실시할 수 없는 단점이 있다. 바이러스 배양법의 경우, 배양을 통해 바이러스를 동정하는 데만 7∼21일이 걸리며 20∼30%만 배양되기 때문에 임상 현장에서 실제로 이용하는데 한계가 있어 실제는 실험용으로 필요시에만 진행한다. 호흡기로 쉽게 전염이 되며 전염력이 높은 인플루엔자 질환의 경우, 현장에서 효율적으로 사용될 수 있는 신속 면역크로마토그래피법이 선호되지만, 이 방법의 경우 민감도가 낮고 무엇보다도 정량적 분석이 불가능하고 정성적 분석만이 가능하다.

이에, 본 발명자들은 신속 형광 면역크로마토그래피법 또는 형광 면역측정법(FLISA)에 사용될 수 있는 코마린 계열의 신규한 화합물을 제조하였으며 이를 인플루엔자 특이 항체에 축합시켜서 형광면역법에 이용하면 인플루엔자 바이러스 A형 H1N1 아종과 H5N3 아종을 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 화학식 1의 코마린 유도체 및 이의 염을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 화학식 1의 코마린 유도체 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 항체를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 항체를 포함하는 형광면역측정용 키트를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 항체를 이용하여 형광 면역분석(FLISA)법에 의해 인플루엔자 바이러스 A형 H1N1 아종과 H5N3 아종을 검출하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 항체를 이용하여 신속 형광 면역크로마토그래피법에 의해 인플루엔자 바이러스 A형 H1N1 아종과 H5N3 아종을 검출하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 일 양태로 본 발명은 화학식 1의 코마린 유도체 및 이의 염을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R₁-R₅는 수소; 히드록시; 할로겐; C₁-C₆ 알콕시; 히드록시, 할로겐 또는 C₁-C₆ 알콕시로 치환 또는 비치환된 C₁-C₆ 직쇄 또는 측쇄 알킬; 또는 NR₆R₇이고, R₆ 및 R₇은 각각 수소; 히드록시, 할로겐 또는 C₁-C₆ 알콕시로 치환된 C₁-C₆ 직쇄 또는 측쇄 알킬; C₁-C₆ 직쇄 또는 측쇄 아실이다.

바람직하게는, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 10의 화합물이다.

[화학식 10]

본 발명의 화합물은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 이의 염 및 용해성 화합물로 제조될 수 있다.

염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과같은 수혼화성 유기용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알콜(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산,질산, 주석산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 제조할 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예를 들어, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

상기 화학식 1의 화합물의 염은, 달리 지시되지 않는 한, 화학식 1의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들면, 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 염으로는 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

또 다른 양태로 본 발명은 화학식 1의 코마린 유도체 제조방법을 제공한다.

보다 구체적으로, 1) 하기 화학식 2의 화합물과 하기 화학식 3의 화합물을 반응시켜 하기 화학식 4의 화합물을 형성하는 단계;

2) 하기 화학식 4의 화합물과 테트라뷰틸암모니움 브로마이드(tetrabutylammonium bromide) 및 염화제일주석이수화물(SnCl₂ dihydrate)을 반응시켜 하기 화학식 5의 화합물을 형성하는 단계; 및

3) 하기 화학식 5의 화합물과 티오카보닐 디이미다졸(thiocarbonyl diimidazole)을 반응시켜 화학식 1의 화합물을 형성하는 단계를 포함하는 화학식 1의 코마린(coumarin) 유도체를 제조하는 방법을 제공한다.

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

상기 식에서, R₁-R₅은 제1항에서 정의한 바와 같다.

화학식 1의 코마린 유도체 제조 반응식은 실시예 1에 상세히 도시되어 있다.

출발물질인 화학식 6의 화합물은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있고 또는 시판되는 화합물이므로 용이하게 수득 가능할 것이다.

상기 1) 단계에서는, 화학식 2의 화합물을 유기용매에 녹인 후 화학식 3의 화합물과 피페리딘을 차례대로 반응시켜 화학식 4의 화합물을 형성한다. 반응 혼합물은 에탄올이나 메탄올과 같은 히드록시기를 가진 용매를 이용하여 가열환류하여 30분에서 20시간 동안 반응시키는 것이 바람직하다. 상기 유기용매는 아세톤, 디에틸 에테르, 테트라히드로퓨란(tetrahydrofuran,THF), 메틸렌클로라이드, 메탄올, 에탄올, 시클로헥센, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 디클로로메탄 및 디메틸설폭시드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 화학식 4의 화합물은 화학식 2의 화합물을 에탄올에 녹인 후 화학식 3의 화합물과 피페리딘을 차례대로 반응시킴으로써 수득하였다.

상기 2) 단계에서는, 상기 1) 단계에서 형성한 화학식 4의 화합물과 테트라뷰틸암모니움 브로마이드(tetrabutylammonium bromide) 및 염화제일주석이수화물을 반응시켜 화학식 5의 화합물을 형성한다. 20 ℃에서 90 ℃에서 2시간 내지 48 시간 동안 반응시키는 것이 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 화학식 5의 화합물은 화학식 4의 화합물과 테트라뷰틸암모니움 브로마이드(tetrabutylammonium bromide) 및 염화제일주석이수화물을 혼합한 후 90℃에서 가열함으로써 수득하였다.

상기 3)단계에서는, 상기 2) 단계에서 형성한 화학식 5의 화합물과 티오카보닐 디이미다졸(thiocarbonyl diimidazole)을 반응시켜 화학식 1의 화합물을 형성하였다. 상온에서 1시간 내지 10 시간 동안 반응시키는 것이 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 화학식 1의 화합물은 화학식 5의 화합물을 디클로로메탄에 녹인 후 티오카보닐 디이미다졸(thiocarbonyl diimidazole)을 반응시킴으로써 수득하였다.

상기 화학식 2의 화합물은 당업계 공지된 다양한 방법에 의해 제조할 수 있고 시판되는 화합물이므로 용이하게 수득할 수 있으나 바람직하게는 상기 화학식 2의 화합물은

a) 하기 화학식 6의 화합물의 카복실산과 페놀 그룹을 메틸레이션시켜 하기 화학식 7의 화합물을 형성하는 단계;

b) 하기 화학식 7의 화합물과 디이소부틸알루미늄하이드라이드( Diisobutylaluminium hydride, DIBAL)를 반응시켜 하기 화학식 8의 화합물을 형성하는 단계;

c) 하기 화학식 8의 화합물과 피리디늄 디크로메이트(pyridinium dichromate, PDC)를 반응시켜 하기 화학식 9의 화합물을 형성하는 단계; 및

d) 하기 화학식 9의 화합물과 브롬화 화합물을 반응시켜 화학식 2의 화합물을 형성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다.

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

상기 식에서, R₁-R₂는 제1항에서 정의한 바와 같다.

상기 a)단계에서는, 화학식 6의 화합물을 유기용매에 녹인 후 이를 포타슘카보네이트(K₂CO₃) 및 디메틸 설페이트(dimethyl sulfate)와 반응시켜 화학식 6의 화합물의 카복실산과 페놀 그룹을 동시에 메틸레이션하여 화학식 7의 화합물을 형성한다. 상기 유기용매는 아세톤, 디에틸 에테르, 테트라히드로퓨란(tetrahydrofuran,THF), 메틸렌클로라이드, 메탄올, 에탄올, 시클로헥센, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 디클로로메탄 및 디메틸설폭시드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 이에 한정되지 않으나 본 발명의 구체적인 실시예에서는 아세톤을 사용하였다.

상기 b) 단계에서는, 상기 a) 단계에서 형성한 화학식 6의 화합물을 유기용매에 녹이고 냉각한 후 디이소부틸알루미늄하이드라이드를 반응시켜 화학식 7의 화합물을 형성한다. -78 ℃ 내지 25 ℃에서 10 분 내지 2 시간 동안 반응시키는 것이 바람직하며, 상기 유기용매는 a)단계에서 사용한 유기용매 중에서 선택하여 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 화학식 7의 화합물은 상기 화학식 6의 화합물을 테트라히드로퓨란에 녹인 후 0℃로 냉각하고 디이소부틸알루미늄하이드라이드를 반응시킴으로써 수득하였다.

상기 c)단계에서는, 상기 b) 단계에서 형성한 화학식 7의 화합물을 유기용매에 녹인 후 피리디늄 디크로메이트와 반응시켜 화학식 8의 화합물의 화합물을 형성한다. 0 ℃ 내지 40 ℃에서 1시간 내지 10 시간 동안 반응시키는 것이 바람직하며, 상기 유기용매는 a)단계에서 사용한 유기용매 중에서 선택하여 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 화학식 8의 화합물은 상기 화학식 7의 화합물을 디클로로메탄에 녹인 후 피리디늄 디크로메이트를 반응시키고 40℃에서 가열함으로써 수득하였다.

상기 d)단계에서는, 상기 c) 단계에서 형성한 화학식 7의 화합물을 브롬화 화합물과 반응시켜 화학식 2의 화합물을 형성한다. 이때 화학식 7의 화합물을 유기용매에 녹인 후 -78 ℃내지 0 ℃에서 유지시켰다가 브롬화 화합물과 반응시킨 후 상온으로 반응 온도를 상승시키는 것이 바람직하다. 상기 유기용매는 a)단계에서 사용한 유기용매 중에서 선택하여 사용할 수 있다.

또한, 상기 화학식 3의 화합물은 당업계 공지된 다양한 방법에 의해 제조할 수 있고 시판되는 화합물이므로 용이하게 수득할 수 있으나 바람직하게는 하기 방법에 의해 제조한다.

에틸 시아노아세테이트(ethyl cyanoacetate)와 2-아미노티오페놀(2-aminothiophenol)을 반응시켜 화학식 3의 화합물을 형성하며, 상기 에틸 시아노아세테이트(ethyl cyanoacetate)와 2-아미노티오페놀(2-aminothiophenol)의 혼합물을 용매 없이 100 ℃내지 120℃에서 2 시간 내지 24 시간 동안 반응시키는 것이 바람직하고 본 발명의 구체적인 실시예에서는 120℃에서 2시간 동안 반응시켰다.

[화학식 10]

상기 식에서, R₄-R₅은 제1항에서 정의한 바와 같다.

또 다른 양태로 본 발명은 상기 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 항체를 제공한다. 이하, 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 항체는 형광체-항체 축합체라고도 칭하며 본 명세서 상에서 특별한 부가 설명이 없는 한 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 항체와 동일한 것을 의미한다.

상기 화학식 1의 코마린 유도체는 티오이소시아네이트(thioisocyanate, -NCS)기를 가지므로 아민기(amine group)를 갖는 단백질과의 축합반응(conjugation)을 통해 결합체를 형성할 수 있다. 따라서, 상기 단백질 물질에는 아민기(amine group)를 가지는 것이라면 모두 포함될 수 있고 예를 들어 항체 또는 항원과 같은 아민기(amine group)를 갖는 단백질이 포함될 수 있으며 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 단클론 항체 4B1-D4와 4F2-G11와 축합반응시켜 결합체를 수득하였다.

상기 축합반응(conjugation)이란 화합물의 2분자 또는 그 이상의 분자가 반응하여 간단한 분자가 제거되면서 새로운 화합물을 만드는 반응이다. 상기 화학식 1의 코마린 유도체와 항체와의 축합반응은 원스텝(one-step)의 과정으로 수행되므로 용이하게 화학식 1의 코마린 유도체와 항체와의 축합체를 수득할 수 있다.

상기 화학식 1의 코마린 유도체는 코마린 골격을 가지므로 형광체로서 특성을 가지는바 이는 LED (light-emitting diode)에 효과적으로 검출 가능하여 형광면역측정법에 사용될 수 있다. 이에, 또 다른 양태로 본 발명은 상기 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 항체를 포함하는 형광면역측정용 키트를 제공한다. 구체적인 실시예에서, 본 발명은 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 항체를 포함하는 신속 형광 면역크로마토그래피 스트립을 제공한다. 바람직한 구체예로서, 본 발명은 대조선과 항체가 고정화된 검사선이 직선 처리되어 있는 나이트로셀룰로스 멤브레인, 시험하고자 하는 시료를 흡수하는 부분인 검체 패드, 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 항체가 처리된 축합 패드, 시료 내 미반응 물질을 흡수하는 흡수 패드, 전술한 구성 부재들이 장착되는 접착용 플라스틱 백킹을 포함하는 신속 형광 면역크로마토그래피 스트립을 제공한다. 본 발명의 신속 형광 면역크로마토그래피 스트립은 전술한 접착용 플라스틱 백킹 위에 검체 패드, 축합 패드, NC 멤브레인 및 흡수 패드를 순서대로 장착하되, 물질이 모세관 현상에 의해 연속적으로 이동될 수 있도록 조립하는 것이 바람직하다. 면역크로마토그래피 스트립의 조립방법은 통상적인 스트립 제조방법에 따라 실시할 수 있다. 이와 같은 본 발명의 면역크로마토그래피 스트립은 카세트(cassette) 형태 또는 막대(stick) 형태로 제조할 수 있다. 본 발명의 면역크로마토그래피 스트립을 이용한 검사 결과는 형광 분석기를 이용하여 여기 파장에서 스트립의 검사선 위치의 형광체를 여기시킨 후 발생되는 형광을 측정함으로써 수행된다.

상기 형광면역측정법은 형광체를 이용한 면역측정법으로 특정 물질의 검출 및 진단을 위해 여러 분야에서 이용되고 있다. 이들 형광 면역측정법은 응용성에 따라 크게 3 가지로 분류될 수 있다. 첫째, 플레이트를 이용한 형광체-결합 면역측정법(fluorescent-linked immunosorbant assay, FLISA)이 있는데, 이는 효소-결합측정법(enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA)과 동일한 원리를 가지며, 가장 널리 이용되고 있는 방법 중 하나이다. 형광 면역분석법(FLISA, fluorescence-linked immunosorbant assay)의 경우, 효소면역분석법(ELISA)과 마찬가지로 형광 측정기를 이용하여 짧은 시간의 분석시간이면 진단하고자 하는 물질을 다량으로 측정할 수 있다. 또한, 이 형광 면역분석법은 일반적으로 효소면역분석법에 비하여 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)가 모두 우수하다고 알려져 있다.

둘째, 라텍스 비드(latex bead)나 마그네틱 비드(magnetic bead)를 이용한 면역 측정법이 있는데, 주로 자동화기기나 장비에 많이 응용되는 기술 중 하나이다. 이 방법은 이들 비드(bead)에 면역물질을 부착하고 이에 결합된 표적물질에 형광체-결합 면역물질을 반응시킴으로써 신호를 얻어 측정하는 방법이다.

셋째, 신속 형광 면역크로마토그래피법(rapid fluorescence immunochromatography)는 높은 정확도를 갖는 기술로 획기적인 전환점을 마련할 수 있게 되었다. 신속 형광 면역크로마토그래피법은 멤브레인과 같은 고정상에 면역 물질(예, 항원 또는 항체)을 고정시키고 이동상으로 형광체-면역물질을 사용하고 반응이 끝난 후, 형광체를 통한 신호를 이용하여 표적물질을 정량적으로 측정할 수 있는 방법이다. 이 방법은 신속하게 결과를 수득할 수 있고 사용법이 간단하고 결과 정량이 가능하여 긴급 현장 진단에 유용하나, 이 시스템에 이용할 수 있는 형광체의 종류가 한정적이며 여기 및 발광 파장대(wavelength)에 따라 상당히 고가의 광원을 사용하여야 하는 단점이 있다.

일반적으로 형광체의 경우 여기(absorbance) 파장과 발광(emission) 파장대가 높을수록, 즉, 낮은 에너지로 여기가 가능할수록 보다 저렴한 형태의 광원을 선택할 수 있어 측정 장비들을 경제적으로 제작할 수 있게 된다. 또한, 면역 물질과 형광체와의 축합(conjugation)반응 결합체는 형광변역측정법을 이용하기 위해 필수적인 요소이므로 사용 전(ready-to-use) 형태의 형광체의 개발은 매우 중요하다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 코마린 유도체는 여기 파장이 459nm이고 발광 파장이 515-558nm이므로 공지된 형광체와 비교하여 여기(absorbance) 파장과 발광(emission) 파장대가 높아 경제적인 형광체이며 티오이소시아네이트(-NCS)기를 가지므로 원스텝으로 항체와 축합반응을 일으키므로 결합체 수득이 용이하다.

본 발명에 따른 형광면역측정용 키트를 사용하여 다양한 질환을 신속하고 정량적으로 분석할 수 있으며 예를 들어 인플루엔자 바이러스 A형 H1N1 아종과 H5N3 아종 진단에 사용될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

이에 다른 양태로 본 발명은 하기 단계를 포함하는 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 항체를 이용하여 형광 면역분석(FLISA)법에 의해 인플루엔자 바이러스 A형 H1N1 아종과 H5N3 아종을 검출하는 방법을 제공한다.

1) 제1항체를 형광 면역분석용 플레이트에 넣고 고정화시키는 단계;

2) 상기 FLISA용 플레이트에 분석 대상 시료를 넣고 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 제2항체를 이동상으로 반응시키는 단계; 및

3) 여기 파장(Excitation)에서 상기 화학식 1의 코마린 유도체를 여기시킨 후 발현하는 형광을 측정하는 단계를 포함한다.

또한, 다른 양태로 하기 단계를 포함하는 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 항체를 이용하여 신속 형광 면역크로마토그래피법에 의해 인플루엔자 바이러스 A형 H1N1 아종과 H5N3 아종을 검출하는 방법을 제공한다.

1) 신속 형광 면역크로마토그래피 스트립의 막에 제1항체를 고정시키고 축합패드에는 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 제2항체를 처리하는 단계;

2) 상기 신속 형광 면역크로마토그래피 스트립에 분석 대상 시료를 반응시키는 단계; 및

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 인플루엔자 바이러스 A형 H1N1 아종과 H5N3 아종 검출을 위해 본 발명에 따른 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 항체를 이용하여 형광 면역분석(FLISA)법(실시예 4) 및 신속 형광 면역크로마토그래피(실시예 5)를 수행하였다.

보다 구체적으로, 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 항체를 이용한 형광 면역분석(FLISA)법에 따른 인플루엔자 바이러스 A형 H1N1 아종과 H5N3 아종 검출 방법은 하기와 같다. 제1항체를 FLISA용 플레이트에 넣고 고정화시켰다. 그 후, 고정화된 항체에 시료를 반응시켰다. 그 후, 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 제2항체를 이동상으로 반응시킨 후 여기 파장(Excitation)에서 화학식 1의 코마린 유도체를 여기시킨 후 발생되는 형광을 측정하였다. 그 결과, 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 항체의 인플루엔자 바이러스들에 대한 반응성을 확인하였으며, 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 항체의 당량이 높을수록 높은 반응성을 나타내므로 당량 수를 올리면 1 HAU/ml보다 낮은 농도에서도 인플루엔자 바이러스들을 측정할 수 있음을 확인하였다.

또한, 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 항체를 이용한 신속 형광 면역크로마토그래피에 따른 인플루엔자 바이러스 A형 H1N1 아종과 H5N3 아종 검출 방법은 하기와 같다. 막에 항 인플루엔자 제1항체를 고정시킨 후 축합 패드에 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 제2항체를 처리하여 도 4a와 같이 제조한다. 그 후, 이에 검출 시료를 반응시키고 형광 분석기를 이용하여 여기 파장(Excitation)에서 스트립의 검사선(T) 위치의 형광체를 여기시킨 후 발생되는 형광을 측정한다. 도4b에서 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 항체를 이용한 신속 형광 면역크로마토그래피에 따르면 인플루엔자 바이러스 A형 H1N1 아종과 H5N3 아종을 1 HAU/ml 농도의 단위로도 측정할 수 있었다.

본 발명에 따른 코마린 유도체와 이를 포함한 형광 면역측정용 키트는 높은 특이성과 민감도를 가지므로 다양한 질병의 진단이 가능하며 특히 정량적 분석이 가능하므로 인플루엔자 바이러스 A형 진단은 물론 수치적 분석이 중요한 심혈관 질환 및 암과 같은 질환의 진단에 유용하게 사용될 수 있고 이와 같이 수치화가 가능하므로 U-health 시스템과 연계되어서 중앙 모니터링 시스템으로 활용할 수도 있다.

도 1은 본 발명에 따른 코마린 형광체를 이용한 인플루엔자 바이러스들의 진단법을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 항 인플루엔자 바이러스 특이 단클론 항체의 인플루엔자 바이러스 A형 H1N1 아종, H5N3 아종, 및 계절성 인플루엔자 바이러스 A형에 대한 반응성 결과에 대한 도면이다.
도 3a는 본 발명에 따른 정제된 형광체-항체 축합체의 흡광도를 나타내는 도면이다.
도 3b는 본 발명에 따른 정제된 형광체-항체 축합체의 인플루엔자 바이러스 A형 H1N1 아종 및 H5N3 아종 바이러스에 대한 반응성을 나타내는 도면이다.
도 4a는 본 발명에 따른 형광체-항체 축합체의 신속 형광 면역크로마토그래피 스트립을 나타내는 도면이다.
도 4b는 본 발명에 따른 형광체-항체 축합체의 인플루엔자 바이러스 A형 H1N1 아종 및 H5N3 아종 바이러스에 대한 신속 형광 면역크로마토그래피 결과를 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 화학식 1의 코마린 ( coumarin ) 유도체 합성

1-1. 화학식 1의 코마린 ( coumarin ) 유도체 합성

항체의 라이신 기의 말단에 있는 아미노기(-NH₂)와 효과적으로 결합할 수 있는 티오이소시아네이트(-NCS) 기를 합성하고자 하였다. 이에, LED (light-emitting diode)에 효과적으로 검출 가능한 여러 골격 중 다양한 치환기의 도입이 가능하여 흡수파장의 조절이 용이한 코마린 골격을 선택하여 이 골격에 티오이소시아네이트(thioisocyanate)를 도입한 화학식 1의 화합물을 합성하였다.

화학식 1의 화합물의 합성은 총 7단계로 이루어졌으며 출발물질인 화학식 6의 화합물로부터 각 단계를 거쳐 코마린(coumarin) 골격의 합성 전구체 화학식 2의 화합물을 합성하였는바, 화학식 6의 화합물의 카복실산과 페놀 그룹을 동시에 메틸레이션하여 화학식 7의 화합물을 얻고 메틸에스터 그룹을 디이소부틸알루미늄하이드라이드(Diisobutylaluminium hydride, DIBAL)를 이용하여 니트로 그룹에 영향을 미치지 않고 선택적으로 환원시켜 벤질알콜 형태인 화학식 8의 화합물를 얻었다. 잘 알려진 산화제인 PDC로 알코올을 산화하여 벤즈알데히드인 화학식 9의 화합물을 얻었다. 코마린 물질을 얻기 위해서는 2-히드록시벤잘데하이드(2-hydroxybenzaldehyde)가 필요하기 때문에 이 단계에서 O-메틸 그룹을 제거하였다. 디메틸레이션(Demethylation) 작용으로 잘 알려진 BBr₃를 이용하여 낮은 온도에서 디메틸레이션하여 코마린 전구체인 화학식 2의 화합물을 합성하였다. 화학식 2의 코마린 골격 합성을 위한 중간체 화합물인 화학식 2의 화합물의 합성 과정은 하기 반응식 1에 나타내었다.

[반응식 1]

화학식 2의 화합물과 함께 코마린 골격의 합성에 필요한 또 다른 전구체의 확보를 위해 2-아미노티오페놀(2-aminothiphenol)을 에틸 시아노아세테이트(ethyl cyanoacetate)와 120 ℃에서 용매 없이 축합하여 전구체 화학식 3의 화합물을 합성하였다. 벤조이타조릴(Benzothiazolyl)기를 가지고 있는 화학식 3의 화합물은 LED 물질의 발현을 위한 핵심코어의 역할을 할 것이라 판단된다. 화학식 3의 화합물 반응식의 합성 과정은 하기 반응식 2에 나타내었다.

[반응식 2]

최종 화합물인 화학식 1의 화합물을 합성하기 위해 화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물을 축합시켰다. 그 다음 에탄올 용매에서 피페리딘을 촉매로 한 축합반응 후 화학식 4의 화합물을 합성하였다. 코마린 골격을 갖는 화학식 4의 화합물은 유기 용매에 대한 용해도가 떨어져 쉽게 고체로 얻을 수 있었다. 화학식 4의 화합물의 니트로 그룹을 NH₂기로 바꾸기 위해 니트로 그룹의 환원이 필요했다. 가장 일반적인 환원조건인 접촉환원반응(Pd/C, H₂ 또는 Lindlar cat. 이용) 조건에서 코마린 링의 이중결합이 환원되는 부반응을 막을 수 없었다. 또한, 헤테로환 물질의 니트로 그룹의 환원에 자주 이용되는 금속과 강산의 조합에서도 많은 부반응이 수반되었다. 이에, 최종적으로 강산을 사용하지 않고 염화제일주석이수화물과 테트라뷰틸테트브로마이드(tetrabuty bromide(TBAB))를 용매 없이 또는 극히 소량의 물을 용매로 하여 환원반응을 시켰을 때 비록 수율은 낮았지만 부반응을 최대한 억제하여 화학식 5의 화합물을 얻었다. 아미노 그룹을 티오이소시아네이트기로 변환하기 위하여 티오포스진(thiophosgene), 티오카보닐 디피리돈(thiocarbonyl dipyridone) 그리고 티오카보닐 디이미다졸(thiocarbonyl diimidazole)을 처리해본 결과 티오카보닐 디이미다졸(thiocarbonyl diimidazole)을 처리했을 때 가장 좋은 수율과 순도로 최종물질, 화학식 1의 화합물을 합성할 수 있었다. 화학식 1의 화합물은 농도별로 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 녹여 저장 용액(stock solution)으로 보관하였고 항체와의 결합에 다른 촉매 없이 곧바로 사용할 수 있었다. 최종적으로 화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물을 반응시켜 화합물 1의 화합물을 제조하는 합성 과정은 하기 반응식 3에 나타내었다.

[반응식 3]

보다 구체적으로 신규한 코마린 유도체 합성 과정은 다음과 같다.

1-2. 화학식 7의 화합물 메틸 -2- 메톡시 -4-니트로베조네이트( methyl -2-methoxy-4-nitrobenzoate) 의 합성

2-히드로-4-니트로 벤조산(2-Hydroxy-4-nitro benzoic acid) (2 g, 10.9 mmol)을 아세톤(60ml)에 녹인 후 포타슘카보네이트(K₂CO₃) (7.54 g, 54.6 mmol)과 디메틸설페이트(dimethyl sulfate) (2.29 ml, 24.0 mmol)를 가하였다. 반응물을 네 시간 동안 가열환류시킨 후 상온으로 냉각하고 아세톤은 감압증류로 제거하였다. 남겨진 반응 혼합물에 에틸아세테이트 (100 mL)와 물(50 mL)를 가하여 두 층으로 만든 후 두 층을 분리하였으며 에틸아세테이트 층은 브린(brine)(20 mL)으로 씻은 후 무수 황산염으로 건조하고 여과한 후 용매를 감압증류로 제거하여 화학식 7의 화합물 (2.28 g, 99.1%)을 얻었다. 화학식 7의 화합물은 더 이상의 정제작업을 거치지 않고 곧바로 화합물(2)의 합성에 이용되었다. ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7.89 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 7.83 (dd, 1H, J = 8.7 Hz), 7.81 (d, 1H, J = 1.8 Hz), 3.99 (S, 3H), 3.93 (S, 3H).

1-3. 화학식 8의 화합물 (2- 메톡시 -4- 니트로페닐 )메탄올(2- methoxy -4- nitrophenyl ) methanol ))의 합성

화학식 7의 화합물 (2.72 g, 10.3 mmol)을 테트라히드로퓨란(tetrahydrofuran, THF)에 녹인 후 0 ℃로 냉각하고 여기에 디이소부틸알루미늄하이드라이드(Diisobutylaluminium hydride, DIBAL) (34 ml, 33.1mmol)를 천천히 적가하였다. 동일 온도에서 한 시간 동안 교반하였으며 TLC로 반응의 완결을 확인한 후 과량의 디이소부틸알루미늄하이드라이드(Diisobutylaluminium hydride, DIBAL)를 파괴하기 위해 메탄올(34 mL)를 천천히 적가하였다. 반응 혼합물에 에틸아세테이트(200 mL)를 가하고 셀라이트(celite)를 통과시켜 여과한 후 여과액을 감압증류하여 화학식 8의 화합물을 합성하였다.

1-4. 화학식 9의 화합물 (2- 메톡시 -4- 니트로벤잘데히드 (2- methoxy -4- nitrobenzaldehyde ))의 합성

화학식 8의 화합물(1.66 g, 9.06 mmol)를 디클로로메탄(dichloromethane, 40 mL)에 녹인 후 PDC(pyridinium dichromate, 13.6 g, 82.1 mmol)을 가한 후 외부온도 40 ℃에서 가열 교반하였다. 반응의 완결을 TLC로 확인 한 후 반응물질을 실리카겔(20 g)에 통과시켰으며 이때 에틸아세테이트를 용리액(eluent)으로 이용하였다. 여과액을 감압증류하여 화학식 9의 화합물 (1.5 g, 91.5%)을 얻었다. ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 10.52 (S, 1H), 7.98 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 7.88 (dd, 1H, J = 8.9 Hz), 7.85 (d, 1H, J = 1.8 Hz), 4.05 (S, 1H)

1-5. 화학식 2의 화합물 (2-히드록시-4-니트로벤잘데히드(2- hydroxy -4-nitrobenzaldehyde))의 합성

화학식 9의 화합물(1.49 g, 8.26 mmol)을 디클로로메탄(50 mL)에 녹인 후 온도를 -78 ℃로 유지시켰다. 여기에 BBr₃ (1M in DCM, 12.3 mL, 12.3 mmol)을 조심스럽게 적가한 후 반응온도를 상온으로 올렸다. TLC를 통해 반응의 완결을 확인하고 물(30 mL)를 반응혼합물에 가하고 에틸아세테이트(100 mL)를 가하여 수층과 유기층으로 나누었다. 유기층만을 분리한 후 재차 물(10 mL), brine (30 mL)로 씻고 무수 황산나트륨 하에 건조하고 여과한 후 감압증류하여 화학식 2의 화합물 (1.37 g, 99.2%)을 얻었다. 화학식 2의 화합물은 정제하지 않고 곧바로 다음 반응에 이용하였다.

1-6. 화학식 3의 화합물 (2- 벤조티아조릴 )아세트산 에틸 에테르(2- Benzothiazolyl )acetic acid ethyl ester ))의 합성

에틸 시아노아세테이트(ethyl cyanoacetate) (1.48 ml, 13.89 mmol)와 2-아미노티오페놀(2-aminothiophenol) (1.5 ml, 13.89 mmol)의 혼합물을 용매 없이 120 ℃에서 두 시간 동안 가열 교반한 후 이 반응혼합물을 상온까지 냉각하였다. 냉각 후 얻어진 조오일(crude oil)을 실리카겔 컬럼크로마토그래피(헥산:에틸 아세테이트 = 2:1)로 정제하여 화학식 3의 화합물 (1.72 g, 56.0%)을 얻었다. ¹H NMR( 500 MHz, CDCl₃) δ 8.03 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 7.87 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 7.49 (t, 1H, J = 7.6 Hz), 7.40 (t, 1H, J = 7.6 Hz), 4.26 (q, 2H, J = 7.3 Hz), 4.21 (S, 2H), 1.30 (t, 3H, J = 7.3 Hz).

1-7. 화학식 4의 화합물 3-( 벤조[디]티아졸 -2-일)-7-니트로- 크로멘 -2-온(3-(benzo[d]thiazol-2-yl)-7-nitro-2H-chromen-2-one))의 합성

화학식 3의 화합물 (793 mg, 4.75 mmol)을 에탄올(15 mL)에 녹인 후 화합물(5) (1.05 g, 4.75 mmol)과 피페리딘(1.0 mL)를 차례대로 가하였다. 반응혼합물을 2시간 동안 가열환류한 후 상온으로 냉각하였다. 이때 생성된 고체를 여과하여 화학식 4의 화합물 (1.31 g, 85%)을 노란색 고체로 얻었다. ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 9.13 (S, 1H), 8.28 (d, 1H, J = 1.8 Hz), 8.23 (dd, 1H, J = 8.2 Hz), 8.12 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 8.01 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 7.90 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 7.57 (t, 1H, J = 8.2 Hz), 7.48 (t, 1H, J = 8.2 Hz).

1-8. 화학식 5의 화합물 (7-아미노-3-( 벤조[디]티아졸 -2-일)- 2에이치 - 크로멘-2-온(7- amino -3-(benzo[d]thiazol-2-yl)-2H-chromen-2-one))의 합성

화학식 4의 화합물(500 mg, 1.54 mmol)과 테트라뷰틸암모늄 브로마이드(tetrabutylammonium bromide) (1 g) 그리고 염화제일주석이수화물 (1.04 g, 4.62 mmol)을 혼합한 후 3시간 동안 90℃에서 가열교반하였다. 반응 중 고체의 혼합이 더디게 일어날 경우 물을 0.1 mL의 단위로 첨가하여 혼합이 용이하도록 하였다. 반응 후 물(50 mL)와 에틸아세테이트(100 mL)를 넣어 두 층으로 만든 후 유층만 분리하고 브린(30 mL)으로 씻고 무수황산나트륨으로 건조, 여과 그리고 감압증류하였다. 얻어진 물질을 에틸아세테이트에서 재결정하여 정제된 화학식 5의 화합물(85 mg, 19%)을 얻었다. ¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) 8.83 (S, 1H), 7.87-7.91 (m, 2H), 7.40-7.45 (m, 2H), 7.30 (t, 1H, J = 8.2 Hz), 6.62 (dd, 1H, J = 8.7 Hz), 6.47 (d, 1H, J = 1.8 Hz).

1-9. 화학식 10의 화합물 (3-( 벤조[디]티아졸 -2-일)-7- 이소티오시아나토 - 2에이치 - 크로멘 -2-온(3-( benzo [d]thiazol-2- yl )-7- isothiocyanato -2H- chromen -2- one ))의 합성

화학식 5의 화합물 (10 mg, 0.034 mmol)을 디클로로메탄(2 mL)에 녹인 후 티오카보닐 디이미다졸(thiocarbonyl diimidazole) (28 mg, 1.17 mmol)을 가한 후 상온에서 10시간 교반하였다. 반응이 완결된 후 반응혼합물을 에틸아세테이트(20 mL)로 희석하고 1N-HCl (3 mL), 물(3 mL) 그리고 브린(5 mL)으로 차례대로 씻은 후 무수황산나트륨으로 건조하고 여과하여 감압증류하였다. 감압증류 후 얻어진 고체를 실리카겔 컬럼크로마토그래피(헥산:에틸아세테이트 = 2:1)로 정제하여 화학식 1의 화합물(5.2 mg, 46%)을 얻었다. ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 9.10 (S, 1H), 8.11 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 7.99 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 7.71 (d, 1H, J = 8.2), 7.55 (t, 1H, J = 8.2 Hz), 7.45 (t, 1H, J = 8.2 Hz), 7.22-7.25 (m, 2H).

실시예 2: 코마린 -항체 축합체 제작

2-1. 인플루엔자 바이러스 특이 단클론 항체

단클론 항체 4B1-D4와 4F2-G11은 인플루엔자 바이러스의 핵단백질(nucleoprotein, 이하 NP)과 특이적으로 결합하는 것으로서 본 발명에서 이용하였다. 이들 단클론 항체들은 인플루엔자 바이러스 A형 H1N1 아종과 H5N3 아종을 효과적으로 검출하는 데에 이용할 수 있음을 사전에 신속 면역크로마토그래피와 효소면역측정법 (ELISA)을 통하여 확인하였다. 도 2에서와 같이 이들 중, 단클론 항체 4B1-D4가 고정상이되고, 단클론 항체 4F2-G11이 코마린과 같은 형광체와 결합하게 되면 보다 우수한 결과를 얻을 수 있게 되어, 본 실시예에서도 이와 같은 형태로 수행하였다.

2-2. 코마린 형광체와 단클론 항체의 축합

　단클론 항체 4F2-G11 (2.89 mg/ml) 1 ml을 0.5 M 탄산수소나트륨(NaHCO₃) 2 ml과 혼합하여 적정 pH를 조성하였다. 혼합액 1 ml을 형광체 화합물 3-(벤조[디]티아졸-2-일)-7-이소티오시아나토-2에이치-크로멘-2-온(3-(benzo[d]thiazol-2-yl)-7-isothiocyanato-2H-chromen-2-one) (PSCNCS)과 각각 10당량 (45 ul), 20당량 (90 ul), 40당량 (180 ul)의 농도로 혼합하였다. 그 후, 코마린 형광체 화합물과 단클론 항체의 축합 반응(conjugation)을 위해서 4℃에서 빛을 차단하고 10시간 동안 방치(incubation)시켰다.

2-3. 코마린 형광체-항체 축합체의 정제

코마린 형광체와 항 인플루엔자 단클론 항체들을 각각 축합 반응 시킨 후, 이들 반응물들을 Sephadex G-25 컬럼을 이용하여 반응하지 않은 코마린 분자들과 축합체(conjugate)를 분리하였다. 이들 축합체의 축합 결과를 확인하기 위하여 코마린 분자가 갖는 흡광 파장인 485 nm에서 흡광도(absorbance)를 측정을 하였다. 그 결과, 도 3a에서와 같이 코마린 형광체가 성공적으로 이들 단클론 항체에 결합되었음을 확인하였다.

실시예 3: 인플루엔자 바이러스 A형 H1N1 아종의 배양 및 정제

3-1. 인플루엔자 바이러스 A형 H1N1 아종과 H5N3 아종의 배양 및 확인

국민건강보험공단 일산병원 (한국, 일산)으로부터 신종플루 감염 확진된 검체를 제공받아 PBS에 희석한 뒤 MDCK 세포에 접종하여 4~7일간 배양한 뒤 바이러스 배양액을 수거하여 RNA를 추출한 뒤, (주)제넷바이오 사 (한국, 논산)의 인플루엔자 바이러스 A형 H1N1 아종 탐지 유전자 키트를 이용하여 확인하였다. 조류독감 바이러스의 경우 강원대학교 수의학과 (한국, 춘천)으로부터 배양된 인플루엔자 바이러스 A형 H5N3 아종을 제공받아 ㈜제넷바이오 사의 인플루엔자 바이러스 A형 (H5) 탐지 유전자 키트를 이용하여 확인하였다(도 3b).

실시예 4: 코마린 -항체 축합체가 적용된 형광 면역분석(FLISA)를 이용한 인플루엔자 바이러스의 검출

4-1. 코마린 -항체 축합체를 이용한 인플루엔자 바이러스의 형광 면역분석

코마린-항체 축합체의 인플루엔자 A형 H1N1 아종 단백질과의 반응성을 확인하기 위하여 형광 면역분석(FLISA)을 수행하였다. 이를 위해서 단클론 항체 4B1-D4을 탄산염 완충용액 (carbonate coating buffer)과 혼합하여 220㎍/㎖의 농도로 만든 다음, FLISA용 96-well 플레이트에 넣고 4℃에서 18시간 고정화시켰다. 그 후, 인산완충용액(PBS, phosphate-buffered saline)으로 세정한 후 미리 준비된 인플루엔자 A형 H1N1 아종 배양액과 인플루엔자 바이러스 A형 H5N3 아종 배양액을 각 10 ㎕씩(최종 바이러스 농도가 1 HAU/ml가 되도록)을 인산완충용액 100 ㎕과 혼합한 후, 플레이트 웰(well)에 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 인산 완충용액으로 세정하고, 본 발명에서 개발한 코마린-단클론 항체 4F2-G11를 각 100 ㎕씩(20 당량과 40당량의 농도) 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 인산 완충용액으로 세정한 후, 여기 파장(Excitation)인 485 nm에서 형광체를 여기시킨 후 발생되는 형광을 535 nm의 파장에서 측정하였다. 그 결과, 코마린-항체 축합체의 인플루엔자 바이러스들에 대한 반응성을 확인하였으며, 이를 통한 진단 키트로의 응용성도 확인하였다. 또한, 본 발명에서는 코마린-항체 축합체의 당량이 높을수록 높은 반응성을 나타내어 당량 수를 올리면 1 HAU/ml보다 낮은 농도에서도 더 예민하게 인플루엔자 바이러스들을 측정할 수 있음을 확인하였다.

실시예 5: 코마린 -항체 축합체가 적용된 신속 형광 면역크로마토그래피를 이용한 인플루엔자 바이러스의 검출

5-1. 코마린 -항체 축합체가 적용된 신속 형광 면역크로마토그래피의 제작

니트로셀룰로오스 멤브레인에 항 인플루엔자 단클론 항체 4B1-D4를 1 mg/ml의 농도고 분주하고 고정화시켰다. 그 후, 0.1% PVP와 0.1% Tween 20가 처리된 축합 패드에 코마린-단클론 항체 4F2-G11 축합체를 처리하여 신속 형광 면역크로마토그래피 스트립을 제조하였다(도 4a). 그 후, 인플루엔자 바이러스 A형 H1N1 아종과 H5N3 아종을 1 HAU/ml이 되도록 인산 완충용액으로 100 ㎕씩 희석 제조한 다음, 신속 형광 면역크로마토그래피를 수행하였다. 수행된 스트립(strip)에 대해서는 형광 분석기를 이용하여 여기 파장(Excitation)인 485 nm에서 스트립의 검사선(T) 위치의 형광체를 여기시킨 후 발생되는 형광을 535 nm의 파장에서 측정하였다. 그 결과, 본 발명에서 사용한 신속 형광 면역크로마토그래피를 이용하여 인플루엔자 바이러스 A형 H1N1 아종과 H5N3 아종을 1 HAU/ml 농도의 단위로도 측정이 가능함을 알 수 있었다(도 4b).

Claims

하기 화학식 1의 코마린(coumarin) 유도체 또는 이의 염:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R₁-R₅는 각각 독립적으로 수소; 히드록시; 할로겐; C₁-C₆ 알콕시; 히드록시, 할로겐 또는 C₁-C₆ 알콕시로 치환 또는 비치환된 C₁-C₆ 직쇄 또는 측쇄 알킬; 또는 NR₆R₇이고,
R₆ 및 R₇은 각각 수소; 히드록시, 할로겐 또는 C₁-C₆ 알콕시로 치환된 C₁-C₆ 직쇄 또는 측쇄 알킬; C₁-C₆ 직쇄 또는 측쇄 아실이다.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 10의 화합물인 코마린(coumarin) 유도체 또는 이의 염:
[화학식 10]

.
1) 하기 화학식 2의 화합물과 하기 화학식 3의 화합물을 반응시켜 하기 화학식 4의 화합물을 형성하는 단계;
2) 하기 화학식 4의 화합물과 테트라뷰틸암모니움 브로마이드(tetrabutylammonium bromide) 및 염화제일주석이수화물(SnCl₂ dihydrate)을 반응시켜 하기 화학식 5의 화합물을 형성하는 단계; 및
3) 하기 화학식 5의 화합물과 티오카보닐 디이미다졸(thiocarbonyl diimidazole)을 반응시켜 화학식 1의 화합물을 형성하는 단계를 포함하는 제1항에 따른 화학식 1의 코마린(coumarin) 유도체를 제조하는 방법:
[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

상기 식에서, R₁-R₅는 제1항에서 정의한 바와 같다.
제3항에 있어서, 상기 1) 단계에서 상기 화학식 4의 화합물은 화학식 2의 화합물을 에탄올에 녹인 후 화학식 3의 화합물과 피페리딘을 반응시킴으로써 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 2) 단계에서 상기 화학식 5의 화합물은 화학식 4의 화합물과 테트라뷰틸암모니움 브로마이드 및 염화제일주석이수화물을 혼합한 후 90℃에서 가열함으로써 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 3)단계에서 상기 화학식 1의 화합물은 화학식 5의 화합물을 디클로로메탄에 녹인 후 티오카보닐 디이미다졸을 반응시킴으로써 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 화학식 2의 화합물은
a) 하기 화학식 6의 화합물의 카복실산과 페놀 그룹을 메틸레이션시켜 하기 화학식 7의 화합물을 형성하는 단계;
b) 하기 화학식 7의 화합물과 디이소부틸알루미늄하이드라이드( Diisobutylaluminium hydride, DIBAL)를 반응시켜 하기 화학식 8의 화합물을 형성하는 단계;
c) 하기 화학식 8의 화합물과 피리디늄 디크로메이트(pyridinium dichromate, PDC)를 반응시켜 하기 화학식 9의 화합물을 형성하는 단계; 및
d) 하기 화학식 9의 화합물과 브롬화 화합물을 반응시켜 화학식 2의 화합물을 형성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 방법:
[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

상기 식에서, R₁-R₂는 제1항에서 정의한 바와 같다.
제7항에 있어서, 상기 a) 단계에서 화학식 7의 화합물은 화학식 6의 화합물을 아세톤에 녹인 후 포타슘카보네이트(K₂CO₃) 및 디메틸설페이트(dimethyl sulfate)를 반응시킴으로써 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 b) 단계에서의 화학식 8의 화합물은 상기 화학식 7의 화합물을 테트라히드로퓨란에 녹인 후 0℃로 냉각하고 디이소부틸알루미늄하이드라이드를 반응시킴으로써 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 c) 단계에서의 화학식 9의 화합물은 상기 화학식 8의 화합물을 디클로로메탄에 녹인 후 피리디늄 디크로메이트를 반응시키고 40℃에서 가열함으로써 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 d) 단계에서의 화학식 1의 화합물은 상기 화학식 9의 화합물을 디클로로메탄에 녹인 후 냉각시켰다가 BBr₃ 을 반응시킨 후 반응 온도를 상온으로 상승시킴으로써 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 화학식 3의 화합물은 에틸 시아노아세테이트(ethyl cyanoacetate)와 하기 화학식 10의 화합물을 반응시킴으로써 수득되는 것을 특징으로 하는 방법:
[화학식 10]

상기 식에서, R₄-R₅는 제1항에서 정의한 바와 같다.
제12항에 있어서, 상기 화학식 3의 화합물은 에틸 시아노아세테이트(ethyl cyanoacetate)와 상기 화학식 10의 화합물의 혼합물을 용매 없이 120℃에서 반응시킴으로써 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 따른 화학식 1의 코마린(coumarin) 유도체가 축합된 항체.
제14항에 따른 화학식 1의 코마린(coumarin) 유도체가 축합된 항체를 포함하는 형광면역측정용 키트.
제15항에 있어서, 상기 형광면역측정용 키트는 신속 형광 면역크로마토그래피법 또는 형광 면역측정법(FLISA)에 사용되는 것을 특징으로 하는 키트.
제15항에 있어서, 상기 형광면역측정용 키트는 인플루엔자 바이러스 A형 H1N1 아종 또는 H5N3 아종의 진단을 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 키트.
하기 단계를 포함하는 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 항체를 이용하여 형광 면역분석(FLISA)법에 의해 인플루엔자 바이러스 A형 H1N1 아종 또는 H5N3 아종을 검출하기 위한 정보제공방법:
제1항체를 형광 면역분석용 플레이트에 넣고 고정화시키는 단계;
상기 FLISA용 플레이트에 분석 대상 시료를 넣고 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 제2항체를 이동상으로 반응시키는 단계; 및
여기 파장(Excitation)에서 상기 화학식 1의 코마린 유도체를 여기시킨 후 발현하는 형광을 측정하는 단계.
하기 단계를 포함하는 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 항체를 이용하여 신속 형광 면역크로마토그래피법에 의해 인플루엔자 바이러스 A형 H1N1 아종 또는 H5N3 아종을 검출하기 위한 정보제공방법:
신속 형광 면역크로마토그래피 스트립의 막에 제1항체를 고정시키고 축합패드에는 화학식 1의 코마린 유도체가 축합된 제2항체를 처리하는 단계;
상기 신속 형광 면역크로마토그래피 스트립에 분석 대상 시료를 반응시키는 단계; 및
여기 파장(Excitation)에서 상기 화학식 1의 코마린 유도체를 여기시킨 후 발현하는 형광을 측정하는 단계.