CN115745936B - 一种荧光化合物及其制备方法和作为荧光探针的应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种荧光化合物及其制备方法和作为荧光探针的应用。所述荧光化合物在与具备完整三维结构的蛋白质共存时仅发出微弱荧光；当蛋白质错误折叠、变性及聚集时，荧光化合物与非共价键与各种形态蛋白质选择性高效结合，结合之后发出强烈荧光；且与不同种类蛋白质错误折叠过程中不同状态结合时能产生不同的荧光信号，并以此实现蛋白错误折叠过程中极性和粘度的变化。可在胞内复杂生物环境下特异性的结合蛋白质组，用于荧光方法探测活细胞内或体外的蛋白质错误折叠过程中的极性和粘度变化或定量探测蛋白质内部极性。

Description

一种荧光化合物及其制备方法和作为荧光探针的应用

技术领域

本申请涉及一种荧光化合物及其制备方法和作为荧光探针的应用，属于荧光检测领域。

背景技术

致病蛋白质分子的错误折叠、变性与聚集会导致多种人类疾病，包括阿尔兹海默症(Aβ肽段)、疯牛病(朊病毒蛋白)、亨丁顿舞蹈症(polyQ蛋白)、渐冻人症(TDP43和SOD1蛋白等)、糖尿病(IAPP肽段)、帕金森症(α-突触核蛋白)以及淀粉样化病变(轻链蛋白等)。尽管研究人员在蛋白质构型疾病领域耕耘数十年，大部分此类疾病的发病机理仍不十分清晰，致使早期诊断方法和特效治疗手段相对匮乏。其中一个重要原因是，领域内缺乏精准的实验工具在活体细胞中实时实地跟踪观测致病蛋白质的整个错误折叠进程，进而无法确定致病机理。

由于其高的灵敏度(低的工作浓度)和极低的检测下限，荧光染料分子常被用于探测和解析诸如蛋白质分子的构型变化在内的生化过程，尤其对于蛋白质淀粉样化病变(Amyloidosis)的临床诊断。与具有完整三维结构的正确折叠蛋白质相比，错误折叠的蛋白质中拥有更高比例的β-层状片段，以及由此引起的更疏水、不易水溶、难以降解的致密结构。此外，蛋白质错误折叠过程常伴随分子内部疏水氨基酸侧链的外翻和蛋白质分子间的堆积聚集。这一系列的物理参数的变动会引起局部环境的极性和流动性下降。荧光分子对这种微环境的细微变化十分敏感，常发生荧光量子产率、荧光寿命、荧光偏振和荧光光谱等性质的剧烈改变，常被科学家利用实现探测和识别目的。蛋白体系流动性降低及可视沉淀的生成往往出现在蛋白质错误折叠的末期，在这两者发生显著改变之前对于蛋白质错误折叠的探测无疑对相关疾病的早期诊断及治疗无疑具有重大意义。

在活细胞原位定量描述蛋白质错误折叠的荧光分子，领域内报道甚少。目前大多数荧光分子要实现活细胞内的检测需要破坏细胞膜的完整性，或是缺乏对聚集蛋白识别的特异性和选择性，不能特异性地与某种蛋白相结合，后者虽然解决了细胞穿透性的问题，但同时也因共价修饰扰动了细胞内蛋白质组原有的生理活性及功能。

因此，发展能够定量探测蛋白质极性的荧光探针及其相关检测方法，对研究蛋白质错误折叠的生理学过程和蛋白质聚集所导致的疾病有着重大的科学意义和临床价值。

此外，识别蛋白质错误折叠与聚集的荧光分子和相关检测方法也常用于建立药物筛选方法，如热位移测定法(thermal shift assay)。因此，发展探测蛋白质聚集过程的方法具有广阔的应用前景。

发明内容

本申请要解决的技术问题为利用荧光分子的环境敏感性和结构特异性，实现活细胞内对不同聚集态蛋白质有选择性的识别并根据蛋白质极性差异产生不同荧光信号。在胞内蛋白质的三维结构正常时仅发出微弱荧光，当蛋白质发生错误折叠、微环境极性降低时荧光波长发生蓝移，进一步变性至聚集时发出强烈荧光。且该类荧光激活类型探针无须对胞内蛋白质组进行广谱共价修饰，故而大幅降低对细胞正常生理功能的干扰和毒性。因此，该发明所述荧光探针可用于活细胞内非共价键探测聚集态的蛋白质分子以及蛋白质错误折叠早期的探测及研究。

为解决上述技术问题，本申请提供的了一种荧光化合物，具有式I的结构：

其中，R₁选自酮基或二氰基；

n选自0～10；

R₂选自C₁～C₅烷氧基、久洛尼定基团、氨基或取代的氨基中的一种；所述取代的氨基选自二甲氨基、N,N-二(2-羟乙基)、N-甲基-N-丁酸中的一种；n为1时，R₂不为二甲氨基。

所述取代的氨基为N-甲基-N-丁酸时，N-甲基-N-丁酸的羧基端接枝有基团A；所述基团A为C_3-20-NH-；所述C_3-20中具有一个或两个醚键；所述C_3-20中含有烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基或苯环中的至少一种；C_3-20的至少一端为基团X；所述基团X选自卤素原子或式II所示的基团；所述卤素原子选自氯原子、溴原子或碘原子；

所述基团A选自具有式III或式IV结构的基团；

所述N-甲基-N-丁酸的羧基端接枝基团A得到的基团具有式V、式VI所述的结构；

根据本申请的另一个方面，提供一种上述的荧光化合物的制备方法，包括以下步骤，

将含有底物1和底物2的原料与碱溶液混合，发生脱水缩合反应，得到所述荧光化合物；

所述底物1选自具有式VII、式VIII、或式IX结构的化合物；

所述底物2选自具有式X的结构的化合物；

所述碱溶液含有碱性物质和溶剂；

所述溶剂选自无水甲醇、无水乙醇、异丙醇、正丁醇中的一种；

所述碱性物质选自氢氧化钾、氢氧化钠、甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钾中的一种；

所述脱水缩合的反应时间为12～48小时；

所述脱水缩合的反应温度为25～50℃。

所述方法还包括将所得到的荧光化合物进行改性；

所述改性包括：将含有荧光化合物和接枝剂的原料与催化剂、溶剂混合，经酸胺缩合反应，得到所述经过改性的荧光化合物。

所述接枝剂选自C_3-20-NH₂中的一种；

所述催化剂选自1水合1-羟基苯并三唑、三乙胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐中的至少一种；

所述溶剂选自无水N，N-二甲基甲酰胺、无水二甲基亚砜、无水四氢呋喃。

优选地，所述混合并进行酸胺缩合反应后，还要在室温下搅拌过夜，水猝灭，用二氯甲烷萃取3次，每次二氯甲烷的用量为50mL，然后真空干燥，使用甲醇/二氯甲烷＝1:20作为洗脱剂通过快速色谱法进一步纯化，获得所述经过改性的荧光化合物。

根据本申请的另一个方面，提供了一种荧光化合物作为荧光探针的应用，所述荧光探针含有上述的化合物或上述的化合物的制备方法制备的化合物以及n为1时，R₂为二甲氨基时具有式I结构的化合物。

所述荧光探针用于检测蛋白质的错误折叠。

所述应用通过利用荧光探针检测蛋白质的聚集态和/或极性确定蛋白质是否错误折叠。

所述荧光探针用于检测特定蛋白质；所述特定蛋白质选自亨廷顿-110Q蛋白、超氧化物歧化酶-G85R蛋白、转甲状腺素蛋白、人免疫球蛋白、大肠杆菌二氢叶酸还原酶、Sortase分选酶中的一种。

本发明所述化合物由一族基于异黄酮的衍生物组成。该类衍生物的荧光量子产率、荧光强度及发射波长对外界微环境敏感。具有良好的生物兼容性和优异的荧光性质。制备成本低廉，制备方法简单，可进行大规模量产。该化合物由荧光发光基团、非共价键结合聚集态蛋白基团。其发光机理是，在结合具有正确折叠三维结构的完整蛋白质时，激发态荧光分子可通过化学键的旋转和振动等，将能量以热能作为主要形式耗散，仅发出微弱荧光。且由于此时蛋白质结构较为疏松，有大量水的存在，内部微环境极性较高，探针产生极性环境所对应的信号。当蛋白质错误折叠、变性、聚集时，其结构中疏水侧链外翻并伴随内部水分的排除及微环境骨架坍缩。此时荧光分子中原本自由结构的旋转及振动，被蛋白质聚集态的致密结构所禁锢，使得激发态分子仅能通过荧光形式退激发，发出强烈荧光。利用荧光强度的大幅跃升，探测活细胞内聚集态蛋白质的形成。此外，聚集态蛋白质中荧光分子所感知的为致密低含水量微环境，故而发出响应蓝移的荧光信号。

本申请能产生的有益效果包括：

(1)本发明保护的化合物作为荧光探针可以非共价键结合各种形态蛋白质；

(2)该类荧光分子可定量探测蛋白质内部极性；

(3)该类荧光探针可以在胞内复杂生物环境下特异性的结合蛋白质组。

附图说明

图1为测试例1中P1在不同环境中最大发射波长(λem)与所处环境介电系数(极性的衡量标准，)作图得到波长-极性标准曲线。

图2为测试例2中P1用于探测二氢叶酸还原酶的加热诱导聚集得到的波长、相对荧光强度曲线。

图3为测试例3中P1用于探测sortase转肽酶的错误折叠及聚集与传统方法OD330的比较图，图3a是不同加热时间实验，图3b是不同加热温度实验。

图4为测试例5中P1-Halo在活细胞中标记及测定特定蛋白的荧光和明场共聚焦照片；图4a为P1-Halo标记的聚集态亨廷顿-110Q变体蛋白的荧光照片；图4b为P1-Halo标记的聚集态亨廷顿-110Q变体蛋白明场照片；图4c为P1-Halo标记的亨廷顿-110Q变体蛋白荧光照片和明场照片重叠；图4d为P1-Halo标记的聚集态超氧化物歧化酶-G85R变体蛋白荧光照片；图4e为P1-Halo标记的聚集态超氧化物歧化酶-G85R变体蛋白明场照片；图4f为P1-Halo标记的聚集态超氧化物歧化酶-G85R变体蛋白荧光和明场照片重叠。

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

如无特别说明，本申请的实施例中的原料和催化剂均购买自上海毕得医药科技。

本申请的实施例中分析方法如下：

利用安捷伦公司UPLC-Q-TOF进行高分辨质谱数据采集，以确认产物组成。

利用布鲁克公司AVNCEIII400进行产物核磁共振谱采集以确认分子结构。

利用Tecan公司Spark荧光光谱酶标仪进行荧光探针在样品中信号的采集，以确定信号波长及强度。

实施例1

在0℃下将KOH(8.40g)溶解在无水甲醇(75mL)中，随后加入2'-羟基苯乙酮(5.4mL,45.0mmol)和4’-二甲氨基-苯甲醛(4.92g,33.0mmol)。将反应混合物在50℃搅拌并保持48小时，然后用水淬灭，以盐酸酸化至pH≈6，并用乙酸乙酯萃取。有机层用饱和盐水洗涤并用Na₂SO4干燥，得到3-[4-(二甲氨基)苯基]-1-(2-羟基苯基)-2-丙烯-1-酮。再在乙酸乙酯中重结晶，得到深红色晶体。

将3-[4-(二甲氨基)苯基]-1-(2-羟基苯基)-2-丙烯-1-酮(1.07g,4.0mmol)和I₂(16mg,0.04mmol)溶解在15mL二甲亚砜中。反应混合物回流1小时，然后冷却至室温。反应混合物用二氯甲烷稀释，然后通过用水萃取除去额外的二甲亚砜。除去所有溶剂后得到粗品，然后通过快速硅胶色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝1:1)纯化，得到淡黄色固体。记作P0。

实施例2

在厚壁压力容器中，将2-甲基-4-色酮(480mg,3.0mmol)和4-二甲氨基-苯甲醛(675mg,4.5mmol)溶解于5mL无水乙醇中，然后加入甲醇钠(NaOMe)(405mg,7.5mmol)，并用配有Viton-O型环的特氟龙螺旋盖密封管。混合物在室温下搅拌过夜，并变成深红色。以水淬灭反应，然后用50mL乙酸乙酯萃取3次。合并有机相并用饱和盐水洗涤，然后用无水Na₂SO4干燥。减压除去溶剂，产物通过快速硅胶色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝4:1)纯化，得到橙色晶体。记作P1。

实施例3

在厚壁压力容器中，将2-甲基-4-色酮(320mg,2.0mmol)和4-二甲基氨基三甲醛(386mg,2.2mmol)溶解在5mL无水乙醇，然后加入乙醇钠(NaOEt)(544mg,8.0mmol)，并用配备的Teflon螺旋盖密封管带有Viton O型圈。混合物在室温下搅拌过夜，并变成深红色。用水淬灭反应，随后用50mL乙酸乙酯萃取3次。合并的有机相用饱和盐水洗涤，然后用无水Na₂SO4干燥。减压除去溶剂，产物通过快速硅胶色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝7:3)纯化，得到深红色晶体。记作P2。

实施例4

将2-甲基-4-色酮(200mg,1.3mmol)和N-(4-甲酰基-苯基)-N-甲基-β-丙氨酸(207mg,1.0mmol)溶解在5mL无水乙醇中，然后加入乙醇钠(510mg，7.5mmol)。将反应混合物在室温搅拌24小时，随后用水淬灭。水层用乙酸酸化，并用乙酸乙酯萃取。P1-酸通过快速柱色谱纯化。将P1-酸(350mg,1.0mmol)和接枝剂(记作Halo-linker，225mg,1.0mmol，盐酸溶液)溶解在4mL无水DMF中，然后加入1-羟基苯并三唑水合物(HOBt·H₂O)(306mg,2.0mmol)、三乙胺(700μL,5.0mmol)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)(384mg,2.0mmol)。将反应在室温下搅拌过夜，然后用水猝灭。反应混合物用3×50mL DCM萃取，然后真空干燥，得到粗产物。使用甲醇/二氯甲烷＝1:20作为洗脱剂通过快速色谱法进一步纯化粗产物。产物记作P1-Halo。

测试例1

建立波长-极性标准曲线。

P1用于测量不同极性有机溶剂体系。P1溶于DMSO中制得2mM的母液后，以不同极性的各种溶剂(四氯化碳、1,4-二氧六环、乙酸乙酯、四氢呋喃、正丁醇、异丙醇、乙醇、甲醇、水)稀释至15μM的工作浓度。100μL不同溶剂的P1溶液被吸取至黑色96孔板内，于酶标仪中测量其荧光发射光谱。所用激发波长为P1不同溶液的最大吸收波长(λex＝λabs)。将P1溶解在不同溶剂中，测量其发射光谱并记录与之对应的最大发射波长的表格如表1。

表1 P1在不同溶剂中的介电常数和最大发射波长

根据表1数据，将所得P1在不同环境中最大发射波长(λem)与所处环境介电系数(极性的衡量标准，)作图得到波长-极性标准曲线，为图1。P1可测试的波长变化范围达到了128nm，同时从图1中计算得到相关系数为0.98，说明采用P1作为荧光探针对有机溶剂体系的极性进行检测具有很高的准确度。

测试例2

P1用于探测二氢叶酸还原酶的加热诱导聚集。纯化后的二氢叶酸还原酶(50μM)及P1(15μM)在pH＝6.23的缓冲溶液(200mM醋酸钠、100Mm氯化钾，以醋酸调pH至6.23)中于常温下混合，均质化后转移到64℃环境中孵育5min以诱导二氢叶酸还原酶错误折叠及聚集。以448nm为激发波长，采集P1在加热前、后的二氢叶酸还原酶中的荧光发射光谱并记录最大发射波长得到图2。热处理后荧光强度15倍的增益表明P1能够特异性的识别聚集态的二氢叶酸还原酶，适宜作为探测蛋白质聚集的探针；P1在正确折叠态的蛋白中仅发出微弱红光，在聚集态蛋白中可发出强烈荧光，同时伴有发射波长的蓝移，此外，波长从585nm到555nm的变化也表明该模型蛋白在热诱导聚集后极性发生显著下降。

测试例3

P1用于测量sortase加热诱导错误折叠及聚集过程中的极性变化。纯化后的sortase(50μM)及P1(15μM)在pH＝6.23的缓冲溶液(200mM醋酸钠、100Mm氯化钾，以醋酸调pH至6.23)中于常温下混合，均质化后转移到不同环境中孵育以诱导sortase分选酶错误折叠及聚集。

改变加热时长的实验在55℃进行，热处理不同时间后以448nm为激发波长，采集P1在热处理不同时间后sortase中的荧光发射光谱并记录最大发射波长。

改变加热温度的实验固定热处理时间为5min,不同温度下热处理后以448nm为激发波长，采集P1在不同温度热处理后sortase中的荧光发射光谱并记录最大发射波长。

改变热处理温度及时间的实验均对相同处理方法但不含P1的蛋白样品，进行传统的OD330测试(330nm处样品对于光的吸收)以确定sortase分选酶在错误折叠及聚集过程中所处的阶段，得到图3。

传统的OD330方法仅能通过浊度的增加检测蛋白质错误折叠过程中不可溶物种的生成。通过P1最大发射波长的变化，可以定量测定在热诱导sortase分选酶错误折叠及聚集过程中不可溶物种生成之前的内部极性变化。(传统方法难以表征不可溶物种生成前的阶段，且无法定量描述过程中蛋白内部极性的变化)。图3的结果表明，蛋白质在错误折叠过程中，会先降低内部极性生成可溶性的寡聚物(内部极性改变主要发生于此阶段)，再转变为不可溶的聚集态(此阶段极性降低已几乎完成)，在不同加热温度或不同加热时间的实验中，荧光波长的变化均早于传统方法OD330，表明在蛋白质变性初期就已出现极性下降。

测试例4

P1识别不同蛋白质在沉淀终点的内部极性差别。常温下混合各种模型蛋白(1mg/mL)及P1(15μM)，随后转移至响应条件下进行热诱导聚集。热诱导条件如表2。

表2不同测试蛋白及其对应的热诱导条件及测得的介电常数

测试的蛋白来源：人免疫球蛋白购自河南新乡华兰生物公司；其余种类蛋白依据文献报道方法纯化Biochemistry 2021,60,32,2447–2456。

通过比较P1在不同蛋白质中聚集终点时的波长发现，不同蛋白质在各自的沉淀终点内部极性不同。由于构成蛋白质的氨基酸极性相近，极性的改变主要为聚集态蛋白中含水量所决定。

缓冲溶液配比：①pH 6.23缓冲溶液(200mM醋酸钠、100Mm氯化钾，以醋酸调pH至6.23)；

②pH 4.4缓冲溶液(200mM醋酸钠、100Mm氯化钾，以醋酸调pH至4.4)。

测试例5

通过AggTag技术，使用P1-Halo测试Htt-110Q以及SOD1-G85R在细胞内形成聚集态后的内部极性。在HEK293T细胞中转染，使之表达与HaloTag相连的Htt-110Q及SOD1-G85R两种致病蛋白；图4为P1-Halo在活细胞中标记及测定特定蛋白的荧光和明场共聚焦照片；图4a为P1-Halo标记的聚集态亨廷顿-110Q变体蛋白的荧光照片；图4b为P1-Halo标记的聚集态亨廷顿-110Q变体蛋白明场照片；图4c为P1-Halo标记的亨廷顿-110Q变体蛋白荧光照片和明场照片重叠；图4d为P1-Halo标记的聚集态超氧化物歧化酶-G85R变体蛋白荧光照片；图4e为P1-Halo标记的聚集态超氧化物歧化酶-G85R变体蛋白明场照片；图4f为P1-Halo标记的聚集态超氧化物歧化酶-G85R变体蛋白荧光和明场照片重叠。从图中可以看出，亨廷顿-110Q变体蛋白在表达后无需任何处理即为聚集态，超氧化物歧化酶-G85R变体蛋白则在加入蛋白酶体抑制剂MG132后产生聚集态。P1-Halo与带有HaloTag相连的蛋白接触后会形成共价连接，从而探测改目标蛋白的内部极性。

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (1)

1.一种荧光化合物作为荧光探针的应用，其特征在于，所述化合物选自P1和/或P1-Halo：

通过利用荧光探针检测特定蛋白质的聚集态和/或极性确定特定蛋白质是否错误折叠；

所述特定蛋白质选自亨廷顿-110Q蛋白、超氧化物歧化酶-G85R蛋白、转甲状腺素蛋白、人免疫球蛋白、大肠杆菌二氢叶酸还原酶、Sortase分选酶中的一种。