KR20110095001A - 조기 진통에 특이적인 위험도 조기예측 마커 유전자 및 이를 이용한 조기진통 관련 유전자 발현양상 분석방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 유전자 발현양상 분석방법은, 피검자의 혈액으로부터 RNA를 준비하는 단계와, 상기 준비한 RNA로부터, 조기 진통에 특이적인 C1QB(GenBank Accession No.: NM_000491.3), C1QA(GenBank Accession No.: NM_015991.2), GMCL1(GenBank Accession No.: NM_178439.3) 및 AHCTF1(GenBank Accession No.: NM_015446.3) 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현수준을 측정하는 단계와, 상기 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현여부, 발현정도 및 정상군과의 발현정도의 차이를 분석하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 조기 진통의 위험도 조기 예측 정확도를 높이기 위한 마커 유전자들을 이용하면 조기 진통관련 유전자들의 발현양상(발현여부, 발현정도 및 정상군과의 발현정도의 차이)을 분석함으로써 임신부의 임신 초기 혈액 샘플로부터 임신부의 조기 진통의 위험을 조기에 예측할 수 있다.
Description
본 발명은 조기 진통에 특이적인 진단용 마커 유전자 및 이를 이용한 조기 진통관련 유전자 발현양상 분석방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 임신 초기의 임신부의 혈액을 이용하여 임신부의 조기 진통 위험도를 미리 예측하고자 할 때 그 정확도를 높이기 위한 마커 유전자를 선별하고, 이를 이용하여 조기 진통관련 유전자 발현양상을 분석하는 방법을 제공하는 것에 관한 것이다.
일반적으로 임신 20주~37주 사이에 규칙적인 자궁수축이 5~8분 간격으로 오거나 자궁경부의 개대가 진행되는 경우를 조기 진통(preterm labor)으로 진단할 수 있다. 조기진통은 특별한 조치를 취하지 않으면 대개 조산을 유발하게 되며, 조산은 출산과 관련된 질환들 중에 신생아 및 산모에게 가장 많은 문제를 야기하는 것으로 알려져 있다. 모든 신생아 사망률의 30% 이상이 조산으로 인한 합병증과 직접 관련되어 있는 것으로 알려져 있다.
우리나라의 경우 조기 진통은 전체 분만의 약 6~7% 정도로 발생하는 것으로 보고되고 있다. 그러나 결혼 연령대가 점점 높아져 가는 사회적 분위기로 인해 앞으로는 이러한 발생 빈도가 높아질 가능성도 배제할 수는 없다.
그런데, 조기진통의 원인은 확실히 알려져 있지는 않다. 다만, 조기진통 환자의 25~40% 정도는 조기파막(premature rupture of membrane, PROM) 후에 조기진통을 겪는 것으로 알려져 있고, 20~25% 정도는 고혈압이나 당뇨, 전치태반과 같은 내과적, 산과적 합병증의 영향을 받아 발생하는 것으로 보고되고 있다. 그 외에 감염과 염증반응이 조기진통과 연관이 있으리라고 믿어지고 있으나, 조기파막 환자의 약 20~30% 정도만이 감염에 의한 증상을 나타내고 있다.
위에서 나열한 요인들은 모두 생리학적인 견지에서 본 조기진통의 유발 요인일 뿐이며, 선천적인 유전학적인 원인에 대해서는 아직 알려진 바가 없다. 즉, 조기진통과 연관된 선천적인 유전자 상의 돌연변이나 대립형질 등의 발현은 아직 구체적으로 파악된 것이 없다. 이러한 맥락에서 조기진통은 선천적인 유전학적 요인보다는 후천적인 요인에 의해 주로 유발되는 것으로 해석할 수 있다. 그런데, 조기진통의 위험을 고려할 때 조기 진통은 임신부에게 발생한 결과적인 생리학적 현상의 관찰보다는 조기 진통의 위험을 사전에 예측하는 것이 중요하다.
조기진통과 관련하여 임신 후 출산까지의 각 단계별로 유전자의 발현 양상을 파악할 경우 조기진통에 대한 조기 예측 및 진단이 가능할 것이라는 연구가 최근에 이루어지고 있다. 즉, 결과적인 생리학적 관찰 보다 상위 단계인 유전자 발현의 양상을 파악함으로써 조기진통에 대한 정확한 사전 예측과 진단, 특히 조기에 위험도 예측과 진단이 가능하다면 임신부의 조기진통 위험에 대처할 수 있을 것이다.
지금까지 분자생물학적 방법을 통해 산모의 자궁, 양막, 양수, 혹은 태반 등에서 분만과 관련된 유전자 발현 변화를 살펴보고자 경우는 많았다. 예를 들어, 양수, 양막 및 태반 등에서 IL-6(Interleukin-6), CRF(corticotrophin-releasing factor), PGESs(prostaglandin E synthases) 등 제한된 숫자의 유전자와 단백질 발현을 조사하여 조기진통과의 관계를 살펴보고자 하는 노력이 있었다(Romero et al, Am. J. Reprod. Immunol. 1993, 36:167-183; Torricelli et al, Reprod. Sci. 2007, 14(3); 241-245; Kubota et al., J. Endocrinol. 2005, 187(3):339-345). 또한, 최근에는 산모의 자궁 조직을 이용한 DNA 칩 실험을 통해 분만과정과 관련된 유전자군을 살펴 보고자 한 시도들도 있었다(Bukowski et al., PloS Med. 2006, 3(6):e169; Bethin et al., Mol. Endocrinol. 2003, 17(8):1454-1469).
그러나, 아직까지 임신부의 임신 초기 혈액에서의 유전자 발현 양상 분석을 통해 조기진통 관련 유전자 마커를 찾아내려는 시도는 거의 없었다.
이와 관련하여 본 출원인은 이러한 문제점들을 감안하기 위하여 조기진통과 관련한 유전자 마커들을 제시한 바 있다. 이 새로운 조기진통관련 유전자 마커들은 임신부의 조기 진통 위험도를 예측할 수 있는 것이 확인되었고, 이러한 조기진통 관련 유전자 마커들이 대한민국 공개특허 제10-2009-0105611호(2009.10.07.자 공개)에 개시되어 있다. 이러한 조기진통관련 유전자 마커들이 임신부의 조기 진통 위험도를 미리 예측할 수 있는 우수한 기술임에도 임신부의 임신 초기 혈액으로부터 조기 진통의 위험도 조기 예측과 관련한 기술의 개발은 본 발명이 속하는 기술분야에서 절실히 요구되고 있었다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 임신부의 임신 초기 혈액을 이용한 조기 진통의 위험도 조기 예측에 활용가능한 생물학적 마커를 개발하기 위해, DNA 칩을 이용하여 조기 진통 산모에게서 정상 산모와는 다른 발현양상을 보이는 유전자들을 일차로 발굴하였고, RT-PCR 및 리얼타임 PCR을 통해 이들이 조기 진통의 위험도 조기예측을 위한 유의성이 높은 유전자 마커들임을 확인하였다.
그 결과, 본 발명의 조기 진통에 특이적인 위험도 조기예측을 위한 유전자 마커들로는 C1QB(GenBank Accession No.: NM_000491.3), C1QA(GenBank Accession No.: NM_015991.2), GMCL1(GenBank Accession No.: NM_178439.3) 및 AHCTF1(GenBank Accession No.: NM_015446.3) 유전자들이 발굴·확인되었고, 이들 유전자들은 조기 진통의 위험도 조기 예측에 사용 가능한 것으로 판단된다.
본 발명은 임신부의 임신 초기 혈액을 채취하여 임신부의 조기 진통 위험도를 예측함에 있어 그 정확도를 높이기 위한 마커 유전자들을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 조기 진통에 특이적인 위험도 조기예측 마커 유전자들을 이용하여 조기 진통관련 유전자 발현양상을 분석하고, 이에 기초하여 임신부의 조기 진통 위험을 조기에 예측하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 임신부의 조기 진통 위험의 조기 예측 정확도를 높이기 위한 마커 유전자들과 특이적으로 결합할 수 있는 유전자 프로브를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 마커 유전자들과 특이적으로 결합할 수 있는 유전자 프로브들이 마이크로어레이되어 있는 DNA 칩을 제공하는데 그 목적이 있다.
추가적으로, 본 발명은 조기 진통에 특이적인 위험도 조기예측 마커 유전자 프로브들이 마이크로어레이되어 있는 DNA 칩을 이용하여 임신부의 임신 초기 혈액 샘플로부터 임신부의 조기 진통 위험을 조기에 예측하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명의 조기 진통에 특이적인 위험도 조기예측 마커 유전자는 C1QB(GenBank Accession No.: NM_000491.3), C1QA(GenBank Accession No.: NM_015991.2), GMCL1(GenBank Accession No.: NM_178439.3) 및 AHCTF1(GenBank Accession No.: NM_015446.3) 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자로서 이들은 조기 진통의 조기 예측 정확도를 높일 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 바와 같은 조기 진통에 특이적인 위험도 조기예측 마커 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 조기 진통 위험도 조기예측 올리고뉴클레오티드 프로브로서, 서열번호 17의 염기서열 내지 서열번호 20의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 조기 진통 위험도 조기예측 올리고뉴클레오티드 프로브에 있어서, 서열번호 17의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 프로브는 마커 유전자 C1QB(GenBank Accession No.: NM_000491.3)와, 서열번호 18의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 프로브는 마커 유전자 C1QA(GenBank Accession No.: NM_015991.2)와, 서열번호 19의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 프로브는 마커유전자 GMCL1(GenBank Accession No.: NM_178439.3)과, 서열번호 20의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 프로브는 마커유전자 AHCTF1(GenBank Accession No.: NM_015446.3)과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예의 조기 진통 위험도 조기예측 검사 칩은 서열번호 17의 염기서열 내지 서열번호 20의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 포함한다. 바람직하게는 상기 프로브는 기판 상에 마이크로어레이되어 있는 것을 특징으로 한다. 상기 기판은 DNA 칩 제작에 일반적으로 사용되는 유리기판 또는 플라스틱 기판인 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예의 조기 진통에 특이적인 위험도 조기예측 마커 유전자 PCR 증폭키트는 서열번호 1 내지 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 제1프라이머 군과, 서열번호 9 내지 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 제2프라이머 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 군, DNA 중합효소, dNTPs, PCR 완충용액 및 PCR 증폭산물의 표지물질을 포함한다.
본 발명의 일실시예의 조기 진통에 특이적인 위험도 조기예측 마커 유전자 PCR 증폭키트에 있어서, 상기 프라이머는 상기 제1프라이머 군으로부터 적어도 하나의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합으로 제공되거나, 상기 제2프라이머 군으로부터 적어도 하나의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합으로 제공되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조기 진통관련 유전자 발현양상 분석방법은,
피검자의 혈액으로부터 RNA를 준비하는 단계와,
상기 준비한 RNA로부터, 조기 진통에 특이적인 C1QB(GenBank Accession No.: NM_000491.3), C1QA(GenBank Accession No.: NM_015991.2), GMCL1(GenBank Accession No.: NM_178439.3) 및 AHCTF1(GenBank Accession No.: NM_015446.3) 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현수준을 측정하는 단계와,
상기 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현여부, 발현정도 및 정상군과의 발현정도의 차이를 분석하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 조기 진통관련 유전자 발현양상 분석방법은,
피검자의 혈액으로부터 RNA를 준비하는 단계와,
상기 준비한 RNA를 이용하여 형광표지된 상보적인 염기서열을 합성하는 단계와,
상기 형광표지된 상보적인 염기서열과, 서열번호 17의 염기서열 내지 서열번호 20의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 혼성화시키는 단계와,
상기 혼성화 단계 이후, 상기 형광표지된 상보적인 염기서열과 상기 프로브와의 결합에 의한 형광강도를 확인하는 단계와,
상기 확인된 형광강도에 의해 조기 진통에 특이적인 유전자의 발현여부, 발현정도 및 정상군과의 발현정도의 차이를 분석하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 일실시예의 조기 진통관련 유전자 발현양상 분석방법은,
피검자의 혈액으로부터 RNA를 준비하는 단계와,
상기 준비한 RNA를 주형으로 사용하고 조기 진통에 특이적인 C1QB(GenBank Accession No.: NM_000491.3), C1QA(GenBank Accession No.: NM_015991.2), GMCL1(GenBank Accession No.: NM_178439.3) 및 AHCTF1(GenBank Accession No.: NM_015446.3) 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자에 대한 프라이머를 이용하여 RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)을 수행하는 단계와,
상기 RT-PCR 증폭 산물에 대한 전기영동을 수행하여 조기 진통에 특이적인 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현여부, 발현정도 및 정상군과의 발현정도의 차이를 분석하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 일실시예의 조기 진통관련 유전자 발현양상 분석방법에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 군에서 선택된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일실시예의 조기 진통관련 유전자 발현양상 분석방법은,
피검자의 혈액으로부터 RNA를 준비하는 단계와,
상기 준비한 RNA를 주형으로 사용하고 조기 진통에 특이적인 C1QB(GenBank Accession No.: NM_000491.3), C1QA(GenBank Accession No.: NM_015991.2), GMCL1(GenBank Accession No.: NM_178439.3) 및 AHCTF1(GenBank Accession No.: NM_015446.3) 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 조기 진통에 특이적인 유전자에 대한 프라이머, 및 증폭되는 상기 적어도 하나의 조기 진통에 특이적인 유전자와 관련하여 조기 진통에 특이적인 유전자 증폭량을 나타내는 표지물질을 이용하여, 조기 진통에 특이적인 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자를 PCR 증폭하는 단계와,
상기 조기 진통에 특이적인 유전자의 증폭 후, 상기 표지물질을 이용하여 조기 진통에 특이적인 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자 증폭량에 기초하여 조기 진통에 특이적인 유전자 발현량을 산출하는 단계와,
상기 산출된 발현량에 기초하여 조기 진통에 특이적인 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현여부, 발현정도 및 정상군과의 발현정도의 차이를 분석하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 일실시예의 조기 진통관련 유전자 발현양상 분석방법에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 9 내지 서열번호 16의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 군에서 선택된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일실시예의 조기 진통관련 유전자 발현양상 분석방법에 있어서, 정상군의 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자를 PCR 증폭하는 단계와,
상기 정상군의 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자에 대한 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값)를 분석하는 단계와,
상기 피검자의 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값)를 분석하는 단계와,
상기 피검자의 Cp값을 상기 정상군의 Cp값과 비교하여 상기 피검자에 있어서 조기 진통에 특이적인 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현여부, 발현정도 및 정상군과의 발현정도의 차이를 분석하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 또 다른 일실시예의 조기 진통관련 유전자 발현양상 분석방법에 있어서, 상기 표지물질은 형광물질이고, 상기 표지물질로부터의 형광의 세기를 측정하여 상기 조기 진통에 특이적인 유전자 발현량을 산출하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 이러한 방식에 의해 임신 초기의 임신부의 혈액을 이용하여 임신부의 조기 진통 위험을 조기에 예측할 수 있다.
본 발명은 임신부의 조기 진통 위험도의 예측 정확도를 높이기 위한 마커 유전자들을 일차적으로 발굴함으로써 조기 진통의 위험도 조기 예측을 가능케 한다.
본 발명은 임신부의 임신 초기 혈액을 채취하여 임신부의 조기 진통 위험의 조기 예측 정확도를 높이기 위한 마커 유전자들을 일차적으로 발굴하고 이들과 특이적으로 결합할 수 있는 유전자 프로브를 이용함으로써 조기 진통의 위험을 조기에 예측 가능하게 한다.
특히, 본 발명은 임신부의 조기 진통의 위험도 조기 예측 정확도를 높이기 위한 마커 유전자들을 이용하여 조기 진통관련 유전자들의 발현양상(발현여부, 발현정도 및 정상군과의 발현정도의 차이)을 분석함으로써 임신부의 임신 초기 혈액 샘플로부터 임신부의 조기 진통의 위험을 조기에 예측할 수 있다.
도 1은 마커 유전자로서 선정된 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들에 대하여 RT-PCR(Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction)을 수행한 후 전기 영동한 결과를 나타낸다.
도 2는 마커 유전자로서 선정된 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들에 대하여 리얼타임 PCR을 수행하여 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들에 대한 분석결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 마커 유전자로서 선정된 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들에 대하여 리얼타임 PCR을 수행하여 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들에 대한 분석결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명의 실시예에 기초하여 보다 상세하게 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예 1: 환자 혈액에서의 RNA 분리 및 정량분석
환자의 검체는 차병원으로부터 제공 받았다. 임신 15~17주의 임신부의 혈액 검체로부터의 RNA는 QiaAmp RNA 블러드 미니 키트(QiaAmp RNA blood mini kit)(Qiagen, Cat# 52304)를 이용하여 제조회사의 제시된 방법에 의해 추출되었다. 환자의 검체(전혈)는 5cc 정도로 채혈되었다. 추출된 RNA는 나노드롭 스펙트로포토미터(NanoDrop spectrophotometer ND-1000, NanoDrop Technologies)를 이용하여 정량분석을 하였다. 이렇게 모은 검체들은 분만전후 의사의 최종 진단을 받은 뒤 실험에 사용하였다.
실시예 2: 혈액 샘플의 마이크로어레이(Microarray)칩 실험 및 결과 분석
디지탈지노믹스㈜(대한민국 서울시 소재)에서 판매하고 있는 팔랑스 32K 사람 마이크로어레이 (Phalanx Human OneArray, Phalanx Biotech)를 이용하여 검체의 유전자 발현 양상을 살펴보았다.
이와 관련된 정보는 Phalanx Biotech사 웹사이트(http://www.phalanxbiotech.com/tech_support/gene_lists.html)에서 찾아볼 수 있다. 15개 샘플의 유전자 발현 양상을 비교하기 위하여, 정상군(10개)과 조기진통 환자군(5개)으로 나누어서 결과를 비교하였다. 실험은 단일 형광 염색약(Single-dye)을 이용해 진행하였다.
샘플은 전체 RNA 2㎍을 시초로 하여 아미노 알릴 메시지 앰프 II aRNA 앰플리케이션 키트(Amino Allyl MessageAmpTM II aRNA Amplification kit)(Ambion Inc.)로 cRNA를 증폭시킨 후 화학적 방법으로 형광 염색약을 결합시켜서 제조하였다. 정상군과 조기진통 환자군 모두 cRNA를 Cy5 형광 염색약 (GE healthcare, Cat# PA25001)으로 표지하였고, 각각 표지된 샘플을 각 마이크로어레이 칩에 혼성화시켰다. 혼성화 반응 용액은 팔랑스 바이오텍(Phalanx biotech)에서 제공하는 1.5×혼성화 용액에 포름아마이드(Formamide, Sigma)를 넣은 용액을 사용했으며 각각의 표지된 샘플과 섞은 최종 부피가 50㎕가 되도록 하였다.
혼성화 환경으로는 마우이시스템 (MAUI Hybridization system, BIOMICRO sytem)을 이용하였으며, 칩 위에 마우이 리드 (MAUI Mixer AO Hybridization Chamber Lids, BIOMICRO system)를 붙인 뒤 샘플을 리드 안으로 집어 넣은 후 마우이 시스템 안에서 42℃에서 16시간 동안 혼성화시켰다.
혼성화 후 비특이적 혼성화 결합을 제거하기 위하여 SSPE를 포함하는 세척용액을 이용하여 칩을 세척하였다. 첫 번째 세척은 칩을 50ml 튜브에 담아 2×SSPE/0.1% SDS 용액으로 42℃에서 10분간 정치시켜서 진행하였고, 두 번째 세척은 칩을 50ml 튜브에 담아 0.1×SSPE/0.1% SDS 용액으로 상온에서 10분간 정치시켜서 진행하였으며, 마지막 세척은 칩을 50ml 튜브에 담아 0.1×SSPE 용액으로 상온에서 10분간 정치시켜서 진행하였다. 세척진행 중에는 암실 혹은 상자를 이용하여 칩이 빛에 노출되지 않도록 하였다.
세척된 칩은 레이저 스캐너 (GenePix 4000B, Agilent Instrument)를 이용하여 635nm의 파장에서 스캐닝하여 각 스팟에 존재하는 형광의 데이터를 얻어서 TIFF 형태의 이미지 파일로 저장하였다.
이와 같이 형광 표지된 cRNA를 인간 유전자가 집적화되어 있는 마이크로어레이 칩에 혼성화시키는 것은 조기 진통 환자의 cRNA가 인간의 어떠한 유전자와 특이적으로 결합하는지 여부를 확인하기 위한 것이다.
이를 위하여 본 실시예에서는 팔랑스 32K 사람 마이크로어레이 칩을 사용하였지만 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 가급적 조기 진통과 관련이 있거나 또는 관련이 없는 것으로 알려진 수천종류의 인간 유전자를 포함할 수 있고, 조기 진통과 관련이 있는 것으로 알려진 다수의 서로 다른 인간 유전자를 포함하는 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 바람직하다.
TIFF 이미지 파일을 GenePix 6.0 소프트웨어(Axon Instrument)로 정량하여 각 스팟의 형광값을 정량하였다.
일반적으로 DNA 칩 마이크로어레이에는 수천 개에서 수만 개의 유전자가 심어져 있기 때문에 형광 데이터를 분석할 때 많은 데이터와 다양한 형태로 인해 오류가 발생한다. 따라서, 이러한 형광 데이터간의 차이를 보정하는 분석 도구와 통계적 기법들이 사용되어야 한다. 즉, 실제 형광데이터 값에서 배경 형광값을 제거하고 오차로 판명된 스팟을 제거할 필요가 있다. 또한, 대비되는 유전자간의 형광데이터 값의 차이를 쉽게 이해하고 유전자 분석에 활용하기 위해 서로 다른 두 형광값의 차이를 조정하는 글로벌 노말라이제이션(global normalization) 기법을 사용할 필요가 있다.
구체적으로, 본 실시예에서는 GenePix 6.0에서 얻어진 정량 결과를 GeneSpring GX 소프트웨어(Agilent Technologies)를 이용하여, 글로벌 노말라이제이션(Global Normalization) 방법으로 보정하였다.
한편, 글로벌 노말라이제이션(global normalization) 방법, 계층적 군집화(hierarchical clustering) 분석, 그리고 이를 통한 정상군과 환자군 간의 전반적인 발현 양상의 차이를 확인하는 방법은 본 출원인이 특허출원한 공개특허 제10-2009-0105611호(2009. 10. 7.자 공개) 및 특허출원 제10-2009-0026799호(2009. 3. 30.자 출원)에 상세히 설명되어 있으므로 그 상세한 설명을 생략한다.
실시예 3: 정상군과 조기 진통 환자군 사이에서 유의한 발현의 차이를 보이는 유전자의 선별
정상 산모군와 조기진통 환자군 사이에서 유의한 발현의 차이를 보이는 유전자를 선별하기 위해 GeneSpring GX 소프트웨어에서 제공하는 통계적 방법들 중 다양한 t-검정법들(Student t-test, Welch t-test, Nonparametric t-test)을 사용하였다. 사용한 통계 방법들에서 모두 FDR(false discovery rate) < 0.01 이하이면서, 정상군과 환자군 사이에서 발현의 차이가 2배 이상 되는 유전자들을 선별하였다.
이 중에서 임심초기 혈액 샘플에서 발현량의 차이가 현저하면서 조기 진통과 관련이 있다는 사실이 아직 알려지지 않은 유전자 4개를 선정하였고(표 1 참조), RT-PCR 및 리얼타임 PCR을 통해 발현 양상을 검증하고자 하였다.
표 1. 임신 초기 혈액 샘플에서 조기진통군과 정상군 간에 유의한 차이를 보인 유전자 중에서 선정된 위험도 조기 예측용 유전자들
즉, 상기 표 1에 도시된 바와 같이, C1QB 및 C1QA 유전자들은 정상 임신부에 비해 조기진통 임신부에서 유전자 발현이 2배 이상 높았고, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들은 조기진통 임신부 비해 정상 임신부에서 유전자 발현이 2배 이상 높게 나타났다. 따라서, 이들 4개의 유전자들은 임신부의 조기진통의 위험도 조기 예측 정확도를 높이기 위한 마커 유전자들로서 적합한 것임을 알 수 있었다.
실시예 4: RT-PCR을 이용한 유전자 발현 양상의 검증
표 1의 선별확인된 4개 유전자들에 대해 조기진통의 위험도 조기 예측 마커 유전자로서의 유효성을 검증하기 위하여 RT-PCR 방법으로 유전자 발현 수준을 재확인하였다. RT-PCR을 수행하기 위해 마이크로어레이 칩 실험에 사용되었던 정상군과 조기진통 환자군의 전체 RNA를 각각 개별적으로 사용하였다.
RT-PCR 반응은 cDNA 합성부터 PCR 과정까지 한번에 진행되는 막심 RT-PCR 프리믹스 키트(Maxime RT-PCR PreMix kit) (Intron biotechnology 제품)를 사용하여 수행하였는데, 반응 시작 시 넣어주는 전체 RNA의 양은 1~100ng 사이에서 결정하였다. RT-PCR에 사용된 프라이머는 10pmol의 농도로 사용하였다. 상기 선별 확인된 4개 유전자들의 RT-PCR을 위한 프라이머 염기서열은 하기의 표 2에 나타낸 바와 같다.
표 2. RT-PCR 용 프라이머 염기서열
그리고 최종 PCR 반응 산물 중 7㎕를 취하여 0.5 ㎍/ml의 에티듐 브로마이드 존재 하에 2% 아가로즈 젤에서 전기영동하여 밴드를 관찰하였다(도 1 참조). 그 결과, 상기 표 1에 제시된 4개의 유전자 모두에 대해서 RT-PCR 결과가 명확히 마이크로어레이 결과와 일치함을 확인할 수 있었고, 마커 유전자 C1QB(GenBank Accession No.: NM_000491.3), C1QA(GenBank Accession No.: NM_015991.2), GMCL1(GenBank Accession No.: NM_178439.3) 및 AHCTF1(GenBank Accession No.: NM_015446.3)은 정상군과 환자군에서 유전자 발현 양상이 현저하게 차이가 나는 것을 다시 한번 확인할 수 있었다(도 1 참조). 따라서 C1QB(GenBank Accession No.: NM_000491.3), C1QA(GenBank Accession No.: NM_015991.2), GMCL1(GenBank Accession No.: NM_178439.3) 및 AHCTF1(GenBank Accession No.: NM_015446.3)의 4개의 유전자들은 조기진통의 위험도 조기 예측 마커 유전자로 적합한 것임을 알 수 있었다.
실시예 5: 리얼타임-PCR을 이용한 유전자 발현 양상의 재검증
표 1의 선별 확인된 4개 유전자들에 대해 조기진통의 위험도 조기 예측 마커 유전자로서의 유효성을 재검증하기 위해 리얼타임 PCR 방법을 사용하여 한번 더 유전자 발현 수준을 확인하였다.
리얼 타임 PCR에 사용된 정상군과 조기진통 환자군의 전체 RNA는 RT-PCR에 사용했던 것과 같은 샘플을 사용하였다.
cDNA 합성은 아미노 알릴 메시지 앰프 II aRNA 앰플리케이션 키트(Amino Allyl MessageAmpTM Ⅱ aRNA Amplification Kit)(Ambion Inc.)에 있는 구성 성분 중 cDNA 합성에 필요한 시약, 즉 T7 올리고 프라이머(oligo primer), 10X 1차 가닥 완충용액(first-strand buffer), 리보뉴클레아제 저해제(Ribonuclease inhibitor), dNTP 믹스(Mix), 역전사 효소(Reverse transcriptase)만을 사용하였다.
리얼 타임 PCR 기기로는 LigthCycler®480(Roche)을 사용하였고 시약은 LigthCycler®480 SYBR GreenⅠMaster(Roche)를 사용하여 수행하였다. 반응에 사용된 cDNA는 1:5로 희석하여 2㎕를 사용하였고 리얼 타임 PCR에 사용된 프라이머는 10pmol의 농도로 사용하였다. 상기 선별 확인된 4개 유전자들의 리얼타임 PCR을 위한 프라이머 염기서열은 하기의 표 3에 나타낸 바와 같다.
표 3. 리얼타임-PCR 용 프라이머 염기서열
최종 결과는 Cp(crossing point)값을 읽어서 확인하였고 유의한 정도에 대해서는 t-test를 통해 판단하였다. 그 결과, 4개의 유전자 모두에 대해서 리얼타임 PCR 결과와 마이크로어레이 결과가 일치하는 것을 확인할 수 있었다(도 2 및 표 4 참조).
한편, 리얼타임 PCR의 기본 원리는 중합효소와 형광공명 에너지 이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광의 검출과 정량에 있다. 리얼타임 PCR에서의 정량은 PCR시 매 주기의 진행 상황을 감시하여 지수 증가기(exponential phase) 범위 내에서 실시간으로 증폭산물을 측정하는 방법으로서, 이때 중요한 개념이 Ct(threshold cycle) 또는 Cp(crossing point)라는 수치이다. 이 값은 소식자의 분리에 의해 생기는 형광의 양이 기본값(baseline level)을 넘어서 감지될 수 있을 정도로 두드러지게 증가하는 시점의 주기수이며, 이는 초기 주형량(본 발명의 경우 마커 유전자의 발현량)을 비교적 정확하게 반영한다.
표 4. 리얼타임-PCR Cp값 분석 결과
결론적으로, RT-PCR과 리얼타임 PCR 결과 C1QB(GenBank Accession No.: NM_000491.3), C1QA(GenBank Accession No.: NM_015991.2), GMCL1(GenBank Accession No.: NM_178439.3) 및 AHCTF1(GenBank Accession No.: NM_015446.3)의 4개의 유전자들은 조기진통의 위험도 조기 예측 마커 유전자로서 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 조기진통의 위험도 조기 예측 마커 유전자들과 특이적으로 결합할 수 있는 유전자 프로브들 및 DNA 칩 제작
실시예 3 내지 실시예 5에서 확인한 4개의 유전자들, 즉 C1QB(GenBank Accession No.: NM_000491.3), C1QA(GenBank Accession No.: NM_015991.2), GMCL1(GenBank Accession No.: NM_178439.3) 및 AHCTF1(GenBank Accession No.: NM_015446.3) 유전자들에 특이적으로 결합하는 프로브를 제작하였다.
프로브는 당업계에 일반적으로 알려진 올리고뉴클레오티드 프로브 합성방법에 따라 제작하였는데, 알데히드가 코팅된 글라스 기판 위에 올리고뉴클레오티드를 공유결합시키기 위하여 모든 프로브의 5' 말단에 아미노 링크를 붙였다. 이와 같은 방식으로 하기의 표 5와 같은 염기서열(서열번호 17 내지 서열번호 20)을 합성하였다.
표 5. DNA 칩에 마이크로어레이되는 프로브 염기서열
또한, 기판 표면에 알데히드가 부착된 유리재질 또는 플라스틱 재질의 마이크로어레이용 칩 기판 위에 전술한 바와 같이 제작된 프로브들을 마이크로어레이 장비를 이용하여 찍어서 DNA 칩을 제작하였다. 마이크로어레이된 DNA 칩의 제작은 당업자에게 널리 알려진 방법을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 마이크로어레이 장비를 이용하여 유리 기판 위에 찍어진 올리고뉴클레오티드 프로브는 5'말단의 아민기가 유리 기판 상의 알데히드기와 시프염기(Schiff's base) 반응을 일으켜 유리 기판 상에 고정된다. 또한, 반응되지 않고 잔존하는 알데히드를 환원시키는 공정을 포함할 수도 있다. 알데히드의 환원조건 역시 특별히 이에 제한되는 것은 아니나 NaBH4 등의 환원제를 사용함이 바람직하다.
마이크로어레이되는 유전자 프로브는 서열번호 17 내지 서열번호 20의 염기서열을 갖는 프로브들 중에서 선택된 적어도 하나의 프로브로서 1개 만을 마이크로어레이할 수도 있고 4개 모두 마이크로어레이할 수도 있다. 구체적인 일실시예로서, 본 발명의 조기진통의 위험도 조기 예측 DNA 칩은 서열번호 17 내지 서열번호 20의 염기서열을 갖는 프로브들을 마이크로어레이한 DNA 칩일 수 있다.
본 발명은 상술한 바와 같은 조기진통의 위험도 조기 예측 마커 유전자를 이용하여 임신부에게 치명적인 조기 진통을 조기에 예측 진단할 수 있다. 즉, 전술한 4개 마커 유전자에 특이적인 프로브들이 집적된 조기진통의 위험도 조기 예측 DNA 칩을 제작하고, 이러한 조기진통의 위험도 조기 예측 DNA 칩에 임신부의 임신 초기 혈액 샘플로부터 분리된 RNA 또는 cDNA를 혼성화시키고, 발현되는 양상(형광강도 및 형광 패턴 등)을 조사함으로써 임신부들 중 조기 진통의 위험을 갖는 환자예상군을 조기에 간단하게 진단할 수 있는 것이다.
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
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labor and methods for analyzing gene expression levels related to
preterm labor using the specific marker genes
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<160> 20
<170> KopatentIn 1.71
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<223> C1QB RT-PCR sense primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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Claims (15)
- 조기 진통에 특이적인 위험도 조기예측 마커 유전자에 있어서,
C1QB(GenBank Accession No.: NM_000491.3), C1QA(GenBank Accession No.: NM_015991.2), GMCL1(GenBank Accession No.: NM_178439.3) 및 AHCTF1(GenBank Accession No.: NM_015446.3) 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자를 포함하는 조기 진통에 특이적인 위험도 조기예측 마커 유전자. - 조기 진통에 특이적인 위험도 조기예측 마커 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 조기 진통 위험도 조기예측 올리고뉴클레오티드 프로브에 있어서,
서열번호 17의 염기서열 내지 서열번호 20의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 포함하는 조기 진통 위험도 조기예측 올리고뉴클레오티드 프로브. - 제2항에 있어서,
서열번호 17의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 프로브는 마커 유전자 C1QB(GenBank Accession No.: NM_000491.3)와, 서열번호 18의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 프로브는 마커 유전자 C1QA(GenBank Accession No.: NM_015991.2)와, 서열번호 19의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 프로브는 마커유전자 GMCL1(GenBank Accession No.: NM_178439.3)과, 서열번호 20의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 프로브는 마커유전자 AHCTF1(GenBank Accession No.: NM_015446.3)과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 조기 진통 위험도 조기예측 올리고뉴클레오티드 프로브. - 서열번호 17의 염기서열 내지 서열번호 20의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 포함하는 조기 진통 위험도 조기예측 검사 칩.
- 제4항에 있어서,
상기 프로브는 기판 상에 마이크로어레이되어 있는 것을 특징으로 하는 조기 진통 위험도 조기예측 검사 칩. - 서열번호 1 내지 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 제1프라이머 군과, 서열번호 9 내지 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 제2프라이머 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 군, DNA 중합효소, dNTPs, PCR 완충용액 및 PCR 증폭산물의 표지물질을 포함하는 조기 진통에 특이적인 위험도 조기예측 마커 유전자 PCR 증폭키트.
- 제6항에 있어서,
상기 프라이머는 상기 제1프라이머 군으로부터 적어도 하나의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합으로 제공되거나, 상기 제2프라이머 군으로부터 적어도 하나의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 조합으로 제공되는 것을 특징으로 하는 조기 진통에 특이적인 위험도 조기예측 마커 유전자 PCR 증폭키트. - 피검자의 혈액으로부터 RNA를 준비하는 단계와,
상기 준비한 RNA로부터, 조기 진통에 특이적인 C1QB(GenBank Accession No.: NM_000491.3), C1QA(GenBank Accession No.: NM_015991.2), GMCL1(GenBank Accession No.: NM_178439.3) 및 AHCTF1(GenBank Accession No.: NM_015446.3) 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현수준을 측정하는 단계와,
상기 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현여부, 발현정도 및 정상군과의 발현정도의 차이를 분석하는 단계를 포함하는 조기 진통관련 유전자 발현양상 분석방법. - 피검자의 혈액으로부터 RNA를 준비하는 단계와,
상기 준비한 RNA를 이용하여 형광표지된 상보적인 염기서열을 합성하는 단계와,
상기 형광표지된 상보적인 염기서열과, 서열번호 17의 염기서열 내지 서열번호 20의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 혼성화시키는 단계와,
상기 혼성화 단계 이후, 상기 형광표지된 상보적인 염기서열과 상기 프로브와의 결합에 의한 형광강도를 확인하는 단계와,
상기 확인된 형광강도에 의해 조기 진통에 특이적인 유전자의 발현여부, 발현정도 및 정상군과의 발현정도의 차이를 분석하는 단계를 포함하는 조기 진통관련 유전자 발현양상 분석방법. - 피검자의 혈액으로부터 RNA를 준비하는 단계와,
상기 준비한 RNA를 주형으로 사용하고 조기 진통에 특이적인 C1QB(GenBank Accession No.: NM_000491.3), C1QA(GenBank Accession No.: NM_015991.2), GMCL1(GenBank Accession No.: NM_178439.3) 및 AHCTF1(GenBank Accession No.: NM_015446.3) 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자에 대한 프라이머를 이용하여 RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)을 수행하는 단계와,
상기 RT-PCR 증폭 산물에 대한 전기영동을 수행하여 조기 진통에 특이적인 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현여부, 발현정도 및 정상군과의 발현정도의 차이를 분석하는 단계를 포함하는 조기 진통관련 유전자 발현양상 분석방법. - 제10항에 있어서,
상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 군에서 선택된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머인 것을 특징으로 하는 조기 진통관련 유전자 발현양상 분석방법. - 피검자의 혈액으로부터 RNA를 준비하는 단계와,
상기 준비한 RNA를 주형으로 사용하고 조기 진통에 특이적인 C1QB(GenBank Accession No.: NM_000491.3), C1QA(GenBank Accession No.: NM_015991.2), GMCL1(GenBank Accession No.: NM_178439.3) 및 AHCTF1(GenBank Accession No.: NM_015446.3) 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 조기 진통에 특이적인 유전자에 대한 프라이머, 및 증폭되는 상기 적어도 하나의 조기 진통에 특이적인 유전자와 관련하여 조기 진통에 특이적인 유전자 증폭량을 나타내는 표지물질을 이용하여, 조기 진통에 특이적인 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자를 PCR 증폭하는 단계와,
상기 조기 진통에 특이적인 유전자의 증폭 후, 상기 표지물질을 이용하여 조기 진통에 특이적인 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자 증폭량에 기초하여 조기 진통에 특이적인 유전자 발현량을 산출하는 단계와,
상기 산출된 발현량에 기초하여 조기 진통에 특이적인 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현여부, 발현정도 및 정상군과의 발현정도의 차이를 분석하는 단계를 포함하는 조기 진통관련 유전자 발현양상 분석방법. - 제12항에 있어서,
상기 프라이머는 서열번호 9 내지 서열번호 16의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 군에서 선택된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머인 것을 특징으로 하는 조기 진통관련 유전자 발현양상 분석방법. - 제12항 또는 제13항에 있어서,
정상군의 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자를 PCR 증폭하는 단계와,
상기 정상군의 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자에 대한 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값)를 분석하는 단계와,
상기 피검자의 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값)를 분석하는 단계와,
상기 피검자의 Cp값을 상기 정상군의 Cp값과 비교하여 상기 피검자에 있어서 조기 진통에 특이적인 C1QB, C1QA, GMCL1 및 AHCTF1 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현여부, 발현정도 및 정상군과의 발현정도의 차이를 분석하는 단계를 더 포함하는 조기 진통관련 유전자 발현양상 분석방법. - 제12항 또는 제13항에 있어서,
상기 표지물질은 형광물질이고, 상기 표지물질로부터의 형광의 세기를 측정하여 상기 조기 진통에 특이적인 유전자 발현량을 산출하는 것을 특징으로 하는 조기 진통관련 유전자 발현양상 분석방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020100014778A KR20110095001A (ko) | 2010-02-18 | 2010-02-18 | 조기 진통에 특이적인 위험도 조기예측 마커 유전자 및 이를 이용한 조기진통 관련 유전자 발현양상 분석방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020100014778A KR20110095001A (ko) | 2010-02-18 | 2010-02-18 | 조기 진통에 특이적인 위험도 조기예측 마커 유전자 및 이를 이용한 조기진통 관련 유전자 발현양상 분석방법 |
Publications (1)
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| KR20110095001A true KR20110095001A (ko) | 2011-08-24 |
Family
ID=44930917
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| KR (1) | KR20110095001A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20230161852A (ko) | 2022-05-19 | 2023-11-28 | 이지연 | 바이오마커 세트를 이용한 조산 예측정보 획득방법 |
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2010
- 2010-02-18 KR KR1020100014778A patent/KR20110095001A/ko not_active Application Discontinuation
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