KR20110094304A - 단백질 고정화 전극 및 그 제조 방법과 기능 소자 및 그 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
화학적으로 안정한 금{金} 전극 위에 높은 안정성을 가지는 시토크롬 c552가 그의 전자 전달능을 보존유지{保持}한 채로 고정화된 장기 안정 이용가능한 단백질 고정화 전극 및 그 제조 방법을 제공한다.
금 전극(11) 위에 소수성{疏水性} 티올 및 친수성{親水性} 티올을 이용해서 자기{自己} 조직화 단분자막{單分子膜}(12)을 형성한다. 자기 조직화 단분자막(12)을 형성한 금 전극(11)을 시토크롬 c552 용액 중에 침지{浸漬}하는 것에 의해, 금 전극(11) 위에 자기 조직화 단분자막(12)을 거쳐서 시토크롬 c552(13)가 고정화된 단백질 고정화 전극을 제작한다.
금 전극(11) 위에 소수성{疏水性} 티올 및 친수성{親水性} 티올을 이용해서 자기{自己} 조직화 단분자막{單分子膜}(12)을 형성한다. 자기 조직화 단분자막(12)을 형성한 금 전극(11)을 시토크롬 c552 용액 중에 침지{浸漬}하는 것에 의해, 금 전극(11) 위에 자기 조직화 단분자막(12)을 거쳐서 시토크롬 c552(13)가 고정화된 단백질 고정화 전극을 제작한다.
Description
본 발명은, 단백질 고정화 전극 및 그 제조 방법과 이 단백질 고정화 전극을 이용한 기능 소자 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
근래{近年}, 단백질 고정화 전극의 수요가 높아지고 있다. 예를 들면, 생체 내에서는 수많은 단백질 커플 사이에서 전자 전달 반응이 행해지고 있지만, 그 단백질 커플 사이의 복합체 형성에 있어서의 배향이나 전자 전달의 메카니즘을 조사{調}할 때에 단백질 고정화 전극이 사용된다. 이 경우, 어떤 단백질을 전극에 고정화하고, 이 단백질과의 사이에서 또다른 하나의 단백질이 특이적인 상호작용을 했을 때에만, 단백질 고정화 전극을 통해서 전류를 검지한다고 하는 사용법으로 된다.
또, 근래, 단백질을 광전 변환 소자에 이용하는 것도 주목되고 있다. 예를 들면, 아연 시토크롬{cytochrome} c(말심근{馬心筋} 시토크롬 c의 철을 아연으로 치환한 것)를 금{金} 전극에 고정화한 단백질 고정화 전극으로부터 광전류가 얻어지는 것이 나타내어지고, 이 단백질 고정화 전극을 이용한 광전 변환 소자가 제안되어 있다(특허 문헌 1 참조). 그러나, 단백질은 생체 밖에서는 불안정하기 때문에, 이 광전 변환 소자의 장기 안정화를 도모할 수 있으면 매우 의미가 있기는 하지만, 본 발명자들이 아는 한, 지금까지 그렇게 말한 보고는 없다.
호열균{好熱菌} Thermusthermophilus 유래 시토크롬 c552는, 말심근 시토크롬 c와 마찬가지로 생체 내에서는 전자 전달체로서 일{기능}하고 있다. 시토크롬 c552는, 말심근 시토크롬 c에 비해 매우 높은 열 안정성을 갖고 있는 것이 알려져 있다(비특허 문헌 1 참조). 예를 들면, 일반적인 단백질의 변성 중점{中点}은 50∼60℃, 말심근 시토크롬 c의 변성 중점은 85℃인데 대해, 시토크롬 c552의 변성 온도는 일반적인 수용액 중(온도의 상한은 100℃)에서는 계측 불능이기 때문에, 적어도 100℃ 이상으로 높다. 또, 구아니딘 염산염(변성제{變性劑}) 4.2M 존재 하에서의 시토크롬 c552의 변성 중점은 60∼70℃라고 보고되어 있다.
시토크롬 c552는 이와 같이 높은 열 안정성을 가지는 것에 의해 디바이스 재료로서 적합하다. 시토크롬 c552와 말심근 시토크롬 c와는, 구성 아미노산, 입체 구조는 닮아 있지만, 전자 전달을 행하는 활성 중심 헴{heme} 포켓의 환경이 다르다. 구체적으로는, 말심근 시토크롬 c에서는 정전하를 갖는 리신 잔기{殘基; residue}가 분자 전체에 분산하고 있지만, 시토크롬 c552에서는 리신 잔기 수야말로 말심근 시토크롬 c와 같은{同} 정도이지만, 리신 잔기는 헴 포켓 주위에는 배치되어 있지 않다. 시토크롬 c552의 생체내 레독스 파트너와의 복합체 구조로부터, 이 복합체 형성은 소수성{疏水性} 상호작용이 메인이라는 것이 보고되어 있다(비특허 문헌 2 참조). 따라서, 시토크롬 c552를 그 전자 전달능을 보존유지{保持}한 채로 전극에 고정화하려면, 그 특이한 조건 검색이 필요하다.
말심근 시토크롬 c를 전극에 고정화하는 방법으로서는, 단분자막{單分子膜}(HS(CH2)10COO-, 1-카르복시-10-데칸티올)을 이용하는 방법이 알려져 있다. 그래서, 시토크롬 c552의 고정화에 이 고정화법을 이용하는 것이 생각된다. 그러나, 말심근 시토크롬 c의 고정화법에 이용되고 있는 단분자막을 이용해서 시토크롬 c552를 전극에 고정화하는 방법에서는, 지금까지, 시토크롬 c552의 산화 환원 전류는 얻어지고 있지 않다.
프랑스의 연구 그룹은, 시토크롬 c552를 은{銀} 전극에 고정화하고, 이 단백질 고정화 전극을 이용해서 단백질 유래의 산화 환원 전류를 얻는 것에 성공했다고 보고하고 있다(비특허 문헌 3 참조). 그러나, 이 단백질 고정화 전극을 이용해서 얻어진 사이클릭 볼타모그램에서는 산화파{酸化波}와 환원파{還元波}와의 사이의 피크 분리가 현저하기 때문에, 단백질의 배향 제어에 문제가 있다. 또, 전극 소재로서의 은은, 통상 환경의 이용에서도 용이하게 부식, 산화가 일어날 수 있다. 즉, 은 전극은, 장기 안정 이용에는 적합{向}하지 않기 때문에, 은 전극 대신에, 화학적으로 안정한 전극을 이용할 필요가 있다.
[선행 기술 문헌]
[특허 문헌]
특허 문헌 1: 일본 특개{特開}2007-220445호 공보
[비특허 문헌]
비특허 문헌 1: Fee, J. A. and 13 others, Protein Sci. 9, 2074(2000)
비특허 문헌 2: Muresanu, L. and 13 others, J. Biol. Chem. 281, 14503(2006)
비특허 문헌 3: Bernad, S. and 3 others, Eur. Biophys. J. 36, 1039 (2007)
그래서, 본 발명이 해결하려는 과제는, 화학적으로 안정한 금 전극 위에 높은 안정성을 가지는 시토크롬 c552, 그의 유도체{誘導體} 또는 그의 변이체{變異體}가 그의 전자 전달능을 보존유지한 채로 고정화된 장기 안정 이용가능한 단백질 고정화 전극 및 그 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하려는 다른{他} 과제는, 화학적으로 안정한 금 전극 위에 높은 안정성을 가지는 시토크롬 c552, 그의 유도체 또는 그의 변이체가 그의 전자 전달능을 보존유지한 채로 고정화된 장기 안정 이용가능한 단백질 고정화 전극을 이용하는 기능 소자 및 그 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 상기의 과제를 해결하기 위하여 예의{銳意} 연구를 행하던 중, 아주 우연히, 금 전극에 대해서 시토크롬 c552를 그의 전자 전달능을 손상{損}시키는 일없이 고정화할 수가 있는 것을 발견하고, 본 발명을 안출하기에 이른 것이다.
즉, 상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은,
금 전극과 이 금 전극에 고정화된 시토크롬 c552, 그의 유도체 또는 그의 변이체를 가지는 단백질 고정화 전극이다.
본 발명은 또,
금 전극에 시토크롬 c552, 그의 유도체 또는 그의 변이체를 고정화하도록 한 단백질 고정화 전극의 제조 방법이다.
본 발명은 또,
금 전극과 이 금 전극에 고정화된 시토크롬 c552, 그의 유도체 또는 그의 변이체를 가지는 단백질 고정화 전극을 가지는 기능 소자이다.
본 발명은 또,
금 전극 위에 시토크롬 c552, 그의 유도체 또는 그의 변이체를 고정화해서 단백질 고정화 전극을 형성하는 공정을 가지는 기능 소자의 제조 방법이다.
여기서, 기능 소자는, 시토크롬 c552, 그의 유도체 또는 그의 변이체를 이용하는 것인 한 특히 한정되지 않지만, 예를 들면 광전 변환 소자나, 광전 변환 기능을 가지는 각종 전자 소자 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 시토크롬 c552, 그의 유도체 또는 그의 변이체는, 전형적으로는, 그 소수성 부분을 금 전극 측으로 향하게 하여 고정화된다. 전형적으로는, 시토크롬 c552, 그의 유도체 또는 그의 변이체와 금 전극과는 자기{自己} 조직화 단분자막을 거쳐서 결합된다. 시토크롬 c552의 유도체는, 시토크롬 c552의 골격의 아미노산 잔기, 또는 헴이 화학 수식{修飾}된 것이다. 시토크롬 c552의 변이체는, 시토크롬 c552의 골격의 아미노산 잔기의 일부가 다른 아미노산 잔기로 치환된 것이다.
상술한 바와 같이 구성된 본 발명에 있어서는, 금 전극은 화학적으로 안정하기 때문에, 단백질 고정화 전극의 사용시에 전극의 부식이나 산화 등이 일어나는 것을 방지할 수가 있다. 또, 금 전극에 고정화했을 때에 시토크롬 c552, 그의 유도체 또는 그의 변이체의 전자 전달능이 손상되지 않도록 할 수가 있다.
본 발명에 의하면, 화학적으로 안정한 금 전극 위에 높은 안정성을 가지는 시토크롬 c552, 그의 유도체 또는 그의 변이체가 그의 전자 전달능을 보존유지한 채로 고정화된 장기 안정 이용가능한 단백질 고정화 전극을 실현할 수가 있다. 그리고, 이 단백질 고정화 전극을 이용해서 고성능인 갖가지 기능 소자를 실현할 수가 있다.
[도 1] 본 발명의 제1 실시형태에 의한 단백질 고정화 전극을 도시하는 대략선도{略線圖; schematic diagram}이다.
[도 2] 본 발명의 제1 실시형태에 의한 단백질 고정화 전극에서 이용되는 시토크롬 c552의 구조를 도시하는 대략선도이다.
[도 3] 본 발명의 제1 실시형태에 의한 단백질 고정화 전극에서 이용되는 시토크롬 c552의 구조를 도시하는 대략선도이다.
[도 4] 말심근 시토크롬 c의 구조를 도시하는 대략선도이다.
[도 5] 말심근 시토크롬 c의 구조를 도시하는 대략선도이다.
[도 6] 본 발명의 제1 실시형태에 의한 단백질 고정화 전극의 시토크롬 c552의 구조의 상세를 도시하는 대략선도이다.
[도 7] 본 발명의 제1 실시형태에 의한 단백질 고정화 전극의 시토크롬 c552의 구조의 상세를 도시하는 대략선도이다.
[도 8] 본 발명의 제1 실시형태에 의한 단백질 고정화 전극의 자기 조직화 단분자막의 구조를 도시하는 대략선도이다.
[도 9] 실시예에 의한 시토크롬 c552 고정화 전극을 이용해서 행한 사이클릭 볼탐메트리의 결과를 도시하는 대략선도이다.
[도 10] 실시예에 의한 시토크롬 c552 고정화 전극을 이용해서 행한 사이클릭 볼탐메트리의 결과를 도시하는 대략선도이다.
[도 11] 실시예에 의한 시토크롬 c552 고정화 전극을 실온{室溫}에서 단백질 용액 중에 보존{保存}했을 때의 전류값의 경일 변화{經日變化; variation per day}를 도시하는 대략선도이다.
[도 12] 실시예에 의한 시토크롬 c552 고정화 전극을 이용해서 행한 사이클릭 볼탐메트리의 결과를 도시하는 대략선도이다.
[도 13] 실시예에 의한 시토크롬 c552 고정화 전극을 이용해서 행한 사이클릭 볼탐메트리의 결과를 도시하는 대략선도이다.
[도 14] 시토크롬 c552 용액 중의 KCl 농도를 바꾸어 제작한 시토크롬 c552 고정화 전극을 이용해서 행한 사이클릭 볼탐메트리의 결과를 도시하는 대략선도이다.
[도 15] 자기 조직화 단분자막의 형성에 이용하는 HS(CH3)10CH2OH의 함유량을 바꾸어 제작한 시토크롬 c552 고정화 전극을 이용해서 행한 사이클릭 볼탐메트리의 결과를 도시하는 대략선도이다.
[도 16] 자기 조직화 단분자막의 형성에 이용하는 HS(CH3)10CH2OH의 함유량을 바꾸어 제작한 시토크롬 c552 고정화 전극을 이용해서 행한 사이클릭 볼탐메트리의 결과를 도시하는 대략선도이다.
[도 17] 자기 조직화 단분자막의 형성에 이용하는 원료 중의 HS(CH3)10CH2OH의 함유량을 바꾸어 제작한 시토크롬 c552 고정화 전극을 이용해서 행한 사이클릭 볼탐메트리에 의해 얻어진 사이클릭 볼타모그램에서의 피크에서의 전류값을 HS(CH3)10CH2OH의 함유량에 대해서 플로트{plot}한 대략 선도이다.
[도 18] 자기 조직화 단분자막의 형성에 이용하는 소수성 티올 및 친수성{親水性} 티올의 길이를 바꾸어 제작한 시토크롬 c552 고정화 전극을 이용해서 행한 사이클릭 볼탐메트리의 결과를 도시하는 대략선도이다.
[도 19] 본 발명의 제2 실시형태에 의한 광전 변환 소자의 구조를 도시하는 대략선도이다.
[도 2] 본 발명의 제1 실시형태에 의한 단백질 고정화 전극에서 이용되는 시토크롬 c552의 구조를 도시하는 대략선도이다.
[도 3] 본 발명의 제1 실시형태에 의한 단백질 고정화 전극에서 이용되는 시토크롬 c552의 구조를 도시하는 대략선도이다.
[도 4] 말심근 시토크롬 c의 구조를 도시하는 대략선도이다.
[도 5] 말심근 시토크롬 c의 구조를 도시하는 대략선도이다.
[도 6] 본 발명의 제1 실시형태에 의한 단백질 고정화 전극의 시토크롬 c552의 구조의 상세를 도시하는 대략선도이다.
[도 7] 본 발명의 제1 실시형태에 의한 단백질 고정화 전극의 시토크롬 c552의 구조의 상세를 도시하는 대략선도이다.
[도 8] 본 발명의 제1 실시형태에 의한 단백질 고정화 전극의 자기 조직화 단분자막의 구조를 도시하는 대략선도이다.
[도 9] 실시예에 의한 시토크롬 c552 고정화 전극을 이용해서 행한 사이클릭 볼탐메트리의 결과를 도시하는 대략선도이다.
[도 10] 실시예에 의한 시토크롬 c552 고정화 전극을 이용해서 행한 사이클릭 볼탐메트리의 결과를 도시하는 대략선도이다.
[도 11] 실시예에 의한 시토크롬 c552 고정화 전극을 실온{室溫}에서 단백질 용액 중에 보존{保存}했을 때의 전류값의 경일 변화{經日變化; variation per day}를 도시하는 대략선도이다.
[도 12] 실시예에 의한 시토크롬 c552 고정화 전극을 이용해서 행한 사이클릭 볼탐메트리의 결과를 도시하는 대략선도이다.
[도 13] 실시예에 의한 시토크롬 c552 고정화 전극을 이용해서 행한 사이클릭 볼탐메트리의 결과를 도시하는 대략선도이다.
[도 14] 시토크롬 c552 용액 중의 KCl 농도를 바꾸어 제작한 시토크롬 c552 고정화 전극을 이용해서 행한 사이클릭 볼탐메트리의 결과를 도시하는 대략선도이다.
[도 15] 자기 조직화 단분자막의 형성에 이용하는 HS(CH3)10CH2OH의 함유량을 바꾸어 제작한 시토크롬 c552 고정화 전극을 이용해서 행한 사이클릭 볼탐메트리의 결과를 도시하는 대략선도이다.
[도 16] 자기 조직화 단분자막의 형성에 이용하는 HS(CH3)10CH2OH의 함유량을 바꾸어 제작한 시토크롬 c552 고정화 전극을 이용해서 행한 사이클릭 볼탐메트리의 결과를 도시하는 대략선도이다.
[도 17] 자기 조직화 단분자막의 형성에 이용하는 원료 중의 HS(CH3)10CH2OH의 함유량을 바꾸어 제작한 시토크롬 c552 고정화 전극을 이용해서 행한 사이클릭 볼탐메트리에 의해 얻어진 사이클릭 볼타모그램에서의 피크에서의 전류값을 HS(CH3)10CH2OH의 함유량에 대해서 플로트{plot}한 대략 선도이다.
[도 18] 자기 조직화 단분자막의 형성에 이용하는 소수성 티올 및 친수성{親水性} 티올의 길이를 바꾸어 제작한 시토크롬 c552 고정화 전극을 이용해서 행한 사이클릭 볼탐메트리의 결과를 도시하는 대략선도이다.
[도 19] 본 발명의 제2 실시형태에 의한 광전 변환 소자의 구조를 도시하는 대략선도이다.
이하, 발명을 실시하기 위한 최량의 형태(이하, 실시형태로 한다)에 대해서 설명한다.
또한, 설명은 이하의 순서로 행한다.
1. 제1 실시형태(단백질 고정화 전극 및 그 제조 방법)
2. 제2 실시형태(광전 변환 소자)
<1. 제1 실시형태>
[단백질 고정화 전극]
도 1에 제1 실시형태에 의한 단백질 고정화 전극을 도시한다.
도 1에 도시하는 바와 같이, 이 단백질 고정화 전극에서는, 금 전극(11) 위에 자기 조직화 단분자막(self-assembled monolayer, SAM)(12)을 거쳐서 시토크롬 c552(13)가 고정화되어 있다. 이 경우, 시토크롬 c552(13)는, 그의 소수성 부분(13a)을 금 전극(11) 측으로 향하게 하여 고정화되어 있다. 시토크롬 c552(13)의 내부에 있는 헴(13b)에는, 중심 금속으로서 철(Fe)이 배위되어 있다.
도 2의 (a)에 시토크롬 c552의 구조를 모식적{模式的}으로 도시한다. 도 2의 (a)는 시토크롬 c552의 헴과 그의 축 배위자{配位子} 히스티딘(His), 메티오닌(Met)과 리신 잔기(정전하 아미노산)를 막대{棒} 모델로 도시한 것이다. 이 시토크롬 c552의 축 배위자 히스티딘(His)이 오른쪽으로 오는 향함{向}을 정면으로 했을 때, 도 2의 (a)는 헴의 정면도이다. 도 2의 (b)에 도 2의 (a)에 도시하는 시토크롬 c552의 표면 전하 분포도를 도시한다. 도 3의 (a)에 시토크롬 c552를 헴 배면측에서 본 도면을 도시한다. 도 3의 (b)에 도 3의 (a)에 도시하는 시토크롬 c552의 표면 전하 분포도를 도시한다.
비교를 위해서, 도 4의 (a)에 말심근 시토크롬 c의 헴 정면측에서 본 도면을, 도 4의 (b)에 도 4의 (a)에 도시하는 말심근 시토크롬 c의 표면 전하 분포도를, 도 5의 (a)에 말심근 시토크롬 c의 헴 배면측에서 본 도면을, 도 5의 (b)에 도 5의 (a)에 도시하는 말심근 시토크롬 c의 표면 전하 분포도를 도시한다.
도 4의 (b) 및 도 5의 (b)에 도시하는 바와 같이, 말심근 시토크롬 c에서는, 정전하가 분자 전체에 산재되어 있는데 대해, 도 2의 (b) 및 도 3의 (b)에 도시하는 바와 같이, 시토크롬 c552에서는, 정전하는 헴 배면에 집중되어 있다. 또, 시토크롬 c552의 헴 정면은 소수성 잔기와 중성 극성 잔기가 차지{占}한다. 시토크롬 c552(13)의 소수성 부분(13a)은 이 헴 정면의 부분을 가리킨다.
도 6에, 금 전극(11) 위에 자기 조직화 단분자막(12)을 거쳐서 고정화된 시토크롬 c552(13)를 모식적으로 도시한다. 도 6에서는, 시토크롬 c552(13)의 축 배위자 히스티딘은 앞쪽측{手前側; front}에 있고, 또 리신 잔기를 막대 모델로 도시했다.
도 7은, 금 전극(11) 위에 자기 조직화 단분자막(12)을 거쳐서 고정화된 시토크롬 c552(13)를 금 전극(11)측에서 본 도면을 도시하고, 축 배위자 히스티딘은 우측에 있다(헴 정면). 도 7에서는, 아미노산 측쇄{側鎖}를 막대 모델로 도시했다.
자기 조직화 단분자막(12)은 세 개의 부분으로 구성된다. 제1 부분은, 이 자기 조직화 단분자막(12)을 고정화하려고 하는 금 전극(11)의 표면의 원자와 반응하는 결합성 관능기(예를 들면, 티올기(-SH) 등)이다. 제2 부분은 통상은 알킬쇄{鎖}이며, 자기 조직화 단분자막(12)의 이차원적인 규칙 구조는 주로 이 알킬쇄 사이의 반데르발스{Van der Waals} 힘에 의해서 정해진다. 그 때문에, 일반적으로, 알킬쇄의 탄소수가 어느 정도 이상 많은 경우에, 안정·고밀도·고배향인 막이 형성된다. 제3 부분은 말단기이며, 이 말단기를 기능성 관능기로 하는 것에 의해 고체 표면의 기능화가 가능해진다.
자기 조직화 단분자막(12)은, 예를 들면 소수성 티올 및 친수성 티올을 이용해서 형성된 것이고, 이들 소수성 티올 및 친수성 티올의 비율{割合}에 의해, 시토크롬 c552(13)와 금 전극(11)과의 사이의 결합의 하기 쉬움{용이함}이 바뀐다. 친수성 티올의 친수기는, 예를 들면 -OH, -NH2, SO3-, OSO3-, COO-, NH4 + 등이다. 이들 소수성 티올 및 친수성 티올은 필요에 따라 선택된다.
이들 소수성 티올 및 친수성 티올의 조합의 매우 적합{好適}한 예를 들면, 소수성 티올이 HS(CH2)nCH3(n=5, 8, 10), 친수성 티올이 HS(CH2)nCH2OH(n=5, 8, 10)이다. 구체적으로는, 예를 들면 소수성 티올이 1-운데칸티올(HS(CH2)10CH3), 친수성 티올이 1-히드록시-11-운데칸티올(HS(CH2)10CH2OH)이다. 소수성 티올 및 친수성 티올의 다른 조합의 예로서는, 소수성 티올이 HS(CH2)mCH3, 친수성 티올이 HS(CH2)nCH2OH(단, m<n, m은 예를 들면 5이상, n은 예를 들면 10이하)의 예도 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 소수성 티올이 HS(CH2)9CH3, 친수성 티올이 HS(CH2)10CH2OH의 예이다.
도 8에 소수성 티올 및 친수성 티올을 이용해서 형성된 자기 조직화 단분자막(12)의 구조를 모식적으로 도시한다. 도 8에 도시하는 바와 같이, 소수성 티올(12a) 및 친수성 티올(12b)의 티올기(-SH) 측이 금 전극(11)의 표면에 결합한다. 또, 소수성 티올(12a)의 소수기 및 친수성 티올(12b)의 친수기(도 8에서 ○로 나타낸다) 측이, 시토크롬 c552(13)의 소수성 부분(13a)과 결합한다.
[단백질 고정화 전극의 제조 방법]
이 단백질 고정화 전극의 제조 방법의 1예에 대해서 설명한다.
우선, 금 전극(11)을 상기의 소수성 티올 및 친수성 티올을 소정의 비율로 혼합한 용액(용매는 예를 들면 에탄올)에 침지{浸漬}하는 것에 의해서, 도 1에 도시하는 바와 같이, 자기 조직화 단분자막(12)을 금 전극(11)의 표면에 형성한다.
다음에, 이렇게 해서 자기 조직화 단분자막(12)을 형성한 금 전극(11)을 시토크롬 c552(13)와 완충액과 필요에 따라 염화 칼륨(KCl) 등의 염을 포함하는 용액에 침지하는 것에 의해서, 자기 조직화 단분자막(12) 위에 시토크롬 c552(13)를 그의 소수성 부분(13a)이 금 전극(11)측을 향하도록 흡착 고정한다.
이상과 같이 해서, 목적으로 하는 단백질 고정화 전극이 제조된다.
[실시예]
이 단백질 고정화 전극(이하, 「시토크롬 c552 고정화 전극」이라고 한다)의 실시예에 대해서 설명한다.
1. 시료{試料}의 제작
소수성 티올로서의 1-운데칸티올(HS(CH2)10CH3)과 친수성 티올로서의 1-히드록시-11-운데칸티올(HS(CH2)10CH2OH)을 25:75의 비율로 혼합한 0.1mM 에탄올 용액을 조제{調製}했다. 이 용액에 청정한 금 드롭 전극 또는 금 평판 전극을 침지하고, 실온에서 하루 밤낮{一晝夜} 방치한다. 이렇게 해서, 자기 조직화 단분자막이 금 드롭 전극 또는 금 평판 전극의 표면에 형성된다.
이들 전극을 초순수{超純水}로 린스한 후, 50μM 시토크롬 c552 용액(10mM 트리스-염산 완충액(pH7.6), 50mM KCl)에 침지하고, 실온에서 30분 이상 인큐베이트한다. 이렇게 해서, 자기 조직화 단분자막을 거쳐서 금 드롭 전극 또는 금 평판 전극의 표면에 시토크롬 c552가 고정화된 시토크롬 c552 고정화 전극이 제작된다.
이렇게 해서 제작한 시토크롬 c552 고정화 전극을 이용해서 사이클릭 볼탐메트리를 행했다. 그 결과를 도 9 및 도 10에 도시한다. 도 9 및 도 10에서, I는 전류(A), E는 참조 전극(Ag/AgCl)에 대한 전위(V)이다(이하, 마찬가지). 도 9 및 도 10에 도시하는 바와 같이, 피크 분리가 없는 전형적인 흡착형의 사이클릭 볼타모그램을 그리고 있는 것을 알 수 있다. 여기서, 도 9에 도시하는 사이클릭 볼타모그램은, 전위 스위프{掃引; sweep} 속도를 10∼100㎷/s의 범위에서 10㎷/s씩 바꾸어 측정한 결과를 나타낸다. 또, 도 10에 도시하는 사이클릭 볼타모그램은, 전위 스위프 속도를 100∼1000㎷/s의 범위에서 100㎷/s씩 바꾸어 측정한 결과를 나타낸다.
도 9 및 도 10으로부터 알 수 있는 바와 같이, 이 시토크롬 c552 고정화 전극에서는, 전위 스위프 속도가 10∼1000㎷/s의 범위에서는 피크 분리가 생기고 있지 않다. 이것은, 이 시토크롬 c552 고정화 전극에서는, 시토크롬 c552의 헴 포켓이 금 전극에 대해서 최적으로 배향하고 있는 것을 나타내고 있다.
도 11은 이 시토크롬 c552 고정화 전극을 실온에서 단백질 용액 중에 보존했을 때의 전류값(애노딕 전류 Ipa 및 캐소딕 전류 Ica)의 경일 변화를 도시한다. 도 11에 도시하는 바와 같이, 이 시토크롬 c552 고정화 전극은, 단백질 용액 중에 있어서 실온에서 1개월간 보존한 후에서도, 같은 산화 환원 전류값이 얻어진다. 이에 대해, 말심근 시토크롬 c를 사용한 마찬가지 실험에서는, 시간이 경과{經}할 때마다 전류값이 감소하고, 사이클릭 볼타모그램에서의 피크 분리도 일어난다.
다음에, 시토크롬 c552 고정화 전극에서의 시토크롬 c552의 헴의 향함이, 실시예에 의한 시토크롬 c552 고정화 전극에서의 시토크롬 c552의 헴의 방향과 반대, 즉 금 전극과 반대측을 향하고 있는 경우의 비교 데이터에 대해서 설명한다. 보다 구체적으로는, 말단의 다른{異} 자기 조직화 단분자막을 이용해서 시토크롬 c552를 금 전극에 고정화한 경우, 즉 올바르지 않은 배향으로 시토크롬 c552를 고정화한 경우의 데이터에 대해서 설명한다.
구체적으로는, 말단(-R)의 다른 탄소수 10의 티올(HS(CH2)10R)을 이용해서 시토크롬 c552를 금 전극에 고정화한 시토크롬 c552 고정화 전극을 이용해서 사이클릭 볼탐메트리를 행했다. 얻어진 사이클릭 볼타모그램을 도 12에 도시한다. 단, 완충액으로서는 10mM 인산-Na 용액(pH7.0)을 이용하고, 전위 스위프 속도는 50㎷/s로 했다.
도 12에서, 말단(-R)이 -COO-인 경우에, 단백질 같은 산화 환원의 피크가 보이지만, 산화 환원 사이클을 반복하면, 얼마 안 있어{결국} 소멸한다. 이것으로부터, 시토크롬 c552를 올바르지 않은 배향으로 금 전극에 고정화한 경우에는, 시토크롬 c552의 기능을 보존유지할 수 없다는 것을 알 수 있다.
다음에, 상기의 시토크롬 c552 고정화 전극을 제작할 때에 이용하는 시토크롬 c552 용액중의 KCl 농도를 변화시켜서 사이클릭 볼탐메트리를 행한 결과에 대해서 설명한다.
측정시에는, 완충액으로서 10mM 인산-Na 용액(pH 7.0)을 이용하고, 전위 스위프 속도는 50㎷/s로 했다. 시토크롬 c552 고정화 전극으로서는, 상기와 마찬가지로 HS(CH2)10CH3 및 HS(CH3)10CH2OH를 이용해서 형성한 자기 조직화 단분자막을 거쳐서 금 드롭 전극에 시토크롬 c552를 고정화한 것을 이용했다. 단, 금 드롭 전극의 직경은 2.5㎜이다.
얻어진 사이클릭 볼타모그램을 도 13에 도시한다. 단, 시토크롬 c552 용액중의 완충액은 10mM 트리스-염산 완충액(pH 7.6)을 이용했다. 시토크롬 c552를 고정화할 수 있는 시토크롬 c552 용액 중의 KCl 농도의 범위는 0∼200mM이므로, 이 범위에서 KCl 농도를 변화시켜서 사이클릭 볼탐메트리를 행했다.
도 14는, 도 13에 도시하는 사이클릭 볼타모그램의 캐소딕 전류(하향{下向}의 피크)를 적분하고, 총{總}전하량을 구하고, KCl 농도에 대해서 플로트한 그래프를 도시한다. 도 14에서, KCl 농도는 10∼30mM가 최적 농도인 것을 알 수 있다. 이 최적 농도의 경우, 시토크롬 c552 용액 중에 KCl이 존재하지 않는 경우, 즉 KCl 농도가 0mM인 경우, 혹은 KCl 농도가 50mM 이상인 경우에 비해, 시토크롬 c552의 고정화량은 약 1.5배로 된다. KCl 농도가 100mM보다 높은 경우에는, 시토크롬 c552 및 자기 조직화 단분자막의 탈리{脫離}가 보이게 된다.
다음에, 자기 조직화 단분자막을 형성할 때에 이용하는, HS(CH2)10CH3과 HS(CH2)10CH2OH를 혼합한 에탄올 용액 중의 HS(CH2)10CH3과 HS(CH2)10CH2OH와의 비율을 바꾸어 자기 조직화 단분자막을 형성했다. 그리고, 이 자기 조직화 단분자막을 거쳐서 시토크롬 c552를 금 전극에 고정화한 시토크롬 c552 고정화 전극의 사이클릭 볼탐메트리를 행했다. 단, 측정시에는, 완충액으로서 10mM 인산-Na 용액(pH 7.0)을 이용하고, 전위 스위프 속도는 50㎷/s로 했다.
얻어진 사이클릭 볼타모그램을 도 15에 도시한다. 도 15의 각주{脚注}의 수치는 ([HS(CH2)10CH3]/[HS(CH2)10CH2OH])를 나타내고, 예를 들면 (20/80)은 HS(CH2)10CH3가 20%, HS(CH2)10CH2OH가 80%인 것을 의미한다.
도 15에 도시하는 결과에 입각해서, HS(CH2)10CH3과 HS(CH2)10CH2OH와의 전체에서의 HS(CH2)10CH2OH의 함유량을 60∼95%의 범위에서 5% 간격으로{刻; 마다, 씩} 세세하게 변화시켜서 조사했다. 그 결과를 도 16에 도시한다.
도 15 및 도 16에 도시하는 결과의, 산화 환원 피크에서의 전류값을 HS(CH2)10CH2OH의 함유량에 대해서 플로트한 그래프를 도 17에 도시한다. 도 17에서, HS(CH2)10CH2OH의 함유량이 60∼90%의 범위에서 시토크롬 c552의 고정화를 양호하게 행하는 것이 가능하다고 하는 것을 알 수 있다. 상세는 생략하지만, 별도{別途} 행한 실험에 의해, 소수성 티올이 HS(CH2)nCH3(n=5, 8, 10), 친수성 티올이 HS(CH2)nCH2OH(n=5, 8, 10)인 경우 전반{全般}에 대해서, HS(CH2)nCH2OH의 함유량이 60∼90%의 범위에서 시토크롬 c552의 고정화를 양호하게 행하는 것이 가능하다고 하는 것이 확인되고 있다.
다음에, 자기 조직화 단분자막을 형성할 때에 이용하는 소수성 티올 및 친수성 티올의 길이를 변화시켜서 사이클릭 볼탐메트리를 행한 결과에 대해서 설명한다. 구체적으로는, 소수성 티올로서 말단이 메틸기이고 탄소수가 5 또는 10인 HS(CH2)5CH3, HS(CH2)10CH3, 친수성 티올로서 말단이 히드록시메틸기이고 탄소수가 5 또는 10인 HS(CH2)10CH2OH, HS(CH2)5CH2OH를 이용하고, 이들을 조합해서 자기 조직화 단분자막을 제작했다. 그리고, 이 자기 조직화 단분자막을 거쳐서 금 전극에 시토크롬 c552를 고정화했다. 이렇게 해서 제작된 시토크롬 c552 고정화 전극을 이용해서 사이클릭 볼탐메트리를 행했다. 얻어진 사이클릭 볼타모그램을 도 18에 도시한다.
도 18에 도시하는 곡선(1), (2), (3), (7)에서, 단백질 유래의 피크가 0V 부근에 보여진다. 이것은, 자기 조직화 단분자막을 형성할 때에 이용하는 소수성 티올 및 친수성 티올에서의 소수성 티올의 메틸기와 친수성 티올의 히드록실기와의 밸런스, 즉 자기 조직화 단분자막의 표면에서의 소수기와 친수기와의 분포의 밸런스가 유지{保}되면, 소수성 티올 및 친수성 티올의 탄소수를 바꾸어도 시토크롬 c552를 동일한 배향으로 고정화할 수가 있는 것을 나타내고 있다. 친수성 티올에 대해서는, 친수기의 탄소수는 5인 경우보다 10인 경우가 보다 양호한 결과가 얻어지고 있다.
이상과 같이, 이 제1 실시형태에 의하면, 화학적으로 안정한 금 전극(11) 위에 높은 안정성을 가지는 시토크롬 c552(13)를 그의 소수성 부분(13a)이 금 전극(11)측을 향하도록 자기 조직화 단분자막(12)을 거쳐서 고정화하도록 하고 있다. 이 때문에, 시토크롬 c552(13)가 그의 전자 전달능을 보존유지한 채로 금 전극(11)에 고정화된 장기 안정 이용가능한 단백질 고정화 전극을 실현할 수가 있다.
<2. 제2 실시형태〉
[광전 변환 소자]
도 19에 도시하는 바와 같이, 이 광전 변환 소자에서는, 제1 실시형태와 마찬가지로, 금 전극(11) 위에 자기 조직화 단분자막(12)을 거쳐서 시토크롬 c552(13)가 고정화된 단백질 고정화 전극을 가진다. 또, 이 시토크롬 c552(13)에는, 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)(14)이 정전적{靜電的}으로 결합되어 있다.
이 광전 변환 소자에서는, 외부로부터 입사{入射}한 광(hν)이 녹색 형광 단백질(14)에 입사하면, 이 광의 입사에 의해 녹색 형광 단백질(14)의 전자가 여기{勵起}된다. 여기된 전자는 시토크롬 c552(13)로 이동하고, 금 기판(11)으로부터 광전류로서 외부로 꺼내{取出}진다. 이렇게 해서 광전 변환이 행해진다.
상기 이외의 것은 제1 실시형태와 마찬가지이다.
이 제2 실시형태에 의하면, 장기 안정 이용가능한 단백질 고정화 전극을 이용한 신규한 광전 변환 소자를 실현할 수가 있다.
이상, 본 발명의 실시형태에 대해서 구체적으로 설명했지만, 본 발명은, 상술한 실시형태에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상에 의거하는 각종 변형이 가능하다.
예를 들면, 상술한 실시형태에서 든 수치, 구조, 구성, 형상, 재료 등은 어디까지나 예에 불과하며, 필요에 따라 이들과 다른 수치, 구조, 구성, 형상, 재료 등을 이용해도 좋다.
11: 금 전극, 12: 자기 조직화 단분자막(SAM), 12a: 소수성 티올, 12b: 친수성 티올, 13: 시토크롬 c552, 13a: 소수성 부분, 13b: 헴.
Claims (14)
- 금{金} 전극과 이 금 전극에 고정화된 시토크롬 c552, 그의 유도체{誘導體} 또는 그의 변이체{變異體}를 가지는 단백질 고정화 전극.
- 제1항에 있어서,
상기 시토크롬 c552, 그의 유도체 또는 그의 변이체는 그의 소수성{疏水性} 부분을 상기 금 전극 측으로 향하게 하여 고정화되어 있는 단백질 고정화 전극. - 제2항에 있어서,
상기 시토크롬 c552, 그의 유도체 또는 그의 변이체와 상기 금 전극과는 자기{自己} 조직화 단분자막{單分子膜}을 거쳐서 결합되어 있는 단백질 고정화 전극. - 제3항에 있어서,
상기 자기 조직화 단분자막은 소수성 티올 및 친수성{親水性} 티올을 이용해서 형성된 것인 단백질 고정화 전극. - 제4항에 있어서,
상기 소수성 티올은 HS(CH2)nCH3(n=5, 8, 10), 상기 친수성 티올은 HS(CH2)nCH2OH(n=5, 8, 10)인 단백질 고정화 전극. - 제5항에 있어서,
상기 자기 조직화 단분자막중 의 HS(CH2)nCH2OH의 함유량이 60% 이상 90% 이하인 단백질 고정화 전극. - 제4항에 있어서,
상기 소수성 티올은 HS(CH2)10CH3, 상기 친수성 티올은 HS(CH2)10CH2OH인 단백질 고정화 전극. - 제4항에 있어서,
상기 소수성 티올은 HS(CH2)mCH3, 상기 친수성 티올은 HS(CH2)nCH2OH(m<n)인 단백질 고정화 전극. - 금 전극에 시토크롬 c552, 그의 유도체 또는 그의 변이체를 고정화하도록 한 단백질 고정화 전극의 제조 방법.
- 제9에 있어서,
상기 시토크롬 c552, 그의 유도체 또는 그의 변이체를 그의 소수성 부분이 상기 금 전극 측으로 향하도록 고정화하는 단백질 고정화 전극의 제조 방법. - 제10항에 있어서,
상기 시토크롬 c552, 그의 유도체 또는 그의 변이체를 자기 조직화 단분자막을 거쳐서 상기 금 전극과 결합하는 단백질 고정화 전극의 제조 방법. - 제11항에 있어서,
상기 금 전극 위에 상기 자기 조직화 단분자막을 형성한 후, 시토크롬 c552, 그의 유도체 또는 그의 변이체와 완충액과 10mM 이상 30mM 이하의 염화 칼륨을 포함하는 용액에 상기 자기 조직화 단분자막이 형성된 상기 금 전극을 침지{浸漬}하는 것에 의해 상기 시토크롬 c552, 그의 유도체 또는 그의 변이체를 상기 자기 조직화 단분자막을 거쳐서 상기 금 전극과 결합하도록 한 단백질 고정화 전극의 제조 방법. - 금 전극과 이 금 전극에 고정화된 시토크롬 c552, 그의 유도체 또는 그의 변이체를 가지는 단백질 고정화 전극을 가지는 기능 소자.
- 금 전극 위에 시토크롬 c552, 그의 유도체 또는 그의 변이체를 고정화해서 단백질 고정화 전극을 형성하는 공정을 가지는 기능 소자의 제조 방법.
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