WO2010071071A1 - タンパク質固定化電極およびその製造方法ならびに機能素子およびその製造方法 - Google Patents

タンパク質固定化電極およびその製造方法ならびに機能素子およびその製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2010071071A1
WO2010071071A1 PCT/JP2009/070674 JP2009070674W WO2010071071A1 WO 2010071071 A1 WO2010071071 A1 WO 2010071071A1 JP 2009070674 W JP2009070674 W JP 2009070674W WO 2010071071 A1 WO2010071071 A1 WO 2010071071A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cytochrome
immobilized
electrode
protein
self
Prior art date
Application number
PCT/JP2009/070674
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
斉爾 山田
義夫 後藤
戸木田　裕一
Original Assignee
ソニー株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ソニー株式会社 filed Critical ソニー株式会社
Priority to US13/139,461 priority Critical patent/US8609438B2/en
Priority to EP09833374.3A priority patent/EP2360466A4/en
Priority to CN200980154795.9A priority patent/CN102282461B/zh
Priority to BRPI0923356-3A priority patent/BRPI0923356A2/pt
Priority to RU2011124246/10A priority patent/RU2532841C2/ru
Publication of WO2010071071A1 publication Critical patent/WO2010071071A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/14—Peptides being immobilised on, or in, an inorganic carrier
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y10/00—Nanotechnology for information processing, storage or transmission, e.g. quantum computing or single electron logic
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • H—ELECTRICITY
    • H10—SEMICONDUCTOR DEVICES; ELECTRIC SOLID-STATE DEVICES NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • H10K—ORGANIC ELECTRIC SOLID-STATE DEVICES
    • H10K30/00—Organic devices sensitive to infrared radiation, light, electromagnetic radiation of shorter wavelength or corpuscular radiation
    • H10K30/451—Organic devices sensitive to infrared radiation, light, electromagnetic radiation of shorter wavelength or corpuscular radiation comprising a metal-semiconductor-metal [m-s-m] structure
    • H—ELECTRICITY
    • H10—SEMICONDUCTOR DEVICES; ELECTRIC SOLID-STATE DEVICES NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • H10K—ORGANIC ELECTRIC SOLID-STATE DEVICES
    • H10K85/00—Organic materials used in the body or electrodes of devices covered by this subclass
    • H10K85/761—Biomolecules or bio-macromolecules, e.g. proteins, chlorophyl, lipids or enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • G01N2333/80—Cytochromes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2610/00—Assays involving self-assembled monolayers [SAMs]
    • H—ELECTRICITY
    • H10—SEMICONDUCTOR DEVICES; ELECTRIC SOLID-STATE DEVICES NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • H10K—ORGANIC ELECTRIC SOLID-STATE DEVICES
    • H10K30/00—Organic devices sensitive to infrared radiation, light, electromagnetic radiation of shorter wavelength or corpuscular radiation
    • H10K30/50—Photovoltaic [PV] devices
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E10/00—Energy generation through renewable energy sources
    • Y02E10/50—Photovoltaic [PV] energy
    • Y02E10/549—Organic PV cells
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P70/00—Climate change mitigation technologies in the production process for final industrial or consumer products
    • Y02P70/50—Manufacturing or production processes characterised by the final manufactured product

Definitions

  • the present invention relates to a protein-immobilized electrode and a method for producing the same, a functional device using the protein-immobilized electrode, and a method for producing the same.
  • Thermusthermophilus-derived cytochrome c552 acts as an electron carrier in the living body in the same manner as the equine cardiac muscle cytochrome c.
  • Cytochrome c552 is known to have very high thermal stability compared to equine myocardial cytochrome c (see Non-Patent Document 1).
  • the denaturation midpoint of a general protein is 50-60 ° C.
  • the denaturation midpoint of equine myocardial cytochrome c is 85 ° C.
  • the denaturation temperature of cytochrome c552 is in a general aqueous solution (the upper limit of the temperature is 100 Since it cannot be measured at (° C.), it is at least 100 ° C. or higher.
  • the midpoint of denaturation of cytochrome c552 in the presence of 4.2M guanidine hydrochloride (modifier) is reported to be 60-70 ° C.
  • Cytochrome c552 is suitable as a device material because of its high thermal stability. Cytochrome c552 and equine cardiac muscle cytochrome c are similar in constituent amino acid and three-dimensional structure, but are different in the environment of the active center hem pocket that conducts electrons. Specifically, lysine residues having a positive charge are dispersed throughout the molecule in equine cardiac muscle cytochrome c, but the number of lysine residues in cytochrome c552 is the same as that of equine cardiac muscle cytochrome c. Is not placed around the hem pocket.
  • Non-Patent Document 2 From the complex structure of cytochrome c552 with the in vivo redox partner, it has been reported that the formation of this complex is mainly a hydrophobic interaction (see Non-Patent Document 2). Therefore, in order to immobilize cytochrome c552 on the electrode while maintaining its electron transfer capability, a specific condition search is necessary.
  • Non-Patent Document 3 A French research group reported that cytochrome c552 was immobilized on a silver electrode and succeeded in obtaining a protein-derived redox current using this protein-immobilized electrode (see Non-Patent Document 3).
  • cytochrome c552 was immobilized on a silver electrode and succeeded in obtaining a protein-derived redox current using this protein-immobilized electrode (see Non-Patent Document 3).
  • the cyclic voltammogram obtained using this protein-immobilized electrode there is a problem in controlling the protein orientation because the peak separation between the oxidation wave and the reduction wave is remarkable.
  • silver as an electrode material can easily corrode and oxidize even in normal environment use. That is, since the silver electrode is not suitable for long-term stable use, it is necessary to use a chemically stable electrode instead of the silver electrode.
  • the problem to be solved by the present invention is that a long-term stable structure in which cytochrome c552 having high stability, a derivative thereof or a variant thereof is immobilized on a chemically stable gold electrode while retaining its electron transfer ability. It is to provide an available protein-immobilized electrode and a method for producing the same. Another problem to be solved by the present invention is the long-term stability in which cytochrome c552, a derivative thereof or a variant thereof having high stability is immobilized on a chemically stable gold electrode while retaining its electron transfer ability. It is to provide a functional device using a protein-immobilized electrode that can be used and a method for producing the functional device.
  • the present inventors have found that it is possible to immobilize cytochrome c552 on a gold electrode without impairing its electron transfer capability, while conducting earnest research to solve the above problems. It came to devise invention. That is, in order to solve the above problems, the present invention provides: A protein-immobilized electrode having a gold electrode and cytochrome c552, a derivative thereof, or a variant thereof immobilized on the gold electrode. The invention also provides This is a method for producing a protein-immobilized electrode in which cytochrome c552, a derivative thereof or a variant thereof is immobilized on a gold electrode.
  • the invention also provides It is a functional element having a protein-immobilized electrode having a gold electrode and cytochrome c552, a derivative thereof, or a variant thereof immobilized on the gold electrode.
  • the invention also provides This is a method for producing a functional device having a step of forming a protein-immobilized electrode by immobilizing cytochrome c552, a derivative thereof or a variant thereof on a gold electrode.
  • the functional element is not particularly limited as long as cytochrome c552, a derivative thereof or a mutant thereof is used, and examples thereof include a photoelectric conversion element and various electronic elements having a photoelectric conversion function.
  • cytochrome c552 a derivative thereof, or a variant thereof is typically immobilized with its hydrophobic portion facing the gold electrode.
  • cytochrome c552, a derivative or variant thereof, and a gold electrode are bound via a self-assembled monolayer.
  • the derivative of cytochrome c552 is obtained by chemically modifying the amino acid residue or heme of the skeleton of cytochrome c552.
  • the mutant of cytochrome c552 is obtained by substituting a part of the amino acid residue of the backbone of cytochrome c552 with another amino acid residue.
  • the gold electrode is chemically stable, it is possible to prevent the electrode from being corroded or oxidized when the protein-immobilized electrode is used. In addition, it is possible to prevent the electron transfer ability of cytochrome c552, a derivative thereof, or a mutant thereof from being impaired when immobilized on a gold electrode.
  • long-term stable protein immobilization in which cytochrome c552 having high stability, a derivative thereof or a variant thereof is immobilized while maintaining its electron transfer ability on a chemically stable gold electrode.
  • An electrode can be realized.
  • various functional elements with high performance can be realized using this protein-immobilized electrode.
  • Is a schematic diagram illustrating a HS (CH 3) 10 CH 2 OH cyclic results of voltammetry content was performed using the cytochrome c552 immobilized electrode was prepared by changing the used to form a self-assembled monolayer.
  • Cyclic voltammograms obtained by cyclic voltammetry performed using cytochrome c552-immobilized electrodes prepared by changing the content of HS (CH 3 ) 10 CH 2 OH in the raw material used for forming the self-assembled monolayer it is a schematic diagram obtained by plotting the current values relative to the content of HS (CH 3) 10 CH 2 OH in the peak at.
  • First Embodiment Protein-immobilized electrode and manufacturing method thereof
  • Second embodiment photoelectric conversion element
  • FIG. 1 shows a protein-immobilized electrode according to the first embodiment.
  • cytochrome c552 13 is immobilized on a gold electrode 11 via a self-assembled monolayer (SAM) 12.
  • SAM self-assembled monolayer
  • cytochrome c552 13 is fixed with its hydrophobic portion 13a facing the gold electrode 11 side.
  • Iron (Fe) is coordinated to the hem 13b inside the cytochrome c552 13 as a central metal.
  • FIG. 2A schematically shows the structure of cytochrome c552.
  • FIG. 2A shows the cytochrome c552 heme and its axial ligands histidine (His), methionine (Met) and lysine residues (positively charged amino acids) in a bar model.
  • FIG. 2A is a front view of heme when the direction in which the axial ligand histidine (His) of cytochrome c552 comes to the right is assumed to be the front.
  • FIG. 2B shows a surface charge distribution diagram of the cytochrome c552 shown in FIG. 2A.
  • FIG. 3A shows a view of cytochrome c552 as seen from the back side of the hem.
  • FIG. 3B shows a surface charge distribution diagram of the cytochrome c552 shown in FIG. 3A.
  • FIG. 4A is a view of the equine myocardial cytochrome c viewed from the hem front side
  • FIG. 4B is a surface charge distribution diagram of the equine myocardial cytochrome c shown in FIG. 4A
  • FIG. 5B shows a surface charge distribution diagram of the equine myocardial cytochrome c shown in FIG. 5A.
  • FIG. 6 schematically shows cytochrome c552 13 immobilized on the gold electrode 11 via the self-assembled monolayer 12.
  • the axial ligand histidine of cytochrome c552 13 is on the near side, and lysine residues are shown in a bar model.
  • FIG. 7 shows a view of cytochrome c552 13 immobilized on the gold electrode 11 via the self-assembled monolayer 12 from the gold electrode 11 side, and the axial ligand histidine is on the right side (heme front). ).
  • the amino acid side chains are shown in a bar model.
  • the self-assembled monolayer 12 is composed of three parts.
  • the first part is a binding functional group (for example, a thiol group (—SH)) that reacts with atoms on the surface of the gold electrode 11 to be immobilized on the self-assembled monolayer 12.
  • the second part is usually an alkyl chain, and the two-dimensional regular structure of the self-assembled monolayer 12 is mainly determined by the van der Waals force between the alkyl chains. Therefore, generally, when the number of carbon atoms in the alkyl chain is more than a certain level, a stable, high-density, highly oriented film is formed.
  • the third part is a terminal group. By using the terminal group as a functional functional group, the solid surface can be functionalized.
  • the self-assembled monolayer 12 is formed using, for example, a hydrophobic thiol and a hydrophilic thiol. Depending on the ratio of the hydrophobic thiol and the hydrophilic thiol, the cytochrome c552 13 and the gold electrode 11 The ease of coupling between changes.
  • the hydrophilic group of the hydrophilic thiol is, for example, —OH, —NH 2 , SO 3 ⁇ , OSO 3 ⁇ , COO ⁇ , NH 4 + and the like. These hydrophobic thiols and hydrophilic thiols are selected as needed.
  • the hydrophobic thiol is 1-undecanethiol (HS (CH 2 ) 10 CH 3 )
  • the hydrophilic thiol is 1-hydroxy-11-undecanethiol (HS (CH 2 ) 10 CH 2 OH). is there.
  • hydrophobic thiols are HS (CH 2 ) m CH 3
  • hydrophilic thiols are HS (CH 2 ) n CH 2 OH (where m ⁇ n, m Is, for example, 5 or more, and n is, for example, 10 or less.
  • the hydrophobic thiol is HS (CH 2 ) 9 CH 3
  • the hydrophilic thiol is HS (CH 2 ) 10 CH 2 OH.
  • FIG. 8 schematically shows the structure of the self-assembled monolayer 12 formed using a hydrophobic thiol and a hydrophilic thiol.
  • the thiol group (—SH) side of the hydrophobic thiol 12 a and the hydrophilic thiol 12 b is bonded to the surface of the gold electrode 11.
  • the hydrophobic group of the hydrophobic thiol 12a and the hydrophilic group (indicated by ⁇ in FIG. 8) of the hydrophilic thiol 12b are bonded to the hydrophobic portion 13a of the cytochrome c552-13.
  • cytochrome c552-immobilized electrode Examples of this protein-immobilized electrode (hereinafter referred to as “cytochrome c552-immobilized electrode”) will be described.
  • cytochrome c552-immobilized electrode 1-undecanethiol (HS (CH 2 ) 10 CH 3 ) as a hydrophobic thiol and 1-hydroxy-11-undecanethiol (HS (CH 2 ) 10 CH 2 OH) as a hydrophilic thiol :
  • a 0.1 mM ethanol solution mixed at a ratio of 75 was prepared.
  • a clean gold drop electrode or gold plate electrode is immersed in this solution and left at room temperature overnight. Thus, a self-assembled monolayer is formed on the surface of the gold drop electrode or the gold plate electrode.
  • cytochrome c552 solution 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6), 50 mM KCl
  • a cytochrome c552-immobilized electrode in which cytochrome c552 is immobilized on the surface of the gold drop electrode or the gold plate electrode via the self-assembled monomolecular film is produced.
  • Cyclic voltammetry was performed using the cytochrome c552 immobilized electrode thus prepared.
  • I current (A)
  • E potential (V) with respect to the reference electrode (Ag / AgCl) (the same applies hereinafter).
  • FIGS. 9 and 10 it can be seen that a typical adsorptive cyclic voltammogram without peak separation is drawn.
  • the cyclic voltammogram shown in FIG. 9 shows the measurement results obtained by changing the potential sweep rate by 10 mV / s in the range of 10 to 100 mV / s.
  • the cyclic voltammogram shown in FIG. 10 shows the results of measurement by changing the potential sweep rate by 100 mV / s in the range of 100 to 1000 mV / s.
  • FIG. 11 shows changes over time in current values (anodic current Ipa and cathodic current Ica) when the cytochrome c552-immobilized electrode was stored in a protein solution at room temperature.
  • the cytochrome c552-immobilized electrode can obtain the same redox current value even after being stored in a protein solution at room temperature for 1 month.
  • the current value decreases with time, and peak separation occurs in the cyclic voltammogram.
  • the data when cytochrome c552 is immobilized on a gold electrode using self-assembled monolayers with different terminals, that is, when cytochrome c552 is immobilized in an incorrect orientation will be described.
  • cyclic voltammetry is performed using a cytochrome c552-immobilized electrode in which cytochrome c552 is immobilized on a gold electrode using a thiol having a carbon number of 10 (HS (CH 2 ) 10 R) having a different terminal (—R).
  • the obtained cyclic voltammogram is shown in FIG.
  • a 10 mM phosphate-Na solution pH 7.0
  • the potential sweep rate was 50 mV / s.
  • cytochrome c552-immobilized electrode a 10 mM phosphate-Na solution (pH 7.0) was used as a buffer, and the potential sweep rate was 50 mV / s.
  • a cytochrome c552-immobilized electrode a cytochrome c552 is attached to the gold drop electrode through a self-assembled monolayer formed using HS (CH 2 ) 10 CH 3 and HS (CH 3 ) 10 CH 2 OH as described above. What was immobilized was used. However, the diameter of the gold drop electrode is 2.5 mm.
  • the obtained cyclic voltammogram is shown in FIG. However, 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6) was used as the buffer in the cytochrome c552 solution. Since the range of KCl concentration in the cytochrome c552 solution capable of immobilizing cytochrome c552 is 0 to 200 mM, cyclic voltammetry was performed by changing the KCl concentration within this range.
  • FIG. 14 shows a graph in which the cathodic current (downward peak) of the cyclic voltammogram shown in FIG. 13 is integrated to obtain the total charge amount and plotted against the KCl concentration.
  • FIG. 14 shows that the optimum concentration of KCl is 10 to 30 mM.
  • the amount of cytochrome c552 immobilized is about 1.5 times that in the case where KCl is not present in the cytochrome c552 solution, that is, when the KCl concentration is 0 mM, or when the KCl concentration is 50 mM or more. become.
  • the KCl concentration is higher than 100 mM, desorption of cytochrome c552 and self-assembled monolayer is observed.
  • HS (CH 2) 10 CH 3 and HS (CH 2) 10 CH 2 OH and HS ethanol solution was mixed with (CH 2) 10 CH 3
  • a self-assembled monolayer was formed by changing the ratio of OH and HS (CH 2 ) 10 CH 2 OH.
  • cyclic voltammetry was performed on a cytochrome c552-immobilized electrode in which cytochrome c552 was immobilized on a gold electrode via the self-assembled monolayer.
  • a 10 mM phosphate-Na solution pH 7.0
  • the potential sweep rate was 50 mV / s.
  • the obtained cyclic voltammogram is shown in FIG.
  • the numerical value of the footnote in FIG. 15 indicates ([HS (CH 2 ) 10 CH 3 ] / [HS (CH 2 ) 10 CH 2 OH]).
  • (20/80) is HS (CH 2 ) 10 CH 3.
  • FIG. 17 is a graph obtained by plotting the current value at the redox peak of the results shown in FIGS. 15 and 16 against the content of HS (CH 2 ) 10 CH 2 OH. From FIG. 17, it is understood that cytochrome c552 can be favorably immobilized when the content of HS (CH 2 ) 10 CH 2 OH is in the range of 60 to 90%.
  • cytochrome c552 was immobilized on the gold electrode through this self-assembled monolayer. Cyclic voltammetry was performed using the cytochrome c552 immobilized electrode thus prepared. The obtained cyclic voltammogram is shown in FIG.
  • cytochrome c552 13 having high stability is placed on the chemically stable gold electrode 11 so that the hydrophobic portion 13a faces the gold electrode 11 side. It is made to fix through the organized monolayer 12. For this reason, it is possible to realize a protein-immobilized electrode that can be stably used for a long time, in which cytochrome c552 13 is immobilized on the gold electrode 11 while maintaining its electron transfer capability.
  • Second Embodiment> [Photoelectric conversion element] As shown in FIG. 19, in this photoelectric conversion element, as in the first embodiment, protein immobilization in which cytochrome c552 13 is immobilized on the gold electrode 11 through the self-assembled monolayer 12 is performed. It has an electrode. Further, a green fluorescent protein (GFP) 14 is electrostatically bound to the cytochrome c552 13.
  • GFP green fluorescent protein
  • the present invention is not limited to the above-described embodiment, and various modifications based on the technical idea of the present invention are possible.
  • the numerical values, structures, configurations, shapes, materials, and the like given in the above-described embodiments are merely examples, and different numerical values, structures, configurations, shapes, materials, and the like may be used as necessary.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Mathematical Physics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Electromagnetism (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

　化学的に安定な金電極上に高い安定性を有するシトクロムｃ５５２がその電子伝達能を保持したまま固定化された長期安定利用可能なタンパク質固定化電極およびその製造方法を提供する。金電極１１上に疎水性チオールおよび親水性チオールを用いて自己組織化単分子膜１２を形成する。自己組織化単分子膜１２を形成した金電極１１をシトクロムｃ５５２溶液中に浸漬することにより、金電極１１上に自己組織化単分子膜１２を介してシトクロムｃ５５２　１３が固定化されたタンパク質固定化電極を作製する。

Description

タンパク質固定化電極およびその製造方法ならびに機能素子およびその製造方法
　この発明は、タンパク質固定化電極およびその製造方法ならびにこのタンパク質固定化電極を用いた機能素子およびその製造方法に関する。
　近年、タンパク質固定化電極の需要が高まってきている。例えば、生体内では数多くのタンパク質カップル間で電子伝達反応が行われているが、そのタンパク質カップル間の複合体形成における配向や電子伝達のメカニズムを調べる際にタンパク質固定化電極が使われる。この場合、あるタンパク質を電極に固定化し、このタンパク質との間でもう一つのタンパク質が特異的な相互作用をしたときにのみ、タンパク質固定化電極を通して電流を検知するといった使い方をされる。
　また、近年、タンパク質を光電変換素子に利用することも注目されている。例えば、亜鉛シトクロムｃ（馬心筋シトクロムｃの鉄を亜鉛に置換したもの）を金電極に固定化したタンパク質固定化電極から光電流が得られることが示され、このタンパク質固定化電極を用いた光電変換素子が提案されている（特許文献１参照。）。しかし、タンパク質は生体外では不安定であるため、この光電変換素子の長期安定化を図ることができれば非常に有意義ではあるものの、本発明者らの知る限り、これまでそういった報告はない。
　好熱菌Thermusthermophilus由来シトクロムｃ５５２は、馬心筋シトクロムｃと同様に生体内では電子伝達体として働いている。シトクロムｃ５５２は、馬心筋シトクロムｃに比べて非常に高い熱安定性を持っていることが知られている（非特許文献１参照。）。例えば、一般的なタンパク質の変性中点は５０～６０℃、馬心筋シトクロムｃの変性中点は８５℃であるのに対し、シトクロムｃ５５２の変性温度は一般的な水溶液中（温度の上限は１００℃）では計測不能であることから、少なくとも１００℃以上と高い。また、グアニジン塩酸塩（変性剤）４．２Ｍ存在下におけるシトクロムｃ５５２の変性中点は６０～７０℃と報告されている。
　シトクロムｃ５５２はこのように高い熱安定性を有することによりデバイス材料として適している。シトクロムｃ５５２と馬心筋シトクロムｃとは、構成アミノ酸、立体構造は似ているが、電子伝達を行う活性中心ヘムポケットの環境が異なる。具体的には、馬心筋シトクロムｃでは正電荷を持つリジン残基が分子の全体に分散しているが、シトクロムｃ５５２ではリジン残基数こそ馬心筋シトクロムｃと同程度であるものの、リジン残基はヘムポケットの周りには配置されていない。シトクロムｃ５５２の生体内レドックスパートナーとの複合体構造から、この複合体形成は疎水性相互作用がメインであることが報告されている（非特許文献２参照。）。したがって、シトクロムｃ５５２をその電子伝達能を保持したまま電極へ固定化するには、その特異な条件検索が必要である。
　馬心筋シトクロムｃを電極に固定化する方法としては、単分子膜（ＨＳ（ＣＨ2）10ＣＯＯ- 、１－カルボキシ－１０－デカンチオール）を用いる方法が知られている。そこで、シトクロムｃ５５２の固定化にこの固定化法を用いることが考えられる。しかし、馬心筋シトクロムｃの固定化法に用いられている単分子膜を用いてシトクロムｃ５５２を電極に固定化する方法では、これまで、シトクロムｃ５５２の酸化還元電流は得られていない。
　フランスの研究グループは、シトクロムｃ５５２を銀電極に固定化し、このタンパク質固定化電極を用いてタンパク質由来の酸化還元電流を得ることに成功したと報告している（非特許文献３参照。）。しかし、このタンパク質固定化電極を用いて得られたサイクリックボルタモグラムでは酸化波と還元波との間のピーク分離が著しいことから、タンパク質の配向制御に問題がある。また、電極素材としての銀は、通常環境の利用においても容易に腐食、酸化が起こりうる。すなわち、銀電極は、長期安定利用には向かないため、銀電極の代わりに、化学的に安定な電極を利用する必要がある。
特開２００７－２２０４４５号公報
Fee,J.A.and 13 others, Protein Sci. 9, 2074(2000) Muresanu,L.and 13 others, J.Biol.Chem. 281,14503 (2006) Bernad,S.and 3 others, Eur.Biophys.J. 36, 1039　(2007)
　そこで、この発明が解決しようとする課題は、化学的に安定な金電極上に高い安定性を有するシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体がその電子伝達能を保持したまま固定化された長期安定利用可能なタンパク質固定化電極およびその製造方法を提供することである。
　この発明が解決しようとする他の課題は、化学的に安定な金電極上に高い安定性を有するシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体がその電子伝達能を保持したまま固定化された長期安定利用可能なタンパク質固定化電極を用いる機能素子およびその製造方法を提供することである。
　本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を行う中で、全く偶然に、金電極に対してシトクロムｃ５５２をその電子伝達能を損なうことなく固定化することができることを見出し、この発明を案出するに至ったものである。
　すなわち、上記課題を解決するために、この発明は、
　金電極とこの金電極に固定化されたシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体とを有するタンパク質固定化電極である。
　この発明はまた、
　金電極にシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体を固定化するようにしたタンパク質固定化電極の製造方法である。
　この発明はまた、
　金電極とこの金電極に固定化されたシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体とを有するタンパク質固定化電極を有する機能素子である。
　この発明はまた、
　金電極上にシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体を固定化してタンパク質固定化電極を形成する工程を有する機能素子の製造方法である。
　ここで、機能素子は、シトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体を用いるものである限り特に限定されないが、例えば、光電変換素子や、光電変換機能を有する各種の電子素子などが挙げられる。
　この発明において、シトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体は、典型的には、その疎水性部分を金電極側に向けて固定化される。典型的には、シトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体と金電極とは自己組織化単分子膜を介して結合される。シトクロムｃ５５２の誘導体は、シトクロムｃ５５２の骨格のアミノ酸残基、またはヘムが化学修飾されたものである。シトクロムｃ５５２の変異体は、シトクロムｃ５５２の骨格のアミノ酸残基の一部が他のアミノ酸残基に置換されたものである。
　上述のように構成されたこの発明においては、金電極は化学的に安定であるため、タンパク質固定化電極の使用時に電極の腐食や酸化などが起きるのを防止することができる。また、金電極に固定化した際にシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体の電子伝達能が損なわれないようにすることができる。
　この発明によれば、化学的に安定な金電極上に高い安定性を有するシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体がその電子伝達能を保持したまま固定化された長期安定利用可能なタンパク質固定化電極を実現することができる。そして、このタンパク質固定化電極を用いて高性能な種々の機能素子を実現することができる。
この発明の第１の実施の形態によるタンパク質固定化電極を示す略線図である。 この発明の第１の実施の形態によるタンパク質固定化電極において用いられるシトクロムｃ５５２の構造を示す略線図である。 この発明の第１の実施の形態によるタンパク質固定化電極において用いられるシトクロムｃ５５２の構造を示す略線図である。 馬心筋シトクロムｃの構造を示す略線図である。 馬心筋シトクロムｃの構造を示す略線図である。 この発明の第１の実施の形態によるタンパク質固定化電極のシトクロムｃ５５２の構造の詳細を示す略線図である。 この発明の第１の実施の形態によるタンパク質固定化電極のシトクロムｃ５５２の構造の詳細を示す略線図である。 この発明の第１の実施の形態によるタンパク質固定化電極の自己組織化単分子膜の構造を示す略線図である。 実施例によるシトクロムｃ５５２固定化電極を用いて行ったサイクリックボルタンメトリーの結果を示す略線図である。 実施例によるシトクロムｃ５５２固定化電極を用いて行ったサイクリックボルタンメトリーの結果を示す略線図である。 実施例によるシトクロムｃ５５２固定化電極を室温でタンパク質溶液中に保存したときの電流値の経日変化を示す略線図である。 実施例によるシトクロムｃ５５２固定化電極を用いて行ったサイクリックボルタンメトリーの結果を示す略線図である。 実施例によるシトクロムｃ５５２固定化電極を用いて行ったサイクリックボルタンメトリーの結果を示す略線図である。 シトクロムｃ５５２溶液中のＫＣｌ濃度を変えて作製したシトクロムｃ５５２固定化電極を用いて行ったサイクリックボルタンメトリーの結果を示す略線図である。 自己組織化単分子膜の形成に用いるＨＳ（ＣＨ3）10ＣＨ2 ＯＨの含有量を変えて作製したシトクロムｃ５５２固定化電極を用いて行ったサイクリックボルタンメトリーの結果を示す略線図である。 自己組織化単分子膜の形成に用いるＨＳ（ＣＨ3）10ＣＨ2 ＯＨの含有量を変えて作製したシトクロムｃ５５２固定化電極を用いて行ったサイクリックボルタンメトリーの結果を示す略線図である。 自己組織化単分子膜の形成に用いる原料中のＨＳ（ＣＨ3）10ＣＨ2 ＯＨの含有量を変えて作製したシトクロムｃ５５２固定化電極を用いて行ったサイクリックボルタンメトリーにより得られたサイクリックボルタモグラムにおけるピークにおける電流値をＨＳ（ＣＨ3）10ＣＨ2 ＯＨの含有量に対してプロットした略線図である。 自己組織化単分子膜の形成に用いる疎水性チオールおよび親水性チオールの長さを変えて作製したシトクロムｃ５５２固定化電極を用いて行ったサイクリックボルタンメトリーの結果を示す略線図である。 この発明の第２の実施の形態による光電変換素子の構造を示す略線図である。
　以下、発明を実施するための最良の形態（以下実施の形態とする）について説明する。
なお、説明は以下の順序で行う。
１．第１の実施の形態（タンパク質固定化電極およびその製造方法）
２．第２の実施の形態（光電変換素子）
〈１．第１の実施の形態〉
［タンパク質固定化電極］
　図１に第１の実施の形態によるタンパク質固定化電極を示す。
　図１に示すように、このタンパク質固定化電極においては、金電極１１上に自己組織化単分子膜（self-assembledmonolayer，ＳＡＭ）１２を介してシトクロムｃ５５２　１３が固定化されている。この場合、シトクロムｃ５５２　１３は、その疎水性部分１３ａを金電極１１側に向けて固定化されている。シトクロムｃ５５２　１３の内部にあるヘム１３ｂには、中心金属として鉄（Ｆｅ）が配位している。
　図２Ａにシトクロムｃ５５２の構造を模式的に示す。図２Ａはシトクロムｃ５５２のヘムとその軸配位子ヒスチジン（Ｈｉｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）とリジン残基（正電荷アミノ酸）とを棒モデルで示したものである。このシトクロムｃ５５２の軸配位子ヒスチジン（Ｈｉｓ）が右に来る向きを正面としたとき、図２Ａはヘムの正面図である。図２Ｂに図２Ａに示すシトクロムｃ５５２の表面電荷分布図を示す。図３Ａにシトクロムｃ５５２をヘム背面側から見た図を示す。図３Ｂに図３Ａに示すシトクロムｃ５５２の表面電荷分布図を示す。
　比較のために、図４Ａに馬心筋シトクロムｃのヘム正面側から見た図を、図４Ｂに図４Ａに示す馬心筋シトクロムｃの表面電荷分布図を、図５Ａに馬心筋シトクロムｃのヘム背面側から見た図を、図５Ｂに図５Ａに示す馬心筋シトクロムｃの表面電荷分布図を示す。
　図４Ｂおよび図５Ｂに示すように、馬心筋シトクロムｃでは、正電荷が分子全体に散在しているのに対し、図２Ｂおよび図３Ｂに示すように、シトクロムｃ５５２では、正電荷はヘム背面に集中している。また、シトクロムｃ５５２のヘム正面は疎水性残基と中性極性残基とが占める。シトクロムｃ５５２　１３の疎水性部分１３ａはこのヘム正面の部分を指す。
　図６に、金電極１１上に自己組織化単分子膜１２を介して固定化されたシトクロムｃ５５２　１３を模式的に示す。図６においては、シトクロムｃ５５２　１３の軸配位子ヒスチジンは手前側にあり、また、リジン残基を棒モデルで示した。
　図７は、金電極１１上に自己組織化単分子膜１２を介して固定化されたシトクロムｃ５５２　１３を金電極１１側から見た図を示し、軸配位子ヒスチジンは右側にある（ヘム正面）。図７においては、アミノ酸側鎖を棒モデルで示した。
　自己組織化単分子膜１２は三つの部分から構成される。第１の部分は、この自己組織化単分子膜１２を固定化しようとする金電極１１の表面の原子と反応する結合性官能基（例えば、チオール基（－ＳＨ）など）である。第２の部分は通常はアルキル鎖であり、自己組織化単分子膜１２の二次元的な規則構造は主としてこのアルキル鎖間のファン・デル・ワールス力によって決まる。そのため、一般に、アルキル鎖の炭素数がある程度以上多い場合に、安定・高密度・高配向な膜が形成される。第３の部分は末端基であり、この末端基を機能性官能基とすることにより固体表面の機能化が可能となる。
　自己組織化単分子膜１２は、例えば、疎水性チオールおよび親水性チオールを用いて形成されたものであり、これらの疎水性チオールおよび親水性チオールの割合により、シトクロムｃ５５２　１３と金電極１１との間の結合のしやすさが変わる。親水性チオールの親水基は、例えば、－ＯＨ、－ＮＨ2、ＳＯ3 - 、ＯＳＯ3 - 、ＣＯＯ- 、ＮＨ4 + などである。これらの疎水性チオールおよび親水性チオールは必要に応じて選択される。
　これらの疎水性チオールおよび親水性チオールの組み合わせの好適な例を挙げると、疎水性チオールがＨＳ（ＣＨ2）n ＣＨ3 （ｎ＝５，８，１０）、親水性チオールがＨＳ（ＣＨ2 ）nＣＨ2 ＯＨ（ｎ＝５，８，１０）である。具体的には、例えば、疎水性チオールが１－ウンデカンチオール（ＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ3）、親水性チオールが１－ヒドロキシ－１１－ウンデカンチオール（ＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ2 ＯＨ）である。疎水性チオールおよび親水性チオールの他の組み合わせの例としては、疎水性チオールがＨＳ（ＣＨ2）m ＣＨ3 、親水性チオールがＨＳ（ＣＨ2 ）n ＣＨ2ＯＨ（ただし、ｍ＜ｎ、ｍは例えば５以上、ｎは例えば１０以下）の例も挙げられる。具体的には、例えば、疎水性チオールがＨＳ（ＣＨ2 ）9ＣＨ3 、親水性チオールがＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ2 ＯＨの例である。
　図８に疎水性チオールおよび親水性チオールを用いて形成された自己組織化単分子膜１２の構造を模式的に示す。図８に示すように、疎水性チオール１２ａおよび親水性チオール１２ｂのチオール基（－ＳＨ）側が金電極１１の表面に結合する。また、疎水性チオール１２ａの疎水基および親水性チオール１２ｂの親水基（図８において○で示す）側が、シトクロムｃ５５２　１３の疎水性部分１３ａと結合する。
［タンパク質固定化電極の製造方法］
　このタンパク質固定化電極の製造方法の一例について説明する。
　まず、金電極１１を上記の疎水性チオールおよび親水性チオールを所定の割合で混ぜた溶液（溶媒は例えばエタノール）に浸漬することによって、図１に示すように、自己組織化単分子膜１２を金電極１１の表面に形成する。
　次に、こうして自己組織化単分子膜１２を形成した金電極１１をシトクロムｃ５５２１３と緩衝液と必要に応じて塩化カリウム（ＫＣｌ）などの塩とを含む溶液に浸漬することによって、自己組織化単分子膜１２上にシトクロムｃ５５２　１３をその疎水性部分１３ａが金電極１１側を向くように吸着固定する。
　以上のようにして、目的とするタンパク質固定化電極が製造される。
［実施例］
　このタンパク質固定化電極（以下「シトクロムｃ５５２固定化電極」と言う。）の実施例について説明する。
１．試料の作製
　疎水性チオールとしての１－ウンデカンチオール（ＨＳ（ＣＨ2）10ＣＨ3 ）と親水性チオールとしての１－ヒドロキシ－１１－ウンデカンチオール（ＨＳ（ＣＨ2）10ＣＨ2 ＯＨ）とを２５：７５の割合で混ぜた０．１ｍＭエタノール溶液を調製した。この溶液に清浄な金ドロップ電極または金平板電極を浸漬し、室温で一昼夜放置する。こうして、自己組織化単分子膜が金ドロップ電極または金平板電極の表面に形成される。
　これらの電極を超純水でリンスした後、５０μＭシトクロムｃ５５２溶液（１０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）、５０ｍＭ　ＫＣｌ）に浸漬し、室温で３０分以上インキュベートする。こうして、自己組織化単分子膜を介して金ドロップ電極または金平板電極の表面にシトクロムｃ５５２が固定化されたシトクロムｃ５５２固定化電極が作製される。
　こうして作製したシトクロムｃ５５２固定化電極を用いてサイクリックボルタンメトリーを行った。その結果を図９および図１０に示す。図９および図１０において、Ｉは電流（Ａ）、Ｅは参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）に対する電位（Ｖ）である（以下同様）。図９および図１０に示すように、ピーク分離のない典型的な吸着型のサイクリックボルタモグラムを描いていることが分かる。ここで、図９に示すサイクリックボルタモグラムは、電位掃引速度を１０～１００ｍＶ／ｓの範囲で１０ｍＶ／ｓずつ変えて測定した結果を示す。また、図１０に示すサイクリックボルタモグラムは、電位掃引速度を１００～１０００ｍＶ／ｓの範囲で１００ｍＶ／ｓずつ変えて測定した結果を示す。
　図９および図１０から分かるように、このシトクロムｃ５５２固定化電極では、電位掃引速度が１０～１０００ｍＶ／ｓの範囲ではピーク分離が生じていない。これは、このシトクロムｃ５５２固定化電極においては、シトクロムｃ５５２のヘムポケットが金電極に対して最適に配向していることを示している。
　図１１はこのシトクロムｃ５５２固定化電極を室温でタンパク質溶液中に保存したときの電流値（アノーディック電流Ｉpaおよびカソーディック電流Ｉca）の経日変化を示す。図１１に示すように、このシトクロムｃ５５２固定化電極は、タンパク質溶液中において室温で１カ月間保存した後でも、同じ酸化還元電流値が得られる。これに対し、馬心筋シトクロムｃを使った同様の実験では、時間が経つごとに電流値が減少し、サイクリックボルタモグラムにおけるピーク分離も起こる。
　次に、シトクロムｃ５５２固定化電極におけるシトクロムｃ５５２のヘムの向きが、実施例によるシトクロムｃ５５２固定化電極におけるシトクロムｃ５５２のヘムの向きと反対、すなわち金電極と反対側を向いている場合の比較データについて説明する。より具体的には、末端の異なる自己組織化単分子膜を用いてシトクロムｃ５５２を金電極に固定化した場合、すなわち正しくない配向でシトクロムｃ５５２を固定化した場合のデータについて説明する。
　具体的には、末端（－Ｒ）の異なる炭素数１０のチオール（ＨＳ（ＣＨ2）10Ｒ）を用いてシトクロムｃ５５２を金電極に固定化したシトクロムｃ５５２固定化電極を用いてサイクリックボルタンメトリーを行った。得られたサイクリックボルタモグラムを図１２に示す。ただし、緩衝液としては１０ｍＭリン酸－Ｎａ溶液（ｐＨ７．０）を用い、電位掃引速度は５０ｍＶ／ｓとした。
　図１２より、末端（－Ｒ）が－ＣＯＯ-である場合に、タンパク質らしい酸化還元のピークが見られるが、酸化還元サイクルを繰り返すと、いずれ消滅する。このことから、シトクロムｃ５５２を正しくない配向で金電極に固定化した場合には、シトクロムｃ５５２の機能を保持することができないことが分かる。
　次に、上記のシトクロムｃ５５２固定化電極を作製する際に用いるシトクロムｃ５５２溶液中のＫＣｌ濃度を変化させてサイクリックボルタンメトリーを行った結果について説明する。
　測定に際しては、緩衝液として１０ｍＭリン酸－Ｎａ溶液（ｐＨ７．０）を用い、電位掃引速度は５０ｍＶ／ｓとした。シトクロムｃ５５２固定化電極としては、上記と同様にＨＳ（ＣＨ2）10ＣＨ3 およびＨＳ（ＣＨ3 ）10ＣＨ2 ＯＨを用いて形成した自己組織化単分子膜を介して金ドロップ電極にシトクロムｃ５５２を固定化したものを用いた。ただし、金ドロップ電極の直径は２．５ｍｍである。
　得られたサイクリックボルタモグラムを図１３に示す。ただし、シトクロムｃ５５２溶液中の緩衝液は１０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）を用いた。シトクロムｃ５５２を固定化することができるシトクロムｃ５５２溶液中のＫＣｌ濃度の範囲は０～２００ｍＭであるので、この範囲でＫＣｌ濃度を変化させてサイクリックボルタンメトリーを行った。
　図１４は、図１３に示すサイクリックボルタモグラムのカソーディック電流（下向きのピーク）を積分し、総電荷量を求め、ＫＣｌ濃度に対してプロットしたグラフを示す。図１４より、ＫＣｌ濃度は１０～３０ｍＭが最適濃度であることが分かる。この最適濃度の場合、シトクロムｃ５５２溶液中にＫＣｌが存在しない場合、すなわちＫＣｌ濃度が０ｍＭである場合、あるいは、ＫＣｌ濃度が５０ｍＭ以上の場合に比べ、シトクロムｃ５５２の固定化量は約１．５倍になる。ＫＣｌ濃度が１００ｍＭより高い場合には、シトクロムｃ５５２および自己組織化単分子膜の脱離が見られるようになる。
　次に、自己組織化単分子膜を形成する際に用いる、ＨＳ（ＣＨ2）10ＣＨ3 とＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ2 ＯＨとを混ぜたエタノール溶液中のＨＳ（ＣＨ2）10ＣＨ3 とＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ2 ＯＨとの比率を変えて自己組織化単分子膜を形成した。そして、この自己組織化単分子膜を介してシトクロムｃ５５２を金電極に固定化したシトクロムｃ５５２固定化電極のサイクリックボルタンメトリーを行った。ただし、測定に際しては、緩衝液として１０ｍＭリン酸－Ｎａ溶液（ｐＨ７．０）を用い、電位掃引速度は５０ｍＶ／ｓとした。
　得られたサイクリックボルタモグラムを図１５に示す。図１５の脚注の数値は（［ＨＳ（ＣＨ2）10ＣＨ3 ］／［ＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ2 ＯＨ］）を示し、例えば、（２０／８０）はＨＳ（ＣＨ2）10ＣＨ3 が２０％、ＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ2ＯＨが８０％であることを意味する。
　図１５に示す結果を踏まえて、ＨＳ（ＣＨ2）10ＣＨ3 とＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ2 ＯＨとの全体におけるＨＳ（ＣＨ2）10ＣＨ2 ＯＨの含有量を６０～９５％の範囲で５％刻みで細かく変化させて調べた。その結果を図１６に示す。
　図１５および図１６に示す結果の、酸化還元ピークにおける電流値をＨＳ（ＣＨ2）10ＣＨ2 ＯＨの含有量に対してプロットしたグラフを図１７に示す。図１７より、ＨＳ（ＣＨ2）10ＣＨ2 ＯＨの含有量が６０～９０％の範囲でシトクロムｃ５５２の固定化を良好に行うことが可能であることが分かる。詳細は省略するが、別途行った実験により、疎水性チオールがＨＳ（ＣＨ2）n ＣＨ3 （ｎ＝５，８，１０）、親水性チオールがＨＳ（ＣＨ2 ）nＣＨ2 ＯＨ（ｎ＝５，８，１０）である場合全般について、ＨＳ（ＣＨ2 ）n ＣＨ2ＯＨの含有量が６０～９０％の範囲でシトクロムｃ５５２の固定化を良好に行うことが可能であることが確認されている。
　次に、自己組織化単分子膜を形成する際に用いる疎水性チオールおよび親水性チオールの長さを変化させてサイクリックボルタンメトリーを行った結果について説明する。具体的には、疎水性チオールとして末端がメチル基で炭素数が５または１０のＨＳ（ＣＨ2）5 ＣＨ3 、ＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ3、親水性チオールとして末端がヒドロキシメチル基で炭素数が５または１０のＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ2ＯＨ、ＨＳ（ＣＨ2 ）5 ＣＨ2 ＯＨを用い、これらを組み合わせて自己組織化単分子膜を作製した。そして、この自己組織化単分子膜を介して金電極にシトクロムｃ５５２を固定化した。こうして作製されたシトクロムｃ５５２固定化電極を用いてサイクリックボルタンメトリーを行った。得られたサイクリックボルタモグラムを図１８に示す。
　図１８に示す曲線（１）、（２）、（３）、（７）において、タンパク質由来のピークが０Ｖ付近に見られる。これは、自己組織化単分子膜を形成する際に用いる疎水性チオールおよび親水性チオールにおける疎水性チオールのメチル基と親水性チオールのヒドロキシル基とのバランス、すなわち、自己組織化単分子膜の表面における疎水基と親水基との分布のバランスが保たれれば、疎水性チオールおよび親水性チオールの炭素数を変えてもシトクロムｃ５５２を同様な配向で固定化することができることを示している。親水性チオールについては、親水基の炭素数は５の場合より１０の場合の方がより良好な結果が得られている。
　以上のように、この第１の実施の形態によれば、化学的に安定な金電極１１上に高い安定性を有するシトクロムｃ５５２　１３をその疎水性部分１３ａが金電極１１側を向くように自己組織化単分子膜１２を介して固定化するようにしている。このため、シトクロムｃ５５２　１３がその電子伝達能を保持したまま金電極１１に固定化された長期安定利用可能なタンパク質固定化電極を実現することができる。
〈２．第２の実施の形態〉
［光電変換素子］
　図１９に示すように、この光電変換素子においては、第１の実施の形態と同様に、金電極１１上に自己組織化単分子膜１２を介してシトクロムｃ５５２　１３が固定化されたタンパク質固定化電極を有する。さらに、このシトクロムｃ５５２　１３には、緑色蛍光タンパク質（GreenFluorescent Protein,ＧＦＰ）１４が静電的に結合している。
　この光電変換素子においては、外部から入射した光（ｈν）が緑色蛍光タンパク質１４に入射すると、この光の入射により緑色蛍光タンパク質１４の電子が励起される。励起された電子はシトクロムｃ５５２　１３に移動し、金基板１１から光電流として外部に取り出される。こうして光電変換が行われる。
　上記以外のことは第１の実施の形態と同様である。
　この第２の実施の形態によれば、長期安定利用可能なタンパク質固定化電極を用いた新規な光電変換素子を実現することができる。
　以上、この発明の実施の形態について具体的に説明したが、この発明は、上述の実施の形態に限定されるものではなく、この発明の技術的思想に基づく各種の変形が可能である。
　例えば、上述の実施の形態において挙げた数値、構造、構成、形状、材料などはあくまでも例に過ぎず、必要に応じてこれらと異なる数値、構造、構成、形状、材料などを用いてもよい。

Claims (14)

  1. 　金電極とこの金電極に固定化されたシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体とを有するタンパク質固定化電極。
  2. 　上記シトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体はその疎水性部分を上記金電極側に向けて固定化されている請求項１記載のタンパク質固定化電極。
  3. 　上記シトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体と上記金電極とは自己組織化単分子膜を介して結合している請求項２記載のタンパク質固定化電極。
  4. 　上記自己組織化単分子膜は疎水性チオールおよび親水性チオールを用いて形成されたものである請求項３記載のタンパク質固定化電極。
  5. 　上記疎水性チオールはＨＳ（ＣＨ2）n ＣＨ3 （ｎ＝５，８，１０）、上記親水性チオールはＨＳ（ＣＨ2 ）nＣＨ2 ＯＨ（ｎ＝５，８，１０）である請求項４記載のタンパク質固定化電極。
  6. 　上記自己組織化単分子膜中のＨＳ（ＣＨ2）n ＣＨ2 ＯＨの含有量が６０％以上９０％以下である請求項５記載のタンパク質固定化電極。
  7. 　上記疎水性チオールはＨＳ（ＣＨ2）10ＣＨ3 、上記親水性チオールはＨＳ（ＣＨ2 ）10ＣＨ2ＯＨである請求項４記載のタンパク質固定化電極。
  8. 　上記疎水性チオールはＨＳ（ＣＨ2）m ＣＨ3 、上記親水性チオールはＨＳ（ＣＨ2 ）n ＣＨ2ＯＨ（ｍ＜ｎ）である請求項４記載のタンパク質固定化電極。
  9. 　金電極にシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体を固定化するようにしたタンパク質固定化電極の製造方法。
  10. 　上記シトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体をその疎水性部分が上記金電極側に向くように固定化する請求項９記載のタンパク質固定化電極の製造方法。
  11. 　上記シトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体を自己組織化単分子膜を介して上記金電極と結合する請求項１０記載のタンパク質固定化電極の製造方法。
  12. 　上記金電極上に上記自己組織化単分子膜を形成した後、シトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体と緩衝液と１０ｍＭ以上３０ｍＭ以下の塩化カリウムとを含む溶液に上記自己組織化単分子膜が形成された上記金電極を浸漬することにより上記シトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体を上記自己組織化単分子膜を介して上記金電極と結合するようにした請求項１１記載のタンパク質固定化電極の製造方法。
  13. 　金電極とこの金電極に固定化されたシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体とを有するタンパク質固定化電極を有する機能素子。
  14. 　金電極上にシトクロムｃ５５２、その誘導体またはその変異体を固定化してタンパク質固定化電極を形成する工程を有する機能素子の製造方法。
PCT/JP2009/070674 2008-12-18 2009-12-10 タンパク質固定化電極およびその製造方法ならびに機能素子およびその製造方法 WO2010071071A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/139,461 US8609438B2 (en) 2008-12-18 2009-12-10 Protein-immobilized electrode and method of manufacturing the same, and functional element and method of manufacturing the same
EP09833374.3A EP2360466A4 (en) 2008-12-18 2009-12-10 IMMOBILIZED PROTEIN ELECTRODE, FUNCTIONAL ELEMENT, AND METHODS OF MANUFACTURING THE SAME
CN200980154795.9A CN102282461B (zh) 2008-12-18 2009-12-10 蛋白质固定化电极及其制造方法,以及功能元件及制造方法
BRPI0923356-3A BRPI0923356A2 (pt) 2008-12-18 2009-12-10 Eletrodo de proteína imobilizada, método para fabricar um eletrodo de proteína imobilizada, elemento funcional, e , método para fabricar um elemento funcional.
RU2011124246/10A RU2532841C2 (ru) 2008-12-18 2009-12-10 Электрод с иммобилизованным белком и способ его изготовления и функциональный элемент и способ его изготовления

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008-322199 2008-12-18
JP2008322199A JP5233650B2 (ja) 2008-12-18 2008-12-18 タンパク質固定化電極およびその製造方法ならびに機能素子およびその製造方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010071071A1 true WO2010071071A1 (ja) 2010-06-24

Family

ID=42268741

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2009/070674 WO2010071071A1 (ja) 2008-12-18 2009-12-10 タンパク質固定化電極およびその製造方法ならびに機能素子およびその製造方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US8609438B2 (ja)
EP (1) EP2360466A4 (ja)
JP (1) JP5233650B2 (ja)
KR (1) KR20110094304A (ja)
CN (1) CN102282461B (ja)
BR (1) BRPI0923356A2 (ja)
RU (1) RU2532841C2 (ja)
WO (1) WO2010071071A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5444747B2 (ja) * 2009-02-17 2014-03-19 ソニー株式会社 カラー撮像素子およびその製造方法ならびに光センサーおよびその製造方法ならびに光電変換素子およびその製造方法ならびに電子機器
JP2011100759A (ja) * 2009-11-04 2011-05-19 Sony Corp 多層透明受光素子および電子機器

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10280182A (ja) * 1997-04-11 1998-10-20 Mitsubishi Heavy Ind Ltd タンパク質固定修飾電極
JP2007220445A (ja) 2006-02-16 2007-08-30 Sony Corp 光電変換素子、半導体装置および電子機器
JP2008122347A (ja) * 2006-11-15 2008-05-29 Sony Corp タンパク質の固定化方法及びこれを用いたバイオセンサー

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SK154298A3 (en) * 1996-05-10 2000-03-13 British Gas Plc Method for the transfer of electrons between an electrode and an enzyme in an electrochemical process
JP4524395B2 (ja) * 2004-05-31 2010-08-18 独立行政法人産業技術総合研究所 チオール基又はスルフィド基含有化合物の検出、濃度測定方法
NO321280B1 (no) 2004-07-22 2006-04-18 Thin Film Electronics Asa Organisk, elektronisk krets og fremgangsmate til dens fremstilling
JP4561451B2 (ja) * 2005-04-15 2010-10-13 セイコーエプソン株式会社 多型検出方法および多型検出用キット
JP5444747B2 (ja) * 2009-02-17 2014-03-19 ソニー株式会社 カラー撮像素子およびその製造方法ならびに光センサーおよびその製造方法ならびに光電変換素子およびその製造方法ならびに電子機器
JP5446414B2 (ja) * 2009-04-16 2014-03-19 ソニー株式会社 光電変換素子

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10280182A (ja) * 1997-04-11 1998-10-20 Mitsubishi Heavy Ind Ltd タンパク質固定修飾電極
JP2007220445A (ja) 2006-02-16 2007-08-30 Sony Corp 光電変換素子、半導体装置および電子機器
JP2008122347A (ja) * 2006-11-15 2008-05-29 Sony Corp タンパク質の固定化方法及びこれを用いたバイオセンサー

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BERNAD, S., EUR. BIOPHYS. J., vol. 36, 2007, pages 1039
FEE, J. A., PROTEIN SCI., vol. 9, 2000, pages 2074
KYOKO FUJITA ET AL.: "Kongo SAM Shushoku Kin Denkyoku o Mochiita Cytochrome c Oyobi Azurin no Sanka Kangen Oto Kaiseki", THE ELECTROCHEMICAL SOCIETY OF JAPAN DAI 71 KAI TAIKAI KOEN YOSHISHU, 24 March 2004 (2004-03-24), pages 77, XP008148734 *
MURESANU, L., J. BIOL. CHEM., vol. 281, 2006, pages 14503
SATORU ISOTA ET AL.: "Diode Tokusei o Motsu Jinko Tanpakushitsu", CHEMISTRY & CHEMICAL INDUSTRY, vol. 48, no. 6, 1 June 1995 (1995-06-01), pages 718 - 720, XP008163010 *
See also references of EP2360466A4
SOPHIE BERNAD ET AL.: "Characterization and Redox Properties of Cytochrome C552 from Thermus thermophilus Adsorbed on Different Self- Assembled Thiol Monolayers, Used to Model the Chemical Environment of the Redox Partner", BIOPOLYMERS, vol. 81, no. 5, 5 April 2006 (2006-04-05), pages 407 - 418, XP008148731 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN102282461A (zh) 2011-12-14
JP5233650B2 (ja) 2013-07-10
EP2360466A1 (en) 2011-08-24
BRPI0923356A2 (pt) 2015-07-21
CN102282461B (zh) 2014-12-24
US20120103798A1 (en) 2012-05-03
RU2532841C2 (ru) 2014-11-10
JP2010145216A (ja) 2010-07-01
RU2011124246A (ru) 2013-01-27
KR20110094304A (ko) 2011-08-23
EP2360466A4 (en) 2014-05-14
US8609438B2 (en) 2013-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rad et al. A review on glucose and hydrogen peroxide biosensor based on modified electrode included silver nanoparticles
Ren et al. Hydrogen peroxide sensor based on horseradish peroxidase immobilized on a silver nanoparticles/cysteamine/gold electrode
Valentini et al. Nanomaterials and analytical chemistry
KR101360407B1 (ko) 재조합 단백질 및 무기입자 이중층을 포함하는 바이오-메모리 디바이스
Yadav et al. Revisiting some recently developed conducting polymer@ metal oxide nanostructures for electrochemical sensing of vital biomolecules: a review
Feng et al. Synergistic effect of zirconium phosphate and Au nanoparticles on direct electron transfer of hemoglobin on glassy carbon electrode
Zhu et al. Non-enzymatic xanthine sensor of heteropolyacids doped ferrocene and reduced graphene oxide via one-step electrodeposition combined with layer-by-layer self-assembly technology
Zheng et al. DNA as a linker for biocatalytic deposition of Au nanoparticles on graphene and its application in glucose detection
Chen et al. A Molecule with Dual Functionality 4‐Aminophenylmethylphosphonic Acid: A Comparison Between Layers Formed on Indium Tin Oxide by In Situ Generation of an Aryl Diazonium Salt or by Self‐Assembly of the Phosphonic Acid
Shie et al. Electroanalytical properties of cytochrome c by direct electrochemistry on multi-walled carbon nanotubes incorporated with DNA biocomposite film
Suhanto et al. Sonochemical synthesis of magnetic Fe 3 O 4/graphene nanocomposites for label-free electrochemical biosensors
Xu et al. A hydrogen peroxide biosensor based on direct electrochemistry of hemoglobin in Hb–Ag sol films
Zhang et al. Gold Nanoparticle‐Based Mediatorless Biosensor Prepared on Microporous Electrode
Al-Akraa et al. Self-assembling of gold nanoparticles array for electrosensing applications
Jakubec et al. Novel Fe@ Fe-O@ Ag nanocomposite for efficient non-enzymatic sensing of hydrogen peroxide
JP5233650B2 (ja) タンパク質固定化電極およびその製造方法ならびに機能素子およびその製造方法
Kaya et al. Carbon nanomaterial-based drug sensing platforms using state-of-the-art electroanalytical techniques
Stine et al. Nanoporous gold for enzyme immobilization
Yang et al. Stepwise synthesis of Gly− Gly− His on gold surfaces modified with mixed self-assembled monolayers
KR20130013776A (ko) 다기능성 바이오-메모리 디바이스
Ribeiro et al. Electrocatalytic oxidation of ethinyl estradiol by an iron oxide nanoparticle/nickel phthalocyanine supramolecular electrode
Berchmans et al. Electrochemical preparation of copper–dendrimer nanocomposites: picomolar detection of Cu 2+ ions
Jin et al. Stripping chronopotentiometric analysis of cysteine on nano-silver coat polyquercetin–MWCNT modified platinum electrode
Chen et al. Multilayer assembly of hemoglobin and colloidal gold nanoparticles on multiwall carbon nanotubes/chitosan composite for detecting hydrogen peroxide
Jia Hydrogen peroxide biosensor based on horseradish peroxidase–Au nanoparticles at a viologen grafted glassy carbon electrode

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200980154795.9

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09833374

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20117013249

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 4407/DELNP/2011

Country of ref document: IN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009833374

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011124246

Country of ref document: RU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13139461

Country of ref document: US

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: PI0923356

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: PI0923356

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20110610