KR20110055639A - 생물학적 물질의 식별 방법 및 장치 - Google Patents

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아르얀 라우렌스 웨이케하위스
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네덜란제 오르가니자티에 포오르 토에게파스트-나투우르베텐샤펠리즈크 온데르조에크 테엔오
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Abstract

생물학적 물질은 MALDI-MS 기술(Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization-Mass Spectroscopy)을 사용하여 시료에서 검출된다. 시료 및 MALDI 물질을 포함하는 액체는 액체의 연속적인 스트림을 형성하기 위해 제조되고 사용된다. 스트림은 드롭을 형성하기 위해 연속적인 부분으로 분리되어 플라이트가 시작되거나, 플라이트가 시작된 후 드롭으로 분리된다. 드롭 형성 기술은 잉크젯 프린터로부터 알려진 것이 사용되어도 좋다. 드롭의 물질은 플라이트 시 이온화된다. 각각의 드롭의 이온화된 물질의 질량 스펙트럼이 측정된다. 바람직하게는, 드롭이 형성되기 전에 액체는 많아야 하나의 미생물의 대다수의 드롭이 드롭 당 존재하는 비율로 희석된다.

Description

생물학적 물질의 식별 방법 및 장치{Method and apparatus for identification of biological material}
본 발명은 액체 중 생물학적 물질의 식별에 관한 것이다.
생물학적 물질, 예컨대 미생물(예컨대, 박테리아, 바이러스), 셀, 펩티드 등을 식별하기 위한 질량 분광 분석의 사용이 알려졌다.
예컨대, MALDI-MS (Matrix Assisted Laser Desorption-Ionization-Mass Spectroscopy)는 미생물을 포함하는 시료 재료의 레이저 이온화 및 이온화된 입자의 질량 분광 분석을 포함한다. MALDI-MS에서 타겟판 상에 미생물과 매트릭스 물질의 혼합물을 제공함으로써 이온화하기 위해 미생물을 제조한다. 혼합물을 건조될 때, 매트릭스 물질은 미생물의 분석 성분의 큰 분자 단편을 보존하는 상대적으로 낮은 에너지로 소프트 이온화를 가능하게 하는 미생물에 부착된다. 레이저 샷은 이들 타겟 위치로부터 물질을 이온화하기 위해 타겟판 상에 선택된 타켓 위치에 발사된다. 각각의 타겟 위치에 대해, 산출물의 질량 분광 분석이 행해진다.
MALDI-MS는 실험실 분석에 매우 적합하지만, 일부 문제가 현존하는 것이 확인되었다. 미생물의 불균일한 혼합인 시료에 대해, 단일 레이저 샷은 개별 종의 식별을 어렵게 하게 하는 다른 종의 미생물의 혼합으로부터 물질을 이온화한다는 심각한 위험이 있다. 분리된 단일 미생물이 타켓판 상에서 발견될지라도, 레이저 샷에 의해 이온화되는 모든 물질의 노이즈에서 그것을 검출하는 것은 불가능하다. MALDI-MS에 있어서, 이들 문제는 예컨대 생체 내 환자로부터 채취된 본래 시료가 미생물의 불균일 혼합을 포함하는 경우에 최초의 브리딩 단계(breeding step)를 사용함으로써 해결된다. 브리딩은 하나의 주요 가닥의 미생물의 실질적인 숫자가 단일 레이저 샷 내에 생성되는 것을 확인하는데 사용될 수 있다. 그러나, 브리딩은 하루가 걸릴 수도 있다. 따라서, 현실적인 MALDI-MS는 생체 내 시료를 채취하는 것과 분석 결과 사이에 단기간이 소요되는 경우에 적합하지 않다. 이것은 그 이용가능성을 한정한다.
예컨대, 실시예에 있어서, MRSA 박테리아가 해를 줄 수 있는 환경에 인커밍 환자를 이송하기 전에, 환자로부터 시료를 얻어 시료 중 존재하는 많은 미생물 중에서 MRSA 박테리아를 확인하는 것이 바람직하다. 실제 사용을 위해, 이러한 측정 결과는 바람직하게는 많아야 몇 시간 내에 이용가능하다. 미생물의 브리드 필요성은 이것을 위해 종래의 MALDI-MS의 실제 사용을 억제한다.
미생물을 식별하기 위한 MALDI-MS의 사용은 A.L. van Wuijckhuijse 등, Journal of Aerosol Science Vol 36 pages 677-697 (EPO 참조 XP004936536)에 간행된 "Matrix-assisted laser deporption/ionization aerosol time of flicght mass spectroscopy for the analysis of bioaerosols: development of a fast detector for airborne biological pathogens"의 기사로부터 알려졌다. 이 문헌은 소정의 값으로 단종 배양(mono-culture) 박테리아 시료를 희석함으로써 생성되는 용액을 분무하기 위한 분무기의 사용을 설명한다. 이 문헌에 설명되는 분무는 균일한 사이즈의 드롭을 보장하지 않는다. 결과적으로 드롭 당 박테리아의 수는 달라질 수 있지만, 오직 하나의 종이 사용되어도 상관없다. 또한, 이 문헌의 분무 방법은 작은 드롭으로 분산될지라도 큰 시료 체적이 이용가능한 것이 요구된다.
WO02052246으로부터 공기중의 미생물 입자를 검출 및 식별하는 장치가 알려져 있다. 이 장치는 미생물 입자를 포함하는 공기를 수집하고, 분석 챔버에 노즐을 통해 입자를 갖는 공기를 공급한다. 분석 챔버에 있어서, 미생물을 갖는 입자는 검출되고, 검출된 입자는 이온화된다. 이 장치는 많은 입자가 질량 분광 분석에 사용되는 기압으로부터 고진공으로 전이시 소실되기 때문에 상대적으로 많은 수의 입자가 필요하다. 포획된 입자에 대해 측정된 입자의 효율은 1퍼센트만큼 낮을 수 있다.
미국 특허 출원 2005/0230615로부터, MALDI-IM (이온 이동도(Ion Mobility)) 측정 기술은 드롭이 Vibrating Orifice Aerosol Generator로 형성된다는 것이 알려진다. 드롭 중 미생물에 대해 설명된 것은 없다. 드롭이 미생물을 함유하는 경우에는 이들 미생물을 식별할 수 없다면 MALDI-IM의 사용이 어려워진다.
MALDI-MS용 타겟판의 제조시 FFFF(Flow Field-Flow Fractionation)의 사용은 Hookeun Lee 등의 Anal. Chem. 2003, 75, 2746-2752에 간행된 "Analysis of Whole Bacterial Cells by Flow-Field Flow Fractionation and Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectroscopy"의 기사로부터 알려진다. 이 문헌은 타켓판이 사용되는 경우에 MALDI-MS의 셀 밀도를 증가시키기 위해 인접한 박테리아 셀을 분리하는데 FFFF가 상용될 수 있다는 것을 나타낸다.
특히, 다른 형태의 미생물, 예컨대 박테리아, 균류 및 바이러스의 혼합을 갖는 액체 시료에 따라 빠른 결과를 제공할 수 있는 생물학적 물질을 식별하는 방법 및 장치를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
시료 중 미생물을 포함하는 생물학적 물질의 식별 방법으로, 상기 방법은
-시료 및 MALDI 매트릭스 물질을 포함하는 액체를 준비하는 단계;
-상기 액체의 연속적인 스트림을 생성하는 단계;
-플라잉 드롭을 형성하기 위해 상기 스트림을 스트림의 연속적인 부분으로 분리하는 단계;
-상기 미생물의 측정된 밀도에 따른 희석 비율, C*V<1(V는 분리된 부분당 체적임)을 만족하는 미생물의 밀도 C에 대응하는 희석 비율로 액체를 희석하는 단계;
-플라이트 시 드롭으로부터 물질을 이온화하는 단계;
-상기 이온화된 물질로부터 질량 스펙트럼을 측정하는 단계를 포함한다.
시료로부터의 생물학적 물질 및 MALDI 매트릭스 물질, 예컨대 매트릭스 물질을 형성한 결정을 포함하는 액체의 스트림을 분리함으로써 액체의 플라잉 드롭이 스트림의 연속적인 부분으로 형성된다. 활성 드롭 발생기(drop former)는 예컨대 압전 소자(piezo-electric element)로 사용될 수 있다. 이온화 및 질량 분광 분석은 플라이트 시 드롭 상에 행해진다. 이 방법에 있어서, 타겟판의 필요 및 그 단점은 제거되는 반면에 고효율이 현실화된다. 건조된 드롭은 그것이 이온화되는 경우에 건조된 입자이기 때문에 드롭은 플라이트 시 건조될 수 있다. 여기에 사용된 "드롭(drop)은 드롭을 건조함으로써 형성된 건조된 입자를 포함한다. 바람직하게는, 질량 스펙트럼은 각각의 드롭 중 하나로부터 각 물질이 측정된다.
시료 또는 액체는 미생물의 밀도 C가 C*V<1을 만족하는 농도에 대응하는 희석 비율로 희석되고, 단 V는 상기 액체의 부분 체적이다. 따라서, 하나 미만의 미생물 또는 셀은 개별 드롭 중 드롭 체적을 평균하여 발생한다. 따라서, 드롭 당 단일 미생물 또는 셀을 갖는 드롭의 상당수의 측정이 얻어질 수 있는 것이 확인될 수 있다. 따라서, 개별 미생물 및/또는 셀의 질량 스펙트럼이 얻어질 수 있다.
실시형태에 있어서, 희석 비율은 시료 중 셀 및/또는 미생물의 농도에 조정될 수 있다. 밀도 검출기는 예컨대 검출된 미생물을 카운팅함으로써 농도를 측정할 수 있고, 측정된 농도는 제어 희석물에 사용될 수 있다. 밀도 검출기는 스트림 또는 MALDI 매트릭스가 전구체 스트림에 첨가되는 경우에 스트림에 흐르는 전구체 스트림 중 미생물을 카운팅함으로써 스트림 중 밀도를 검출하기 위해 설치된 (플로우) 사이토미터를 포함할 수 있다.
실시형태에 있어서, 스트림은 시료 및 매트릭스 물질을 갖는 스트림이 발생하는 점 후에 어떤 실질적인 축 재배열 없이 드롭 발생기에 흐른다. 즉, 액체가 분리된 부분이 스트림의 연속 부분에 대응하면 매트릭스 물질은 첨가되거나 또는 적어도 희석 후이다. 이 방법에 있어서, 다수의 미생물을 갖는 드롭의 가능성이 저감된다. 이것은 사이토미터로 이 스트림의 밀도를 측정하고, 이 측정에 따른 희석을 제어함으로써 개선된다. 실시형태에 있어서, 희석은 스트림 발생으로부터 캐리어 액체와 스트림 하류를 혼합함으로써 행해질 수 있다. 또한, 이것은 다수의 미생물을 갖는 드롭의 가능성을 저감한다.
시료 중 생물학적 물질을 식별하는 장치로서, 이 장치는
-시료 및 MALDI 매트릭스 물질이 혼합된 액체의 연속적인 스트림을 공급하기 위해 형성된 스트림 발생기;
-C*V<1(V는 분리된 부분당 체적임)을 만족하는 미생물의 농도 C에 대응하는 희석 비율로 미생물의 밀도, 측정된 미생물의 밀도에 따라 제어된 믹서의 희석 비율을 측정하는 믹서 및 검출기를 포함하는 믹싱 유닛;
-상기 스트림을 스트림의 연속적인 부분으로 분리하고, 플라이트 경로를 따라 플라이트 중인 상기 부분으로부터 형성된 드롭을 공급하기 위해 형성된 액체 부분 세퍼레이터;
-상기 드롭으로부터 물질을 이온화하는 방사선을 공급하기 위해 형성되고 플라이트 경로에 향하는 방사선원;
-각각의 드롭 중 하나로부터 이온화된 물질의 질량 스펙트럼을 얻기 위해 형성된 질량 분석기를 포함한다. 이 액체 부분 세퍼레이터는 예컨대 압전 공진자(piezo-electric resonator)를 포함하는 드롭 발생기이어도 좋다.
다른 실시형태에 있어서, 이 장치의 액체 부분 세퍼레이터는 가스 스트림 배출구 및 가스 동적 노즐을 형성하기 위해 형성된 배출구로 액체의 스트림을 공급하는 도관(conduit)을 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 이 장치는 각각의 드롭 중 하나의 드롭 체적을 평균하여 하나 미만의 미생물의 농도에 대응하는 희석 비율로 시료 또는 액체에 희석물을 첨가하기 위해 형성된 희석 유닛을 포함한다. 또한, 농도는 대부분의 드롭이 시료로부터 많아야 하나의 미생물을 포함할 때 사용되어도 좋다. 또 다른 실시형태에 있어서, 희석 유닛은 시료 또는 시료를 갖는 액체의 밀도를 검출하고, 검출된 밀도에 따른 상기 비율로 희석을 제어하기 위해 형성된 밀도 검출기를 포함한다.
실시형태에 있어서, 액체 부분 세퍼레이터는 이온화가 행해지는 진공 공간에 드롭을 직접적으로 발생하기 위해 형성할 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 이 장치는 방사선원으로부터 드롭 형성 및 펄스 발생을 동시에 발생하기 위해 형성된 제어 유닛을 포함한다.
이들 및 다른 목적 및 유용한 양태는 실시형태의 설명으로부터 명확해질 것이다.
도 1은 미생물을 식별하는 장치를 나타낸다.
도 2는 형광판을 갖는 식별 장치를 나타낸다.
도 3은 자외선 세퍼레이터를 갖는 식별 장치를 나타낸다.
도 4는 다른 식별 장치를 나타낸다.
도 4a-c는 액체 스트림 세퍼레이터의 예를 나타낸다.
도 5-7은 식별 장치의 실시형태를 나타낸다.
도 1은 생물학적 물질을 식별하는 장치를 도식적으로 나타낸다. 미생물의 식별 어플리케이션(application to identification of micro-organisms)은 이 장치의 내용에 기재되어 있지만, 이 장치는 플라잉 드롭에 MALDI 질량 분광 분석을 행하는 장치 중 단 하나의 실시형태라는 것으로 이해해야 한다. 다른 생물학적 물질이 미생물, 예컨대 셀(예컨대, 혈구, 펩티드 등) 대신에 사용되어도 좋은 것으로 이해되어야 한다.
이 장치는 리시버(10), 도관(11), 제1 믹싱 유닛(12), 제2 믹싱 유닛(14), 챔버(15), 압전 공진자(16), 제어 회로(17), 펄스 레이저(18) 및 질량 분석기(19)를 포함한다. 압전 공진자(16)는 잉크의 드롭을 형성하기 위해 잉크젯 프린터에 사용되는 형태이어도 좋다. 도관(11)은 일련의 시료 리시버(10), 제1 믹싱 유닛(12), 제2 믹싱 유닛(14) 및 압전 공진자(16)와 연결되어 있다. 제어 회로(17)는 압전 공진자(16) 및 펄스 레이저(18)와 연결되어 있다.
압전 공진자(16)는 챔버(15)에 위치한다. 제2 믹싱 유닛(14)의 도관(11)은 압전 공진자(16)를 통해 개구부로 흐른다. 펄스 레이저(18)는 챔버(15)를 통해 개구부로부터 발사되는 드롭의 플라이트 경로를 향하고 있다. 질량 분석기(19)는 챔버(15)에 부착되어 있고, 플라이트 경로에서 드롭에 의해 펄스 레이저(18)로부터 방사선을 흡수하는 이온화된 단편을 수용하기 위해 위치한다.
운용에 있어서, 시료 리시버(10)로부터의 시료 물질, 제1 믹싱 유닛(12)으로부터의 희석물 및 제2 믹싱 유닛(14)으로부터의 매트릭스 물질을 포함하는 액체의 스트림은 챔버(15)를 통해 플라이트 시 발사된 작은 액체 드롭이 되는 부분으로 분리된다. 챔버(15)를 통해 플라이트 시, 액체 드롭 중 매트릭스 물질은 드롭이 플라이트시 건조될 때 미생물이 결정화되어 건조된 입자가 된다. 이어서, 레이저 펄스는 펄스 레이저(18)로부터 건조된 입자에 발사된다. 이것은 건조된 입자로부터 물질을 이온화시킨다. 이온화된 물질은 질량 분석기(19)에서 분석된다.
예컨대, 직경이 1-100마이크로미터의 범위의 드롭이 사용되어도 좋다. 바람직하게는, 이 범위와 실질적으로 동일한 균일한 사이즈의 드롭이 사용되는데, 이는 일정 거리에서 액체의 스트림을 브레이킹함으로써, 예컨대 일정 평균 유량의 스트림 상에 적절한 진동수의 주기적 외란을 사용함으로써 실현된다.
드롭의 사이즈가 작기 때문에 드롭이 이온화를 위해 준비되는데 플라이트 동안 짧은 시간만이 필요하다. 준비는 플라이트 시 발생하기 때문에 모든 면 상에 미생물이 둘러싸인 매트릭스 물질을 갖는 미생물이 형성되어도 좋다. 종래의 MALDI-MS의 경우에서와 같이 드롭과 타겟판 사이의 계면에서 결정핵은 발생하지 않는다. 바람직하게는, 희석률과 드롭 사이즈의 조합이 선택되므로 미생물을 갖는 대부분의 드롭은 미생물 하나만을 포함한다. 예컨대, 드롭 체적을 평균하여 많아야 하나의 미생물의 농도에 대응하는 희석 비율이 사용되어도 좋다.
펄스 레이저(18)가 한번에 하나의 건조된 입자에 발사되기 때문에, 하나의 미생물을 갖는 드롭으로부터 입자 각각의 측정된 질량 스펙트럼은 하나의 미생물만을 나타낸다. 또한, 드롭의 사용은 이온화되는 시료의 사이즈가 드롭 사이즈 및 드롭 내에 용해된 및 분산된 물질의 양에 의해 결정된다는 것을 의미한다. 이것은 종래의 MALDI-MS와 대조되고, 시료의 사이즈는 드롭의 사이즈보다 매우 클 수 있는 타겟판 상의 레이저 스팟의 사이즈에 의해 결정되므로 더 많은 물질이 이온화되어 질량 스펙트럼에 증가된 "노이즈" 비율을 야기할 수 있다. 또한, 다양한 미생물의 혼합이 이온화되어도 좋다.
실험은 페니실린 저항력을 갖거나 갖지 않는 각각의 포도상 구균(Staphylococcus Aureus)이 구별될 수 있는 것을 설명하기 위해 행해진다. 이 실험에 있어서, 시료 물질, 희석물 및 매트릭스 물질을 포함하는 액체의 에어로졸화가 사용된다. 각각의 입자(진공 건조 드롭)는 펄스 레이저로 이온화되고, 이온화된 물질의 질량 스펙트럼이 얻어진다. 페니실린 저항력을 갖는 포도상 구균을 갖는 입자 및 페니실린 저항력을 갖지 않는 포도상 구균을 갖는 입자는 질량 스펙트럼에 따라 구별될 수 있다는 것을 발견했다.
제1 믹싱 유닛(12)은 희석 유닛으로서 작용한다. 그것은 제1 믹서(120), 희석물 저장소(122) 및 검출기(124)를 포함한다. 희석물 저장소(122)는 제1 믹서(120)와 연결되어 희석물을 공급하고, 제1 믹서(120)는 시료 리시버(10)로부터 시료 물질과 희석물을 혼합하기 위해 형성되었다. 검출기(124)는 미생물이 측정 빔을 통해 예컨대, 미생물을 갖는 액체가 순환되는 도관에서 흐르는 경우에 각각의 미생물로부터 산란되는 광을 검출하기 위해 형성된 광학 검출기이어도 좋다. 단위 시간 인터벌 당 평균 검출되는 미생물의 수로부터 밀도를 결정할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 광학 산란 강도는 희석물 및 시료 리시버(10)로부터의 물질을 포함하는 제1 믹서(120) 중 액체로부터 측정될 수 있다.
이 형태의 검출기는 그 자체로 알려져 있다. 사이토미터 또는 플로우 사이토미터의 알려진 형태가 사용되어도 좋다. 그 자체로 알려진 바와 같이 사이토미터는 인접한 액체의 이면에 대해 각각의 미생물 중 물질의 공간적 농도 사이의 차이에 대응하여 생물학적 물질의 밀도의 주요 변동을 감지하는 장치일 것이다. 예컨대, 시간적 변동은 미생물을 갖는 액체의 흐름이 발생하는 위치에서 검출될 수 있고, 공간적 변동은 검출 위치를 스캐닝함으로써 검출될 수 있다. 광학적 검출은 예컨대 미생물 당 최대 액체 체적보다 작은 사이즈의 작은 지역에 포커스되는 형광 또는 다른 광학 특성의 검출을 위해 제공되는 장치를 사용해도 좋다. 하나 이상의 검출기는 미생물을 특징인 NADH와 같은 물질을 형광을 내는 파장에서 형광을 검출하는데 사용된다. 다른 광학 특성, 예컨대 산란, 회절 등이 사용되어도 좋다.
입자 검출기(124)는 제1 믹서(120)의 제어 인풋(input)에 연결되는 것으로 보인다. 제어 메카니즘은 측정된 밀도가 떨어지거나 소정의 밀도 이하일 때까지 시료에 가해지는 희석물의 양을 증가시키기 위해 배열된다. 액체 순환 회로는 바람직한 밀도에 이를 때까지 희석물 주입점을 따라 희석된 시료를 순환하는데 사용될 수 있다. 실제로, 제어 컴퓨터(도시하지 않음)는 밀도 측정기(124)로부터 측정 데이터를 수용하고, 이 데이터에 따라 믹서 통제 시그널을 생성하는데 사용될 수 있다.
운용시 미생물을 포함하는 액체 시료는 시료 리시버(10)에 제공된다. 펌프(도시하지 않음)는 도관(11)을 통해 제1 믹싱 유닛(12)에 시료 물질을 펌핑한다. 제1 믹서(120)는 시료 물질에 희석물을 첨가한다. 물 또는 에탄올은 예컨대 희석물로서 사용될 수 있다. 시료 물질의 배치가 제1 혼합 회로(12)에 공급된 후, 배치가 프로세싱되고 제1 믹싱 유닛(12)을 떠날 때까지 시료 리시버(10)로부터 물질을 더 얻지 않고 프로세싱이 이 배치에 계속되는 배치 방식 프로세싱(Batch-wise processing)이 사용되어도 좋다. 예컨대, 사이즈가 0.01 내지 10밀리리터의 범위인 배치가 사용되어도 좋다.
피드백 루프(feedback loop)는 밀도 측정기(124)에 의해 관찰되는 밀도가 소정의 비율로 낮아질 때까지 희석률을 증가시키는데 사용된다. 피드백 대신에, 최초의 밀도가 측정되고 얻어진 비율이 소정의 비율로 첨가된 희석물의 양을 제어하는데 사용되는 피드 포워드 솔루션(feed forward solution)이 사용되어도 좋다. 실시형태에 있어서, 소정의 비율이 선택되어 대부분의 드롭이 하나 미만의 미생물을 포함한다. 이 비율은 드롭 당 하나 미만의 미생물의 평균이 얻어지거나 드롭 당 4와 1/4 사이의 평균이 얻어지도록 정해질 수 있다. 액체 중 미생물의 전체 수가 충분하고, 미생물의 형태가 비특이적인 것을 알았다. 따라서, 임의의 형태의 단 하나의 미생물을 갖는 드롭의 적합한 수가 확인될 수 있다.
실제 비율은 검출기(124)로부터의 측정과 미생물의 농도 사이의 관계를 사용하여 드롭 형성의 파라미터를 설정함으로써 제어되는 드롭의 사이즈와 조합하여 선택될 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 이 비율은 하나의 미생물을 포함하는 드롭의 분획이 소정의 비율, 예컨대 생성된 질량 스펙트럼의 1/10 내지 1/2일 때까지 비율을 조정함으로써 미생물로부터의 물질이 질량 분석에 의해 관찰되는 드롭의 분획의 관찰에 따라 칼리브레이션(calibration) 단계 시 실험적으로 설정될 수 있다. 하나의 실시예에 있어서, 희석 비율이 희석물에 대해 1 내지 5 시료까지 희석이 사용될 수 있다.
제1 믹싱 유닛(14)의 피드백은 미생물을 포함하지 않는 불필요한 드롭의 수 또는 하나 이상의 유기체를 포함하는 드롭의 상당한 수의 관점에서 다양한 농도의 미생물을 갖는 시료는 효율에서 큰 변화를 야기하지 않는다는 것을 알았다. 농도가 미리 제어될 수 있으면 피드백 또는 밀도 결정이 필요하지 않다. 유사하게, 농도가 높지 않아 소정 희석 후 다수의 유기체를 갖는 상당수의 드롭의 우려가 지속되고, 효율의 손실이 수용되는 것이 알려지면 피드백 또는 밀도 결정은 생략될 수 있다. 소정의 희석률이 사용되는 경우에는 제1 믹싱 유닛(12)은 생략되어도 좋다.
제2 믹싱 유닛(14)은 제2 믹서(140) 및 매트릭스 물질 저장소(142)를 포함한다. 매트릭스 저장소(142)는 제2 믹서(140)와 연결되어 제2 믹서(140)에 매트릭스 물질을 공급하고, 제2 믹서(140)는 형성되어 매트릭스 물질과 제1 믹싱 유닛(12)으로부터 희석된 시료 물질을 혼합한다.
운용에 있어서, 액체를 제1 믹싱 유닛(12)으로부터 제2 믹싱 유닛(14)으로 이동시킨다. 도관(11)이 이 목적을 위해 설명되지만, 배치 조작(batch op) 액체는 어떤 방법으로든 제2 믹싱 유닛(14)으로 이동될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 제2 믹싱 유닛(14)은 제1 믹싱 유닛(14)과 조합될 수 있다. 제2 믹싱 유닛(14)에 있어서, MALDI 매트릭스 물질이 첨가된다. MALDI 매트릭스 물질은 선행 기술에 그 자체로 잘 알려져 있다. 매트릭스 물질이 사용될 수 있으며, 이는 미생물에 부착되어 결정화되기에 적합하고, 미생물로부터 물질을 이온화하는 레이저 펄스를 흡수하기에 적합한 광학적 흡수 밴드를 갖는다. 광범위한 적합한 매트릭스 물질이 알려져 있다. 결정을 형성하지 않는 MALDI 매트릭스 물질 또한 알려져 있다. 유기체 또는 특이 유기 물질의 특이 형태로 지시된 MALDI 매트릭스 물질이 사용되지만, 또한 광범위한 유기체 및/또는 유기 물질에 적용 가능한 MALDI 매트릭스 물질이 사용될 수 있다. 제2 믹싱 유닛(14)은 계측대상물질(analyte)에 대한 몰 매트릭스 비율은 100:1 내지 10000:1을 제공하는데 충분한 양으로 MALDI 매트릭스 물질을 가하기 위해 형성될 수 있다.
제2 믹싱 유닛(14)로부터 얻어진 액체는 도관(11)을 통해 액체의 연속적인 스트림으로서 압전 공진자(16)를 통해 개구부로 펌핑된다. 제2 믹싱 유닛(14)에서 압전 공진자로 직접 연결된 도관(11)을 설명하지만, 액체의 배치는 제2 믹싱 유닛(14)으로부터 어떤 다른 방법에 의해 도관(11)의 인풋의 위치로 이송될 수 있다는 것으로 이해해야 한다. 중간 저장소(도시하지 않음)는 도관(11)의 인풋에 사용될 수 있다. 액체 펌프(도시하지 않음)는 압전 공진자(16)로 도관(11)을 통해 스트림 액체를 펌핑하는데 사용될 수 있고, 펌프는 제2 믹싱 유닛(14) 또는 액체는 도관(11)을 통해 압전 공진자(16)에 액체의 스트림을 가하기 위해 액체가 이동되는 중간 저장소 중 액체에 압력을 가하는데 사용될 수 있다. 도관(11)은 너무 짧아서 제2 믹싱 유닛(14) 또는 중간 저장소로부터 압전 공진자(16)를 통해 개구부까지 직접적인 연결이 형성될 수 있다.
실시형태에 있어서, 압전 공진자(16)는 프레임(frame), 20마이크로미터의 개구부를 갖는 오리피스(orifice)를 갖는 맴브레인(membrane)을 포함하고, 이는 액체의 흐름이 향하고, 압전 물질이 맴브레인과 프레임 사이에 연결된다. 바람직하게 적어도 10마이크로미터의 개구부가 사용된다. 압전 물질은 오리피스가 액체 흐름의 방향으로 앞뒤로 움직이도록 만들기 위해 위치된다. 전극은 모션을 구동하기 위해 압전 물질에 제공된다.
운용에 있어서, 제어 회로(17)는 전극에 고주파 전기 여기(electric excitation)를 적용한다. 주파수 1 kHz 내지 1MHz 범위가 예컨대 사용될 수 있다. 고주파 전기 전압은 액체 흐름의 방향으로 개구부의 주기적인 동작을 야기하고, 이는 액체 스트림을 부분으로 분리하여 드롭을 만드는 것을 야기한다. 일련의 드롭은 챔버(15)를 통해 플라이트 경로를 따라 발사된다. 바람직하게, 압전 공진자(16)의 여기 주파수의 일정한 설정이 사용되어 동일한 사이즈의 드롭이 생성된다. 드롭 사이즈를 제어하는 기술은 잉크젯 프린팅 기술로부터 그 자체로 잘 알려져 있다.
실시형태는 압전 공진자(16)가 액체를 드롭으로 분리하는데 사용되는 것을 설명하지만, 다른 드롭 형성 기술이 사용될 수 있다는 것으로 이해해야 한다.
챔버(15)에 있어서, 낮은 압력의 분위기, 예컨대 1/1000밀리바 내지 약간의 밀리바의 범위내로 유지된다. 분위기는 임의의 가스로 이루어질 수 있다. 실시예에 있어서, 노멀 공기가 사용된다. 압전 공진자(16)로부터 이온화 지점까지의 플라이트 경로의 길이는 드롭의 속도가 주어졌을 때 플라이트 경로를 횡단하는데 필요한 시간이 예컨대 결정화에 의해 매트릭스를 제자리에 두는데 충분한 것을 따를 때 적어도 바람직하다. 하나의 실시형태에 있어서, 하나 이상의 중간 노즐 스키머(intermediate nozzle skimmers)는 질량 분석에 적합한 비율에 달할 때까지 가스 압력을 줄이기 위해 플라이트 경로를 따라 사용될 수 있다. 실시형태에 있어서, 질량 분석은 거의 10-6 밀리바 또는 일반적으로 10-5 밀리바 이하의 압력에서 행해진다. 드롭이 형성되는 단계에서 낮은 시작 압력을 사용함으로써, 압력이 도달되기 전 드롭의 손실은 낮은 수준을 유지할 수 있고, 이는 장치의 효율을 증가시킨다. 모든 드롭이 동일한 플라이트 경로를 따라 형성되는 것은 또한 효율을 증가시킨다. 바람직하게, 드롭은 직접 진공에 주입되지만, 드롭 형성의 안정성을 증가시키기 위해 높은 압력 단계를 첨가하는 것이 바람직할 수 있다.
몇 마이크로미터의 드롭 사이즈(예컨대, 1 내지 10마이크로미터의 범위)의 드롭은 1/1000초 또는 1/1000000초 내에 매트릭스 형성(예컨대, 결정화)하기 위해 충분히 건조한다. 20 m/sec의 속도에서 이는 플라이트 경로의 길이에 심하게 제한되지 않는다. 초당 100-300미터 범위의 속도 이상이 사용될 수 있다.
가스 플로우 원(gas flow source)(도시하지 않음)은 플라이트 경로를 따라 가스젯(gas jet)을 형성하기 위해 압전 공진자(16)에 근접하여 제공될 수 있다. 이러한 젯은 연속적인 드롭이 뭉쳐지는 경우를 줄이는데 도움이 될 수 있다.
제어 회로(17)는 압전 공진자(16)의 진동(oscillations), 상대적인 펄스와 동기 시 펄스를 생성하기 위해 펄스 레이저(18)를 제어하여 펄스 레이저(18)로부터의 펄스는 압전 공진자(16)로부터의 드롭이 레이저 빔을 통과하는 시점에 플라이트 경로에 도착할 수 있다. 이것은 드롭으로부터 입자의 이온화를 발생시킨다. 질량 분석기(19)는 생성된 입자의 질량 스펙트럼을 분석한다.
압전 공진자(16)의 진동을 갖는 레이저 펄스의 동기화는 압전 공진자(16)의 여기 신호에 레이저 펄스를 동기화함으로써 실현될 수 있다. 또한, 드롭 검출기(도시하지 않음)는 챔버(15)에 플라이트 경로를 따라 드롭을 검출하는데 사용되고, 펄스 레이저(18)는 예컨대 검출기로부터의 신호를 작동시킬 수 있다. 이 검출기는 또한 드롭 속도를 측정하기 위해 형성되어 각 드롭의 도착 시간을 예상한다. 또한, 소정의 속도가 추측되고, 이는 실험적으로 결정될 수 있다.
질량 스펙트럼은 제어 회로(17) 또는 측정 컴퓨터에서 통제되고, 각 드롭의 미생물의 형태를 식별하기 위해 참조 스펙트럼 또는 참조 스펙트럼의 일부 또는 알려진 미생물의 생체지표(biomarker)의 리스트와 비교할 수 있다. 간단한 스크리닝 실시형태에 있어서, 소수의 참조 스펙트럼이 충분할 수 있다. 식별된 미생물의 수는 전체 드롭수, 또는 미생물 또는 참조 형태의 셀을 포함하는 드롭수와 비교함으로써 식별된 미생물의 농도를 결정하기 위해 계산될 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 더 큰 수의 참조 스펙트럼과의 비교는 시료중 미생물의 형태 또는 세포 형태의 범위를 식별하기 위해 행해진다.
도 2는 드롭의 프리스크리닝(prescreening)을 사용하는 실시형태를 나타낸다. 다른 레이저(20) 및 형광 검출기(22)가 첨가된다. 또 다른 레이저(20)는 드롭 중 미생물의 형광을 여기하기 위해 선택된 파장을 갖는다. 예컨대, 266㎚의 파장이 사용될 수 있다. 또 다른 레이저(20)는 그들이 이온화 시점에 도달하기 전에 드롭의 플라이트 경로(24)의 부분으로 향한다. 연속적인 파장 레이저 또는 드롭 형성이 동시에 발생되는 펄스 레이저를 사용할 수 있다. 형광 검출기(22)는 또 다른 레이저(20)에 의해 조사한 후 플라잉 드롭으로부터 형광을 포획하기 위해 유사하게 플라이트 경로(24)로 향한다. 형광 검출기(22)는 제어 회로(17)와 연결되고, 이는 조건적으로 미생물의 존재를 나타내는 형광이 검출되는 드롭에만 발사되는 펄스 레이저를 발생하기 위해 형성된다. 또한, 또 다른 레이저(20)는 발사를 촉발시키는데, 즉 발사 시점을 선택하는데 사용된다. 다른 실시형태에 있어서, 하나 이상의 레이저는 하나 이상의 레이저로 검출되는 드롭의 시점 및/또는 속도를 사용하여 발사를 촉발시키는데 사용될 수 있다. 이것은 또 다른 레이저(20)가 사용되는지와 관계없이 행해질 수 있다.
또 다른 실시형태에 있어서, 형광은 압전 공진자(16)에 액체를 드롭으로 분리하기 전에 도관(11)에서 검출될 수 있다. 이 경우에 있어서, 또 다른 레이저 및 형광 검출기는 도관(11)을 향하고, 제어 회로(17)는 압전 공진자(16)의 유속 및 압전 공진자(16)의 여기 신호를 검출할 때부터 미생물이 분리될 드롭을 결정할 수 있다. 도관(11)에서 형광의 검출은 매트릭스 결정화가 미생물로부터 형광의 검출을 방해하는 것을 억제하도록 도울 수 있다.
도 3은 시료 저장소(10)로 향하는 초음파원(ultrasound source)(30) 또는 시료 저장소(10)와 제1 믹싱 유닛(12) 사이의 도관(11)을 포함하고, 미생물의 클러스터를 각 미생물로 분리하기 위해 형성된 장치의 실시형태를 나타낸다. 또한, 초음파원(30)은 미생물이 예컨대 면봉 또는 여과지에 수집되는 시료 캐리어로부터 미생물을 분리하는데 사용될 수 있다.
미생물의 클러스터를 초음파 분리하는 기술이 잘 알려져 있다. 클러스터의 분리는 하나 이상의 미생물이 동시에 존재하는 드롭의 수를 줄이는데 사용될 수 있다. 시료는 초음파원(30)이 시료 저장소(10)로 향하는 것을 설명하지만, 하나 이상의 초음파원(30)이 클러스터를 분리하기 위해 시료 저장소(10) 및 압전 공진자(16) 사이에 어느 위치를 향해도 좋은 것으로 이해해야 한다. 제1 믹싱 유닛(12) 전 클러스터의 분리는 더욱 신뢰할 수 있는 밀도 측정 및 더욱 균일한 희석을 얻을 수 있다는 점에서 유용하다.
초음파를 사용하여 클러스터를 분리하는 대신에, 다른 분리 기술, 예컨대 잘 알려져 있고, 예컨대 액체를 흔듦으로써 액체 중 보텍스를 생성하는 것을 포함하는 보텍싱(vortexing)이 사용될 수 있다. 클러스터의 분리 없이, 일부 드롭이 미생물의 클러스터를 포함할 위험이 존재한다. 일부 경우에, 이것은 예컨대 클러스터가 균일하거나 또는 클러스터 중 유기체의 다양한 형태들을 구분할 필요가 없을 때 문제가 되지 않는다.
도 4a는 압전 공진자(16)를 갖는 세퍼레이터의 상세를 도시적으로 나타낸 것이다. 도관(11)은 압전 공진자(16)를 통해 개구부로 끝나고, 이는 드롭을 발사하기 위해 주기적으로 수축된다. 압전 공진자(16)가 액체의 스트림을 드롭으로 분리하는데 사용되는 실시형태를 나타내지만, 다른 드롭 형성 기술이 사용될 수 있는 것으로 이해해야 한다. 예컨대, 잘 알려져 있고, 스트림이 가스 플로우에 주입될 때 또는 그 후에 액체의 스트림이 드롭으로 분리되도록 작용하는 가스 플로우에 도관(11)이 열리는 가스 동적 노즐(gas dynamic nozzle)이 사용될 수 있다. 도 4b는 도관(11)의 말단이 가스 플로우가 공급되는 더 큰 도관(50) 내에서 방출되는 구성이 사용되는 실시예를 나타낸다. 따라서, 드롭은 가스성 환경에 액체의 스트림을 주입한 후에 형성될 수 있다. 이것은 효율을 증가시키고, 펄스 레이저(18)가 드롭의 타격이 필요한 때에 발사되는 것을 확인하기 위해 필요한 제어를 단순화시키기 때문에, 가스 및 액체 유량 및 개구부 사이즈가 설정되어 드롭 사이즈의 제한된 범위가 얻어지는 것이 바람직하다.
다른 실시형태에 있어서, 액체의 스트림이 도관의 개구부로 도관을 통해 가해지고, 드롭이 개구부로부터 플라이트 하는 것을 분리하는, 탭(tap)으로부터 드립핑(dripping)하는 것과 유사한 드롭 분리 메카니즘이 사용될 수 있다. 개구부를 지나는 중력, 또는 가스 플로우는 개구부로부터 드롭을 분리하는데 사용될 수 있다. 이 실시형태에 있어서, 드롭 사이즈는 액체의 스트림의 유량의 분리, 개구부의 직경 및/또는 형태 및 가스 유속을 사용하여 통제될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 도 4c에 나타낸 바와 같이 도관(11) 중 가스 주입구(54)는 도관(11)을 통해 액체의 스트림이 규칙적으로 공간을 둔 거리에서 가스 버블을 주입하는데 사용될 수 있다. 가스 주입구(54) 중 밸브(56)는 버블을 형성하는데 사용될 수 있다. 버블은 스트림이 도관(11)의 개구부에 도달하기 전에 스트립을 부분으로 분리하여, 스트림이 도관(11)의 개구부에 가해질 때 각 부분이 각각의 드롭이 될 것이다.
상기한 바와 같이, 이 장치는 미생물 및 매트릭스 물질을 포함하는 액체의 스트림에서 미생물을 식별하는 프로세스를 제공한다. 액체 스트림은 드롭, 바람직하게는 단분산된(monodisperse) 드롭으로 분리된다. 드롭은 플라이트 경로를 따라 플라이트 시 공급된다. 이 드롭은 플라이트 시 진공에서 건조된다. 생성된 건조된 입자는 이온화되어 질량 스펙트럼을 얻었다. 입자는 플라이트 시 분석된다. 설명된 실시형태에 있어서, 액체는 미생물을 갖는 대부분의 드롭이 미생물 하나만을 포함하는 희석 비율로 희석한다.
장치의 구체적인 실시형태를 나타내지만, 이 프로세스는 장치의 변형된 실시형태로 행해질 수 있는 것으로 이해해야 한다. 예컨대, 도관(11)을 사용하는 것 대신에 희석물 믹싱 유닛, 매트릭스 재료 믹싱 유닛 및 드롭 형성 스테이션(droplet forming station)을 이송할 수 있는 이동식 시료 홀더(transportable sample holder)가 사용될 수 있다. 희석물 혼합 및 매트릭스 물질 혼합은 도 4에 나타낸 바와 같이, 희석물과 매트릭스 물질을 갖는 시료를 동시에 또는 다른 시간 인터벌을 두고 혼합하는 믹싱 단계(42)를 갖는 단일 믹싱 유닛(40)에 행해질 수 있다. 이송의 부분은 도관에서 행해질 수 있고, 다른 부분이 이송 유닛으로 행해질 수 있다. 매트릭스 물질의 희석 및 첨가의 서열은 변경될 수 있고, 또는 임의의 믹싱 단계가 다수의 믹싱 단계로 나뉠 수 있다.
미생물에의 어플리케이션이 실시예의 방법에 의해 설명되지만, 이 기술은 생물학적 물질의 다른 형태, 예컨대 셀, 예컨대 혈구 또는 이러한 셀의 특정 형태를 식별하는데 사용될 수 있는 것으로 이해해야 한다. 시료는 다양한 물질의 혼합물을 포함할 수 있고, 복수의 형태의 물질은 다른 드롭의 질량 스펙트럼으로부터 얻어진 결과를 조합함으로써 시료로부터 식별될 수 있다.
병원 허가 스크리닝 어플리케이션(hospital admission screening application)에 있어서, 생물학적 물질은 환자로부터, 예컨대 침, 또는 임의의 점막 또는 혈액 시료 또는 소변 시료 또는 그 조합을 채취할 수 있고, 이 시료는 설명된 바와 같이 프로세스될 수 있다. 질량 스펙트럼으로 드롭 중 미생물의 얻어진 식별, 또는 특정 항생물질 내성을 갖는 포도상 구균과 같은 해로운 미생물의 참조 질량 스펙트럼과 매칭하는 질량 스펙트럼으로 미생물을 포함하는 드롭의 수는 환자에게 일반적인 치료가 허용될 수 있는지를 결정하는데 사용될 수 있다. 해로운 포도상 구균을 갖는 환자는 특별한 치료가 행해질 수 있다.
유사하게, 해로운 미생물의 감염의 발생은 다수의 환자로부터 시료를 채취하고, 설명한 바와 같이 시료를 프로세싱함으로써 모니터링될 수 있다. 실시형태에 있어서, 예컨대 병동에서, 개별 환자를 선택할 필요 없이 예컨대 사람의 집단 중 해로운 미생물의 식별이 필요한 경우에 다른 환자의 시료가 혼합될 수 있다.
진단 어플리케이션(diagnostic application)에 있어서, 생물학적 물질의 시료는 환자로부터 채취될 수 있고, 이 시료는 설명한 바와 같이 프로세스되어 특정 미생물에의 감염을 검출할 수 있다.
계속적으로 이온화하는데 충분한 전력을 공급할 필요를 피하는 펄스 레이저로 실시형태를 설명하지만, 드롭의 분리 특성은 연속적인 파장 레이저의 사용을 가능하게 할 수 있는 것으로 이해해야 한다. 레이저 대신에, 광원의 다른 형태는 드롭의 적어도 부분을 이온화하기 위해 광을 제공하는데 사용될 수 있다. UV 광 또는 적외광이 예컨대 사용될 수 있다. 광 대신에, 이온화하는 다른 방법으로 예컨대 이온 충격(ion bombardment) 또는 초음파 조사가 고려될 수 있다.
도 5는 시료 저장소(50), 제1 캐리어 액체 저장소(520), 펌프(522), 제1 믹싱 유닛(524), 플로우 필드-플로우 분획기(Flow Field-Flow fractionator)(54), 사이즈 검출기(540), 3방향 밸브(542), 매트릭스 저장소(550), 제2 믹싱 단계(552), 제2 캐리어 액체 저장소(믹싱 단계), 제3 믹싱 단계(562), 플로우 사이토미터(57) 및 드롭 생성기(58)를 포함하는 식별 장치를 나타낸다. 펌프(522), 제1 믹싱 단계(524), 플로우 필드-플로우 분획기(54), 3방향 밸브(three way valve)(542), 제2 믹싱 단계(552), 제3 믹싱 단계(562) 및 드롭 형성기는 액체 플로우 채널(liquid flow channel)을 따라 연속하여 연결된다. 제1 캐리어 액체 저장소(520)는 펌프(522)의 인풋으로 공급한다. 시료 저장소(50)는 제1 믹싱 단계(524)의 인풋으로 공급한다. 사이즈 검출기(540)는 플로우 필드-플로우 분획기(54)의 하류 및 3방향 밸브(542)의 상류에서 액체 플로우 채널의 부분에 연결된다. 매트릭스 저장소(550)는 제2 믹싱 단계(552)의 인풋으로 공급한다. 제2 캐리어 액체 저장소(믹싱 단계)는 제3 믹싱 단계의 인풋으로 공급한다. 플로우 사이토미터(57)는 제3 믹싱 단계(562)의 하류 및 드롭 형성기(58)의 상류에서 액체 플로우 채널의 부분에 연결된다.
도시하지 않지만, 장치는 예컨대 3방향 밸브(542)와 제 2 믹싱 단계(552) 사이의 액체 플로우 채널을 따라 하나 이상의 위치에 다양한 양의 액체를 저장하기 위한 버퍼(buffer)를 포함할 수 있다. 버퍼는 유량의 변화를 저감하는데 사용될 수 있다.
운용에 있어서, 펌프(522)는 플로우 채널을 통해 제1 캐리어 액체 저장소(520)로부터 캐리어 액체를 펌핑한다. 예컨대, 암모늄 아세테이트가 첨가된 물은 캐리어 액체로서 사용될 수 있다. 제1 믹싱 단계(524)는 펄스 시간 인터벌 동안 캐리어 액체의 스트림에 시료 액체의 펄스된 양을 혼합한다. 플로우 필드-플로우 분획기(54)는 입자 사이즈에 따라 일시적으로 연속적인 분획으로 스트림을 분획한다. 사이즈 검출기(540)는 시간 함수에 따라 입자의 사이즈를 검출하고, 3방향 밸브(542)를 제어하여, 검출된 사이즈에 따라 플로우를 제2 믹싱 단계(552) 또는 폐기물 아웃풋으로 통과시킨다. 제2 믹싱 단계(552)는 스트림 중에서 매트릭스 저장소(560)로부터 MALDI 매트릭스 물질을 혼합한다. 제3 믹싱 단계(562)는 스트림 중 추가적인 캐리어 액체를 혼합한다. 플로우 사이토미터(57)는 스트림 중 미생물의 밀도를 측정한다. 제3 믹싱 단계(562)의 혼합률은 측정된 밀도에 따라 제어된다. 드롭 발생기(58)는 스트림의 연속적인 부분으로 스트림을 분리하고, 각 부분으로부터 형성되는 드롭을 발사한다.
바람직하게, 플로우 채널은 스트림이 제2 믹싱 단계(552)로부터 드롭 발생기(58)로 임의의 실질적인 축 재배열(axial rearrangement) 없이 흐르도록 고안되어 있다. 즉, 액체가 축적되고 혼합될 수 있는 큰 저장소는 플로우 채널에 회피된다. 따라서, 드롭 발생기(58)가 액체를 분리하는 부분은 제2 믹싱 단계(552) 후 또는 적어도 제3 믹싱 단계 후 스트림의 연속 부분에 대응한다. 제3 믹싱 단계(562)에서의 희석은 이하 스트림에 캐리어 액체를 혼합함으로써 행해진다.
피드백 루프는 제3 믹싱 단계(562)를 제어하는데 사용될 수 있고, 피드백 루프는 측정된 밀도 "C"가 소정의 타겟 값(target value) 이상인지 이하인지에 따라 혼합률이 증가 또는 감소하도록 고안되어 있다. 소정의 타겟 값 CO는 C0*V=A를 만족하는 것이 사용될 수 있고, 식 중 V는 드롭 발생기(58)가 스트림을 분리한 부분의 체적이고, A는 2 이하, 바람직하게는 1 이하의 수이다; 값 A=0.2가 예컨대 사용될 수 있다. 밀도가 너무 낮게 떨어지면 캐리어 액체가 없거나 소정의 최소 캐리어 액체가 첨가된다고 하더라도 소정의 타겟 값 이하로 유지되고, 제3 믹싱 단계(562)의 제어가 밀도에 따라 중단될 수 있다.
플로우 필드 플로우 분획기(54) 대신에 임의의 다른 분획 장치는 시료 액체의 펄스로 스트림을 입자 사이즈가 점진적으로 변화하는 스트림으로 분획하는데 사용될 수 있다. 드롭이 존재하는 경우에 미생물의 식별을 방해할 수 있는 시료로부터 상대적으로 작은 사이즈의 물질의 양을 줄이는 점은 유용하다. 또한, 제3 믹싱 단계(562)에서 혼합률이 미생물의 다른 분획들 사이에서 미생물 밀도차를 제공하기 위해 적시에 적용될 수 있는 점은 유용하다. 따라서, 단일 미생물을 갖는 드롭은 각 분획에 더욱 쉽게 실현될 수 있다. 매우 다른 밀도의 분획이 동시에 존재하는 경우에는 어려울 수 있다.
종래의 플로우 필드-플로우 분획기(54)가 사용되어도 좋다. 이러한 컬럼은 예컨대 앞서 인용된 Hookeun Lee et al.의 기사에 설명되어 있다. 간단히, 이러한 장치는 시료 물질을 갖는 캐리어 액체의 스트림이 흐르는 개구부 채널과 같은 얇은 리본을 사용한다. 다른 유속은 흐르는 방향을 가로지르는 채널의 위치의 기능에 따라 발생한다. 외부장(external field)을 사용하여 다른 횡단 밀도 분포(transverse density distributions)는 입자의 다른 분획을 실현한다. 외부장, 예컨대 전기장(electric field), 도입된 기온 경도(temperature gradient), 중력 등이 사용될 수 있다. 밀도 분포는 장의 효과와 밀도 경사에 대응하는 확산(diffusion) 사이의 밸런스로부터 발생한다. 따라서, 다른 분획은 미생물을 온전하게 남기고 시간에 의해 분리되는 플로우 필드-플로우 분획기(54)의 산출시에 나타날 것이다.
사이즈 검출기(540)는 분획을 나타내는 입자의 사이즈를 검출하도록 작용한다. 사이즈 검출기(540)는 타이트하게 통제된 플로우 필드-플로우 분획 프로세스가 사용되는 경우에는 생략될 수 있다. 이 경우에 있어서, 3방향 밸브(542)는 예컨대 시료 물질의 펄스 후 소정의 지연 시 제2 믹싱 단계(552)를 향해 액체가 흐르는 시간 인터벌을 정의하는 타이머에 의해 통제될 수 있다. 사이즈 검출기(540)는 사이즈를 측정함에 따라 광 산란을 측정하기 위해 형성되지만, 도전성 측정 또는 형광 측정과 같은 다른 기술이 사용될 수 있다.
플로우 사이토미터(57)는 미생물에 기인하는 패싱 액체 중 형광으로 일시적 피크를 검출하기 위해 형성된 형광 검출기를 포함할 수 있다. 예컨대, NADH에 대응하는 파장에서의 형광이 사용될 수 있다. 시간 단위당 이러한 피크의 수는 제3 믹싱 단계(562)를 통제하는 밀도 시그널로 사용될 수 있다. 실시형태에 있어서, 플로우 사이토미터(57)로부터 각 미생물의 검출은 레이저가 펄스 레이저(도시하지 않음)의 발사, 플로우 사이토미터(57)가 드롭이 형성될 액체 스트림의 부분에서 미생물을 검출하지 않을 경우에 문제가 되는 드롭의 발사가 가능하도록 사용될 수 있다. 미생물 드롭의 밀도가 제3 믹싱 단계(562)가 유기체 밀도에 따라 캐리어 액체를 혼합하는 레벨 이하로 떨어지는 경우에, 발사의 통제는 효율적인 질량 분석을 유지하는데 사용될 수 있다.
도 6은 플로우 사이토미터(57)와 드롭 발생기(58) 사이에 추가적인 3방향 밸브(60), 플로우 사이토미터(57)와 연결된 제어 인풋을 갖는 장치를 나타낸다. 운용에 있어서, 개별 미생물의 검출은 미생물이 검출되는 경우에는 드롭 발생기(58)에, 그 외에는 폐기물 아웃풋에 액체를 통과시키는 추가적인 3방향 밸브(60)를 통제하는데 사용된다. 이러한 방법에 있어서, 불필요한 드롭의 수는 최소화된다. 미생물 드롭의 밀도가 제3 믹싱 단계(562)가 유기체 밀도에 따라 캐리어 액체를 혼합하는 레벨 이하로 떨어지는 경우에는, 폐기물 아웃풋의 통제는 효율적인 질량 분석을 유지하는데 사용된다. 실시형태에 있어서, 드롭 발생기(58)의 "온 디멘드(on demand)" 제어는 액체가 폐기물 아웃풋에 공급되지 않는 경우에 형성하는 드롭을 촉발시키기 위해 사용된다. 도 7은 플로우 사이토미터(57)가 제3 믹싱 단계(562)의 상류에 위치한다. 따라서, 피드 포워드 제어(feed forward control)는 검출된 미생물 밀도와 혼합률 사이의 소정의 관계식에 따라 실현된다. 이하 관계식이 사용된다.
Fadd= Norg * Vdrop/A -Fin
식 중, Fadd는 제2 캐리어 액체 저장소(560)의 유량으로 혼합된 것이고, Norg는 단위 시간 당 검출된 미생물의 인커밍 밀도이고, Vdrop은 드롭이 형성되는 것으로부터 액체 부분의 체적이고, A는 바람직한 밀도, 바람직하게는 1보다 작고, 예컨대 A=0.2이다. 도 5 및 6의 피드백 솔루션(feedback solutions)에 있어서, 이 관계식은 피드백에 의해 실현된다. 밀도는 검출된 미생물을 카운팅함으로써 또는 연속적인 검출들 사이에 시간 간격으로부터 측정될 수 있다. 실시형태에 있어서, 도 7의 실시형태 중 제3 믹싱 단계(562)는 각 미생물의 검출, 시간 간격이 감소될 때 첨가되는 캐리어 액체의 양을 증가시키는 유기체의 연속적인 검출들 사이에 시간 간격에 따라 통제되는 혼합률에 따라 제어될 수 있다.
도 7의 피드 포워드 솔루션은 더 작은 시료로 검출을 제공을 가능하게 하는 이점이 있다. 피드 포워드 솔루션은 추가적인 3방향 밸브(60)(도시하지 않음)의 사용 또는 발사를 가능하게 하는 것을 조합할 수 있다. 이 경우에 있어서 제어는 통계적이고, 드롭의 낮은 퍼센트만이 미생물을 포함하는 경우에 발사를 억제할 수 있다. 플로우 사이토미터(57)가 제 2 믹싱 단계(552)와 제3 믹싱 단계(562) 사이에 위치하는 실시형태를 나타내지만, 플로우 사이토미터(57)가 제2 믹싱 단계(562)의 상류에 위치해도 좋은 것으로 이해해야 한다. 이 경우에 있어서, 밀도는 MALDI 매트릭스 물질의 첨가 전에 측정된다. 제2 믹싱 단계(562)가 공지의 비율로 MALDI 매트릭스 물질에 가해지도록 지시되는 경우에, 제2 믹싱 단계(562) 전 스트림 중 미생물의 밀도는 이 단계 후 밀도로 변경될 수 있다. 더 나은 통제를 위해서, 제2 믹싱 단계(562) 후 플로우 사이토미터(57)가 바람직하다.
도 7의 사이토미터(57)로부터의 밀도 측정은 레이저 발사 및/또는 추가적인 3방향 밸브(도시하지 않음)를 제어하는데 사용될 수 있다. 추가적인 3방향 밸브는 도 6에서 3방향 밸브(60)와 같은 유사한 위치, 또는 플로우 사이토미터(57)와 제3 믹싱 단계(552) 사이에 위치될 수 있다. 실시형태에 있어서, 사이즈 검출기(54)는 3방향 밸브(542)를 제어하여 적어도 미생물의 한계 밀도(threshold density) 검출시 제2 믹싱 단계(552)에 액체를 통과시키는 사이토미터에 의해 대체될 수 있다. 이 경우에 있어서, 이 사이토미터는 제3 믹싱 단계(562)에 의해 희석을 제어하는데 사용될 수 있다. 그러나, 단일 사이토미터가 복수의 용도를 나타내지만, 대신에 복수의 사이토미터가 이들 용도 중 각 하나 또는 그룹을 시행하는데 사용될 수 있다.
실시형태에 있어서, 드롭 발생기(58)의 플로우 사이토미터 상류는 희석을 제어하기 위한 측정 없이 펄스 레이저(18)의 발사를 제어하는데 사용될 수 있다. 이것은 예컨대 미생물의 밀도가 너무 높아지지 않은 것이 알려지는 경우에 사용될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 드롭 발생기(58)의 플로우 사이토미터 상류는 3방향 밸브를 제어하여 미생물의 검출 또는 미생물의 밀도가 역치를 초과하는 검출시 선택적으로 드롭 형성기(58)에 액체를 공급하는데 사용된다. 이것은 희석을 제어하기 위한 측정 없이 행해질 수 있다. 레이저 발사 제어의 조합 및 3방향 밸브가 사용될 수 있다.
따라서, 시료 중 생물학적 물질을 식별하는 장치가 제공될 수 있고, 이 장치는
-시료 및 결정 형성 매트릭스 물질이 혼합된 액체의 연속적인 스트림을 공급하기 위해 형성된 스트림 발생기;
-상기 스트림을 스트림의 연속적인 부분으로 분리하고, 플라이트 경로를 따라 플라이트 중인 상기 부분으로부터 형성된 드롭을 공급하기 위해 형성된 액체 부분 세퍼레이터;
-상기 드롭으로부터 물질을 이온화하는 방사선을 공급하기 위해 형성되고 플라이트 경로에 향햐는 방사선원(radiation source);
-각각의 드롭 중 하나로부터 이온화된 물질의 질량 스펙트럼을 얻기 위해 형성된 질량 분석기; 및
-스트림 발생기와 액체 부분 세퍼레이터 사이에 위치하고, 스트림 중 미생물을 검출하기 위해 형성되는 사이토미터를 포함하고, 상기 사이토미터는 방사선원 및/또는 방사선원을 가능하게 하고 및/또는 미생물의 검출에 따라 액체 부분 세퍼레이터 또는 다른 곳에 스트림을 가리키는 것 사이에 선택을 제어하는 플로우 경로 셀렉터를 연결한다. 이러한 방법으로 장치는 고효율을 갖는 미생물의 작은 시료를 프로세싱하기 위해 제조될 수 있다.
3방향 밸브의 사용이 플로우 경로 셀렉터를 실현화하기 위해, 액체를 더 프로세싱하고 폐기하기 위해 통과하는 액체 사이에 변환되기 위해 설명되지만, 다른 형태의 밸브가 이것, 예컨대 매니폴드(manifolds)로 사용될 수 있다.
플로우 필드-플로우 분획기(54)의 복수의 가지(branch)는 다른 시료를 처리하기 위해 평행하게 사용될 수 있다. 각 가지는 그것에 상응하고, 예컨대 3방향 밸브(542)를 포함하는 성분을 포함할 수 있다. 액체 매니폴드는 제2 믹싱 단계(552)의 인풋에 성공적으로 이 가지를 연결하는데 사용될 수 있다. 따라서, 효육적인 사용은 플로우 필드-플로우 분획이 오랜 시간이 걸리더라도 장치가 제조될 수 있다.
시료 중 생물학적 물질을 식별하는 방법이 제공되지만, 이 방법은 시료 및 MALDI 매트릭스 물질을 포함하는 액체를 준비하는 단계; 상기 액체의 연속적인 스트림을 생성하는 단계; 플라잉 드롭을 형성하기 위해, 상기 스트림을 연속적인 부분으로 분리하는 단계; 플라이트 시 드롭으로부터 물질을 이온화하는 단계; 상기 이온화된 물질로부터 질량 스펙트럼을 측정하는 단계를 포함한다.
생물학적 물질은 미생물을 포함한다. 이 방법은 시료 또는 액체를 각 부분의 체적을 평균하여 하나 미만의 미생물의 농도에 대응하는 희석 비율로 희석하는 단계를 포함한다. 희석 비율은 측정될 수 있고, 희석은 액체가 상기 농도로 희석될 때까지 진행되기 위해 제어될 수 있다. 클러스터 분리 단계는 분리 단계 전에 미생물의 클러스터를 각 미생물로 분리하기 위해 시료 또는 액체에 적용될 수 있다.
액체는 예컨대, 상기 스트림 중 규칙적인 인터벌로 연속 부분을 분리함으로써 실질적으로 동일한 체적의 부분으로 분리될 수 있다. 액체의 연속적인 부분은 스트림으로부터 그들을 분리하는 동안 또는 그 후에 플라이트시 발사될 수 있다. 또한, 이 스트림은 플라이트시 발사될 수 있고, 이 스트림은 스트림이 플라이트시에 연속적인 부분으로 분리될 수 있다. 드롭은 매트릭스 물질의 클러스터가 이온화 단계 전에 플라이트시 형성되는 적어도 건조 레벨로 플라이트시 건조될 수 있다. 가스젯은 플라이트시 드롭의 궤적의 적어도 부분을 따라 적용될 수 있다. 드롭은 상기 이온화 전에 형광에 따라 스크리닝되고, 적어도 소정의 형광 강도를 생성하기 위해 검출되는 액체의 부분을 갖는 드롭을 이온화될 수 있다.
장치는 시료 중 생물학적 물질을 식별하기 위해 제공되고, 장치는 시료 및 결정 형성 매트릭스 물질이 혼합된 액체를 준비하기 위해 형성된 믹서; 액체의 연속적인 스트림을 공급하기 위해 형성된 스트림 발생기; 상기 스트림을 부분으로 분리하고, 플라이트 경로를 따라 플라이트 중인 상기 부분으로부터 형성된 드롭을 공급하기 위해 형성된 액체 부분 세퍼레이터; 상기 드롭으로부터 물질을 이온화하는 방사선을 공급하기 위해 형성되고 플라이트 경로로 향하는 방사선원; 또한 각각의 드롭 중 하나로부터 이온화된 물질의 질량 스펙트럼을 얻기 위해 형성된 질량 분석기를 포함한다.

Claims (16)

  1. 하기 단계를 포함하는, 시료 중 미생물을 포함하는 생물학적 물질의 식별 방법:
    -시료 및 MALDI 매트릭스 물질을 포함하는 액체를 준비하는 단계;
    -상기 액체의 연속적인 스트림(stream)을 생성하는 단계;
    -플라잉 드롭(flying drop)을 형성하기 위해, 상기 스트림을 스트림의 연속적인 부분으로 분리하는 단계;
    -상기 미생물의 측정된 밀도에 따른 희석 비율, C*V<1(V는 분리된 부분당 체적임)을 만족하는 미생물의 밀도 C에 대응하는 희석 비율로 액체를 희석하는 단계;
    -플라이트 시 드롭으로부터 물질을 이온화하는 단계;
    -상기 이온화된 물질로부터 질량 스펙트럼을 측정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    사이토미터(cytometer)로 스트림 중 미생물의 밀도를 측정하고, 사이토미터 아웃풋 결과에 따라 상기 희석 단계를 제어하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 스트림 중 사이토미터로 측정하는 단계는 상기 스트림 또는 MALDI 매트릭스가 전구체 스트림에 첨가되는 경우에 스트림에 흐르는 전구체 스트림(precursor stream) 상에 상기 희석 단계의 상류(upstream)에 행해지는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 희석 단계는 스트림의 발생되는 곳으로부터 하류(downstream)에서 캐리어 액체(carrier liquid)와 스트림을 혼합함으로써 행해지는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 측정된 밀도와 역치를 비교하고, 상기 밀도가 역치(threshold value) 이하인 경우에 상기 이온화 단계를 불능화하는 단계를 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 밀도는 상기 희석 단계의 하류 및 상기 스트림을 부분으로 분리하는 상류에서 사이토미터로 측정되고, 사이토미터로 미생물의 검출에 따른 상기 이온화 단계를 위해 각각의 부분 중 하나를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    다양한 사이즈의 입자를 연속적으로 포함하는 액체를 플로우로 분획시키고, 상기 플로우를 희석시키고, 상기 분획 단계 후에 미생물의 밀도를 측정하고, 미생물의 측정된 밀도에 따라 상기 희석 단계를 제어하는 것을 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 분획 단계는 플로우 필드-플로우 분획(flow field-flow fractionation)을 적용하는 단계를 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액체를 실질적으로 동일한 체적의 부분으로 분리하는 단계를 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분리 단계 전에 미생물의 클러스터를 각각의 미생물로 분리하기 위해 시료 또는 액체에 클러스터 분리 단계를 적용하는 것을 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    이하 식에 따라 액체를 희석하는 캐리어 액체의 유량 F를 제어하는 단계를 포함하는, 방법:
    F= Norg * Vdrop/A -Fin
    (식 중, Norg는 단위 시간 당 검출된 미생물의 인커밍 밀도(incoming density)이고, Vdrop은 드롭이 형성된 액체 부분의 체적이고, Fin은 스트림의 인커밍 유량이고, A는 하나 미만의 표적 밀도이다).
  12. 하기를 포함하는, 시료 중 생물학적 물질을 식별하는 장치:
    -시료 및 MALDI 매트릭스 물질이 혼합된 액체의 연속적인 스트림을 공급하기 위해 형성된 스트림 발생기(stream generator);
    -C*V<1(V는 분리된 부분당 체적임)을 만족하는 미생물의 농도 C에 대응하는 희석 비율로 미생물의 밀도, 측정된 미생물의 밀도에 따라 제어된 믹서의 희석 비율을 측정하는 믹서 및 검출기를 포함하는 믹싱 유닛(mixing unit);
    -상기 스트림을 스트림의 연속적인 부분으로 분리하고, 플라이트 경로를 따라 플라이트시 상기 부분으로부터 형성된 드롭을 공급하기 위해 형성된 액체 부분 세퍼레이터;
    -상기 드롭으로부터 물질을 이온화하는 방사선을 공급하기 위해 형성되고 플라이트 경로로 향하는 방사선원(radiation source);
    -각각의 드롭 중 하나로부터 이온화된 물질의 질량 스펙트럼을 얻기 위해 형성된 질량 분석기.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 검출기는 MALDI 매트릭스가 전구체 스트림에 첨가되는 경우에 스트림 또는 스트림으로 흐르는 전구체 스트림 중에서 밀도를 측정하기 위해 형성된 사이토미터를 포함하는, 장치.
  14. 제1항의 방법에 의해 얻어진 질량 스펙트럼으로부터 박테리아를 식별하는 단계를 포함하는, 항생제에 대한 저항력을 갖는 박테리아의 검출 방법:
  15. 하기 단계를 포함하는, 병원에서 환자에게 특별한 치료를 제공할지를 결정하는 방법:
    -환자로부터 생물학적 물질의 시료를 채취하는 단계;
    -상기 시료 및 MALDI 매트릭스 물질을 포함하는 액체를 준비하는 단계;
    -상기 액체의 연속적인 스트림을 생성하는 단계;
    -플라잉 드롭을 형성하기 위해 상기 스트림을 스트림의 연속적인 부분으로 분리하는 단계;
    -미생물의 측정된 밀도에 따른 희석 비율, C*V<1(V는 분리된 부분당 체적임)을 만족하는 미생물의 농도 C에 대응하는 희석 비율로 시료 또는 액체를 희석하는 단계;
    -상기 드롭이 플라이트 시 드롭으로부터 물질을 이온화하는 단계;
    -각각의 드롭 중 하나의 질량 스펙트럼을 측정하는 단계;
    -상기 드롭의 적어도 부분의 질량 스펙트럼이 소정의 미생물의 질량 스펙트럼과 일치할 때 환자를 격리하는 단계.
  16. 하기 단계를 포함하는, 병원에서 소정의 미생물에 감염의 발생을 모니터링하는 방법:
    -적어도 두명의 환자로부터 생물학적 물질의 시료를 채취하는 단계;
    -시료 및/또는 개별 환자의 시료 및 MALDI 매트릭스 물질을 포함하는 액체 또는 액체들을 제조하는 단계;
    -상기 액체 또는 액체들의 연속적인 스트림 또는 연속적인 스트림들을 생성하는 단계;
    -플라잉 드롭을 형성하기 위해 상기 스트림 또는 스트림들을 연속적인 부분으로 분리하는 단계;
    -미생물의 측정된 밀도에 따른 희석 비율, C*V<1(V는 분리된 부분당 체적임)을 만족하는 미생물의 농도 C에 대응하는 희석 비율로 시료 또는 액체를 희석하는 단계;
    -상기 드롭이 플라이트 시 드롭으로부터 물질을 이온화하는 단계;
    -각각의 드롭 중 하나의 질량 스펙트럼을 측정하는 단계;
    -상기 드롭의 적어도 부분의 질량 스펙트럼이 소정의 미생물의 질량 스펙트럼과 일치할 때 감염 경보를 발생시키는 단계.
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