CN102187426A - 用于识别生物材料的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

使用MALDI-MS(基质辅助激光解吸和电离质谱)技术在试样中检测生物材料。准备包含试样和MALDI基质材料的液体，并将其用于形成液体的连续流束。将该流束分散成接连的部分，以形成发射到飞行中的液滴，或将流束发射到飞行中，然后分散成液滴。可使用从喷墨印刷机中已知的液滴形成技术。对飞行中的液滴电离出材料。测量来自各个液滴的电离材料的质谱。优选地，在液滴形成之前将液体稀释到大多数液滴均为每个液滴最多含有一个微生物的水平。

Description

用于识别生物材料的方法和装置
技术领域
本发明涉及对液体中的生物材料的识别。
背景技术
已经知道可使用质谱分析法来识别生物材料，比如微生物(如细菌、病毒)、细胞、多肽等。
例如，MALDI-MS(基质辅助激光解吸-电离质谱分析)涉及包含微生物的试样材料的激光电离和电离颗粒的质谱分析。在MALDI-MS中，通过在靶板上提供微生物和基质材料的混合物来准备用于电离的微生物。当混合物干燥时，基质材料会粘附在微生物上，这导致了具有较低能量的软电离，其可保存较大的分子碎片以用于分析微生物的组成。朝向靶板上的选定目标位置进行激光轰击，以便从这些目标位置中电离出材料。对每个目标位置，对产物进行质谱分析。
已发现MALDI-MS非常适合实验室分析，但是仍存在一些问题。对于不同类微生物的混合物试样来说，用单一激光轰击来从不同种类微生物的混合物中电离出材料会导致各个物种的识别复杂化，这是很危险的。即使在靶板上可发现孤立的单一微生物，也不可能在由激光轰击所电离的所有材料的噪声中检测到它。在MALDI-MS中，当例如取自患者体内的原始试样包含不同类微生物的混合物时，通过使用初始培育步骤可克服这些问题。培育可用于保证在单一激光轰击中产生主要为一种的大量微生物。然而，培育可能要占用一天的时间。结果，如果在采集体内试样和提供分析结果之间需要短的周转时间，实际上MALDI-MS就不适用了。这限制了其应用。
例如在一个例子中，在将入住病人转移到MRSA细菌会造成伤害的环境中之前，希望从病人处获得试样，并且在存在于试样中的众多微生物中识别出MRSA细菌。为了能实际使用，优选应当在最多几个小时内就获得此检测的结果。培育微生物的需要阻止了传统MALDI-MS用于此目的的实际使用。
从A.L.van Wuijckhuijse等撰写并发表于期刊《Journal of Aerosol Science》第36卷第677-697页(EPO参考XP004936536)的题为《Matrix-assisted laser deporption/ionization aerosol time of flicght mass spectroscopy for the analysis of bioaerosols：development of a fast detector for airborne biological pathogens》的文章中得知了采用MALDI-MS来进行微生物识别。该文献描述了使用喷雾器来喷洒通过稀释单一培养的细菌试样到预定值而产生的溶液。在该文献中所提及的雾化无法保证液滴具有相同的尺寸。结果，每个液滴中的细菌数量是变化的，然而由于仅使用一个种类的细菌，因此这并不重要。此外，该文献中的雾化方法需要使用较大的试样量，即使在少量液滴上分配时也是如此。
从WO02052246中得知了一种用于检测并识别生物气溶胶颗粒的装置。该装置收集包含生物气溶胶颗粒的空气，并通过喷嘴将带有颗粒的空气送入分析室中。在分析室中检测带有微生物的颗粒，并且电离所检测的颗粒。由于在从大气压到质谱仪所用的高真空的转换过程中很多颗粒会丢失，因此该装置需要相对大量的颗粒。所测试的颗粒相比于所捕捉的颗粒的效率可低至百分之一。
从美国专利申请2005/0230615得知了一种MALDI-IM(离子迁移率)测量技术，其中液滴通过震荡孔板气溶胶发生器来形成。然而它并未公布关于液滴中的微生物的信息。如果液滴包含有微生物，那么使用MALDI-IM将导致识别这些微生物即使不是不可能也是很困难的。
从Hookeun Lee等撰写并发表在期刊《Anal.Chem.》2003，75，2746-2752的题为《Analysis of Whole Bacterial Cells by Flow-Field Flow Fractionation and Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectroscopy》的文章中得知了使用流体场流分离仪(FFFF)来制备用于MALDI-MS的靶板。该文献显示了当使用靶板时可采用FFFF来分散完整的细菌细胞，以提高用于MALDI-MS的细胞密度。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种识别生物材料的方法和装置，其可基于带有不同类型微生物如细菌、真菌和病毒的混合物的液体试样来快速提供结果。
本发明提供了一种识别试样中的包含有微生物的生物材料的方法，该方法包括：
-准备包含试样和MALDI基质材料的液体；
-产生液体的连续流束；
-将流束分散成流束的接连的部分，以形成飞行的液滴；
-根据微生物的测量密度来将液体稀释到与微生物的密度C相一致的稀释水平，其中C满足关系式C*V＜1，V是每个所分散部分的体积；
-从飞行中的液滴中电离材料；
-测量所电离材料的质谱。
这里，通过将包含来自试样的生物材料和MALDI基质材料(例如晶体形成基质材料)的液体的流束分散成流束的接连部分来形成液体的飞行液滴。例如，可使用带有压电元件的有源液滴形成器。对飞行中的液滴进行电离和质谱分析。通过这种方法，可以不需要靶板并消除其缺点，同时可实现高效率。液滴在飞行中会变干，使得在电离时变干的液滴成为干燥颗粒。这里所用的用语“液滴”包括通过干燥液滴而形成的干燥颗粒。优选地，测定每个来自各液滴的材料的质谱。
试样或液体被稀释到与其中微生物的密度C满足关系式C*V＜1的浓度相一致的稀释水平，这里V是液体的所述部分的体积。因此，平均在单个液滴的液滴体积中将会有少于一个微生物或细胞。因此，可以保证能获得数量可观的每个液滴含有一个微生物或细胞的液滴的测定结果。结果，可以获得单个微生物和/或细胞的质谱。
在一个实施方案中，稀释水平可与试样中的细胞和/或微生物的浓度相适应。可采用密度检测器来测定浓度，例如通过对所检测微生物计数，并且采用所测定的浓度来控制稀释。密度检测器可包含(流式)细胞仪，其定位成例如通过对流束或前体流束中的微生物进行计数来检测流束中的密度，其中前体流束在将MALDI基质加入到前体流束中时注入到流束中。
在一个实施方案中，在产生了带有试样和基质材料的流束的位置之后，流束流向液滴形成器而无任何重大的轴向重排列。即，一旦已加入了基质材料或至少在稀释之后，液体被分散成的那些部分对应于流束的接连部分。这样便降低了液滴带有多个微生物的可能性。这可通过使用细胞仪来测量该流束中的密度并基于该测量来控制稀释来改进。在一个实施方案中，可通过在流束产生处的下游将载液混合到流束中来进行稀释。这也降低了液滴带有多个微生物的可能性。
在一个实施方案中，用于识别试样中的生物材料的装置包括：
-流束产生器，其配置为可提供其中已经混合有试样和MALDI基质材料的液体的连续流束；
-混合单元，其包括混合器和用于测量微生物密度的检测器，根据微生物的测量密度来控制混合器的稀释水平，使之到与满足关系式C*V＜1的微生物浓度C相一致的稀释水平，其中V是每个分散部分的体积；
-液体部分分散器，其配置为将流束分散成流束的接连部分，并提供由沿飞行路径在飞行中的所述部分形成的液滴；
-辐射源，其指向飞行路径，并且配置为提供用于电离来自液滴的材料的辐射；
-质谱仪，其配置为获得来自单个液滴的所电离材料的质谱图。液体部分分散器可为液滴形成器，其例如包括压电谐振器。
在另一实施方案中，装置的液体部分分散器包括气体流束供给出口和用于将液体流束供给到配置为形成气体动力喷嘴的出口的导管。
在另一实施方案中，该装置包含稀释单元，其配置为将稀释剂添加到试样或液体中，以达到与平均在单个液滴的液滴体积中少于一个微生物的浓度相一致的稀释水平。作为替代，可使用其中大多数液滴包含最多一个来自试样的微生物的浓度。在另一实施方案中，稀释单元包括密度检测器，其配置为检测试样或带有试样的液体的密度，并且根据所检测的密度来控制稀释到所述的水平。
在一个实施方案中，液体部分分散器可配置为直接将液滴发射到进行电离的真空空间中。
在另一实施方案中，该装置包括控制单元，其配置为使液滴形成和源自辐射源的脉冲产生同步。
附图说明
通过对示例性实施方案的描述可以清楚这些和其它的目的以及有利的方面。
图1显示了用于识别微生物的装置；
图2显示了带有荧光屏的识别装置；
图3显示了带有超声分散器的识别装置；
图4显示了另一识别装置；
图4a-c显示了液体流束分散器的例子；
图5-7显示了识别装置的实施方案。
具体实施方式
图1示意性地显示了用于识别生物材料的装置。尽管就该装置而言将描述其在微生物识别中的应用，然而应当理解，该装置仅是能够对飞行液滴进行MADLDI质谱分析的装置的一种实施方案。应理解的是，除了微生物以外也可使用其它生物材料，比如细胞(如血细胞、多肽等)。
装置包括试样接收器10、导管11、第一混合单元12、第二混合单元14、小室15、压电谐振器16、控制回路17、脉冲激光器18和质谱分析仪19。压电谐振器16可为用在喷墨打印机中以形成墨滴的那种类型。导管11将试样接收器10、第一混合单元12、第二混合单元14和压电谐振器16串联式相连。控制回路17与压电谐振器16和脉冲激光器18相耦合。
压电谐振器16位于小室15中。导管11从第二混合单元14通入到穿过压电谐振器16的开口。脉冲激光器18指向从该开口发射出的穿过小室15的液滴的飞行路径。质谱分析仪19与小室15相连，并且定位成接收由在飞行路径中的液滴吸收来自脉冲激光器18的辐射而造成的电离碎片。
在操作中，将包含来自试样接收器10的试样材料、来自第一混合单元12的稀释剂和来自第二混合单元14的基质材料的液体流束分散成多个部分，其中每个部分均形成发射为穿过小室15飞行的小液滴。在穿过小室15的飞行期间，当液滴在飞行中变干时液滴中的基质材料会在微生物的周围结晶，形成干燥的颗粒。随后，脉冲激光器18对干燥的颗粒发射激光脉冲。这导致干燥颗粒中的材料的电离。在质谱仪19中分析所电离的材料。
例如可使用直径在1-100微米范围中的液滴。优选使用具有处于该范围中的几乎完全相同尺寸的液滴，这可通过在规则的间距处打断液体流束、例如通过在平均流速恒定的流束上施加适当频率的周期性干扰来实现。
由于此小尺寸的液滴，在飞行期间仅需很少的时间来使液滴为电离做好准备。由于该准备发生在飞行中，可形成带有包围在微生物所有侧面的基质材料的微生物。就像在传统的MALDI-MS情况中一样，在液滴和靶板之间的界面处没有晶核产生。优选地，稀释速率与液滴尺寸的组合选择成使得大多数带有微生物的液滴包含不超过一个微生物。例如，可使用与平均在液滴体积中最多一个微生物的浓度相一致的稀释水平。
由于脉冲激光器18每次朝向一个干燥的颗粒发射，所以来自带有一个微生物的液滴的颗粒的每个测定质谱仅代表一个微生物。而且，液滴的使用意味着被电离试样的尺寸由液滴的尺寸和液滴中所溶解和分散的材料的量所确定。这与传统的MALDI-MS相反，在传统的MALDI-MS中，试样的尺寸由靶板上的远大于液滴尺寸的激光斑的尺寸决定，因此有更多的材料电离，这会在质谱中导致增加的“噪声”水平。另外，不同微生物的混合物也会被电离。
进行了实验，其显示出可以区分具有或不具有青霉素抗性的单个金黄色葡萄球菌。在该实验中使用了包含试样材料、稀释剂和基质材料的液体气溶胶。通过脉冲激光器对单个颗粒(真空干燥的液滴)进行电离，并获得电离材料的质谱。结果发现，基于其质谱可将带有具青霉素抗性的金黄色葡萄球菌的颗粒和带有不具青霉素抗性的金黄色葡萄球菌的颗粒区分开。
第一混合单元12用作稀释单元。它包括第一混合器120、稀释剂储存器122和检测器124。稀释剂储存器122与第一混合器120相连以提供稀释剂，第一混合器120配置为将稀释剂与来自试样接收器10的试样材料相混合。检测器124可为光学检测器，其配置为当微生物流过测量光束、例如在带有微生物的液体于其中流通的导管中时检测散射自单个微生物的光。通过在平均每单位时间间隔中检测到的微生物的计数，便可确定密度。在另一实施方案中，测量来自包含了稀释剂和来自试样接收器10的材料的第一混合器120中的液体的光散射强度。
这种类型的检测器本身是已知的。可使用已知类型的细胞仪或流式细胞仪。如所知的那样，细胞仪是一种检测生物材料密度的局部波动的装置，该波动与相对于邻近液体为背景的单个微生物中的材料的空间浓度之间的差异相对应。例如，在带有微生物的液体所流过的位置处可检测到瞬时波动，或者通过扫描检测位置可检测到空间波动。例如可使用这样的光学检测，其使用的装置提供了荧光的检测，或者聚焦到尺寸小于每微生物的最大液体体积的小区域中的其它光学特性的检测。可使用一个或多个检测器，在材料如NADH发射荧光(其为微生物的特征)的波长下检测荧光。也可使用其它光学特性，比如散射、衍射等。
颗粒检测器124显示为与第一混合器120的控制输入端相连。控制机构设置为可提高加入到试样中的稀释剂的量，直到测量密度已经降低到或低于预定的密度。可采用液体循环回路来沿稀释剂注入点而循环所稀释的试样，直到达到所希望的密度。在操作中，可采用控制计算机(未示出)来接收来自密度检测器124的测量数据，并且基于此数据产生混合器的控制信号。
在操作中，将包含微生物的液体试样提供到试样接收器10中。泵(未示出)将试样材料经导管11泵送到第一混合单元12中。第一混合器120将稀释剂加入到试样材料中。例如可采用水或乙醇作为稀释剂。可使用分批式处理，其中可将一批试样材料提供到第一混合回路12中，其后接着处理该批次而不从试样接收器10中获取其它材料，直到该批次已被处理完并已经离开第一混合单元12。例如可使用处于0.01到10毫升范围内的批次大小。
采用反馈回路来提高稀释速率，直到通过密度检测器124所观测到的密度已经降到预定的水平。作为反馈的替代还可使用前馈方法，其中测量初始密度并采用最终水平来将所加入稀释剂的量控制到预定水平。在一个实施方案中，该预定水平选择成使得大多数液滴将包含一个微生物或更少。该水平可设置成使得达到平均每个液滴少于一个微生物，或平均每个液滴中四到四分之一个微生物。应注意的是，液体中的微生物的整体计数得到满足就可以了，不必指定微生物的类型。因此，可保证仅具有一个任何类型微生物的液滴的合理数量。
结合由液滴形成的参数设定来控制的液滴尺寸，并使用来自检测器124的测量结果和微生物的浓度之间的关系来选择实际水平。在一个实施方案中，这个水平在校正步骤期间基于对液滴部分的观测(其中通过质谱仪观测液滴中的来自微生物的材料)来试验性地设置，通过调整该水平直到包含一个微生物的液滴的比率处于例如所产生质谱的十分之一到一半的预定水平为止。在一个例子中，可使用稀释率为试样对稀释剂在一比五之间的稀释。
应注意的是，第一混合单元14中的反馈用于保证具有不同微生物浓度的试样不会导致大的效率变化(就未包括微生物的无用液滴的数量而言)，或者不会导致数量可观的包含多于一个生物体的液滴。如果可预先控制浓度，则可不需要反馈或密度确定。类似的，如果已知浓度不会高得致使在预定的稀释后留存有数量可观的带有多个生物体的液滴的风险，并且一定的效率损失是可接受的话，那么可以省略反馈或密度确定。在此情况下可使用预定的稀释率，或者可以省略第一混合单元12。
第二混合单元14包括第二混合器140和基质材料储存器142。基质材料储存器142与第二混合器140相连，以向第二混合器140提供基质材料，第二混合器140配置为可将基质材料与来自第一混合单元12的稀释的试样材料相混合。
在操作中，液体从第一混合单元12移向第二混合单元14。尽管为了该目的而显示出了导管11，然而应理解的是，分批操作的液体可以任何方式移向第二混合单元14。在另一实施方案中，第二混合单元14可与第一混合单元14相结合。在第二混合单元14中加入了MALDI基质材料。MALDI基质材料在现有技术中是已知的。可使用适合于结晶粘附在微生物上并具有适于吸收激光脉冲以电离来自微生物的材料的光吸收波段的基质材料。已知有多种适当的基质材料。不会形成晶体的MALDI基质材料也是已知的。可使用针对特定类型的生物体或特定有机材料的MALDI基质材料，但是作为替代也可使用适用于更宽范围的生物体和/或有机材料的MALDI基质材料。第二混合单元14可配置为添加足量的MALDI基质材料，以提供大约为100∶1到10000∶1的基质与分析物摩尔比。
将来自第二混合单元14的液体作为液体的连续流经导管11泵送到穿过压电谐振器16开口中。尽管显示了将第二混合单元14与压电谐振器直接相连的导管11，然而应了解的是，可通过其它任何方式将一批液体从第二混合单元14输送到导管11入口处的位置。在导管11的入口处可使用中间储存器(未示出)。可采用液体泵(未示出)来将液体流束经导管11泵送到压电谐振器16，或者可采用泵来给第二混合单元14中的或液体已流入其中的中间储存器中的液体施加压力，以便于迫使液体流束经导管11流向压电谐振器16。导管11可以较短，使得有效地形成了从第二混合单元14或中间储存器到穿过压电谐振器16的开口的直接连接。
在一个实施方案中，压电谐振器16包括框架、带有液体朝向其流动的20微米开口的孔的膜层，以及连接在膜层和框架之间的压电材料。优选使用至少10微米的开口。压电材料定位成可使孔在液体流动方向上前后移动。在压电材料上提供了电极，以驱动该运动。
在操作中，控制回路17给电极施加高频电激励。例如可使用1kHz到1MHz范围中的频率。高频电压导致开口在液体流动方向上作周期性运动，这导致液体流束破碎成部分，形成液滴。将一系列液滴沿着穿过小室15的飞行路径发射。优选使用激励频率恒定设置的压电谐振器16，以便于产生相同尺寸的液滴。从喷墨印刷技术中已经知道了用于控制液滴尺寸的技术。
尽管已经描述了采用压电谐振器16来将液体流束分散成液滴的示例性实施方案，然而应当了解，也可使用其它的液滴形成技术。
在小室15中保持具有低压的气氛，例如在千分之一毫巴到几毫巴的范围中。该气氛可包含任何气体。在一个实施例中使用标准大气。优选地，从压电谐振器16到电离位置的飞行路径的长度至少如此之长，使得在考虑到液滴速度的情况下穿过飞行路径所需的时间足以例如通过结晶使基质就位。在一个实施方案中，可沿着飞行路径使用一个或多个中间喷嘴除沫器以降低气压，直到达到对于质谱仪合适的水平。在一个实施方案中，质谱仪在接近10-6毫巴或更一般地在低于10-5毫巴的压力下运行。通过在液滴形成阶段使用低启动压力，在达到此压力之前的液滴损失可保持为较低，这提高了装置的效率。所有液滴都沿着相同的飞行路径形成的事实也提高了效率。优选地，将液滴直接注入到真空中，但是有利的是添加一个高压阶段，以提高液滴形成的稳定性。
就几微米(例如在1到10微米之间的范围内)尺寸的液滴而言，液滴在几毫秒或甚至几微秒内就可充分地干燥以实现基质的形成(如结晶)。就20m/s的速度而言，这不会对飞行路径的长度施加严格的约束。可以使用甚至更高的在100-300m/s范围中的速度。
可在压电谐振器16的附近提供气流源(未示出)，以产生沿着飞行路径的气体射流。此射流可有助于降低连续液滴凝聚的几率。
控制回路17控制脉冲激光器18，以产生以相对的相位与压电谐振器16的振动同步的脉冲，使得来自脉冲激光器18的脉冲将会在来自压电谐振器16的液滴穿过激光束的时间点到达飞行路径。这会导致来自液滴的颗粒的电离。质谱仪19分析射出颗粒的质谱。
通过同步激光脉冲与压电谐振器16的激励信号，可实现激光脉冲与压电谐振器16的振动的同步。作为替代，可采用液滴检测器(未示出)来检测在小室15中沿飞行路径的液滴，并且可通过来自此检测器的信号来触发脉冲激光器18。该检测器也可配置为测量液滴的速度，以预测每个液滴的到达时间。作为替代，可采用由实验来确定的预定速度。
可将质谱收集到控制回路17或测量计算机中，并且与对照谱或部分对照谱或已知微生物的生物标志清单进行比较，以识别各个液滴中的微生物的类型。在简单的筛选实施方案中，与少量的对照谱进行对比就足够了。可计算所识别微生物的计数，以通过将该计数与液滴的全部计数或与包括对照类型的微生物或细胞的液滴的计数进行比较来确定所识别的微生物的浓度。在一个更具探索性的实施方案中，可进行与更大数量的对照谱的比较，以识别试样中的微生物类型或细胞类型的范围。
图2显示了使用液滴预筛选的实施方案。这里增加了其它激光器20和荧光检测器22。该其它激光器20具有选定成可激励液滴中的微生物的荧光的波长。例如可使用266nm的波长。该其它激光器20指向液滴在到达电离点之前其飞行路径24的一部分处。可使用连续波激光器，或与液滴形成同步的脉冲激光器。类似地，荧光检测器22指向飞行路径24，以捕捉来自由其它激光器20辐射后的飞行液滴的荧光。荧光检测器22与控制回路17相连，其配置为可导致脉冲激光器有条件地、仅在其中已检测到表示微生物存在的荧光的液滴处发射。此外，可采用其它激光器20来触发发射，即选择发射的时间点。在另一个实施方案中，采用一个或多个激光器来触发发射，使用通过所述一个或多个激光器检测到的时间点和/或液滴速度。这可以不依赖于是否使用了其它激光器20来完成。
在另一实施方案中，在压电谐振器16处液体分散成液滴之前在导管11中检测荧光。在此情况下，其它激光器和荧光检测器指向导管11，并且控制回路17从检测时间、朝向压电谐振器16的流速和压电谐振器16的激励信号中确定其中微生物将被隔离出来的液滴。在导管11中的荧光检测可有助于阻止基质结晶妨碍对来自微生物的荧光检测。
图3显示了一个实施方案，其中装置包含指向试样接收器10或处于试样接收器10和第一混合单元12之间的导管11的超声波源30，其配置为将微生物群簇分散成单个的微生物。此外，超声波源30可用于从已经收集了微生物的试样载体如棉签或滤纸中分离微生物。
用于微生物群簇的超声分离技术是已知的。群簇的分离可用于降低在其中一次存在多于一个微生物的液滴的数量。尽管已经显示了一个其中超声波源30指向试样接收器10的实施例，然而应了解的是，也可设置一个或多个超声波源30指向处在试样接收器10和压电谐振器16之间的任何位置以用于分离群簇。在第一混合单元12之前分离群簇具有的优点是，可获得更可靠的密度确定和更均匀的稀释。
作为使用超声方法分散群簇的替代，也可使用其它分散技术，比如涡流方法，其为已知的且涉及到例如通过振动液体来在液体中产生旋涡。不进行群簇分散所存在的风险是，一些液滴中可能包括微生物群簇。在一些情况、例如当群簇为同质的时，或者当不需要在群簇中的不同类型生物之间进行区分时，这可能不是个问题。
图4a示例性地显示了带有压电谐振器16的分散器的更多细节。导管11终止于穿过周期性地缩窄以发射液滴的压电谐振器16的开口。尽管已描述了采用压电谐振器16将液体流束分散成液滴的实施方案，然而应了解的是也可使用其它的液滴形成技术。例如可使用已知的气体动力喷嘴，其中导管11通向一气体流，当将流束注入到该气体流中时或在其后，所述气体流用于将液体流束分散成小液滴。图4b显示了可使用结构的一个例子，其中导管11的端部通到一更大的提供有气体流的导管50中。因此，在将液体流束注入到气体环境中之后可以形成液滴。优选地，气体和液体的流速以及开口尺寸设定成可获得窄范围的液滴尺寸，这提高了效率并简化了所需要的控制，以保证脉冲激光器18在需要撞击液滴的时刻发射。
在另一个实施方案中，可使用类似于从水龙头中滴水的液滴分散机理，其中迫使液体流束经导管到导管的开口，并且液滴从开口中断开而形成飞行。可利用重力或穿过该开口的气体流来将液滴从开口中断开。在该实施方案中，可通过选择液体流束的流速、开口的直径和/或形状以及气体流速来控制液滴的尺寸。在另一个实施方案中，可采用如图4c所示的通入导管11的气体入口54来在规则间隔开的距离处将气泡注入到经过导管11的液体流束中。可利用气体入口54中的阀门56来形成气泡。在流束到达导管11的开口之前，气泡将流束分散成一些小段，使得当流束从导管11的开口中被压出来时，每个小段将形成各自的液滴。
如所述，该装置提供用于微生物的识别过程，其中液体流束包含微生物和基质材料。将液体流束打断成液滴，优选地形成单分散的液滴。以沿飞行路径飞行的方式提供液滴。这些液滴在飞行时在真空中变干。所得的干燥颗粒被电离以获得质谱图。在飞行中对这些颗粒进行分析。在所示实施方案中，将液体稀释到大多数带有微生物的液滴仅包含一个微生物的稀释水平。
尽管已经显示了该装置的一个特定实施方案，然而应了解的是，该过程可通过该装置的改进实施方案来完成。例如，作为使用导管11的替代，也可使用可输送的试样承载器，其被可输送到稀释剂混合单元、基质材料混合单元和液滴形成站。如图4所示，通过使用用于同时地或在不同的时间间隔中混合试样、稀释剂和基质材料的混合级42，便可在一个混合单元40中进行稀释剂的混合和基质材料的混合。一部分输送可在导管中进行，另一部分可使用输送单元来进行。可改变稀释和基质材料添加的顺序，或者可将任何混合步骤分成多个混合步骤。
尽管借助于例子描述了对微生物的应用，然而应当了解，该技术可用于识别其它类型的生物材料，比如细胞，例如血细胞或特定类型的此种细胞。试样可包括各种材料的混合物，并且通过结合从不同液滴的质谱中获得的结果，可从试样中识别出多种类型的材料。
在住院许可筛选应用中，生物材料的试样可取自病人，例如取自唾液或取自任何黏膜或血样或尿样或其结合，并且如所述地来处理试样。可采用从其质谱图中得到的液滴中微生物的合成识别，或包含带有质谱图的微生物的液滴计数来决定是否接受病人进行一般治疗，其中该质谱图与有害微生物、比如具有特定抗生素抗力的金黄色葡萄球菌的对照图谱相匹配。可对带有有害微生物的病人再次检查，以用于特别治疗。
类似地，通过从多个病人中取样并如所述地处理试样，可监测带有有害微生物的传染病的爆发。在一个实施方案中，例如如果需要在一组人中识别有害微生物，例如在医院的病房中，可将取自不同病人的试样混合，而不需要挑选出单个的病人。
在诊断应用中，生物材料试样可取自病人，并且如所述地处理试样，以检测带有特定微生物的感染。
尽管描述了带有脉冲激光器的实施方案，其避免了需要连续地提供用于电离的足够能量，然而应了解的是，液滴的分散本质使得能够使用连续波激光。作为激光的替代，也可使用其它类型的光源以提供用于电离至少部分液滴的光。例如可使用紫外光或红外光。除了光，可考虑用于电离的其它方法，例如离子轰击或甚至超声照射。
图5显示了识别装置，其包括试样储存器50、第一载液储存器520、泵522、第一混合级524、流体场流分离仪54、尺寸检测器540、三通阀542、基质储存器550、第二混合级552、第二载液储存器560、第三混合级562、流式细胞仪57和液滴形成器58。泵522、第一混合级524、流体场流分离仪54、三通阀542、第二混合级552、第三混合级562以及液滴形成器58沿着液体流动通道串联连接在一起。第一载液储存器520给泵522的输入端提供进料。试样储存器50给第一混合级524的输入端提供进料。尺寸检测器540与液体流动通道中的处在流体场流分离仪54的下游和三通阀542的上游的部分相连。基质储存器550给第二混合级552的输入端提供进料。第二载液储存器560给第三混合级562的输入端提供进料。流式细胞仪57与液体流动通道中的处在第三混合级562的下游和液滴形成器58的上游的部分相连。
尽管未示出，在沿着液体流动通道的一个或多个位置、例如在三通阀542和第二混合级552之间，该装置可包括用于存储不同量液体的缓冲器。缓冲器可用于降低流速的变化。
在操作中，泵522将载液从第一载液储存器520泵送经过流动通道。例如可采用带有乙酸铵添加剂的水作为载液。在脉冲时间间隔中，第一混合级524将脉冲量的试样液体混合到载液流束中。流体场流分离仪54根据颗粒的尺寸将流束分成暂时的接连的部分。尺寸检测器540检测作为时间的函数的颗粒尺寸，并且根据所检测的尺寸来控制三通阀542，以使液体流到第二混合级552或废料出口。第二混合级552将来自基质储存器560的MALDI基质材料混合到流束中。可使用连续混合。第三混合级562将额外的载液混合到流束中。流式细胞仪57测定流束中微生物的密度。根据所测定的密度来控制第三混合级562的混合速率。液滴形成器58将流束分散成流束的接连部分，并且发射由各个部分所形成的液滴。
流动通道优选地设计成使得流束从第二混合级552流到液滴形成器58而无任何明显的轴向重排。即，在液体通道中避免了液体可在其中积累并混合的较大储存器。结果，液体形成器58将液体所分散的部分与流束的在第二混合级552或至少在第三混合级562之后的接连部分相一致。第三混合级562处的稀释通过将载液混合到流束中来进行。
可采用反馈回路来控制第三混合级562，该反馈回路设计为可根据测量密度“C”是否在预设目标值之上或之下而向上或向下地改变混合率。可使用满足关系式C0*V＝A的预设目标值C0，这里V是其中液滴形成器58将流束分散成的部分的体积，A是小于2、优选小于1的数值；例如可使用值A＝0.2。当密度降到低得使其保持低于预设目标值时(即使未加入载液或加入预定的最小量载液)，第三混合级562的控制可不再依赖于密度。
作为流体场流分离仪54的替代，也可使用任何其它的分离装置，其将带有脉冲试样液体的流束分离成带有逐渐变化的颗粒尺寸的流束。其优点是降低了来自试样的相对小尺寸的材料的量，当这种小尺寸材料存在于液滴中时，其会妨碍微生物的识别。此外，其具有的优点是，可及时调整第三混合级562中的混合速率，以提供在不同部分的微生物之间的微生物密度的差异。因此对于每个部分来说，可以更容易地实现带有单个微生物的液滴。当密度差异甚大的部分同时存在时，这会是困难的。
可使用传统的流体场流分离仪54。例如，在之前引用的Hookeun Lee等撰写的文章中描述了此栏目。简略地说，此装置使用了薄带状开口通道，其中带有试样材料的载液流束从中流过。作为通道中与流动方向垂直的位置的函数，出现不同的流动速度。通过外场，对颗粒的不同部分可实现不同的横向密度分布。可使用比如电场、所施加的温度梯度、重力场等的外场。密度分布起因于在场效应和抵消密度梯度的扩散之间的平衡。结果，在流体场流分离仪54的出口处将出现按时间分散的不同部分，留下完整的微生物。
尺寸检测器540用于检测出现部分的颗粒的尺寸。当使用严格控制的流体场流分离方法时，可以省略尺寸检测器540。在此情况下，例如可由计时器来控制三通阀542，该计时器限定了用于在试样材料脉冲后的预定延迟处使液体流向第二混合级552的时间间隔。尺寸检测器540可配置为测量作为尺寸测定的光散射，然而也可使用其它技术，比如导电性测量或荧光检测。
流式细胞仪57可包括荧光检测器，其配置为可检测流经液体中的归因于微生物的荧光暂时峰。例如可使用波长与NADN相一致的荧光。可采用每时间单位内此峰的计数作为控制第三混合级562的密度信号。在一个实施方案中，采用来自流式细胞仪57的单个微生物的检测来促使脉冲激光器(未示出)的激光发射，当流式细胞仪57在形成液滴的液体流束部分中未检测到微生物时，不在该液滴处进行发射。当微生物液滴的密度低于第三混合级562根据微生物密度而混合载液的水平时，可采用发射控制来保持质谱仪的效率。
图6显示了带有处于流式细胞仪57和液滴形成器58之间的附加三通阀60以及与流式细胞仪57相连的控制输入端的装置。在操作中，采用单个微生物的检测来控制该附加三通阀60，当检测到微生物时使液体流到液滴形成器58，否则则流到废料出口。这样便可将无用液滴的数量减至最小。当微生物液滴的数量低于第三混合级562根据微生物密度来混合载液的水平时，可采用对废料出口的控制来保持质谱仪的效率。在一个实施方案中使用对液滴形成器58的“按需”控制，以在未将液体送到废料出口时触发液滴形成。图7显示了其中流式细胞仪57位于第三混合级562上游的装置。因此，根据所检测的微生物的密度和混合速率之间的预定关系，可以实现前馈控制。可使用下面的关系式
Fadd＝Norg*Vdrop/A-Fin
这里，Fadd是来自第二载液储存器560的混合流速，Norg是每单位时间所检测微生物的进入密度，Vdrop是形成液滴的液体部分的体积，A是期望密度，A优选小于1，例如A＝0.2。在图5和6的反馈方法中，通过反馈来实现该关系。通过计数检测到的微生物或从连续检测之间的时间距离中可确定密度。在一个实施方案中，可根据每个微生物的检测来控制图7所示实施方案中的第三混合级562，根据在生物体的连续检测之间的时间距离来控制混合速率，当该时间距离减小时增加所加入的载液的量。
图7的前馈方法的优点是，其使得能对更小的试样提供检测。前馈控制方法可与使用附加三通阀60(未示出)或促使发射相结合。在此情况下，控制是统计意义上的，当仅有低百分比的液滴包含微生物时，则阻止发射。尽管显示了其中流式细胞仪57位于第二混合级552和第三混合级562之间的实施方案，然而应当了解的是，流式细胞仪57也可位于第二混合级552的上游。在此情况下，在加入MALDI基质材料之前测量密度。当第二混合级552设计为以已知速率添加MALDI基质材料时，可将在第二混合级552之前的流束中的微生物密度转换为在此级之后的密度。为了更好地控制，流式细胞仪57优选位于第二混合级552之后。
来自图7的细胞仪57的密度测量可用于控制激光发射和/或附加三通阀(未示出)。该附加三通阀可安装在与图6中的三通阀60类似的位置，或在流式细胞仪57和第三混合级562之间。在一个实施方案中，可用细胞仪代替尺寸检测器54，在检测到微生物的至少密度阈值时，其可控制三通阀542以使液体流到第二混合级552。在此情况下，通过第三混合级562，此细胞仪也可用于控制稀释。尽管所示的单个细胞仪兼有多个用途，但是应了解的是，作为替代可使用多个细胞仪，每个用于执行这些用途中的各自的一个或一组。
在一个实施方案中，可采用液滴形成器58上游的流式细胞仪来控制脉冲激光器18的发射，甚至不用控制稀释。例如当已知微生物的密度不会过高时，这是可使用的。在另一个实施方案中，当检测到微生物或检测到微生物的密度超过阈值时，可采用液滴形成器58上游的流式细胞仪来控制三通阀，以便有选择地向液滴形成器58提供液体。这甚至可在不控制稀释的情况下完成。可以使用激光发射与三通阀控制的结合。
因此，提供了一种用于识别试样中的生物材料的装置，该装置包括
-流束发生器，其配置为提供液体的连续流，其中已经将试样和晶体形成基质材料相混合；
-液体部分分散器，其配置为将流束分散为流束的接连部分，并且提供由所述部分形成的沿飞行路径飞行中的液滴；
-辐射源，其指向飞行路径，并且配置为提供辐射以用于电离来自液滴的材料；
-质谱分析仪，其配置为获得来自单个液滴的电离材料的质谱图；和
-细胞仪，其位于流束发生器和液体部分分散器之间并配置为检测流束中的微生物，细胞仪与辐射源和/或流动路径选择器相连，使得可根据微生物的检测导致辐射源和/或控制选择将流束引向液体部分分散器或其它地方。这样，装置可以更高的效率处理微生物的小试样。
尽管已经描述了三通阀的使用以实现流动路径选择器，以在用于进一步处理的流经液体和废料液体之间进行切换，然而应了解的是，为此可使用其它类型的阀门，比如歧管。
可以平行的方式使用带有流体场流分离仪54的多个分支，以便处理不同的试样。每个分支可包含与上面相一致的部件，并且例如包括三通阀542。可采用液体歧管来将这些分支与第二混合级552的输入端依次连接。因此，即使流体场流分离仪需要较多的时间，也可有效地使用该装置。
提供了一种识别试样中的生物材料的方法，该方法包括：准备包含试样和MALDI基质材料的液体；形成液体的连续流束；将流束分散成接连的部分以形成飞行的液滴；电离来自飞行中液滴的材料；以及测量所电离材料的质谱。
生物材料包括微生物。该方法可包括将试样或液体稀释到与平均在单个部分的体积中少于一个微生物的浓度相一致的稀释水平。可测量稀释水平并控制稀释，以继续进行直到将液体稀释到所述浓度。在分离步骤前可对试样或液体实施群簇分离步骤，以将微生物群簇分散成单个的微生物。
可将液体分散成体积大体相等的部分，例如通过在所述流束中在规则的间隔处分散连续部分。在将其从流束中分散出来的期间或其后，可将液体的接连部分发射到飞行中。作为替代，可将流束发射到飞行中，并且当流束在飞行中时将流束分散成连续部分。在电离步骤之前，液滴会在飞行中变干，至少到在飞行中形成了基质材料晶体的干燥水平。可沿着飞行中的液滴轨迹的至少一部分施加气体射流。在所述电离之前基于荧光来检测液滴，并且仅电离带有已检测到产生了至少预定荧光强度的液体部分的液滴。
提供了用于识别试样中的生物材料的装置，该装置包括：配置为准备液体的混合器，其中将试样和晶体形成基质材料相混合；配置为提供液体的连续流束的流束发生器；配置为将流束分散成部分并且提供形成自沿飞行路径在飞行中的所述部分的液滴的液体部分分散器；指向飞行路径并配置为提供用于电离来自液滴的材料的辐射线的辐射源；以及配置为获得来自单个液滴的电离材料的质谱图的质谱分析仪。

Claims (16)

1.一种识别试样中包含微生物的生物材料的方法，该方法包括：
-准备包含试样和MALDI基质材料的液体；
-产生液体的连续流束；
-将所述流束分散成流束的接连的部分，以形成飞行液滴；
-根据所述微生物的测量密度来将液体稀释到与微生物的密度C相一致的稀释水平，其中C满足关系式C*V＜1，V是每个所分散部分的体积；
-从飞行中的液滴中电离材料；
-测量所电离材料的质谱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括使用细胞仪来测量流束中的微生物的密度，并且根据细胞仪的输出结果来控制所述稀释。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述稀释的上游对所述流束或前体流束进行使用所述细胞仪的在流束中的测量，其中所述前体流束在将MALDI基质加入到所述前体流束中时流入到所述流束中。
4.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过在流束产生处的下游将载液混合到流束中来执行所述稀释。
5.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，包括将所述测量密度与阈值相比较，并且在密度低于阈值时不进行所述电离。
6.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在所述稀释的下游和将流束分散成部分的上游使用细胞仪来测量密度，该方法包括根据由细胞仪对微生物的检测来选择用于所述电离的单个部分。
7.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，包括：将液体分散成连续地包含不同尺寸颗粒的液流、稀释该液流、在所述分散之后测量微生物的密度，以及根据微生物的测量密度来控制所述稀释。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述分散包括施加流体场流分离技术。
9.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，包括将液体分散成体积大体相等的部分。
10.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，包括在分散步骤之前对试样或液体施加群簇分散步骤，以将微生物的群簇分散成单个的微生物。
11.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，包括根据关系式F＝Norg*Vdrop/A-Fin来控制用于稀释液体的载液的流速F，其中Norg是每单位时间检测到的微生物的进入密度，Vdrop是用于形成液滴的液体部分的体积，Fin是流束的进入流速，A是小于1的目标密度。
12.一种用于识别试样中的生物材料的装置，该装置包括
-流束产生器，其配置为提供其中已经混合有试样和MALDI基质材料的液体的连续流束；
-混合单元，其包括混合器和用于测量微生物密度的检测器，根据微生物的测量密度来控制混合器的稀释水平，使之到与满足关系式C*V＜1的微生物浓度C相一致的稀释水平，其中V是每个分散部分的体积；
-液体部分分散器，其配置为将流束分散成流束的接连部分，并提供由沿飞行路径在飞行中的所述部分形成的液滴；
-辐射源，其指向飞行路径，并且配置为提供用于电离来自液滴的材料的辐射；
-质谱仪，其配置为获得来自单个液滴的所电离材料的质谱。
13.根据权利要求12所述的装置，其特征在于，所述检测器包括细胞仪，其配置为测定流束中的或前体流束中的密度，所述前体流束在将MALDI基质加入到前体流束时流入所述流束中。
14.一种检测具有抗生素抗力的细菌的方法，包括通过由权利要求1的方法获得的质谱来识别该细菌。
15.一种在医院中确定是否对病人给予特殊治疗的方法，该方法包括
-从病人处采集生物材料的试样；
-准备包含试样和MALDI基质材料的液体；
-产生液体的连续流束；
-将流束分散成流束的接连部分，以形成飞行的液滴；
-根据微生物的测量密度将试样或液体稀释到与满足关系C*V＜1的微生物的浓度C相一致的稀释水平，其中V是每个分散部分的体积；
-当液滴在飞行中时从液滴中电离材料；
-测量单个液滴的质谱；
-当至少一部分液滴的质谱与预定微生物的质谱相匹配时，隔离病人。
16.一种在医院中监测带有预定微生物的传染病暴发的方法，该方法包括
-从至少两个病人处采集生物材料的试样；
-准备包含来自各个病人的试样和/或多个试样以及MALDI基质材料的液体或多个液体；
-产生液体或多个液体的连续流束或多个连续流束；
-将流束或多个流束分散成接连的部分以形成飞行的液滴；
-根据微生物的测量密度将试样或液体稀释到与满足关系式C*V＜1的微生物的浓度C相一致的稀释水平，其中V是每个分散部分的体积；
-当液滴在飞行中时从液滴中电离材料；
-测量单个液滴的质谱；
-当至少一部分液滴的质谱与预定的微生物的质谱相匹配时，发出传染病警报。
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