KR20110041123A - 오메가-3 불포화 지방산과 아스코르빈산과의 복합체의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 오메가-3 불포화 지방산과 아스코르빈산을 리파아제 존재하에서 축합시켜 오메가-3 불포화 지방산과 아스코르빈산과의 복합체를 제조하는 방법에 있어서, 상기 축합이 이온성 용매(ionic liquid); 또는 이온성 용매와 유기용매와의 혼합 용매 중에서 수행되는 것을 특징으로 하는 오메가-3 불포화 지방산과 아스코르빈산과의 복합체의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따른 제조방법은 고농도의 아스코르빈산의 용해가 가능한 용매 시스템을 사용함으로써, 수율 및 부피당 생산성을 현저하게 높일 수 있으므로, 생산성을 획기적으로 향상시킬 수 있다.
오메가-3 불포화 지방산, 아스코르빈산, 복합체

Description

오메가-3 불포화 지방산과 아스코르빈산과의 복합체의 제조방법{Process for preparing a complex of omega-3 unsaturated fatty acid and ascorbic acid}
본 발명은 오메가-3 불포화 지방산과 아스코르빈산과의 복합체의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 리파아제를 이용한 효소적 축합반응에 있어서 특정 용매 시스템을 사용함으로써 수율을 현저하게 증가시킬 수 있는 오메가-3 불포화 지방산과 아스코르빈산과의 복합체의 개선된 제조방법에 관한 것이다.
오메가-3 불포화 지방산(ω-3 unsaturated fatty acid)은 오메가-3 고도 불포화 지방산(ω-3 highly unsaturated fatty acid) 또는 고도불포화 지방산(polyunsaturated fatty acid, PUFA)라고도 불리우며, 대표적으로는 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid, DHA), 에이코사펜타엔산(Eicosapentaenoic aicd, EPA), 아라키돈산(Arachidonic acid, ARA), 도코사펜타엔산(Docosapentaenoic aicd, DPA), 및 α-리놀렌산 등이 알려져 있다. 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산은 체내에서 합성되지 않는 필수 지방산의 일종으로서, 주로 식품을 통해서 섭취하여야 한다.
도코사헥사엔산은 인간이나 동물의 망막, 정액 및 두뇌조직에 풍부하게 존재 하며, 특히 두뇌 지방의 60%를 구성하고 있는 필수 지방산이다. 도코사헥사엔산은 아라키돈산(arachidonic acid, ARA)과 함께 유아의 두뇌, 눈, 신경체계의 건강한 발달을 위해 중요한 것으로 알려져 있다. 또한 최근에는 암부터 관절염에 걸친 수많은 질병과 심혈관 질환 및 정신적인 장애의 예방과 치료에 효과가 있음이 보고되고 있다(박덕천, 식품세계, 5, 87-93(2004)).
오메가-3 불포화 지방산은 산소에 의하여 쉽게 산폐되어, 어유 가공식품의 경우 원료로 사용했던 어유의 비린내가 재발됨으로써 제품의 풍미가 현저하게 나빠지는 문제점이 있다(Terao et al. 1992, Adachi et al. 1995).
이러한 단점을 극복하기 위하여, 지용성 천연 항산화제인 알파-토코페롤을 함께 배합하여 조성물 형태로 사용하는 것이 제시된 바 있으나, 알파-토코페롤 또한 열과 산소 등 외부 요인에 불안정한 문제점이 있다. 즉, 알파-토코페롤이 산화되어, 비가역적으로 알파-토포페롤 퀴논으로 변환될 수 있는 불안정한 에폭사이드를 생성함으로써 식품내에서 그 기능을 발휘하기도 전에 산화되어 버리는 문제점이 있다(식품과학과 산업 6월호, 2002).
또한, 항산화제로서 비타민 C로 불리는 아스코르빈산을 오메가-3 불포화 지방산과 에스테르 결합시켜 복합체화하는 것이 제안된 바 있다. 즉, 아스코르빈산은 강력한 항산화 효과에도 불구하고, 화학구조의 특성상 수용성 성질을 가지므로 식품 및 화장품 등의 응용에 있어서 제한을 초래하였으나(Youchun Yan et al. 1999), 이러한 문제점을 극복하기 위하여 아스코르빈산의 지방산 에스테르 형태로 제조하는 것이 제안된 바 있다. 얻어진 복합체 즉 지방산 에스테르는 에스테르 결합에 의 해 아스코르빈산의 6-위치에 오메가-3 불포화 지방산가 결합된 형태로서, 화학구조상 양쪽성 성격으로 인해 지용성 환경에서의 용해도 및 항산화 효과를 증진시키는 것으로 알려져 있다(XY Liu et al. 1996).
상기 아스코르빈산과 오메가-3 불포화 지방산과의 복합체는 화학적 합성방법 또는 효소적 합성방법을 통해 제조할 수 있다. 예를 들어, 화학적 합성방법은 오메가-3 불포화 지방산 및 아스코르빈산을 디시클로헥실 카르보디이미드와 같은 커플링화제를 사용하여 축합시켜 제조하거나, 혹은 오메가-3 불포화 지방산을 산 클로라이드(acid chloride) 형태로 전환하여 아스코르빈산과 반응시킴으로써 제조할 수 있다(미국특허 제6,069,168호 참조). 그러나, 화학적 합성방법은 벤젠 등 건강에 해로운 유기용매를 사용하여야 하며, 아스코르빈산의 불안정성으로 인해 반응부산물이 생성되는 단점이 있다.
한편, 효소적 합성방법은 오메가-3 불포화 지방산 및 아스코르빈산을 아세톤과 같은 유기용매에 용해한 후, 리파아제를 이용해 축합시켜 아스코르빈산과 오메가-3 불포화 지방산과의 복합체 즉, 아스코르빈산의 6-위치에 오메가-3 불포화 지방산이 에스테르 결합으로 결합된 복합체를 제조한다 (Yoshiyuki Watanabe et al., JAOCS, 2001, 78, 823). 상기 복합체는 실리카겔 크로마토그래피에 의해 임의로 정제될 수 있다. 그러나, 종래의 효소적 합성방법은 수율이 매우 낮고, 또한 부피당 생산성(Volumetric Productivity, VP)이 낮다는 문제점이 있다. 예를 들어, 상기 공지된 제조방법에서의 부피당 생산성(g/L)은 28g/L 정도에 불과하다.
본 발명자들은 효소적 합성방법에 있어서의 문제점 즉, 낮은 수율 및 낮은 부피당 생산성(Volumetric Productivity, VP)을 해결할 수 있는 개선된 제조방법을 개발하기 위하여, 다양한 연구를 수행하였다. 본 발명자들은 다양한 조건을 검토하던 중, 부피당 생산성의 저하가 유기용매 중 아스코르빈산의 낮은 용해도로 인하여 발생된다는 것을 발견하였으며, 특정 이온성 용매(ionic liquid)를 사용하여 고농도의 아스코르빈산의 용해가 가능하도록 용매 시스템을 구성할 경우 이러한 문제점이 해결될 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 오메가-3 불포화 지방산과 아스코르빈산과의 복합체를 높은 수율 및 부피당 생산성으로 제조할 수 있는 효소적 합성방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 오메가-3 불포화 지방산과 아스코르빈산을 리파아제 존재하에서 축합시켜 오메가-3 불포화 지방산과 아스코르빈산과의 복합체를 제조하는 방법에 있어서, 상기 축합이 이온성 용매(ionic liquid); 또는 이온성 용매와 유기용매와의 혼합 용매 중에서 수행되는 것을 특징으로 하는 오메가-3 불포화 지방산과 아스코르빈산과의 복합체의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 이온성 용매는 트리옥틸메틸암모늄·트리플루오로아세테이트(trioctylmethylammonium·trifluoroacetate), 1-부틸-3-메틸 이미다졸리움·CF3SO3(1-butyl-3-methylimidazolium·CF3SO3), 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, t-부탄올, 2-메틸-2-부탄올, 및 아세톤으로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택될 수 있다. 상기 이온성 용매와 유기용매와의 혼합 용매는 이온성 용매 및 유기용매의 부피비가 1 : 1∼3 인 혼합 용매일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 혼합용매는 트리옥틸메틸암모늄·트리플루오로아세테이트 및 t-부탄올의 1 : 1 (부피비)의 혼합용매일 수 있다. 또한, 상기 용매 중의 아스코르빈산의 농도는 20∼250 g/L일 수 있으며, 상기 오메가-3 불포화 지방산 및 아스코르빈산의 몰비는 1:1 내지 6:1의 범위일 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법은 상기 축합을 통하여 얻어진 생성물을 분리한 다음, 헥산 추출 공정을 수행하여 미반응물을 제거한 후, 물을 가하여 침전된 오메가-3 불포화 지방산과 아스코르빈산과의 복합체를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법은 이온성 용매; 또는 이온성 용매와 유기용매와의 혼합 용매 시스템을 사용한 효소적 축합 반응에 의해, 오메가-3 불포화 지방산과 아스코르빈산과의 복합체를 제조한다. 상기 용매 시스템은 고농도의 아스코르빈산의 용해가 가능함으로써, 수율 및 부피당 생산성을 현저하게 높일 수 있으므로, 생산성을 획기적으로 향상시킬 수 있다.
본 명세서에서, "오메가-3 불포화 지방산(ω-3 unsaturated fatty acid)"이라 함은 오메가-3 고도 불포화 지방산(ω-3 highly unsaturated fatty acid) 또는 고도불포화 지방산(polyunsaturated fatty acid, PUFA)라고 지칭되는 자유산 형태 및 또한, 지방산의 말단 카르복실산이 C1∼C4 알코올 등과 에스테르 결합을 형성한 아실 에스테르 형태를 모두 포함한다. 구체적으로는 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid, DHA), 에이코사펜타엔산(Eicosapentaenoic aicd, EPA), 아라키돈산(Arachidonic acid, ARA), 도코사펜타엔산(Docosapentaenoic aicd, DPA), 및 α-리놀렌산 등 및 이들의 C1∼C4 알코올 등과 에스테르 결합물을 포함하며, 바람직하게는 DHA 또는 EPA이다. 본 명세서에서 "PUFA"라고 칭할 경우, 상기한 오메가-3 불포화 지방산을 의미한다.
또한, "오메가-3 불포화 지방산과 아스코르빈산과의 복합체(complex of omega-3 unsaturated fatty acid and ascorbic acid)"라 함은 아스코르빈산의 6번 위치 히드록시가 오메가-3 불포화 지방산과 에스테르 결합을 통하여 결합된 화합물을 의미하며, 본 명세서에서는 "6-O-PUFA 아스코르빈산"로 칭하기도 한다.
본 발명은 오메가-3 불포화 지방산과 아스코르빈산을 리파아제 존재하에서 축합시켜 오메가-3 불포화 지방산과 아스코르빈산과의 복합체를 제조하는 방법에 있어서, 상기 축합이 이온성 용매(ionic liquid); 또는 이온성 용매와 유기용매와의 혼합 용매 중에서 수행되는 것을 특징으로 하는 오메가-3 불포화 지방산과 아스코르빈산과의 복합체의 제조방법을 제공한다.
상기 이온성 용매는 트리옥틸메틸암모늄·트리플루오로아세테이트(trioctylmethylammonium·trifluoroacetate, tOMAㆍTFA), 1-부틸-3-메틸이미다졸리움·CF3SO3(1-butyl-3-methylimidazolium·CF3SO3, BMIMㆍCF3SO3), 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 바람직하게는 tOMAㆍTFA 이다.
또한, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, t-부탄올, 2-메틸-2-부탄올, 및 아세톤으로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 t-부탄올이다.
상기 이온성 용매와 유기용매와의 혼합 용매는 이온성 용매 및 유기용매의 부피비가 1 : 1∼3 인 혼합 용매일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 혼합용매는 트리옥틸메틸암모늄·트리플루오로아세테이트 및 t-부탄올의 1 : 1 (부피비)의 혼합용매일 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법은 상기와 같은 용매 시스템을 채용함으로써 기존 유기용매만을 사용한 반응계에 비해 고농도의 오메가-3 불포화 지방산 및 아스코르빈산의 반응을 가능하게 하므로, 부피당 생산성을 크게 높일 수 있다. 따라서, 축합반응에 있어서, 상기 용매 중의 아스코르빈산의 농도는 20∼250 g/L, 더욱 바람직하게는 100∼250 g/L, 특히 바람직하게는 약 200 g/L의 범위일 수 있다. 또한, 상기 PUFA 및 아스코르빈산의 몰비는 1:1 내지 6:1의 범위일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 약 5:1의 범위일 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 리파아제는 미생물 유래의 공지의 리파 아제, 더욱 구체적으로는 1,3-특이 또는 비특이 리파아제를 사용할 수 있다. 상기 리파아제는 반응에 사용된 후 회수하여 재사용할 수 있으며, 따라서 '고정화 리파아제(immobilized lipase)'로 칭해질 수 있다. 상기 미생물 유래의 리파아제는 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 칸디다(Candida) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 크로모박테리움(Chromobacterium) 속, 리조푸스(Rhizopus)속 등의 미생물로부터 유래된 공지의 리파아제일 수 있다. 또한, 상기 리파아제는 상업적으로 시판되는 효소, 예를 들어 Chirazyme L-2, c.-f. 또는 C2 (Roche Molecular Biochemicals사) 또는 Novozyme 435 (노보자임스 코리아(주)) 등을 사용할 수도 있다.
상기 축합 반응은 40∼80 ℃, 바람직하게는 50∼70 ℃, 더욱 바람직하게는 약 70 ℃에서 수행할 수 있으며, 반응계의 순분 함량은 0.1 중량% 이하, 더욱 바람직하게는 0.01 중량% 이하로 유지하는 것이 바람직하다. 필요할 경우, 수분 제거를 위하여 분자체(molecular seive), 예를 들어 4 Å의 분자체를 가하여 반응을 수행할 수도 있다. 상기 축합 반응을 통하여 얻어진 6-O-PUFA 아스코르빈산은 실리카겔을 이용한 통상의 크로마토그래피법에 의해 정제될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 축합을 통하여 얻어진 생성물을 분리한 다음, 헥산 추출 공정을 수행하여 미반응물(예를 들어, 미반응의 PUFA)을 제거한 후, 물을 가하여 침전된 오메가-3 불포화 지방산과 아스코르빈산과의 복합체를 분리할 수 있다. 상기 축합 반응 혼합물로부터 생성물의 분리는 통상의 방법, 예를 들어 원심분리 등에 의해 분자체 등의 고형물을 제거하고 상등액을 얻음으로써 수행할 수 있다. 또한, 헥산 추출 공정을 수행하여 얻어진 수층(aqueous phase)에 물을 가할 경우, 상기 복합체가 침전되게 되며, 상기 침전물은 통상의 방법, 예를 들어 여과, 원심분리 등에 의해 분리할 수 있고, 분리된 침전물은 통상의 방법, 예를 들어 감압건조 등의 방법으로 건조하여 최종적으로 복합체를 얻을 수 있다.
상기와 같은 본 발명의 제조방법에 따른 6-O-PUFA 아스코르빈산의 생산성은 80g/L 내지 150g/L, 바람직하게는 120g/L 내지 150g/L 의 범위로서, 매우 우수한 생산성을 달성할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1. PUFA와 아스코르빈산 몰비의 영향 평가
EPA 및 L-아스코르빈산의 몰 비율을 1:1에서 9:1까지 변경하여, 생산성을 평가하였다. 즉, 용매로서 수분함량 0.01 중량% 이하로 탈수시킨 아세톤을 사용하였으며, 리파아제로서 Novozyme 435(노보자임스 코리아(주))를 기질량(즉, EPA 및 L-아스코르빈산의 총 중량) 대비 1:1 부피비로 첨가하였다. 반응 온도는 50 ℃, 교반 속도는 500 rpm, 및 반응시간은 36시간으로 하였다. 수율 분석을 위해 시간별로 샘플을 채취하여 분석하였으며, 초기 투입한 아스코르빈산 양을 기준으로 계산하였다. 그 결과는 도 1과 같다. 도 1로부터, 몰비에 따른 반응속도 및 수율변화는 몰비가 증가할수록, 즉 EPA의 함량이 증가할수록 증가하는 경향을 보였으나, 몰비 5:1에서 최대치(48%)를 보인 후에는 오히려 감소하는 경향을 나타내었다.
실시예 2. 수분함량에 따른 영향 평가
반응용매로서 아세톤을 사용하고, 아세톤의 수분함량을 0.01 중량%에서 2 중량%까지 변화시키면서, 수율에 미치는 영향을 평가하였다. EPA와 아스코르빈산의 몰비는 5:1로 하였으며, 그 밖의 조건은 실시예 1과 동일하게 하였다. 그 결과는 도 2와 같다. 도 2로부터, 수분함량이 2 중량%일 경우 수율이 0% 이었으며, 이는 수분의 존재로 인해 에스테르화 반응의 방향이 반응물 쪽으로 치우쳐 있음을 알 수 있다. 수분 함량이 0.01 중량%에서는 수율이 25% 이상으로 수분의 제거가 반응의 수율이나 반응성에 큰 영향을 미침을 알 수 있다.
실시예 1 및 2에서 알 수 있는 바와 같이, 아세톤을 용매로 사용하였을 때, 생산성의 증가에 한계가 있었다. 이는 아세톤에 대한 아스코르빈산의 낮은 용해도에 기인하는 것으로 확인되었다(data not shown). 용매로서 이온성 용매 또는 이온성 용매와 유기용매의 혼합 용매 시스템을 구성하여 축합반응을 수행하였다.
실시예 3. tOMAㆍTFA를 사용한 6-O-PUFA 아스코르빈산의 제조
아스코르빈산 0.2148 g, DHA 2.08 g을 tOMAㆍTFA 1ml에 용해시킨 후, 분자체(4 Å) 200 mg 및 리파아제(Novozyme 435) 200 mg을 가한 다음, 70 ℃에서 300 rpm으로 교반하면서, 24 시간 동안 축합반응을 수행하였다. 반응 혼합물을 3000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액에 헥산 1 ml을 가하여 2회 추출하여 미반응의 PUFA를 제거하였다. 남아 있는 수층에 물 1 ml을 가하여 침전물을 생성시킨 후, 3000 rpm으로 원심분리 침전물을 회수하였다. 얻어진 침전물을 감압 건조하여 6-O-PUFA 아스코르빈산 0.1 g을 얻었다 (부피당 생산성: 100 g/L).
실시예 4. BMIMㆍCF3SO3를 사용한 6-O-PUFA 아스코르빈산의 제조
tOMAㆍTFA 1ml 대신 BMIMㆍCF3SO3를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 3과 동일한 방법으로 반응을 수행하여 6-O-PUFA 아스코르빈산 0.112 g을 얻었다 (부피당 생산성: 112 g/L).
실시예 5. tOMAㆍTFA과 t-BuOH과의 혼합용매를 사용한 6-O-PUFA 아스코르빈산의 제조
tOMAㆍTFA 1ml 대신 tOMAㆍTFA 및 t-BuOH의 혼합용매 1ml (1:1 v/v)를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 3과 동일한 방법으로 반응을 수행하여 6-O-PUFA 아스코르빈산 0.178 g을 얻었다 (부피당 생산성: 178 g/L).
비교예. t-BuOH을 사용한 6-O-PUFA 아스코르빈산의 제조
tOMAㆍTFA 1ml 대신 t-BuOH 1ml를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 3과 동일한 방법으로 반응을 수행하여 6-O-PUFA 아스코르빈산 0.0062 g을 얻었다 (부피당 생산성: 62 g/L).
도 1은 PUFA와 아스코르빈산과의 몰비에 따른 반응성을 평가한 결과를 나타낸다.
도 2는 반응 용매 중 수분량에 따른 수율의 변화를 평가한 결과를 나타낸다.

Claims (8)

  1. 오메가-3 불포화 지방산과 아스코르빈산을 리파아제 존재하에서 축합시켜 오메가-3 불포화 지방산과 아스코르빈산과의 복합체를 제조하는 방법에 있어서, 상기 축합이 이온성 용매(ionic liquid); 또는 이온성 용매와 유기용매와의 혼합 용매 중에서 수행되는 것을 특징으로 하는 오메가-3 불포화 지방산과 아스코르빈산과의 복합체의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 이온성 용매가 트리옥틸메틸암모늄·트리플루오로아세테이트(trioctylmethylammonium·trifluoroacetate), 1-부틸-3-메틸이미다졸리움·CF3SO3(1-butyl-3-methylimidazolium·CF3SO3), 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 유기용매가 메탄올, 에탄올, t-부탄올, 2-메틸-2-부탄올, 및 아세톤으로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 이온성 용매와 유기용매와의 혼합 용매가 이온성 용매 및 유기용매의 부피비가 1 : 1∼3 인 혼합 용매인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 이온성 용매와 유기용매와의 혼합 용매가 트리옥틸메틸암모늄·트리플루오로아세테이트와 t-부탄올의 1 : 1 (부피비)의 혼합용매인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 용매 중의 아스코르빈산의 농도가 20∼250 g/L인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 오메가-3 불포화 지방산 및 아스코르빈산의 몰비가 1:1 내지 6:1인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 축합을 통하여 얻어진 생성물을 분리한 다음, 헥산 추출 공정을 수행하여 미반응물을 제거한 후, 물을 가하여 침전된 오메가-3 불포화 지방산과 아스코르빈산과의 복합체를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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