KR20110031370A

KR20110031370A - 염산 ｉｃｏｔｉｎｉｂ, 합성, 결정형, 약학적 조성물 및 이의 사용

Info

Publication number: KR20110031370A
Application number: KR1020117002841A
Authority: KR
Inventors: 인시앙 왕; 리에밍 딩; 펜라이 탄; 윤얀 후; 웨이 헤; 빈 한; 웨이 롱; 용 리우; 구오지안 시에; 하이마 에이아이; 챨스 데이비스; 돈 쟝
Original assignee: 베타 파마, 인크.
Priority date: 2008-07-08
Filing date: 2009-07-07
Publication date: 2011-03-25
Also published as: AU2009267683B2; US20140343082A1; JP2011527291A; NZ590334A; CN101878218A; JP2015110649A; CN104592242A; WO2010003313A1; WO2010003313A8; IL210447A0; CN104530061B; CN103254204B; AU2009267683A1; JP5719770B2; CN103254204A; CA2730311A1; CN102911179B; EP2392576A1; CN104592242B; US8822482B2

Abstract

본 발명은 4-[(3-에티닐페닐)아미노]-6,7-벤조-12-크라운-퀴나졸린 염산과 이의 새로운 결정형, EGFR 키나아제에 의한 질병의 치료제로서의 사용, 다른 치료제와의 병용에 의한 치료제로서의 사용에 관한 것이다. 또한 발명은 4-[(3-에티닐페닐)아미노]-6,7-벤조-12-크라운-퀴나졸린 염산의 합성법과 이의 새로운 결정형 그리고 합성 4-[(3-에티닐페닐)아미노]-6,7-벤조-12-크라운-퀴나졸린 염산에 관련있는 합성 중간체에 관한 것이다.

Description

염산 ＩＣＯＴＩＮＩＢ, 합성, 결정형, 약학적 조성물 및 이의 사용 {ICOTINIB HYDROCHLORIDE, SYNTHESIS, CRYSTALLOGRAPHIC FORM, MEDICAL COMBINATION, AND USES THEREOF}

본 발명은 4-[(3-에티닐페닐)아미노]-6,7-벤조-12-크라운-퀴나졸린 염산염과 이의 새로운 결정형에 관한 것이며, 또한 본 발명은 이러한 화합물의 합성법과 이러한 화합물을 포함하고 있는 약학적 조성물과 암의 치료를 위한 이러한 조합물의 사용 및 관련있는 중간체에 관한 것이다.

티로신 키나아제 수용체는 막관통 단백질(trans-membrane proteins)로서, 세포외 자극에 대한 반응에 따라, 세포 번식, 혈관 형성, 세포 소멸 및 기타 세포 성장의 중요한 요인을 조절하기 위하여 신호 전달 체계를 전파한다. 그러한 수용체의 한 종류인 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 티로신 키나아제 수용체는 뇌암, 폐암, 간암, 방광암, 유방암, 두경부암, 식도암, 소화기암, 난소암, 자궁암, 또는 갑상선암을 포함하는 많은 인체 암에 과발현되어 있다.

EGFR는 많은 암 세포에 발현되어 있다. 동족 리간드(EGF, TGFα (즉, 변형시키는 성장 인자-α) 및 뉴레귤린(neuregulin)를 세포외 도메인에 묶는것은 가족 구성원간에 동종 또는 이종 이합체화를 일으키며 이는 각 세포질안에 존재하는 특정 티로신, 세린 및 트레오닌의 인산 전달 반응의 결과로 인한 세포질 티로신 키나아제 도메인의 병치이다. 형성된 포스포티로신은 다양한 어댑터 분자에 대한 결합 사이트로 작용하여 결과적으로 급증된 세포 반응을 유발하는 신호 전달 체계(Ras/미토겐 활성화된, PI3K/Akt 및 Jak/STAT)를 활성화한다.

다양한 분자학, 세포 생물학 및 임상 연구들은, 임상적인 항암 치료 효과를 성취하기 위하여, EGFR 티로신 키나아제 수용체가 암 세포 증식과 전이 및 다른EGFR-관련 신호 전달 응답을 억제할 수 있음을 보여주고 있다. 유사한 화학 구조를 가진 두 개의 경구용EGFR 키나아제 수용체에는, 진행된 비소세포 폐암 치료에 대해 2003년에 미국 FDA 승인을 받은 (나중에 승인이 취소되었음) 게피티닙 (이레사; 아스트라제네카)과, 진행된 비소세포 폐암 및 취장암 치료제로 2004년에 미국 FDA 승인을 받은 염산엘로티닙 (타세바; 로슈 및 OSI)이 있다.

중국 특허 발행 번호 CN1305860C는 페이지 29, 보기 15, 화합물 23에서 4-[(3-에티닐페닐)아미노]-6,7-벤조-12-크라운-퀴나졸린 (유리 염기)의 구조를 나타내고 있다.

본 발명의 목적 중 하나는 4-[(3-에티닐페닐)아미노]-6,7-벤조-12-크라운-퀴나졸린의 염산염을 제공하는 것이며 이는 화학식 I로 아래와 같이 나타낼 수 있다:

본 발명의 발명자들은 우연치 않게 위의 화학식 I의 화합물이 하나 이상의 결정형로 존재함을 발견하였다. 이러한 다수의 결정형는 결정형 I, II, III 및 IV로 칭하기로 한다. 화학식 I의 화합물과 그 결정형들은 더 나은 용해성과 화학적 안전성을 가지며 따라서 임상 적용을 용이하게 한다. 설명을 용이하게 하기 위하여, 화학식 I의 화합물, "4-[(3-에티닐페닐)아미노]-6,7-벤조-12-크라운-퀴나졸린 염산" 은 이하 "염산 Icotinib"이라 칭할 것이며, 이의 유리 염기인 "4-[(3-에티닐페닐)아미노]-6,7-벤조-12-크라운-퀴나졸린"은 "Icotinib"이라 칭할 것이다.

하나의 예로서, 본 발명은 염산 Icotinib의 결정형 I을 보여준다. 도 1에 나타난 바와 같이, 결정형 I의 X-선 분말 회절 스펙트라는 통상적으로 다음과 같은 피크 회절 각도를 가진다 (여기서 "간격"은 도 1의 "d-값"을 나타낸다):

염산 Icotinib의 결정형 I은 상당히 안정적인 결정형으로 평균 입자 크기 (D₉₀)가 대략 1-10 μm인 미립자들이 고르게 분포되어 있으며 임상 사용을 위해 용이하게 제조될 수 있다.

한편, 본 발명에서의 염산 Icotinib의 결정형 II를 살펴보면, 도 2에서 나타난 바와 같이, 결정형 II의 X-선 분말 회절 스펙트라는 통상적으로 다음과 같은 피크 회절 각도를 가진다 (여기서 "간격"은 도 2의 "d-값"을 나타낸다):

다음으로, 본 발명에서의 염산 Icotinib의 결정형 III를 살펴보면, 도 3에서 나타난 바와 같이, 결정형 III의 X-선 분말 회절 스펙트라는 통상적으로 다음과 같은 피크 회절 각도를 가진다 (여기서 "간격"은 도 3의 "d-값"을 나타낸다):

마지막으로, 본 발명에서의 염산 Icotinib의 결정형 IV를 살펴보면, 도 4에서 나타난 바와 같이, 결정형 IV의 X-선 분말 회절 스펙트라는 통상적으로 다음과 같은 피크 회절 각도를 가진다 (여기서 "간격"은 도 4의 "d-값"을 나타낸다):

위에 나타낸 결정형 I, II, III, 및 IV 에 대하여, 주요 피크만이 (즉, 가장 두드러지고, 특색이 있으며, 독특하고 그리고/또는 재생할 수 있는 피크) 집약되며 추가적인 피크는 전통적인 방법에 의한 회절 스펙트라로부터 얻을 수 있다. 앞서 설명한 주요 피크는 오차 범위 (마지막 소수 자리에서 ±2 또는 표시 값에서 ±0.2)내에서 재생할 수 있습니다.

본 발명의 또 다른 목적은 화학식 I의 화합물 (염산 Icotinib)을 만드는 방법을 제공하는 것이다:

방법 1:

방법 2:

방법 3:

BPI-02는 재결정화에 의해 얻을 수 있다.

본 발명에 의해 만들어진 염산 Icotinib의 결정형 I, II, III 및 IV 는 다음과 같은 방법을 통해 만들 수 있다: 4-[(3-에티닐페닐)아미노]-6,7-벤조-12-크라운-퀴나졸린 염산은 극성 용매로 완전히 용해될 때까지 환류된다. 필터와 냉각, 결정화, 필터 및 건조를 거치고 난 뒤, 각기 해당되는 다른 결정형이 생성된다. 특정 결정화 절차는 본 발명의 보기 섹션에서 보여질 것이다.

위에 나타낸 결정화는 단일 용매, 혼합 용매 또는 물과 유기 용매의 혼합액에서 이루어질 수 있다. 결정화에 대한 적절한 극성 용액은 물, 저 탄소 알콜, 케톤, 에테르, 에스테르, 할로겐화 탄화수소, 알칸, 할로겐화 벤젠, 지방족 니트릴, 및 다른 방향족 용매에서 선택할 수 있지만 반드시 이에 국한되지는 않는다. 선호되는 용매는 이소프로판올, 초산 에틸, 50% 에탄올, 물, N,N-디메틸포름아마이드, 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 프로판올이다.

여기서 사용된 "저탄소 알콜"이라는 용어는 직쇄(straight-chain) 또는 측쇄(branched-chain)의 C₂-C₃를 포함한 직쇄 또는 측쇄 C₁-C₅ 알코올이다. 특정 보기로는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 및 부타놀을 포함한다.

본 발명의 결정형의 결정화는, 증발, 냉각에 의한 적어도 하나의 용매를 포함하는 적절한 용매 시스템에서 구할 수 있고 그리고/또는 용매 시스템에서 과포화를 얻기 위해 역용매의 추가(본 발명에서 설명한 것 보다 덜 염산 Icotinibe를 용해할 수 있는 용매)함으로서 구할 수 있다.

결정화는 씨앗 결정이 있거나 없거나 간에 만들어질 수 있으며 이는 본 발명에 나타나 있다.

본 발명에서 설명된 각각의 결정형은 결정화 과정의 특정한 열역학 및 평형 상태의 물성에 따른 특정 조건하에서 이루어진다. 따라서, 본 분야의 전문가들은 형성된 결정형은 결정화 과정의 동력학 및 열역학 물성의 결과임을 알고 있을 것이다. 특정한 조건하에서 (즉, 본 발명의 용매, 온도, 압력, 및 화합물의 농도), 특정 결정형은 다른 결정형보다 더 안정적일 수 (또는 다른 어떤 결정형보다 더 안정적일 수 있음) 있다. 그러나, 특정 결정형의 상대적으로 낮은 열역학적 안정도는 동력학적으로 장점이 될 수 있다. 시간, 불순물 분포도, 섞기, 씨앗 결정의 존재 유무 등과 같은 동력학 이외의 추가 요인 또한 결정형에 영향을 미칠 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 염산 Icotinib과 위에서 설명한 결정형 I, II, III 및 IV에서 선택된 하나 이상의 화합물과 약학적으로 수용될 수 있는 매개체의 적절한 양을 포함하고 있는 약학적 화합물을 제공하고 있다. 활성 화합물은 화합물의 1-99% (무게)가 될 수 있지만, 1-70% (무게)가 선호되고, 또는 보다 더 선호되는 바로는 화합물의 10-30% (무게)가 되는 경우이다.

약학 화합물은 정제, 캡슐, 알약, 파우더, 서방성 제제, 액체 그리고/또는 물약과 같은 경구용 형식으로 복용될 수 있으며; 무균 용액, 현탁액 또는 유상액의 형식으로 비장형 주입에 의할 수 있고; 바르는 제제, 연고 또는 크림에 의해 부분적 치료에 사용될 수 있으며 또는 좌약에 의해 항문에 삽입될 수 있다. 약학 화합물은 정확한 복용량 투여를 위해 단위 복용량 형식으로 사용될 수도 있다. 추가로, 약학 화합물은 다른 유효 성분을 포함할 수도 있다.

적절한 약학 화합물의 매개체는 물, 다양한 유기 용매 및 다양한 비활성 희석제 또는 충전제를 포함한다. 필요한 경우, 약학 화합물은 향신료, 접착제 및 첨가제와 같은 다영한 첨가물을 포함할 수 있다. 경구용에 대해서, 정제는 구연산과 같은 다양한 첨가물과 녹말, 알긴산, 규산염과 같은 붕해제를 포함하며, 자당, 젤라틴, 아리비아 고무와 같은 다양한 접착제를 포함할 수 있다. 추가로, 스테아린산 마그네슘과 탈크 충전제와 같은 윤활제가 정제 제조에 흔히 사용된다. 동일한 종류의 고체 화합물로 부드럽거나 단단한 젤라틴 캡슐로 만들어질 수 있다. 경구용 복용을 위해 수성 현탁액이 필요한 경우, 활성 화합물은 다양한 감미료 또는 향료, 색소 또는 염색료를 합성하여 만들어질 수 있습니다. 필요한 경우, 다양한 유화제가 사용될 수 있고 현탁액이 만들어 질 수 있으며; 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 글리세린 또는 다른 조합물과 같은 희석제에 의해 만들어질 수 있다.

위에 설명한 약학 화합물은 경구로 복용되는 것이 좋다.

위에 설명한 약학 화합물은 정제나 또는 캡슐로 복용하는 것이 좋다.

다른 측면에서의 본 발명은(즉 염산 Icotinib과 위에 설명한 그의 결정형 I, II, III 및 IV) 포유 동물에서의 비-악성 과형성 질병의 치료 또는 예방에 사용될 수 있는 의약품 제조에 있어 이러한 발명의 화합물의 사용을 설명한다. 비-악성 과형성 질병은 양성 피부 과다 증식 또는 양성 전립성 비대와 같은 질병이다.

또 다른 측면에서, 본발명은(즉 염산 Icotinib과 위에 설명한 그의 결정형 I, II, III 및 IV) 포유 동물에서의 췌장염, 신장병, 암, 혈관 형성 또는 혈관 형성과 관련된 질병의 치료 또는 예방에 사용될 수 있는 의약품 제조에 있어 이러한 발명의 화합물의 사용을 설명한다.

더 나아가, 본 발명은(즉 염산 Icotinib과 위에 설명한 그의 결정형 I, II, III 및 IV) 포유 동물에서의 배아 줄기 세포 이식에 사용될 수 있는 의약품 제조에 있어 이러한 발명의 화합물의 사용을 설명한다.

본 발명의 염산 Icotinib과 위에 설명한 그의 결정형 I, II, III 및 IV은 종양 혈관 생성 인자, 류마티스 관절염, 아테롬성 동맥 경화증과 같은 만성 염증 질환, 건선, 피부 경화증, 당뇨병으로 인한 피부 질환과 같은 피부병, 당뇨 망막증, 조기 망막증, 노인성 황반 형성, 혈관종, 신경 교종, 카포시 육종, 난소암, 유방암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 림프종암, 결장암, 피부암 및 이러한 질병들의 합병증을 포함한, 그러나 이에 국한되지는 않는, 질병을 치료하거나 예방하는데 사용된다.

여기서 언급한 포유 동물이라 함은 인간을 주로 나타낸다.

본 발명의 또 다른 목적은 포유 동물에 있어 악성 직과 증식을 치료하는 방법을 제공하는데 있다. 이러한 방법에는 효과적인 양의 염산 Icotinib 그리고/또는 결정형 그리고/또는 위에 언급한 약학 화합물을 과형성 질병을 앓고 있는 환자에게 투여하는 것이 포함된다. 어떤 구현에서는, 이러한 치료 방법에 매트릭스 메탈로프로티나아제 (MMP (matrix metalloproteinase)) 억제제, 혈관내피 성장 인자 수용체(VEGFR) 키나아제 억제제, HER2 억제제, VEGFR 항체 의약품, 그리고/또는 앤도스타틴 의약품의 사용이 포함된다. 다른 구현에서는, 이러한 치료 방법에 유사 분열 억제제, 알킬화제, 항대사 물질, 항-종양 약물, 성장 인자 억제제, 세포 주기 억제제, 엔자임, 엔자임 억제제, 생물학적 반응 조절 물질, 항 호르몬 의약품, 등과 같은 하나 이상의 항암 물질이 포함된다. 이러한 항암 물질은 카보플라빈, 파클리탁셀, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 5-FU, 캠토테신, 싸이클로포스파마이드, BCNU 및 다른 의약품에서 선택될 수 있다.

다른 측면에서 본 발명은 티로신 키아나제 기능 장애로 인한 질병의 치료에 대한 방법을 제공한다. 이 치료 방법에는 티로신 기능 장애로 인한 질병을 가진 환자에게 효과적인 양의 염산 Icotinib 그리고/또는 그의 결정형 그리고/또는 본 발병의 약학 화합물을 투여하는 것이 포함된다. 티로신 키아나제 기능 장애와 관련된 질병에는 뇌암, 폐암, 간암, 방광암, 유방암, 두경부암, 식도암, 소화기암, 난소암, 자궁암, 또는 갑상선암 및 이러한 질병과 관련된 합병증을 포함되지만 반드시 이에 국한되지는 않는다.

위에 언급한 치료 방법이 목표하는 질병에는 뇌암, 폐암(비소세포 폐암(NSCLC)과 같은), 신장암, 뼈암, 간암, 방광암, 흉부암, 유방암, 경부암, 식도암, 소화기암, 결장암, 항문암, 유방암, 난소암, 흑색종, 피부암, 부신암종, 자궁경부암, 림프종암, 또는 갑상선암 및 이러한 질병과 관련된 합병증에서 선택될 수 있다.

위에 언급한 방법은 화학 치료, 생화확 치료 또는 방사선 치료와 함께 병행하여 적용될 수 있다.

위에 언급한 치료 방법에는 더 나아가 항-EGFR 항체, 항-EGF 항체 또는 두 가지 다 같은 치료에 적용하는 것이 포함된다.

유효 성분 또는 화합물의 투여 복용법은 치료 받을 환자의 개인적인 필요에 따라, 복용 방법에 따라, 병의 심각성 정도에 따라, 복용 스케줄에 따라 또한 담당 의사의 평가와 판단에 따라 결정된다. 그러나, 유효 성분에 의거하여, 효과적인 복용법의 선호되는 범위는 대략 몸무게 1 킬로그램당 하루 0.01-120 mg; 또는 단일 또는 복수 복용에서 몸무게 1킬로그램당 하루 1-50 mg 정도이다. 어떤 경우에서는, 위에 나타낸 복용 범위에서 최소량을 적용하는 것이 더 적절할 때도 있으며, 어떤 경우에는, 유해한 부작용 없이, 복용 범위에서 높은량을 적용하여야 할 때도 있다.

또 다른 측면에서 본 발명은 임상 적용에 대한 4-[(3-에티닐페닐)아미노]-6,7-벤조-12-크라운-퀴나졸린 염산을 제공하는 것이다. 특별히, 본 발명은 암 환자에 대하여 다음과 같은 치료 선택과 함께 염산 Icotinib을 가진 임상 치료와 관계된 것이다: 염산 Icotinib의 복용량 그리고/또는 결정형 I, II, III 또는 IV의 복용량은 하루 1-3 번, 25-2100 mg/일 복용할 수 있다; 하루 1-3 번, 75-1200 mg/일 복용이 선호된다; 하루 2-3 번, 75-1200 mg/일 복용이 더 선호된다; 하루 2-3 번, 100-1200 mg/일 복용이 가장 선호된다.

도 1은 염산 Icotinib 결정형 I의 X-선 분말 회절 패턴 (이소프로판올로부터 결정화)을 나타낸다.
도 2은 염산 Icotinib 결정형 II의 X-선 분말 회절 패턴 (50% 에탄올로부터 결정화)을 나타낸다.
도 3은 염산 Icotinib 결정형 III의 X-선 분말 회절 패턴 (수성 용매로부터 결정화)을 나타낸다.
도 4은 염산 Icotinib 결정형 IV의 X-선 분말 회절 패턴 (N, N-디메틸포름아마이드로부터 결정화)을 나타낸다.
도 5은 염산 Icotinib에 대한 ¹H-NMR스펙트라를 나타낸다.
도 6은 염산 Icotinib에 대한 ¹³C-NMR스펙트라를 나타낸다.

보기

다음에서 보여지는 특정 보기와 효능 시험이 본 발명을 보다 더 잘 설명해 준다. 이것은 어떠한 경우에도 본 발명의 범위를 제한하거나 한정짓지는 않는다.

보기 1

단계 1

준비작업: 400 L의 반응 장치에서 수산화 나트륨 16 kg (400 mol)을 물 80 L에 용해하고, 이후, 트리에틸렌 글리콜 18.8 L (140 mol)과 THF 32 L를 반응 장치에 첨가한다. 이를 5 ℃ 이하에서 냉각한 다음, 코실 클로라이드 47.84 kg (260 mol)와 THF 용액 50 L를 한 방울씩 첨가한다. 첨가한 다음에는, 반응 혼합물을 이 온도에서 2 시간 동안 그대로 둔다. 그리고 240 L의 얼음물에 혼합물을 붓는다. 침전물이 형성되고 걸러지며 적은 양의 물로 씻어 건조시킨다. 하얀색 결정 가루로 BPI-01 58.64 kg이 91.4%에서 생성된다. mp: 77-80 ℃, HPLC: 97%. TLC (페트롤늄 에테르: 에틸 아세테이트 = 1:1) Rf = 0.87.

NMR 데이타: ¹H-NMR (CDCl₃): δ ppm: 7.78 (d, 4H, J = 10.4 Hz, 술포닐 그룹 옆의 벤젠 프로톤); 7.34 (d, 4H, J = 11.6 Hz, 메틸 그룹 옆의 벤젠 프로톤); 4.129 (dd, 4H, J = 5.6 Hz, 술포닐 그룹 옆의 에틸렌 프로톤); 3.64 (dd, 4H, J = 5.6 Hz, 술포닐 그룹에서 떨어진 에틸렌 프로톤); 3.517 (s, 4H, 가운데 있는 에틸렌 프로톤); 2.438 (s, 6H, 벤젠 위의 메틸 프로톤).

단계 2

준비 작업: 에틸 3,4-디하이드록시벤조에이트 3.64 kg (20 mol)과 탄산 칼륨 12.4 kg (89.6 mol)을 N,N-디메틸포름아마이드 300 L에 용해시킨 용액으로 약 30분 동안 85-90 ℃로 가열한다. BPI-01 용액 9.17 kg (20 mol)을 N,N-디메틸포름아마이드 40 L에 1.5-2 시간에 걸쳐 한 방울씩 첨가한다. 첨가한 이후, 30분 동안 반응을 위해 그대로 놔 둔다; 반응 완료는 TLC (전개 용매: 페트롤륨 에테르: 에틸 아세테이트 = 1:1, Rf = 0.58)에 의해 확인된다. 반응 혼합물을 반응기에서 제거하여 여과시킨다. 여과된 용액은 N,N-디메틸포름아마이드를 제거하기 위하여 증발시킨다; 에틸 아세테이트 240 L를 남은 용액에 용해시킨다. 여과와 진공 증발을 거친 후, 잔여 용액이 페트롤륨 에테르 300 L와 함께 추출된다. 페틀롤륨 에테르가 증발한 다음에는, 증발 잔류물은 재결정화되고 이때 이소프로판올의 비율은 1:2.5 (W/V)이며; 백색 파우더로서의 BPI-02 1.68 kg은 생산률 28%로 얻어진다. mp: 73-76 ℃, HPLC: 96.4%.

NMR 데이타: ¹H-NMR (CDCl₃): δ ppm: 7.701 (d, 1H, J = 2.4 Hz, 포지션 6에서 벤젠 프로톤); 7.68 (s, 1H, 포지션 2에서 벤젠 프로톤); 6.966 (d, 1H, J = 10.8 Hz, 포지션 5에서 벤젠 프로톤); 4.374-3.81 (q, 2H, J = 9.6 Hz, 에틸의 메틸렌); 3.78-4.23 (dd, 12H, J = 4.8 Hz, 크라운 에테르 프로톤); 1.394 (t, 3H, J = 9.6 Hz, 에틸의 메틸 프로톤).

MS: m/z 296.

단계 3

준비 작업: 5 L 반응 플라스크에 있는 BPI-02 592 g (2 mol)과 아세트산 600 mL의 용액을 0℃로 냉각한다; 농축 질산 1640 mL (25.4 mol)을 천천히 섞는다. 내부 온도는 10 ℃를 초과하여서는 안된다. 0℃이하로 냉각되는 동안, 농축 황산 1 L를 한 방울씩 첨가한다. 내부 온도는 5 ℃를 넘어서는 안된다. 그런 다음에, 반응물을 1-2시간 동안 0-5 ℃에서 보관한다. 반응이 끝난 다음에는, 반응 용액을 얼음물 15 L가 담긴 플라스틱 통에 붓는다. 섞고, 여과하고 그리고 에탄올에서 재결정화한 다음, BPI-03 449 g이 연한 노란색에서 노란색을 띄는 결정 파우더로 생산률 65.7% 에서 생성된다. mp: 92-95 ℃, HPLC: 98.2%. TLC (페트롤륨 에테르: 에틸 아세테이트 = 1:1) Rf = 0.52.

NMR 데이타: ¹H-NMR (CDCl₃): δ ppm: 7.56 (s, 1H, 포지션 5에서 벤젠 프로톤); 7.20 (s, 1H, 포지션 2에서 벤젠 프로톤); 4.402 (q, 2H, J = 9.2 Hz, 에틸의 메틸렌 프로톤); 4.294 (dd, 12H, J = 4.8 Hz, 크라운 에테르 프로톤); 1.368 (t, 3H, J = 9.2 Hz, 에틸의 메틸 프로톤).

단계 4

준비 작업: 3 L 짜리 수소화 반응기에, 메탄올 2 L와 BPI-03 195 g (0.57 mol)을 첨가하고, 아세틸 염화물 63 mL을 천천히 섞는다. 잠깐 휘저어준 다음, 40%의 물을 함유하고 있는 Pd/C 33 g을 섞는다. 반응은 수소 흡수가 멈출 때까지, 4 ATM 수소하에서 진행하고, 이 상태의 반응물을 1-2 시간 동안 방치한다. 반응이 끝나면, 반응 혼합물을 5 L 짜리 반응기에 옮긴다. 여과와 결정화 그리고 다시 여과가 끝나면 생성물이 얻어진다. 모액은 진공하에서 농축이 되고, 더 많은 생성물을 얻을 수 있게 된다. 결합된 생성물은 BPI-04 168 g으로 흰색에서 분홍색을 띄는 결정 파우더이며 생산률은 85%이다. mp: 198-201 ℃, HPLC: 99.1%. TLC (페트롤륨 에테르: 에틸 아세테이트 = 1:1) Rf = 0.33.

NMR 데이타: ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ ppm: 8-9 (br., 3H, 아미노 그룹의 2 프로톤 그리고 염화 수소산의 프로톤); 7.37 (s, 1H, 포지션 5에서 벤젠 프로톤); 6.55 (s, 1H , 포지션 2에서 벤젠 프로톤); 4.25 (q, 2H, J = 7.06 Hz, 에틸의 메틸렌 프로톤); 4.05 (dd, 12H, J = 4.04 Hz, 크라운 에테르 프로톤); 1.31 (t, 3H, J = 7.06 Hz, 에틸의 메틸 프로톤).

단계 5

준비 작업: BPI-04 1105 g (3.175 mol), 포름아미드 4810 g (106.9 mol), 그리고 포름산 암모늄 540 g (8.55 mol)을 10 L 짜리 세구병에 첨가한다. 반응 혼합물은 4 시간 동안 환류 하에서 165 ℃로 가열한다. 상온에서 냉각한 다음, 물 3 L를 첨가하고, 혼합물을 10 분간 저어 준다. 여과와 세척, 건조를 거치면, 흰색의 결정 파우더 BPI-05 742 g가 생산률 80%로 얻어진다. mp: 248-251 ℃, HPLC: 99.78%. TLC (클로로폼: 메탄올 = 8:1) Rf = 0.55.

NMR 데이타: ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ ppm: 12.06 (s, 1H, 퀴나졸린의 NH); 8.0 (d, 1H, J = 3.28 Hz, 퀴나졸린 포지션 3의 프로톤); 7.62 (s, 1H, 퀴나졸린 포지션6의 프로톤); 7.22 (s, 1H, 퀴나졸린 포지션 9의 프로톤); 4.25 (dd, 12H, J = 4.08 Hz, 크라운 에테르 프로톤).

단계 6

준비 작업: BPI-05 337 g (1.13 mol), 클로로폼 7.1 L, POCl₃ 1.83 L (19.58mol) 및 N,N-디메틸포름아마이드 132 ml을 10 L 짜리 세구병에 첨가한다. 반응 혼합물을 환류 온도에서 저어 준다. 용해가 다 된 후, 반응 완료는 TLC (전개 용매: 클로로폼: 메탄올 = 15:1, Rf = 0.56)에 의해 확인된다; 반응이 완료되는데는 대략 8 시간이 소요된다. 그리고 난 후, 반응물 용액은 냉각되고 진공 상태에서 건조될 때까지 증발된다. 클로로폼 4 L에 잔류액을 용해하고; 4 kg의 얼음 조각을 그 용액에 붓고 0.5 시간 동안 젓는다. 분리된 다음, 수성 물질(aqueous phase)은 클로로폼 2 L와 함께 두 번 추출된다. 유기 물질이 결합되고, 얼음물 4 L를 첨가하면 온도가 30 ℃이하로 유지되는 동안 6 N NaOH의 pH는 pH 8-9가 된다. 분리된 다음, 유기 물질은 세척되고 포화 NaCl로 세척되고, 나트륨 황산염 무수물위에 건조되며 용매는 진공 증발에 의해 제거된다. 아세톤으로 증발 잔류물을 세척하고 여과하면; 흰색의 결정 파우더인 BPI-06 268 g이 생산률 77%에서 생성된다. 이때 mp: 164-167℃ 그리고 HPLC 순도 99%.

NMR 데이타: ¹H-NMR (CDCl₃): δ ppm: 8.89 (s, 1H, 퀴나졸린 포지션 2의 프로톤); 7.68 (s, 1H, 퀴나졸린 포지션 9의 프로톤); 7.42 (s, 1H, 퀴나졸린 포지션 6의 프로톤); 4.38-3.81 (dd, 12H, J = 3.88 Hz, 크라운 에테르 프로톤).

단계 7

본 발명의 화합물 준비 작업: 에탄올 500 mL의 BPI-06 20.8 g 현탁액에 이소프로판올 200 mL의 N,N-디메틸포름아마이드를 25 mL과 m-아세틸린 아닐린 8.98 g을 첨가한다. 반응 혼합물은 완전히 용해될 때까지 5 분 가량 상온에서 저어준 후, 반응 용액을 환류에서 3 시간 가열한다. 농축하고 건조한 뒤, 잔류 물질을 에틸 아세테이트에 용해시키고, 물로 세척하고, 나트륨 황산염 무수물 위에 건조시킨다. 그러면, 화학식 I의 화합물 27.1 g이 흰색 결정 파우더로 생성된다.

NMR 데이타: ¹H-NMR (Bruker APX-400, 용매: DMSO-d₆, 내부 규격 TMS): δ ppm: 3.58 (dd, 2H, 크라운 포지션 12에서 두 개의 프로톤); 3.60 (dd, 2H, 크라운 포지션 13에서 두 개의 프로톤); 3.73 (dd, 2H, 크라운 포지션 10에서 두 개의 프로톤); 3.80 (dd, 2H, 크라운 포지션 15에서 두 개의 프로톤); 4.30 (s, 1H, 알키닐의 프로톤); 4.34 (dd, 2H, 크라운 포지션 16에서 두 개의 프로톤); 4.40 (dd, 2H, 크라운 포지션 9에서 두 개의 프로톤); 7.39 (d, 1H, 포지션 25에서 벤젠 프로톤); 7.46 (dd, 1H, 포지션 26에서 벤젠 프로톤); 7.49 (s, 1H, 퀴나졸린 포지션 6에서 프로톤); 7.82 (d, 1H, 포지션 27에서 벤젠 프로톤); 7.94 (t due dd, 1H, 퀴나졸린 포지션 19에서 프로톤); 8.85 (s, 1H, 포지션 23에서 벤젠 프로톤); 8.87 (s, 1H, 퀴나졸린 포지션 2에서 프로톤); 11.70 (s, 1H, 염분으로서 방향족 아민의 프로톤); 14-16 (bs, 1H, 염산염), 도 5 참조.

NMR 데이타: ¹³C-NMR (DMSO-d₆), 도 6 참조.

질량 분석(MS): 장비: ZAB-HS, 시험 조건: EI, 200℃, 700ev, MS 분자량 측정: m/z 427.

최종 제품의 원소 분석:

(1). C, H, N 측정

장비: Elementar-Vario EL.

표 1. 계산치와 비교 (%)한 원소 분석의 결과

C, H, N의 측정치와 계산치의 오차는 0.3% 이하이며 최종 제품의 사양을 만족한다.

(2). Cl 측정

장비: Carlo-Erba1112 원소 분석기, 염소 측정: 산소 플라스크법, 질화 수은의 표준 용액: 0.01079 mol/L.

표 2. 계산치와 비교 (%)한 염소 테스트 결과

보기 2: 염산 Icotinib 결정형 I의 준비

바닥이 둥근 250 mL 짜리 플라스크에, 염산 Icotinib 0.1 g을 이소프로판올 200 mL에 용해시키고 가열한다. 여과를 한 후, 결정화를 하기 위해 그 여과물을 냉각시킨다. 결정을 여과하고 적은 양의 아세톤에 세척한 뒤 60 ℃이하의 진공하에서 건조시킨다. 그러면 흰색의 결정 파우더가 225-228℃의 mp로 생성된다.

파우더 X-레이 회절 패턴방법은 결정형 I의 구조를 특징지어 주는데 사용된다; 도 1 참조 (TGA 장비: DSC204 (NETZSCH 회사)). TGA 결과는 염산 Icotinib 결정형 I이 결정 용매가 없음을 나타내었다.

보기 3: 염산 Icotinib 결정형 II 의 준비

바닥이 둥근 25 mL 짜리 플라스크에, 염산 Icotinib 0.5 g을 50% 에탄올 15 mL에 용해시키고 가열한다. 여과를 한 후, 결정화를 하기 위해 그 여과물을 냉각시킨다. 결정을 여과하고 적은 양의 5 mL의 아세톤에 세척한 뒤 60 ℃이하의 진공하에서 건조시킨다. 그러면 흰색의 결정 파우더가 224-227℃의 mp로 생성된다.

파우더 X-레이 회절 패턴방법은 결정형 II의 구조를 특징지어 주는데 사용된다; 도 2 참조 (TGA 장비: DSC204 (NETZSCH 회사)). TGA 결과는 염산 Icotinib 결정형 II의 각 분자가 결정수의 2.11 분자를 함유하고 있음을 나타내었다.

보기 4: 염산 Icotinib 결정형 III 의 준비

바닥이 둥근 25 mL 짜리 플라스크에, 염산 Icotinib 0.5 g을 물 15 mL에 용해시키고 가열한다. 여과를 한 후, 결정화를 하기 위해 그 여과물을 냉각시킨다. 결정을 여과하고 적은 양의 5 mL의 아세톤에 세척한 뒤 60 ℃이하의 진공하에서 건조시킨다. 그러면 흰색의 결정 파우더가 224-227℃의 mp로 생성된다.

파우더 X-레이 회절 패턴방법은 결정형 III의 구조를 특징지어 주는데 사용된다; 도 3 참조 (TGA 장비: DSC204 (NETZSCH 회사)). TGA 결과는 염산 Icotinib 결정형 III의 각 분자가 결정수의 1.90 분자를 함유하고 있음을 나타내었다.

보기 5: 염산 Icotinib 결정형 I V 의 준비

바닥이 둥근 25 mL 짜리 플라스크에, 염산 Icotinib 0.5 g을 N,N-디메틸포름아마이드 10 mL에 용해시키고 가열한다. 여과를 한 후, 결정화를 하기 위해 그 여과물을 냉각시킨다. 결정을 여과하고 적은 양의 5 mL의 아세톤에 세척한 뒤 60 ℃이하의 진공하에서 건조시킨다. 그러면 연한 노란색의 결정 파우더가 223-226℃의 mp로 생성된다.

파우더 X-레이 회절 패턴방법은 결정형 IV의 구조를 특징지어 주는데 사용된다; 도 4 참조 (TGA 장비: DSC204 (NETZSCH 회사)). TGA 결과는 염산 Icotinib 결정형 IV의 각 분자가 N,N-디메틸포름아마이드 결정의 0.158 분자를 함유하고 있음을 나타내었다.

효능 테스트

테스트 1: 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 염산 Icotinib 결정형 I에 의한 EGFR 티로신 티나아제의 억제 및 선택성

방법: 이 방법은 단백질 키나아제가 기질 인산화를 촉진시킬 수 있는 능력에 근거하고 있다; 방사성 동위 원소 ³²P-라벨 ATP (³²P-γ-ATP)는 ³²P를 가진 단백질 기질을 방사성적으로 태그시키기 위하여 반응 시스템에서 이용된다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여 단백질 기질을 분리하고 격리시킨 이후에, 방사성 동위 원소 ³²P-라벨 단백질 기질의 세기가 기록되어진다.

EGFR 티로신 키나아제 (2.4 μg/μl, 14.5 units/μg, 시그마)와 Crk (EGFR 기질, 32 ng/μl)은 25 μl의 키나아제 반응 버퍼에서 혼합된다. 이 키나아제 반응 버퍼는 1 μM의 비 아이소토프 라벨-ATP를 포함하고 있다. 위에 언급한 혼합물은 염산 Icotinib 결정형 I (0, 0.5, 2.5, 12.5, 및 62.5 nM)의 다른 농도를 포함한다. 혼합물을 얼음에 10 분간 담궈 두고, ³²P-γ-ATP의 1 μCi를 첨가한다. 30 ℃ 에서 20 분간 둔 다음에, 도데실황산 나트륨(SDS) 샘플 버퍼를 첨가하고, 혼합물을4 분 동안 100 ℃의 물에서 끓인다. 샘플은 10% SDS-PAGE에 의해 분리된다. . 폴리아크릴아미드 겔의 진공 건조가 완료되면 포스포르이미저(몰레큘라 다이나믹스(Molecular Dynamics Inc.) 제품)을 이용하여 방사성 라벨된 단백질의 세기가 측정되고 기록된다. 신호는 이미지콴트 소프트웨어(ImageQuant software)를 이용하여 수량적으로 분석된다. Crk 기질 인산화의 정도는 키나에제의 활동을 예측하는데 사용된다.

억제 (%) = (1 - 테스트 그룹의 키나아제 활동/통제 그룹의 키나아제 활동) x 100%

결과:

(1) 염산 Icotinib 결정형 I은 용량 반응 의존 관계에서 EGFR 티로신 키나아제를 억제하였다. 염산 Icotinib 결정형 I의 농도가 0.5, 2.5, 12.5 및 62.5 nM일 때, EGFR 키나아제 활동의 억제률은 각각 20.5, 36.6, 63 및 87.6%이었다. 용량-반응 곡선에서, EGFR 키나아제 활동을 억제하기 위한 염산 Icotinib 결정형 I의 IC₅₀ (50% 의 활동이 억제될 때의 억제제의 농도)는 해외에서 판매되고 있는 제품과 비슷한 5 nM이었다.

(2) EGFR 티로신 키나아제를 억제에 대한 염산 Icotinib 결정형 I의 선택성을 연구하기 위해서, 염산 Icotinib 결정형 I이 EGFR과 Arg (abl-관련 유전자) 티로신 키나아제 활동과 Crk 기질 인산화를 어느 정도 억제할 수 있는지 같은 방법을 사용하여 평행하게 비교하였다. 62.5 nM 농도를 가진 염산 Icotinib 결정형 I은 Arg 키나아제를 억제하지는 못했지만, EGFR 키나아제는 억제하였는데 이때, EGFR 키나아제에 대한 염산 Icotinib 결정형 I의 선택성은 97%였다.

위에 나타낸 결과는 염산 Icotinib 결정형 I이 민감하고 선택적인 EGFR 키나아제 억제제임을 보여준다.

테스트 2: 세포 단위에서 염산 Icotinib 결정형 I에 의한 EGFR -중개 단백질 인산화의 억제

방법: 본 실험은 다량의 EGFR-발현 세포 라인, A431 (인간 편평 세포 암종)을 활용하였다. 대수 증식기에 있는 A431 세포들을 12 홈판 세포 배양기(5x10⁵ 세포/홈)에 넣는다; 이 세포들은 5% CO₂에서 10% 소태아 혈청 (FCS)을 함유하고 있는 DMEM 세포 배양기에서 (Gibco 회사) 37℃로 18 시간 배양된다. 이 세포들은 PBS 버퍼로 두 번 세척되고, FCS가 없는 DMEM이 첨가된다. 18 시간 배양한 다음에, 디메틸 술폭시드(DMSO)에 있는 염산 Icotinib 결정형을 최종 농도가 0, 10, 50, 250 또는 1000 nM이 되도록 하여 별도의 배양 홈에 첨가한다. 37℃에서 2.5 시간 인큐베이트한 다음에, 세포를 자극하기 위해 EGF 100 ng/ml을 5 분간 첨가한다. 총 세포 단백질을 수집하기 위하여, 세포는 1 mM 바나데이트(탈인산화 억제)가 있는 곳에서 추출되고, 단백질 10% SDS-PAGE에 의해 용해되며 니트로셀룰로스로 이동된다. 항-포스포티로신 항체(PY99 및 4G10, 업스테이트 바이오텍)와 함께 인산화 단백질 (PY99 및 4G10, 업스테이트 바이오텍)을 검출한 뒤에, 양고추냉이 과산화 효소 라벨된(horseradish peroxidase-labeled) 2차 항체 (트랜스덕션 래보러토리, Inc)의 실현화와 ECL 화학 발광 (아멀샴 주식회사) 밴드가 농도 측정법에 의해 수량화된다. 내부 조절로서 염산 Icotinib 결정형 I의 여러 농도에 노출된 세포에 있는 EGFR의 양을 비교하기 위하여 막들을 벗겨내고 이것을 항-EGFR 항체와 함께 인큐베이트한다.

억제율 (%) = (1 - 테스트 그룹의 키나아제 활동/통제 그룹의 키나아제 활동) x 100%

결과: A431 세포에서, 염산 Icotinib 결정형 I은 EGF-유도된, EGFR 티로신 키나아제 중재 세포간 단백질 티로신 인산화를 각기 다른 농도 10, 50, 250 및 1000 nM에서 각각 5.4, 52.9, 61.9 및 63.7% 억제하였다. 반수 영향 농도 (EC₅₀)는 대략 50 nM이었다. 결과는 또한 EGFR 발현이 각기 다른 염산 Icotinib 결정형 I의 농도에 노출된 세포들 사이에서 크게 다르지 않음을 보여 주었으며, 이는 약물이 EGFR 발현을 변경시키지 않고 EGFR 키나아제 활동만 억제함을 의미한다.

테스트 3: 염산 Icotinib 결정형 I에 의한 시험관에서의 인체 종양 세포주의 성장 억제

종양 세포주: A431인체 편평세포암종, A549 인체 비소세포 폐암, BEL-7402 인체 간암, BGC-823 인체 위선암, HCT8 인체 췌장암, H460 인체 폐선암, KB 인체 편평세포암종.

방법: 10% FBS를 가지는 RPMI1640세포 배양액 200 μL가 있는 96-홈판에 세포(~2 × 10³)를 넣었다. 37℃ 에서 24시간이 지난 후, 5%의 CO₂, 배양액은 DMSO에 용해된 염산 Icotinib 결정형 I을 함유하고 있는 배양액을 가지고 5 개 홈판의 배양기판으로 대체되었으며 여러 차례 희석되었고 최종 Icotinib 농도는 0.05-300 μM가 되었다. DMSO 농도는 최고 약물 농도에서 0.1% 미만이었다. 음성대조법으로서, 0.1% DMSO를 가지는 단일 배양액에서 세포를 인큐베이트하였다. 96 시간 인큐베이트한 이후에, 마이크로플레이크 리더(기준 파장 450 nm, 검출 파장 570 nm)을 이용하여MTT [3-(4,5-다이메틸싸이아졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라조니움] 비색 분석법을 실시하였다. 억제율에서의 약물 농도의 로가리듬은 선형이며 약물의 억제 중간 농도가 (IC₅₀) 구해졌다.

결과: 표 3에 나타난 바와 같이, 염산 Icotinib 결정형 I에 의한, 높은 EGFR-발현 A431 세포를 포함하여 인체 종양 세포의 시험관에서의 억제는 복용양에 의존하였다. A431 세포주는 아주 민감하며 IC₅₀이 1 μmol/L이고, 그 다음이 소화기 암 세포주 BGC823, 인체 비소세포 폐암 세포주 A549, 그리고 인체 폐선암 세포주 H460 로 민감하며 각각 IC₅₀가 4, 12 및 16 μmol/L이다. 염산 Icotinib 결정형 I은 HCT8, BEL-7402, 및 KB 종양 세포에 대해서는 매우 낮은 활동을 하였다.

표 3. 염산 Icotinib 결정형 I의 종양 세포 성장 억제

테스트 4: 인체 종양 이종 이식을 한, 털 없는 쥐에서 염산 Icotinib 결정형 I에 의한 종양의 억제

인체 A431 (인체 편평 세포암종 세포주) 이종 이식 종양의 억제에 있어 염산 Icotinib 결정형 I과 염산 erlotinib을 비교하기 위한 기초 연구

방법: 이종 이식 연구를 위해 높은 EGFR-발현 인체 A431 (인체 편평 세포암종 세포주) 세포주를 선택하였다.

종양 이식 방법: 종양 결절을 생성하기 위하여 BALB/C 털 없는 쥐의 오른쪽 다리 밑에 A431 인체 편평 세포암종 세포주를 피하 주사 주입하였다. 이 결절들을 채취하여 통상적인 주사를 위해 6 mm³ 단위로 자르고 연구를 위해 각 쥐에게 주입하였다. 종양이 대략 20 mm³의 크기로 자라면 (6-7일), 쥐들을 한 그룹당 6-9 마리씩 임의로 4 그룹으로 나누고 몸무게를 기록하였다. 네 개의 그룹은 통제 그룹 (약물 치료 없음), 염산 erlotinib 치료 그룹 (200 mg/kg), 저량 및 다량의 염산 Icotinib 결정형 I 치료 그룹 (200 및 50 mg/kg)으로 구성되었다. 약물은 경구를 통해 하루 한번 씩 투입되었으며; 복용 횟수는 종양 성장에 따라 각기 다르게 하였다. 종양 부피 [종양 부피 (V) = 종양 크기 (L) × 종양의 짧은 지름 (S)²/2]는 칼리퍼스를 이용하여 3 일에 한 번씩 측정하였다. 마지막 약을 투여 하고 몸무게를 잰 후 24-시간 이후에 쥐는 희생되었다. 종양을 제거하고 실제 종양의 크기를 재기 위하여 무게를 재었다. t 테스트를 이용하여 모든 그룹을 분석하였다. p 값이 <0.05이면, 이는 통계적으로 매우 중요한 것으로 간주되었다.

효능결정: 종양 억제율 = [1 - 치료 그룹의 종양 평균 무게 (T) /통제 그룹의 종양 평균 무게 (C)] × 100%

결과는, A431 이종 이식 쥐 모델에게 경구로 투여된 염산 Icotinib 결정형 I이 뚜렷한 항암 효과와 복용량 의존도를 보여주고 있음을 나타내었다. 염산 Icotinib 결정형 I 과 염산 erlotinib 사이의 효능 결과는 200 mg/kg에서 비교될 수 있었으며, 이 모델에서는 염산 Icotinib 결정형 I보다(64.6%) erlotinib이 다소 우수한 (77.6%) 종양 억제를 보여 주었다. 그러나, 독성은 erlotinib이 더 강했으며; 8 마리 중3 마리가 200 mg/kg를 5 일 동안 투여한 뒤 사망하였으며 복용량을100 mg/kg로 낮춘 뒤에는 9 일간의 회복기 이후 사망하였다. 동등하게 비교하기 위하여 erlotinib를 100 mg/kg로 낮출 때 Icotinib도 똑같이 100 mg/kg으로 낮추었다. 양쪽의 복용량에서 Icotinib 그룹은 독성이 관찰되지 않았다. 실험이 종료될 때 erlotinib 그룹의 쥐들은 몸무게가 많이 줄었으며 활기가 없었으며 반면 Icotinib 그룹은 뭄무게가 늘었으며 추가 9 일간 약을 투여하였음에도 약 내성을 보여 주었다.

테스트 5: 인체 종양 이종 이식을 한, 털 없는 쥐에서 염산 Icotinib 결정형 I과 Iressa ^TM 정제의 종양 억제 비교

방법: H460 인체 폐선암 세포 이종 이식에 대한 염산 Icotinib 결정형 I과 Iressa^TM 정제의 항암 작용을 비교하기 위하여 사용된 연구 방법은 표 4에 나타내었다.

연구 결과는 염산 Icotinib 결정형 I과 Iressa^TM 정제의 연마 분말을 하루 한 번 14 일 동안 위관 영양법으로 투여할 경우, 염산 Icotinib 결정형 I의 높은 복용량, 중간 복용량, 낮은 복용량(120, 60 및 30 mg/kg)에 따른 H460 종양 억제율은 각각 52.0, 49.3 및 37.5%이었고; Iressa^TM 그룹 (120 mg/kg)의 종양 억제율은 38.3%였다. 염산 Icotinib 결정형 I 30 mg/kg 그룹은 인체 폐선암 세포 이종 이식에 대해Iressa^TM 정제 120 mg/kg 그룹과 같은 억제율을 보여 주었고, 30 mg/kg 보다 더 높은 두 개의 복용량 그룹에서는 Iressa^TM 정제 120 mg/kg 복용 그룹보다 더 높은 억제울을 보여주었다. 독성에 있어서는 Iressa^TM 정제 그룹이 염산 Icotinib 결정형 I 그룹보다 더 높게 나타났으며 Iressa^TM 정제 그룹에서의 동물들은 몸무게가 더 줄었고 활기가 없었다.

염산 Icotinib 결정형 I을 사용한 비글과 생쥐, 쥐에 대해 약리학과 독성학을 진행하였다. 결과는: Icotinib 염산 Icotinib 결정형 I은 구강 독성이 낮았으며, 골수 독성은 없었고 간 독성은 원 상태로 되돌릴 수 있다는 것이었다. 약학적 안전성에 대한 테스트 결과에서는, 염산 Icotinib 결정형 I이 호흡 기능, 혈압, 순환 기능에 아무런 영향을 미치지 않았으며, 또한 자율 신경계 활동이나 또는 중앙 신경계에도 아무런 영향을 미치지 않음을 보여 주었다. 추가 독성 테스트 결과에서는 최기성 독성, 돌연 변이성 독성 및 생식 독성이 없을 보여 주었다.

추가로, 비글과 쥐에서 염산 Icotinib 결정형 I의 비 임상적인 약물 동력학적 연구를 실시하였다. 결과는 염산 Icotinib 결정형 I가 경구로 투여되었을 경우 흡수가 잘 되었으며, 쥐와 개에 있어 절대적 생체내 이용 효율은 27-62%이었음을 보여주었다. 대략 1 시간에서 플라즈마 농도는 최고치에(Tmax) 도달하였고, 주로 배설물이나 소량은 소변으로 배출되었다. 염산 Icotinib은 다양한 조직으로 흡수되었으나, 뇌 조직에는 소량 흡수되었다. 이는 개에서는 혈액-뇌 사이의 막을 넘나드는 것이 쉽지 않음을 나타내는 것이다. 염산 Icotinib 결정형 I에 대해서, 쥐의 간에서는 P450 엔자임의 유도 효과가 두드러진 것이 없었으며, 약물 메타볼리즘 엔자임에서의 억제적 활동은 없었다.

테스트 6: 임상 시험

1) 정제를 만들기 위한 염산 Icotinib 결정형 I을 이용하여, 1 차 임상 안전 연구가 76 개체에서 단일 복용량 25, 50, 100, 150, 225, 325, 425, 575 및 1025 mg을 가지고 실시되었다. 결과는 25-1025 mg의 단일 복용량이 안전함을 보여 주었다.

2) PK의 2 차 임상 시험에서는, 적어도 한 번의 플라티늄 제제가 포함된 항암 화학요법에서 실패를 한 후기 단계의 비소세포 폐암(NSCLC) 환자 104 명에게 음식을 주지 않고 염산 Icotinib 결정형 I 정제를 투여하였을 경우 안전성과 효능성 시험을 실시하였다. 치료의 효능 평가는 표 4에 나타내었다. 사용한 용어의 정의는: PR: 부분 관해, CR: 완전 관해, SD: 병의 안정, PD: 병의 진행, ORR: 객관적 반응률, DCR: 질환 제어율.

표 4. 염산 Icotinib 결정형 I 정제를 다양한 복용량으로 후기 단계의 비소세포 폐암(NSCLC) 환자에게 투여했을 때 효능 평가

위의 데이타는 염산 Icotinib 결정형 I이 비소세포 폐암을 치료하는데 효과적임을 나타낸다.

테스트 7: 염산 Icotinib 과 염산이 없는 Icotinib 의 각기 다른 결정형에 대한 약물 동력학적 연구

약물과 시약: Icotinib (염산 없는) 및 염산 Icotinib 결정형 I, II, III, 및 IV는 작은 미립자로 간다. 물질 함량 (순도)는 99.0%이하가 되어서는 안된다. 카르복시 메틸셀룰로오스 나트륨은 의약품 등급이다.

실험 동물: 흰쥐, 암컷 및 수컷, 각 150-220 g.

약물 준비: 각 약물을 적절한 양으로 무게를 재고 카르복시 메틸셀룰로오스 나트륨을 은 0.5%까지 첨가한다. 최종 농도가 물에서 3.5 mg/mL되도록 현탁액을 준비한다.

복용법 및 샘플 채취: 염산 Icotinib 35 mg/kg에 해당하는 현탁액을 복용량10 ml/kg로 굶은 흰쥐에게 경구로 각각 투여한다. 약을 투여한 후 1, 2, 3, 6, 10, 및 24분 간격으로 약 0.5-1.0 mL의 혈액을 헤파린화 시킨 튜브에 채취하여 원심 분리하여 분리된 플라즈마를 -20℃에 저장한다.

분리한 다음에, 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 샘플을 분석하였다. 크로마토그래피 조건으로는 고정상으로서는 C18-실레인 결합 실리카를 이용, 이동상으로는 아세토니트릴에서의 나트륨 디수소 인산염 0.02 mol/L (40:60, pH를 5.0로 조정하기 위해 수산화 나트륨액 사용)를 이용하였고 파장 길이는 334 nm이었다. 각 혼합물에 대한 농도-시간 곡선 밑의 면적은 아래의 표에 내타내었다.

위의 실험은, 염산 Icotinib 결정형 I, II, III, 및 IV의 농도-시간 곡선 밑의 면적(0-t)과 농도-시간 곡선 밑의 면적(0-무한대)이 프리 베이스의 면적보다 최고 약 3 배 가량 더 많음을 보여주고 있다. 따라서, 염산 Icotinib 결정형 I, II, III, 및 IV의 생체 이용율은 프리 베이스의 생체 이용율보다 월등하게 우수함을 알수 있다.

Claims

4-[(3-에티닐페닐)아미노]-6,7-벤조-12-크라운-퀴나졸린의 염산염인 하기 화학식 I의 화합물.
다음 단계를 포함하는 제1항의 화합물의 제조 방법.
다음 단계를 포함하는 제1항의 화합물의 제조 방법.
다음 단계를 포함하는 제1항의 화합물의 제조 방법.
다음 화학식의 화합물.
X-선 분말 회절 패턴에서 하기 회절각에서의 회절 피크를 특징으로 하는 4-[(3-에티닐페닐)아미노]-6,7-벤조-12-크라운-퀴나졸린 염산염의 결정형 I.
X-선 분말 회절 패턴에서 하기 회절각에서의 회절 피크를 특징으로 하는 4-[(3-에티닐페닐)아미노]-6,7-벤조-12-크라운-퀴나졸린 염산염의 결정형 II.
X-선 분말 회절 패턴에서 하기 회절각에서의 회절 피크를 특징으로 하는 4-[(3-에티닐페닐)아미노]-6,7-벤조-12-크라운-퀴나졸린 염산염의 결정형 III.
X-선 분말 회절 패턴에서 하기 회절각에서의 회절 피크를 특징으로 하는 4-[(3-에티닐페닐)아미노]-6,7-벤조-12-크라운-퀴나졸린 염산염의 결정형 IV.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 결정형을 얻기 위하여 용매 또는 혼합 용매에 4-[(3-에티닐페닐)아미노]-6,7-벤조-12-크라운-퀴나졸린 염산염을 용해하고 환류, 여과, 냉각, 결정화, 및 건조하는 것을 포함하는, 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 결정형의 제조 방법.
제10항에 있어서, 용매가 물, 저급 알코올, 케톤, 에테르, 에스테르, 할로겐화 탄화수소, 알칸, 할로겐화 벤젠, 지방족 니트릴 또는 방향족 용매인 방법.
제11항에 있어서, 용매가 이소프로판올, 에틸 아세테이트, 50% 수성 에탄올, 물, N,N-디메틸포름아미드, 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 프로판올인 방법.
치료적 유효량의 제1항의 화합물 및/또는 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 결정형 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
제13항에 있어서, 경구 투여에 적합한 것인 약학 조성물.
제13항에 있어서, 정제 또는 켑슐 형태인 약학 조성물.
제15항에 있어서, 정제 또는 캡슐의 복용량 단위가 25-1025 mg인 약학 조성물.
제13항에 있어서, 약학 조성물 중 제1항의 화합물 또는 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 결정형이 1-99 중량%, 바람직하게는 1-70 중량%, 또는 보다 바람직하게는 10-30 중량%인 것인 약학 조성물.
포유류의 과다 비-악성 과형성 질환 (excessive non-malignant hyperplasia disease), 췌장염, 신장 질환, 암, 혈관 신생 또는 혈관 발생-관련 질병에 대한 치료 또는 예방을 위한 의약품 또는 포유류 배아 세포 이식을 위한 의약품의 제조에 있어서 제1항의 화합물 또는 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 결정형의 용도.
제18항에 있어서, 과다 비-악성 과형성 질환이 양성 피부 비대증 또는 양성 전립선 비대증인 용도.
제18항에 있어서, 과다 비-악성 증식 질환, 췌장염, 신장 질환, 암, 혈관 신생 또는 혈관 신생-관련 질환이 종양 혈관 신생, 류마티스 관절염과 같은 만성 염증 질환, 죽경화증, 건선 및 경피증과 같은 피부 질환, 당뇨병에 의한 피부 질환, 당뇨 망막 병증, 조기 망막증, 노인성 착색 (age-related degeneration strains), 혈관종, 신경 교종, 카포시 (Kaposi)내부 종양, 난소암, 유방암, 폐암, 췌장암, 림프종, 전립선암, 결장암 및 피부암 및 이들의 합병증으로부터 선택된 것인 용도.
치료적 유효량의 제1항의 화합물 및/또는 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 결정형 및/또는 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 포유류 조직의 과다한 증식에 의한 질병이 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류 조직의 과다한 증식에 의한 질병을 치료하는 방법.
제21항에 있어서, 메트릭스 메탈로프로테이나제 억제제, 혈관 내피 성장 인자 수용체 키나아제 억제제, HER2 억제제, 혈관 내피 성장 인자 수용체 항체 약물 또는 앤도스타틴 약물을 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제21항에 있어서, 유사 분열 억제제, 알킬화 약물, 항대사 물질, 종양 항생제, 성장 인자 억제제, 세포 주기 억제제, 엔자임, 엔자임 억제제, 생물학적 반응 조절 물질, 및 항-호르몬 약물로부터 선택된 항-종양 약물을 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
치료적 유효량의 제1항의 화합물 및/또는 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 결정형 및/또는 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 티로신 키나아제 기능 장애와 관련된 질병이 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 티로신 키나아제 기능 장애와 관련된 질병을 치료하는 방법.
제24항에 있어서, 티로신 키나아제 기능 장애와 관련된 질병이 뇌암, 폐암, 간암, 방광암, 흉부암, 두경부암, 식도암, 소화기관암, 유방암, 난소암, 자궁암 또는 갑상선암 및 이들의 합병증으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 질병이 뇌암, 폐암, 신장암, 골암, 간암, 방광암, 흉부암, 두경부암, 식도암, 위암, 결장암, 항문암, 유방암, 난소암, 흑색종, 피부암, 부신암종, 자궁경부암, 림프종 또는 갑상선암 및 이들의 합병증으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항의 화합물 및/또는 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 결정형의 투여량이 50 내지 2,100 mg/일이고 투여 주기가 1일당 1 내지 3 회인 방법.
제27항에 있어서, 투여량이 75 내지 1,200 mg/일이고 투여 주기가 1일당 1 내지 3 회인 방법.
제28항에 있어서, 투여량이 75 내지 1,200 mg/일이고 투여 주기가 1일당 2 내지 3 회인 방법.
제29항에 있어서, 투여량이 100 내지 1,200 mg/일이고 투여 주기가 1일당 2 내지 3 회인 방법.