KR20110028981A - 표적지향성 ｓｉＲＮＡ-층상형 무기 수산화물 나노혼성체, 그 제조방법, 및 나노혼성체를 함유하는 종양 치료용 약학 조성물 - Google Patents

표적지향성 ｓｉＲＮＡ-층상형 무기 수산화물 나노혼성체, 그 제조방법, 및 나노혼성체를 함유하는 종양 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 강력한 유전자 치료제인 siRNA (small interfering RNA)와 표적지향성 층상형 무기 수산화물과의 나노혼성체, 그 제조방법, 및 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체를 함유하는 종양 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 나노혼성체는, 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 표적지향성 다작용기 리간드가 결합된 층상형 무기 수산화물과 나노혼성체를 이루고 있는 siRNA의 생체 내 안정성이 종양특이적 전달 효율을 향상시켜 비교적 낮은 농도의 투여량에서 siRNA의 종양치료 활성을 나타내므로 범용적인 표적지향성 종양치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
siRNA, 층상형 무기 수산화물, 표적지향성, 나노하이브리드, 유전자 치료제

Description

표적지향성 ｓｉＲＮＡ-층상형 무기 수산화물 나노혼성체, 그 제조방법, 및 나노혼성체를 함유하는 종양 치료용 약학 조성물 {Active siRNA-Inorganic Layered Double Hydroxide Nanohybrid, a Process for Preparing the Same, and a Pharmaceutical Composition Comprising the Same for Treating Targeted Tumor}
본 발명은 강력한 유전자 치료제인 siRNA (small interfering RNA)와 표적지향성 층상형 무기 수산화물과의 나노혼성체, 그 제조방법, 및 상기 나노혼성체를 함유하는 종양 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
유전자 치료에 있어서 안전하고 효율적인 유전자 전달기술은 오랫동안 연구되어 왔으며 다양한 유전자 전달체와 전달기술이 개발되어 왔다. 아데노바이러스, 레트로바이러스 등 바이러스를 이용한 유전자 전달기술과, 리포좀과 양이온성 지질, 그리고 양이온성 고분자 등을 이용한 비바이러스성 벡터(nonviral vector)를 이용한 유전자 전달기술들이 개발되어 왔다. 그러나, 현재까지 바이러스 자체를 유전자 치료제의 전달체로 이용하는 방법은 전달된 유전자가 숙주의 염색체에 이입되 어 숙주 유전자의 정상기능에 이상을 유도하거나 발암 유전자를 활성화시키지 않는다고 확신할 수 없으며, 바이러스 유전자가 적은 양이라도 계속 발현되고 있을 경우 자가면역증을 유발하거나, 바이러스 전달체로부터 변형된 형태의 바이러스 감염이 유발될 경우 효율적인 방어면역을 일으키지 못할 수도 있다. 따라서, 바이러스를 사용하는 방법 대신 리포좀에 유전자를 융합시키는 방법이나 양이온을 지닌 지질이나 고분자를 이용한 방법, 무기 나노입자를 이용한 방법 등이 그들 각각의 단점을 개량하는 방향으로 연구되고 있다. 이들 비바이러스성 벡터들은 바이러스성 벡터보다는 그 효율성에 있어 많이 뒤떨어지지만, 생체 내 안전성과 경제성을 고려해 볼 때 부작용이 적고 생산 가격이 저렴해 질 수 있다는 장점이 있다. 또한, 현재 유전자 전달 시스템(gene delivery system)에서 가장 중요하게 떠오르고 있는 접근법은 표적 특이적 전달성 (target specific delivery)에 관한 부분이다. 유전자를 생체내에 직접 투여하게 되면, 생체내 모든 장기 및 세포들이 동일하게 유전자의 공격을 받음으로써 정상세포 및 정상조직이 손상을 입게 되므로 선택적 유전자 전달 및 치료 방법을 위한 기술 개발이 중요하다.
한편, siRNA는 최근 동물세포에서 특정 유전자의 발현을 저해시키는데 탁월한 효과를 나타내는 것으로 밝혀져 유전자 치료제로 각광을 받고 있는 물질로써, 이들의 높은 활성과 정밀한 유전자 선택성으로 인해 지난 20년간 연구되어 현재 치료제로 활용 중인 안티센스 올리고뉴클레오티드(ODN)를 대체할 치료제로 기대되고 있다. siRNA 는 19개에서 23개 정도의 뉴클레오티드로 구성된 짧은 이중 나선의 RNA 가닥으로, 이들과 염기서열이 상보적인 치료하고자 하는 유전자의 mRNA를 표적 으로 삼아 유전자 발현을 억제시킨다. 그러나, siRNA는 안정성이 낮아 생체 내에서 단시간에 분해되어 버리므로 그 치료 효율이 급격히 떨어지게 되고, 고가의 siRNA의 투여량을 높게 해야 하며, siRNA의 음이온성으로 인해 같은 음전하를 띄는 세포막을 쉽게 투과하기가 어려워 결과적으로 세포내로의 전달성이 떨어지게 된다는 문제점이 있다 (Celia M. ＆Henry, Chemical and Engineering News December, 22, 32-36, 2003). 또한, 비록 siRNA가 이중가닥으로 구성되어 있기는 하지만, RNA를 구성하는 리보스당의 결합은 DNA를 구성하는 디옥시리보스당의 결합에 비해 화학적으로 매우 불안정하여 대부분이 생체 내에서 반감기가 30분 내외로 빠르게 분해되어 버린다. 최근에는 siRNA에 여러 가지 작용기를 도입하여 이들을 분해효소로부터 보호하여 안정성을 향상시키고자 하는 시도를 하고 있으나 (Frank Czauderna et al., Nucleic Acids Research 31, 2705-2716, 2003 참조), 현재까지 siRNA의 안정성 확보 및 효율적인 세포막 투과성을 위한 기술은 개발 단계에 있다고 할 수 있다. 또한, siRNA의 치료효과를 얻기 위해 이들의 혈액 내에서의 불안정성을 고려하여 단순히 고농도의 siRNA 만을 계속적으로 주입하는 방법을 사용하고 있으나 그 효율이 낮은 것으로 알려져 있으며, 경제적인 측면에서도 유전자 치료제로써 siRNA를 이용하기 위해서는 이들의 세포내 전달이 용이한 새로운 비바이러스성 전달체 제조 기술개발이 필연적으로 요구된다고 할 수 있다. 대한민국등록특허 제10-0883471호에 의하면, siRNA와 친수성 고분자를 공유결합으로 연결시킨 하이브리드 접합체 및 상기 접합체와 양이온성 화합물로 이루어진 고분자 전해질 복합체 미셀을 이용하여 siRNA의 생체내 안정성을 향상시킴으로써 세포내로 치료용 siRNA를 효 율적으로 전달할 수 있으며, 또한 비교적 낮은 농도의 투여량에서 siRNA의 활성을 나타낼 수 있다고 보고되어 있다.
그러나, siRNA의 안정성 향상과 표적지향성 유전자 치료제 개발을 위한 비바이러스성 층상형 무기 수산화물을 이용한 종양 치료용 약학 조성물은 보고된 바 없으며, 이에 본 발명자들은 siRNA를 이용하는 표적지향성 유전자 치료제를 개발하고자 노력한 결과, siRNA를 종양 특이적 다작용기 리간드가 결합된 층상형 무기 수산화물과 나노혼성화시켜 효율적으로 종양을 치료할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 siRNA의 세포내 전달 효율성을 향상시키기 위해, siRNA를 층상형 무기 수산화물에 캡슐화시키고 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 표적지향성 다작용기 리간드가 결합된 나노혼성체 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 종양치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 화학식 1로 표시되는 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체를 제공한다:
[화학식 1]
[M(Ⅱ)1- xM(Ⅲ)x(OH)2]X+[S][T]
여기서, M(Ⅱ)는 2가 금속 양이온을 나타내고 M(Ⅲ)은 3가 금속 양이온을 나타내고, x는 0.1 내지 0.5 미만의 수이며 S는 siRNA이며, [T]는 종양 표적지향성 다작용기 리간드이다.
본 발명은 또한, (a) 2가 금속염과 3가 금속염 함유 수용액에 염기 수용액을 적가하여, 침전된 층상형 무기 수산화물을 제조하는 단계; (b) siRNA 함유 용액을 (a)단계에서 제조된 층상형 무기 수산화물이 분산된 용액과 혼합 및 교반하여 제조된 층상형 무기 수산화물이 분산된 용액과 혼합 및 교반하여 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체를 이루는 단계; 및 (c) 상기 혼성체에 종양 마커 특이적 다작용기 리간드를 결합시켜 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체를 제조하는 단계를 포함하는 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 나노혼성체를 함유하는 종양 치료용 약학 조성물 및 그 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체는 siRNA의 생체 내 안정성을 증가시키고, 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 표적지향성 다작용기 리간드는 종양특이적 전달 효율을 향상시켜 비교적 낮은 농도의 투여량에서 siRNA의 종양치료 활성을 나타내어 다양한 질병 종양 치료의 효율성 및 정확성을 향상시키는 조성물로 사용할 수 있을 뿐만 아니라 새로운 형태의 siRNA 전달 시스템으로 생명공학을 위한 기초연구와 의학 산업상의 매우 유용하게 사용될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 표적지향성을 가지는 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "나노혼성체(nanohybrid)"는 siRNA가 층상형 무기 수산화물과 분자간 인력(intermolecular interaction)으로 결합되는 것을 의미한다. 상기 분자간 인력의 종류 (예, 정전기적 인력, 소수성 인력, 수소 결합, 공유 결합(예, 디설파이드 결합), 반데르 발스 결합, 이온 결합 등)는 특별히 제한적이지 않기 때문에 다양하게 선택될 수 있다. 또한, 상기 "나노혼성체"라는 용어는 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체상에 표적지향성 다작용기 리간드가 분자간 인력으로 결합되어 있는 형태도 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 일 관점에서, 하기의 화학식 1로 표시되는 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체에 관한 것이다:
[화학식 1]
[M(Ⅱ)1- xM(Ⅲ)x(OH)2]X+[S][T]
여기서, M(Ⅱ)는 2가 금속 양이온을 나타내고 M(Ⅲ)은 3가 금속 양이온을 나 타내고 x는 0.1 내지 0.5 미만의 수이며 S는 siRNA이며 T는 종양 표적지향성 다작용기 리간드이다.
본 발명에 있어서, siRNA의 뉴클레오티드 길이가 긴, 예컨대 분자량 30,000 수준에서는 표적지향성 층상형 금속 수산화물과 결합된 경우에도 이중가닥의siRNA 올리고머가 이들의 유전자 저해작용에 관여하는 생체 내 효소 복합체인 RNA-유도성 사일런싱 복합체(RISC)와 안정적으로 결합할 수 있으나, 보통의 19개의 뉴틀레오티드인 10,000 수준의 siRNA의 경우 유전자 저해작용을 돕는 세포내 효소 복합체와 결합할 때 표적지향성 다작용기 리간드에 의해 구조적 안정성이 떨어질 수 있으므로 생체 내에서 또는 세포내에서 이들 결합체가 분해될 수 있는 결합을 도입하는 것이 유리하다. 따라서, 상기 siRNA의 올리고 가닥은 분자량 10,000 내지 30,000 사이에서 선택되는 것이 바람직하다. siRNA 올리고 가닥이 상기 범위의 분자량을 가질 경우, 19 내지 30개, 바람직하게는 19 내지 23개의 뉴클레오타이드를 포함하게 된다. 이 때, 상기 siRNA는 c-myc, c-myb, c-fos, c-jun, c-raf, c-src, bcl-2 또는 VEGF (vascular endothelial growth factor), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PIGF, 또는 서바이빈 유래의 siRNA를 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 siRNA 도입시에, 세포질 내에 과량 존재하는 글루타치온(glutathione)에 의해 세포내에서 분해되는 이황화결합, 세포내 유입된 후 산성을 띄는 환경에서 효과적으로 분해될 수 있는 산 분해성 결합, 세포내로 유입된 후 세포 안에서 효과적으로 분해가 가능한 에스테르결합, 안하이드라이드 결합과 특정 세포 주변에 존재하는 효소들에 의해 세포내로 유입되기 직전에 분해될 수 있는 효소분해성 결합 등을 도입하는 것이 바람직할 수 있다.
암(cancer)은 일반적으로 능동적이고 자발적인 세포의 죽음인 세포자멸(apoptosis)의 속도가 줄어들고 세포주기가 변하는 것과 연관되어 있기 때문에, 세포주기를 억제하거나 또는 세포자멸을 회복시키는 방법은 새로운 종양 치료방법으로 대두되고 있다. 세포자멸이 억제되는 종양에서는 세포자멸 억제 단백질(IAPs; inhibitors of apoptosis)이 발현된다고 알려지고 있으며, 전기 IAPs는 세포자멸을 유도하는 단백질분해효소(caspase)의 활성을 직접적으로 억제하거나 또는 관련된 전사인사인 NF-kB의 활성을 조절하는 방식으로, 그 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다. 최근의 연구결과로부터, IAPs의 하나인 서바이빈(survivin) 단백질이 종양과 관련되어 있음이 밝혀지게 되었다. 서바이빈은 지금까지 테스트된 대부분의 신생 종양이나 형질변이된 세포주에서 공통적으로 발현되는 단백질로서, 지속적인 변이(mutation)가 일어나는 종양에서도 일정한 수준으로 발현된다고 알려지게 되어, 항암치료에 있어서 중요한 타겟이 될 것으로 예측되고 있다 (참조: Ambrosini G, et al., Nat. Med., 3(8):917-921, 1997).
서바이빈을 암호화하는 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합하여, 전기 mRNA를 불활성화시킬 수 있는 siRNA를 직접 종양세포에 도입시켜서, 종양 세포내에서 서바이빈의 발현을 억제시키거나 또는 서바이빈의 활성을 저해함으로써, 암세포를 효과적으로 치료하는 방법이 주목을 받고 있다 (대한민국등록특허 10-0848665). 본 발명의 이중가닥 siRNA는 서바이빈을 암호화하는 유전자로부터 전사된 mRNA와 결합할 수 있고, 세포내에서 서바이빈 발현을 억제한다.
본 발명의 siRNA의 바람직한 실시예로는, 거의 모든 종양으로부터 공통적으로 발현되는 서바이빈의 발현을 억제할 수 있는 서바이빈을 암호화하는 mRNA와 상보결합할 수 있는 siRNA일 수 있다.
구체적으로, 상기 서바이빈을 암호화하는 mRNA와 상보결합할 수 있는 siRNA는, 하기 표 1과 같은 염기서열일 수 있다.
[표 1]
염기서열 서열번호
5’-AAGGAGAUCAACAUUUUCA-3’ 서열번호1
5’-UAGGAAAGGAGAUCAACAU-3’ 서열번호2
5’-AGGAAAGGAGAUCAACAUU-3’ 서열번호3
5’-AGGAAAGGAGAUCAACAUU-3’ 서열번호4
5’-GGAAAGGAGAUCAACAUUU-3’ 서열번호5
5’-GAAAGGAGAUCAACAUUUU-3’ 서열번호6
5’-AAAGGAGAUCAACAUUUUC-3’ 서열번호7
5’-AGGAGAUCAACAUUUUCAA-3’ 서열번호8
5’-GGAGAUCAACAUUUUCAAA-3’ 서열번호9
또한, 상기 siRNA의 센스 또는 안티센스의 말단기는 다른 기능기로 치환될 수 있다. 예를 들어, 기능기의 예로서 3'의 하이드록시기는 아민기, 설프하이드릴기, 또는 포스페이트기 등으로서 치환될 수 있다. 본 발명에 따른 siRNA는 그 말단부에 종양 세포 선택적 리간드가 더 구비될 수도 있다. 상기 리간드로는 바람직하게는 세포특이적 항체, 세포 선택적 펩타이드, 세포성장인자, 폴산, 갈락토스, 만노스, 알지디, 트렌스페린 등이 사용될 수 있다. 이들 리간드는 이황화결합, 아미드 결합, 에스테르결합 등의 결합을 통해 상기 siRNA의 말단기에 도입될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 층상형 무기 수산화물은 결정 구조가 층상형이며, 음이온 교환능 (anion exchange capacity)이 있다. 이는 층상형 무기 수산화물의 수산화물층이 양전하를 띠고 있어 이를 보상하기 위해 음이온이 층간에 존재하며, 이 층간 음이온은 다른 음이온 화학종으로 치환될 수 있기 때문이다. 하기 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[화학식 2]
[M(Ⅱ)1- xM(Ⅲ)x(OH)2]X+[An -]X/n ·yH2O
여기서, M(Ⅱ)는 2가 금속 양이온을 나타내고 M(Ⅲ)은 3가 금속 양이온을 나타내고 A는 음이온 화학종으로서 n은 음이온의 전하수 이며 x는 0.1 내지 0.5 미만의 수이고 및 y는 0을 초과하는 양수이다.
본 발명에 있어서, 상기 2가 금속 양이온은 Mg2 +, Ca2 +, Co2 +, Cu2 +, Ni2 + 및 Zn2+로 구성된 군에서 선택되고, 상기 3가 금속 양이온은 Al3 +, Cr3 +, Fe3 +, Ga3 +, In3 +, V3 +, 및 Ti3 + 로 구성된 군에서 선택되고, 상기 음이온은 CO3 2 -, NO3 -, Cl-, OH-, O2 -, 및 SO4 2 -로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 2가 금속 양이온과 3가 금속 양이온의 비율을 2:1, 3:1 및 4:1 등으로 조절하여 층 전하가 조절된 형태의 층상형 무기 수산화물을 형성시킬 수 있다. 상기 2가 금속 양이온, 3가 금속 양이온, 및 상기 음이온은 상기 종류로 한정되는 것은 아니며, 당해 기술분야에서 층상형 무기 수산화물로서 공지된 것에 해당하는 것을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "종양 표적지향성 다작용기 리간드"는, siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체에 추가적으로 결합되어 표적지향성을 부여하는 종양 특이적 결합성분을 의미한다. 이러한 종양 특이적 결합성분의 예로는, 항원, 항체, RNA, DNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘 (streptavidin), 뉴트라비딘 (neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선동위원소로 표지된 바이오물질, 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 바이오물질을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
여기서, 상기 표적지향성 다작용기 리간드는 (i) 부착영역, (ii) 교차연결영역 및 (iii) 활성성분영역을 포함하는 물질을 의미한다. 이하에서 상기 다작용기 리간드를 보다 구체적으로 설명한다.
상기 "부착영역"은 층상형 무기 수산화물에 표면개질되어 부착될 수 있는 작용기 (functional group)를 포함하는 스페이서 혹은 표적지향성 다작용기 리간드의 일부분, 바람직하게는 말단을 의미한다. 따라서 부착영역은 층상형 무기 수산화물 표면과 친화성이 높은 작용기를 포함하는 것이 바람직하며, 층상형 무기 수산화물 이루는 물질에 따라 다양하게 선택될 수 있다. 부착영역은 예를 들면 aminosilane, epoxysilane, vinylsilane, -COOH, -NH2, -SH, -CONH2, -PO3H, -PO4H, -SO3H, -SO4H 또는 -OH를 포함할 수 있다.
상기 "교차연결영역"은 표면개질된 층상형 무기 수산화물에 근접한 다작용기 리간드의 일부분과 교차연결할 수 있는 작용기를 포함하는 ‘부착영역의 말단’과 ‘표적지향성 다작용기 리간드의 말단’을 의미한다. "교차연결"이란 다작용기 리간드가 근접하여 위치한 표면개질된 층상형 무기 수산화물의 부착영역 말단과 분자간 인력(intermolecular interaction)으로 결합되는 것을 의미한다. 상기 분자간 인력의 종류 (예, 소수성 인력, 수소 결합, 공유 결합(예, 디설파이드 결합), 반데르 발스 결합, 이온 결합 등)는 특별히 제한적이지 않기 때문에 교차연결할 수 있는 작용기는 목적한 분자간 인력의 종류에 따라 다양하게 선택될 수 있다. 교차연결영역은 예를 들면 -SH, -NH2, -COOH, -OH, -NR4 +X-, -에폭시(epoxy), -에틸렌(ethylene), -아세틸렌(acetylene) -술포네이트(sulfonate), -니트레이트(nitrate), 또는 포스포네이트(phosphonate)를 작용기로서 포함할 수 있다. 상기 교차연결영역의 작용기는 부착영역의 말단과 활성성분 말단의 종류 및 이의 화학식에 따라 달라질 수 있다.
또한, 상기 분자간결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합 중 어느 것이어도 무방하다. 이때, 비분해성 결합으로는 아미드 결합(amide bond) 또는 포스페이트 결합(phosphate bond)이 있고, 분해성 결합으로는 이황화결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드(anhydride) 결합, 생분해성 결합, 또는 효소 분해성 결합 등이 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 "활성성분영역"은 부착영역과 교차연결 할 수 있는 작용기를 포함하는 종양 특이적 결합성분 혹은 표적지향성 다작용기 리간드의 일부분, 바람직하게는 상기 부착영역과 반대편에 위치한 말단을 의미한다.
여기서, 상기 종양 특이적 결합성분은 항원, 항체, RNA, DNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘 (streptavidin), 뉴트라비딘 (neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선동위원소로 표지된 성분, 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 종양 특이적 결합성분 리간드로 바람직하게는 세포특이적 항체, 세포 선택적 펩타이드, 세포성장인자, 폴산, 갈락토스, 만노스, 알지디, 트렌스페린 등이 사용될 수 있다. 상기 활성성분은 종양 특이적으로 결합할 수 있는 리간드 또는 항체가 적합할 것이다. 상기 리간드로는 바람직하게는 세포특이적 항체, 세포 선택적 펩타이드, 세포성장인자, 폴산, 갈락토스, 만노스, 알지디, 트렌스페린 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체에 종양에 특이적으로 결합하여 치료할 수 있는 물질을 결합시킨 나노혼성체를 제공한다. 즉, 본 발명에서 "표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체"는 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체가 부착영역, 교차연결영역 및 활성성분영역을 포함하는 표적지향성 다작용기 리간드에 의해 둘러싸여 있되, 상기 활성성분영역에는 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 결합되어 있는 나노혼성체를 의미한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 표적지향성 나노혼성체를 구성하는 표적지향성 다작용기 리간드로는, 종양 세포에서 과발현되는 폴레이트 수용기에 선택적으로 감응하면서 카복실 말단을 갖고 있는 폴산을 사용하였다. 즉, 부착영역은 아미노실란의 실란 부분이며, 교차연결영역은 아미노실란의 아민 말단 부분과 폴산의 카복실 말단이 반응하여 결합된 펩티드 영역이며, 활성성분영역은 폴레이트 수용기에 감응하는 영역이다.
폴산 (folic acid (FA))는 세포 내에서 유전자를 생산하는 메커니즘인 폴레이트 회로 (folate cycle)에서 중요한 역할을 하는 영양분으로서 특히 세포 분화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 암세포는 빠른 세포 분화를 위하여 많은 양의 폴산 (혹은 폴레이트)를 필요로 하며, 이를 위하여 세포막에 폴레이트 수용기 (folate receptor)를 과발현하여 대량의 폴산을 섭취하려는 경향이 있다. 특히 KB 세포와 같은 일부 유방암 세포에서는 정상 세포에 비하여 폴레이트 수용기가 과발현되어 있어, 폴레이트는 이들 암세포를 인지하는 일종의 리간드 (ligand) 역할을 할 수 있다. 암세포를 인지하는 리간드는 폴레이트와 같은 화학 물질 외에도 항체 (antibody), 압타머 (aptamer)등이 있을 수 있으나 면역 부작용이 없고, 비교적 싼 가격으로 접근할 수 있다는 점에서 폴레이트는 리간드로서의 이점이 크다. 따라서 최근 몇몇 연구에서는 폴레이트를 리간드로 사용하여 약물전달체의 암세포 친화력을 높이려는 노력을 보이고 있다. 특히 리포좀과 같은 약물전달체의 표면에 리간드를 부착하려는 연구 (Gabizon, A. et al., Adv. Drug Delivery Rev. (2004) 56:1177-1192)와 PEG-DSPE (polyethyelenglycol-disterarolyl phosphatidylethanolamine) 과 같은 고분자형 약물전달체의 말단에 리간드를 부착하여 담지된 DNA의 감염효율을 높이려는 연구 (Hattori, Y. et al., J. Contorlled Rel., (2004) 97:173-183) 혹은 pNIPAM (poly(Nisopropylacrylamide))과 같은 하이드로젤 형태의 약물 전달체에 폴레이트를 부착하여 세포 타겟팅 하려는 연구 (Nayak, S. et al., J. Am. Chem. Soc., (2004) 126:10258-10259) 등이 대표적인 예이다.
본 발명의 나노혼성체는 종양과 관련된 다양한 질병, 예를 들어 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암 및 자궁경부암을 치료하는 유전자 치료제로 이용될 수 있다.
위와 같은 종양 질환 세포에서는, 정상 세포에서는 거의 또는 전혀 생산되지 않는 특정 물질을 발현 및/또는 분비하는데 이들을 일반적으로 "종양 마커(tumor marker)"라고 명명한다. 그러한 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 siRNA-층상형 무기 수산화물에 결합시켜 만든 나노혼성체는 종양 치료에 유용하게 이용될 수 있다. 당업계에는 다양한 종양 마커 뿐만 아니라 이들과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 공지되어 있다. 상기 리간드로는 바람직하게는 세포특이적 항체, 세포 선택적 펩타이드, 세포성장인자, 폴산, 갈락토스, 만노스, 알지디, 트렌스페린 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 종양 마커는 작용 기작에 따라 리간드, 항원, 수용체, 이들을 코딩하는 핵산으로 분류할 수 있다.
종양 마커가 "리간드"인 경우에는 상기 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 본 발명에 따른 나노혼성체의 표적지향성 다작용기 리간드 성분으로 도입할 수 있는데, 상기 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 수용체 또는 항체가 적합할 것이다. 본 발명에서 이용 가능한 리간드 및 이와 특이적으로 결합할 수 있는 수용 체의 예로는 시냅토타그민의 C2(synaptotagmin의 C2)와 포스파티딜세린, 아넥신 V(annexin V)와 포스파티딜세린, 인테그린 (integrin)과 이의 수용체, VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)와 이의 수용체, 안지오포이에틴 (angiopoietin)과 Tie2 수용체, 소마토스타틴(somatostatin)과 이의 수용체, 바소인테스티날 펩타이드 (vasointestinal peptide)와 이의 수용체 등이 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.
종양 마커가 "항원"인 경우 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 본 발명에 따른 나노혼성체의 표적지향성 활성성분으로 도입할 수 있는데 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 적합할 것이다. 본 발명에서 이용 가능한 항원 및 이와 특이적으로 결합하는 항체의 예로는 암성 태아성 항원(carcinoembryonic antigen - 대장암 표지 항원)과 허셉틴(Genentech, USA), HER2/neu 항원(HER2/neu antigen - 유방암 표지항원)과 허셉틴, 전립선 특이 항원 (prostate-specific membrane antigen - 전립선암 표지 항원)과 리툭산 (IDCE/Genentech, USA) 등이 있다.
종양 마커가 "수용체"인 대표적인 예는 난소암 세포에서 발현되는 폴산 수용체가 있다. 상기 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 물질(폴산 수용체의 경우에는 폴산)이 본 발명에 따른 나노혼성체의 표적지향성 다작용기 리간드로 도입될 수 있는데 상기 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 리간드 또는 항체, 바람직하게는, 항체가 적합할 것이다.
여기서, 항체는 특정 대상과만 선택적이고 안정적으로 결합하는 성질을 갖고 있으며, 항체의 Fc 영역에 있는 리신의 -NH2, 시스테인의 -SH, 아스파라긴산 및 글루탐산의 -COOH는 나노혼성체의 표적지향성 활성성분 영역 작용기와 결합하는데 유용하게 이용될 수 있기 때문이다. 이러한 항체는 상업적으로 입수하거나 당업계에 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 일반적으로 포유동물 (예, 마우스, 래트, 염소, 토끼, 말 또는 양)을 적절한 양의 항원으로 1회 이상 면역화시킨다. 일정 시간 후 역가가 적정 수준에 이르렀을 때, 포유동물의 혈청으로부터 회수한다. 회수한 항체는 원하는 경우 공지된 공정을 이용하여 정제하고 사용시까지 냉동 완충된 용액에 저장할 수 있다. 이러한 방법의 상세한 사항은 당업계에 잘 알려져 있다.
한편, 상기 "핵산"은 전술한 리간드, 항원, 수용체 또는 이의 일부분을 코딩하는 RNA 및 DNA를 포함한다. 핵산은 당업계에 알려진 바와 같이 상보적인 서열 간에 염기쌍(base pair)을 형성하는 특징을 갖고 있기 때문에 특정 염기서열을 갖는 핵산은 상기 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 핵산을 이용하여 검출할 수 있다. 상기 효소, 리간드, 항원, 수용체를 코딩하는 핵산과 상보적인 염기서열을 갖는 핵산을 본 발명에 따른 나노혼성체의 표적지향성 활성성분으로 이용할 수 있다.
또한, 핵산은 5'- 및 3'- 말단에 -NH2, -SH, -COOH 등의 작용기가 있어 활성성분의 작용기와 결합하는데 유용하게 이용될 수 있다. 이러한 핵산은 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예를 들면 자동 DNA 합성기 (예, 바이오써치, 어플라이드 바이오시스템스 등으로부터 구입할 수 있는 것)를 사용하여 합성할 수 있다. 예로서, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드는 문헌(Stein et al. Nucl. Acids Res. 1988, vol.16, p.3209)에 기술된 방법에 의해 합성할 수 있다. 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오타이드는 조절된 유리 중합체 지지체를 사용하여 제조할 수 있다(Sarin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1988, vol.85, p.7448).
본 발명에 있어서, 상기 나노혼성체의 입도가 10 내지 350 nm 인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 50 내지 200 nm 이다. 이는 표적지향성 나노혼성체가 다작용기 리간드의 수용기, 즉 종양 마커에 선택적으로 감응한 뒤 효과적으로 세포에 내포화되도록 하며, 향후 생체 내에 투여할 시, 모세혈관이 막히지 않고, 세포에 물리적 충격을 가하지 않게 하기 위한 것이다. 표적지향성 나노혼성체가 너무 작아 50 nm에도 미치지 못할 경우에는 세포에 대량 유입되어 물리적 충격을 줄 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체 중의 siRNA 함량은 1~50 중량%인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 2가 금속염과 3가 금속염 함유 수용액에 염기 수용액을 적가하여, 침전된 층상형 무기 수산화물을 제조하는 단계; (b) siRNA 함유 용액을 (a)단계에서 제조된 층상형 무기 수산화물이 분산된 용액과 혼합 및 교반하여 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체를 이루는 단계; 및 (c) 상기 혼성체에 종양 마커 특이적 다작용기 리간드를 결합시켜 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체를 제조하는 단계를 포함하는, 표적지향성siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 상기 (c) 단계 후에, (d) 상기 나노혼성체에 1종 이상의 약제학적으 로 허용가능한 담체를 첨가하여 제제화하는 단계를 포함하는 상기 나노혼성체를 함유하는 종양 치료용 약학 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 층상형 무기 수산화물은 하기 화학식 2로 표시되는데, 공침 방법으로 쉽게 제조할 수 있다
[화학식 2]
[M(Ⅱ)1- xM(Ⅲ)x(OH)2]X+[An -]X/n ·yH2O
여기서, M(Ⅱ)는 2가 금속 양이온을 나타내고 M(Ⅲ)은 3가 금속 양이온을 나타내고 A는 음이온 화학종으로서 n은 음이온의 전하수 이며 x는 0.1 내지 0.5 미만의 수이고 및 y는 0을 초과하는 양수이다.
상기 화학식 2에서 M(Ⅲ)는 이에 해당하는 3가의 양이온이 선택적으로 존재할 수 있으며, 전혀 존재하지 않을 수도 있다. 화학식 3와 같이 M(Ⅱ)이온과 M(Ⅲ)이온이 공존할 경우에는, 과량의 M(Ⅲ) 이온이 층상형 구조의 생성을 방해할 수 있으므로 M(Ⅲ)이온이 전체 금속이온에 대해 50몰% 이하로 존재하는 것이 바람직하다.
상기 2가 금속 양이온과 3가 금속 양이온의 비율을 2:1, 3:1 및 4:1 등으로 조절하여 층 전하가 조절된 형태의 층상형 무기 수산화물을 형성시킬 수 있다.
상기 2가 금속염으로는 Mg2 +, Ca2 +, Co2 +, Cu2 +, Ni2 +, 또는 Zn2 + 등을 양이온으로 하고, NO3 -, Cl-, OH-, O2-, SO4 2 -, CO3 2 - 또는, 숙시네이트 등을 음이온으로 하는 염 화합물이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 3가 금속염으로는 Al3+, Cr3 +, Fe3 +, Ga3 +, In3 +, V3 +, 또는 Ti3 + 등을 양이온으로 하고, NO3 -, Cl-, OH-, O2-, SO4 2 -, CO3 2 - 또는, 숙시네이트 등을 음이온으로 하는 염화합물이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. Mg 금속염의 경우 Mg(NO3)2, MgCl2, MgSO4, 또는 이들의 수화물 등을 사용할 수 있고, Al의 금속염의 경우는 Al(OH)3, Al(NO3)3, Al2(SO4)3, 또는 이들의 수화물 등을 사용할 수 있다. 상기 2가 금속 양이온, 3가 금속 양이온, 및 상기 음이온은 상기 종류로 한정되는 것은 아니며, 당해 기술분야에서 층상형 무기 수산화물로서 공지된 것에 해당하는 것을 모두 포함할 수 있다.
공침 반응은 염기를 가하여 침전을 유도할 수 있다. 적합한 염기로는 예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화마그네슘, 수산화칼슘 또는 암모니아를 사용할 수 있다. 반응 용액의 pH는 5 내지 12, 바람직하게는 6 내지 10이고, 반응온도는 0℃ 내지 100℃, 바람직하게는 15℃ 내지 30℃이다. 반응 시간은 10분 이상이 바람직하다. 또한 반응 중에는 질소 또는 불활성 기체를 연속적으로 투입하여 반응시키는 것이 바람직하다.
상기 층상형 무기 수산화물은, 제조과정에 있어서, i) 반응액의 온도, ii) 반응액의 농도, iii) 금속양이온간의 혼합 비율, iv) 세척수의 온도, v) 건조온도 등의 합성 요인으로부터 다양한 입도와 형상을 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에 있어서, siRNA-층상형 무기수산화물 나 노혼성체 제조과정은, 층상형 무기 수산화물의 제조와 동시에 siRNA 함유 용액을 함께 공침시킴으로써 나노혼성체를 형성시키는 공침법 (co-precipitation method) 층상형 무기 수산화물을 형성시킨 다음 siRNA 함유 용액을 혼합 및 교반하여 이온교환에 의해 층상형 무기 수산화물의 층간에 도입하여 나노혼성체를 형성시키는 이온교환법 (ion-exchange method) 제조한 층상형 무기 수산화물을 하소시킨 다음 siRNA함유 용액을 가하여 재구성시킴으로써 나노혼성체를 형성시키는 하소-재구성법 (calcination-reconstruction method) 또는, 제조한 층상형 무기 수산화물을 낱장의 시트(sheet)형태로 박리화시킨 다음 siRNA 함유 용액을 가하여 재조합시킴으로써 나노혼성체를 형성시키는 박리화-재조합법(exfoliation-reassembling method) 등 이 있다.
상기 공침법에 의한 본 발명에 따른 나노혼성체의 제조방법은 siRNA 및 2가/3가 금속염의 용액을 제조하는 단계 및 상기 용액에 염기를 가해 pH를 6 내지 10으로 적정하여 침전물을 수득하는 단계를 포함한다.
상기 이온교환법에 의한 본 발명에 따른 나노혼성체의 제조방법은 2가/3가 금속염의 용액을 제조하는 단계 상기 2가/3가 금속염의 용액에 염기를 가해 pH를 6 내지 10으로 적정하여 층상형 무기 수산화물 침전물을 형성시키는 단계 및 상기 형성된 침전물에 siRNA함유 용액을 부가하여 상기 침전물의 층간에 존재하는 음이온과의 이온교환에 의해 상기 침전물의 층간에 siRNA를 도입시키는 단계를 포함한다.
상기 하소-재구성법에 의한 본 발명에 따른 나노혼성체의 제조방법은 2가/3가 금속염의 용액을 제조하는 단계 상기 2가/3가 금속염의 용액에 염기를 가해 pH 를 6 내지 10으로 적정하여 층상형 무기 수산화물 침전물을 형성시키는 단계 상기 형성된 침전물의 층간 음이온을 제거하기 위해 250℃ 내지 500℃ 이내의 온도에서 1 시간 이상 열처리, 바람직하게는 400℃에서 4시간 정도 열처리 하여 하소시키는 단계 및 siRNA 함유 용액에 상기 하소된 침전물에 부가하고 교반시켜 재구성하는 단계를 포함한다.
상기 박리화-재조합법에 의한 본 발명에 따른 나노혼성체의 제조방법은 2가/3가 금속염의 용액을 제조하는 단계 상기 2가/3가 금속염의 용액에 염기를 가해 pH를 6 내지 10으로 적정하여 층상형 무기 수산화물 침전물을 형성시키는 단계 상기 형성된 침전물의 층간 음이온을 긴 탄소사슬의 음이온성 이온으로 치환하거나 특정 용매를 사용하여 층상형 무기 수산화물을 낱장의 단일층 시트로 박리화, 바람직하게는 포름아마이드 용액에 0.05 중량%로 분산 및 2일간 교반하여 박리화시키는 단계 및 siRNA 함유 용액을 상기 박리화된 콜로이드 용액에 부가하고 교반시켜 재조합하는 단계를 포함한다.
상기 제조방법에서, 2가/3가 금속염 용액, 염기 용액 또는 siRNA 함유 용액을 제조하기 위한 용매는 상기 반응에 관여하지 않으면서 상기 siRNA 및 금속염을 모두 용해할 수 있는 용매이기만 하면 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 증류수, 에탄올, 증류수 및 에탄올의 혼합용매가 이 이용될 수 있다.
상기 제조방법에서 층상형 무기 수산화물과 siRNA간의 반응은 특별히 한정되는 것은 아니며, 통상적으로는 상온에서, 바람직하게는 siRNA 변성 온도이하에서 수행이 가능하고, 대략 10분 내지 7일간 동안 반응시켜 얻어질 수 있다. 반응에 요 구되는 상기 각 반응물의 첨가비는 특별히 한정되지는 않으며, siRNA:층상형 무기 수산화물 몰비(％)로 10:90 내지 90:10으로 첨가될 수 있고, 이를 통해 siRNA의 층상형 무기 수산화물 도입률을 조절할 수 있다.
또한 siRNA가 종양 세포내로 전달된 이후, 층상형 무기 수산화물로부터 분해된 금속 양이온의 존재 하에서는 이중가닥 siRNA의 인산기와 금속 양이온의 상호작용으로 불용성 형태로 siRNA의 활성에 부정적인 영향을 줄 수 있다. (Duguid J et al., Biophys . J. 65:1916-1928, 1993). 2가/3가 금속 양이온과 강하게 킬레이트 결합을 형성하는 EDTA (Ethylene diamine tetra acetic acid) 를 상기 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체 제조 (b) 단계에서 siRNA와 함께 첨가하여 나노혼성체를 형성시켜 종양치료에 사용하면, 세포 내로 유입된 이후, 약산성 조건에서 층상형 금속 수산화물의 분해 산물인 금속 양이온과의 상호작용을 줄임으로써, siRNA의 활성을 증가시키는데 보조적 역할을 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체를 유효성분으로 함유하는 종양 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 약학조성물은 통상적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 종양은 이에 제한되는 것은 아니나, 유방암, 폐암, 구강암, 췌장암, 결장암, 전립선암, 난소암 등일 수 있으며, 일 예로, 실시예에서 나타난 바와 같은, 구강암 또는 폐암일 수 있다.
본 발명의 종양치료용 약학 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 여러 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지 등이 포함된다. 본 발명의 종양치료용 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 나노혼성체 함유 약학 조성물은 임상투여를 위해 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 경구투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야의 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 나노혼성체 함유 종양치료용 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립가능 하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명에 따른 나노혼성체 함유 종양치료용 약학 조성물은 의약 분야에서 통상적으로 이용되는 경로를 통해 투여될 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하고 예를 들어 정구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 장관, 설하 또는 국소 투여경로를 통하여 투여할 수 있다.
일 구현예로써, 본 발명에 따른 나노혼성체 함유 종양치료용 약학 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제형은 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제 및 시럽제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 주사제의 제형인 경우에는, 액제, 현탁액제 또는 유탁액제 형태일 수 있다.
본 발명의 바람직한 나노혼성체 함유 종양치료용 약학 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액으로서 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것도 사용할 수 있다.
또는, 주사용 또는 주입용 최종 제제 이외에도, 동결건조물 또는 살균 산제로 존재하고, 투여 직전에 용매, 예를 들어 물과 혼합하여 주사용 또는 주입용 최종 제제를 제조할 수 있는 투여형태일 수 있다.
본 발명의 나노혼성체 함유 종양치료용 약학 조성물은 통상의 환자 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한, 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.
본 발명의 나노혼성체 함유 약학 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 서바이빈을 암호화하는 유전자와 상보결합할 수 있는 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체의 투여량은, 환자의 연령, 성별, 증상, 투여방법 또는 예방목적에 따라, 체중 kg 당 siRNA 기준으로 0.05 내지 0.1㎍을 비경구 투여할 수 있다. 특이 증상을 나타내는 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법 등에 따라 당업자가 투여량을 변화시킬 수도 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체 제조
1-1. NO 3 -층상형 무기 수산화물 제조
Mg(NO3)2·H2O (0.2 M) 및 Al(NO3)3·H2O (0.1 M)을 탄산이온 (CO3 2 -)이 제거된 증류수에 용해시키고, NaOH 수용액 (1 M)으로 pH 9~10 값으로 적정하여 침전에 의해 형성된 층상형 무기 수산화물 결정체를 얻었다. 층상형 무기 수산화물 결정체를 100℃에서 16시간 동안 교반하고, 세척과정을 거쳐 미반응 염을 제거한 후, 동결건조하여 NO3-층상형 무기 수산화물을 얻었다.
1-2. siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체 제조
상기 1-1에서 수득한 층상형 무기 수산화물을 증류수에 재분산시키고, 이 분산용액에 서바이빈을 암호화하는 유전자와 상보 결합할 수 있는 siRNA (바이오니아, KR, 서열번호 1)를 증류수에 용해된 용액을 첨가하고 (siRNA:층상형 무기 수산화물=3:1 중량비) 37℃에서 2일간 교반한 후, 세척과정을 거쳐 미반응 siRNA를 제거한 후, siRNA가 층상형 무기 수산화물의 층간에 삽입된 나노혼성체를 수득하였다. 상기 나노혼성체 제조과정은 공기 중의 이산화탄소에 의한 탄산이온(CO3 2-) 생성을 방지하기 위하여 질소 분위기 하에서 진행되었다.
1-3. 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체 제조
폴산 다작용기 리간드가 활성성분으로 결합된 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체를 제조하기 위해, 우선 상기 1-2에서 제조된 siRNA-층상형 무기 수산화물을 아미노실란이 부착된 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체를 합성하였다. siRNA-층상형 무기 수산화물을 에탄올에 재분산하고 건조하여 표면수를 증발시킨 후, 아미노 프로필 실란이 용해되어 있는 톨루엔 용액에 첨가하여 60℃에서 6시간 교반하고 세척하여 아미노실란이 부착영역에 결합된 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체를 얻었다. 상기 아미노실란이 결합된 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체를 재분산시킨 수용액, 반응 촉매제인 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 (EDC), N-하이드록시숙신이미드 (NHS), 트리에틸아민 (ET3N)이 각각 용해된 수용액, 폴산 (폴레이트)이 디메틸술폭사이드 (DMSO) 에 용해된 용액을 준비하였다. siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체 분산액에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 수용액과 N-하이드록시숙신이미드 수용액을 첨가하고, 폴산 용액을 첨가한 후, 트리에틸아민 수용액을 사용하여 pH를 9로 적정한다. 반응물은 38℃에서 5시간 동안 교반하고, 디메틸술폭시드와, 증류수로 세척한 뒤 동결건조함으로써, 폴산 다작용기 리간드가 결합된 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체를 수득하였다.
상기의 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체 제조의 표면 반응은 1차적으로 부착영역인, 층상형 무기 수산화물의 M(금속)-OH 결합이 M-O-Si-아민으로 표면 개질되고, 2차적으로 교차연결영역에서 말단의 아민과 폴산의 카복실기가 반응하여M-O-Si-펩타이드-폴산이 형성되며, 활성성분영역은 폴레이트 수용기에 감응하는 말단 영역이다.
상기 실시예 1에 제조한 나노혼성체의 결정 구조를 확인하기 위하여 X 선 회절(Rigaku, D/Max 2200) 분석을 수행하였다. 그 결과 도 2에서 나타난 바와 같이, 층상형 무기 수산화물의 층간 간격은 약 7.9 Å으로 질산음이온이 삽입되어 있는 전형적인 층상형 구조임을 확인하였고, siRNA-층상형 무기 수산화물의 층간 간격은 약 25 Å으로 질산음이온이 siRNA와 이온교환되며 siRNA가 수산화층과 평행한 구조로 층간에 삽입되면서 약 20 Å 팽창되었고, 그 결과 2차원 구조를 갖는 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체가 수득되었음을 알 수 있다. 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 역시 다작용기 리간드 결합 반응 이후에도 층간 간격을 유지하는 것을 통해, siRNA 층간에 삽입되어 있는 형태의 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체가 제조되었음을 알 수 있다.
상기 실시예 1에서 제조한 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체의 형상 및 입도를 확인하기 위하여 투과 전자 현미경(JEOL JEM-2100F) 분석을 수행하였다. 그 결과 도 3에 도시한 바와 같이, 상기 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체는 평균 100±20 nm크기의 육각 형상의 나노입자로 제조되었음을 알 수 있다.
실험예 1: 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체의 혈청내 안정성 분석
상기 실시예 1에서 제조한 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체의 혈청내 안정성을 조사하였다.
siRNA 기준으로 농도 10㎍을 안정성 반응액(rat 혈청 10% 포함, Invitrogen) 90㎕에 가하고, 37℃에서 방치하였다. 소정 시간 (0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 24시간)이 경과한 시점에서 12㎕씩을 분주하여, -70℃에 즉시 동결시켜 보관하고, 보관된 각각의 시간별 시료 2.5㎕를 트리스-아세테이트(TAE) 버퍼에서 젤 전기 영동(1％ 아가로즈 젤)하여, 혈청내에서 siRNA가 유지되는 지의 여부를 확인하였다. 비교군으로는 순수 siRNA를 사용하였다.
그 결과, 도 4에 도시한 바와 같이 순수 siRNA는 혈청을 포함하는 반응액에서 8시간 배양하면 거의 완전히 분해되었다 (도 4(a)). 반면, 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체는 동일한 조건 하에서 뉴클레아제에 의해 매개되는 siRNA 분해가 24시간이 경과한 후에도 전혀 검출되지 않았다 (도 4(b)). 이와 같은 혈청내에서의 지속적인 siRNA의 안정화는 층상형 무기 수산화물에 층간 삽입되어 있는 siRNA가 층상형 무기 수산화물의 양이온성 층전하와 siRNA의 음이온성 인산기가 강한 정전기적 인력으로 결합되어 뉴클레아제가 나노혼성체 내부 중심부로 접근하는 것을 구조적으로 가려주기 때문에 얻어지는 것으로 판단된다.
실시예 2: 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체의 In-Vitro 효능 시험
2-1. 종양 세포주 배양 및 세포주에서의 서바이빈의 발현억제
종양 세포주인 인간 구강암 세포주(KB, 한국세포주 은행)는 폴레이트 수용체가 과발현되는 세포로 이의 최대 발현을 유도하기 위하여 폴레이트가 없는 배양액에서 최소 2주 이상 37℃, CO2 조건하에서 배양 후 사용하였다.
KB세포를 RPMI 1640 배지(Welgene, KR)에 각각 1 x 105/2ml로 분주하여 37℃, CO2 배양기에서 배양한 뒤, 실시예 1에서 제조된 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체, 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체를 siRNA 기준으로 100 nM의 농도로 세포에 처리하여 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 6시간 경과 후, RPMI 1640 배지로 2회 세척한 다음, 신선한 RPMI 1640 배지로 교체한 후 24시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 서바이빈의 발현을 억제하기 위해 추가적으로 배양하였다.
비교군으로는 아무 처리하지 않은 세포, 대조군으로는 NO3-층상형 무기 수산화물, 및 실험군으로는 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체를 처리한 세포를 사용하였다. 또한 대조군으로 표적지향성 리간드인 폴산에 의한 종양 특이적 세포내재화를 확인하기 위해, 폴산 (1mg/ml) 함유 배양액을 24시간 동안 배양한 후에 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체를 처리한 세포를 사용하였다.
본 발명에 따른 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체는 종양 마커인 폴레이트 수용체가 과발현된 종양 세포에서 리셉터-매개를 통하여 세포 내로 투과되며 (receptor-mediated endocytosis), 종양 마커가 발현되지 않는 종양 세포에서는 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체 혹은 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체 모두 클라드린-매개 내포화 (clathrin-mediated endocytosis)라는 메커니즘에 의해 세포 내재화되어 종양 치료 효과를 나타내는 것으로 판단된다. 또한 표적지향성 다작용기 리간드가 부착된 나노혼성체를 사용한 경우에 많은 양의 나노혼성체가 종양 선택적으로 세포 내로 유입됨을 알 수 있다. 이 결과는 표적지향성 층상형 무기 수산화물이 종양 세포 특이적 siRNA 전달 매개 체로서 역할을 할 수 있음을 제시한다.
2-2. RT - PCR 에 의한 서바이빈 mRNA 의 정량분석
종양 세포 억제가 실제로 세포내 서바이빈mRNA의 양의 감소로부터 기인하는지 여부를 확인하기 위하여, RNA 추출키트(RNeasy mini kit, Qiagen, Germany)를 이용하여 전체 RNA 중 서바이빈 mRNA의 농도를 RT-PCR (Real-time PCR) 분석에 의해, 다음과 같은 방법으로 정량하였다.
즉, 각 시료의 전체 RNA 1㎍을 oligo-dT18 (500ng/㎕) 1㎕ 및 dNTP(각 2.5mM) 2㎕와 같이 혼합하고, 70℃에서 10분간 반응시킨 다음, 얼음에서 5분간 냉각시키고, 역전사효소(reverse superscript (200U/㎕), Invitrogen) 0.5㎕, 10X 반응완충액 2㎕, RNase 저해재 (inhibitor) 0.5㎕ 및 적량의 멸균수를 혼합하여, 전체 부피를 20㎕로 맞춘 후, 42℃에서 15분 반응시키고, 95℃에서 5분동안, 4℃에서 5분동안 반응시켜서 각각의 cDNA를 수득하였다. 그런 다음, 각각의 cDNA 1㎕, RT-PCR 시스템(Applied Biosystems Prism 7900 Sequence Detection System, Applied Biosystems, USA)의 2X SYBR Green Master Mix 10㎕, 서바이빈 및 GAPDH에 특이적인 각각의 정방향 프라이머(10pM) 0.4㎕ 및 역방향 프라이머 (10pM) 0.4㎕을 혼합한 다음, RT-PCR을 수행하였다 (50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초로 40회 반복). 이때, 사용된 정방향(forwarding) 프라이머와 역방향(reverse) 프라이머의 서열은 다음과 같다:
서바이빈 특이적 정방향 프라이머: 5'-CCTTCACATCTGTCACGTTCTCC-3' (서열번 호 10)
서바이빈 특이적 역방향 프라이머: 5'-ATCATCTTACGCCAGACTTCAGC-3' (서열번호 11)
GAPDH 특이적 정방향 프라이머: 5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3' (서열번호 12)
GAPDH 특이적 역방향 프라이머: 5'-ACCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG-3' (서열번호 13)
PCR이 종료된 후, cDNA 표준곡선을 사용하여, 각각의 수득한 서바이빈 PCR 산물의 양 및 GAPDH PCR 산물의 양을 측정하고, 서바이빈의 측정값을 GAPDH의 측정값으로 나누어, 서바이빈 상대적 발현량을 산출하고, 이로부터 서바이빈 mRNA의 발현감소율을 비교하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었으며, KB세포에서 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체를 처리한 경우에는 40% 서바이빈 발현감소, 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체를 처리한 경우에는 60% 서바이빈 발현을 감소시켰다.
이를 통해, 본 발명의 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체 및 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체는 서바이빈의 mRNA 수준을 감소시킬 뿐만 아니라, 서바이빈의 발현감소에 따른 종양세포의 증식억제를 직접적으로 유발시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체는 siRNA의 생체 내 안정성이 증가시켰으며, 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 표적지향성 다작용기 리간드는 종양특이적 전달 효율을 향상시켜 비교적 낮은 농도의 투여량에서 siRNA의 종양치료 활성을 나타내어 다양한 질병 종양 치료의 효율성 및 정확성을 향상시키는 조성물로 사용할 수 있음을 확인하였고, 새로운 형태의 siRNA 전달 시스템으로 생명공학을 위한 기초연구와 의학 산업상의 매우 유용하게 사용될 수 있는 유용한 발명임이 확인되었다.
이상으로 본 발명 내용의 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체를 제조하는 반응의 모식도이다.
도 2는 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체의 X선 회절도이다. ((a): NO3-층상형 무기 수산화물, (b): siRNA-층상형 무기 수산화물, (c): 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물)
도 3은 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체의 투과전자현미경 이미지이다.
도 4는 siRNA와 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체의 혈액내 안정성 평가를 위해, 혈청 단백질이 존재하는 환경 하에서 시간에 따른 siRNA의 분해 정도를 나타내는 전기영동 이미지이다. ((a): 순수 siRNA, (b): 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물)
도 5는 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체가 종양 세포 내에서 서바이빈의 발현을 억제하는 정도를 mRNA 수준으로 나타낸 그래프이다. ((a): 비교군, (b): NO3-층상형 무기 수산화물, (c) siRNA-층상형 무기 수산화물, (d): 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물, 폴산 함유 배지, (e): 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물, 폴산 함유하지 않는 배지)
<110> Nanohybrid <120> Active siRNA-Inorganic Layered Double Hydroxide Nanohybrid, a Process for Preparing the Same and a Pharmaceutical Composition Comprising the Same for Treating Targeted Tumor <130> P09-B100 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA derived from survivin <400> 1 aaggagauca acauuuuca 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA derived from survivin <400> 2 uaggaaagga gaucaacau 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA derived from survivin <400> 3 aggaaaggag aucaacauu 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA derived from survivin <400> 4 aggaaaggag aucaacauu 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA derived from survivin <400> 5 ggaaaggaga ucaacauuu 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA derived from survivin <400> 6 gaaaggagau caacauuuu 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA derived from survivin <400> 7 aaaggagauc aacauuuuc 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA derived from survivin <400> 8 aggagaucaa cauuuucaa 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA derived from survivin <400> 9 ggagaucaac auuuucaaa 19 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> survivin specific forwarding primer <400> 10 ccttcacatc tgtcacgttc tcc 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> survivin specific reverse primer <400> 11 atcatcttac gccagacttc agc 23 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH specific forwarding primer <400> 12 ggtgaaggtc ggagtcaacg 20 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH specific reverse primer <400> 13 accatgtagt tgaggtcaat gaagg 25

Claims (21)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체:
    [화학식 1]
    [M(Ⅱ)1- xM(Ⅲ)x(OH)2]X+[S][T]
    상기 화학식 1에서, M(Ⅱ)는 2가 금속 양이온을 나타내고, M(Ⅲ)은 3가 금속 양이온을 나타내고, x는 0.1 내지 0.5 미만의 수이며, S는 siRNA이며, 상기 T는 종양 표적지향성 다작용기 리간드이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 siRNA는 서바이빈 유전자 유래인 것을 특징으로 하는 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 1 내지 9로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 2가 금속 양이온은 Mg2 +, Ca2 +, Co2 +, Cu2 +, Ni2 + 및 Zn2 +로 구성된 군에서 선택되고, 상기 3가 금속 양이온은 Al3 +, Cr3 +, Fe3 +, Ga3 +, In3 +, V3+, 및 Ti3 + 로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 종양 표적지향성 다작용기 리간드는 항원, 항체, RNA, DNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘 (neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선 동위원소로 표지된 생체물질, 및 종양 리셉터(receptor)로 구성된 군에서 선택된 하나와 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 종양 리셉터는 리간드, 항원, 수용체, 및 이들을 코딩하는 핵산으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 종양 리셉터는 시냅토타그민 I의 C2, 아넥신 V, 인테그린, VEGF, 안지오포이에틴 1, 안지오포이에틴 2, 소마토스타틴, 바소인테스티날 펩타이드, 암성 태아성 항원, HER2/neu 항원, 전립선 특이 항원 및 폴산 수용체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 종양 리셉터와 특이적으로 결합할 수 있는 종양 표적지향성 다작용기 리간드는 포스파티딜세린, VEGFR, 인테그린 수용체, Tie2 수용체, 소마토스타틴 수용체, 바소인테스티날 펩타이드 수용체, 허셉틴, 리툭산 및 폴산으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 종양 치료용 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 담체는 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 완충 물질, 물, 염, 전해질, 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 종양 치료용 약학 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제 현탁화제, 계면활성제, 감미제, 보존제, 윤활제, 착향제, 점증제, pH조정제, 습윤제 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 첨가제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 치료용 약학 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 제형은 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제 및 시럽제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 종양 치료용 약학 조성물.
  13. 제9항에 있어서, 제형은 액제, 현탁액제 또는 유탁액제 형태의 주사제인 것을 특징으로 하는 종양 치료용 약학 조성물.
  14. 제9항에 있어서, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 구강, 심장내, 골수내, 경막내, 경피, 장관, 피하, 설하 또는 국부 투여용으로 제형화하는 것을 특징으로 하는 종양 치료용 약학 조성물.
  15. 제9항에 있어서, 단위-투여량 또는 다-투여량 단위제제로 제형화된 종양 치료용 약학 조성물.
  16. 제9항에 있어서, 치료 대상의 체중 kg 당 0.05 내지 0.1㎍의 siRNA를 함유하는 것을 특징으로 하는 종양 치료용 약학 조성물.
  17. 제9항에 있어서, 상기 종양은 구강암 또는 폐암인 것을 특징으로 하는 종양 치료용 약학 조성물.
  18. 다음의 단계를 포함하는, 제1항의 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체 의 제조방법:
    (a) 2가 금속염과 3가 금속염 함유 수용액에 염기 수용액을 적가하여, 침전된 층상형 무기 수산화물을 제조하는 단계; (b) siRNA 함유 용액을 (a)단계에서 제 조된 층상형 무기 수산화물이 분산된 용액과 혼합 및 교반하여 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체를 이루는 단계; 및 (c) 상기 혼성체에 종양 표적지향성 다작용기 리간드를 결합시켜 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체를 제조하는 단계.
  19. 제18항에 있어서, 상기 (a)단계의 층상형 무기 수산화물은 하기 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:
    [화학식 2]
    [M(Ⅱ)1- xM(Ⅲ)x(OH)2]X+[An -]X/n·yH2O
    여기서, M(Ⅱ)는 2가 금속 양이온을 나타내고
    M(Ⅲ)은 3가 금속 양이온을 나타내고
    A는 음이온 화학종으로서 n은 음이온의 전하수이며
    x는 0.1 내지 0.5 미만의 수이고 및
    y는 0을 초과하는 양수이다.
  20. 제19항에 있어서, 상기 2가 금속 양이온은 Mg2 +, Ca2 +, Co2 +, Cu2 +, Ni2 + 및 Zn2 +로 구성된 군에서 선택되고, 상기 3가 금속 양이온은 Al3 +, Cr3 +, Fe3 +, Ga3 +, In3+, V3 +, 및 Ti3 + 로 구성된 군에서 선택되고, 상기 음이온은 CO3 2 -, NO3 -, Cl-, OH-, O2-, 및 SO4 2 -로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 다음의 단계를 포함하는, 제9항의 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체를 함유하는 종양 치료용 약학 조성물의 제조방법:
    (a) 2가 금속염과 3가 금속염 함유 수용액에 염기 수용액을 적가하여, 침전된 층상형 무기 수산화물을 제조하는 단계; (b) siRNA 함유 용액을 (a)단계에서 제조된 층상형 무기 수산화물이 분산된 용액과 혼합 및 교반하여 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체를 이루는 단계; (c) 상기 혼성체에 종양 마커 특이적 다작용기 리간드를 결합시켜 표적지향성 siRNA-층상형 무기 수산화물 나노혼성체를 제조하는 단계; 및 (d) 상기 나노혼성체에 약학적으로 허용가능한 담체를 이용하여 제제화하는 단계.
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