KR20110028440A

KR20110028440A - 말초 순환으로의 골수 유래 다능성 줄기세포 동원약

Info

Publication number: KR20110028440A
Application number: KR1020107026779A
Authority: KR
Inventors: 가츠토 다마이; 다케히코 야마자키; 다케나오 치노; 야스후미 가네다
Original assignee: 가부시키가이샤 제노믹스; 고꾸리쯔 다이가꾸 호우징 오사까 다이가꾸
Priority date: 2008-04-30
Filing date: 2009-04-30
Publication date: 2011-03-18
Also published as: AU2009240884A8; RU2010148792A; AU2009240884A1; KR101728379B1; CN102076350A; JP6002727B2; CA2722852A1; WO2009133939A1; RU2519714C2; JPWO2009133939A1; AU2009240884B2; EP2301559A4; BRPI0911439A2; JP2015038094A; AU2009240884B8; US8673580B2; JP5660889B2; AU2009240884A2; EP2301559A1; US20110091928A1

Abstract

본 발명은 1)유리 피부조각으로부터 추출되는 조직 추출액을 정맥내에 투여함으로써 말초혈중에 골수 유래 다능성 조직 줄기세포를 유도하고, 2)또한, 유리 피부조각중의 골수 유래 다능성 조직 줄기세포를 말초혈중에 동원하는 물질은 HMGB1인 것, 3)골수 유래 다능성 줄기세포를 말초혈중에 동원하는 활성을 가진 HMGB1은 배양 세포로부터 간편하게 정제할 수 있다는 것을 세계 최초로 규명하였다.

Description

말초 순환으로의 골수 유래 다능성 줄기세포 동원약{Agent for recruitment of bone-marrow-derived pluripotent stem cell into peripheral circulation}

본 발명은 말초 순환으로의 골수 유래 다능성(多能性) 줄기세포 동원약에 관한 것이다.

최근, 손상 조직의 회복 과정에 여러가지 줄기세포가 기여하고 있는 것이 명백해져 손상 부위에 줄기세포를 다수 동원함으로써 기능적 조직 재생을 유도하는 새로운 재생 의료의 개발이 진행되고 있다. 이러한 새로운 재생 의료를 실현하기 위해서는, 1)손상 부위에 동원 가능한 줄기세포가 생체 내에 풍부하게 존재하는 것, 2)줄기세포를 손상 부위에 동원하는 인자가 단리·동정(同定)되어 있는 것이 필요하다.

손상 부위에 동원 가능한 줄기세포는, 손상부 또는 그 주변 조직에 존재하는 조직 줄기세포와 말초혈중에 존재하는 골수 유래 줄기세포가 있다. 최근에 골수 유래 세포가 많은 손상 조직 재생에 기여하고 있는 것으로 보고되고 있지만, 손상 조직으로의 골수 유래 세포 동원 기전에 대해서는 알려져 있지 않다. 여기서 말하는 골수 유래 세포는 혈액 세포(백혈구, 적혈구)로의 분화 능력을 가진 조혈계 줄기세포와 구별되고, 지금까지 골수 중간엽 줄기세포라고 불리는 세포로 대표되는 줄기세포 또는 골수 중에 존재하는 조직 전구세포 집단을 포함한다. 골수 중간엽 줄기세포는 골아세포, 지방세포, 연골세포로의 분화 능력을 가진 미분화 줄기세포로서, 섬유아세포, 근육세포, 간질 세포(stromal cell), 힘줄세포 등 그 밖의 중간엽의 세포로 더 분화할 수 있도록 되어 있다. 최근에는 골수 중간엽 줄기세포가 신경세포, 더 나아가 상피계 세포(피부 각질세포 등)나 혈관내피세포로 분화되는 것이 증명되어 있다(비특허문헌 9). 조직 전구세포는, 혈액계 이외의 특정 조직세포로의 일방향성 분화 능력을 가진 미분화 세포라고 정의되고, 상술한 중간엽 조직, 상피계 조직, 신경조직, 실질장기, 혈관내피로의 분화 능력을 가진 미분화 세포를 포함한다.

HMGB1(High mobility group box 1: 고이동성 그룹 1 단백질)은 생체내 거의 모든 세포에 존재하는 분자량 약 25,000의 단백질로서, 과거의 보고에 의하면, 1)세포 내에서 DNA와 결합하여, 크로마틴 구조를 제어함으로써 유전자 발현을 조절하고 있고(비특허문헌 1), 2)염증성 사이토카인 TNF-α나 IL-1, LPS의 작용에 의해 염증조직에 존재하는 단구(單球)나 마크로파지에서 분비되어 세포 밖에서 RAGE(당화 최종산물 수용체)에 결합하여(비특허문헌 2) 강력한 염증반응을 유도하고(비특허문헌 3), 3)관류저하(hypoperfusion)에 의해 괴사에 빠진 세포로부터 주위의 조직으로 방출되고(비특허문헌 4), 4)중증 감염증인 패혈증 환자의 염증 진전에 관여하고 있으며(비특허문헌 5), 5)심근경색 모델에서, 경색부에 투여함으로써 심근내에 존재하는 줄기세포의 분열·증식을 촉진하여 심근의 재생·기능 회복을 촉진하고(특허문헌 1), 6) 관류 저하 간장 모델 동물에서 관류 저하상태 제작전에 미리 투여함으로써 간장해의 정도를 경감시키고(비특허문헌 6), 7)근육손상 모델에서 손상 부위에 투여한 HMGB1은 동시에 투여한 혈관 전구세포를 손상 부위로 유도하여 근조직 재생을 촉진하고(비특허문헌 7), 8)신경세포에서 신경돌기의 형성을 유도하는(비특허문헌 8) 등의 기능이 알려져 있다. 그러나 골수 유래 줄기세포, 특히 골아세포, 연골세포, 지방세포 등으로 분화 가능한, 이른바 중간엽 줄기세포를 손상 조직에 동원한다는 보고는 과거에 존재하지 않는다.

종래 뇌나 척수의 중추신경세포는 한번 장해를 받으면 재생이 되지 않는다고 믿어 왔다. 그러나, 최근 신경 줄기세포의 존재 및 그의 유도가 가능하게 되었다. 또한 정상 신경계에서의 신경 줄기세포 니치(niche)도 동정되어 왔다. 따라서 이미 불가능하다고 여겨왔던 손상 중추 신경계 세포의 회복도 기대할 수 있게 되었다. 현재 뇌척수 손상, 변성 질환 등에 대한 신경재생에 관한 연구가 전개되고 있다.

뇌조직(세포) 손상의 원인으로서는 외상에 의한 뇌좌상, 뇌허혈성 질환이 주를 이룬다. 다른 원인으로서, 뇌종양 적출 수술을 비롯한 뇌외과적 수술에 기인하는 것을 들 수 있다. 특히 뇌실질세포에서 발생하는 신경교종의 완전 적출이 어렵고 운동이나 언어기능 장해를 피하기 위해서는 부분적 적출로 그칠 수 밖에 없다. 또한 악성 신경교종은 생명 예후도 나쁘고 화학요법이나 방사선 요법을 비롯하여 최근 연구가 활발하게 이루어지고 있는 면역·유전자 치료도 충분한 효과를 나타내지는 못하고 있다. 따라서 가급적 많은 종양세포를 적출하고 그 결과 생기는 뇌기능 손상을 회복시키는 치료가 있다면 이상적이다.

특허문헌 1: 일본특표2005-537253

비특허문헌 1: Bustin 등, Mol Cell Biol, 19:5237-5246, 1999년 비특허문헌 2: Hori 등, J.Biol. Chem., 270, 25752-25761, 1995년 비특허문헌 3: Wang 등, Science, 285:248-251, 1999년 비특허문헌 4: Muller 등, EMBO J, 20:4337-4340, 2001년 비특허문헌 5: Wang 등, Science, 285:248-251, 1999년 비특허문헌 6: Germani 등, J Leukoc Biol. Jan;81(1):41-5,2007년 비특허문헌 7: Palumbo 등, J.Cell Biol., 164:441-449, 2004년 비특허문헌 8: Merenmies 등, J.Biol.Chem., 266:16722-16729, 1991년 비특허문헌 9: Wu Y 등, Stem cells, 25:2648-2659,2007년

골수중의 줄기세포에는 골조직, 연골조직, 지방조직으로 분화 가능한 중간엽 줄기세포의 존재가 알려져 있다. 최근 상피계 세포나 신경계 세포로 분화되는 다능성 줄기세포가 존재한다는 것도 명백해졌다.

또한, 난치성 피부궤양의 치료법으로서 식피(植皮)에 의한 치료가 있다. 발명자들의 연구에 의해 궤양 치료후의 이식피부조각은 표피, 진피 혹은 모피(털을 구성하는 조직)가 골수 유래 세포에 의해 재구축되어 피부가 재생된다는 것이 명백해졌다. 그래서 골수중의 상기한 바와 같은 조직 복원 능력을 가진 세포군을 간편하고도 효율적으로 회수하는 방법이 기대되지만, 현재 그와 같은 방법은 개발되지 않은 상황이다.

따라서, 본 발명은 골수 유래 다능성 줄기세포를 대량으로 말초혈중에 동원하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명은 이식 피부조각이 생체 조직에 생착되는 과정에서 골수 유래 세포가 피부외 조직으로부터 이식 피부조각에 동원되어 피부 조직 재생에 관여할 가능성이 있기 때문에 이와 같은 다능성을 가진 골수 유래 세포를 말초혈중에 동원하는 기구가 있는 것으로 상정하고 피부 조직 추출액이나 골수 유래 다능성 줄기세포 유도제를 정맥내에서 투여함으로써 골수 유래 다능성 줄기세포를 대량으로 말초혈중에 동원할 수 있게 하였다. 구체적으로는, 1)유리(遊離) 피부조각에서 추출되는 조직 추출액을 정맥내에 투여함으로써 말초혈중에 골수 유래 다능성 조직 줄기세포를 유도하고, 2)또한 유리 피부조각 중의 골수 유래 다능성 조직 줄기세포를 말초혈중에 동원하는 물질은 HMGB1인 것, 3)골수 유래 다능성 줄기세포를 말초혈중에 동원하는 활성을 가진 HMGB1은 배양 세포로부터 간편하게 정제할 수 있다는 것을 세계 최초로 명백히 하였다.

본원은 이 식견에 기초하여 하기 발명을 제공하는 것이다.

〔1〕하기 (a) 내지 (i) 중 어느 하나에 기재된 성분을 함유하고, 혈관 또는 근육에 투여되는, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하기 위해 사용하는 약제;

(a)HMGB1단백질

(b)HMGB1단백질을 분비하는 세포

(c)HMGB1단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(d)HMGB2단백질

(e)HMGB2단백질을 분비하는 세포

(f)HMGB2단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(g)HMGB3 단백질

(h)HMGB3 단백질을 분비하는 세포

(i)HMGB3 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터.

〔2〕세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정을 포함한 방법으로 제조되는 세포 또는 조직 추출액을 함유하고 혈관 또는 근육에 투여되는, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하기 위해 사용하는 약제.

〔3〕하기 공정을 포함한 방법으로 제조되는 헤파린 결합 분획을 함유하고 혈관 또는 근육에 투여되는, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하기 위해 사용하는 약제;

(a)세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정,

(b)공정(a)에서 얻어지는 추출액을 고정화 헤파린에 접촉시키는 공정 및

(c)고정화 헤파린에서 헤파린 결합 분획을 용출하는 공정.

〔4〕하기 공정을 포함한, 세포 또는 조직 추출액에 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자가 포함되는지 여부를 평가하는 방법으로서, 공정(b)에서의 골수세포의 골수로부터 말초혈로의 동원 활성이 대조군과 비교하여 높은 경우에 세포 또는 조직 추출액에 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자가 포함된다고 판정되는 방법;

(a)세포 또는 조직 추출액을 제조하는 공정 및

(b)공정(a)에서 제조된 추출액에 의한 골수세포의 골수로부터 말초혈로의 동원 활성을 측정하는 공정.

〔5〕하기 공정을 포함한, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자가 포함되는 세포 또는 조직 추출액을 스크리닝하는 방법;

(a)여러 추출액에 대해서 〔4〕에 기재된 방법으로 해당 추출액에 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자가 포함되는지 여부를 평가하는 공정 및

(b)공정(a)에서 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자가 포함된다고 평가된 추출액을 선택하는 공정.

〔6〕〔4〕 또는 〔5〕에 기재된 방법에 의해 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자를 포함한다고 판정된 추출액으로부터, 골수세포의 골수로부터 말초혈로의 동원 활성을 지표로 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자를 정제하는 공정을 포함하는, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자의 동정 방법.

〔7〕혈관 또는 근육에 투여되는, 하기 (a) 내지 (i) 중 어느 하나에 기재된 물질을 함유하는 조성물을 포함한, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하기 위한 키트;

(a)HMGB1 단백질

(b)HMGB1 단백질을 분비하는 세포

(c)HMGB1 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(d)HMGB2 단백질

(e)HMGB2 단백질을 분비하는 세포

(f)HMGB2 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(g)HMGB3 단백질

(h)HMGB3 단백질을 분비하는 세포

(i)HMGB3 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터.

〔8〕혈관 또는 근육에 투여되는, 세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정을 포함한 방법으로 제조되는 세포 또는 조직 추출액을 포함한, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하기 위한 키트.

〔9〕혈관 또는 근육에 투여되는, 하기 공정을 포함한 방법으로 제조되는 헤파린 결합 분획을 포함한, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하기 위한 키트;

(a)세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정,

(c)고정화 헤파린으로부터 헤파린 결합 분획을 용출하는 공정.

〔10〕하기 (a) 내지 (i) 중 어느 하나에 기재된 물질을 혈관 또는 근육에 투여하는 공정을 포함한, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 방법;

(a)HMGB1단백질

(b)HMGB1단백질을 분비하는 세포

(c)HMGB1단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(d)HMGB2단백질

(e)HMGB2단백질을 분비하는 세포

(f)HMGB2단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(g)HMGB3 단백질

(h)HMGB3 단백질을 분비하는 세포

(i)HMGB3 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터.

〔11〕세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정을 포함한 방법으로 제조되는 세포 또는 조직 추출액을 혈관 또는 근육에 투여하는 공정을 포함한, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 방법.

〔12〕하기 공정을 포함한 방법으로 제조되는 헤파린 결합 분획을 혈관 또는 근육에 투여하는 공정을 포함한, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 방법;

(a)세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정,

〔13〕혈관 또는 근육에 투여되는, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하기 위해 사용하는 약제의 제조에서의, 하기 (a) 내지 (i) 중 어느 하나에 기재된 물질의 사용;

(a)HMGB1단백질

(b)HMGB1단백질을 분비하는 세포

(c)HMGB1단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(d)HMGB2단백질

(e)HMGB2단백질을 분비하는 세포

(f)HMGB2단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(g)HMGB3 단백질

(h)HMGB3 단백질을 분비하는 세포

(i)HMGB3 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터.

〔14〕혈관 또는 근육에 투여되는, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하기 위해 사용하는 약제의 제조에서의, 세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정을 포함한 방법으로 제조되는 세포 또는 조직 추출액의 사용.

〔15〕혈관 또는 근육에 투여되는, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하기 위해 사용하는 약제의 제조에서의, 하기 공정을 포함한 방법으로 제조되는 헤파린 결합 분획의 사용;

(a)세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정,

(b)공정(a)에서 얻어지는 추출액을 고정화 헤파린에 접촉시키는 공정, 및

〔16〕혈관 또는 근육에 투여되는, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 방법에 사용하기 위한, 하기 (a) 내지 (i) 중 어느 하나에 기재된 물질;

(a)HMGB1단백질

(b)HMGB1단백질을 분비하는 세포

(c)HMGB1단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(d)HMGB2단백질

(e)HMGB2단백질을 분비하는 세포

(f)HMGB2단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(g)HMGB3 단백질

(h)HMGB3 단백질을 분비하는 세포

(i)HMGB3 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터.

〔17〕혈관 또는 근육에 투여되는, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 방법에 사용하기 위한, 세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정을 포함한 방법으로 제조되는 세포 또는 조직 추출액.

〔18〕혈관 또는 근육에 투여되는, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 방법에 사용하기 위한, 하기 공정을 포함한 방법으로 제조되는 헤파린 결합 분획;

(a)세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정,

발명을 실시하기 위한 형태

본 발명은 하기 (a) 내지 (i) 중 어느 하나에 기재된 성분을 함유하고 혈관 또는 근육에 투여되는, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하기 위해 사용하는 약제를 제공한다.

(a)HMGB1 단백질

(b)HMGB1 단백질을 분비하는 세포

(c)HMGB1 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(d)HMGB2 단백질

(e)HMGB2 단백질을 분비하는 세포

(f)HMGB2 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(g)HMGB3 단백질

(h)HMGB3 단백질을 분비하는 세포

(i)HMGB3 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

상기 약제를 혈관 또는 근육에 투여함으로써 말초 순환중에 골수 조직 줄기세포가 동원되어 손상 조직의 재생을 촉진할 수 있다. 또한, 상기 약제에는 기능적 조직 재생 유도·촉진제로서의 용도뿐만 아니라 조직 줄기세포의 감소에 의한 조직·장기 기능 저하를 예방하는, 이른바 예방 의약으로서의 용도 혹은 가령성(加齡性) 변화 진행을 지연시키는 항가령 의약으로서의 용도를 기대할 수 있다.

또한, 상기 약제를 투여하여 말초혈중에 동원한 다능성 줄기세포를 체외로 회수 후 농축하여 손상 부위에 투여하여 치료할 수도 있다. 종래의 골수 중간엽 줄기세포 치료에서는 체내 심부(深部)에 있는 골수로부터 세포를 회수하기 때문에 생체에 대해 침습이 있지만, 본 발명의 약제를 사용하면 저침습으로 골수 중간엽 줄기세포를 말초혈로부터 회수하여 골수 중간엽 줄기세포 이식 등에 이용할 수 있다.

본 발명은 세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정을 포함한 방법으로 제조되는 세포 또는 조직 추출액을 함유하고 혈관 또는 근육에 투여되는, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하기 위해 사용하는 약제에 관한 것이다.

용매에 침지되는 세포 또는 조직으로서는 특별히 제한은 없지만 조직 유래 세포, 조직 유래 세포로부터 수립된 주화(株化)세포(예를 들면 HeLa, HEK293을 예시할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다), 단리된 세포, 단리되지 않은 세포(예를 들면 단리된 조직중에 존재하는 세포), HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질을 코드하는 DNA가 도입된 세포 등을 예시할 수 있다. 상기 조직으로서는 어떠한 조직이든 상관 없으며, 예를 들면 생체 피부 조직, 체내 생검(수술) 조직(뇌, 폐, 심장, 간장, 위, 소장, 대장, 췌장, 신장, 방광, 비장, 자궁, 정소나 혈액 등)을 예시할 수 있지만 이들로 제한되지는 않는다.

상기 용매로서는 생리식염수, PBS(Phosphate-buffered saline), TBS(Tris-buffered saline)를 예시할 수 있지만 이들에 제한되지 않는다. 또한, 세포나 조직을 용매에 침지하는 시간으로서는, 세포 괴사가 유도되기 위해 필요·충분한 시간, 즉 1시간 내지 48시간(예를 들면 6시간 내지 48시간), 바람직하게는 12 내지 24시간이지만 이 시간으로 한정되지는 않는다. 따라서 「세포를 용매에 침지하는 공정」은 「괴사가 유도되기 위해 필요·충분한 시간, 세포를 용매에 침지하는 공정」이나 「세포를 괴사시키는 공정」으로 바꿔 말할 수 있다. 또한, 세포나 조직을 용매에 침지하는 온도로서 4℃ 내지 25℃(예를 들면 4℃ 내지 8℃), 바람직하게는 4℃를 예시할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 세포나 조직을 용매에 침지하는 pH로서는 pH7 내지 8, 바람직하게는 pH7.5를 예시할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 완충액의 성분으로서 10mM∼50mM, 바람직하게는 10∼20mM 농도의 인산 완충액을 들 수 있지만 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에서는 세포나 조직을 용매에 담근 후에 세포나 조직을 포함한 용매로부터 해당 세포나 해당 조직을 제거할 수도 있다. 용매로부터 세포나 조직을 제거하는 방법은 당업자에게 주지의 방법이라면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면 4℃∼25℃(예를 들면 4℃), 또한, 중력 가속도10G∼10만G(예를 들면 440G)로 원심분리하여 상청액을 분리함으로써 용매로부터 세포나 조직을 제거할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 해당 상청액을 세포나 조직 추출액으로서 이용할 수 있다.

본 발명에 사용되는 세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정을 포함한 방법으로 제조되는 세포 또는 조직 추출액으로서는, 예를 들면 피부 추출액이나 말초혈 단핵구 추출액(말초혈 추출액)을 들 수 있지만 이들에 제한되지 않는다.

말초혈 추출액의 조정 방법은 주사기 등을 사용하여 채혈한 후 냉동고나 액체 질소, 드라이아이스 등으로 세포를 동결하고 그 후 0℃ 이상의 온도하에서 재융해한다. 또한, 세포의 불용 성분을 제거하기 위해 예를 들면 4℃∼25℃(예를 들면 4℃), 또한, 중력 가속도 10G∼100000G(예를 들면 440G)로 원심분리하고 상청액을 분리함으로써 용매로부터 세포의 불용 성분을 제거할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 해당 상청액을 세포나 조직 추출액으로서 이용할 수 있다. 세포의 불용 성분을 제거하기 위해서는 원심분리 조작 대신에 0. 45㎛의 미세공을 가진 니트로셀룰로스 필터 등을 통과시킴으로써 불용 성분을 제거할 수 있다. 또한, 채혈한 말초혈을 3시간 내지 48시간 4℃의 상태로 둠으로써 세포의 괴사를 유발하여 말초혈중의 세포로부터 세포내 성분을 분비시킬 수 있다. 그 후 중력 가속도 10G∼100000G(예를 들면 440G)로 원심분리하여 상청액을 분리함으로써 용매로부터 세포의 불용 성분을 제거할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 해당 상청액을 세포나 조직 추출액으로서 이용할 수 있다. 세포의 불용 성분을 제거하기 위해서는 원심분리 조작 대신에 0. 45㎛의 미세공을 가진 니트로셀룰로스 필터 등을 통과시킴으로써 불용 성분을 제거할 수 있다.

또한, 말초혈 단핵구로부터 세포 추출액을 조정하는 방법은, 주사기 등을 사용하여 말초혈 전혈을 채취한 후 PBS에서 전량을 4mL로 희석하고 원심관에 Ficoll-Paque Plus(GE)액을 3mL 삽입 후 그 위에 희석 혈액을 중층(重層)한다. 400G(18℃)로 40분간 원심분리하여 단핵구를 포함한 중간층을 새로운 원심관에 회수하고 45mL의 PBS를 더하여 800G(18℃)로 5분간 원심분리하여 상청액을 제거한다. 또한 다시 한번 45mL의 PBS를 가하여 800G(18℃)로 5분간 원심분리하여 상청액을 제거한다. 침전된 세포에 200μL의 PBS를 가하여 현탁한다. 세포 현탁액은 -80℃의 냉동고내에서 30분간 동결하고 얼음위에서 융해한다. 이 동결 융해 조작을 3회 반복한다. 또한 800G(4℃)로 15분간 원심분리하여 상청액을 회수한다. 세포를 동결하는 대신에 4℃의 냉장고에 3시간 내지 48시간 둠으로써 세포의 괴사를 유발하여 세포내 성분을 분비시킬 수 있다. 또한, 얼음위에서 냉각하면서 초음파 처리를 함으로써 세포를 파괴하여 세포내 성분을 세포밖으로 내보낼 수 있다. 어떠한 경우이든 세포내 성분을 세포밖으로 내보낸 후 중력 가속도 440G 내지 1000000G, 바람직하게는 100000G 내지 20000G로 원심분리 조작을 하고 그 상청액을 회수하여 세포 추출액으로 한다. 또한, 원심분리 조작 대신에 0.45㎛의 미세공을 가진 니트로셀룰로스 필터 또는 셀룰로오스 아세테이트 등을 통과시킴으로써 불용 성분을 제거하여 세포 추출액으로 할 수 있다.

또한 본 발명은 하기 공정을 포함한 방법으로 제조되는 헤파린 결합 분획을 함유하고 혈관 또는 근육에 투여되는, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하기 위해 사용하는 약제에 관한 것이다.

(a)세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정

(c)고정화 헤파린에서 헤파린 결합 분획(헤파린 정제 분획, 헤파린 칼럼 정제 분획이라고도 표현할 수 있음)을 용출하는 공정.

고정화 헤파린이란, 헤파린을 불용성 담체에 공유 결합시킨 것이다. 상기 불용성 담체로서는, Sepharose beads(Sepharose 4B, Sepharose 6B 등: GE Healthcare)가 예시되는데, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서는, 시판되는 고정화 헤파린(Hitrap Hepalin HP column: GE Healthcare)을 이용해도 좋다.

세포나 조직의 추출액과 고정화 헤파린의 접촉조건으로서는, pH7~8정도(바람직하게는 pH7.5), 염농도는 0~200mM, 바람직하게는 100~200mM정도가 예시되지만, 이들에 제한되지는 않는다. 추출액과 고정화 헤파린이 접촉하는 시간은 특별히 한정되지 않지만, 헤파린 결합 분획을 고정화 헤파린에 충분히 흡착시킨다는 관점에서는 5분 이상 유지되는 것이 바람직하다. 또한, 온도로서는 4~8℃, 바람직하게는 4℃를 들 수 있는데, 이들에 제한되지는 않는다. 또한 고정화 헤파린에 흡착한 헤파린 결합 분획의 용출 조건으로서는 pH7~8정도, 염농도 200~1000mM(바람직하게는 1000mM정도)가 예시되는데, 이들에 제한되지는 않는다.

상기 추출액 또는 상기 분획을 함유하는 약제를 혈관 또는 근육에 투여함으로써 말초 순환중에 골수 조직 줄기세포가 동원되어 손상 조직의 재생을 촉진할 수 있다. 또한, 상기 약제에는 기능적 조직 재생 유도·촉진제로서의 용도뿐만 아니라 조직 줄기세포의 감소에 의한 조직·장기 기능 저하를 예방하는, 이른바 예방 의약으로서의 용도 혹은 가령성 변화의 진행을 지연시키는 항가령 의약으로서의 용도를 기대할 수 있다.

또한, 상기 약제를 투여하고 말초혈중에 동원한 다능성 줄기세포를 체외로 회수 후 농축하고 손상 부위에 투여하여 치료할 수도 있다. 종래의 골수 중간엽 줄기세포 치료에서는 체내 심부에 있는 골수로부터 세포를 회수하기 때문에 생체에 대해 침습이 있지만, 본 발명의 약제를 사용하면 저침습으로 골수 중간엽 줄기세포를 말초혈로부터 회수하여 골수 중간엽 줄기세포 이식 등에 이용할 수 있다.

본 발명은 또한, 혈관 또는 근육에 투여되는, 하기 (a) 내지 (i) 중 어느 하나에 기재된 물질을 함유하는 조성물을 포함한, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하기 위한 키트를 제공한다.

(a)HMGB1 단백질

(b)HMGB1 단백질을 분비하는 세포

(c)HMGB1 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(d)HMGB2 단백질

(e)HMGB2 단백질을 분비하는 세포

(f)HMGB2 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(g)HMGB3 단백질

(h)HMGB3 단백질을 분비하는 세포

(i)HMGB3 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

본 발명은 또한, 혈관 또는 근육에 투여되는, 세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정을 포함한 방법으로 제조되는 세포 또는 조직 추출액을 포함한, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 혈관 또는 근육에 투여되는, 하기 공정을 포함한 방법으로 제조되는 헤파린 결합 분획을 포함한, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하기 위한 키트를 제공한다.

(a)세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정,

상기 말초혈로의 골수세포 동원용 키트는 혈관 또는 근육에 투여됨으로써 말초 순환중에 골수 조직 줄기세포를 동원하는 것을 특징으로 한다.

상기 키트로서는, (1)피브리노겐에 용해한 상기 추출액 또는 상기 분획 등 및 (2)트롬빈을 포함한 조직 재생 촉진용 키트, 또는 (1)상기 추출액 또는 상기 분획 등 (2)피브리노겐 및 (3)트롬빈을 포함한 조직 재생 촉진용 키트를 예시할 수 있다. 본 발명에서는 시판되는 피브리노겐이나 트롬빈을 사용할 수 있다. 예를 들면 피브리노겐HT-Wf(베네시스-미츠비시웰파마), 베리플라스트(ZLB베링), 티젤(박스터), 볼힐(화학 및 혈청요법 연구소), 타코콤(ZLB베링)를 들 수 있지만 이들로 제한되지는 않는다.

손상 조직에 동원된 골수 유래 세포는 여러가지 세포로 분화되어 손상 조직의 기능적 재생 및 기능유지, 기능강화에 기여한다. 본 발명에서 손상 조직으로서는 허혈, 관류저하·저산소상태를 초래하는 여러가지 병태, 외상, 화상, 염증, 자기면역, 유전자 이상 등에 의해 손상된 조직을 들 수 있는데, 이들 원인에 한정되지는 않는다. 또한 손상 조직에는 괴사 조직도 포함된다.

본 발명에서의 조직으로서는, 골수 유래 세포가 분화 가능한 조직인 한 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 피부조직, 골조직, 연골조직, 근조직, 지방조직, 심근조직, 신경계조직, 폐조직, 소화관조직, 간·담·췌조직, 비뇨·생식기 등 생체 내의 모든 조직을 예시할 수 있다. 또한, 상기 조직재생 촉진제를 이용함으로써, 난치성 피부궤양, 피부창상, 수포증, 탈모증 등의 피부질환은 물론이고 뇌경색, 심근경색, 골절, 폐경색, 위궤양, 장염 등의 조직손상에서 기능적 조직재생을 유도하는 치료가 가능해진다. 상기 조직재생 촉진제가 투여되는 동물종류로서는 인간 또는 비인간 동물을 들 수 있고, 예를 들어 인간, 마우스, 랫트, 원숭이, 돼지, 개, 토끼, 햄스터, 모르모트 등을 예시할 수 있는데, 이들에 한정되지는 않는다.

본 발명의 골수세포는 조혈계 줄기세포 및 이에 유래하는 백혈구, 적혈구, 혈소판 이외의 세포로서, 지금까지 골수 중간엽 줄기세포 또는 골수 간질 다능성 줄기세포 또는 골수 다능성 줄기세포라고 불리는 세포로 대표되는 줄기세포 또는 골수 중에 존재하는 조직 전구세포집단을 포함한다. 본 발명의 골수세포로서는 골수 채취(골수세포 채취) 혹은 말초혈 채혈에 의해 단리할 수 있는 세포이다. 조혈계 줄기세포는 비부착 세포이고, 본 발명의 골수세포는 골수 채취(골수세포 채취), 말초혈 채혈에 의해 얻어진 혈액 중의 단핵구 분획 세포 배양에 의해 부착세포로서 얻어진다. 또한, 본 발명의 골수세포는 중간엽 줄기세포를 포함하고, 골아세포(분화를 유도하면 칼슘의 침착을 인정함으로써 특정 가능), 연골세포(알시안 블루 염색 양성, 사프라닌-O 염색 양성 등으로 특정 가능), 지방세포(수단III 염색 양성으로 특정 가능), 또한 섬유아세포, 평활근세포, 간질 세포, 힘줄세포 등의 중간엽 세포, 또한 신경세포, 상피세포(예를 들어, 표피 각질세포, 장관 상피세포는 사이토케라틴 패밀리를 발현함), 혈관 내피세포로의 분화능력을 갖는 것이 바람직하지만, 분화 후의 세포는 상기 세포에 한정되지 않으며 간장, 신장, 췌장 등의 실질 장기세포로의 분화능력도 포함한다.

본 발명에서 골수 유래 중간엽 줄기세포 또는 골수 간질 다능성 줄기세포 또는 골수 다능성 줄기세포란 골수내에 존재하는 세포로서, 골수에서 직접 혹은 그 밖의 조직(혈액이나 피부, 지방, 기타 조직)에서 간접적으로 채취되고, (플라스틱 혹은 유리제) 배양용기로의 부착세포로서 배양·증식 가능하며, 뼈, 연골, 지방 등의 중간엽 조직(중간엽 세포), 또는 골격근, 심근, 나아가 신경조직, 상피조직(다능성 줄기세포)으로의 분화능력을 가진다는 특징을 갖는 세포이고, 골수혈 채혈, 말초혈 채혈, 또한, 지방 등 중간엽조직, 피부 등 상피조직, 뇌 등 신경조직으로부터의 채취에 의해 취득할 수 있다. 또한, 골수 유래 중간엽 줄기세포 또는 골수 간질 다능성 줄기세포 또는 골수 다능성 줄기세포는 한 번 배양용기에 부착시킨 세포를 생체의 손상부에 투여함으로써, 예를 들어 피부를 구성하는 케라티노사이트 등의 상피계 조직, 뇌를 구성하는 신경계 조직으로의 분화능력도 가진다는 특징도 갖는다.

본 발명의 골수 중간엽 줄기세포 또는 골수 간질 다능성 줄기세포 또는 골수 다능성 줄기세포는 골아세포(분화를 유도하면 칼슘의 침착을 인정함으로써 특정 가능), 연골세포(알시안 블루 염색 양성, 사프라닌-0 염색 양성 등으로 특정 가능), 지방세포(수단 Ⅲ 염색 양성 등으로 특정 가능) 이외에, 예를 들어 섬유아세포, 평활근세포, 골격근세포, 간질 세포(stromal cell), 힘줄세포 등의 중간엽 세포, 신경세포, 색소세포, 표피세포, 모낭세포(사이토케라틴 패밀리, 헤어케라틴 패밀리 등을 발현함), 상피계 세포(예를 들어, 표피 각화세포, 장관 상피세포는 사이토케라틴 패밀리 등을 발현함), 내피세포, 또한, 간장, 신장, 췌장 등의 실질 장기세포로 분화하는 능력을 갖는 것이 바람직하지만, 분화 후의 세포는 상기 세포에 한정되지는 않는다.

또한, 인간 골수 중간엽 줄기세포 또는 골수 간질 다능성 줄기세포 또는 골수 다능성 줄기세포는 골수 채취(골수세포 채취), 말초혈 채혈, 지방 채취, 직접 혹은 단핵구 분획을 분리 후에 배양하여 부착세포로서 취득할 수 있는 세포를 예시할 수 있는데, 이에 제한되지는 않는다. 인간 골수 중간엽 줄기세포 또는 골수 간질 다능성 줄기세포 또는 골수 다능성 줄기세포의 마커로서는 Lin음성, CD45음성, CD44양성의 전부 또는 일부를 예시할 수 있는데, 이들에 제한되지는 않는다.

또한 마우스 골수 중간엽 줄기세포 또는 골수 간질 다능성 줄기세포 또는 골수 다능성 줄기세포는, 예를 들어 실시예에 기재된 방법에 의해 취득할 수 있는 세포를 예시할 수 있는데, 이에 제한되지는 않는다. 마우스 골수 중간엽 줄기세포 또는 골수 간질 다능성 줄기세포 또는 골수 다능성 줄기세포의 마커로서는 CD44양성, PDGFRα양성, PDGFRβ양성, CD45음성, Lin음성, Sca-1양성, c-kit음성의 전부 또는 일부를 예시할 수 있는데, 이들에 제한되지는 않는다.

조직 전구세포는 혈액계 이외의 특정 조직세포로의 일방향성 분화능력을 갖는 미분화세포라고 정의되고, 상술한 중간엽 조직, 상피계 조직, 신경조직, 실질 장기, 혈관내피로의 분화능력을 갖는 미분화세포를 포함한다.

본 발명의 약제에서, 상기 추출액, 상기 헤파린 결합 분획 또는 상기 (a) 내지 (i)에 기재된 성분 중에서 적어도 하나의 성분 이외의 성분으로서는, 골수세포의 동원이나 조직재생 촉진을 저해하지 않는 한 특별히 제한되지는 않는다. 예를 들어, 본 발명의 약제에는 상기 추출액, 상기 헤파린 결합 분획 또는 상기 (a) 내지 (i)에 기재된 성분 중에서 적어도 하나의 성분과 함께, HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3의 기능적 조직재생 유도기능을 강화하는 관련분자(군), HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3의 기대되는 효과 이외의 작용을 억제하는 분자(군), 골수 유래 세포의 증식이나 분화를 제어하는 인자, 이들 인자 혹은 세포의 기능을 강화·유지하는 그 이외의 인자를 포함하는 것이 가능하다.

본 발명의 약제에서의 추출액, 헤파린 결합 분획, HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질의 기원이 되는 동물종류로서는 인간 또는 비인간 동물을 들 수 있고, 예를 들어 인간, 마우스, 랫트, 원숭이, 돼지, 개, 토끼, 햄스터, 모르모트 등을 예시할 수 있는데, 상기 추출액 등이 투여되는 동물종류와 같은 동물종류인 것이 바람직하다.

본 발명의 약제에서의 HMGB1단백질로서는 서열번호:1, 3 또는 5에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질을 예시할 수 있는데, 이들에 한정되지는 않는다. 본 발명의 HMGB1단백질에는 서열번호: 1, 3 또는 5에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단백질도 포함된다. 이러한 단백질로서는, 예를 들어 1)서열번호: 1, 3 또는 5에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실(缺失), 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 서열번호: 1, 3 또는 5에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질 및 2)서열번호: 2, 4 또는 6에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 DNA에 의해 코드되는 단백질로서, 서열번호: 1, 3 또는 5에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질을 들 수 있다.

본 발명의 약제에서의 HMGB2단백질로서는 서열번호: 7, 9 또는 11에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질을 예시할 수 있는데, 이들에 한정되지는 않는다. 본 발명의 HMGB2단백질에는 서열번호: 7, 9 또는 11에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단백질도 포함된다. 이러한 단백질로서는, 예를 들어 1)서열번호: 7, 9 또는 11에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 서열번호: 7, 9 또는 11에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질 및 2)서열번호: 8, 10 또는 12에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화되는 DNA에 의해 코드되는 단백질로서, 서열번호: 7, 9 또는 11에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질을 들 수 있다.

본 발명의 약제에서의 HMGB3 단백질로서는 서열번호: 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질을 예시할 수 있는데, 이들에 한정되지는 않는다. 본 발명의 HMGB3 단백질에는 서열번호: 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단백질도 포함된다. 이러한 단백질로서는, 예를 들어 1)서열번호: 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 서열번호: 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질 및 2)서열번호: 14 또는 16에 기재된 염기서열을 포함한 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화되는 DNA에 의해 코드되는 단백질로서, 서열번호: 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질을 들 수 있다.

서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질은, 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질의 호모로그 혹은 파라로그일 수 있다. 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단백질은, 당업자에 의해 주지의 방법(실험 의학 별책·유전자 공학 핸드북, pp 246-251, 요도사, 1991년 발행)으로 단리할 수 있다.

서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단백질로서는, 골수 유래 세포의 유도활성을 갖는 단백질을 들 수 있다.

서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단백질은 천연에 존재하는 단백질을 포함한다. 일반적으로 진핵생물의 유전자는 인터페론 유전자 등으로 알려져 있는 바와 같이 다형현상(polymorphism)을 가진다. 이 다형현상에 의해 생긴 염기서열의 변화에 따라 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가되는 경우가 있다. 이와 같이 자연에 존재하는 단백질로서, 또한 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 가지고, 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 기능적으로 동등한 단백질은 본 발명의 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질에 포함된다.

또한, 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 기능적으로 동등한 단백질인 한 인위적으로 제작된 변이 단백질도 본 발명에 포함된다. 주어진 염기 서열에 대해 무작위로 변이를 가하는 방법으로서는, 예를 들어 DNA의 아질산처리에 의한 염기쌍의 치환이 알려져 있다(Hirose, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 79:7258-7260, 1982). 이 방법으로는, 변이를 도입하고자 하는 세그먼트를 아질산처리함으로써 특정의 세그먼트 내에 무작위로 염기쌍의 치환을 도입할 수 있다. 혹은, 또한 목적으로 하는 변이를 임의의 장소에 일으키는 기술로서는 gapped duplex법 등이 있다(Kramer W. and Fritz HJ., Methods in Enzymol., 154:350-367, 1987). 변이를 도입해야 할 유전자를 클로닝한 환형 이중쇄의 벡터를 단일쇄로 분리하고, 목적으로 하는 부위에 변이를 가진 합성 올리고뉴클레오티드를 혼성화시킨다. 제한효소에 의해 절단하여 선형화된 벡터 유래의 상보적 단일쇄 DNA를 상기 환형 단일쇄 벡터에 어닐링하고, 상기 합성 뉴클레오티드와의 사이의 간격을 DNA 폴리머라아제를 이용하여 채우며 라이게이션함으로써 완전한 이중쇄 환형 벡터로 한다.

변형되는 아미노산의 수는 전형적으로는 50 개 이내의 아미노산이고, 바람직하게는 30 개 이내의 아미노산이며, 더 바람직하게는 5 개 이내의 아미노산(예를 들어, 1 개의 아미노산)이라고 여겨진다.

아미노산을 인위적으로 치환하는 경우, 성질이 비슷한 아미노산으로 치환하면 원래의 단백질의 활성이 유지되기 쉽다고 여겨진다. 본 발명의 단백질에는 상기 아미노산 치환에 있어서 보존적 치환이 가해진 단백질로서, 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단백질이 포함된다. 보존적 치환은, 단백질의 활성에 중요한 도메인의 아미노산을 치환하는 경우에 중요하다고 생각된다. 이러한 아미노산의 보존적 치환은 당업자에게는 잘 알려져 있다.

보존적 치환에 상당하는 아미노산의 그룹으로서는, 예를 들어 염기성 아미노산(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 아미노산(예를 들어, 아스파라긴산, 글루타민산), 비하전극성 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β분기 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 들 수 있다.

또한, 비보존적 치환에 의해 단백질의 활성 등을 보다 상승(예를 들어, 항상적 활성화형 단백질 등을 포함함)시키는 것도 고려된다.

그 밖에, 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 얻는 방법으로서 혼성화를 이용하는 방법을 들 수 있다. 즉, 서열번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 또는 16에 나타내는 바와 같은 본 발명에 따른 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질을 코드하는 DNA 혹은 그 단편을 프로브로 하고 이것과 혼성화할 수 있는 DNA를 단리한다. 혼성화를 엄격한 조건하에서 실시하면, 염기서열로서는 상동성이 높은 DNA가 선택되고, 그 결과로서 단리되는 단백질에는 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질과 기능적으로 동등한 단백질이 포함될 가능성이 높아진다. 상동성이 높은 염기서열이란, 예를 들어 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 나타낼 수 있다.

또, 엄격한 조건이란, 구체적으로는 예를 들어 6×SSC, 40% 포름아미드, 25℃에서의 혼성화와 1×SSC, 55℃에서의 세정이라는 조건을 나타낼 수 있다. 엄격함은 염농도, 포름아미드의 농도 혹은 온도의 조건으로 좌우되는데, 당업자라면 이들의 조건을 필요한 엄격함이 얻어지도록 설정하는 것은 자명하다.

혼성화를 이용함으로써, 예를 들어 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질 이외의 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질의 호몰로그를 코드하는 DNA의 단리가 가능하다.

서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단백질은, 통상적으로 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열과 높은 상동성을 가진다. 높은 상동성이란, 적어도 30% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상(예를 들어, 95% 이상)의 서열의 동일성을 가리킨다. 염기서열이나 아미노산 서열의 동일성은 인터넷을 이용한 상동성 검색 사이트를 이용하여 행할 수 있다[예를 들어, 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)에 있어서, FASTA, BLAST, PSI-BLAST 및 SSEARCH 등의 상동성 검색을 이용할 수 있다[예를 들어, 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)의 웹사이트의 상동성 검색(Search and Analysis)의 페이지; http//www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html]. 또한 National Center for Biotechnology Information(NCBI)에 있어서 BLAST를 이용한 검색을 할 수 있다(예를 들어, NCBI의 홈페이지의 웹사이트의 BLAST의 페이지;http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/;Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol., 1990, 215(3):403-10; Altschul, S.F. & Gish, W., Meth. Enzymol., 1996, 266:460-480; Altschul, S.F. et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25:3389-3402)].

예를 들어, Advanced BLAST 2.1에서의 아미노산 서열의 동일성의 산출은 프로그램으로 blastp를 이용하고, Expect값을 10, Filter는 전부 OFF로 하여, Matrix로 BLOSUM62를 이용하고, Gap existence cost, Per residue gap cost 및 Lambda ratio를 각각 11, 1, 0.85(디폴트값)로 설정하고 검색하여 동일성(identity)의 값(%)을 얻을 수 있다(Karlin, S. and S.F. Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68; Karlin, S. and S.F. Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7).

본 발명에 따른 단백질 또는 그 기능적으로 동등한 단백질은, 당쇄 등의 생리적인 수식, 형광이나 방사성 물질과 같은 표식 혹은 다른 단백질과의 융합이라는 각종 수식을 가한 단백질일 수 있다. 특히 이후에 기재하는 유전자 재조합체에 있어서는, 발현시키는 숙주에 따라 당쇄에 의한 수식에 차이가 생길 가능성이 있다. 그러나 비록 당쇄의 수식에 차이가 있어도, 본 명세서 중에 개시된 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질과 같은 성상을 나타내는 것이면 모두 본 발명에 따른 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질 또는 기능적으로 동등한 단백질이다.

HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질은 생체재료뿐만 아니라, 이를 코드하는 유전자를 적절한 발현 시스템에 도입함으로써 유전자 재조합체(recombinant)로서 얻을 수도 있다. HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질을 유전자 공학적인 기술에 의해 얻기 위해서는, 앞에서 말한 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질을 코드하는 DNA를 적절한 발현계에 도입하여 발현시키면 된다. 본 발명에 응용 가능한 호스트/벡터계로서는, 예를 들어 발현 벡터 pGEX와 대장균을 나타낼 수 있다. pGEX는 외래 유전자를 글루타티온 S-전이효소(GST)와의 융합 단백질로서 발현시킬 수 있으므로(Gene, 67:31-40, 1988), HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질을 코드하는 유전자를 도입한 pGEX를 열 쇼크로 BL21과 같은 대장균주에 도입하여 적절한 배양시간 후에 이소프로필티오-β-D-갈락토사이드(IPTG)를 첨가하여 GST융합 HMGB1, GST융합 HMGB2 또는 GST융합 HMGB3 단백질의 발현을 유도한다. 본 발명에 따른 GST는 글루타티온 세파로즈 4B에 흡착하기 때문에, 발현 생성물은 친화성 크로마토그래피에 의해 용이하게 분리·정제할 수 있다.

HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질의 재조합체를 얻기 위한 호스트/벡터계로서는 그 밖에도 다음과 같은 것을 응용할 수 있다. 우선, 세균을 호스트로 이용하는 경우에는, 히스티딘 태그, HA 태그, FLAG 태그 등을 이용한 융합 단백질의 발현용 벡터가 시판되고 있다. 효모에서는, Pichia속 효모가 당쇄를 구비한 단백질의 발현에 유효한 것이 알려져 있다. 당쇄의 부가라는 점에서는, 곤충세포를 호스트로 하는 바큘로바이러스 벡터를 이용한 발현계도 유용하다(Bio/Technology, 6:47-55, 1988). 또, 포유동물의 세포를 이용하여 CMV, RSV 혹은 SV40 등의 프로모터를 이용한 벡터의 트랜스펙션이 행해져 있고, 이들의 호스트/벡터계는 모두 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질의 발현계로서 이용할 수 있다. 또한, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노수반 바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터를 이용하여 유전자를 도입할 수도 있다.

얻어진 본 발명의 단백질은, 숙주세포 안 또는 세포 밖(배지 등)으로부터 단리하여 실질적으로 순수하고 균일한 단백질로서 정제할 수 있다. 단백질의 분리, 정제는 통상의 단백질의 정제에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 되고 전혀 한정되지 않는다. 예를 들어, 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 용매침전, 용매추출, 증류, 면역침강, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석, 재결정 등을 적절히 선택, 조합하면 단백질을 분리, 정제할 수 있다.

크로마토그래피로서는, 예를 들어 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다(Marshak et al., Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). 이들의 크로마토그래피는 액상 크로마토그래피, 예를 들어 HPLC, FPLC 등의 액상 크로마토그래피를 이용하여 행할 수 있다.

또한 본 발명의 단백질은 실질적으로 정제된 단백질인 것이 바람직하다. 여기서 「실질적으로 정제된」이란, 본 발명의 단백질의 정제도(단백질 성분 전체에서의 본 발명의 단백질의 비율)가 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 100% 또는 100%에 가까운 것을 의미한다. 100%에 가까운 상한은 당업자의 정제기술이나 분석기술에 의존하는데, 예를 들어 99.999%, 99.99%, 99.9%, 99% 등이다.

또한 상기 정제도를 갖는 것이면, 어떠한 정제방법에 의해 정제된 것이어도 실질적으로 정제된 단백질에 포함된다. 예를 들어, 상술한 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 용매침전, 용매추출, 증류, 면역침강, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석, 재결정 등을 적절히 선택 또는 조합함으로써 실질적으로 정제된 단백질을 예시할 수 있는데, 이들에 한정되지는 않는다.

본 발명의 약제에서의 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질을 방출 또는 분비하는 세포로서는, 기본적으로 생체 내의 모든 조직 유래 세포가 해당한다. 채취 및 배양이 용이한 세포로서는 섬유아세포(예를 들어, 정상피부 섬유아세포 및 그것에서 유래하는 세포주)를 예시할 수 있는데, 이에 한정되지는 않는다. 또한, HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질을 분비하는 세포는 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질을 코드하는 DNA 혹은 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질을 코드하는 DNA에 분비 신호를 코드하는 DNA(ATG CAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTG TGG GTT CCA GGT TCC ACT GGT GAC; 서열번호: 17)를 결합시킨 DNA를 주지의 발현 벡터나 유전자 치료용 벡터에 삽입함으로써 제작된 벡터를 섬유아세포(예를 들어, 정상피부 섬유아세포 및 그것에 유래하는 세포주) 등의 포유류세포나 곤충세포, 그 이외의 세포에 도입함으로써도 제작할 수 있다. 분비 신호를 코드하는 DNA로서는 상술한 서열을 가진 DNA가 예시되는데 이에 한정되지는 않는다. 또한, 이들 세포가 유래하는 동물종류에 특별히 제한은 없지만, 조직재생이 이루어지는 대상동물종의 세포, 대상 자신의 세포 혹은 조직재생이 이루어지는 대상의 혈연에 해당하는 자로부터 유래하는 세포를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약제에서의 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질을 코드하는 DNA는, HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질을 코드하는 한 cDNA 또는 게놈 DNA이어도 되고, 또한 천연의 DNA 또는 인공적으로 합성된 DNA이어도 된다. HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질을 코드하는 DNA는, 통상적으로 벡터(예를 들어, 유전자 치료용 벡터)에 삽입된 상태에서 본 발명의 약제에 함유된다.

본 발명에서의 유전자 치료용 벡터로서는 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터, 센다이바이러스 엔빌로프 벡터, 파필로마바이러스 벡터 등을 예시할 수 있으나, 이들에 한정되지는 않는다. 해당 유전자 치료용 벡터에는, 유전자 발현을 효과적으로 유도하는 프로모터 DNA 서열이나 유전자 발현을 제어하는 인자, DNA의 안정성을 유지하기 위해 필요한 분자가 포함되어도 된다.

또, 본 발명의 약제에서는, HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질의 부분 펩티드로서 골수세포의 골수로부터 말초혈로의 동원 활성을 갖는 펩티드, 해당 부분 펩티드를 분비하는 세포 또는 해당 부분 펩티드를 코드하는 DNA가 삽입된 벡터를 함유할 수도 있다.

본 발명의 약제의 투여 방법은, 혈관 또는 근육으로의 비경구 투여이다. 관련된 투여 방법으로서는 구체적으로는 주사 투여를 들 수 있다. 예를 들면 혈관내 주사(동맥내 주사, 정맥내 주사 등), 근육내 주사 등에 의해 본 발명의 약제를 혈관 또는 근육에 투여할 수 있다.

또한 환자의 연령, 증상에 의해 적절히 투여방법을 선택할 수 있다. HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질을 투여할 경우, 예를 들어 1회의 투여에 대해 체중 1㎏당 O.0000001㎎ 내지 1000㎎의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 혹은, 예를 들어 환자당 0.00001 내지 100000㎎/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질을 분비하는 세포나 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 유전자 치료용 벡터를 투여하는 경우에도 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질의 양이 상기 범위 내가 되도록 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제는 이들의 투여량에 제한되지는 않는다.

본 발명의 약제는 통상적인 방법에 따라 제제화할 수 있고(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A), 의약적으로 허용되는 담체나 첨가물을 함께 포함하는 것이어도 된다. 예를 들어 계면활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕해제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 들 수 있는데, 이들에 제한되지 않고 그 밖의 통상의 담체를 적절히 사용할 수 있다. 구체적으로는 경질무수규산, 유당, 결정 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 카멜로오스 칼슘, 카멜로오스 나트륨, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 중쇄지방산 트리글리세라이드, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유60, 백당, 카르복시메틸 셀룰로오스, 옥수수 전분, 무기염류 등을 들 수 있다.

또한, 상술한 세포 또는 조직의 추출액, 헤파린 결합 분획, HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질, HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질을 분비하는 세포, HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터, HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질의 부분 펩티드, 해당 부분 펩티드를 분비하는 세포 또는 해당 부분 펩티드를 코드하는 DNA가 삽입된 벡터의 용도는 하기 (1)∼(3)과 같이 표현할 수도 있다.

(1)세포 또는 조직 추출액, 헤파린 결합 분획, HMGB1, HMGB2, HMGB3 단백질, 해당 단백질을 분비하는 세포, 해당 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터, 해당 단백질의 부분 펩티드, 해당 부분 펩티드를 분비하는 세포, 또는 해당 부분 펩티드를 코드하는 DNA가 삽입된 벡터를 혈관 또는 근육에 투여하는 공정을 포함한, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 방법,

(2)혈관 또는 근육에 투여되는, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하기 위해 사용하는 약제의 제조에서의, 세포 또는 조직 추출액, 헤파린 결합 분획,HMGB1, HMGB2, HMGB3 단백질, 해당 단백질을 분비하는 세포, 해당 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터, 해당 단백질의 부분 펩티드, 해당 부분 펩티드를 분비하는 세포, 또는 해당 부분 펩티드를 코드하는 DNA가 삽입된 벡터의 사용,

(3)혈관 또는 근육에 투여되는, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 방법에 사용하기 위한 세포 또는 조직 추출액, 헤파린 결합 분획, HMGB1, HMGB2, HMGB3 단백질, 해당 단백질을 분비하는 세포, 해당 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터, 해당 단백질의 부분 펩티드, 해당 부분 펩티드를 분비하는 세포, 또는 해당 부분 펩티드를 코드하는 DNA가 삽입된 벡터.

또한, 본 발명은 하기 공정을 포함한, 세포 또는 조직 추출액에 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자가 포함되는지 여부를 평가하는 방법으로서, 공정(b)에서의 골수세포의 골수로부터 말초혈로의 동원 활성이 대조군과 비교하여 높은 경우에 세포 또는 조직 추출액에 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자가 포함된다고 판정되는 방법을 제공한다.

(a)세포 또는 조직 추출액을 제조하는 공정 및

(b)공정(a)에서 제조된 추출액에 의한 골수세포의 골수로부터 말초혈으로의 동원 활성을 측정하는 공정

상기 방법에서는 우선 세포 또는 조직을 용매에 침지한다. 상기 세포로서는 특별히 제한은 없지만, 조직 유래 세포, 조직 유래 세포에서 수립된 세포주(예를 들어, HeLa, HEK293을 예시할 수 있는데, 이들에 제한되지 않음), 단리된 세포, 단리되지 않은 세포(예를 들어, 단리된 조직 중에 존재하는 세포), HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질을 코드하는 DNA가 도입된 세포 등을 예시할 수 있다. 상기 조직으로서는 어떠한 조직이어도 되고, 예를 들어 생체 피부 조직, 체내 생검(수술) 조직(뇌, 폐, 심장, 간장, 위, 소장, 대장, 췌장, 신장, 방광, 비장, 자궁, 정소나 혈액 등), 손상 조직을 예시할 수 있다. 또한, 해당 용매로서는 생리식염수, PBS, TBS를 예시할 수 있는데, 이들에 제한되지는 않는다. 또한 세포 또는 조직을 용매에 침지하는 시간으로는 세포 괴사를 유도하기 위해 필요·충분한 시간(통상 24시간 이상)인 것이 바람직한데, 이 시간에 한정되지는 않는다. 또한, 본 발명에서는, 세포 또는 조직을 용매에 담근 후에 세포 또는 조직을 포함하는 용매로부터 그 세포나 그 조직을 제거할 수도 있다. 용매에서 세포 또는 조직을 제거하는 방법은 당업자에게 주지의 방법이라면 특별히 제한되지는 않는다.

그 후 얻어진 세포 또는 조직 추출액에 의한 골수세포의 골수로부터 말초혈로의 골수세포 동원 활성을 측정한다. 대조군으로서는, 세포 또는 조직을 침지하기 전의 용매를 예시할 수 있다. 골수세포의 골수세포 동원 활성은, 예를 들면 실시예의 기재 방법으로 측정할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다.

골수로부터 말초 순환으로의 골수세포의 동원 활성은, 얻어진 세포 또는 조직 추출액을 경정맥, 경피, 근육내, 복강내 투여한 후 1분 내지 4주일 경과 후, 바람직하게는 1시간 내지 24시간 경과 후, 더욱 바람직하게는 12시간 경과 후 말초혈을회수하여 그 단핵구 세포군에 대해 유세포 분석기법을 이용하여 PDGFRα양성 세포이면서 CD44양성 세포, 또는 PDGFRβ세포이면서 CD44양성 세포의 세포수를 카운트함으로써 측정할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다.

또한, 본 발명은, 하기 공정을 포함한, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자가 포함되는 세포 또는 조직 추출액을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

(a)여러 추출액에 대해서 상기 방법으로 해당 추출액에 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자가 포함되는지 여부를 평가하는 공정, 및

(b)공정(a)에서 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자가 포함된다고 평가된 추출액을 선택하는 공정

또한 본 발명은 상기 평가 방법이나 스크리닝 방법에 의해 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자를 포함한다고 판정된 추출액으로부터, 골수세포의 동원 활성을 지표로 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자를 정제하는 공정을 포함한, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자의 동정 방법을 제공한다. 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자의 정제에는 통상의 단백질의 정제에 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 되고 전혀 한정되지 않는다. 예를 들어, 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 용매침전, 용매추출, 증류, 면역침강, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석, 재결정 등을 적절히 선택, 조합하면 단백질을 분리, 정제할 수 있다. 정제된 인자는, 예를 들어 질량분석 등의 당업자에게 주지의 방법에 의해 동정할 수 있다. 동정된 인자를 사용함으로써 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원할 수 있다. 또한, 해당 인자는 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 후보나 골수세포의 골수로부터 말초혈로의 동원에 기여하는 후보로 표현할 수도 있다.

아울러 본 명세서에서 인용된 모든 선행 기술문헌은 참조로서 본 명세서에 추가된다.

도 1은, HMGB1발현벡터의 도면이다.
도 2는, 마우스 꼬리정맥으로부터 피부 추출액(SE)을 투여하고 말초혈을 채취하는 도면이다.
도 3은, 피부 추출액(SE)을 투여후 12시간후의 마우스 말초혈 단핵구(球) 분획을 항마우스PDGFRα항체, 항마우스 CD44항체로 형광 표식하고 유세포 분석기(flow cytometry)로 분획한 도면이다. 상단 3개는 음의 대조군의 PBS투여군(n=3), 하단 3개는 피부 추출액(SE) 투여군(n=3)이다. 종축은 CD44의 발현량을 횡축은 PDGFRα의 발현량을 나타낸다. 파란 선으로 둘러싼 부분이 CD44양성이면서 PDGFRα양성 세포군을 나타내며, 피부 추출액 투여군(SE)에서 PBS군에 비해 증가하고 있다.
도 4는, 마우스 꼬리정맥으로부터 HMGB1을 투여하여 말초혈을 채취하는 도면이다.
도 5는, HMGB1을 투여후 12시간된 마우스 말초혈 단핵구 분획을 항마우스PDGFRα항체, 항마우스CD44항체로 형광 표식하고 유세포 분석기로 분획한 도면이다. 왼쪽은 음의 대조군의 PBS투여 마우스, 오른쪽은 HMGB1투여 마우스의 도면이다. 종축은 CD44의 발현량을, 횡축은 PDGFRα의 발현량을 나타내고 있다. 파란 선으로 둘러싼 부분이 CD44양성이면서 PDGFRα양성 세포군을 나타내고, HMGB1투여 마우스에서 PBS투여 마우스에 비해 증가된다.
도 6은, 신생 마우스 피부 추출액중의 HMGB패밀리를 Western blot법을 사용하여 검출한 사진이다.
도 7은, HEK293 세포에 발현시킨 정제 재조합 Flag tag-HMGB패밀리 융합 단백질의 Western blot의 결과를 도시한 사진이다.
도 8은, 보이덴 챔버를 이용한 재조합 HMGB1·HMGB2·HMGB3의 골수 중간엽 줄기세포 유주(遊走) 활성을 도시한 도면이다. 모든 재조합 단백질이 대조군에 비해 유주 활성을 나타내었다.
도 9는, 마우스의 피부궤양 치료 모델에서의 HMGB 패밀리에 의한 치료 결과를 도시한 도면이다. HMGB1·HMGB2·HMGB3 모두 대조군에 비해 유의적으로 궤양 면적의 축소 효과를 나타내었다.
도 10은, 인간 HMGB1 및 인간 피부 추출액이 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 유주하는 활성을 보이덴 챔버를 이용하여 확인한 사진이다.
도 11은, 마우스 심장, 마우스 뇌 및 마우스 피부 추출액 중의 골수 중간엽 줄기세포 유도 활성물질을 헤파린 칼럼으로 정제하고, 보이덴 챔버를 이용하여 활성을 확인한 사진이다.
도 12는, 배양 세포주 HEK293 및 HeLa추출액의 인간 골수 중간엽 줄기세포 유주 활성을 보이덴 챔버법을 이용하여 확인한 사진이다. 모든 배양 세포주가 인간 골수 중간엽 줄기세포 유주 활성을 나타내었다.
도 13은, A는 마우스를 뇌정위 고정장치(brain stereotaxic apparatus)에 고정시키고 메스로 머리부의 정중앙을 절개하고 드릴을 이용하여 천두(穿頭)를 실시한 사진이다. B는 뇌에 주사기를 이용하여 음압을 가하고 뇌조직을 일부 흡인한 사진이다. C는 피브린 접착제(피브리노겐)에 용해한 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획을 5㎕ 주입하고, 다음에 피브린 접착제(트롬빈)를 5㎕ 주입한 후의 사진이다. D 및 E는 뇌손상 모델 치료 후 2주일 후의 사진이다. 대조군 D에 비해 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획에 의한 치료군 E에서 GFP 양성세포의 집적이 인정되었다. F 및 G는 뇌손상 모델 치료 후 6주일 후의 사진이다. 대조군 F에 비해 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획에 의한 치료군의 G에서 GFP 양성세포의 집적이 인정되었다.
도 14는, A는 CD44 및 PDGFRα를 가진 세포의 존재 빈도를 표시한 유세포 분석기의 결과를 도시한 도면이다. 말초혈중의 PDGFRα양성이면서 CD44양성 세포 및 PDGFRα양성이면서 CD44음성 세포 모든 세포군도 HMGB1투여에 의해 증가되었다. B는 PDGFRα양성이면서 CD44양성 세포, C는 PDGFRα양성이면서 CD44음성 세포에 대해서 각각 PBS투여군과 HMGB1투여군에서 말초혈중의 출현 빈도를 비교한 결과를 도시한 도면이다. 모든 세포군은 HMGB1투여군에서 통계적으로 유의적으로 증가되었다.

<실시예>

이하 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예로 제한되지는 않는다.

〔실시예 1〕

목적: 피부 조직 추출액내에 존재하는 골수 유래 조직 줄기세포 유도 인자에 의한 골수 조직 줄기세포의 말초혈로의 동원

방법: 상기 목적에 대해 하기 방법에 의해 연구를 하였다.

1)골수 유래 조직 줄기세포 유도제의 제조: 신생 마우스(2일령) 25마리에서 얻은 유리 피부조각을 생리적 인산 완충액 pH7.4(PBS) 25㎖에 침지하고 4℃에서 24시간 인큐베이션한 후 조직을 제거하기 위해 4℃의 조건하에서 10분간, 440G로 원심분리하여 상청액을 회수하여 피부 추출액(SE)을 제작하였다.

또한, C57/Bl6신생 마우스 피부로부터 Trizol(invitrogen)을 사용하여 RNA를 추출하고 또한, SuperScript III cDNA synthesis kit(Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 템플릿으로 하여 HMGB1의 cDNA를 PCR(폴리메라아제 연쇄 반응)법을 사용하여 증폭하고 아미노산 서열의 N말단에 Flag tag의 서열(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys; 서열 번호:18)을 부가한 단백질을 발현하도록 포유류 세포에 단백질을 발현시키는 플라스미드 벡터 pCAGGS에 삽입하였다(도 1). 이들 플라스미드 벡터를 HEK293(인간 태아 신(腎)세포 유래 배양 세포주)에 유전자 도입하여 48시간 배양하여 단백질을 발현시켰다. HMGB1 단백질을 각각 발현시킨 세포 및 배양 상청액은 4℃에서 16시간 인큐베이트한 후 4400g·5분간 원심분리하여 상청액을 회수하였다. 이 상청액 50mL당 100μL의 Anti Flag항체Gel(Sigma)을 혼합하여 4℃에서 16시간 인큐베이트하였다. 원심분리하여 Gel을 회수한 후 PBS를 사용하여 5회 세정하였다. 또한 3X Flag 펩티드(final 100㎍/㎖)를 사용하여 용출하였다. 용출한 단백질은 HMGB1 ELISA kit(시노테스트)를 사용하여 농도를 확인하고 동결 건조후 PBS를 사용하여 200㎍/mL로 조정하였다.

2)8주령 수컷 마우스(C57/Bl6)의 꼬리정맥에 전술한 피부 추출액(SE) 500μL 또는 음의 대조군으로서 PBS 500μL를 30G1/2의 주사침을 장착한 실린지를 사용하여 투여하였다(도 2). 투여 6/12/24/48시간후 이소퓨란에 의한 흡입 마취하에서 마우스의 심장으로부터 헤파린 코팅한 1mL의 실린지를 사용하여 말초혈 1mL를 채혈하고 3mL의 PBS와 혼합한 후 3mL의 Ficol(GE healthcare)위에 조용히 중층하였다. 원심기를 사용하여 25℃에서 400g, 40분간 원심분리하였다. 중간층의 백탁된 층의 세포를 단핵구 분획으로서 회수하였다. 회수한 세포에 용혈제인 HLB solution(면역 생물 연구소) 1mL를 가하여 실온에서 5분 인큐베이트하였다. 이 용혈 조작을 2회 반복하였다. 10mL의 PBS를 가하여 25℃에서 440g, 5분간 원심분리하여 상청액을 제거하고 세포를 회수하였다. 이 세포 1,000,000개에 항마우스 PE표식 PDGFRα항체(e-Bioscience), PE표식 항마우스PDGFRβ항체(e-Bioscience), PerCy5표식 항마우스CD44항체(BD biosciences) 각각을 PBS에서 100배 희석하여 20분간 실온에서 인큐베이트하였다. 그 후 이 세포를 25℃, 440g, 5 분간 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 1% 파라포름알데히드 함유PBS를 400μL 가하여 유세포 분석기 해석의 샘플로 하였다.

8주령 수컷 마우스(C57/Bl6)의 꼬리정맥에 마우스HMGB1 250μL(1㎍/μL) 또는 음의 대조군으로서 PBS 250μL을 30G 1/2의 주사침을 장착한 실린지를 사용하여 투여하였다(도 4). 투여 12시간후 이소퓨란에 의한 흡입 마취하에 마우스의 심장으로부터 헤파린 코팅한 1mL의 실린지를 사용하여 말초혈 1mL를 채혈하고 3mL의 PBS와 혼합한 후 3 mL의 Ficol(GE healthcare) 위에 조용히 중층하였다. 원심기를 사용하여 25℃에서 400g, 40분간 원심분리하였다. 중간층의 백탁된 층의 세포를 단핵구 분획으로서 회수하였다. 회수한 세포에 용혈제인 HLB solution(면역 생물 연구소) 1mL를 가하여 실온에서 5분간 인큐베이트하였다. 이 용혈 조작을 2회 반복하였다. 10mL의 PBS를 가하여 25℃에서 440g, 5분간 원심분리하여 상청액을 제거하고 세포를 회수하였다. 이 세포 1,000,000개에 항마우스 PE표식PDGFRα항체(e-Bioscience), PerCy5표식 항마우스CD44항체(BD biosciences) 각각을 PBS로 100배 희석하여 20분간 실온에서 인큐베이트하였다. 그 후 이 세포를 25℃, 440g, 5분간 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 1% 파라포름알데히드 함유 PBS를 400μL 가하여 유세포 분석기 해석의 샘플로 하였다.

결과: 피부 추출액(SE)을 주사 12시간후 말초혈에서 유의적으로 PDGFRα양성, CD44양성 세포가 동원된 것이 확인되었다(도 3). HMGB1을 주사한지 12 시간후의 말초혈에서 유의적으로 PDGFRα양성, CD44양성 세포가 동원된 것이 확인되었다(도 5).

[실시예 2]

목적: 재조합 HMGB1단백질의 정맥내 투여에 의해 중간엽 줄기세포가 말초혈 중에 동원되는지를 확인하였다.

방법: C57BL6마우스(8∼10주령, 수컷) 꼬리정맥으로부터 재조합 HMGB1단백/생리식염수(100㎍/㎖)를 400㎕(40㎍HMGB1) 혹은 생리식염수 400㎕ 투여하였다. 12시간후에 마우스 말초혈을 채취하고 PBS를 가하여 4mL로 희석하였다. 원심관에 Ficoll-Paque Plus(GE)액을 3mL 삽입 후 그 위에 희석 혈액을 중층하였다. 400G(18℃)에서 40분간 원심분리하고 단핵구를 포함한 중간층을 새로운 원심관에 회수하고 45mL의 PBS를 가하고 800G(18℃)에서 5분간 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 또 다시 한번 45mL의 PBS를 가하고 800G(18℃)에서 5분간 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 얻어진 단핵구를 Phycoerythrobilin(PE)표식 항마우스PDGFRα항체 및 Fluorescein isothiocyanate(FITC)표식 항마우스CD44항체로 반응시킨 후 유세포 분석기(Facscan; Becton, Dickinson and Company)에 의해 단핵구 분획내의 PDGFRα양성/CD44양성 세포의 존재 빈도를 평가하였다.

결과: HMGB1투여 12시간후에 말초혈 단핵구 분획내의 PDGFRα양성이면서 CD44양성 세포 및 PDGFRα양성이면서 CD44음성 세포가 유의적으로 증가하고 있다는 것이 명백해졌다(도 14). 즉, HMGB1은 골수내로부터 말초혈중에, 중간엽 줄기세포의 마커로서 알려져 있는 PDGFRα양성 세포를 동원하는 활성이 있는 것으로 나타났다.

고찰: PDGFRα 및 CD44는 골수 유래 다능성 줄기세포를 대표하는 골수 중간엽 줄기세포의 표면 마커로서 알려져 있다. 골수 중간엽 줄기세포는 골세포, 연골세포, 지방세포로 분화 가능한 다능성 줄기세포이며, 또한, 신경세포나 상피세포 등으로도 분화 가능하다. 또한, 본 실험에서 사용한 피부조각은 조혈(阻血)상태이므로 서서히 조직이 괴사 상태가 되어 세포 표면의 단백질 내지 핵 등 세포내의 단백질이 주위로 방출된다. 또한, HMGB1은 피부 추출액에 함유되는 단백질이다. 이식피부 등에서는 이들 단백질이 신호가 되어 이식피부조각에 골수 유래의 조직 줄기세포를 동원하고, 이식피부조각 안에서 골수세포 유래 표피, 피하조직, 모포(毛包)조직 등을 재구축하여 기능적 피부를 재생한다고 생각된다. 본 실험은 이와 같은 피부 추출액 또는 HMGB1을 정맥내에 투여함으로써 말초 순환중에 골수 유래 조직 줄기세포를 동원하는 데 성공한 최초의 발견이다. 본 발견에 의해 골수 유래 다능성 줄기세포를 말초혈중에 동원하여 뇌경색이나 심근경색, 골절, 피부궤양 등의 조직 손상을 동반한 난치성 질환에 대한 신규 치료법이 가능해진다. 또한, 말초혈중에 동원한 세포는 통상의 채혈과 마찬가지로 채취가 가능하여 지금까지 뇌경색 치료를 위해서 골수로부터 채취해온 종래의 방법에 비해 간편하고 안전한 골수 유래 조직 줄기세포의 채취 방법이 가능해졌다.

[참고예 1]

목적: 피부 추출액 중 HMGB1패밀리의 동정과 골수 중간엽 줄기세포 유도활성의 검토

방법: 신생 마우스 피부 추출액 중에 포함되는 HMGB단백질 패밀리의 유무를 Western blot법을 이용하여 확인하였다. 샘플로서 신생 마우스 400마리에서 얻은 유리 피부조각을 생리적 인산 완충액 pH7.4(PBS) 400㎖내에 침지하고 4℃에서 24시간 인큐베이션한 후 조직을 제거하기 위해 4℃의 조건하에서 10분간 440G로 원심분리하여 상청액을 회수하여 얻어진 피부 추출액 10㎕을 SDS-PAGE법을 이용하여 전기영동하고, 겔 중에서 분리된 단백질을 블로팅 장치(ATTO)를 이용하여 PVDF막으로 통과시켰다. 3% 탈지유 및 0.1% Tween 20 함유 PBS(S-T-PBS)로 실온에서 1 시간 배양한 후, S-T-PBS로 1000배로 희석한 토끼 항마우스 HMGB1 항체, 토끼 항마우스 HMGB2항체, 토끼 항마우스 HMGB3항체를 각각 4℃에서 16시간 반응시켰다. 반응 후, 동 PVDF막을 S-T-PBS로 5분간 5회 세정 후, S-T-PBS로 2000배 희석한 퍼옥시다아제 표식 염소 항토끼 IgG항체(GE Healthcare)에서 동 PVDF막을 25℃에서 1시간 배양하였다. 또한 S-T-PBS로 5분간 5회 세정 후 ECL Western Blotting Detection System(GE Healthcare)을 동 PVDF막과 반응시키고, ECL 필름을 감광시킨 후 현상하여 HMGB1, HMGB2, HMGB3 단백질의 존재를 검출하였다.

신생 마우스 피부로부터 Trizol(invitrogen)을 이용하여 RNA를 추출하고, 또한, SuperScript Ⅲ cDNA 합성 키트(Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 주형으로 하여 HMGB1, HMGB2 및 HMGB3의 cDNA를 PCR(폴리메라아제 연쇄반응)법을 이용하여 증폭하고, 아미노산 서열의 N말단에 Flag tag의 서열(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys; 서열번호: 18)을 부가한 단백질을 발현하도록 포유류 세포에서 단백질을 발현시키는 플라스미드 벡터 pCAGGS에 삽입하였다. 이들의 플라스미드 벡터를 HEK293(인간 태아 신세포 유래 배양 세포주)에 유전자 도입하고 48시간 배양하여 단백질을 발현시켰다. HMGB1, HMGB2 및 HMGB3 단백질을 각각 발현시킨 세포 및 배양 상청액은 4℃에서 16시간 배양한 후, 4400g·5분간 원심분리하여 상청액을 회수하였다. 이 상청액 50mL당 100μL의 항 Flag항체 겔(Sigma)을 혼합하여 4℃에서 16시간 배양하였다. 원심분리하여 Gel을 회수한 후 PBS를 이용하여 5회 세정하였다. 또, 3X Flag 펩티드(최종 100㎍/㎖)를 이용하여 용출하였다. 재조합 단백질의 발현을 S-T-PBS로 1000배 희석한 마우스 항Flag항체 및 S-T-PBS로 2000배 희석한 퍼옥시다아제 표식 항마우스 IgG항체(GE Healthcare)를 이용한 Western blot법으로 확인하였다. 이들의 정제 재조합 단백질의 마우스 골수 중간엽 줄기세포의 유주 활성을 보이덴 챔버를 이용하여 평가하였다. 또한, HMGB 패밀리의 in vivo에서의 약효를 관찰하기 위해, 8주령 C57BL/6 마우스의 등 피부를 직경 8㎛의 원형으로 절제하여 피부궤양모델을 제작하고, 거기에 정제한 HMGB1·HMGB2·HMGB3 각각(100ng/μL)을 1g/100mL PBS의 농도의 히알루론산 용액과 같은 양씩 혼합하고 그 중에서 100μL을 궤양면에 투여하였다. 궤양면은 건조하지 않도록 점착성 투명 창상피복·보호재 Tegaderm(3M Healthcare)으로 덮고 경시적으로 창상면적을 계측하여 치유효과를 측정하였다.

또한 인간 골수 중간엽 줄기세포를 인간 피부 추출액 및 인간 정제 HMGB1이 유주하는 활성이 있는지를 조사하기 위해, 보이덴 챔버를 이용하여 평가하였다. 면적 1㎠의 인간 피부를 1㎖의 PBS에 침지하고 4℃의 조건하에서 16시간 배양한 후, 4℃의 조건하에서 10분간 440G로 원심분리하였다. 상청액만을 회수하여 인간 피부 추출액으로서 사용하였다. 또한, 보이덴 챔버의 상부에 넣는 세포는 인간 골수 중간엽 줄기세포(Cambrex사)를 이용하였다.(본 세포는 유세포 분석기에 의한 세포표면 항원의 분석결과, CD105양성, CD166양성, CD29양성, CD44양성, CD34음성, CD45음성으로 되어 있다. 또, 분화유도시험에 의해 지방세포, 연골세포, 골세포로의 분화가 양성이다.) 또한 챔버 하부에는 인간 HMGB1을 100ng/웰(R&D사) 및 PBS로 10배 희석한 인간 피부 추출액을 넣고, 대조군으로서 PBS를 이용하였다.

결과: Western blot의 결과, HMGB1의 밴드 이외에 HMGB2나 HMGB3의 밴드가 검출되었다. 따라서, 신생 마우스 피부 추출액 중에는 HMGB1 이외에 패밀리 단백질인 HMGB2 및 HMGB3이 함유되어 있는 것이 확인되었다(도 6). 각각의 단백질의 N말단에 Flag tag를 부가한 HMGB1·HMGB2·HMGB3의 발현 벡터를 제작하였다(도 1). HEK293세포에 발현 벡터를 유전자 도입하고, 발현한 단백질을 플래그 태그(Flag tag)를 이용하여 정제한 후, Western blot법을 이용하여 단백질을 확인하였다(도 7). 이들의 정제 단백질을 이용하여 마우스 골수 중간엽 줄기세포의 유주 활성을 측정한 바 모든 단백질에서 활성이 확인되었다(도 8). 마우스의 등부분에 제작한 궤양 면적을 7일마다 계측한 바, 비치료군에 비해 HMGB1, 2 및 3에 의한 치료군쪽이 유의적으로 궤양 면적의 축소 효과를 확인할 수 있었다(도 9). 마우스의 경우와 같이, 인간 HMGB1 및 인간 피부 추출액은 인간 골수 중간엽 줄기세포를 유주하는 활성이 있다는 것이 명백해졌다(도 10).

고찰: HMGB1과 상동성이 높은 단백질로서 HMGB2 및 HMGB3가 알려져 있다. 이들의 단백질도 HMGB1과 같은 성질을 가지는 것이 기대된다. 그래서, 유리된 피부 조각 추출액으로부터 HMGB1의 패밀리인 HMGB2 및 HMGB3도 생산되는 것을 확인하였다. 또, HMGB1·HMGB2·HMGB3의 재조합 단백질을 제작하여 in vitro에서의 골수 중간엽 줄기세포 유주 활성을 확인하고, in vivo에서의 피부궤양 치료효과도 확인하였다. 신생 마우스의 유리된 피부 조각 중의 HMGB패밀리(HMGB1·HMGB2·HMGB3) 및 재조합 HMGB 패밀리에는 골수 중간엽 줄기세포 유도활성이나 골수 유래의 상피계로 분화 가능한 줄기세포를 국소로 유도하는 활성이 있고, 또한, 이들의 유도된 골수 유래의 세포군이 손상 조직에 있어서 표피 각질세포나 모낭이나 섬유아세포와 같은 여러가지 세포로 분화하여 손상 조직의 치유를 촉진하는 효과가 있는 것이 명백해졌다. 또한, 골수 중간엽 줄기세포는 다능성 줄기세포이므로, 다른 조직손상상태, 예를 들어 뇌손상, 심근경색, 골절 등의 조직손상의 치료에 HMGB 패밀리를 전신투여 또는 국소투여함으로써 마찬가지로 치료효과를 기대할 수 있다고 확신한다.

또한, 인간과 마우스의 HMGB1은 각각을 구성하는 아미노산 서열에서 98%(213/215)의 상동성이 있고, HMGB2는 각각을 구성하는 아미노산 서열에서 96%(202/210)의 상동성이 있으며, HMGB3은 각각을 구성하는 아미노산 서열에서 97%(195/200)의 상동성이 있음을 알고 있다. 그래서, 인간의 HMGB가 마우스의 HMGB와 동일한 활성을 갖는다고 생각되는데, 본 결과로부터, 인간의 피부 추출액이나 HMGB1이 마우스의 피부 추출액이나 HMGB1과 동일하게 골수 중간엽 줄기세포를 유도하는 활성이 있음이 명백해졌다.

[참고예 2]

목적: 골수 중간엽 줄기세포 유도인자 조직 추출액의 제작방법의 확립

방법: 6주령 C57BL6 1 마리의 뇌, 심장, 장, 신장, 간장 및 신생 마우스 피부 1 마리분을 생리적 인산 완충액 pH7.4(PBS) 1㎖ 내에 침지하고 4℃에서 24시간 배양한 후 조직을 제거하기 위해서 4℃의 조건하에서 10분간, 440G에서 원심분리하여 상청을 회수하여 조직 추출액으로 하였다. 얻어진 추출액 중에 골수 중간엽 줄기세포 유도활성이 존재하는 것을 확인하기 위해 보이덴 챔버를 이용하여 골수 유래 중간엽 줄기세포에 대한 유주 활성을 검토하였다. 또한, 동일한 샘플 중에 포함되는 HMGB1의 농도를 HMGB1 ELISA kit(시노테스트)를 이용하여 측정하였다. 또한, 뇌, 심장 및 피부의 조직 추출액을 헤파린 친화성 칼럼에 결합시키고, 결합 분획의 단백질의 골수 중간엽 줄기세포 유도활성을 보이덴 챔버를 이용하여 확인하였다.

결과: 마우스 뇌 추출액에는 신생 마우스 피부 추출액과 동등한 HMGB1이 함유되어 있었다. 또, 골수 중간엽 줄기세포의 유도활성은 마우스 뇌에서도 피부와 동일하게 인정되었다. 마우스 장 추출액과 마우스 심장 추출액 중에 HMGB1은 거의 포함되어 있지 않았지만, 골수 중간엽 줄기세포의 유도활성은 인정되었다. 또한 마우스 뇌, 마우스 심장의 헤파린 칼럼 결합 분획은 마우스 피부의 헤파린 칼럼 결합 분획과 같이 골수 중간엽 줄기세포를 유도하는 활성이 있었다(도 11). 표 1은 마우스 각 조직 추출액의 HMGB1 농도와 골수 중간엽 줄기세포의 유도활성을 측정한 결과를 나타낸다.

	HMGB1 농도(ng/mL)	골수 중간엽 줄기세포 유도활성
피부	110	있음
뇌	140	있음
심장	4	있음
장	0	있음
신장	115	ND
간장	61	ND

ND:시행하지 않음

고찰: 피부뿐만 아니라 뇌에서도 장기를 생리적 완충액에 침지할 뿐인 간편한 방법으로 HMGB1을 간편하게 추출하는 방법을 개발하였다. 이 방법은, 다른 장기, 예를 들어 간장이나 신장에서도 동일하다. 또한 심장이나 장으로부터의 추출액에는 HMGB1을 거의 함유하지 않음에도 불구하고 골수 중간엽 줄기세포 유도활성이 인정되었다. 이는 추출액 중에 HMGB1과 다른 별개의 골수 중간엽 줄기세포 유도물질이 포함되어 있는 것으로 생각할 수 있다. 이들의 추출액에 포함되는 물질은 원래 각각의 조직에 존재하는 것이고, 생리적으로는 조직 손상시에 골수 중간엽 줄기세포를 손상 조직으로 유도하고 있다고 생각된다. 본 발명에 의해 HMGB1을 포함하는 복수의 골수 중간엽 줄기세포 유도물질을 각종 장기로부터 기능적이고 간편하게 추출하는 신규의 방법을 개발할 수 있었다. 또, 조직 추출액으로부터 골수 중간엽 줄기세포 유도물질을 정제하기 위해 헤파린 칼럼에 결합시키는 방법을 개발하였다. 또한 이들의 골수 중간엽 줄기세포 유도활성을 가지는 성분은 피부와 같은 방법으로 뇌나 심장으로부터도 헤파린 칼럼을 이용하여 정제할 수 있다.

[참고예 3]

목적: 배양세포로부터 중간엽 줄기세포 유주 활성 물질을 추출하는 방법을 확립한다.

방법: 인간 태아 신장 유래 배양 세포주 HEK293 및 인간 자궁경부암 세포주 HeLa는 각각 10% 우태아혈청 함유 D-MEM(nacalai사 제품)으로 배양하였다. 각각의 세포를 PBS로 세정 후, 세포 10⁷개를 4℃의 5㎖의 PBS(nacalai사 제품)에 16시간 침지하였다. 중력 가속도 440G로 4℃에서 5분간 원심분리하여 상청액을 회수하였다. 보이덴 챔버의 상층에 인간 골수 중간엽 줄기세포를 넣고 하층에 DMEM으로 5배 희석한 세포 추출액을 넣어 인간 골수 중간엽 줄기세포 유주 활성을 확인하였다.

결과: HEK293 추출액도 HeLa 추출액도 모두 골수 중간엽 줄기세포를 유주하는 활성을 나타내었다(도 12).

고찰: 배양세포를 PBS에 침지하는 간편한 방법으로 골수 중간엽 줄기세포를 유주하는 활성물질을 추출하는 데 성공하였다.

[참고예 4]

목적: 마우스 뇌 결손 모델을 제조하여 국소 손상부위에 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획을 서방화(徐放化)하여 투여시 자기의 골수계에 포함되는 줄기세포를 국소 손상부위에 유주시킴으로써 신경계세포의 재생을 유도할 수 없는지 검토한다.

방법:

(1)피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획의 제작

절제한 신생 마우스 피부로부터 PBS(1마리/㎖) 중에 4℃에서 16 시간 배양하여 추출한 피부 추출액을 4℃의 9배 용적 20mM 인산 버퍼 pH7.5를 이용하여 10배로 희석하였다. 미리 20mM 인산 완충용액 pH7.5(30㎖)를 HiTrap Hepalin HP column(칼럼 용량: 5㎖, GE Healthcare) 중에 흘려서 칼럼을 평형화하였다. 또한, 희석액을 칼럼에 결합시켰다. 그 후, 20mM 인산 완충용액 pH7.5, 100mM NaCl(30㎖)로 칼럼을 세정하였다. 흡착된 단백질을 용출하기 위해 20mM 인산 버퍼 pH7.5, 1000mM NaCl을 칼럼 내에 유입하고 용출액을 튜브에 분획화하였다. 흡착 분획에 대해 각각 마우스 골수 유래 세포주의 유주 활성을 보이덴 챔버법을 이용하여 평가하여 유주능력을 가진 분획을 모았다. 이 활성을 가진 용액을 피부 추출액 헤파린 정제 분획으로서 하기 참고예에 사용하였다.

(2)골수 억제 마우스의 제조

마우스에 10Gy의 X선 단회조사를 하여 골수 억제 마우스를 제조하였다.

(3)골수 억제 마우스로의 GFP 마우스 골수 이식

GFP마우스의 양측 대퇴골 및 하퇴골에서 골수세포를 채취하였다. 이를 조사 후 24시간 경과한 골수 억제 마우스의 꼬리정맥을 통해 투여하였다. 또한, 투여는 이소플루란에 의한 흡입 마취하에 시행하였다.

(4)마우스 뇌 손상(뇌조직 결손) 모델의 작성

GFP 마우스의 골수세포를 이식한 골수 억제 마우스를 이소플루란으로 흡입마취하고 펜토바르비탈(45mg/㎏)을 복강 내에 주입하였다. 마우스를 뇌정위 고정장치에 고정시키고 메스로 머리부에 정중앙 절개를 가하였다. 정수리점(bregma)으로부터 우외측 2.5㎜, 전방 1㎜에 드릴을 이용하여 천두를 실시하였다(도 13A). 이 부위로부터 깊이 3㎜의 위치를 끝단으로 하여 20G 서플로우(Surflow) 침의 외통을 삽입하여 고정하였다. 여기에 주사기를 이용하여 음압을 가하여 뇌조직을 일부 흡인하였다(도 13B).

(5)피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획의 뇌조직 결손부로의 투여

상술한 위치에 해밀턴 주사기와 26G 주사기를 이용하여 피브린 접착제(피브리노겐)(Bolheal(Kaketsuken))에 용해한 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획을 5㎕ 주입하고, 다음에 피브린 접착제(트롬빈)(Bolheal(Kaketsuken))를 5㎕ 주입하였다(도 13C). 이 조작은 피부 추출액에 헤파린 칼럼 정제 분획의 서방제로서의 효과를 위한 것이다.

(6)뇌조직 결손부에서의 신경계세포 재생효과의 평가

대조군과 치료군의 마우스를 이용하여 평가하였다. 적절한 경과설정을 정하고(경시적으로) 마우스를 4% 파라포름알데히드로 관류 고정시킨 후 뇌 절취를 수행하였다. 또, 4% 파라포름알데히드를 외부 고정하였다. 15%와 30% 경사의 수크로오스로 탈수하여 동결 절편을 얻었다.

DAPI(4',6-Diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) 용액으로 핵을 염색하고 광표백 방지제를 이용하여 봉입하였다. 공초점 레이저 현미경으로 손상부위(뇌조직 결손부)에서의 GFP 양성세포의 집적을 평가하였다.

결과: 투여 후 2주일 및 6주일 후의 GFP 양성세포 집적을 정성적으로 나타내었다. 2주일 후(대조군; 도 13D, 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획; 도 13E) 및 6주일 후(대조군; 도 13F, 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획; 도 13G) 모두 대조군에 비해 치료군의 손상부위에 GFP 양성세포의 집적이 높은 경향이 있었다.

고찰: 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획 투여에 의해 골수 유래 세포가 뇌조직 결손부위에 집적하여 신경세포의 형태를 나타내었다. 골수 유래 중간엽 줄기세포는 신경세포로도 분화하는 것이 알려져 있고, 본 결과로부터, 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획에 의해 뇌손상부위에서의 신경계세포의 재생을 유도할 수 있는 것이 명백해졌다. 또한 이는 뇌허혈성 질환이나 뇌타박상에서의 뇌조직 장해부위에서의 신경재생에도 응용 가능하다.

본 발명은 뇌경색이나 심근경색, 골절, 피부궤양 등의 조직 손상을 동반하는 난치성 질환에 대한 신규 치료법을 제공하는 것이다. 또한, 말초혈중에 동원한 세포는 통상의 채혈과 마찬가지로 채취가 가능하기 때문에 본 발명은 지금까지 뇌경색 치료를 위해 골수로부터 채취해온 종래의 방법에 비해 간편하고 안전한 골수 유래 조직 줄기세포의 채취 방법을 가능하게 하는 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> GENOMIX CO., LTD. OSAKA UNIVERSITY <120> Agent for recruitment of bone-marrow-derived pluripotent stem cell into peripheral circulation <130> G6-A0801P <150> JP 2008-119348 <151> 2008-04-30 <160> 18 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 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gaggaagatg aagaggatga ggaggaggag 600 gaagatgaag aagatgaaga tgaagaagaa gatgatgatg atgaataa 648 <210> 3 <211> 215 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val 165 170 175 Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu 180 185 190 Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu 195 200 205 Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu 210 215 <210> 4 <211> 648 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 atgggcaaag gagatcctaa aaagccgaga ggcaaaatgt cctcatatgc attctttgtg 60 caaacttgcc gggaggagca caagaagaag cacccggatg cttctgtcaa cttctcagag 120 ttctccaaga agtgctcaga gaggtggaag accatgtctg ctaaagaaaa ggggaaattt 180 gaagatatgg caaaggctga caaggctcgt tatgaaagag aaatgaaaac ctacatcccc 240 cccaaagggg agaccaaaaa gaagttcaag gaccccaatg cacccaagag gcctccttcg 300 gccttcttct tgttctgttc tgagtaccgc cccaaaatca aaggcgagca tcctggctta 360 tccattggtg atgttgcaaa gaaactagga gagatgtgga acaacactgc agcagatgac 420 aagcagccct atgagaagaa agctgccaag ctgaaggaga agtatgagaa ggatattgct 480 gcctacagag ctaaaggaaa acctgatgca gcgaaaaagg gggtggtcaa ggctgaaaag 540 agcaagaaaa agaaggaaga ggaagatgat gaggaggatg aagaggatga ggaagaggag 600 gaagaagagg aagacgaaga tgaagaagaa gatgatgatg atgaataa 648 <210> 5 <211> 215 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 5 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val 165 170 175 Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu 180 185 190 Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu 195 200 205 Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu 210 215 <210> 6 <211> 648 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 6 atgggcaaag gagatcctaa gaagccgaga ggcaaaatgt cctcatatgc attctttgtg 60 caaacctgcc gggaggagca caagaagaag cacccggatg cttctgtcaa cttctcagag 120 ttctccaaga agtgctcaga gaggtggaag accatgtctg ctaaagaaaa ggggaaattt 180 gaagatatgg caaaggctga caaggctcgt tatgaaagag aaatgaaaac ctacatcccc 240 cccaaagggg agaccaaaaa gaagttcaag gaccccaatg cccccaagag gcctccttcg 300 gccttcttct tgttctgttc tgagtaccgc ccaaaaatca aaggcgagca tcctggctta 360 tccattggtg atgttgcgaa gaaactagga gagatgtgga acaacactgc tgcggatgac 420 aagcagccct atgaaaagaa ggccgccaag ctgaaggaga agtatgagaa ggatattgct 480 gcctacagag ctaaaggaaa acctgatgca gcgaaaaagg gggtggtcaa ggctgagaag 540 agcaagaaaa agaaggaaga ggaagacgac gaggaggatg aagaggatga ggaagaggag 600 gaagaggagg aagacgaaga tgaagaagaa gatgatgatg atgaataa 648 <210> 7 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Gly Lys Gly Asp Pro Asn Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ser Ser Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Ser Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ser Asp Lys Ala Arg Tyr Asp Arg Glu Met Lys Asn Tyr Val Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Asp Lys Lys Gly Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu His Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Ser Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Thr Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Ser Glu Gln Ser Ala Lys Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Gln Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Ser Glu Ala Gly Lys Lys Gly Pro Gly 165 170 175 Arg Pro Thr Gly Ser Lys Lys Lys Asn Glu Pro Glu Asp Glu Glu Glu 180 185 190 Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu 195 200 205 Glu <210> 8 <211> 630 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 atgggtaaag gagaccccaa caagccgcgg ggcaaaatgt cctcgtacgc cttcttcgtg 60 cagacctgcc gggaagagca caagaagaaa cacccggact cttccgtcaa tttcgcggaa 120 ttctccaaga agtgttcgga gagatggaag accatgtctg caaaggagaa gtcgaagttt 180 gaagatatgg caaaaagtga caaagctcgc tatgacaggg agatgaaaaa ttacgttcct 240 cccaaaggtg ataagaaggg gaagaaaaag gaccccaatg ctcctaaaag gccaccatct 300 gccttcttcc tgttttgctc tgaacatcgc ccaaagatca aaagtgaaca ccctggccta 360 tccattgggg atactgcaaa gaaattgggt gaaatgtggt ctgagcagtc agccaaagat 420 aaacaaccat atgaacagaa agcagctaag ctaaaggaga aatatgaaaa ggatattgct 480 gcatatcgtg ccaagggcaa aagtgaagca ggaaagaagg gccctggcag gccaacaggc 540 tcaaagaaga agaacgaacc agaagatgag gaggaggagg aggaagaaga agatgaagat 600 gaggaggaag aggatgaaga tgaagaataa 630 <210> 9 <211> 210 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Met Gly Lys Gly Asp Pro Asn Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ser Ser Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Ser Lys Phe Glu Asp Leu Ala 50 55 60 Lys Ser Asp Lys Ala Arg Tyr Asp Arg Glu Met Lys Asn Tyr Val Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Asp Lys Lys Gly Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Asn Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Ile Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Thr Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Ser Glu Gln Ser Ala Lys Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Gln Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Ser Glu Ala Gly Lys Lys Gly Pro Gly 165 170 175 Arg Pro Thr Gly Ser Lys Lys Lys Asn Glu Pro Glu Asp Glu Glu Glu 180 185 190 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp 195 200 205 Glu Glu 210 <210> 10 <211> 633 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 atgggcaagg gtgaccccaa caagccgcgg ggcaaaatgt cctcgtacgc cttcttcgtg 60 cagacctgcc gcgaggagca caagaagaag catcccgact cgtcggtgaa cttcgccgag 120 ttctccaaga aatgctccga gagatggaag accatgtctg caaaggaaaa gtccaagttt 180 gaagatttgg ccaagagcga caaagctcgt tatgacaggg agatgaagaa ctatgttcct 240 cccaaagggg ataagaaagg aaagaaaaaa gaccccaatg ctccgaagag accaccgtct 300 gccttcttcc tgttttgctc tgaaaatcgc ccaaagatca aaattgaaca cccaggcctg 360 tctattggag atactgcgaa gaaactgggt gagatgtggt ctgagcaatc tgccaaagat 420 aaacaaccgt atgagcagaa agcagctaaa ctaaaggaga agtatgaaaa ggatattgct 480 gcataccgtg ccaagggcaa aagtgaagca ggaaagaagg gtcctggtag gccaacaggc 540 tcaaagaaga agaacgaacc agaagatgag gaggaggaag aagaggagga agaggaggaa 600 gatgacgagg aagaagagga ggatgaagaa taa 633 <210> 11 <211> 210 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 11 Met Gly Lys Gly Asp Pro Asn Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ser Ser Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Ser Lys Phe Glu Asp Leu Ala 50 55 60 Lys Ser Asp Lys Ala Arg Tyr Asp Arg Glu Met Lys Asn Tyr Val Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Asp Lys Lys Gly Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu His Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Ser Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Thr Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Ser Glu Gln Ser Ala Lys Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Gln Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Ser Glu Val Gly Lys Lys Gly Pro Gly 165 170 175 Arg Pro Thr Gly Ser Lys Lys Lys Asn Glu Pro Glu Asp Glu Glu Glu 180 185 190 Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp 195 200 205 Glu Glu 210 <210> 12 <211> 633 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 12 atgggcaagg gggaccccaa caagccgcgg ggcaagatgt cctcgtacgc cttcttcgtg 60 cagacctgcc gggaggagca caagaagaag catcccgact cgtcggtcaa cttcgccgag 120 ttctcgaaga aatgttcgga gagatggaag accatgtctg ccaaggaaaa gtcgaagttt 180 gaggatttgg ccaagagcga caaagctcgt tatgacaggg agatgaagaa ctatgttcct 240 cccaaaggtg ataagaaagg aaagaaaaaa gatccaaatg ctcccaagag accaccgtct 300 gccttcttcc tgttttgctc tgaacatcgc ccaaagatca aaagtgaaca ccccggcctg 360 tctattggag atactgcaaa gaaactgggg gagatgtggt ctgagcaatc tgccaaagat 420 aaacaaccgt atgagcagaa agcagctaaa ctaaaggaga agtatgaaaa ggatattgct 480 gcataccgtg ccaagggcaa aagtgaagta ggaaagaagg gtcctggtag gccaacaggc 540 tcaaagaaga agaatgaacc agaagatgag gaagaggagg aggaggaaga agatgatgaa 600 gatgaagagg aggaagatga ggatgaagaa taa 633 <210> 13 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Ala Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Lys Gly Lys Met Ser Ala Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys Asn Pro 20 25 30 Glu Val Pro Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Gly Lys Glu Lys Ser Lys Phe Asp Glu Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Val Arg Tyr Asp Arg Glu Met Lys Asp Tyr Gly Pro 65 70 75 80 Ala Lys Gly Gly Lys Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro 85 90 95 Pro Ser Gly Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Phe Arg Pro Lys Ile Lys 100 105 110 Ser Thr Asn Pro Gly Ile Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly 115 120 125 Glu Met Trp Asn Asn Leu Asn Asp Ser Glu Lys Gln Pro Tyr Ile Thr 130 135 140 Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Val Ala Asp Tyr 145 150 155 160 Lys Ser Lys Gly Lys Phe Asp Gly Ala Lys Gly Pro Ala Lys Val Ala 165 170 175 Arg Lys Lys Val Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 180 185 190 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu 195 200 <210> 14 <211> 603 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 atggctaaag gtgaccccaa gaaaccaaag ggcaagatgt ccgcttatgc cttctttgtg 60 cagacatgca gagaagaaca taagaagaaa aacccagagg tccctgtcaa ttttgcggaa 120 ttttccaaga agtgctctga gaggtggaag acgatgtccg ggaaagagaa atctaaattt 180 gatgaaatgg caaaggcaga taaagtgcgc tatgatcggg aaatgaagga ttatggacca 240 gctaagggag gcaagaagaa gaaggatcct aatgctccca aaaggccacc gtctggattc 300 ttcctgttct gttcagaatt ccgccccaag atcaaatcca caaaccccgg catctctatt 360 ggagacgtgg caaaaaagct gggtgagatg tggaataatt taaatgacag tgaaaagcag 420 ccttacatca ctaaggcggc aaagctgaag gagaagtatg agaaggatgt tgctgactat 480 aagtcgaaag gaaagtttga tggtgcaaag ggtcctgcta aagttgcccg gaaaaaggtg 540 gaagaggaag atgaagaaga ggaggaggaa gaagaggagg aggaggagga ggaggatgaa 600 taa 603 <210> 15 <211> 200 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Met Ala Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Lys Gly Lys Met Ser Ala Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys Asn Pro 20 25 30 Glu Val Pro Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ser Lys Glu Lys Ser Lys Phe Asp Glu Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Val Arg Tyr Asp Arg Glu Met Lys Asp Tyr Gly Pro 65 70 75 80 Ala Lys Gly Gly Lys Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro 85 90 95 Pro Ser Gly Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Phe Arg Pro Lys Ile Lys 100 105 110 Ser Thr Asn Pro Gly Ile Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly 115 120 125 Glu Met Trp Asn Asn Leu Ser Asp Asn Glu Lys Gln Pro Tyr Val Thr 130 135 140 Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Val Ala Asp Tyr 145 150 155 160 Lys Ser Lys Gly Lys Phe Asp Gly Ala Lys Gly Pro Ala Lys Val Ala 165 170 175 Arg Lys Lys Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 180 185 190 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu 195 200 <210> 16 <211> 603 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 16 atggctaaag gtgaccccaa gaaaccaaag ggcaagatgt ctgcttatgc cttctttgtg 60 cagacatgca gggaagaaca taagaagaaa aacccagagg ttcccgtcaa ttttgctgag 120 ttctccaaga agtgctcgga gaggtggaag accatgtcta gcaaagagaa atcaaagttt 180 gatgaaatgg caaaggcaga taaagtccga tatgatcggg agatgaaaga ttatggacca 240 gctaaaggag gcaagaagaa gaaggaccca aatgccccca aaagacctcc gtctggattt 300 ttcttattct gctctgaatt ccgccccaag atcaaatcca caaaccctgg catctccatt 360 ggagatgtgg caaaaaagct gggtgagatg tggaataact taagtgacaa tgaaaagcag 420 ccttatgtca ccaaggcagc aaagctgaag gagaagtatg agaaggatgt tgctgactat 480 aagtctaaag ggaagtttga tggtgccaag ggtcctgcta aagttgcccg gaaaaaggtg 540 gaagaagagg aagaggagga ggaagaggaa gaagaggagg aggaagagga ggaagatgaa 600 taa 603 <210> 17 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 17 atgcagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctgt gggttccagg ttccactggt 60 gac 63 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 18 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Lys 1 5

Claims

하기 (a) 내지 (i) 중 어느 하나에 기재된 성분을 함유하고 혈관 또는 근육에 투여되는, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하기 위해 사용하는 약제;
(a)HMGB1 단백질
(b)HMGB1 단백질을 분비하는 세포
(c)HMGB1 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
(d)HMGB2 단백질
(e)HMGB2 단백질을 분비하는 세포
(f)HMGB2 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
(g)HMGB3 단백질
(h)HMGB3 단백질을 분비하는 세포
(i)HMGB3 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터.
세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정을 포함하는 방법으로 제조되는 세포 또는 조직 추출액을 함유하고 혈관 또는 근육에 투여되는, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하기 위해 사용하는 약제.
하기 공정을 포함한 방법으로 제조되는 헤파린 결합 분획을 함유하고 혈관 또는 근육에 투여되는, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하기 위해 사용하는 약제;
(a)세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정,
(b)공정(a)에서 얻어지는 추출액을 고정화 헤파린에 접촉시키는 공정 및,
(c)고정화 헤파린에서 헤파린 결합 분획을 용출하는 공정.
하기 공정을 포함한, 세포 또는 조직 추출액에 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자가 포함되는지 여부를 평가하는 방법으로서, 공정(b)에서의 골수세포의 골수로부터 말초혈로의 동원 활성이 대조군과 비교하여 높은 경우에 세포 또는 조직 추출액에 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자가 포함된다고 판정되는 방법;
(a)세포 또는 조직 추출액을 제조하는 공정 및,
(b)공정(a)에서 제조된 추출액에 의한 골수세포의 골수로부터 말초혈로의 동원 활성을 측정하는 공정.
하기 공정을 포함한, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자가 포함되는 세포 또는 조직 추출액을 스크리닝하는 방법;
(a) 복수의 추출액에 대해서 제4항에 기재된 방법으로 해당 추출액에 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자가 포함되는지 여부를 평가하는 공정 및,
(b)공정(a)에서 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자가 포함된다고 평가된 추출액을 선택하는 공정.
제4항 또는 제5항에 기재된 방법에 의해 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자를 포함한다고 판정된 추출액으로부터, 골수세포의 골수로부터 말초혈로의 동원 활성을 지표로 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자를 정제하는 공정을 포함하는, 골수세포를 골수로부터 말초혈로 동원하는 인자의 동정 방법.