KR20100138227A

KR20100138227A - 구강 건강 유지 및 개선용 조성물

Info

Publication number: KR20100138227A
Application number: KR1020090056654A
Authority: KR
Inventors: 신현철; 황혜정; 이행우; 김성호; 박용주; 천현철
Original assignee: 라이브켐 주식회사
Priority date: 2009-06-24
Filing date: 2009-06-24
Publication date: 2010-12-31
Also published as: JP5457554B2; JP2012531404A; KR101144221B1; WO2010150944A1

Abstract

본 발명은 디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 유효성분으로 포함하는 구강 건강 유지 및 개선용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 치아의 부식, 치석 형성, 입냄새 생성 및 잇몸 질환을 일으키는 주요 원인인 바이오필름의 생성 억제 및 제거 효과가 탁월하여 구강 및 치아의 상태를 장시간 상쾌하고 청결하게 유지할 수 있게 한다. 또한, 충치 및 잇몸 질환을 예방 및 개선함으로써 구강 건강을 효과적으로 유지하고 개선시키는 효과를 제공한다.

구강, 디벤조-p-디옥신, 바이오필름, 입냄새, 치주염

Description

구강 건강 유지 및 개선용 조성물{Composition for the management and improvement of oral health}

본 발명은 구강 건강 유지 및 개선용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 미생물 바이오필름 형성 억제 및 제거 효과가 우수하여 구강 건강을 효과적으로 유지하고 개선할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

구강의 건강 혹은 정상적인 기능과 상태는 모든 인류의 일상 생활에 매우 소중한 것으로서, 이상 발생시 삶의 질을 심각히 저해시킨다. 구강의 건강 요소와 관련하여 가장 커다란 영향을 끼치는 요소는 치아의 부식 또는 충치, 잇몸 질환 혹은 치주질환, 그리고 불쾌한 입냄새의 발생 이라고 할 수 있으며, 그 근본 원인은 구강에 서식하는 병원균들에 의해 형성되는 바이오필름이다(Allaker 2008). 이들 병원균들도 구강 표면에 부착되지 않은 상태에서는 타액 등의 용액 상태로 존재하다가 양치질이나 음료섭취와 함께 쉽게 제거될 수 있어, 구강에 질환을 일으킬 기회가 매우 적다. 그러나 이들 병원균들은 효과적인 생존을 위하여 구강 표면에 부착되는 성질이 있어, 바이오필름을 형성하게 된다. 일단 바이오필름이 형성되면, 외부의 물리, 화학적 자극에 대한 방어력이 현저하게 커지기 때문에, 일반적인 물리 적 방법으로 제거하기 어려울 뿐만 아니라, 독성이 매우 강한 항균제를 사용하거나 많은 양의 항균제를 사용하여야 일시적으로 나마 제거될 수 있다. 바이오 필름은 방치될 경우, 더욱 두터워지고 강해져 치석을 형성하여 수많은 세균의 서식처가 되어 각종 구강 질환을 일으키게 된다. 이러한 과정을 막기위한 대표적인 방법으로서 치과에서의 스케일링과 같은 물리적인 방법이 권장되어 왔으며, 그 효과도 검증되어 왔다. 그러나 치과 방문의 번거로움과, 두려움 그리고 경제적인 이유로 대개의 경우, 충분한 수준의 관리를 받지 않고 있다. 그러나, 칫솔질을 통한 바이오필름이나 치석의 제거에는 한계가 있어, 수 많은 인구가 구강질환에 노출되고 있다. 이에 따라, 클로로헥시딘(chlorhexidine), 세틸피리디니움 클로라이드(cetylpyridinium chloride), 트리클로산(triclosan)과 같이, 충치균 및 치주염균을 살균하는 성분이 함유된 제품들이 개발되어 대중화 되었다. 그러나 이러한 합성 항생제는 장기간 사용할 경우, 구강내 점막을 자극할 뿐만 아니라, 정상균도 파괴시켜 오히려 구강내 병원균에 대한 내성을 증가시키며, 치아착색 및 미각을 해치는 등의 인체에 대한 부작용이 크다. 구강세정제에 사용되는 대표적인 항균물질인 클로로헥시딘의 경우, 쇼크 증세를 나타내는 것이 확인되었으며, 특히 구강내 상처가 있을 경우 더욱 위험한 것으로 보고되고 있다. 이에 따라 최근들어 식물 유래의 항균작용을 갖는 성분의 사용이 증가하고 있으며, 그 예로 thymol, eucalyptol, menthol, EGCG, xylitol 등이 사용되고 있으나, 그 효과가 제한적이다.

본 발명은, 종래기술의 상기와 같은 문제를 해결하기 위한 것으로서, 구강 건강의 유지 및 개선에 있어서 핵심적인 요소라 할 수 있는 미생물에 의한 바이오 필름의 생성 억제 및 제거 효과가 매우 탁월하여, 낮은 농도에서도 구강의 불쾌감을 효과적으로 방지할 뿐만 아니라, 뛰어난 충치 및 잇몸질환의 개선 기능을 나타내며, 인체에 안전한 구강 건강 유지 및 개선용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 디벤조-p-디옥신(dibenzo-p-dioxine) 유도체를 유효성분으로 포함하는 구강 건강 유지 및 개선용 조성물을 제공한다.

상기에서 디벤조-p-디옥신(dibenzo-p-dioxine) 유도체는 하기 화학식1, 화학식2, 화학식3 및 화학식4로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화합물일 수 있다:

상기 화학식1 내지 4에서,

R은 각각 독립적으로 수소, C1~C5의 알킬, C2~C5의 알케닐, 페닐, C7~C12의 페닐알킬, C2~C20의 알카노일, C3~C20의 알케노일, 히드록시페닐, 디히드록시페닐 또는 트리하이드록시페닐이다.

본 발명 구강 건강 개선용 조성물은 치아의 부식, 치석 형성, 입냄새 생성 및 잇몸 질환을 일으키는 주요 원인인 바이오필름의 생성 억제 및 제거 효과가 탁월하여 구강 및 치아의 상태를 장시간 상쾌하고 청결하게 유지할 수 있게 한다. 또한, 충치 및 잇몸 질환을 예방 및 개선함으로써 구강 건강을 효과적으로 유지하고 개선시키는 효과를 제공한다. 또한, 천연성분으로 구성되어 인체에 안전하므로 연령에 관계 없이 구강 건강 유지 및 개선에 보편적으로 사용될 수 있다.

바이오필름의 아래쪽에 존재하게 되는 스트렙토코코스 계열의 균들은 구강내에 존재하는 당분을 사용하여 젓산을 형성하게 되며, 이 젓산이 치아의 법랑질을 부식시켜 충치를 발생시키게 된다. 또한 플라그가 발달되면 잇몸에 존재하게 되는 P. gingivalis 균이 자극성 화합물을 발생시켜 잇몸조직에 각종 염증을 일으키게 된다. 또한 혀 밑에 서식하는 혐기성 박테리아들로 이루어진 바이오필름은 구강내에 남게 되는 단백질을 분해하여 황이나 아민 화합물을 발생시켜 구취를 일으켜서 불쾌감을 유발한다.

일반인들이 치약이나 구강청정제의 형태로 쉽고, 안전하고, 효과적으로 구강 건강을 유지하고 개선하는데 적합한 이상적인 활성성분의 요건은 저농도에서의 항균활성, 항염활성의 지속성, 무자극성, 지속적 사용시의 안전성, 불쾌감의 부재 등이라고 할 수 있다. 이에 따라 본 발명자들은 합성 항생제의 단점인 내성증가의 문제, 치아착색, 독성, 미각손실 등의 부작용의 염려가 없는 천연에서 유래된 화학적 구조를 갖는 성분으로서, 바이오필름 생성억제 및 제거 활성에 있어서 이미 알려진 식물성분보다 저농도에서 효과적이며, 지속적인 효과를 나타내는 성분을 찾아내고자 연구하였다.

문헌(Rosan et al, Microbes and Infection 2000, 2:1599-1607)에 의하면, 바이오필름의 형성은 구강조직 표면에 박테리아가 부착되는 초기 부착 단계(initial attachment)와 수 주에 걸쳐 박테리아와 박테리아 간의 결합이 방대하게 형성되는 상호부착(co-adhesion)단계로 이루어 진다. 첫번째 단계는 약 1주일 간에 걸쳐서 일어나며, 거의 전적으로 스트렙토코코스 계열의 균이 부착된다. 두번 째 단계는 수 주간에 걸쳐서 일어나며, 700여종이 넘는 종류의 박테리아가 관여할 수 있지만, 주로 P. gingivalis 등이 관여하는 것으로 알려지고 있다. 또한 초기 부착 단계 및 상호부착 단계 모두에 있어서 부착을 매개하는 특정 단백질들이 존재함으로써 바이오필름의 형성을 가능하게 한다는 것이 알려져 있다. 따라서 기존 항균성분의 효과가 제한적인 이유는 부착 단계는 효과적으로 막지 못하면서, 항균성분이 3차원 용액상에 존재하는 박테리아 만을 주로 제거하는데 사용됨으로써 일시적인 효과만을 나타내기 때문이다. 따라서 고농도, 혹은 독성이 강한 항균성분이 필요하게 되고, 이에 따라, 인체에 대한 독성 증가, 미각 손실, 박테리아의 내성 증가의 단점이 발생한다. 따라서 기존의 성분을 사용한 제품으로는 일반인이 통상적인 방법(하루 1-2회의 양치질 및/혹은 구강세정액 사용 등)으로 바이오필름의 생성을 충분히 예방하고 제거할 수 없을 뿐만 아니라, 부작용으로 인하여 예방 차원에서 경제적이고, 편리하고, 근본적이고, 안전하게 구강 건강 유지 및 개선을 추구하기 어렵다.

바이오필름 형성의 핵심 요인으로서 부착단계에 대한 중요성을 인지한 상태에서 본 발명자들은 기존의 3차원 용액상의 항균작용이 아니라, 구강표면에서의 2차원적인 항균작용이 가능한 성분 혹은 조성을 찾아냄으로써 그러한 조성이 보다 효과적으로 구강 건강 유지 및 개선에 사용될 수 있도록 하기 위하여 노력하였다. 보다 구체적으로, 용액상에서 우수한 항균활성을 갖는 천연화합물로서, 구강조직의 표면에 박테리아가 부착될 때 사용되는 매개 단백질과 효과적으로 결합할 수 있는 성분을 찾아냄으로써 구강내 박테리아의 부착 부위를 불활성화시킴과 동시에 구강조직 표면에 항균 성분을 2차원적으로 배열시킴으로써 낮은 농도에서도 구강내 바이오필름의 생성을 원천 봉쇄하고, 효과의 지속성을 극대화 시킬 수 있도록 하는 것이다. 보다 구체적으로, (1) 구강표면에 부착되는 박테리아인 스트렙토코코스 계열의 병원균에 대한 항균효과가 우수한 천연화합물로서 구강표면에 존재하는 박테리아 부착 부위와 효과적으로 결합할 수 있는 성분을 찾는다. (2) 바이오필름 형성 2단계에 주로 관여하여 염증을 야기시키는 P. gingivalis 등의 박테리아 등에 대한 항균작용이 우수한 성분으로서 박테리아간 상호결합을 매개하는 단백질과 결합할 수 있는 성분을 찾는다. 이러한 성분은 더 이상의 바이오필름의 축적을 억제할 뿐만 아니라 2차원적으로 배열됨으로써 항균성분의 실제농도를 극대화 시키게 되어 바이오필름의 효과적인 소멸을 가능하게 한다.

따라서 본발명이 기존의 기술과 차별화 되는 점은, 기존의 항균제는 스트렙토코코스 및 P. gingivalis 병원균과 항균제의 상호작용이 3차원 용액상에서 일어나게 하는 반면, 본 발명의 항균성분은 구강표면상에서 박테리아가 부착될수 있는 부위에 특이적으로 결합함으로써 각종 구강발생의 진원지를 효과적으로 차단할 뿐만아니라 2차원상에서 항균작용이 일어나게 한다는 것이다. 본 발명의 장점은, 바이오필름의 진원지를 특이적으로 차단하고, 동시에 그 부위에 항균력을 제공함으로써 기존에 가능하지 않았던 수준의 바이오필름 억제 효과를 나타낼 수 있다는 것이며, 다른 장점은 2차원 상에서 작용하므로, 소량의 항균성분으로 바이오필름 내지는 플라그의 형성을 억제하고 소멸시킬 수 있다는 것이다. 또한, 부착능력이 뛰어 난 성분과 항균활성이 뛰어난 성분들의 조합을 통하여 다양한 조성을 제공할 수 있다.

본 발명자들은 이러한 새로운 성분 혹은 조성을 구현하기 위하여 문헌을 연구하던 중, 미국 특허 제5013542호(Method to inhibit adhesion of disease-causing microorganisms to teeth) 및 문헌(Rosan et al, Microbes and Infection 2000, 2:1599-1607)으로부터 구강 병원균이 치아표면 및 다른 병원균들과 부착되는 과정에 있어서 구강 표면 및 병원균의 표면에 존재하는 프롤린이 풍부한(proline-rich) 펩티드가 중요하게 관여한다는 사실을 확인하였다. 그리고 그에 착안하여 항균력과 프롤린이 풍부한 펩티드와의 결합력이 동시에 우수한 성분을 검색하던 중, 디벤조-p-디옥신 골격을 갖는 천연화합물 및 이들을 함유한 조성이 항균력과 프롤린이 풍부한 펩티드와의 결합력 면에서 가장 뛰어난 것을 발견하였다. 또한 이들 성분 및 이들로 구성된 조성물의 미생물 필름 생성 억제 및 제거 효과가 저농도에서도 탁월함을 발견하였으며, 이를 적용한 시험제품에 대한 효능 실험을 통하여 그 우수한 실용적 가치를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 디벤조-p-디옥신(dibenzo-p-dioxine) 유도체를 유효성분으로 포함하는 구강 건강 유지 및 개선용 조성물에 관한 것이다.

상기에서 바람직하게는, 디벤조-p-디옥신(dibenzo-p-dioxine) 유도체가 하기 화학식1, 화학식2, 화학식3 및 화학식4로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상 의 화합물일 수 있다:

[화학식1]

[화학식2]

[화학식3]

[화학식4]

상기 화학식1 내지 4에서,

상기에서 R은 각각 독립적으로 수소; 메틸; 에테닐; 벤질; 아세틸 또는 올레오일(oleoyl); 4-히드록시페닐; 2,4-히드록시페닐; 또는 2,4,6-트리히드록시페닐인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 수소이다.

상기 구강 건강 유지 및 개선용 조성물에 있어서, 각 화합물의 함량은 조성물 총 중량에 대하여, 화학식1의 화합물은 3~70중량%이고, 화학식2의 화합물은 1~75중량%이고, 화학식3의 화합물은 2~60중량%이고, 화학식4의 화합물은 2~60중량%인 것이 바람직하며; 조성물 총 중량에 대하여, 화학식1의 화합물은 15~60중량%이고, 화학식2의 화합물은 6~750중량%이고, 화학식3의 화합물은 15~50중량%이고, 화학식4의 화합물은 12~50중량%인 것이 더욱 바람직하다.

상기 화학식1 내지 4의 화합물은 구강 건강 유지 및 개선에 도움이 되는 여러가지 우수한 효능을 갖지만 특히, 다음과 같은 면에서 우수한 효능을 나타낸다.

상기 화학식1의 화합물은 특히, 바이오필름의 초기 형성과정에 관여하는 충치 원인 다종균에 대한 억제 효능이 매우 뛰어난 특성을 갖는다. 따라서, 상기와 같은 함량의 범위 내로 포함될 경우, 특히, 조성물의 바이오필름 형성 억제 효능과 충치 원인균 등의 박테리아에 대한 항균활성 효능을 강화시킨다.

상기 화학식2의 화합물은 특히, 치주세포의 염증 억제 활성(TNF-α 억제 활성 및 IL-1β억제활성)이 매우 뛰어난 특성을 갖는다. 따라서, 상기와 같은 함량의 범위 내로 조성물에 포함될 경우, 특히, 치주염 억제 및 개선 효과를 강화시킨다.

상기 화학식3의 화합물은 특히, 바이오필름의 초기 형성과정에 관여하는 충치 원인 다종균에 대한 억제 효능과 바이오필름의 2단계 발달에 관여하는 치주염 원인균에 대한 뛰어난 항균활성 효능을 갖는다. 따라서, 상기와 같은 함량의 범위 내로 조성물에 포함될 경우, 특히, 바이오필름 형성 억제 효능과 충치 원인균 및 치주염 원인균 등의 박테리아에 대한 항균활성 효능을 강화시킨다.

상기 화학식4의 화합물은 특히, 박테리아가 부착되는 초기 부착 단계(initial attachment)에서 구강조직 표면에 대한 박테리아의 부착을 방지하는 효능이 매우 뛰어난 특성을 갖는다. 따라서, 상기와 같은 함량의 범위 내로 조성물에 포함될 경우, 특히, 바이오필름 형성 억제 효능을 강화시킨다.

본 발명의 구강 건강 유지 및 개선용 조성물에 있어서, 상기 화학식1, 화학식2, 화학식3 및 화학식4로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화합물이 화학식1의 화합물, 화학식3의 화합물 및 화학식 4의 화합물인 경우에 바이오필름 생성억제 활성이 특히 우수하다.

본 발명의 구강 건강 유지 및 개선용 조성물은 하기 화학식5, 화학식6, 화학식7, 화학식8, 화학식9 및 화학식10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 디벤조-p-디옥신(dibenzo-p-dioxine) 유도체를 더 포함할 수 있다:

상기 화학식5 내지 10에서,

상기에서 화학식5, 화학식6, 화학식7, 화학식8, 화학식9 및 화학식10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 디벤조-p-디옥신(dibenzo-p-dioxine) 유도 체는 본 발명의 조성물에 조성물총 중량에 대하여 0.1~50중량%로 포함될 수 있다.

상기에서 본원발명의 구강 건강 유지 및 개선용 조성물에 더 포함되는 화학식5, 화학식6, 화학식7, 화학식8, 화학식9 및 화학식10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 디벤조-p-디옥신(dibenzo-p-dioxine) 유도체가 화학식7의 화합물을 포함하는 경우에 더욱 바람직한 활성을 나타낸다.

상기 화학식7의 화합물은 특히, 바이오필름의 초기 형성과정에 관여하는 충치 원인 다종균에 대한 억제 효능과 바이오필름의 2단계 발달에 관여하는 치주염 원인균에 대한 뛰어난 항균활성 효능을 갖는다. 따라서, 본 발명의 조성물에 포함될 경우, 특히, 바이오필름 형성 억제 효능과 충치 원인균 및 치주염 원인균 등의 박테리아에 대한 항균활성 효능을 강화키는 역할을 한다.

본 발명의 구강 건강 유지 및 개선용 조성물이 화학식1, 화학식3 및 화학식7의 화합물을 포함하는 경우에 바이오필름 제거 활성이 특히 우수한 특성을 갖는다.

본 발명의 구강 건강 유지 및 개선용 조성물이 디벤조-p-디옥신 유도체로서 상기 화학식1 내지 화학식10의 화합물을 모두 포함하는 경우에, 화학식1의 화합물 3~50중량%, 화학식2의 화합물 1~15중량%, 화학식3의 화합물 2~40중량%, 화학식4의 화합물 2~30중량%, 화학식5의 화합물 0.1~10중량%, 화학식6의 화합물 0.1~10중량%, 화학식7의 화합물 2~40중량%, 화학식8의 화합물 0.1~10중량%, 화학식9의 화합물 0.1~6중량% 및 화학식10의 화합물0.1~20중량%로 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 구강 건강 유지 및 개선용 조성물은 약학적 제제나 건강보조식품 등으로 제조될 수 있다. 약학적 제제로 제조되는 경우에는 이 분야에서 통상적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 보조 활성 물질을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 의한 약학적 조성물은 정제, 협구 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르제, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물에 의한 건강보조식품은 정제, 분말, 캡슐, 서스펜션, 시럽, 음료, 식품(예를 들어, 바(bar) 또는 빵), 치약, 껌, 캔디 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 구강 건강 유지 및 개선용 조성물의 일일 사용량은 0.01~100mg 정도가 바람직하다. 본 발명의 구강 건강 유지 및 개선용 조성물은 구강내 바이오필름의 발생억제 및 제거, 치아의 부식 예방, 치석형성 예방, 잇몸 질환 예방 및 개선, 및 입 냄새 개선의 용도로 바람직하게 사용될 수 있다.

이하에서, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. 하기의 실시예는 본 발명의 범위 내에서 당업자에 의해 적절히 수정, 변경될 수 있다.

본 발명에 따른 디벤조-ｐ-디옥신 유도체는 통상적인 모든 방법에 의해 얻을 수 있고, 시판되는 시약을 사용하여 합성 할 수 있으며, 천연물 특히, 해조류로부터 추출 및 분리하여 얻을 수 있다.

실시예 1: 디벤조-ｐ-디옥신 유도체의 분리 정제

실시예 1-1. 아이제니아 아보리아로부터 폴리페놀 혼합물의 정제 아이제니아 아보리아(Eisenia arborea, 1kg)를 신선한 상태로 착즙기를 이용하여 섬유질을 제거한 후, 95% 에틸알코올(4L)을 추가하여 상온에서 30분간 교반하여 용액만을 걸러낸 후, 건조하여 58g의 갈색분말을 었었다. 얻어진 건조 분말을 20배량의 증류수(50℃)에 용해시킨 후, PVPP(Polyvinylpyrrolidone) 수지(건조분말의 10배)와 혼합하여 교반한 후(50℃, 1hr), 용액을 걸러내어 제거하고, 충분한 량의 증류수(PVPP 수지의 5배 이상)로 세척하였다. 세척된 PVPP 수지에 95% 에탄올(PVPP 수지의 3배량)을 더하여 상온에서 30분간 교반한 후, 걸러내고, 용액을 취하여 건조하여 8g의 흑갈색 분말을 얻었다. 폴린 시약을 사용하여 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과 95.6%로 나타났다.

실시예 1-2. 정제된 폴리페놀 혼합물로부터 디벤조-p-디옥신 유도체의 분리

상기 실시예1에서 얻은 폴리페놀 혼합물을 0.2㎛ 막여과지로 여과하여 고속 액체 크로마토그래피에 로딩(loading)하였다. 고속 액체 크로마토그래피에서, 컬럼은 HP ODS Hypersil 컬럼을, 용매로는 증류수와 메탄올을 사용하였으며, 용매의 공 급은 1.0㎖/분의 유속으로 메탄올 15%에서 70%까지 30분간에 걸쳐 선형구배(linear gradient)를 걸어 10개의 활성물질을 분리하였다. 각 화합물은 화학식1 내지 10의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체임을 확인하였다.

[화학식1]

[화학식2]

[화학식3]

[화학식4]

[화학식5]

[화학식6]

[화학식7]

[화학식8]

[화학식9]

[화학식10]

상기 화학식1 내지 10에서, R 수소 이다.

실시예 2. Proline-rich peptide 와의 binding/inactivation 실험

본 발명의 디벤조-p-디옥신 화합물 및 항균활성이 잘 알려진 성분들이 바이오필름 형성에 있어서 결정적인 역할을 하는 부착단계를 억제하는 능력을 평가하였다. 부착활성은 동일한 농도에서 시료가 고정화된 Proline-rich protein 1에 결합하는 정도로부터 ELISA 법으로 결정하였다. 보다 상세하게 다음과 같이 수행되었다.

PRP1(Proline-rich protein 1)을 3명의 남성으로부터 기증된 타액으로부터 Ramasubbu et al(Ramasubbu, N., M. S. Reddy, E. J. Bergey, G. G. Haraszthy, S.-D. Soni, and M. J. Levine. 1991. Large-scale purification and characterization of the major phosphoproteins and mucins of human submandibular-sublingual saliva. Biochem. J. 280:341-352.)의 방법으로 분리정제하였다. 정제된 PRP1(2 mmol/ml, 인산완충용액 pH 7.4)을 2% 글루타르알데히드(인산 완충용액, pH 7.4)로 활성화된 96-well 플래이트에 처리한 후 4℃에서 밤새 배양(overnight incubation)시켜 고정화 시켰다. 0.1% Tween 20이 포함된 인산완충용액(PBST 용액)으로 3회 세척하고 카세인(casein) 용액을 처리하여 상온에서 1시간 방치 후 다시 PBST 용액으로 3회 세척하였다. 화학식1~10 및 비교시료(100 ug/mL)를 각 웰에 첨가한 후 상온에서 3시간 방치한후 PBST용액으로 3회 세척한 후 카세인 용액을 처리하였다. Rabbit Anti-Human PRAP1 Polyclonal Antibody(Abcam, 영국)을 1:10,000으로 희석하여 각 well에 첨가한 후, 4℃에서 밤새 방치한 후 PBST용액으로 3회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 결합된 항체의 검출은 AP-conjugated Goat anti-rabbit IgG(H+L),(Anaspec,USA)을 2차항체, p-니트로페닐 포스페이트(p-Nitrophenyl phosphate)를 기질로 사용하여 405nm에서 수행하고 다음 식을 사용하여 계산하였다. 음성대조시료로서 알부민(bovine serum albumin)을 사용하였다.

PRP1에 대한 부착활성(%) = 100 × (음성대조시료 처리시의 흡광도-시료 처리시의 흡광도)/음성대조시료 처리시의 흡광도

실험결과 화학식4의 화합물이 가장 우수한 효과를 보였다.

화합물	부착 활성(%)
Chlorhexidine gluconate	38
eucalyptol	21
Resveratrol	32
curcumin	25
EGCG	62
xylitol	11
화학식1	87
화학식2	80
화학식3	85
화학식4	95
화학식5	71
화학식6	73
화학식7	84
화학식8	74
화학식9	73
화학식10	72

실시예 3. 용액상에서의 항균 활성 평가

실시예 3-1. 바이오필름의 초기 형성과정에 관여하는 충치 원인균에 관한 용액상에서의 항균활성 측정

구강표면의 박테리아 부착 부위에 결합하여 부착부위를 봉쇄함과 동시에 부착될 박테리아에 대한 항균활성까지 겸비한다면 바이오필름 생성 억제효과가 더욱 커질 것이다. 따라서 부착단계에 대한 억제와 독립적으로 용액상에서의 항균활성을 측정하여 활성이 우수한 성분을 찾아내고자 하였다.

상기 실시예 2에서 제조된 시험물 및 비교샘플에 대하여 충치의 원인균인 스트렙토코코스 뮤탄스(Streptococcus mutans, ATCC25275), 스트렙토코코스 상기스(S.sanguis ATCC 10556)(American type culture Collection, Rockwille, MD, USA), 액티노마이스 비스코서스(Actinomyces viscosus KCCM 12074, Korea Culture enter of Microorganisms, 서울)로 구성된 다종균에 대한 항균활성을 측정하였다. 모든 균은 혐기성 조건하에서 37℃에서 24시간 동안 BHI(brain heart infusion broth, DIFCO laboratories, Ditroit, MI, USA) 배양액내에서 배양되었다. 각 시료의 항균활성은 배양액 미세 희석법을 이용한 최소저해농도(Minimum inhibitory concentration, MIC) 측정법을 이용하였다. 보다 상세하게는, 상기 조성물의 표준용액을 1,000ug/ml 의 농도로 10% DMSO용액을 용매로 제조한 다음, 이를 BHI배양액을 이용하여 단계적으로 2배씩 연속 희석하여 0.25-125ug/ml 용액을 제조하였다. 96-폴리스티렌 플레이트의 각 웰당 20ul의 다종균을 접종시켜 세포농도가 1X106 CFU/ml가 되도록 배양액을 사용하여 농도를 조절 한 후 연속 희석하여 제조된 여러가지 농도의 상기 시료를 첨가 하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 각 웰내의 박테리아의 성장 정도를 596nm에서 흡광도를 측정하여 구하였다. 최소 저해농도(MIC)는 대조군(시료를 처리하지 않은 셀)과 비교하여 박테리아의 성장이 90%이상 저해되는 시료의 최소 농도로 결정 하였다. 모든 실험은 3번 반복되었으며 각 평균값을 사용하였다. 각 시료의 최소 저해 농도(MIC)를 하기 표 2에 나타냈다.

실시예 3-2. 바이오필름의 2단계 발달에 관여하는 치주염 원인균에 대한 항균활성 측정

상기 실시예 2에서 제조된 시험물을 이용하여 치주염의 원인균인 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis ATCC 53978), 포피로모나스 엔도돈테일리스(Porphyromonas endodontalis ATCC 35406), 프레보텔라 인터에디아(Prevotella intermedia ATCC 25611)에 대한 항균활성을 측정하였다. 모든 박테리아는 혐기성 조건하(90% N2, 5% CO2, 5% H2)에서 37℃에서 24시간 동안 배양액(30 g/L tripticase soy broth, 5 g/L yeast extract, 0.5 g/L L-cysteine, 5 μg/mL hemin and 0.2 μg/mL vitamin K1)으로 배양되었다. 상기 조성물의 치주염균에 대한 항균활성은 배양액 미세 희석법을 이용한 최소저해농도(Minimum inhibitory concentration, MIC) 측정법을 이용하였다. 보다 상세하게는, 상기 조성물의 표준용액을 1,000ug/ml의 농도로 10% DMSO용액을 용매로 제조한 다음, 이를 BHI배양액을 이용하여 단계적으로 2배씩 연속 희석하여 0.25-125ug/ml 용액을 제조하였다. 96-폴리스티렌 플레이트의 각 웰당 20ul의 박테리아를 접종시켜 상기 균주의 세포수가 1 X 106 CFU/ml가 되도록 배양액을 사용하여 농도를 조절 한 후 연속 희석하여 제조된 여러가지 농도의 상기 조성물을 첨가 하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 각 웰내의 박테리아의 성장 정도를 596nm에서 흡광도를 측정하여 구하였다. 최소 저해농도(MIC)는 대조군(시료를 처리하지 않은 셀)과 비교하여 박테리아의 성장이 90%이상 저해되는 시료의 최소 농도로 결정 하였다. 모든 실험은 3번 반복되었으며 각 평균값을 사용하였다. 각 조성물의 최소 저해 농도(MIC)를 하기 표 2에 나타냈다.

화합물	충치 원인 다종균에 대한 최소저해농도(ug/mL)	치주염 원인균에 대한 최소저해농도(ug/mL)
Chlorhexidine gluconate	1.0	0.5
eucalyptol	>125	>125
Resveratrol	>125	>125
curcumin	>125	>125
EGCG	>125	>125
xylitol	>125	>125
화학식1	15.6	15.6
화학식2	31.3	15.6
화학식3	15.6	7.8
화학식4	31.3	15.6
화학식5	62.5	31.5
화학식6	31.3	15.6
화학식7	15.6	7.8
화학식8	31.3	31.3
화학식9	31.3	31.3
화학식10	31.3	15.6

시험결과 Chlorhexidine gluconate이 용액상에서 가장 강력한 항균작용을 나타냈다. 천연성분 중에서는 화학식3 및 7이 가장 우수한 항균작용을 나타냈다.

실시예 4. P Gingivalis 균에서 분비되는 LPS 의해 유도되는 치주세포의 염증 억제 활성 평가

치주염은 잇몸염증과 이에 따른 치주세포의 파괴에 의해 일어나는 일련의 감염질환을 일컫는다. 치주염과 관련있는 여러가지 박테리아 중 포르피로모마스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)는 이들 중 가장 잘 알려져 있는 박테라아이다. 이러한 박테리아에 의해 생성되는 LPS, 단백질, 혹은 단백질 분해효소등은 대표적인 세포 독성물질로 치주질환과 밀접한 관계가 있다.

P. gingivalis에 의해 생성된 LPS는 인터루킨-1(IL-1β) 혹은 종양괴사인자(TNF-α) 등의 염증인자 생성을 촉진하는데, 이들 염증인자들은 각종 치주 질환을 일으키는 원인으로 알려져 있다.

따라서 상기 조성물의 P. gingivalis에 의해 생성된 LPS에 의해 발현되는 인터루킨-1(IL-1β)과 종양괴사인자(TNF-α)의 생성 억제 효과를 통하여 치주염 예방효과를 측정하였다.

P. gingivalis(A7A1-28)은 BHI 배양액(5 mg of hemin and 0.5 mg of vitamin K/ml함유)을 이용하여 37℃ 혐기성 조건하에서(90% N2, 5% H2, and 5% CO2) 24시간 배양하였다. P.gingivalis에 의해 생성된 LPS를 페놀-증류수 방법을 이용하여 추출하였다. 보다 상세하게는 배양된 박테리아 셀을 증류수에 서스펜션 시킨 후, 같은 양의 90% 페놀을 60℃에서 첨가한후 20분간 저어주었다. 수용액층을 원심분리(7,000 rpm for 15 min at 4℃)하여 분리한 후 비이온화수를 이용하여 4℃ 에서 3일간 투석 한 후, 이를 다시 원심분리(40,000 rpm for 1.5 h at 4℃)하여 침전물을 얻었다. 이 침전물을 투석을 통하여 정제 한 후 이를 진공 건조하여 4℃에 보관하였다. 마우스 유래의 대식세포(RAW 264.7)를 포도당 4.5g/ℓ, 10% 혈청, 1% 항생제가 함유된 DMEM 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 이들 세포를 분주하여 48시간 배양한 후, 화학식1 내지 10 및 비교시료를 50 μg/ml의 농도로 DMEM 배지에 희석시켜 배양된 대식 세포에 처리하여 37℃에서 3일간 배양하였다. 배양 후 배지를 모두 제거하고, 리시스버퍼(0.1M 포타슘 포스페이트 버퍼, pH 7.8/1% Triton X-100/1mM DTT/2mM EDTA)를 이용하여 배양액을 처리 한 후, 배양액 내의 생성된 인터루킨-1β와 종양괴사인자(TNF-a)의 양을 효소면역 에세이법(Enzyme-linked innumosorbent assay, ELISA)에 의하여 측정하고, 그 결과를 하기 표3에 나타냈다.

화합물	TNF-α 억제 활성	IL-1β 억제활성
Methyl salicylate	80%	78%
eucalyptol	55%	45%
(±)-menthol	20%	17%
Resveratrol	55%	61%
curcumin	58%	63%
quercetin	60%	57%
EGCG	64%	68%
xylitol	3%	2%
화학식1	79%	81%
화학식2	83%	85%
화학식3	77%	82%
화학식4	76%	80%
화학식5	66%	69%
화학식6	70%	72%
화학식7	78%	80%
화학식8	69%	73%
화학식9	66%	72%
화학식10	70%	73%

상기 표 3에 나타난 바와 같이 Chlorhexidine gluconate은 배양된 세포를 소멸시켰으므로, 측정이 불가하였으며, 화학식2가 가장 우수한 활성을 나타냈다.

실시예 5. 조성물의 제조

상기 실시예3 및 4로부터 디벤조-p-디옥신 성분들이 바이오필름 생성을 억제하는데 필요한 각각의 활성에서 가장 우수한 것으로 나타났다. 각 활성이 뛰어난 성분들을 선정하여 조성물1 내지 10을 제조하였다. 각 조성물의 화학적 조성을 하기 표 4에 나타냈다.

시료	시료의 조성
조성물1	화학식1(R=H), 60중량% + 화학식4(R=H), 40중량%
조성물2	화학식3(R=H), 50 중량% + 화학식4(R=H), 50중량%
조성물3	화학식2(R=H), 20 중량% + 화학식3(R=H), 30 중량% + 화학식4(R=H), 50 중량%
조성물4	화학식2(R=H), 70 중량% + 화학식3(R=H), 22 중량% + 화학식7(R=H), 8 중량%
조성물5	화학식1(R=H), 30 중량% + 화학식2(R=H), 6 중량% + 화학식3(R=H), 20 중량% + 화학식4(R=H), 20 중량% + 화학식7(R=H), 24 중량%
조성물6	화학식1(R=H), 18 중량% + 화학식2(R=H), 6 중량% + 화학식3(R=H), 16 중량% + 화학식4(R=H), 12 중량% + 화학식5(R=H), 10 중량% + 화학식6(R=H), 5 중량% + 화학식7(R=H), 16 중량% + 화학식8(R=H), 4 중량% + 화학식9(R=H), 3 중량% + 화학식10(R=H), 10 중량%
조성물7	화학식1(R=H), 25 중량% + 화학식3(R=H), 18 중량% + 화학식4(R=H), 15 중량% + 화학식6(R=H), 12 중량% + 화학식7(R=H), 20 중량% + 화학식10(R=H), 10 중량%,
조성물8	화학식2(R=acetyl, H(3:7)), 50 중량% + 화학식4(R=H), 50 중량%
조성물9	화학식1(R=oleoyl, H(1:9)), 100 중량%
조성물10	화학식3(R=methyl, H(2:8)), 100 중량%
조성물11	화학식1(R=H), 30 중량% + 화학식3(R=H), 30 중량% + 화학식4(R=H), 40 중량%
조성물12	화학식1(R=H), 20 중량% + 화학식3(R=H), 40 중량% + 화학식7(R=H), 40 중량%

실시예 6. 바이오필름 생성 예방 효과 평가

상기 실시예 5에서 제조된 조성물과 비교시료에 대하여 바이오 필름 생성 억제 활성을 측정하였다. 상기 조성물은 100% 디메틸설폭사이드에 녹여서 0.5-40ul/ml의 농도로 뮤신을 이용하여 희석하였다. 인공침은 1% typeIII 뮤신(mucin from porcine stomach, Sigma-Aldrich)을 부착완충용액에 희석시킨후 121℃에서 15분간 멸균시킨 것을 사용하였다.

균주로는 충치 원인 균인 스트렙토코코스 뮤탄스(Streptococcus mutans, ATCC25275), 스트렙토코코스 상기스(S.sanguis ATCC 10556)(American type culture Collection, Rockwille, MD, USA), 액티노마이스 비스코서스(Actinomyces viscosus KCCM 12074, Korea Culture enter of Microorganisms, 서울)를 사용하였으며 이들을 접종하여 다종(multi-species) 접종용액을 제조 하였다. 보다 상세하게는 배양된 각 박테리아를 원심분리기를 통하여 분리한 후(4500, 5min), PBS(phosphate-buffered saline, pH7.2)로 세척하였다. 이를 부착완충용액(10mM KPO4, 50mM KCl, 1mM CaCl₂, 0.1mM MgCl₂, pH7.0)에 다시 1x106 CFU/ml 농도로 서스팬션 시켰다. 접종세포 용액은 각 박테리아를 같은 농도로 포함하였다. 상기 조성물들의 바이오 필름 생성억제 활성을 측정하기 위하여 Rukayadi와 Hwang의 방법을 사용하였다. 보다 상세하게는 96-웰 폴리스티렌 마이크로 플레이트에 0.5-50ug/ml의 시료를 각 웰에 넣고 상온에서 쉐이커를 이용하여 3시간 동안 배양한 후, 공기중에서 건조시켰다. 시료가 코팅된 96-웰플레이트에 20ul의 박테리아 접종액을 첨가한후 총 부피가 200ul가 되도록 배양액을 채운후(최종농도 1x105 CFU/ml) 37℃에서 24시간 배양하였다. 남아있는 배양액을 제거한 후, 200ul 50mM PBS를 이용하여 남은 바이오 필름을 형성하지 않은 셀들을 세척하였다. 바이오필름을 형성한 셀을 0.4% 크리스탈 바이올렛 용액을 이용하여 30분 동안 착색한 다음, 증류수를 이용하여 남아있는 용액을 깨끗이 세척하였다. 착색된 셀을 95% 에탄올 200ul에 녹인 후 그 양을 흡광도(596nm)를 이용하여 측정하였다. 본 시료의 바이오필름 억제효과는 다음식을 이용하여 측정하고 그 결과를 하기 표 5에 나타냈다.

바이오필름 생성 예방효과(%) = (1-시료가 코팅된 셀의 흡광도/대조군 셀의 흡광도) X 100

대조군으로 시료가 코팅되지 않은 셀을 사용하였으며, 50% 예방효과를 나타내는 농도(IC50)를 구하였다.

시료	바이오필름 생성 50% 억제 농도 (IC₅₀, ug/mL)
조성물1	2.7
조성물2	3.0
조성물3	2.6
조성물4	2.8
조성물5	2.4
조성물6	2.1
조성물7	2.5
조성물8	5.0
조성물9	4.9
조성물10	5.5
조성물 11	2.1
조성물 12	2.4
화학식1	3.8
화학식2	3.7
화학식4	3.1
화학식7	4.0
Chlorhexidine gluconate	5.3
eucalyptol	>50
EGCG	>50
xylitol	>50

실시예 7. 바이오필름 제거 효과 평가

구강내에 이미 형성된 바이오필름을 효과적으로 제거하는 것은 구강 건강을 개선시키는데 있어서 생성을 억제하는 것만큼 중요하다. 따라서 상기 실시예 5에서 제조된 조성물과 비교샘플에 대하여 바이오필름의 제거 효과를 측정하였다. 제조된 조성물과 비교시료에 대한 박테리아 바이오필름 제거 효과 측정을 위하여 96-웰플레이트에 여러가지 박테리아 바이오 필름을 Stepanovic의 방법에 의하여 다음과 같이 코팅하였다. 각 플레이트에 200ul의 인공침을 넣고 상온에서 3시간 동안 가볍게 흔들면서 배양한 다음, 부착되지 않은 남은 인공침을 제거 한 후, 플레이트를 공기중에서 건조시킨다. 플레이트에 박테리아 접종액 20ul 을 넣고 3% 수크로즈를 함유한 BHI 배양액을 이용하여 37 C에서 24시간 배양하여 바이오필름을 형성시켰다. 남아있는 배양액을 제거한 후 200ul 50mM PBS를 이용하여 남은 바이오 필름을 형성하지 않은 셀들을 세척하였다. 각 셀에 시험물 또는 비교시료를 0.5~50ug/mL의 농도로 처리하고 1시간 동안 배양하였다. 바이오필름을 형성한 셀을 0.4% 크리스탈 바이올렛 용액을 이용하여 30분 동안 착색한 다음, 증류수를 이용하여 남아있는 용액을 깨끗이 세척하였다. 착색된 셀을 95% 에탄올 200ul에 녹인 후 흡광도를 이용하여 측정하였다(596nm). 각 시료의 바이오필름 제거활성은 처리 전 후의 흡광도를 비교하여 결정하였다

바이오필름 제거효과는 하기 식에 의하여 계산하였으며 50% 제거효과를 나타내는 농도(IC50)를 구하여 하기 표 6에 나타냈다.

바이오필름 제거효과(%) = (1-시료의 흡광도/시료를 처리하지 않은 셀의 흡광도) X 100

시료	바이오필름50% 제거 농도 (IC₅₀, ug/mL)
조성물1	3.8
조성물2	3.9
조성물3	3.7
조성물4	3.6
조성물5	3.5
조성물6	3.0
조성물7	2.9
조성물8	5.0
조성물9	4.9
조성물10	5.5
조성물11	3.2
조성물12	2.9
화학식1	5.8
화학식2	5.7
화학식4	5.1
화학식7	6.0
Chlorhexidine gluconate	8.1
eucalyptol	>50
EGCG	>50
xylitol	>50

실시예 8. 치주 질환에 대한 예방 및 치료 효과 평가

상기 조성물들의 치주 질환 예방 및 치료 효과를 하기 표7에 기재된 방법에 따르는 임상시험을 통하여 평가 하였다.

대상	30명의 충치를 가진 남, 녀 (여자 16명, 남자 14명; 평균 나이 37, 연령대 23-56)
샘플	대조군: 본 발명의 조성물을 포함하지 않은 츄잉검 실험군: 본 발명의 조성물7을 츄잉검 조성물 총중량 대비 0.6중량%로 포함한 츄잉검 츄잉검의 조성: 하기 표 8.
방법	1. Baseline(0주) 에서 모든 대상자에 대한 충치 검사 및 스켈링을 실시한다. 2. 대상자를 대조군 및 실험군의 2개의 그룹으로 나눈다 3. 모든 대상자는 2개의 츄잉검을 5분동안 씹도록 하며, 1일 5회 실시한다. 실험군의 경우 90mg/일의 상기추출물에 노출되었다. 4. 본 임상시험은 12주 동안 진행되며 0, 4, 8, 12주에 치주 질환 지표에 대한 검사를 실시한다.
평가 방법	6개의 치아를 선택한 후 다음 항목에 대한 검사를 실시하였다. 1. 플라그 양 평가(Plaque accumulation, PLA): 선택된 치아의 여섯 사이트에 생성된 플라그의 높이를 측정한 후 그 평균값을 사용하였다. 2. 잇몸검사(Gingival Index, GI): 선택된 치아의 네 사이트의 잇몸상태를 Loe and Silness index를 이용하여 스코어를 선택하고 이들의 평균값을 사용하였다. 3. Clinical attachment level(CAL): 잇몸과 치아 사이의 간격을 모든 치아에 대해 측정하였다. 4. Periodontal probing depth(PD): 치아와 잇몸사이에 probe를 넣어 그 깊이를 측정하였다. 5. Bleeding on probing(BOP): 잇몸사이에 probe를 넣었다가 뺐을 때 출혈이 일어나는 경우를 양성으로 한다.

츄잉검 제조 성분은 하기의 표8에 나타냈다.

원료 (중량%)	대조군용 츄잉검	시험군용 츄잉검
상기 조성물7	0.00	0.60
껌 베이스	28.04	27.44
자일리톨	50.00	50.00
솔비톨	15.00	15.00
말티톨	6.00	6.00
구연산	0.40	0.40
수크랄로스	0.01	0.01
레몬향	0.05	0.05
정제수	0.50	0.50
합계	100.00	100.00

상기 평가결과, 도1에 나타낸 바와 같이, 본 발명 조성물7을 포함한 츄잉검을 사용한 실험군의 치주상태 개선효과 및 치주질환 예방 효과가 대조군과 비교하여 매우 뛰어남을 확인하였다.

실시예 9. 상기 조성물의 충치 예방 효과

상기 조성물6의 충치 예방 및 충치내에 존재하는 박테리아에 대한 항균효과를 하기 표9에 기재된 방법에 따르는 임상시험을 통하여 평가하였다.

대상	PD(Periodontal probing depth)가 6mm 이상이며, 심하게 흔들리는 치아 혹은 치주염으로 발전 가능성이 있는 잇몸염증을 가진 20명의 남, 녀(여자 6명, 남자 14명; 평균 나이 45, 연령대 32-56세)
특징	이중맹검, 무작위, 대조군과 비교 시험
시험기간	8주
샘플	대조군: 본 발명의 조성물을 포함하지 않은 구강세정제(에틸알코올 27중량%, 물 73중량%) 실험군: 본 발명의 조성물6을 세정제 조성물 총중량 대비 0.05 중량%로 포함한 구강세정제(에틸알코올 27중량%, 물 72.95중량% 포함)
방법	1. Baseline(0주) 에서 모든 대상자에 대한 충치 검사 및 스켈링을 실시하였다. 2. 대상자를 대조군 및 실험군의 2개의 그룹으로 나누었다 3. 모든 대상자는 1일 3회, 식사후 20mL의 구강세정제를 입안에 머금고 치아 및 잇몸를 30초간 세정한후 뱉어내었다. 실험군의 경우 1일 30mg의 상기조성물6에 노출되었다. 4. 본 임상시험은 8주 동안 진행되었으며, 8주 후에 침과 잇몸내액을 채취하였다.
평가 방법	1. 채취된 침 속의 락토페린 양을 효소 면역에세이법을 이용하여 측정하였다. 2. 잇몸 내액(Gingival crevicular fluid)을 채취하여 37℃에서 7일간 배양한 후 박테라아의 콜로니수를 측정하였다.

상기 평가결과, 하기 표10에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 조성물6의 충치 개선효과 및 예방 효과가 뛰어남을 확인하였다.

	대조군		시험군
	Baseline	8 주	Baseline	8 주
락토페린양(ug/ml)	20.1± 5.6	19.8 ± 2.6	18.5 ± 4.1	9.6 ± 2.3
박테리아 콜로니수 (CFU/mL, x 10⁶, mean ± SD)	15.3 ± 4.5	15.7 ± 7.0	17.9 ± 5.6	10.8 ± 2.5

실시예 10. 양치 효과의 지속성 비교 실험

일반인들이 일상생활에서 가장 큰 불편을 느끼는 입냄새 발생 등 구강 불쾌도에 끼치는 영향을 치약을 사용하여 하기 표11에 기재된 방법으로 평가하였다. 대조 치약으로는 구취효과가 우수한 것으로 알려진 감태 추출물 및 클로로헥시딘이 포함된 치약을 사용하였다.

대상	20명의 건강한 남녀(여자 10명, 남자 10명; 평균 나이 35, 연령대 23-59)
샘플	치약 A: 활성성분으로 상기 조성물5를 포함한 치약 치약 B: 활성성분으로 감태 추출물을 포함한 치약 치약 C: 활성성분으로 클로로헥시딘을 포함한 치약 치약 A, B, C의 공통 치약조성은 중량비로 다음과 같다. 이산화규소: 라우릴황산나트륨: 글리세린: 카르복시메틸셀룰로스: 자이리톨: 스피아민트유: 안식향산부틸: 활성성분 = 20:3:20:1.8:1.3:0.9:0.2:0.1(단위: 중량%) 치약의 색깔(연갈색) 용기, 맛은 모두 구별할 수 없게 제조하였다.
방법	1. 대상자들이 무작위 순서로 최소 3일 간격으로 각각 3가지 치약을 사용한 테스트를 할 수 있도록 하였다. 치약에 대한 구별을 실험자 및 대상자 모두 모르게 이중맹검으로 진행하였다. 2. 실험방법은 다음과 같다. 낮12시-12시30분 사이에 동일한 식단의 식사(쌀밥 1공기, 불고기200g, 김치50g, 된장국 200mL)를 섭취한 후, 오후 1시에 각 치약을 사용하여 양치질(2분간)을 수행하였다. 양치 후 대화, 운동, 물과 음식물 섭취 등 구강 상태에 영향을 줄수 있는 행동을 금지하고, 1시간 단위로 오후 7시까지 구강 불쾌지수에 대하여 점수를 기록하였다. 계속해서 저녁 7시-7시30분 사이에 저녁 식사(쌀밥 1공기, 생선 구이 200g, 김치50g, 콩나물무침 50g, 미역국 200mL)를 섭취한 후 대화, 운동, 물과 음식물 섭취 등 구강 상태에 영향을 줄수 있는 행동을 금지한 상태에서 오후 9시 및 11시, 그리고 취침후 다음날 아침 7시에 구강불쾌지수를 기록하였다.
평가 방법	구강 불쾌지수는 다음과 같이 정의하였다. 0점: 양치질 직후의 상쾌함 1점: 미미한 불쾌감이 인지되지만 무시할 정도 2점: 약간 불쾌한 정도 3점: 어느정도 불쾌하지만, 일반적인 대화에 지장이 없을 정도 4점: 상당히 불쾌하여 대화시 조심해야할 정도 5점: 가까이 서서 대화하기 불가능 할 정도로 불쾌함

상기 실험결과 도2에 도시된 바와 같이, 본 발명의 조성물5를 포함한 치약을 사용한 실험군은 양치 효과가 오랜 시간 지속되었으나, 활성성분으로서 감태 추출물을 포함한 치약이나 클로로헥시딘을 포함한 치약을 사용한 실험군은 양치효과가 오래 지속되지 못하는 결과를 나타냈다.

도 1은 본 발명의 조성물7을 포함한 츄잉껌을 사용하여 치주 질환 예방 및 치료 효과를 대조군과 비교하여 시험한 결과를 나타낸 그래프이다(PLA: 플라그 양 평가, GI: 잇몸검사, BOP: 잇몸사이에 프로브를 넣었다가 뺐을 때 출혈 평가, PD: 치아와 잇몸 사이 깊이 측정, CAL: 잇몸과 치아 사이의 간격 측정)

도 2는 본 발명의 조성물5를 포함하는 치약을 사용하여 양치 효과의 지속성을 대조군과 비교하여 시험한 결과를 나타낸 그래프이다.

Claims

디벤조-p-디옥신(dibenzo-p-dioxine) 유도체를 유효성분으로 포함하는 구강 건강 유지 및 개선용 조성물.
청구항1에 있어서, 상기 디벤조-p-디옥신(dibenzo-p-dioxine) 유도체가 하기 화학식1, 화학식2, 화학식3 및 화학식4로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 구강 건강 유지 및 개선용 조성물:

[화학식1]

[화학식2]

[화학식3]

[화학식4]

상기 화학식1 내지 4에서,

R은 각각 독립적으로 수소, C1~C5의 알킬, C2~C5의 알케닐, 페닐, C7~C12의 페닐알킬, C2~C20의 알카노일, C3~C20의 알케노일, 히드록시페닐, 디히드록시페닐 또는 트리하이드록시페닐이다.
청구항2에 있어서, 상기 화학식1 내지 4에서 R은 각각 독립적으로 수소, 메틸, 에테닐, 벤질, 아세틸, 올레오일(oleoyl), 4-히드록시페닐, 2,4-히드록시페닐 또는 2,4,6-트리히드록시페닐인 것을 특징으로 하는 구강 건강 유지 및 개선용 조성물.
청구항2에 있어서, 각 화합물의 함량은 조성물 총 중량에 대하여, 화학식1의 화합물은 3~70중량%이고, 화학식2의 화합물은 1~75중량%이고, 화학식3의 화합물은 2~60중량%이고, 화학식4의 화합물은 2~60중량%인 것을 특징으로 하는 구강 건강 유지 및 개선용 조성물.
청구항2에 있어서, 상기 구강 건강 유지 및 개선용 조성물에 포함되는 화학식1, 화학식2, 화학식3 및 화학식4로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화합물이 화학식1의 화합물, 화학식3의 화합물 및 화학식 4의 화합물인 것을 특징으로 하는 구강 건강 유지 및 개선용 조성물.
청구항2에 있어서, 상기 구강 건강 유지 및 개선용 조성물은 하기 화학식5, 화학식6, 화학식7, 화학식8, 화학식9 및 화학식10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 디벤조-p-디옥신(dibenzo-p-dioxine) 유도체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 구강 건강 유지 및 개선용 조성물.

[화학식5]

[화학식6]

[화학식7]

[화학식8]

[화학식9]

[화학식10]

상기 화학식5 내지 10에서,

R은 각각 독립적으로 수소, C1~C5의 알킬, C2~C5의 알케닐, 페닐, C7~C12의 페닐알킬, C2~C20의 알카노일, C3~C20의 알케노일, 히드록시페닐, 디히드록시페닐 또는 트리하이드록시페닐이다.
청구항6에 있어서, 상기 화학식5, 화학식6, 화학식7, 화학식8, 화학식9 및 화학식10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 디벤조-p-디옥신(dibenzo-p-dioxine) 유도체가 화학식7의 화합물인 것을 특징으로 하는 구강 건강 유지 및 개선용 조성물.
청구항7에 있어서, 상기 구강 건강 유지 및 개선용 조성물에 포함되는 화학식1, 화학식2, 화학식3 및 화학식4로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화합물이 화학식1의 화합물 및 화학식3의 화합물인 것을 특징으로 하는 구강 건강 유지 및 개선용 조성물.
청구항6에 있어서, 상기 화학식5 내지 10에서 R은 각각 독립적으로 수소, 메틸, 에테닐, 벤질, 아세틸, 올레오일(oleoyl), 4-히드록시페닐, 2,4-히드록시페닐 또는 2,4,6-트리히드록시페닐인 것을 특징으로 하는 구강 건강 유지 및 개선용 조성물.
청구항6에 있어서, 화학식5, 화학식6, 화학식7, 화학식8, 화학식9 및 화학식10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 디벤조-p-디옥신(dibenzo-p-dioxine) 유도체는 조성물총 중량에 대하여 0.1~50중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 구강 건강 유지 및 개선용 조성물.
청구항1 또는 청구항2에 있어서, 구강내 바이오필름의 발생억제 및 제거, 치아의 부식 예방, 치석형성 예방, 잇몸 질환 예방 및 개선, 또는 입 냄새 개선 기능을 갖는 것을 특징으로 하는 구강 건강 유지 및 개선용 조성물.